抗真菌物質の製造方法
【課題】 カンジダ属やアスペルギルス属等の真菌に対する抗菌活性があり、しかも扱い易い水溶性の抗真菌物質であるジヒドロフェニルアラニンの製造方法を提供すること。
【解決手段】 ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法を提供する。
【解決手段】 ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗真菌物質の製造方法に関し、詳しくはストレプトミセス属に属する放線菌を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶや癌の治療、そして臓器移植において問題とされているのが、微生物による感染症である。細菌の感染症に対する抗生物質の開発は、すでに確立されている。ＭＲＳＡやＶＲＥ等の薬剤耐性菌の出現という問題もあるが、それ以上に深刻であるのが真菌による感染症である。特に、カンジダ・アルビカンスによるカンジダ症やアスペルギルス属菌によるアスペルギルス症は、移植手術において大きな妨げとなっている（非特許文献１参照）。
【０００３】
酵母および糸状菌は真核生物であり、原核生物である細菌に対して真菌と称されている。ある種の真菌はヒトや動物に対して病原性を示し、真菌感染症の起因菌とされている。これら真菌の病原性は概ね弱いものであるが、抵抗力の低下した状態の患者には、重篤な症状を来すことがある。
真菌による種々の病気は、ヒトや動物の健康に甚大な影響を与えているため、それらの治療に有用な新規薬剤の開発が期待されている。
また、ある種の真菌は植物病原菌として知られており、農業に甚大な被害を与えている。さらに、最近の住宅事情を反映した結露等による住宅への糸状菌の進入は、ヒトにアレルギー等の症状をもたらし、ヒトや動物の健康に悪影響を及ぼしている。これらの有効な対策として、新規抗真菌剤の開発並びに植物防御の面から新たな農園芸用抗真菌剤の開発が期待されている。
【０００４】
従来、これらの問題点を克服すべく、種々の抗真菌剤が開発されており、一応の成果が得られているが、前述のように、真菌はヒトと同様に真核生物であり、強い抗真菌作用を示す物質はヒトに対しても毒性を示す場合が多く、実用面で解決すべき多くの課題が残されている。
また、従来から知られている抗真菌剤は殆どのものが疎水性の性質を示し、ハンドリング、商品形態、商品設計等の理由により、扱いやすい水溶性の抗真菌剤が求められていた。
【０００５】
一方、ジヒドロフェニルアラニンは水溶性を示し、本物質がシュードモナス属やミクロスポラン属等の細菌や一部の酵母、糸状菌に対して抗菌活性を有することが報告されている（非特許文献２、３参照）が、カンジダ属やアスペルギルス属等の真菌に対する抗菌活性は認められていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｗ．ディーコン、「現代真菌学入門」培風館発行、１９９０年
【非特許文献２】Ｔａｔｕｏ Ｙａｍａｓｉｔａら、ジャーナル オブ アンチバイオティクス ２３，５３７，（１９７０）
【非特許文献３】Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ，カナディアン ジャーナル オブ アンチバイオティクス １６，５４５，（１９７０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れた抗真菌剤を探索、開発することを目的とし、特にカンジダ・アルビカンスやアスペルギルス・ニガー等の真菌に有効な抗生物質の探索を行い、抗真菌剤を開発することを課題とするものである。
また、本発明は、抗真菌物質を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、カンジダ・アルビカンスやアスペルギルス・ニガー等の真菌に有効な抗生物質の探索を行なった。その結果、Ｌ−２，５−ジヒドロフェニルアラニン（以下、ＤＨＰＡと略すことがある。）が、ある一定の条件下でこれらの真菌に対し抗菌活性を有することを見出した。
特に、アスペルギルス・ニガーに対して、ＤＨＰＡは非常に低い濃度で生育を阻害する作用があること、および無機塩の存在下では、ＤＨＰＡの抗真菌活性がさらに向上することを見出した。
さらに、本発明者は、ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養して得られた培養物から、ＤＨＰＡを採取できることを見出した。
【０００９】
本発明は、ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ストレプトミセス属に属する放線菌の培養物から、抗真菌物質であるＤＨＰＡを製造する方法が提供される。ＤＨＰＡは、特にアスペルギルス・ニガーに対しては非常に低濃度で抗菌活性を示し、また、無機塩の存在下では、ＤＨＰＡの単独使用では十分な効果が奏されない酵母などに対する抗菌活性が著しく改善される。
【００１１】
しかも、ＤＨＰＡは水に対する溶解度が比較的高いため、真菌感染症の治療剤として様々な投与形態で臨床に応用することができる。さらに、ＤＨＰＡは、農園芸用分野、工業分野、養殖漁業分野などにおいて、効率的な抗真菌活性の発現が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明におけるジヒドロフェニルアラニンは、正式には、前記したように、ＤＨＰＡである。
