抗ＣＤ１６結合分子
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの表面上に発現しているヒトＦｃガンマＩＩＩ受容体（すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に特異的に結合する結合分子、特に、特異的にＡ型ＦｃγＲＩＩＩに結合するがＢ型ＦｃγＲＩＩＩに結合しない結合分子、ならびに診断の診断および治療におけるこのような結合分子の使用に関する。本発明は、更にこのような結合分子をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、およびこのような宿主細胞を用いる本発明の結合分子の製造方法まで拡張される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの表面上に発現しているヒトＦｃガンマＩＩＩ受容体（すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に特異的に結合する結合分子、特に、特異的にＡ型ＦｃγＲＩＩＩに結合するがＢ型ＦｃγＲＩＩＩに結合しない結合分子、ならびに疾患の診断および治療におけるこのような結合分子の使用に関する。本発明は、更にこのような結合分子をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、およびこのような宿主細胞を用いる本発明の結合分子の製造方法まで拡張される。
【背景技術】
【０００２】
抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）に関与することが知られているいくつかのＩｇＧのＦｃ部の低親和性受容体、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩとしても知られる）は、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解の誘発に関与する、最も特徴付けられた膜受容体である（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９，ＰＮＡＳ ９６：５６４０−５６４４）。ヒトＮＫ細胞は、全リンパ球の約１５％を構成し、また、表現型上は、そのＣＤ５６の発現とＣＤ３発現の欠如とにより特徴付けられる（ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＲｉｔｚ，１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７６：２４２１−２４３８）。ヒトＮＫ細胞の多く（約９０％）は、ＣＤ５６を低密度で発現し（ＣＤ５６ｄｉｍ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を高レベルで発現する（Ｃｏｏｐｅｒら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３−６４０）。ヒトＦｃγＲＩＩＩは、２つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ、として存在し、これらは、その細胞外の免疫グロブリン結合領域において９６％の配列同一性を有する（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５−２２１）。
【０００３】
ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、マスト細胞、およびＮＫ細胞上で、膜貫通型受容体として発現する。ＮＫ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＩＡのアルファー鎖は、ＦｃεＲＩγ鎖および／またはＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３ζ鎖を含有する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合し、シグナル伝達を媒介する（Ｗｉｒｔｈｍｕｅｌｌｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１３８１−１３９０）。ＦｃγＲＩＩＩＡの、異なる組み合わせのγおよびζ鎖のホモおよびヘテロ−ダイマーとの相互作用が、ＮＫ細胞において観察され、ＮＫ細胞における、種々のＦｃγＲＩＩＩＡ複合体を介する異なるシグナル伝達経路の可能性が示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９９０、ＰＮＡＳ ８７（６）：２２７４−２２７８；Ａｃｋｅｒｌｙら，１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：１１−１４）。
【０００４】
ＦｃγＲＩＩＩＢは、多型核顆粒球（ＰＭＮ）上に、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型受容体（ＦｃγＲＩＩＩＢアイソフォーム）として存在し、これは腫瘍細胞の殺滅を引き起こすことができない（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，上掲）。さらに、ＦｃγＲＩＩＩＢは血清中で可溶性受容体として存在し、抗体への結合に基づいて、生体内で免疫複合体の形成を介して副作用を引き起こす。
【０００５】
ＦｃγＲ発現エフェクター細胞は、ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞の破壊に関与することが示されている。このことは、ＦｃγＲ活性の使用を含む、がんの治療への、いくつかの免疫治療のアプローチの開発を導いた。例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体はＦｃγＲへの結合によって誘導されたＡＤＣＣによる腫瘍細胞の破壊を介在し得、また、腫瘍細胞への一方の特異性と顆粒球上のＦｃγＲＩまたはＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩのいずれかへの他方の特異性とを有する二特異性分子もまたエフェクター細胞動員を改善するために開発が行われている（ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら，２０００ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３９１−３９７）。
