抗炎症剤としてのエクテイナシジン化合物
我々は、抗炎症活性を、エクテイナシジン化合物において見出した。このような化合物は広く記載されており、以降の一般式（Ｉ）を持つことがあり、式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する。
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤に関する。より具体的には、本発明は、抗炎症活性の、既知のクラスの化合物における発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球／マクロファージは、先天的および適応免役（免疫）の重要な成分と認識されている。循環単球は、変化できる前駆体であり、種々の形の組織マクロファージへと分化する能力を有する。マクロファージは、外来の侵入者に対するガード（防御）に立ち、瞬時に体を病原に対してディフェンス（守備）でき、ならびに、他の免疫担当（適格）細胞動員シグナル（信号）を送り、抗原をＴリンパ球に対して提示できる。もう一方では、マクロファージは、幾つかの疾患の発症もしくは進展においても、示唆されており、主に、原炎症および原血管新生メディエーター産生を経由する。このような病状は例えば、幾つかの慢性疾患（例えば、リューマチ関節炎、アテローム（粥状）硬化、紅斑性狼瘡）および腫瘍において存在する際立った炎症を包含する。
【０００３】
腫瘍部位では、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が、浸潤ストローマ細胞の主要な成分を代表する。ＴＡＭは、複雑な遊走の役割を、腫瘍内で持ち、＜＜マクロファージバランス仮説＞＞において示唆されるとおりである。事実、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで刺激されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージもしくは古典経路で活性化されたマクロファージとも呼ばれる）は、腫瘍細胞を殺す潜在能力を持つが、幾つかの線の証拠が、腫瘍のミクロな環境内のマクロファージが、第２経路で活性化されたマクロファージ、つまりＭ２マクロファージに向かって歪曲されるとの考えを裏付ける。最も頻繁には、ＴＡＭは、非細胞毒性であり、数種の成長および血管新生因子を産生する。ＴＡＭは、免疫抑制分子（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）、および、ケモカインを包含して種々の炎症メディエーターをも産生する。ケモカインは、マトリックスメタロ（金属）プロテアーゼを活性化させ、これは、マトリックス蛋白を消化し、腫瘍播種を促進させる。これゆえ、腫瘍部位でのＴＡＭの蓄積および炎症分子の連続発現が実際に、腫瘍進展を煽ることがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）化合物は、天然および合成化合物を包含する。これらは、縮合した５環系および１，４−架橋を保有する。我々は、抗炎症活性（作用）を、これらエクテイナシジン化合物において見出した。このような化合物は広く記載されており、以降の一般式（Ｉ）：
【０００５】
【化１】
【０００６】
を持ってよく、式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する。
【０００７】
これゆえ、本発明は、炎症を処置していく方法を提供し、これは、一般式（Ｉ）を持っている有効量のエクテイナシジン化合物の投与を含む。
【０００８】
本発明は、一般式（Ｉ）を持っているエクテイナシジンを、医薬として許容可能な担体もしくは稀釈剤と共に含んでいる医薬品をも提供する。
【０００９】
本発明は更に、一般式（Ｉ）を持っているエクテイナシジンの、炎症処置における使用のための医薬品調製における使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
我々は、エクテイナシジン化合物が、抗炎症活性を保有することを見出した。これゆえ、本発明は、上で定義されたような一般式（Ｉ）の化合物に関する新たな医療指針に関する。
【００１１】
これらの化合物において、その置換基は、以降のガイダンスに従って、選択され得る。
【００１２】
アルキルおよびアルコキシ基は、好ましくは、１〜１２炭素原子を持つ。１つのより好ましいクラス（分類）のアルキルおよびアルコキシ基は、１〜約６炭素原子、最も好ましくは、１、２、３、もしくは４炭素原子を持つ。メチル、エチル、および、イソプロピルを包含してプロピルが、本発明の化合物において、特に好ましいアルキル基である。メトキシ、エトキシ、および、イソプロポキシを包含してプロポキシが、本発明の化合物において、特に好ましいアルキル基である。もう１つ別のより好ましいクラスのアルキルおよびアルコキシ基は、４〜約１２炭素原子、尚より好ましくは、５〜約８炭素原子、最も好ましくは、５、６、７、もしくは８炭素原子を持つ。本明細書において使用される場合、この用語アルキルとは、他に修飾されなければ、環状および非環状基両方に関するが、環状基は、少なくとも３員環炭素を含むことになる。
【００１３】
本発明の化合物における好ましいアルケニルおよびアルキニル基は、１つ以上の不飽和結合および２〜約１２炭素原子を持つ。１つのより好ましいクラスのアルケニルもしくはアルキニル基は、２〜約６炭素原子、最も好ましくは、２、３、もしくは４炭素原子を持つ。もう１つ別のより好ましいクラスのアルケニルもしくはアルキニル基は、４〜約１２炭素原子、尚より好ましくは、５〜約８炭素原子、最も好ましくは、５、６、７、もしくは８炭素原子を持つ。これらの用語アルケニルおよびアルキニルとは、本明細書において使用される場合、環状および非環状基両方に関する。
【００１４】
本発明の化合物における適切なアリール基は、単および多環化合物を包含し、分離および／または縮合したアリール基を含有する多環化合物も包含する。典型的なアリール基は、１〜３の分離もしくは縮合した環と、６〜約１８炭素環原子とを含有する。特に好ましいアリール基は、置換もしくは非置換フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントリル、およびアントラシルを包含する。
【００１５】
適切なアルカノイルオキシおよびアルカノイル基は、２〜約２０炭素原子、より好ましくは、２〜約８炭素原子、尚より好ましくは、２〜約６炭素原子、もっとより好ましくは、２炭素原子を持つ。もう１つ別の好ましいクラスのアルカノイルオキシ基は、１２〜約２０炭素、尚より好ましくは、１４〜約１８炭素原子、最も好ましくは、１５、１６、１７、もしくは１８炭素原子を持つ。
【００１６】
上記の基は、１カ所以上の利用できる位置において、１つ以上の適切な基により、置換されてよく、ＯＲ’、＝Ｏ、ＳＲ’、ＳＯＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＮＯ２、ＮＨＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、＝Ｎ−Ｒ’、ＮＨＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）２、ＮＨＳＯ２Ｒ’、ＣＮ、ハロゲン、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’のようなものであり、式中、各Ｒ’基は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＮ、ハロゲン、＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、ならびに、置換もしくは非置換アリールからなる群から選択される。本発明の化合物における適切なハロゲン置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを包含する。
【００１７】
本発明の好ましい化合物は、一般式（Ｉ）のものであり、式中、１つ以上の以降の定義が適用される。
Ｒ５は、アルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、メチルであり；
Ｒ１２は、メチルであり；
Ｒ１６は、メチルであり；
Ｒ１７は、メトキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮであり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂがアミド基であるか、または、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
を形成する。
【００２０】
本発明用の化合物の例は、エクテイナシジン７４３のような天然エクテイナシジン、ならびに、例えば、米国特許第５，０８９，２７３号明細書、米国特許第５，４７８，９３２号明細書、米国特許第５，６５４，４２６号明細書、米国特許第５，７２１，３６２号明細書、米国特許第６，１２４，２９３号明細書、米国特許第５，１４９，８０４号明細書、米国特許第０９／５４６，８７７号明細書、米国特許第５，９８５，８７６号明細書、および国際公開（ＷＯ）０１／７７１１５号において開示される他の１，４−架橋縮合エクテイナシジン化合物を包含する。
【００２１】
エクテイナシジン７４３はＥＴ７４３としても知られ、エクテイナシジン７４３が特に好ましい。ＥＴ７４３は天然物であり、海産被嚢類Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎｉａ ｔｕｒｂｉｎａｔａ由来であり、潜在的な抗腫瘍活性を有する。これは新規で有効な薬剤であり、現在、臨床試験段階にあり、軟組織サルコーマ、乳癌、および卵巣癌を包含してある幾つかのヒト固形腫瘍において抗癌活性を示している。
【００２２】
以降の式（ＩＩＩ）の化合物が、特に好ましい。
【００２３】
【化３】
【００２４】
式中、Ｒａが水素でＲｂが式−ＮＨＲｆ−のアミドであり、式中、Ｒｆがアルカノイルであるか、あるいは、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、あるいは、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【００２５】
【化４】
【００２６】
を形成し、Ｒｄがアルカノイルであり、そして、Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮである。
【００２７】
これらアルカノイル基は、アセチル以上、例えば、Ｃ２０までであり得る。
【００２８】
これゆえ、本発明の好ましい化合物は：
【００２９】
【化５】
【００３０】
ならびに異なるアシル基を有する関連化合物を包含する。
【００３１】
本発明により提供される医薬品は医薬組成物であり、本エクテイナシジン化合物、および、医薬として許容可能な担体を含んでいる。医薬品は従来の形のものであり得、適切な投薬手順がなされ得る。
【００３２】
指し示されているように、本発明の化合物は、抗炎症剤として有用である。これゆえ、これら化合物は、炎症を患う疾患の処置において、特に、慢性炎症および自己免疫疾患（例えば、リューマチ関節炎、Ｓｊｏｇｒｅｎ病、Ｃｒｏｈｎ病）ならびにアテローム硬化の処置において、使用され得る。
【実施例】
【００３３】
本研究において、我々は、薬理的範囲内濃度において、エクテイナシジン７４３が、選択毒性を骨髄系列に関して示し、単球／マクロファージのアポトーシスを誘導したことを実証する。非細胞毒性濃度において、エクテイナシジン７４３が有意に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの分化を阻害し、選択された炎症サイトカインの産生を抑えた。これらの知見は、幾つかのヒト疾患における単球／マクロファージを標的化していくことを狙いとされる治療アプローチに関連していることがある。
【００３４】
ＥＴ７４３に加えて、ＥＴ６３７誘導体Ａ、ＥＴ６３７誘導体Ｂ、ＥＴ５９４、ＥＴ７４３誘導体Ａ、およびＥＴ７４５も、テストされた。これらも、選択された炎症サイトカイン産生を抑えると示された。
【００３５】
材料および方法
細胞調製：