ＤＨＰＡは、発酵法や化学合成法あるいはこれらの組み合わせにより製造することができる。また、発酵法による場合、生産菌はカビ、放線菌、酵母などのいずれでもよい。１例として、ストレプトミセス属に属する放線菌を使用する場合について説明する。
ストレプトミセス属に分類される放線菌（Streptomyces sp.) は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８である。
【００１３】
上記の放線菌を培養してＤＨＰＡを生産させるために用いる培地は、本菌が生育し、ＤＨＰＡを生産することができるものであればよく、特に制限はない。
例えば、蒸留水、イオン交換水、井戸水、水道水などに炭素源、窒素源を含有し、所望により、さらにミネラル類、ビタミン類などを含有する培地を利用することができる。培地の形状としては液状が望ましい。
炭素源としては、炭水化物、糖質類、有機酸塩、アルコール類などが利用できる。具体的には、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、乳酸、酒石酸などが用いられ、特にグルコースが好ましく用いられる。これら炭素源は単独で、あるいは２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
窒素源としては、アンモニア塩類、硝酸塩類などの無機窒素化合物、またはペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、コーン・スチープ・リカー、ＳＶＰ（ソリュブル・ベジタブル・プロテイン）、尿素、大豆粕、魚粉、発酵廃棄物などの有機窒素化合物を挙げることができ、これら窒素源も単独で、あるいは２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１４】
培地は、通常オートクレーブや発酵槽内で蒸気などを用いて滅菌処理を行なった後に用いることが好ましい。通常は、別に培養した種菌を培地に接種して培養を行なう。この場合、種菌の培養条件は、本培養の培養条件と同一の条件を採用することができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、微生物を培養するための培養条件には特に制限はない。培養方式に関しても、例えば静置培養方式、通気攪拌培養方式及び振とう培養方式のいずれも用いられる。培養温度としては、２０〜４０℃の間ならばいずれでも構わないが、好ましくは３０℃前後の温度で培養する。攪拌または振とう培養方式で培養する場合、攪拌回転数は通常の微生物培養に適用される範囲ならばよく、４００ｒｐｍ程度の条件が適当である。
【００１５】
培養終了後、培養液からＤＨＰＡを分離、精製する方法についても特に制限はなく、１例を示すと、培養液に硫酸、塩酸、酢酸等の酸を加えて酸性にしてから濾過する。濾過の方法は特に制限されず、濾過助剤を用いてヌッチェにて濾過しても良いし、膜による濾過を行なっても良いが、好ましくは濾過助剤を用いてヌッチェを用いで濾過することができる。
次いで、得られた培養濾液から陽イオン交換樹脂でＤＨＰＡを吸着する。このとき用いる陽イオン交換樹脂に制限はないが、好ましくはＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ２を使用する。その後、樹脂を水にて洗浄するが、好ましくは蒸留水を用いて行う。洗浄後、陽イオン交換樹脂に吸着したＤＨＰＡを溶離させるため、弱塩基性の溶液、例えばアンモニア水（ＮＨ4 ＯＨ溶液) 、炭酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液等で、好ましくはアンモニア水を用いて溶離する。
しかる後、活性フラクションを高速液体クロマトグラフィー等の方法で確認して収集する。この活性フラクションは、陰イオン交換樹脂等にて吸着する。陰イオン交換樹脂は、任意のもの用いることができるが、好ましくはＤｏｗｅｘ １−Ｘ２を使用することができる。
【００１６】
この後、水にて洗浄してから弱酸性溶液にて溶出する。このとき使用する水についても特に制限はないが、より好ましくは蒸留水を用いる。また、弱酸性溶液としては、酢酸、リン酸、希塩酸等を用いることができるが、好ましくは０．０５Ｍの酢酸を用いる。活性フラクションは、前述と同様に、高速液体クロマトグラフィー等の方法で確認して収集する。収集した活性フラクションは濃縮、結晶化を行なうことでＤＨＰＡを得ることができる。この場合の濃縮、結晶化の方法には特に制限はないが、より好ましくはロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールを用い、より好ましくはメタノールを使用して溶解後、さらに濃縮、攪拌することにより結晶を得ることができる。
【００１７】
ＤＨＰＡは、アスペルギルス属などの糸状菌に対しては単独で抗菌活性を示すが、無機塩を共存させると、その活性は増強される。特に、酵母などの真菌に対しては、ＤＨＰＡと無機塩を併用すると、優れた抗菌活性が奏される。
無機塩としては、アルカリ金属やマンガン族金属の塩を用いることができ、より好ましくは塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マンガン等が挙げられる。また、その濃度は対象の真菌の種類などを考慮して決定すればよいが、好ましくは０．０１Ｍ〜２．０Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜１．５Ｍである。