【０００６】
自然免疫の細胞性のメディエーターでとして、ＮＫ細胞は、専門の細胞キラーであり、Ｔ細胞とは異なり、恒常的に、付加的な（予備）刺激を必要としない活性化状態で存在する傾向がある。対照的に、静止している細胞傷害性のＴ−細胞は、抗原−ＭＨＣ複合体の結合を介する活性化と、それに続くＣＤ２８を介する副刺激を必要とする。したがって、免疫エフェクター細胞の中で、ＮＫ細胞は、免疫治療における使用の、より魅力的な候補の一つであり、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）とＨＥＲ−２／ｎｅｕとに、またはＣＤ１６とＣＤ３０とに特異的な二特異性抗体が開発されている（Ａｒｎｄｔら，１９９９ Ｂｌｏｏｄ ９４：２５６２−２５６８；ＭｃＣａｌｌら，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６１１２−６１１７）。
【０００７】
今日まで生産されてきた抗−ＣＤ１６抗体の多くは、２つのＣＤ１６アイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）を区別できず、例外は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１Ｄ３（これは好中球上で発現するフォームのＣＤ１６、すなわちＦｃγＲＩＩＩＢ、のみを認識する）、および異なるアロタイプの型のＦｃγＲＩＩＩＢを認識するモノクローナル抗体である。（Ｏｒｙら，１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１６７６−８１；Ｈｕｉｚｉｎｇａら，１９９０ Ｂｌｏｏｄ ７５：２１３−７；Ｔａｍｍ＆Ｓｃｈｍｉｄｔ １９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ １５７：１５７６−１５８１）。しかし、これまで、特異的に、ＮＫ細胞上で発現するＦｃγＲＩＩＩＡには結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢには結合しない分子の例は無かった。
【発明の開示】
【０００８】
しかしながら，ＦｃγＲＩＩＩＡに特異的な抗体は、主にＮＫ細胞を集め、循環する可溶性のＦｃγＲＩＩＩＢには結合せず、好中球または活性化された好酸球への結合によってＮＫ細胞結合からそれないので、疾患関連細胞に対する二または多特異性結合分子のコンポーネントとして、特に有用である。ＦｃγＲＩＩＩＡ特異的抗体は、ＮＫ細胞に結合するだけでなく、結合によってそれらを活性化し、ＮＫ細胞の殺滅を効果的に媒介する。
【０００９】
我々はいくつかの新たな抗ＣＤ１６ｓｃＦｖを同定した。これらは、有用な性質を示す。すなわち、これらは、ＦｃγＲＩＩＩＡに特異的であり、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合せず、またＮＫ細胞を結合によって活性化できる。
ＦｃγＲＩＩＩＡは、特にＩｇＧ結合ドメインの４８位および１５８位において、いくつかの対立遺伝子多型を示すことが知られている。前記の抗ＣＤ１６抗体は、異なるＦｃγＲＩＩＩＡの多型フォームに異なる親和性で結合することが示され、Ｋｏｅｎｅらの研究（１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：１１０９−１１１４）は、これらの抗体のうちのいくつかの結合の違いの原因は１５８位での多型であるとしている。ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＦアレルおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖアレルの遺伝子頻度は、それぞれ約０．６および０．４であるので、任意のＣＤ１６Ａ抗体について、両方のアレル型を認識することは、あらゆる患者において、抗ＣＤ１６Ａ 抗体がＮＫ細胞集団に結合し活性化することを確実にする。
【００１０】
本明細書中、抗ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖは、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆをほぼ同じ親和性で認識するが、ＦｃγＲＩＩＩＢには結合しない。
【００１１】
本明細書に記載の新規なｓｃＦｖは前記のように新規な結合分子を生産するために用いることができ、これは治療剤として用いることができる。本明細書中、「結合分子」なる語は、抗体およびその抗原結合断片（当該抗体およびその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的または特異的に結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しない）、並びにこのような抗体または抗原結合断片、およびこのような抗体または抗原結合断片を含有するタンパク質複合体を包含する。
【００１２】
したがって、本発明の第一の態様によれば、少なくとも１つの抗原への特異性を有する結合分子（当該少なくとも１つの抗原はＦｃγＲＩＩＩＡであり、当該結合分子は特異的にＦｃγＲＩＩＩＢに結合しない）が提供される。
好ましい実施態様において、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、抗体またはその抗原結合断片によって与えられる。したがって、本発明の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡに特異性を有するが、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異性を有さない、少なくとも一つの抗体（またはその抗原結合断片）を含有するか、ある実施態様においては、少なくとも一つの抗体（またはその抗原結合断片）からなる。
【００１３】
ＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える抗体は、自然に存在する抗体であっても、組み換え抗体であってもよい。本発明の抗体は、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体であってよい）。好ましくは、当該抗体は、ＩｇＧ抗体である。本発明の使用に適当な抗原結合断片は、自然に存在するものでも組み替え体であってもよく、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Fv、一本鎖抗体（ｓｃＦｖを包含する）、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＣＤＲを包含する。当業者は、このような抗原結合断片およびその調製に精通しているであろう。疑義を避けるためであるが、本明細書中で用いられる一本鎖抗体なる用語は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有し、適当な柔軟性のあるポリペプチドリンカーが連結している、遺伝子操作された一本鎖分子をいう。
【００１４】
ある実施態様においてはＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える抗体または抗原結合断片は、少なくとも１つのヒトＣＤＲ（好ましくは下記の表１に記載のＣＤＲから選択される）を含有する。
表１ 選択的および特異的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢに選択的に結合しないｓｃＦｖに由来するヒト軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
【００１５】
【表１】
【００１６】
当業者は、単独ＣＤＲを例外として、前記抗体および抗原結合断片が、通常、３つの軽鎖ＣＤＲおよび／または３つの重鎖ＣＤＲを構成することを理解するであろう。更なる実施態様によれば、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有する前記抗体または抗原結合断片は、３つのヒトの軽鎖ＣＤＲおよび／または３つのヒト重鎖ＣＤＲを含有する。好ましくは、ヒト軽鎖ＣＤＲ１は配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有し、ヒト軽鎖ＣＤＲ２は配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を有し、ならびにヒト軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８および配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ヒト重鎖ＣＤＲ１は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、ヒト重鎖ＣＤＲ２は配列番号１８のアミノ酸配列を有し、そしてヒト重鎖ＣＤＲ３は配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
前記抗体または前記抗原結合断片は、軽鎖の可変領域を含有するか、またはそれからなるが、下記のアミノ酸配列の１つを有していてよい。
【００１８】
配列番号１０：syelmqppsvsvssgqtasipcsgdkleekyvswyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００１９】
配列番号１１：syeltqplsesvaqgqtaritcggnniesrnvhwyqqkpgqapvlviyrdnnrpsgiperfsgsnsgnmatltisraqagdaadyycqvwdnytvlfgggtkltvl;
【００２０】
配列番号１２：
syeltqppsvavapgktaritcggnnigsknvhwyqqkpgqapvlviyrdsnrpsgiperfsgsnsgntatltisraqagdeadfycqvwdnyivlfgggtkltvl;
【００２１】
配列番号１３：
qavltqppsvsvapgqtaripcegnnigsknvhwyrqkpgqvpvlvmyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００２２】
配列番号１４：
qpvltqplsvsvapgqtaritcggnnigsknvhwyqqkpgqapvlviyrdssrpsgiperlsgsnsgdtatltisraqagdeadyycqvwddyivvfgggtkltvl;
【００２３】
配列番号１５：
syeltqppsvsvtpgqtatitcgandigkrnvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００２４】
配列番号１６：
qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl．
【００２５】
前記抗体または前記抗原結合断片は、重鎖の可変領域を含有するか、またはそれからなるが、下記のアミノ酸配列（配列番号９）：evqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvss
を有していてよい。
【００２６】
好ましい実施態様においては、ＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える前記抗体または前記抗原結合断片は、完全ヒト型である。
【００２７】
更なる好ましい実施態様においては、本発明の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を、このような細胞上に発現しているＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に基づいて、活性化できる。すなわち、結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に基づいて、生物学的応答（特に、シグナル応答）の誘発を可能にしている。好ましくは、結合分子は、このような細胞への結合によって 抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）と類似の方法で、細胞殺滅を引き起こすこともできる。
【００２８】
本発明の結合分子がＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を活性化することができるかどうかを試験するため、例えば本明細書の実施例に記載のように、末梢血ＮＫ細胞におけるカルシウム動因を誘発する能力を試験できる。NK細胞媒介細胞傷害性を引き起こす本発明の結合分子の能力は、また本明細書に記載の実施例のように、新たに単離されたＮＫ細胞を用いた、リダイレクテッド細胞溶解（re-directed cell lysis）を検出するカルセイン放出分析を用いて試験できる。