精製された集団のヒト血液（中の）単球が、以前記載されたように（Ａｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．、Ｐｉｅｍｏｎｔｉ、Ｌ．、Ｌｏｎｇｏｎｉ、Ｄ．、Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ、Ｓ．、Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ、Ａ．、Ｒｕｃｏ、Ｌ．、およびＭａｎｔｏｖａｎｉ、Ａ．＜＜ＩＬ−１０は、樹状細胞への単球の分化を防ぐが、マクロファージへのその成熟を促進する＞＞Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：３５９−３６９，１９９８参照）、ＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌ勾配上での差別化密度遠心により、調製された。単球は通常＞８５％、ＣＤ１４＋細胞であった。精製されたＴリンパ球（＞９５％ＣＤ３＋）が、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上、以前記載されたように（Ｃｈｉｅｐｐａ、Ｍ．、Ｂｉａｎｃｈｉ、Ｇ．、Ｄｏｎｉ、Ａ．、Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅ、Ａ．、Ｓｉｒｏｎｉ、Ｍ．、Ｌａｓｋａｒｉｎ、Ｇ．、Ｍｏｎｔｉ、Ｐ．、Ｐｉｅｍｏｎｔｉ、Ｌ．、Ｂｉｏｎｄｉ、Ａ．、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ、Ａ．、Ｉｎｔｒｏｎａ、Ｍ．、およびＡｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．＜＜単球由来樹状細胞上のマンノースレセプター（受容体）の架橋が、抗炎症免疫抑制プログラムを活性化させる＞＞Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４５５２−４５６０，２００３参照）して、得られた。ヒト胸腺細胞が、外科手術を受けている小児患者から切除された胸腺から、単離された。胸腺細胞が、梳解していくことにより得られ、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上で単離された。
【００３６】
細胞が、１０６細胞／ｍＬで、完全培地ＲＰＭＩ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＦＲＧ）＋１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中、培養された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させられたマクロファージが、単球培養（単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（２０ｎｇ／ｍＬ）５日間）により、得られた。ある幾つかの実験において、マクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＦＮ−γ（５００ＩＵ／ｍＬ）もしくはＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）で２４時間、処理された。
【００３７】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および腫瘍細胞が、ミラノ−ビコッカ（Ｍｉｌａｎ−Ｂｉｃｏｃｃａ）大学Ｓ．ジェラルド（Ｇｅｒａｒｄｏ）病院産婦人科医院に入院された卵巣アデノカルシノーマと診断された患者の腹水から単離された。該腹水中に含有された細胞が遠心され、ＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌの識別密度勾配ならびにプラスチックに対する接着により、以前記載されたように単離された（Ａｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．、Ｐｅｃｃａｔｏｒｉ、Ｆ．、Ｍａｇｇｉｏｎｉ、Ｄ．、Ｅｒｒｏｉ、Ａ．、Ｓｉｒｏｎｉ、Ｍ．、Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｎ．、Ｌｉｓｓｏｎｉ、Ａ．、Ｇａｌａｚｋａ、Ａ．、Ｍｅｉｅｒｓ、Ｗ．、Ｍａｎｇｉｏｎｉ、Ｃ．等＜＜再発腹水卵巣カルシノーマ患者における腹腔内組み換えγ−ＩＮＦ：腫瘍関連エフェクターにおける細胞毒性およびサイトカイン産生ならびに腫瘍細胞上での主要組織適合抗原発現の調節＞＞Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：７３１８−７３２３，１９９０参照）。ＴＡＭ精製および腫瘍細胞調製は通常＞６５±１０％であり、形態および表現型分析により定められるとおりであった。細胞が、エクテイナシジン７４３を用いて、指し示された濃度において処理され、１〜５日間培養され、図面の指示において特定されるとおりであった。インキュベート期間の終わりに、細胞が回収され、洗浄され、ＤＮＡ解析もしくは機能アッセイに使用された。
【００３８】
細胞生存率の決定
細胞生存率が、ＤＮＡ含量により、フローサイトメトリーにおいて、分析された。
処理に晒された細胞が、７０％エタノールを用いて固定され、ＰＢＳ中洗浄され、１０μｇ／ｍＬのＰＩをＰＢＳ中において、および、２５μＬのＲＮＡｓｅ１０，０００単位を含有している沃化プロピジウム（ＰＩ）溶液を用いて終夜暗所において、染色された。ＰＩ取り込みが、少なくとも２０，０００細胞／サンプルにおいて評価され、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、６２０ｎｍの通過帯フィルターを用いた。アポトーシスが、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩを用いて染色していくことにより、検出された。ＦＡＣＳ分析が実施され、５３０および６２０ｎｍの通過帯フィルターを、それぞれ緑（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）および赤（ＰＩ）の蛍光に、５７０ｎＭの２色鏡と組み合わせて、使用した。
【００３９】
表現型解析
細胞膜マーカー発現が、免疫蛍光により実施され、フローサイトメトリーにより分析された。細胞が、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６８、抗ＣＤ２０６（マンノース受容体）、次いで、ＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇを用いて、記載されたようにインキュベートされた。少なくとも１０，０００細胞が、分析された。
【００４０】
サイトカイン産生
非処理細胞またはエクテイナシジン７４３もしくは他の抗新生物剤を用いて処理された細胞の上清が、２４時間培養後回収され、凍結された。単球、マクロファージ、およびＴＡＭが、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを用いて刺激され、最大サイトカイン産生を誘導した。サイトカインＣＣＬ２、ＴＮＦ、およびＩＬ−６の決定が、製造元の説明書に従って、特異的ＥＬＩＳＡにより、測定された。
【００４１】
腫瘍患者
エクテイナシジン７４３を用いたフェーズＩＩ治験を受けているサルコーマもしくは卵巣癌患者が、欧州腫瘍研究機関（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ミラノ、イタリア）に入院した。患者は、エクテイナシジン７４３（１３００ｍｇ／ｍ２）を、３時間の点滴で与えられた。血液サンプル（４０ｍＬ）が、本処置直前、該点滴の終わりに（３時間）回収された。血液サンプルが直ちに加工され、Ｐｅｒｃｏｌｌ精製単球（通常１０６細胞）がＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を用いて５日間培養された。分化させられた細胞が、上記のように、回収され、数えられ、表現型発現に関して分析された。結果が、絶対数マーカー陽性細胞／１０，０００細胞として、表される。マクロファージの分化の有意な阻害は、同一患者からの、治療前に回収された細胞に対する、マーカー陽性（＋）細胞の５０％抑制と見なされた。
【００４２】
実施例１
エクテイナシジン７４３が、選択的細胞毒性効果を、単核食細胞において示す
我々はまず、エクテイナシジン７４３処理の効果を、ヒト白血球サブセット生存率に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、研究した。血液（中の）単球、リンパ球、および胸腺細胞の精製調製品が、異なる濃度のエクテイナシジン７４３を用いて、４８時間培養された。細胞生存率が、ＤＮＡ解析および沃化プロピジウム（ＰＩ）染色により、フローサイトメトリーにおいて、査定された。血液（中の）単球の精製調製品は高度に、この薬剤の細胞毒性効果に感受性であった。用量依存的な死が、５０％致死用量（ＩＣ５０）の２．５〜５ｎＭを用いた４８時間後の培養において見出された（図１Ａ）。精製Ｔリンパ球は遙かに僅かに感受性であり、５ｎＭにおいて全て生存していた。リンパ球に関するＩＣ５０は、２０ｎＭであった。単離されたての胸腺細胞は、遙かにより耐性であった（ＩＣ５０＞４０ｎＭ、図１Ａ）。
【００４３】
視覚的に、エクテイナシジン７４３に晒された全ての死んでいる単球が、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖに関して陽性に染まり、この薬剤がアポトーシスを誘導することを指し示している（図１Ｂ）。単球の死も、ＤＮＡ解析により、フローサイトメトリーにおいて、確かめられた（図２）。Ｍ−ＣＳＦ、単球の成長および分化因子の存在下に、エクテイナシジン７４３の毒性効果からの一部保護が、観察された。Ｍ−ＣＳＦが、単球の死を、５５％から３０％に、５ｎＭエクテイナシジン７４３において、４８時間のインキュベート後に、６５％から３５％に、１０ｎＭにおいて、２４時間の処理後に、シフトさせた（図２）。Ｍ−ＣＳＦは、エクテイナシジン７４３と同時もしくは前に加えられた場合のみ有効であったが、もはや、この薬剤の４時間後に与えられた場合、有効でなかった。
【００４４】
エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果の速度論的解析が、Ｍ−ＣＳＦ存在下に実施された。細胞が、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および異なる濃度のエクテイナシジン７４３を用いて処理された。サンプルが、指し示された時間において回収され、ＤＮＡ解析用にテストされた。より高濃度において、有意な毒性が既に、２４時間のインキュベート後に観察され、ずっと上昇した（図３Ａ）。より低濃度（２．５ｎＭ）は、４０〜５０％の死を、５日後に誘導した。
【００４５】
我々は次に、エクテイナシジン７４３の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて５日間、Ｍ−ＣＳＦと共に培養された単球から得られた既に分化したマクロファージに関して、研究した。最後の４８時間におけるエクテイナシジン７４３の添加が結果的に有意な死をもたらしたが、単離したての単球に比較して、より低い程度であった。図４Ａは、同一ドナーからの単球およびマクロファージの感受性を比較している代表的な実験を示す。単球が、マクロファージに、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）との培養により、分化した。３日目に、エクテイナシジン７４３が、培養に加えられ、４８時間、インキュベートされた。結果は、同一ドナーから得られた単球およびマクロファージの比較を示す。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。同様な結果が、他の４実験において得られた。一連の異なる４実験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したものに関するＩＣ５０は、１０ｎＭであった。
【００４６】
我々は次いで、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γにより古典経路で活性化されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージ）ならびにＩＬ−４により第２経路で活性化されたマクロファージ（Ｍ２マクロファージ）の、エクテイナシジン７４３に対する感受性をテストした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−γ（５００ＵＩ：ｍＬ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）を用いて、エクテイナシジン７４３存在下もしくは非存在下に、４８時間刺激された。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。ＬＰＳ刺激およびＩＬ−４刺激両方のマクロファージが、非刺激マクロファージ同様、薬剤処理に対して感受性であった（図４Ｂ）。
【００４７】
我々はまた、非処置卵巣アデノカルシノーマ患者の腹水から単離された腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をも、テストした。異なる３人の卵巣癌患者から単離されたＴＡＭ強化調製品が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、エクテイナシジン７４３を用いて、４８時間処理された。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。ＴＡＭが有意に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、エクテイナシジン７４３により殺傷され、１０ｎＭにおいて、４０〜７０％殺傷率であった。異なる３人の患者からの結果が、図４Ｃにおいて示される。