無機塩の添加方法は特に制限がなく、ＤＨＰＡと該塩が共存するように添加すれば良い。例えば、該塩溶液をＤＨＰＡあるいは該塩とＤＨＰＡ溶液を混合し、両者を共存させることにより優れた抗菌作用が発揮される。また、ＤＨＰＡまたはその溶液を抗真菌剤として使用する直前に、無機塩又はその溶液と混合しても良い。
【００１８】
抗真菌作用を有するＤＨＰＡは、上記の如く、無機塩と共存させ、さらには他の有効成分も配合して、様々な用途において様々な形態にて使用することができる。例えば、ヒトや動物用医薬品、植物病治療剤（例えば抗カビ剤など）、工業用抗菌剤、養殖漁業用抗菌剤等の用途へ幅広く展開できる可能性を有するものである。
ＤＨＰＡを有効成分とする本発明の薬剤を真菌感染症の治療剤として使用するには、種々の投与形態に合わせて、該薬剤を既知の医薬品用担体と適宜組み合わせて製剤化すればよい。このような投与形態としては、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、座薬等による非経口投与、あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与の全身投与の他、軟膏剤、ローション剤、膣座薬等の局所投与の形態を例示することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例等より本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ジヒドロフェニルアラニンの調製
ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）の凍結乾燥菌体を５０ｍＬのＹＭＧ培地（０．５％ 酵母エキス，０．５％ 麦芽エキス，１％ グルコース）を含む５００ｍＬ容の坂口フラスコにて３０℃で１日振盪培養した。これを５０００ｍＬのＹＭＧ培地を含む７０００ｍＬ容のミニジャーファーメンターＡＣＤ−Ｉ０を用い、通気量は３Ｌ／ｍｉｎで３０℃で培養した。培養は、撹拌回転数４００ｒｐｍで４８時間行なった。
【００２０】
この方法にて、ジャーファーメンターで５０００ｍＬ培養し、これを２回行なった。得られた培養液をｐＨ３に調節してから濾過した。それをＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ２に吸着し、蒸留水２００ｍＬで洗浄してから０．１ＭのＮＨ4 ＯＨ溶液３Ｌで溶出した。活性フラクションを高速液体クロマトグラフィーで判定することによって集めた。次に、該活性フラクションをＤｏｗｅｘ １−Ｘ２に吸着して、同様に蒸留水２００ｍＬで洗浄してから０．０５Ｍの酢酸水溶液３Ｌで溶出した後、活性フラクションを同じようにして集めた。
しかる後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、メタノールに溶解した。次に、結晶が晶出する寸前までメタノールを濃縮し、その溶液を一晩撹拌することにより結晶化を行なった。この結果、培養液１０Ｌに対し９８％の結晶末を７８０ｇ得た。
【００２１】
（１）活性フラクションの判定
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の条件の検討
移動相は０．１Ｍのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いた。カラムはＹＭＣ社のＯＤＳ−ＡＭを、ポンプは島津製作所のＬＣ−６Ａを用い、流速は毎分１ｍｌで行なった。検出器には島津製作所のＵＶ−１０Ａを用いた。検出波長は、２１０ｎｍで行なった。その結果、ＤＨＰＡのリテンションタイムは約６分であった。
【００２２】
（２）ジヒドロフェニルアラニンの同定
ＤＨＰＡはＤ2 Ｏ（重水）に溶かし、ＮＭＲで分析を行なった。 1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ、 1Ｈ− 1Ｈ ＣＯＳＹ、 1Ｈ−13Ｃ ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣのスペクトラムを得、さらにＦＡＢ−ＭＳも行なった。これらで得たスペクトルデータから２，５−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
さらに、ＤＨＰＡのＤ体、Ｌ体の決定は以下のようにして行なった。はじめに、１ｍｇ／Ｌの試料溶液を調製し、その液１０μＬに０．４％トリエチルアミンを含むアセトニトリル溶液を１０Ｌ加え、よく混合した。次に、この混合液に０．２％の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソシアネートを含むアセトニトリル溶液２０Ｌを加えてよく混合し、室温で２０分間放置した。１０Ｌを光学異性体分割カラムＬ−カラムＯＤＳで分析した。溶出には、１０ｍＭ リン酸二水素カリウム（ｐＨ２．８）：メタノール（１：１，ｖ／ｖ）を用いた。また、検出器は前述の機器を使用し、検出は２５０ｎｍの吸光を観察した結果、本物質はＬ−２，５−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
【００２３】