【００２９】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有し、ＦｃγＲＩＩＩＢに対する特異性を欠くだけでなく、１以上の更なる抗原への特異性も有する 、結合分子も提供する。したがって、本発明の結合分子は、多特異性である。本明細書で用いられる「多特異性」なる用語は、本発明の結合分子が、ＦｃγＲＩＩＩＢに対する特異性を欠く一方で、少なくとも２つの特異性を有し、その１つはＦｃγＲＩＩＩＡに対するものであることを意味する。したがって、本発明の多特異性結合分子は、例えば、一本鎖のダイアボディ(diabody)、(scFv)2、タンデムの二特異性抗体(TandAb)、トリボディ（tri-body）（三特異性抗体）、テトラボディ（tetrabody）（四特異性抗体）およびフレクシボディ（flexibody）のような、二特異性、三特異性、および四特異性分子を少なくとも包含する（Ｌｅ Ｇａｌｌら，１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ ４５３：１６４−１６８およびＷＯ０３／０２５０１８を参照）。
【００３０】
それらの多特異性によって、本発明のこの態様の結合分子は、マクロファージまたはNK細胞を、更なる抗原またはこのような抗原を有する細胞へ向けさせ、それによって当該抗原または抗原を有する細胞を貪食作用またはNK細胞媒介細胞殺滅によって絶滅させうる。例えば、本発明の結合分子は腫瘍特性抗原に対する更なる１以上の特異性を有しえ、これによってNK細胞を腫瘍細胞に向けうる。ＦｃγＲＩＩＩＡに結合している結合分子によって生じるＮＫ細胞の活性化は腫瘍細胞の破壊を導く。この様式によって、本発明の結合分子を、その更なる特異性または特異性に依存して、罹患細胞および病原体（例、バクテリア、真菌類、マイコプラズマ、ウイルス、寄生体、プリオン）の治療および／または排除の目的で用いることができる。
【００３１】
したがって、本発明の更なる態様において、前記のように本発明は、少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する結合分子を提供する。本発明のある実施態様では、少なくとも１つの更なる抗原は、細胞表面抗原である。本発明の実施態様によって結合分子が特異性を示す細胞表面抗体の例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体タンパク質（腫瘍胎児抗原未成熟ラミニン受容体ＯＦＡ−ｉＬＲとしても知られる）、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ−１、ＥｒｂＢ１としても知られる）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ−２、ＥｒｂＢ２、ｎｅｕとしても知られる）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ−３としても知られている）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ（胎盤アルカリホスファターゼ）、トムセン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５である。
【００３２】
更なる実施態様においては、前記「少なくとも１つの更なる抗原」は、例えば病原体由来の抗原であり、当該抗原は宿主細胞、感染細胞、細菌、真菌類、マイコプラズマ、寄生体もしくはウイルスから分泌されるか、またはそれらの外表面上に発現されたものでもよく、あるいはこのような病原体の溶解に基づいて放出されたものでもよい。例えば、本発明の結合分子は、ＣＭＶ感染細胞表面上のｇｐ３４もしくはｇｐ６８のようなウイルスタンパク質、またはインフルエンザウィルスの存在に基づく赤血球凝集素に対して更なる特異性を有してもよく、それによってウイルス感染細胞を標的とするか、または直接的にウイルスを標的とすることができる。その代わりに、病原体がプリオンである場合、プリオンタンパク質自体が抗原となりうる。
【００３３】
更なる実施態様においては、少なくとも１つの更なる抗原は、アレルゲンであるか、または循環ＩｇＥまたは（特に）肥満細胞上のＦｃεＲＩ受容体のような、アレルゲンに対する身体の応答に関与する分子である。
【００３４】
好ましくは、本発明の本態様の結合成分においては、前記少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性は、抗体またはその抗原結合断片によって与えられる。前記のように、当業者は、抗体の型（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、およびこのような抗体に由来する抗原結合断片（例えば、免疫グロブリンＬ鎖、免疫グロブリンＨ鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＣＤＲ）に精通しており、これらもまた、本発明の本態様で用いられうる。好適な実施態様において、前記抗体はＩｇＧ抗体である。
【００３５】
したがって、本発明の、多特異性の、特に二特異性の結合分子は下記のフォーマットのいずれかを有する：二特異性ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ２、（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ）２、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合タンパク質、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）２、（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、二特異性ダイアボディ、ジスフィルド安定化（ｄｓ）ダイアボディ、ノブ・イントゥ・ホール ダイアボディ（‘ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｗｈｏｌｅ’ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、フレクシボディ、ＤｉＢｉ ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、［（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ］２、（ｓｃＤｂ−ＣＨ３）２、（ｓｃＤｂ−Ｆｃ）２、ジ−ダイアボディ（Ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｔａｎｄｅｍａｂ（ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｅ Ｇａｌｌ，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，７：２３３−２４２、ならびにＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ，２００５，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：６４９−６５８でレビューされている）。好適な実施態様においては、結合分子はＴａｎｄＡｂまたはフレクシボディである。他の多くの二特異性抗体フォーマットとは異なり、ＴａｎｄＡｂは抗体可変領域のみを含有するホモダイマーであり、そのフォーメーションは異なるポリペプチド鎖上に位置するｓ相補的ＶＨおよびＶＬ領域の会合によって決定される。ＴａｎｄＡｂはダイアボディおよび（ｓｃＦｖ）２の２倍のサイズであり、二価的にエフェクターと標的細胞との両方に結合でき、例えばダイアボディーおよび（ｓｃＦｖ）２に対して、改善された薬物動態学的特徴を有し、例えば、インビトロおよびインビボの両方において、より高い安定性および促進された生物学的活性を有する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９３：４１−５６；Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：４３３６−４３４１；Ｒｅｕｓｃｈら，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２：５０９−５１８）。同じ特異性を有する同属のＶＨおよびＶＬ領域の分子間鎖の対合は、二特異性ｓｃＦｖＢ−ダイアボディＡ−ｓｃＦｖＢタンデム分子（いわゆる、“フレクシボディ”）（ＡおよびＢは、同一または異なる特異性を有してよい）の形成にも用いられうる。分子間鎖の対合に関係する相補領域の会合の厳格さおよびそれらを分けるリンカーの長さに依存して、二特異性一本鎖分子の２量体、３量体、および更に４量体が形成されうる。
本発明の本実施態様で用いられ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆タンパク質、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムセン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファー、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＩｇＥに対する特異性を示す抗体および抗体結合断片の例は、病原体に対する抗体として、公知文献に記載されている（例えば、ＥＰ−Ａ−１３１４７４１、Ｒｅｆｆら，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５、ＥＰ−Ａ−１００５８７０、ＷＯ０１／９２３４０、ＵＳ６，０３３，８７６、ＷＯ８６／０３２２３、Ｂｕｔｏら，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ １２：１−５、ＵＳ６，６９９，４７３、ＷＯ９８／５０４３３、ＵＳ５，７７０１９５、ＥＰ−Ａ−０５０２８１２、Ｃａｒｔｅｒら，１９９２ ＰＮＡＳ ８９：４２８５−４２８９、ＵＳ ５，９６８，５１１、ＷＯ ０４／１０６３８３、Ｎｏｕｒｉら，２０００ ＢＪＵ Ｉｎｔ．８６：８９４−９００、ＥＰ−Ａ−０４２９２４２、Ｒａｖｎら，２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４３：９８５−９９６、Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇら，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６３−７１、ＷＯ８８／０５０５４、ＷＯ０２／０５３５９６、ＷＯ０４／０７１５２９、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，１９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：８０５−８１４、Ｐｒｅｓｔａら，１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２を参照）。これらの引用文献は、このような抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列またはそれらをコードする核酸配列を提供するところ、当業者は本発明の結合分子の生産に直接的にこのような配列を直接利用することができる。これらの引用文献は、このような抗体または抗原結合断片を産生するハイブリドーマまたはセルラインを開示するところ、当業者は、標準的な分子生物学の技術を用いて、適当なハイブリドーマまたはセルラインから，所望する抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を得ることができ、いったん得られた核酸配列は、本発明の結合分子の構築に用いることができる。