【００４８】
これらの実験全体が、ヒト単核食細胞が高度に、治療範囲内濃度において、エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果に対して感受性であることを実証する。Ｍ−ＣＳＦ存在下でさえ、単球が決して、細胞周期を進まなかったことが、記されるべきであり、フローサイトメトリーを用いたＤＮＡ解析によりチェックされたとおりであった。単球におけるエクテイナシジン７４３の毒性効果はこれゆえ、細胞周期から独立しており、非複製細胞におけるこの薬剤の生物学的効果を研究する唯一の機会を提供する。
【００４９】
実施例２
非細胞毒性濃度のエクテイナシジン７４３が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、マクロファージの分化を阻害する
マクロファージの分化に関するエクテイナシジン７４３の効果を研究するために、非細胞毒性用量のこの薬剤が使用された。単球が、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および細胞毒性濃度以下のエクテイナシジン７４３と共に、５日間培養された。表現型の分析が、間接免疫蛍光により実施され、フローサイトメトリーにおいて、巨大細胞上で開閉させて、分析された。通常、平均６５±１５％（＞１０の実験の平均±ＳＤ）のインプット（入力）の単球が、ＣＤ１６、ＣＤ６８、およびＣＤ２０６（マンノース受容体）を包含して典型的なマクロファージマーカーを発現している巨大細胞へと分化する。５日の培養後、単球生存率が、フローサイトメトリーにおける沃化プロピジウム染色により評価され、０．５および１ｎＭエクテイナシジン７４３において、それぞれ９２％および７０％の非処理細胞であった。マクロファージの分化のプロセスが一部、ｄｅ ｎｏｖｏ発現のＣＤ６８、ＣＤ１６、およびＣＤ２０６として阻害され、１ｎＭエクテイナシジン７４３において抑えられた（図３Ｂ）。
【００５０】
上のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける知見を評価するために、我々は、腫瘍患者におけるエクテイナシジン７４３のｉｎ ｖｉｖｏ投与が、単球生存率に関する計測可能な効果ならびにマクロファージの分化に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける許容量を持ち得るかどうか、テストした。エクテイナシジン７４３を用いるフェーズＩＩ治験が現在、進行卵巣アデノカルシノーマ患者において進行中であり、彼らは、２とおりの異なるサイクルの従来のシスプラチンおよびタキソール主体の化学療法に失敗していた。この研究のために選択された腫瘍患者は、１３００μｇ／ｍＬ／ｍ２のエクテイナシジン７４３を用いて処置された。患者からの血液サンプルが、薬剤投与直前および３時間の点滴の終わりに、採血された。精製単球が直ちに単離され、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）と共に５日間培養され、マクロファージの分化を誘導させ、次いで、表現型発現用に分析された。１２人の評価可能な患者の内、６被験者からの単球が、エクテイナシジン７４３処理後に、マクロファージの分化の減少を示した。表１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化された患者からのマクロファージの表現型分析を示し、彼らの細胞は、治療後に、治療前に回収された細胞に比較して、ＣＤ２０６、ＣＤ１６、およびＣＤ６８発現の少なくとも５０％阻害を示した。示されるデータは、全１０，０００の入力細胞についての、マーカー陽性細胞の絶対数である。他の６人の患者から回収された単球は、如何なる有意な減少をも、それらの分化能において、示さなかった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
我々はまた、エクテイナシジン７４３を用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける処理が、測定可能な単球減少を、癌患者において引き起こしたかどうかも、調べた。単球の値は、血液製剤から、通常の臨床分析の間に、得られた。単球形態分析が記録され利用可能であった９患者の内、７患者が、単球数の減少を示し（少なくとも１サイクルにおいて、点滴前の値に比較して２５％阻害）、全白血球に亘る単球％および単球／μＬ血液の絶対数両方で評価された。３人の代表の患者からの結果が、図５において示される。全数白血球における一定レベルもしくは一過的な増加にもかかわらず、薬剤点滴後最初の数日において、単球は決して増加せず、実際に頻繁に減少した。
【００５３】
実施例３
エクテイナシジン７４３は、炎症サイトカイン／ケモカイン産生を阻害する
単球／マクロファージは、炎症／免疫応答を司る可溶性因子の、潜在産生者である。我々はこれゆえ、これらの細胞の分泌機能に関するエクテイナシジン７４３処理効果をテストした。ケモカインＣＣＬ２は、単核食細胞の主要走化因子であり、免疫および幾つかの腫瘍細胞により、産生される。腫瘍由来ＣＣＬ２は、循環している単球を、その腫瘍部位において惹き付け、腫瘍ＴＡＭ含量は、ＣＣＬ２レベルと相関し、幾つかの腫瘍において実証されているとおりである。
【００５４】
単球およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化されたマクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激された。１時間のＬＰＳ刺激後、それらは、エクテイナシジン７４３処理された。１６時間のインキュベート後、細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。これらの処理条件下、５ｎＭまでの濃度に関して、細胞生存率は通常＞８５％であった。エクテイナシジン７４３処理は用量依存的に、ＬＰＳ刺激単球およびｉｎ ｖｉｔｒｏ由来マクロファージによるＣＣＬ２産生を抑えた（図６Ａ）。５ｎＭでの平均阻害は、単球に関しては、６５％（５０〜８０％の範囲、ｎ＝５）であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージに関しては、５０％（２５〜７５％の範囲、ｎ＝５）であった。結果は、３〜５実験の平均±ＳＥである。
【００５５】
次に、卵巣カルシノーマに関連したＴＡＭが、テストされた。単離したての卵巣腫瘍細胞およびＴＡＭが、エクテイナシジン７４３と共に１６時間インキュベートされた。ＴＡＭが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激された。細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。結果は、ＴＡＭに関しては、４実験の平均±ＳＥであり、腫瘍細胞に関しては、１実験からである。ＬＰＳ刺激によるＣＣＬ２産生は、５０％抑制され（４０〜６０％の範囲、ｎ＝４）（図７Ａ）、一方、それらの本来の産生は、４３％抑制された（３０〜５０％の範囲、ｎ＝４）。
【００５６】
我々は、２種の他のサイトカインＩＬ−６およびＴＮＦをもテストし、これらは、マクロファージおよび腫瘍細胞により産生され、炎症特性を持ち、ある幾つかの腫瘍の成長因子としても作用する。ＩＬ−６産生はいつも、エクテイナシジン７４３処理後に抑えられ、全体としての阻害は、５ｎＭにおいて、単球およびマクロファージにおいて、それぞれ５４％（５１〜５７％の範囲、ｎ＝２）および６９％（６６〜７２％の範囲、ｎ＝２）であった（図６Ｂ）。ＴＡＭにおけるＩＬ−６放出は幾らか、処理に対してより耐性であり、５ｎＭにおいて、平均阻害が３５％（２５〜５３％の範囲、ｎ＝４）、１０ｎＭにおいて、４７％（３３〜６３％の範囲、ｎ＝４）であった（図７Ｂ）。
【００５７】
興味あることに、エクテイナシジン７４３は、単離したての腫瘍細胞によるＣＣＬ２およびＩＬ−６の本来の産生をも抑えた。代表的な実験が、図７において示される。
【００５８】
対照的に、そして、非常に驚くべきことに、単球、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージ、およびＴＡＭが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激され、エクテイナシジン７４３処理され、１時間のＬＰＳ刺激を進められ、そして１６時間のインキュベート後に、細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた場合、単球／マクロファージにより、ならびに、ＴＡＭによるＴＮＦ産生が、ＴＡＭに関して（図８Ａ）１０ｎＭまでさえも、決して阻害されなかったことが観察され、エクテイナシジン７４３が、選択された遺伝子にしか干渉しないことを示唆している。これらの結果は、これらの条件下に、細胞が本処理により損傷されなかったことも、指し示している。サイトカイン産生に関するエクテイナシジン７４３の阻害効果がその転写レベルにあったかどうかを証明すべく、我々は、ＬＰＳ刺激マクロファージからのＣＣＬ２およびＴＮＦのｍＲＮＡを、エクテイナシジン７４３に晒されたＬＰＳ刺激単球におけるＣＣＬ２およびＴＮＦ転写産物のリアルタイムのＰＣＲにより、解析した。図８Ｂにおいて示されるように、エクテイナシジン７４３処理後、ＣＣＬ２転写産物の一貫した抑制が観察され、一方、ＴＮＦｍＲＮＡは、Ｅｌｉｓａにおいて得られた結果では、影響を受けなかった。
【００５９】
これらの結果全体が、薬理濃度におけるエクテイナシジン７４３が、２種の重要な炎症サイトカイン産生を、単核食細胞および腫瘍細胞において抑えることを指し示す。
【００６０】
実施例４
他のエクテイナシジン化合物も、炎症サイトカイン／ケモカイン産生を阻害する
我々は、５種の他のエクテイナシジン化合物（表２）も、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト単球によるＣＣＬ２産生の、それらの阻害能に関して、テストした。これら５種のテスト化合物の内、ＥＴ６３７誘導体Ａのみが、単球による炎症サイトカイン産生を、濃度２．５および５ｎＭにおいて下方修正させる顕著で一貫した能力を示した。これらの濃度は、単球生存率に、４８時間の被曝後に、影響を及ぼさなかった。ＥＴ６３７誘導体Ａの阻害の程度は、ＥＴ７４３に比較して、更により際立っていた。表２において、ＣＣＬ２産生が、腫瘍細胞上清に対する単球の被曝により誘導され、異なる２人のドナーにおいて、２．５および５ｎＭにおいて、それぞれ８０％および９７％まで阻害されることが、示される。同一の実験において、ＥＴ７４３は、３０％〜７０％阻害した。他の化合物も、阻害活性を示したが、他の２種の上記化合物よりも、低レベルであった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
単球がＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激され、ＥＴ７４３および他のエクテイナシジン化合物で処理された場合、同様な結果が得られたが、全体の阻害は、腫瘍上清がＣＣＬ２誘導刺激として使用された場合の前の実験と比較して、顕著でなかった。
【００６３】
図１０において、ＥＴ６３７誘導体Ａが、ＣＣＬ２産生の有意な阻害を与えることが、確かめられた。
【００６４】
実施例５
エクテイナシジン７４３の、現在卵巣癌において使用される抗新生物剤との比較
エクテイナシジン７４３が活発に、卵巣アデノカルシノーマ処置に向けて研究されているので、エクテイナシジン７４３のこれらの抗炎症効果を、この疾患において従来使用される他の化合物、つまり、ドキソルビシン、シスプラチン、およびタキソールと比較するのが、興味あった。単球が４８時間、指し示された濃度のエクテイナシジン７４３、ドキソルビシン、タキソール、およびシスプラチンと共にインキュベートされた。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。図９Ａは、活性濃度において（＞０．５μＭ）、腫瘍細胞上、ドキソルビシンが高度に、単球上、４８時間の処理後に細胞毒性であったことを示す一方、シスプラチンおよびタキソールはそうではなかった。シスプラチンでの有意な毒性は、非常に高濃度（４０μＭ）においてのみ観察された一方、タキソールは、３００ｎＭにおいてさえ、無効であった。
【００６５】
指し示された用量のこれら抗腫瘍剤で処理されたＬＰＳ刺激単球によるＣＣＬ２およびＴＮＦ産生も、テストされた。細胞上清が２４時間のインキュベート後に回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。図９Ｂにおいて示されるように、タキソールおよびドキソルビシンが無効であったが、ＤＤＰ（シスプラチン）（１０μＭ）がＣＣＬ２産生を抑えた。これらの化合物のいずれもが、ＴＮＦ産生に干渉しなかった。これらの結果は、単球の細胞毒性およびＣＣＬ２の阻害が、卵巣癌処置において従来使用される抗腫瘍剤の一般化された特性でないことを、指し示す。
【００６６】
考察
この研究において、我々は、単核食細胞に関する、エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果を評価してきた。血液を循環している単球が高度に、この薬剤に対して感受性であり、濃度５ｎＭ／４８時間においてアポトーシスを引き起こした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）も、５〜１０ｎＭにおいて感受性であった。これらの値は、有効治療濃度範囲内にある。低濃度のエクテイナシジン７４３において、単球が、マクロファージへのその分化において、阻害された。我々は、これらの結果を、エクテイナシジン７４３治療を受けている担癌患者からの単球を研究していくことにより、確かめている。１２人のテスト患者のうちの６人において、点滴（１３００ｍｇ／ｍ２）３時間後に回収された単球が、治療直前に回収された単球に比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマクロファージの分化の＞５０％の阻害を示した。更に、有意な単球減少が、これらの患者の大多数における薬剤点滴後の最初の数日において観察されている。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるエクテイナシジン７４３に対する簡単な被曝が、単球における細胞毒性効果を提供するに充分であることを指し示す。
【００６７】
我々の仕事の主要な知見は、エクテイナシジン７４３の、炎症サイトカイン産生における阻害活性である。単球／マクロファージにより産生される種々の炎症サイトカインの中でも、我々は、ＩＬ−６、ＴＮＦ、およびケモカインＣＣＬ２をテストしてきた。ＣＣＬ２は、単球および他の白血球（サブセット）を惹き付けるケモカインであり、単球／マクロファージおよび幾つかの腫瘍細胞の両方により、産生される。卵巣アデノカルシノーマ細胞が、莫大な量のＣＣＬ２を産生すること、ならびに、これらのレベルが、腫瘍のマクロファージ含量と相関することが、記載されてきた。ＣＣＬ２はこれゆえ、この腫瘍部位において、単球／マクロファージの動員を統制している最重要因子の内の１種である。エクテイナシジン７４３は強く、ＬＰＳ活性化単球、マクロファージ、およびＴＡＭによるＣＣＬ２放出を、阻害した。エクテイナシジン７４３はまた強く、単離されたての卵巣腫瘍細胞による本来のＣＣＬ２産生を、阻害した。これゆえ、ＴＡＭおよび腫瘍細胞によるより低レベルのＣＣＬ２がよく、その腫瘍部位において動員されるマクロファージ数を減らす。上記のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験において、エクテイナシジン７４３が、１６時間の培養期間を通してずっと、存在していた。我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのエクテイナシジン７４３に対するより短い被曝が、サイトカイン産生に影響を及ぼすに充分であったかどうかも、チェックした。エクテイナシジン７４３に晒された単球が、１時間の培養後に洗浄され、新鮮培中で置き換えられた。これらの条件下に、ＣＣＬ２産生阻害が尚、１６時間の処理を受けている細胞に比較すれば僅かに低かったが、有意であった（それぞれ、５７％および６９％阻害）。
【００６８】
ＩＬ−６は、原炎症サイトカインであり、免疫／造血系における重要な効果を有し、ＣＣＬ２産生のコファクター（共因子）である。加えて、幾つかの研究が、ＩＬ−６が、卵巣癌を包含してある幾つかの腫瘍細胞の成長因子として作用することもあることを指摘している。ＣＣＬ２に関しては、ＬＰＳ誘導ＩＬ−６が劇的に、単球／マクロファージにおいて、エクテイナシジン７４３により減少された。単離されたての腹水腫瘍細胞の本来のＩＬ−６産生も、減少された。
【００６９】
新規な、最近記載された、ＩＬ−６の効果は、Ｔリンパ球を抑制Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介抑制から救うその能力である。Ｔｒｅｇは小さいが、非常に重要なサブセットのＴリンパ球であり、Ｔ細胞の自己反応性を制御し、ホメオスタシス（恒常性）を維持する。Ｔｒｅｇに関する自己免疫疾患における役割は、よく認められている。Ｔｒｅｇにより抑制される自己反応性Ｔリンパ球は、ＩＬ−６により救われ得、こうして、自己免疫反応を永続していく。これゆえ、エクテイナシジン７４３媒介によるＩＬ−６の抑制は、好ましい治療効果たり得る。エクテイナシジン７４３は決して、慢性炎症疾患処置用には考えられてこなかった。この研究の結果は、抗原提示細胞（つまり、単球）前駆細胞におけるその細胞毒性効果と、ＩＬ−６を減少させるその能力との両方に関して、エクテイナシジン７４３が、抗炎症治療における興味ある候補であることを指摘する。
【００７０】
ＣＣＬ２およびＩＬ−６とは違って、エクテイナシジン７４３は、もう１種別の重要な炎症メディエーターであり、ＬＰＳ刺激単球／マクロファージにより産生されるＴＮＦの産生には、有意な効果を全く持たなかった。
【００７１】
我々は、他のエクテイナシジン化合物がＥＴ７４３同様、ヒト単球によるＣＣＬ２産生を阻害できることを、実証した。テスト化合物から、ＥＴ６３７誘導体Ａが、ＣＣＬ２産生を下方修正させる顕著で一貫した能力を示している。ＥＴ６３７誘導体Ａの阻害の程度は、ＥＴ７４３に比較して、更により際立っていた。他の化合物も、阻害活性を示したが、より低レベルにおいてであった。
【００７２】
結論として、エクテイナシジン７４３および他のエクテイナシジン化合物が、単球／マクロファージの生存率および機能に影響を及ぼすとの知見が、これらの化合物の新規な効果および新たな治療指針を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】パネルＡ：エクテイナシジン７４３と共に培養された血液（中の）単球、リンパ球、および胸腺細胞の、細胞生存率。 パネルＢ：エクテイナシジン７４３処理された単球のアポトーシス。
【図２】Ｍ−ＣＳＦ前処理が一部、単球を、エクテイナシジン７４３の原アポトーシス効果から保護する。
【図３】パネルＡ：単球へのエクテイナシジン７４３の細胞毒性効果の速度論。 パネルＢ：マクロファージの分化の阻害。
【図４】パネルＡ：同一ドナーからの単球およびマクロファージの、ＥＴ７４３に対する感受性。 パネルＢ：古典経路で、ＬＰＳとＩＦＮ−γとにより、あるいは、ＩＬ−４により活性化されたマクロファージの、ＥＴ７４３に対する感受性。 パネルＣ：腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の、ＥＴ７４３に対する感受性。
【図５】腫瘍患者におけるエクテイナシジン７４３のｉｎ ｖｉｖｏ点滴が、一過性の単球減少を誘導する。
【図６】エクテイナシジン７４３が、単球およびマクロファージによるＣＣＬ２（パネルＡ）およびＩＬ−６（パネルＢ）産生を阻害する。
【図７】エクテイナシジン７４３が、ＴＡＭおよび単離したての腫瘍細胞におけるＣＣＬ２（パネルＡ）およびＩＬ−６（パネルＢ）産生を阻害する。
【図８】パネルＡ：エクテイナシジン７４３は、単球、マクロファージ、およびＴＡＭによるＴＮＦ産生に影響を及ぼさない。 パネルＢ：エクテイナシジン７４３に晒されたＬＰＳ刺激単球における、ＣＣＬ２およびＴＮＦの転写産物のリアルタイムのＰＣＲ。
【図９】パネルＡ：エクテイナシジン７４３、ドキソルビシン、タキソール、およびＣｉｓ−ＤＤＰの、単球への細胞毒性。アスタリスク（＊）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された腫瘍細胞株に関する、各薬剤に関するＩＣ５０を指し示す。 パネルＢ：指し示された用量の抗腫瘍剤で処置されたＬＰＳ刺激単球によるＣＣＬ２およびＴＮＦ産生。
【図１０】エクテイナシジン７４３および他のエクテイナシジン化合物で前処理されたＬＰＳ単球による、ＣＣＬ２分泌。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤に関する。より具体的には、本発明は、抗炎症活性の、既知のクラスの化合物における発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球／マクロファージは、先天的および適応免役（免疫）の重要な成分と認識されている。循環単球は、変化できる前駆体であり、種々の形の組織マクロファージへと分化する能力を有する。マクロファージは、外来の侵入者に対するガード（防御）に立ち、瞬時に体を病原に対してディフェンス（守備）でき、ならびに、他の免疫担当（適格）細胞動員シグナル（信号）を送り、抗原をＴリンパ球に対して提示できる。もう一方では、マクロファージは、幾つかの疾患の発症もしくは進展においても、示唆されており、主に、原炎症および原血管新生メディエーター産生を経由する。このような病状は例えば、幾つかの慢性疾患（例えば、リューマチ関節炎、アテローム（粥状）硬化、紅斑性狼瘡）および腫瘍において存在する際立った炎症を包含する。
【０００３】
腫瘍部位では、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が、浸潤ストローマ細胞の主要な成分を代表する。ＴＡＭは、複雑な遊走の役割を、腫瘍内で持ち、＜＜マクロファージバランス仮説＞＞において示唆されるとおりである。事実、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで刺激されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージもしくは古典経路で活性化されたマクロファージとも呼ばれる）は、腫瘍細胞を殺す潜在能力を持つが、幾つかの線の証拠が、腫瘍のミクロな環境内のマクロファージが、第２経路で活性化されたマクロファージ、つまりＭ２マクロファージに向かって歪曲されるとの考えを裏付ける。最も頻繁には、ＴＡＭは、非細胞毒性であり、数種の成長および血管新生因子を産生する。ＴＡＭは、免疫抑制分子（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）、および、ケモカインを包含して種々の炎症メディエーターをも産生する。ケモカインは、マトリックスメタロ（金属）プロテアーゼを活性化させ、これは、マトリックス蛋白を消化し、腫瘍播種を促進させる。これゆえ、腫瘍部位でのＴＡＭの蓄積および炎症分子の連続発現が実際に、腫瘍進展を煽ることがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）化合物は、天然および合成化合物を包含する。これらは、縮合した５環系および１，４−架橋を保有する。我々は、抗炎症活性（作用）を、これらエクテイナシジン化合物において見出した。このような化合物は広く記載されており、以降の一般式（Ｉ）：
【０００５】
【化１】
【０００６】
を持ってよく、式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する。
【０００７】
これゆえ、本発明は、炎症を処置していく方法を提供し、これは、一般式（Ｉ）を持っている有効量のエクテイナシジン化合物の投与を含む。
【０００８】
本発明は、一般式（Ｉ）を持っているエクテイナシジンを、医薬として許容可能な担体もしくは稀釈剤と共に含んでいる医薬品をも提供する。
【０００９】
本発明は更に、一般式（Ｉ）を持っているエクテイナシジンの、炎症処置における使用のための医薬品調製における使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
我々は、エクテイナシジン化合物が、抗炎症活性を保有することを見出した。これゆえ、本発明は、上で定義されたような一般式（Ｉ）の化合物に関する新たな医療指針に関する。
【００１１】
これらの化合物において、その置換基は、以降のガイダンスに従って、選択され得る。
【００１２】
アルキルおよびアルコキシ基は、好ましくは、１〜１２炭素原子を持つ。１つのより好ましいクラス（分類）のアルキルおよびアルコキシ基は、１〜約６炭素原子、最も好ましくは、１、２、３、もしくは４炭素原子を持つ。メチル、エチル、および、イソプロピルを包含してプロピルが、本発明の化合物において、特に好ましいアルキル基である。メトキシ、エトキシ、および、イソプロポキシを包含してプロポキシが、本発明の化合物において、特に好ましいアルキル基である。もう１つ別のより好ましいクラスのアルキルおよびアルコキシ基は、４〜約１２炭素原子、尚より好ましくは、５〜約８炭素原子、最も好ましくは、５、６、７、もしくは８炭素原子を持つ。本明細書において使用される場合、この用語アルキルとは、他に修飾されなければ、環状および非環状基両方に関するが、環状基は、少なくとも３員環炭素を含むことになる。