参考例１ ＤＨＰＡの抗菌スペクトラム
ＤＨＰＡの抗菌スペクトラムは液体培地希釈法によって調べた。
培地としては、細菌には３％ブイヨン培地を、酵母・糸状菌には２．５％麦芽汁培地を用いた。ＤＨＰＡは３０ｍｇ／ｍＬになるように滅菌した蒸留水に溶解し、希釈して各試験培地に最終濃度１．０ｍｇ／ｍＬ〜０．９７ｇ／ｍＬとなるように添加した。
ＤＨＰＡの抗菌スペクトラムを表１に示す。最小生育阻止濃度（以下、ＭＩＣと略す。）の判定は、細菌は３０℃で、酵母は２５℃で培養し、判定は２４時間後に肉眼で行ない、糸状菌については２５℃で培養し、判定は４８時間後に行なった。
その結果、表から明らかなように、細菌に対してはＤＨＰＡは抗菌活性を示さず、酵母に対しては一部を除いてＤＨＰＡは抗菌活性を示した。一方、糸状菌に対しては低い濃度でＤＨＰＡは抗菌活性を示した。
このＤＨＰＡがアスペルギルス・ニガー ＡＴＣＣ６２７５に対し、低い濃度で抗菌活性を示すことは初めて明らかとなった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
参考例２ 合成培地におけるＤＨＰＡの抗菌スペクトラム
ＤＨＰＡは、フェニルアラニンと拮抗することが報告されており（Ｔａｔｕｏ Ｙａｍａｓｉｔａら、 ジャーナル オブ アンチバイオティクス、２３，５３７（１９７０）、Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ、 カナディアン ジャーナル オブ アンチバイオティクス、１６，５４５（１９７０）、ＭａｒｙＬｏｕ Ｓｎｏｗら，ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー、３３，１７７４（１９６８））、培地のアミノ酸成分によって抗菌活性が低くなっている可能性が考えられた。よって、培地にフェニルアラニンを含まないような合成培地においてＤＨＰＡのＭＩＣを判定した。
【００２６】
細菌のＭＩＣ測定に用いた培地としては、１％ グルコース，０．５％ グルタミン酸ナトリウム，０．１％ リン酸水素二カリウム，０．０２％ 硫酸マグネシウム７水和物を用いた。酵母・糸状菌のＭＩＣ測定には、ツアペック−ドックス培地（３％ グルコース，０．３％ 硝酸ナトリウム，０．１％ リン酸二水素カリウム，０．０５％ 硫酸マグネシウム７水和物，０．０５％ 塩化カリウム，０．００１％ 硫酸鉄７水和物，ｐＨ７．３）を用いた。判定は、参考例１に記載したＭＩＣ測定方法と同様にしてＤＨＰＡの抗菌スペクトラムを測定して行なった。結果を表２に示した。
表から明らかなように、細菌や酵母に対しては、ＤＨＰＡが高濃度で抗菌活性を示した。一方、アスペルギルス・ニガー ＡＴＣＣ６２７５等の糸状菌に対して、ＤＨＰＡは低濃度で抗菌活性を示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
参考例３ アスペルギルスに対するジヒドロフェニルアラニンのＭＩＣ
培地として、２．５％麦芽汁培地と前述のツアペック−ドックス培地の２種を用い、アスペルギルスに対するＤＨＰＡのＭＩＣを調べた。判定は、参考例１に記載した方法と同様にして行なった。結果を表３に示した。
表３から分かるように、２．５％麦芽汁培地においては、ＤＨＰＡは低い濃度で抗菌活性を示した。しかし、アスペルギルス・フラバス ＩＦＯ６３４３、アスペルギルス・フミガツス ＩＦＯ５８４０に対しては、ＤＨＰＡは弱い抗菌活性を示した。一方、ツアペック−ドックス培地を使用すると、アスペルギルス・ニガーに対しては低い濃度のＤＰＨＡが抗菌活性を示した。しかし、アスペスギルス・フラバス ＩＦＯ６３４３とアスペスギルス・フミガツス ＩＦＯ５８４０に対してはＤＨＰＡの抗菌活性は認められなかった。
したがって、ＤＨＰＡはアスペルギルス・ニガーに特異的に抗菌活性を示すことが分かった。
【００２９】
【表３】
【００３０】
参考例４ サッカロミセス・セレビシエに対するＤＨＰＡの抗菌活性
各種塩との共存下でＤＨＰＡの抗菌活性を測定した。測定に用いた培地は、酵母ニトロゲンベース、アミノ酸不含（ディフコ社、アメリカ）０．６７％とグルコース２．０ ％からなるものを使用した。この培地に表４に示す各種塩をそれぞれ添加し、サッカロミセス・セレビシエに対するＤＨＰＡのＭＩＣを測定した。その結果、サッカロミセス・セレビシエに対しては、ＤＨＰＡをＮａ+ 、Ｌｉ+ 、Ｍｎ2+等のイオンを生じる無機塩と共存した状態で用いたときに、抗菌活性は上昇した（表４参照）。すなわち、ＤＨＰＡは１．２Ｍ 塩化ナトリウム、０．６Ｍ 硫酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化リチウム、１０ｍＭ 塩化マンガンと共存させたときに、抗菌活性が上昇した。しかし、１．２Ｍ 塩化カリウムや１．２Ｍ ソルビトールと共存した場合には、抗菌活性の上昇は認められなかった。
【００３１】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗真菌物質の製造方法に関し、詳しくはストレプトミセス属に属する放線菌を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶや癌の治療、そして臓器移植において問題とされているのが、微生物による感染症である。細菌の感染症に対する抗生物質の開発は、すでに確立されている。ＭＲＳＡやＶＲＥ等の薬剤耐性菌の出現という問題もあるが、それ以上に深刻であるのが真菌による感染症である。特に、カンジダ・アルビカンスによるカンジダ症やアスペルギルス属菌によるアスペルギルス症は、移植手術において大きな妨げとなっている（非特許文献１参照）。