本発明の更なる態様は、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＦアレルおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖアレルにほぼ同じ親和性で結合可能な、前記の態様のいずれか１つ記載の結合分子を提供する。すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡの２つの１５８アレルに対する前記結合因子の親和性の違いは２倍以下である。本発明の本態様にしたがった好適な具体例において、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、本明細書に記載の４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖ由来の抗体または抗原結合断片によって与えられる。本発明のこの態様に従った好ましい実施態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、本明細書中に記載の、４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖに由来する抗体または抗原結合断片によって与えられる。特に好ましい実施態様においては、本発明の当該態様に従った結合分子は、ＴａｎｄＡｂ型であり、本明細書中に記載の４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖに由来する抗原結合断片およびＣＤ１９またはＣＤ３０に対する特異性を有する抗原結合断片を含有する。
【００３６】
当業者は、本発明の結合分子が人の治療で使われることが意図されるところにおいて、結合分子の潜在的な免疫原性は最小にされるべきであることを理解するであろう。したがって、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／または更なる抗原に対する特異性は、抗体または抗原結合断片によって与えられるところ、抗体または抗原結合断片は、キメラ、ＣＤＲ移植ヒト化、または完全ヒト型であることが好ましい。より好ましくは、抗体または抗原結合断片は、ヒト化または完全ヒト型である。抗体のヒト化を実行する標準的な分子生物学的技術の使用は、現在では、当該技術分野においてはルーチン的なものであり、非ヒト抗体配列を用いて提供され、当業者が容易にこのような抗体のヒト化変種を製造することができる。本明細書で用いられる「完全ヒト型」なる用語は、それが抗体または抗原結合断片に関する限りにおいて、抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列がヒトから得られる（すなわち、ヒトに由来するか、またはヒトの中に見いだされうる）ことを意味する。
上記の方法に代えて、または加えて、免疫原性を減らすために用いられうるもう１つの技術が、デイムニゼーション（deimmunisation）の技術である。デイムニゼーション技術は、抗体および他のタンパク質生物学治療剤からの、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープの同定と分離を伴う。Ｔｈ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する能力を有する、タンパク質の中の短いペプチド配列を含有する。ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合剤はＴ細胞によって識別されることができ、そしてＴｈ細胞の賦活化と分化も引き起こすことができ、これは、Ｂ細胞との相互作用を介する免疫原性の獲得と維持に必要とされ、投与された生物学的治療剤に特異的に結合する抗体の分泌物をもたらす。抗体デイムニゼーションの目的で、Ｔｈ−細胞エピトープは、例えばペプチドのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合を予測するコンピューターに基づく方法によって抗体配列の中で識別される（Ａｌｔｕｖｉａら，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４９：２４４−２４５０，およびＳｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，９：１８３８−１８４６を参照）。Ｔ細胞による認識を避けるために、このようにして同定されたＴｈ細胞エピトープは、アミノ酸置換によってタンパク配列から排除される。これは、例えば、治療用タンパク質におけるＴｈ細胞エピトープをコードする核酸配列を改変する部位特異的突然変異誘発法のような標準的な分子生物学テクニックの使用を通じて達成できる。このようにして、ＨＡＭＡ（ヒトの抗マウス抗原性）および／または抗イディオタイプ応答が抑制または回避されるように、抗体または抗原結合断片を修飾できる（Ｂａｎｄｅｒら，２００３，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３０：６６７−６７６；Ｎａｎｕｓら，２００３，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１７０：Ｓ８４−Ｓ８９）。このように、更なる実施態様では、本発明の結合分子は、修飾されて、それらの配列に存在しているＴｈ細胞エピトープが除去されている。本明細書中、このような結合分子を、デイムナイズされた結合分子と称する。
【００３７】
更なる態様においては、本発明の結合分子は、更なる機能的領域を含有する。この機能的領域が結合分子にエフェクター特性を与えることができる。例えば、機能的領域は、ＦｃＲ結合ペプチドまたは抗体のＦｃ領域であってもよく、それらは、それらのＦｃ受容体結合能を通じて、結合分子にエフェクター特性を与える。代わりに、当該機能的領域はプロドラッグを活性薬物に変換できる酵素であってもよい。このようにして、本発明の結合分子を、抗体依存性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に用いることができる。更なる実施態様では、機能的領域は、結合分子の血清半減期を増加させるタンパク質またはペプチドである。このようなタンパク質の例は、ＦｃγＲｎ（新生児のＦｃ受容体）への結合能によって、結合分子の血清半減期を増加させられる結成アルブミンまたはＩｇＧのＦｃ部である。更なる実施態様では、機能的領域はサイトカインであってもよい。
更なる態様では、本発明の結合分子を、標識分子、あるいは毒素に結合させることができる。標識分子または毒素がタンパク質である場合、結合分子への結合は、ペプチド結合または化学的結合によって生じさせうる。したがって、本発明の当該態様によれば、結合分子は、標識分子または毒素が、ペプチド結合、好ましくはペプチドリンカーによって結合分子に連結された融合タンパク質の形態であるか、または化学的複合体の形態であってもよい。疑義の回避のためであるが、本明細書中、複合体なる用語は、２つのコンポーネントが、ペプチド結合（したがって、複合体は融合タンパク質を包含する）、化学結合、エステル結合、またはジスルフィド架橋によって物理的に連結されていることを意味するために用いられる。