【００１３】
本発明の化合物における好ましいアルケニルおよびアルキニル基は、１つ以上の不飽和結合および２〜約１２炭素原子を持つ。１つのより好ましいクラスのアルケニルもしくはアルキニル基は、２〜約６炭素原子、最も好ましくは、２、３、もしくは４炭素原子を持つ。もう１つ別のより好ましいクラスのアルケニルもしくはアルキニル基は、４〜約１２炭素原子、尚より好ましくは、５〜約８炭素原子、最も好ましくは、５、６、７、もしくは８炭素原子を持つ。これらの用語アルケニルおよびアルキニルとは、本明細書において使用される場合、環状および非環状基両方に関する。
【００１４】
本発明の化合物における適切なアリール基は、単および多環化合物を包含し、分離および／または縮合したアリール基を含有する多環化合物も包含する。典型的なアリール基は、１〜３の分離もしくは縮合した環と、６〜約１８炭素環原子とを含有する。特に好ましいアリール基は、置換もしくは非置換フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントリル、およびアントラシルを包含する。
【００１５】
適切なアルカノイルオキシおよびアルカノイル基は、２〜約２０炭素原子、より好ましくは、２〜約８炭素原子、尚より好ましくは、２〜約６炭素原子、もっとより好ましくは、２炭素原子を持つ。もう１つ別の好ましいクラスのアルカノイルオキシ基は、１２〜約２０炭素、尚より好ましくは、１４〜約１８炭素原子、最も好ましくは、１５、１６、１７、もしくは１８炭素原子を持つ。
【００１６】
上記の基は、１カ所以上の利用できる位置において、１つ以上の適切な基により、置換されてよく、ＯＲ’、＝Ｏ、ＳＲ’、ＳＯＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＮＯ２、ＮＨＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、＝Ｎ−Ｒ’、ＮＨＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）２、ＮＨＳＯ２Ｒ’、ＣＮ、ハロゲン、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’のようなものであり、式中、各Ｒ’基は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＮ、ハロゲン、＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、ならびに、置換もしくは非置換アリールからなる群から選択される。本発明の化合物における適切なハロゲン置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを包含する。
【００１７】
本発明の好ましい化合物は、一般式（Ｉ）のものであり、式中、１つ以上の以降の定義が適用される。
Ｒ５は、アルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、メチルであり；
Ｒ１２は、メチルであり；
Ｒ１６は、メチルであり；
Ｒ１７は、メトキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮであり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂがアミド基であるか、または、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
を形成する。
【００２０】
本発明用の化合物の例は、エクテイナシジン７４３のような天然エクテイナシジン、ならびに、例えば、米国特許第５，０８９，２７３号明細書、米国特許第５，４７８，９３２号明細書、米国特許第５，６５４，４２６号明細書、米国特許第５，７２１，３６２号明細書、米国特許第６，１２４，２９３号明細書、米国特許第５，１４９，８０４号明細書、米国特許第０９／５４６，８７７号明細書、米国特許第５，９８５，８７６号明細書、および国際公開（ＷＯ）０１／７７１１５号において開示される他の１，４−架橋縮合エクテイナシジン化合物を包含する。
【００２１】
エクテイナシジン７４３はＥＴ７４３としても知られ、エクテイナシジン７４３が特に好ましい。ＥＴ７４３は天然物であり、海産被嚢類Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎｉａ ｔｕｒｂｉｎａｔａ由来であり、潜在的な抗腫瘍活性を有する。これは新規で有効な薬剤であり、現在、臨床試験段階にあり、軟組織サルコーマ、乳癌、および卵巣癌を包含してある幾つかのヒト固形腫瘍において抗癌活性を示している。
【００２２】
以降の式（ＩＩＩ）の化合物が、特に好ましい。
【００２３】
【化３】
【００２４】
式中、Ｒａが水素でＲｂが式−ＮＨＲｆ−のアミドであり、式中、Ｒｆがアルカノイルであるか、あるいは、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、あるいは、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【００２５】
【化４】
【００２６】
を形成し、Ｒｄがアルカノイルであり、そして、Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮである。
【００２７】
これらアルカノイル基は、アセチル以上、例えば、Ｃ２０までであり得る。
【００２８】
これゆえ、本発明の好ましい化合物は：
【００２９】
【化５】
【００３０】
ならびに異なるアシル基を有する関連化合物を包含する。
【００３１】
本発明により提供される医薬品は医薬組成物であり、本エクテイナシジン化合物、および、医薬として許容可能な担体を含んでいる。医薬品は従来の形のものであり得、適切な投薬手順がなされ得る。
【００３２】
指し示されているように、本発明の化合物は、抗炎症剤として有用である。これゆえ、これら化合物は、炎症を患う疾患の処置において、特に、慢性炎症および自己免疫疾患（例えば、リューマチ関節炎、Ｓｊｏｇｒｅｎ病、Ｃｒｏｈｎ病）ならびにアテローム硬化の処置において、使用され得る。
【実施例】
【００３３】
本研究において、我々は、薬理的範囲内濃度において、エクテイナシジン７４３が、選択毒性を骨髄系列に関して示し、単球／マクロファージのアポトーシスを誘導したことを実証する。非細胞毒性濃度において、エクテイナシジン７４３が有意に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの分化を阻害し、選択された炎症サイトカインの産生を抑えた。これらの知見は、幾つかのヒト疾患における単球／マクロファージを標的化していくことを狙いとされる治療アプローチに関連していることがある。
【００３４】
ＥＴ７４３に加えて、ＥＴ６３７誘導体Ａ、ＥＴ６３７誘導体Ｂ、ＥＴ５９４、ＥＴ７４３誘導体Ａ、およびＥＴ７４５も、テストされた。これらも、選択された炎症サイトカイン産生を抑えると示された。
【００３５】
材料および方法
細胞調製：
精製された集団のヒト血液（中の）単球が、以前記載されたように（Ａｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．、Ｐｉｅｍｏｎｔｉ、Ｌ．、Ｌｏｎｇｏｎｉ、Ｄ．、Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ、Ｓ．、Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ、Ａ．、Ｒｕｃｏ、Ｌ．、およびＭａｎｔｏｖａｎｉ、Ａ．＜＜ＩＬ−１０は、樹状細胞への単球の分化を防ぐが、マクロファージへのその成熟を促進する＞＞Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：３５９−３６９，１９９８参照）、ＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌ勾配上での差別化密度遠心により、調製された。単球は通常＞８５％、ＣＤ１４＋細胞であった。精製されたＴリンパ球（＞９５％ＣＤ３＋）が、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上、以前記載されたように（Ｃｈｉｅｐｐａ、Ｍ．、Ｂｉａｎｃｈｉ、Ｇ．、Ｄｏｎｉ、Ａ．、Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅ、Ａ．、Ｓｉｒｏｎｉ、Ｍ．、Ｌａｓｋａｒｉｎ、Ｇ．、Ｍｏｎｔｉ、Ｐ．、Ｐｉｅｍｏｎｔｉ、Ｌ．、Ｂｉｏｎｄｉ、Ａ．、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ、Ａ．、Ｉｎｔｒｏｎａ、Ｍ．、およびＡｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．＜＜単球由来樹状細胞上のマンノースレセプター（受容体）の架橋が、抗炎症免疫抑制プログラムを活性化させる＞＞Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４５５２−４５６０，２００３参照）して、得られた。ヒト胸腺細胞が、外科手術を受けている小児患者から切除された胸腺から、単離された。胸腺細胞が、梳解していくことにより得られ、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上で単離された。
【００３６】
細胞が、１０６細胞／ｍＬで、完全培地ＲＰＭＩ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＦＲＧ）＋１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中、培養された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させられたマクロファージが、単球培養（単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（２０ｎｇ／ｍＬ）５日間）により、得られた。ある幾つかの実験において、マクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＦＮ−γ（５００ＩＵ／ｍＬ）もしくはＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）で２４時間、処理された。
【００３７】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および腫瘍細胞が、ミラノ−ビコッカ（Ｍｉｌａｎ−Ｂｉｃｏｃｃａ）大学Ｓ．ジェラルド（Ｇｅｒａｒｄｏ）病院産婦人科医院に入院された卵巣アデノカルシノーマと診断された患者の腹水から単離された。該腹水中に含有された細胞が遠心され、ＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌの識別密度勾配ならびにプラスチックに対する接着により、以前記載されたように単離された（Ａｌｌａｖｅｎａ、Ｐ．、Ｐｅｃｃａｔｏｒｉ、Ｆ．、Ｍａｇｇｉｏｎｉ、Ｄ．、Ｅｒｒｏｉ、Ａ．、Ｓｉｒｏｎｉ、Ｍ．、Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｎ．、Ｌｉｓｓｏｎｉ、Ａ．、Ｇａｌａｚｋａ、Ａ．、Ｍｅｉｅｒｓ、Ｗ．、Ｍａｎｇｉｏｎｉ、Ｃ．等＜＜再発腹水卵巣カルシノーマ患者における腹腔内組み換えγ−ＩＮＦ：腫瘍関連エフェクターにおける細胞毒性およびサイトカイン産生ならびに腫瘍細胞上での主要組織適合抗原発現の調節＞＞Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：７３１８−７３２３，１９９０参照）。ＴＡＭ精製および腫瘍細胞調製は通常＞６５±１０％であり、形態および表現型分析により定められるとおりであった。細胞が、エクテイナシジン７４３を用いて、指し示された濃度において処理され、１〜５日間培養され、図面の指示において特定されるとおりであった。インキュベート期間の終わりに、細胞が回収され、洗浄され、ＤＮＡ解析もしくは機能アッセイに使用された。
【００３８】
細胞生存率の決定
細胞生存率が、ＤＮＡ含量により、フローサイトメトリーにおいて、分析された。
処理に晒された細胞が、７０％エタノールを用いて固定され、ＰＢＳ中洗浄され、１０μｇ／ｍＬのＰＩをＰＢＳ中において、および、２５μＬのＲＮＡｓｅ１０，０００単位を含有している沃化プロピジウム（ＰＩ）溶液を用いて終夜暗所において、染色された。ＰＩ取り込みが、少なくとも２０，０００細胞／サンプルにおいて評価され、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、６２０ｎｍの通過帯フィルターを用いた。アポトーシスが、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩを用いて染色していくことにより、検出された。ＦＡＣＳ分析が実施され、５３０および６２０ｎｍの通過帯フィルターを、それぞれ緑（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）および赤（ＰＩ）の蛍光に、５７０ｎＭの２色鏡と組み合わせて、使用した。