【０００３】
酵母および糸状菌は真核生物であり、原核生物である細菌に対して真菌と称されている。ある種の真菌はヒトや動物に対して病原性を示し、真菌感染症の起因菌とされている。これら真菌の病原性は概ね弱いものであるが、抵抗力の低下した状態の患者には、重篤な症状を来すことがある。
真菌による種々の病気は、ヒトや動物の健康に甚大な影響を与えているため、それらの治療に有用な新規薬剤の開発が期待されている。
また、ある種の真菌は植物病原菌として知られており、農業に甚大な被害を与えている。さらに、最近の住宅事情を反映した結露等による住宅への糸状菌の進入は、ヒトにアレルギー等の症状をもたらし、ヒトや動物の健康に悪影響を及ぼしている。これらの有効な対策として、新規抗真菌剤の開発並びに植物防御の面から新たな農園芸用抗真菌剤の開発が期待されている。
【０００４】
従来、これらの問題点を克服すべく、種々の抗真菌剤が開発されており、一応の成果が得られているが、前述のように、真菌はヒトと同様に真核生物であり、強い抗真菌作用を示す物質はヒトに対しても毒性を示す場合が多く、実用面で解決すべき多くの課題が残されている。
また、従来から知られている抗真菌剤は殆どのものが疎水性の性質を示し、ハンドリング、商品形態、商品設計等の理由により、扱いやすい水溶性の抗真菌剤が求められていた。
【０００５】
一方、ジヒドロフェニルアラニンは水溶性を示し、本物質がシュードモナス属やミクロスポラン属等の細菌や一部の酵母、糸状菌に対して抗菌活性を有することが報告されている（非特許文献２、３参照）が、カンジダ属やアスペルギルス属等の真菌に対する抗菌活性は認められていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｗ．ディーコン、「現代真菌学入門」培風館発行、１９９０年
【非特許文献２】Ｔａｔｕｏ Ｙａｍａｓｉｔａら、ジャーナル オブ アンチバイオティクス ２３，５３７，（１９７０）
【非特許文献３】Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ，カナディアン ジャーナル オブ アンチバイオティクス １６，５４５，（１９７０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れた抗真菌剤を探索、開発することを目的とし、特にカンジダ・アルビカンスやアスペルギルス・ニガー等の真菌に有効な抗生物質の探索を行い、抗真菌剤を開発することを課題とするものである。
また、本発明は、抗真菌物質を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、カンジダ・アルビカンスやアスペルギルス・ニガー等の真菌に有効な抗生物質の探索を行なった。その結果、Ｌ−２，５−ジヒドロフェニルアラニン（以下、ＤＨＰＡと略すことがある。）が、ある一定の条件下でこれらの真菌に対し抗菌活性を有することを見出した。
特に、アスペルギルス・ニガーに対して、ＤＨＰＡは非常に低い濃度で生育を阻害する作用があること、および無機塩の存在下では、ＤＨＰＡの抗真菌活性がさらに向上することを見出した。
さらに、本発明者は、ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養して得られた培養物から、ＤＨＰＡを採取できることを見出した。
【０００９】
本発明は、ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ストレプトミセス属に属する放線菌の培養物から、抗真菌物質であるＤＨＰＡを製造する方法が提供される。ＤＨＰＡは、特にアスペルギルス・ニガーに対しては非常に低濃度で抗菌活性を示し、また、無機塩の存在下では、ＤＨＰＡの単独使用では十分な効果が奏されない酵母などに対する抗菌活性が著しく改善される。
【００１１】
しかも、ＤＨＰＡは水に対する溶解度が比較的高いため、真菌感染症の治療剤として様々な投与形態で臨床に応用することができる。さらに、ＤＨＰＡは、農園芸用分野、工業分野、養殖漁業分野などにおいて、効率的な抗真菌活性の発現が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明におけるジヒドロフェニルアラニンは、正式には、前記したように、ＤＨＰＡである。
ＤＨＰＡは、発酵法や化学合成法あるいはこれらの組み合わせにより製造することができる。また、発酵法による場合、生産菌はカビ、放線菌、酵母などのいずれでもよい。１例として、ストレプトミセス属に属する放線菌を使用する場合について説明する。
ストレプトミセス属に分類される放線菌（Streptomyces sp.) は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８である。
【００１３】
上記の放線菌を培養してＤＨＰＡを生産させるために用いる培地は、本菌が生育し、ＤＨＰＡを生産することができるものであればよく、特に制限はない。
例えば、蒸留水、イオン交換水、井戸水、水道水などに炭素源、窒素源を含有し、所望により、さらにミネラル類、ビタミン類などを含有する培地を利用することができる。培地の形状としては液状が望ましい。