【００３９】
表現型解析
細胞膜マーカー発現が、免疫蛍光により実施され、フローサイトメトリーにより分析された。細胞が、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６８、抗ＣＤ２０６（マンノース受容体）、次いで、ＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇを用いて、記載されたようにインキュベートされた。少なくとも１０，０００細胞が、分析された。
【００４０】
サイトカイン産生
非処理細胞またはエクテイナシジン７４３もしくは他の抗新生物剤を用いて処理された細胞の上清が、２４時間培養後回収され、凍結された。単球、マクロファージ、およびＴＡＭが、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを用いて刺激され、最大サイトカイン産生を誘導した。サイトカインＣＣＬ２、ＴＮＦ、およびＩＬ−６の決定が、製造元の説明書に従って、特異的ＥＬＩＳＡにより、測定された。
【００４１】
腫瘍患者
エクテイナシジン７４３を用いたフェーズＩＩ治験を受けているサルコーマもしくは卵巣癌患者が、欧州腫瘍研究機関（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ミラノ、イタリア）に入院した。患者は、エクテイナシジン７４３（１３００ｍｇ／ｍ２）を、３時間の点滴で与えられた。血液サンプル（４０ｍＬ）が、本処置直前、該点滴の終わりに（３時間）回収された。血液サンプルが直ちに加工され、Ｐｅｒｃｏｌｌ精製単球（通常１０６細胞）がＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を用いて５日間培養された。分化させられた細胞が、上記のように、回収され、数えられ、表現型発現に関して分析された。結果が、絶対数マーカー陽性細胞／１０，０００細胞として、表される。マクロファージの分化の有意な阻害は、同一患者からの、治療前に回収された細胞に対する、マーカー陽性（＋）細胞の５０％抑制と見なされた。
【００４２】
実施例１
エクテイナシジン７４３が、選択的細胞毒性効果を、単核食細胞において示す
我々はまず、エクテイナシジン７４３処理の効果を、ヒト白血球サブセット生存率に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、研究した。血液（中の）単球、リンパ球、および胸腺細胞の精製調製品が、異なる濃度のエクテイナシジン７４３を用いて、４８時間培養された。細胞生存率が、ＤＮＡ解析および沃化プロピジウム（ＰＩ）染色により、フローサイトメトリーにおいて、査定された。血液（中の）単球の精製調製品は高度に、この薬剤の細胞毒性効果に感受性であった。用量依存的な死が、５０％致死用量（ＩＣ５０）の２．５〜５ｎＭを用いた４８時間後の培養において見出された（図１Ａ）。精製Ｔリンパ球は遙かに僅かに感受性であり、５ｎＭにおいて全て生存していた。リンパ球に関するＩＣ５０は、２０ｎＭであった。単離されたての胸腺細胞は、遙かにより耐性であった（ＩＣ５０＞４０ｎＭ、図１Ａ）。
【００４３】
視覚的に、エクテイナシジン７４３に晒された全ての死んでいる単球が、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖに関して陽性に染まり、この薬剤がアポトーシスを誘導することを指し示している（図１Ｂ）。単球の死も、ＤＮＡ解析により、フローサイトメトリーにおいて、確かめられた（図２）。Ｍ−ＣＳＦ、単球の成長および分化因子の存在下に、エクテイナシジン７４３の毒性効果からの一部保護が、観察された。Ｍ−ＣＳＦが、単球の死を、５５％から３０％に、５ｎＭエクテイナシジン７４３において、４８時間のインキュベート後に、６５％から３５％に、１０ｎＭにおいて、２４時間の処理後に、シフトさせた（図２）。Ｍ−ＣＳＦは、エクテイナシジン７４３と同時もしくは前に加えられた場合のみ有効であったが、もはや、この薬剤の４時間後に与えられた場合、有効でなかった。
【００４４】
エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果の速度論的解析が、Ｍ−ＣＳＦ存在下に実施された。細胞が、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および異なる濃度のエクテイナシジン７４３を用いて処理された。サンプルが、指し示された時間において回収され、ＤＮＡ解析用にテストされた。より高濃度において、有意な毒性が既に、２４時間のインキュベート後に観察され、ずっと上昇した（図３Ａ）。より低濃度（２．５ｎＭ）は、４０〜５０％の死を、５日後に誘導した。
【００４５】
我々は次に、エクテイナシジン７４３の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて５日間、Ｍ−ＣＳＦと共に培養された単球から得られた既に分化したマクロファージに関して、研究した。最後の４８時間におけるエクテイナシジン７４３の添加が結果的に有意な死をもたらしたが、単離したての単球に比較して、より低い程度であった。図４Ａは、同一ドナーからの単球およびマクロファージの感受性を比較している代表的な実験を示す。単球が、マクロファージに、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）との培養により、分化した。３日目に、エクテイナシジン７４３が、培養に加えられ、４８時間、インキュベートされた。結果は、同一ドナーから得られた単球およびマクロファージの比較を示す。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。同様な結果が、他の４実験において得られた。一連の異なる４実験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したものに関するＩＣ５０は、１０ｎＭであった。
【００４６】
我々は次いで、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γにより古典経路で活性化されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージ）ならびにＩＬ−４により第２経路で活性化されたマクロファージ（Ｍ２マクロファージ）の、エクテイナシジン７４３に対する感受性をテストした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−γ（５００ＵＩ：ｍＬ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）を用いて、エクテイナシジン７４３存在下もしくは非存在下に、４８時間刺激された。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。ＬＰＳ刺激およびＩＬ−４刺激両方のマクロファージが、非刺激マクロファージ同様、薬剤処理に対して感受性であった（図４Ｂ）。
【００４７】
我々はまた、非処置卵巣アデノカルシノーマ患者の腹水から単離された腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をも、テストした。異なる３人の卵巣癌患者から単離されたＴＡＭ強化調製品が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、エクテイナシジン７４３を用いて、４８時間処理された。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。ＴＡＭが有意に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、エクテイナシジン７４３により殺傷され、１０ｎＭにおいて、４０〜７０％殺傷率であった。異なる３人の患者からの結果が、図４Ｃにおいて示される。
【００４８】
これらの実験全体が、ヒト単核食細胞が高度に、治療範囲内濃度において、エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果に対して感受性であることを実証する。Ｍ−ＣＳＦ存在下でさえ、単球が決して、細胞周期を進まなかったことが、記されるべきであり、フローサイトメトリーを用いたＤＮＡ解析によりチェックされたとおりであった。単球におけるエクテイナシジン７４３の毒性効果はこれゆえ、細胞周期から独立しており、非複製細胞におけるこの薬剤の生物学的効果を研究する唯一の機会を提供する。
【００４９】
実施例２
非細胞毒性濃度のエクテイナシジン７４３が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、マクロファージの分化を阻害する
マクロファージの分化に関するエクテイナシジン７４３の効果を研究するために、非細胞毒性用量のこの薬剤が使用された。単球が、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および細胞毒性濃度以下のエクテイナシジン７４３と共に、５日間培養された。表現型の分析が、間接免疫蛍光により実施され、フローサイトメトリーにおいて、巨大細胞上で開閉させて、分析された。通常、平均６５±１５％（＞１０の実験の平均±ＳＤ）のインプット（入力）の単球が、ＣＤ１６、ＣＤ６８、およびＣＤ２０６（マンノース受容体）を包含して典型的なマクロファージマーカーを発現している巨大細胞へと分化する。５日の培養後、単球生存率が、フローサイトメトリーにおける沃化プロピジウム染色により評価され、０．５および１ｎＭエクテイナシジン７４３において、それぞれ９２％および７０％の非処理細胞であった。マクロファージの分化のプロセスが一部、ｄｅ ｎｏｖｏ発現のＣＤ６８、ＣＤ１６、およびＣＤ２０６として阻害され、１ｎＭエクテイナシジン７４３において抑えられた（図３Ｂ）。
【００５０】
上のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける知見を評価するために、我々は、腫瘍患者におけるエクテイナシジン７４３のｉｎ ｖｉｖｏ投与が、単球生存率に関する計測可能な効果ならびにマクロファージの分化に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける許容量を持ち得るかどうか、テストした。エクテイナシジン７４３を用いるフェーズＩＩ治験が現在、進行卵巣アデノカルシノーマ患者において進行中であり、彼らは、２とおりの異なるサイクルの従来のシスプラチンおよびタキソール主体の化学療法に失敗していた。この研究のために選択された腫瘍患者は、１３００μｇ／ｍＬ／ｍ２のエクテイナシジン７４３を用いて処置された。患者からの血液サンプルが、薬剤投与直前および３時間の点滴の終わりに、採血された。精製単球が直ちに単離され、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）と共に５日間培養され、マクロファージの分化を誘導させ、次いで、表現型発現用に分析された。１２人の評価可能な患者の内、６被験者からの単球が、エクテイナシジン７４３処理後に、マクロファージの分化の減少を示した。表１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化された患者からのマクロファージの表現型分析を示し、彼らの細胞は、治療後に、治療前に回収された細胞に比較して、ＣＤ２０６、ＣＤ１６、およびＣＤ６８発現の少なくとも５０％阻害を示した。示されるデータは、全１０，０００の入力細胞についての、マーカー陽性細胞の絶対数である。他の６人の患者から回収された単球は、如何なる有意な減少をも、それらの分化能において、示さなかった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
我々はまた、エクテイナシジン７４３を用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける処理が、測定可能な単球減少を、癌患者において引き起こしたかどうかも、調べた。単球の値は、血液製剤から、通常の臨床分析の間に、得られた。単球形態分析が記録され利用可能であった９患者の内、７患者が、単球数の減少を示し（少なくとも１サイクルにおいて、点滴前の値に比較して２５％阻害）、全白血球に亘る単球％および単球／μＬ血液の絶対数両方で評価された。３人の代表の患者からの結果が、図５において示される。全数白血球における一定レベルもしくは一過的な増加にもかかわらず、薬剤点滴後最初の数日において、単球は決して増加せず、実際に頻繁に減少した。
【００５３】
実施例３
エクテイナシジン７４３は、炎症サイトカイン／ケモカイン産生を阻害する
単球／マクロファージは、炎症／免疫応答を司る可溶性因子の、潜在産生者である。我々はこれゆえ、これらの細胞の分泌機能に関するエクテイナシジン７４３処理効果をテストした。ケモカインＣＣＬ２は、単核食細胞の主要走化因子であり、免疫および幾つかの腫瘍細胞により、産生される。腫瘍由来ＣＣＬ２は、循環している単球を、その腫瘍部位において惹き付け、腫瘍ＴＡＭ含量は、ＣＣＬ２レベルと相関し、幾つかの腫瘍において実証されているとおりである。
【００５４】
単球およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化されたマクロファージが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激された。１時間のＬＰＳ刺激後、それらは、エクテイナシジン７４３処理された。１６時間のインキュベート後、細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。これらの処理条件下、５ｎＭまでの濃度に関して、細胞生存率は通常＞８５％であった。エクテイナシジン７４３処理は用量依存的に、ＬＰＳ刺激単球およびｉｎ ｖｉｔｒｏ由来マクロファージによるＣＣＬ２産生を抑えた（図６Ａ）。５ｎＭでの平均阻害は、単球に関しては、６５％（５０〜８０％の範囲、ｎ＝５）であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージに関しては、５０％（２５〜７５％の範囲、ｎ＝５）であった。結果は、３〜５実験の平均±ＳＥである。
【００５５】
次に、卵巣カルシノーマに関連したＴＡＭが、テストされた。単離したての卵巣腫瘍細胞およびＴＡＭが、エクテイナシジン７４３と共に１６時間インキュベートされた。ＴＡＭが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激された。細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。結果は、ＴＡＭに関しては、４実験の平均±ＳＥであり、腫瘍細胞に関しては、１実験からである。ＬＰＳ刺激によるＣＣＬ２産生は、５０％抑制され（４０〜６０％の範囲、ｎ＝４）（図７Ａ）、一方、それらの本来の産生は、４３％抑制された（３０〜５０％の範囲、ｎ＝４）。
【００５６】
我々は、２種の他のサイトカインＩＬ−６およびＴＮＦをもテストし、これらは、マクロファージおよび腫瘍細胞により産生され、炎症特性を持ち、ある幾つかの腫瘍の成長因子としても作用する。ＩＬ−６産生はいつも、エクテイナシジン７４３処理後に抑えられ、全体としての阻害は、５ｎＭにおいて、単球およびマクロファージにおいて、それぞれ５４％（５１〜５７％の範囲、ｎ＝２）および６９％（６６〜７２％の範囲、ｎ＝２）であった（図６Ｂ）。ＴＡＭにおけるＩＬ−６放出は幾らか、処理に対してより耐性であり、５ｎＭにおいて、平均阻害が３５％（２５〜５３％の範囲、ｎ＝４）、１０ｎＭにおいて、４７％（３３〜６３％の範囲、ｎ＝４）であった（図７Ｂ）。
【００５７】
興味あることに、エクテイナシジン７４３は、単離したての腫瘍細胞によるＣＣＬ２およびＩＬ−６の本来の産生をも抑えた。代表的な実験が、図７において示される。
【００５８】
対照的に、そして、非常に驚くべきことに、単球、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージ、およびＴＡＭが、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激され、エクテイナシジン７４３処理され、１時間のＬＰＳ刺激を進められ、そして１６時間のインキュベート後に、細胞上清が回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた場合、単球／マクロファージにより、ならびに、ＴＡＭによるＴＮＦ産生が、ＴＡＭに関して（図８Ａ）１０ｎＭまでさえも、決して阻害されなかったことが観察され、エクテイナシジン７４３が、選択された遺伝子にしか干渉しないことを示唆している。これらの結果は、これらの条件下に、細胞が本処理により損傷されなかったことも、指し示している。サイトカイン産生に関するエクテイナシジン７４３の阻害効果がその転写レベルにあったかどうかを証明すべく、我々は、ＬＰＳ刺激マクロファージからのＣＣＬ２およびＴＮＦのｍＲＮＡを、エクテイナシジン７４３に晒されたＬＰＳ刺激単球におけるＣＣＬ２およびＴＮＦ転写産物のリアルタイムのＰＣＲにより、解析した。図８Ｂにおいて示されるように、エクテイナシジン７４３処理後、ＣＣＬ２転写産物の一貫した抑制が観察され、一方、ＴＮＦｍＲＮＡは、Ｅｌｉｓａにおいて得られた結果では、影響を受けなかった。
【００５９】
これらの結果全体が、薬理濃度におけるエクテイナシジン７４３が、２種の重要な炎症サイトカイン産生を、単核食細胞および腫瘍細胞において抑えることを指し示す。
【００６０】
実施例４
他のエクテイナシジン化合物も、炎症サイトカイン／ケモカイン産生を阻害する
我々は、５種の他のエクテイナシジン化合物（表２）も、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト単球によるＣＣＬ２産生の、それらの阻害能に関して、テストした。これら５種のテスト化合物の内、ＥＴ６３７誘導体Ａのみが、単球による炎症サイトカイン産生を、濃度２．５および５ｎＭにおいて下方修正させる顕著で一貫した能力を示した。これらの濃度は、単球生存率に、４８時間の被曝後に、影響を及ぼさなかった。ＥＴ６３７誘導体Ａの阻害の程度は、ＥＴ７４３に比較して、更により際立っていた。表２において、ＣＣＬ２産生が、腫瘍細胞上清に対する単球の被曝により誘導され、異なる２人のドナーにおいて、２．５および５ｎＭにおいて、それぞれ８０％および９７％まで阻害されることが、示される。同一の実験において、ＥＴ７４３は、３０％〜７０％阻害した。他の化合物も、阻害活性を示したが、他の２種の上記化合物よりも、低レベルであった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
単球がＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激され、ＥＴ７４３および他のエクテイナシジン化合物で処理された場合、同様な結果が得られたが、全体の阻害は、腫瘍上清がＣＣＬ２誘導刺激として使用された場合の前の実験と比較して、顕著でなかった。
【００６３】
図１０において、ＥＴ６３７誘導体Ａが、ＣＣＬ２産生の有意な阻害を与えることが、確かめられた。
【００６４】
実施例５
エクテイナシジン７４３の、現在卵巣癌において使用される抗新生物剤との比較
エクテイナシジン７４３が活発に、卵巣アデノカルシノーマ処置に向けて研究されているので、エクテイナシジン７４３のこれらの抗炎症効果を、この疾患において従来使用される他の化合物、つまり、ドキソルビシン、シスプラチン、およびタキソールと比較するのが、興味あった。単球が４８時間、指し示された濃度のエクテイナシジン７４３、ドキソルビシン、タキソール、およびシスプラチンと共にインキュベートされた。生存率が、ＰＩ染色により査定され、フローサイトメトリーにより分析された。図９Ａは、活性濃度において（＞０．５μＭ）、腫瘍細胞上、ドキソルビシンが高度に、単球上、４８時間の処理後に細胞毒性であったことを示す一方、シスプラチンおよびタキソールはそうではなかった。シスプラチンでの有意な毒性は、非常に高濃度（４０μＭ）においてのみ観察された一方、タキソールは、３００ｎＭにおいてさえ、無効であった。
【００６５】
指し示された用量のこれら抗腫瘍剤で処理されたＬＰＳ刺激単球によるＣＣＬ２およびＴＮＦ産生も、テストされた。細胞上清が２４時間のインキュベート後に回収され、ＥＬＩＳＡにおいてテストされた。図９Ｂにおいて示されるように、タキソールおよびドキソルビシンが無効であったが、ＤＤＰ（シスプラチン）（１０μＭ）がＣＣＬ２産生を抑えた。これらの化合物のいずれもが、ＴＮＦ産生に干渉しなかった。これらの結果は、単球の細胞毒性およびＣＣＬ２の阻害が、卵巣癌処置において従来使用される抗腫瘍剤の一般化された特性でないことを、指し示す。
【００６６】
考察
この研究において、我々は、単核食細胞に関する、エクテイナシジン７４３の細胞毒性効果を評価してきた。血液を循環している単球が高度に、この薬剤に対して感受性であり、濃度５ｎＭ／４８時間においてアポトーシスを引き起こした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したマクロファージおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）も、５〜１０ｎＭにおいて感受性であった。これらの値は、有効治療濃度範囲内にある。低濃度のエクテイナシジン７４３において、単球が、マクロファージへのその分化において、阻害された。我々は、これらの結果を、エクテイナシジン７４３治療を受けている担癌患者からの単球を研究していくことにより、確かめている。１２人のテスト患者のうちの６人において、点滴（１３００ｍｇ／ｍ２）３時間後に回収された単球が、治療直前に回収された単球に比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマクロファージの分化の＞５０％の阻害を示した。更に、有意な単球減少が、これらの患者の大多数における薬剤点滴後の最初の数日において観察されている。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるエクテイナシジン７４３に対する簡単な被曝が、単球における細胞毒性効果を提供するに充分であることを指し示す。
【００６７】
我々の仕事の主要な知見は、エクテイナシジン７４３の、炎症サイトカイン産生における阻害活性である。単球／マクロファージにより産生される種々の炎症サイトカインの中でも、我々は、ＩＬ−６、ＴＮＦ、およびケモカインＣＣＬ２をテストしてきた。ＣＣＬ２は、単球および他の白血球（サブセット）を惹き付けるケモカインであり、単球／マクロファージおよび幾つかの腫瘍細胞の両方により、産生される。卵巣アデノカルシノーマ細胞が、莫大な量のＣＣＬ２を産生すること、ならびに、これらのレベルが、腫瘍のマクロファージ含量と相関することが、記載されてきた。ＣＣＬ２はこれゆえ、この腫瘍部位において、単球／マクロファージの動員を統制している最重要因子の内の１種である。エクテイナシジン７４３は強く、ＬＰＳ活性化単球、マクロファージ、およびＴＡＭによるＣＣＬ２放出を、阻害した。エクテイナシジン７４３はまた強く、単離されたての卵巣腫瘍細胞による本来のＣＣＬ２産生を、阻害した。これゆえ、ＴＡＭおよび腫瘍細胞によるより低レベルのＣＣＬ２がよく、その腫瘍部位において動員されるマクロファージ数を減らす。上記のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験において、エクテイナシジン７４３が、１６時間の培養期間を通してずっと、存在していた。我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのエクテイナシジン７４３に対するより短い被曝が、サイトカイン産生に影響を及ぼすに充分であったかどうかも、チェックした。エクテイナシジン７４３に晒された単球が、１時間の培養後に洗浄され、新鮮培中で置き換えられた。これらの条件下に、ＣＣＬ２産生阻害が尚、１６時間の処理を受けている細胞に比較すれば僅かに低かったが、有意であった（それぞれ、５７％および６９％阻害）。
【００６８】
ＩＬ−６は、原炎症サイトカインであり、免疫／造血系における重要な効果を有し、ＣＣＬ２産生のコファクター（共因子）である。加えて、幾つかの研究が、ＩＬ−６が、卵巣癌を包含してある幾つかの腫瘍細胞の成長因子として作用することもあることを指摘している。ＣＣＬ２に関しては、ＬＰＳ誘導ＩＬ−６が劇的に、単球／マクロファージにおいて、エクテイナシジン７４３により減少された。単離されたての腹水腫瘍細胞の本来のＩＬ−６産生も、減少された。
【００６９】
新規な、最近記載された、ＩＬ−６の効果は、Ｔリンパ球を抑制Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介抑制から救うその能力である。Ｔｒｅｇは小さいが、非常に重要なサブセットのＴリンパ球であり、Ｔ細胞の自己反応性を制御し、ホメオスタシス（恒常性）を維持する。Ｔｒｅｇに関する自己免疫疾患における役割は、よく認められている。Ｔｒｅｇにより抑制される自己反応性Ｔリンパ球は、ＩＬ−６により救われ得、こうして、自己免疫反応を永続していく。これゆえ、エクテイナシジン７４３媒介によるＩＬ−６の抑制は、好ましい治療効果たり得る。エクテイナシジン７４３は決して、慢性炎症疾患処置用には考えられてこなかった。この研究の結果は、抗原提示細胞（つまり、単球）前駆細胞におけるその細胞毒性効果と、ＩＬ−６を減少させるその能力との両方に関して、エクテイナシジン７４３が、抗炎症治療における興味ある候補であることを指摘する。
【００７０】
ＣＣＬ２およびＩＬ−６とは違って、エクテイナシジン７４３は、もう１種別の重要な炎症メディエーターであり、ＬＰＳ刺激単球／マクロファージにより産生されるＴＮＦの産生には、有意な効果を全く持たなかった。