炭素源としては、炭水化物、糖質類、有機酸塩、アルコール類などが利用できる。具体的には、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、乳酸、酒石酸などが用いられ、特にグルコースが好ましく用いられる。これら炭素源は単独で、あるいは２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
窒素源としては、アンモニア塩類、硝酸塩類などの無機窒素化合物、またはペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、コーン・スチープ・リカー、ＳＶＰ（ソリュブル・ベジタブル・プロテイン）、尿素、大豆粕、魚粉、発酵廃棄物などの有機窒素化合物を挙げることができ、これら窒素源も単独で、あるいは２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１４】
培地は、通常オートクレーブや発酵槽内で蒸気などを用いて滅菌処理を行なった後に用いることが好ましい。通常は、別に培養した種菌を培地に接種して培養を行なう。この場合、種菌の培養条件は、本培養の培養条件と同一の条件を採用することができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、微生物を培養するための培養条件には特に制限はない。培養方式に関しても、例えば静置培養方式、通気攪拌培養方式及び振とう培養方式のいずれも用いられる。培養温度としては、２０〜４０℃の間ならばいずれでも構わないが、好ましくは３０℃前後の温度で培養する。攪拌または振とう培養方式で培養する場合、攪拌回転数は通常の微生物培養に適用される範囲ならばよく、４００ｒｐｍ程度の条件が適当である。
【００１５】
培養終了後、培養液からＤＨＰＡを分離、精製する方法についても特に制限はなく、１例を示すと、培養液に硫酸、塩酸、酢酸等の酸を加えて酸性にしてから濾過する。濾過の方法は特に制限されず、濾過助剤を用いてヌッチェにて濾過しても良いし、膜による濾過を行なっても良いが、好ましくは濾過助剤を用いてヌッチェを用いで濾過することができる。
次いで、得られた培養濾液から陽イオン交換樹脂でＤＨＰＡを吸着する。このとき用いる陽イオン交換樹脂に制限はないが、好ましくはＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ２を使用する。その後、樹脂を水にて洗浄するが、好ましくは蒸留水を用いて行う。洗浄後、陽イオン交換樹脂に吸着したＤＨＰＡを溶離させるため、弱塩基性の溶液、例えばアンモニア水（ＮＨ4 ＯＨ溶液) 、炭酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液等で、好ましくはアンモニア水を用いて溶離する。
しかる後、活性フラクションを高速液体クロマトグラフィー等の方法で確認して収集する。この活性フラクションは、陰イオン交換樹脂等にて吸着する。陰イオン交換樹脂は、任意のもの用いることができるが、好ましくはＤｏｗｅｘ １−Ｘ２を使用することができる。
【００１６】
この後、水にて洗浄してから弱酸性溶液にて溶出する。このとき使用する水についても特に制限はないが、より好ましくは蒸留水を用いる。また、弱酸性溶液としては、酢酸、リン酸、希塩酸等を用いることができるが、好ましくは０．０５Ｍの酢酸を用いる。活性フラクションは、前述と同様に、高速液体クロマトグラフィー等の方法で確認して収集する。収集した活性フラクションは濃縮、結晶化を行なうことでＤＨＰＡを得ることができる。この場合の濃縮、結晶化の方法には特に制限はないが、より好ましくはロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールを用い、より好ましくはメタノールを使用して溶解後、さらに濃縮、攪拌することにより結晶を得ることができる。
【００１７】
ＤＨＰＡは、アスペルギルス属などの糸状菌に対しては単独で抗菌活性を示すが、無機塩を共存させると、その活性は増強される。特に、酵母などの真菌に対しては、ＤＨＰＡと無機塩を併用すると、優れた抗菌活性が奏される。
無機塩としては、アルカリ金属やマンガン族金属の塩を用いることができ、より好ましくは塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マンガン等が挙げられる。また、その濃度は対象の真菌の種類などを考慮して決定すればよいが、好ましくは０．０１Ｍ〜２．０Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜１．５Ｍである。
無機塩の添加方法は特に制限がなく、ＤＨＰＡと該塩が共存するように添加すれば良い。例えば、該塩溶液をＤＨＰＡあるいは該塩とＤＨＰＡ溶液を混合し、両者を共存させることにより優れた抗菌作用が発揮される。また、ＤＨＰＡまたはその溶液を抗真菌剤として使用する直前に、無機塩又はその溶液と混合しても良い。
【００１８】
抗真菌作用を有するＤＨＰＡは、上記の如く、無機塩と共存させ、さらには他の有効成分も配合して、様々な用途において様々な形態にて使用することができる。例えば、ヒトや動物用医薬品、植物病治療剤（例えば抗カビ剤など）、工業用抗菌剤、養殖漁業用抗菌剤等の用途へ幅広く展開できる可能性を有するものである。