【００７１】
我々は、他のエクテイナシジン化合物がＥＴ７４３同様、ヒト単球によるＣＣＬ２産生を阻害できることを、実証した。テスト化合物から、ＥＴ６３７誘導体Ａが、ＣＣＬ２産生を下方修正させる顕著で一貫した能力を示している。ＥＴ６３７誘導体Ａの阻害の程度は、ＥＴ７４３に比較して、更により際立っていた。他の化合物も、阻害活性を示したが、より低レベルにおいてであった。
【００７２】
結論として、エクテイナシジン７４３および他のエクテイナシジン化合物が、単球／マクロファージの生存率および機能に影響を及ぼすとの知見が、これらの化合物の新規な効果および新たな治療指針を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】パネルＡ：エクテイナシジン７４３と共に培養された血液（中の）単球、リンパ球、および胸腺細胞の、細胞生存率。 パネルＢ：エクテイナシジン７４３処理された単球のアポトーシス。
【図２】Ｍ−ＣＳＦ前処理が一部、単球を、エクテイナシジン７４３の原アポトーシス効果から保護する。
【図３】パネルＡ：単球へのエクテイナシジン７４３の細胞毒性効果の速度論。 パネルＢ：マクロファージの分化の阻害。
【図４】パネルＡ：同一ドナーからの単球およびマクロファージの、ＥＴ７４３に対する感受性。 パネルＢ：古典経路で、ＬＰＳとＩＦＮ−γとにより、あるいは、ＩＬ−４により活性化されたマクロファージの、ＥＴ７４３に対する感受性。 パネルＣ：腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の、ＥＴ７４３に対する感受性。
【図５】腫瘍患者におけるエクテイナシジン７４３のｉｎ ｖｉｖｏ点滴が、一過性の単球減少を誘導する。
【図６】エクテイナシジン７４３が、単球およびマクロファージによるＣＣＬ２（パネルＡ）およびＩＬ−６（パネルＢ）産生を阻害する。
【図７】エクテイナシジン７４３が、ＴＡＭおよび単離したての腫瘍細胞におけるＣＣＬ２（パネルＡ）およびＩＬ−６（パネルＢ）産生を阻害する。
【図８】パネルＡ：エクテイナシジン７４３は、単球、マクロファージ、およびＴＡＭによるＴＮＦ産生に影響を及ぼさない。 パネルＢ：エクテイナシジン７４３に晒されたＬＰＳ刺激単球における、ＣＣＬ２およびＴＮＦの転写産物のリアルタイムのＰＣＲ。
【図９】パネルＡ：エクテイナシジン７４３、ドキソルビシン、タキソール、およびＣｉｓ−ＤＤＰの、単球への細胞毒性。アスタリスク（＊）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された腫瘍細胞株に関する、各薬剤に関するＩＣ５０を指し示す。 パネルＢ：指し示された用量の抗腫瘍剤で処置されたＬＰＳ刺激単球によるＣＣＬ２およびＴＮＦ産生。
【図１０】エクテイナシジン７４３および他のエクテイナシジン化合物で前処理されたＬＰＳ単球による、ＣＣＬ２分泌。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
の有効量のエクテイナシジン化合物の投与を含む、炎症を処置する方法。
【請求項２】
前記炎症が、慢性炎症疾患、自己免疫疾患、および粥状硬化からなる群から選択される疾患により引き起こされる、請求項１の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ５がアルカノイルオキシである、請求項１の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ６がメチルである、請求項１の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１２がメチルである、請求項１の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１６がメチルである、請求項１の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１７がメトキシである、請求項１の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１８がＯＨである、請求項１の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮであり、Ｒａが水素であってＲｂがアミド基であるか、または、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【化２】
を形成する、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記エクテイナシジン化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
式中：
Ｒａが水素でＲｂが式−ＮＨＲｆ−のアミドであり、式中、Ｒｆがアルカノイルであるか、あるいは、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、あるいは、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【化４】
を形成し、Ｒｄがアルカノイルであり、そして、Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮである
、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記エクテイナシジン化合物が：
【化５】
からなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
【化６】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
のエクテイナシジン化合物の、請求項１〜１１のいずれか１項の方法における使用のための医薬品の調製における、使用。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）：
【化７】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
のエクテイナシジン化合物、ならびに、医薬として許容可能な担体を含む、炎症処置用医薬品。
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
の有効量のエクテイナシジン化合物の投与を含む、炎症を処置する方法。
【請求項２】
前記炎症が、慢性炎症疾患、自己免疫疾患、および粥状硬化からなる群から選択される疾患により引き起こされる、請求項１の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ５がアルカノイルオキシである、請求項１の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ６がメチルである、請求項１の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１２がメチルである、請求項１の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１６がメチルである、請求項１の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１７がメトキシである、請求項１の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ１８がＯＨである、請求項１の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）のエクテイナシジン化合物において、基Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮであり、Ｒａが水素であってＲｂがアミド基であるか、または、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【化２】
を形成する、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記エクテイナシジン化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
式中：
Ｒａが水素でＲｂが式−ＮＨＲｆ−のアミドであり、式中、Ｒｆがアルカノイルであるか、あるいは、ＲａとＲｂとが＝Ｏを形成するか、あるいは、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素が基式（ＩＩ）：
【化４】
を形成し、Ｒｄがアルカノイルであり、そして、Ｒ２１が、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣＮである
、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記エクテイナシジン化合物が：
【化５】
からなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
【化６】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
のエクテイナシジン化合物の、請求項１〜１１のいずれか１項の方法における使用のための医薬品の調製における、使用。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）：
【化７】
式中：
Ｒ５は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１６は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり；
Ｒ１７は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ１８は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはアルカノイルオキシであり；
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、もしくはもう１つ別の求核基であり；ならびに
Ｒａが水素であってＲｂが任意に置換されたアミノであるか、または、ＲａとＲｂとがカルボニル官能基＝Ｏを形成するか、または、Ｒａ、Ｒｂ、およびこれらが取り付けられている炭素がテトラヒドロイソキノリン基を形成する
のエクテイナシジン化合物、ならびに、医薬として許容可能な担体を含む、炎症処置用医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５１４６８８（Ｐ２００８−５１４６８８Ａ）
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３４０９３（Ｐ２００７−５３４０９３）
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３５２４４
【国際公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【出願人】（５０７１００４７６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＭＡ ＭＡＲ Ｓ．Ａ．， ＳＯＣＩＥＤＡＤ ＵＮＩＰＥＲＳＯＮＡＬ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｌｉｇｏｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｌａ Ｍｉｎａ， Ａｖｄａ． ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ， １， Ｃｏｌｍｅｎａｒ Ｖｉｅｊｏ， ２８７７０ Ｍａｄｒｉｄ， Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３５２４４
【国際公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【出願人】（５０７１００４７６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＭＡ ＭＡＲ Ｓ．Ａ．， ＳＯＣＩＥＤＡＤ ＵＮＩＰＥＲＳＯＮＡＬ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｌｉｇｏｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｌａ Ｍｉｎａ， Ａｖｄａ． ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ， １， Ｃｏｌｍｅｎａｒ Ｖｉｅｊｏ， ２８７７０ Ｍａｄｒｉｄ， Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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