ＤＨＰＡを有効成分とする本発明の薬剤を真菌感染症の治療剤として使用するには、種々の投与形態に合わせて、該薬剤を既知の医薬品用担体と適宜組み合わせて製剤化すればよい。このような投与形態としては、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、座薬等による非経口投与、あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与の全身投与の他、軟膏剤、ローション剤、膣座薬等の局所投与の形態を例示することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例等より本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ジヒドロフェニルアラニンの調製
ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）の凍結乾燥菌体を５０ｍＬのＹＭＧ培地（０．５％ 酵母エキス，０．５％ 麦芽エキス，１％ グルコース）を含む５００ｍＬ容の坂口フラスコにて３０℃で１日振盪培養した。これを５０００ｍＬのＹＭＧ培地を含む７０００ｍＬ容のミニジャーファーメンターＡＣＤ−Ｉ０を用い、通気量は３Ｌ／ｍｉｎで３０℃で培養した。培養は、撹拌回転数４００ｒｐｍで４８時間行なった。
【００２０】
この方法にて、ジャーファーメンターで５０００ｍＬ培養し、これを２回行なった。得られた培養液をｐＨ３に調節してから濾過した。それをＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ２に吸着し、蒸留水２００ｍＬで洗浄してから０．１ＭのＮＨ4 ＯＨ溶液３Ｌで溶出した。活性フラクションを高速液体クロマトグラフィーで判定することによって集めた。次に、該活性フラクションをＤｏｗｅｘ １−Ｘ２に吸着して、同様に蒸留水２００ｍＬで洗浄してから０．０５Ｍの酢酸水溶液３Ｌで溶出した後、活性フラクションを同じようにして集めた。
しかる後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、メタノールに溶解した。次に、結晶が晶出する寸前までメタノールを濃縮し、その溶液を一晩撹拌することにより結晶化を行なった。この結果、培養液１０Ｌに対し９８％の結晶末を７８０ｇ得た。
【００２１】
（１）活性フラクションの判定
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の条件の検討
移動相は０．１Ｍのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いた。カラムはＹＭＣ社のＯＤＳ−ＡＭを、ポンプは島津製作所のＬＣ−６Ａを用い、流速は毎分１ｍｌで行なった。検出器には島津製作所のＵＶ−１０Ａを用いた。検出波長は、２１０ｎｍで行なった。その結果、ＤＨＰＡのリテンションタイムは約６分であった。
【００２２】
（２）ジヒドロフェニルアラニンの同定
ＤＨＰＡはＤ2 Ｏ（重水）に溶かし、ＮＭＲで分析を行なった。 1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ、 1Ｈ− 1Ｈ ＣＯＳＹ、 1Ｈ−13Ｃ ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣのスペクトラムを得、さらにＦＡＢ−ＭＳも行なった。これらで得たスペクトルデータから２，５−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
さらに、ＤＨＰＡのＤ体、Ｌ体の決定は以下のようにして行なった。はじめに、１ｍｇ／Ｌの試料溶液を調製し、その液１０μＬに０．４％トリエチルアミンを含むアセトニトリル溶液を１０Ｌ加え、よく混合した。次に、この混合液に０．２％の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソシアネートを含むアセトニトリル溶液２０Ｌを加えてよく混合し、室温で２０分間放置した。１０Ｌを光学異性体分割カラムＬ−カラムＯＤＳで分析した。溶出には、１０ｍＭ リン酸二水素カリウム（ｐＨ２．８）：メタノール（１：１，ｖ／ｖ）を用いた。また、検出器は前述の機器を使用し、検出は２５０ｎｍの吸光を観察した結果、本物質はＬ−２，５−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
【００２３】
参考例１ ＤＨＰＡの抗菌スペクトラム
ＤＨＰＡの抗菌スペクトラムは液体培地希釈法によって調べた。
培地としては、細菌には３％ブイヨン培地を、酵母・糸状菌には２．５％麦芽汁培地を用いた。ＤＨＰＡは３０ｍｇ／ｍＬになるように滅菌した蒸留水に溶解し、希釈して各試験培地に最終濃度１．０ｍｇ／ｍＬ〜０．９７ｇ／ｍＬとなるように添加した。
ＤＨＰＡの抗菌スペクトラムを表１に示す。最小生育阻止濃度（以下、ＭＩＣと略す。）の判定は、細菌は３０℃で、酵母は２５℃で培養し、判定は２４時間後に肉眼で行ない、糸状菌については２５℃で培養し、判定は４８時間後に行なった。
その結果、表から明らかなように、細菌に対してはＤＨＰＡは抗菌活性を示さず、酵母に対しては一部を除いてＤＨＰＡは抗菌活性を示した。一方、糸状菌に対しては低い濃度でＤＨＰＡは抗菌活性を示した。
このＤＨＰＡがアスペルギルス・ニガー ＡＴＣＣ６２７５に対し、低い濃度で抗菌活性を示すことは初めて明らかとなった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
参考例２ 合成培地におけるＤＨＰＡの抗菌スペクトラム
ＤＨＰＡは、フェニルアラニンと拮抗することが報告されており（Ｔａｔｕｏ Ｙａｍａｓｉｔａら、 ジャーナル オブ アンチバイオティクス、２３，５３７（１９７０）、Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ、 カナディアン ジャーナル オブ アンチバイオティクス、１６，５４５（１９７０）、ＭａｒｙＬｏｕ Ｓｎｏｗら，ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー、３３，１７７４（１９６８））、培地のアミノ酸成分によって抗菌活性が低くなっている可能性が考えられた。よって、培地にフェニルアラニンを含まないような合成培地においてＤＨＰＡのＭＩＣを判定した。
【００２６】
細菌のＭＩＣ測定に用いた培地としては、１％ グルコース，０．５％ グルタミン酸ナトリウム，０．１％ リン酸水素二カリウム，０．０２％ 硫酸マグネシウム７水和物を用いた。酵母・糸状菌のＭＩＣ測定には、ツアペック−ドックス培地（３％ グルコース，０．３％ 硝酸ナトリウム，０．１％ リン酸二水素カリウム，０．０５％ 硫酸マグネシウム７水和物，０．０５％ 塩化カリウム，０．００１％ 硫酸鉄７水和物，ｐＨ７．３）を用いた。判定は、参考例１に記載したＭＩＣ測定方法と同様にしてＤＨＰＡの抗菌スペクトラムを測定して行なった。結果を表２に示した。
表から明らかなように、細菌や酵母に対しては、ＤＨＰＡが高濃度で抗菌活性を示した。一方、アスペルギルス・ニガー ＡＴＣＣ６２７５等の糸状菌に対して、ＤＨＰＡは低濃度で抗菌活性を示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
参考例３ アスペルギルスに対するジヒドロフェニルアラニンのＭＩＣ
培地として、２．５％麦芽汁培地と前述のツアペック−ドックス培地の２種を用い、アスペルギルスに対するＤＨＰＡのＭＩＣを調べた。判定は、参考例１に記載した方法と同様にして行なった。結果を表３に示した。
表３から分かるように、２．５％麦芽汁培地においては、ＤＨＰＡは低い濃度で抗菌活性を示した。しかし、アスペルギルス・フラバス ＩＦＯ６３４３、アスペルギルス・フミガツス ＩＦＯ５８４０に対しては、ＤＨＰＡは弱い抗菌活性を示した。一方、ツアペック−ドックス培地を使用すると、アスペルギルス・ニガーに対しては低い濃度のＤＰＨＡが抗菌活性を示した。しかし、アスペスギルス・フラバス ＩＦＯ６３４３とアスペスギルス・フミガツス ＩＦＯ５８４０に対してはＤＨＰＡの抗菌活性は認められなかった。
したがって、ＤＨＰＡはアスペルギルス・ニガーに特異的に抗菌活性を示すことが分かった。
【００２９】
【表３】
【００３０】
参考例４ サッカロミセス・セレビシエに対するＤＨＰＡの抗菌活性
各種塩との共存下でＤＨＰＡの抗菌活性を測定した。測定に用いた培地は、酵母ニトロゲンベース、アミノ酸不含（ディフコ社、アメリカ）０．６７％とグルコース２．０ ％からなるものを使用した。この培地に表４に示す各種塩をそれぞれ添加し、サッカロミセス・セレビシエに対するＤＨＰＡのＭＩＣを測定した。その結果、サッカロミセス・セレビシエに対しては、ＤＨＰＡをＮａ+ 、Ｌｉ+ 、Ｍｎ2+等のイオンを生じる無機塩と共存した状態で用いたときに、抗菌活性は上昇した（表４参照）。すなわち、ＤＨＰＡは１．２Ｍ 塩化ナトリウム、０．６Ｍ 硫酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化リチウム、１０ｍＭ 塩化マンガンと共存させたときに、抗菌活性が上昇した。しかし、１．２Ｍ 塩化カリウムや１．２Ｍ ソルビトールと共存した場合には、抗菌活性の上昇は認められなかった。
【００３１】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法。
【請求項１】
ストレプトミセス属に属する放線菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１８）を培地に培養し、培養物からジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法。
【公開番号】特開２００６−１９７９４５（Ｐ２００６−１９７９４５Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０５９２５（Ｐ２００６−１０５９２５）
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【分割の表示】特願２０００−５５４０４（Ｐ２０００−５５４０４）の分割
【原出願日】平成１２年３月１日（２０００．３．１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【分割の表示】特願２０００−５５４０４（Ｐ２０００−５５４０４）の分割
【原出願日】平成１２年３月１日（２０００．３．１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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