放射能標識または螢光もしくは発光標識（化学発光を含む）のような標識分子への本発明の結合分子の結合は、当該結合分子が免疫学的染色試薬として使われることを可能にする。このような試薬は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現している組織潜入ＮＫ細胞、マクロファージ、またはマスト細胞の検出に、あるいは当該結合分子が更なる抗原に特異性を示す場合は、ＮＫ細胞−結合分子−更なる抗原の複合体の検出に用いられうる。後者の検出は、疾患の診断、または疾患の進行もしくは寛解のモニタリングにおいて、特に有用たりうる。
【００３８】
本発明の結合分子が、リボシル転移酵素、セリンプロテアーゼ、グアニルシクラーゼアクティベーター、カルモジュリン依存アデニルシクラーゼ、リボ核酸酵素、ＤＮＡアルキル化剤または有糸分裂抑制剤（例えばドキソルビシン）等のような毒素分子に連結されている場合、当該結合分子は、ＮＫ細胞と大型食細胞をターゲットにして、破壊させるために用いることができる。従って、このような結合分子は免疫抑制薬として使用できる。当業者は、本発明の当該態様において、結合分子がただ１つの抗原、すなわちＦｃγＲＩＩＩＡのみに対して特異性を示すことが好ましいことを理解するであろう。免疫系の抑制は、選択的および特異的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合する一価抗原結合断片を含有するか、またはそれからなる結合分子の使用によっても達成されうる。このような一価の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体をブロックする分子として作用し、架橋されず、これによってＮＫ細胞またはマクロファージを活性化しないので、好ましい。好ましい一価の抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲを包含する。
【００３９】
当業者は、化学的連結を介する標識分子または毒素の付加の代わりに、ペプチド標識またはペプチド毒度もまた用いることができることを理解するであろう。例えば、本発明の結合分子は、テトラ−、ペンタ−、もしくはヘキサ−ヒスチジン・タグ、またはｃ−ｍｙｃタグ等のようなＮ−またはＣ−末ペプチド・タグとの融合タンパク質として発現してもよい。
本発明の結合分子は、任意の適当なタンパク質発現系における、それらをコードする核酸の発現によって生産されてもよい。したがって、更なる態様においては、本発明は、本発明の結合分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の当該態様における使用に特に適当なポリヌクレオチドは、前記表１に記載のＣＤＲをコードする。特に、表１の軽鎖および重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を手に入れた当業者は、下記の核酸配列から，様々な軽鎖および重鎖ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列を得ることができるだろう。
【００４０】
配列番号1:
gaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca;
【００４１】
配列番号2:
tcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４２】
配列番号3:
tcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４３】
配列番号4:
tcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctg
【００４４】
配列番号5:
caggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４５】
配列番号6:
cagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４６】
配列番号7:
tcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４７】
配列番号8:
cagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４８】
配列番号１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しないヒトｓｃＦｖに由来する重鎖可変領域をコードする。配列番号２〜８は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しないヒトｓｃＦｖに由来する軽鎖可変領域をコードする。したがって、配列番号１〜８は、また本発明のポリヌクレオチドの例であり、本発明の更なる結合分子の生産に用いることができる。
【００４９】
本発明の、多特性結合分子、特に二特異性結合分子、をコードするポリヌクレオチドは、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しない抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列を、更なる抗原に対する特異性を有する抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列と組み合わせて用いて、ＷＯ０３／０２５０１８に記載の方法で構築することができる。
【００５０】
適当なタンパク質発現系で結合分子を発現させるため、当該結合分子をコードするポリヌクレオチドを適当なプロモーター、および所望による適当な転写ターミネーターに、作動可能に連結する。これは、本発明のポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入し、ゲノムに存在するプロモーターを利用して当該ポリヌクレオチドの発現を促進することによって、達成できる。別法として、本発明のポリヌクレオチドを、作動可能にプロモーターおよび所望によるターミネーター領域に連結したベクター上で、宿主細胞に導入してもよい。
【００５１】
一般に、結合分子をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結するベクター中のプロモーターは、当該ポリヌクレオチドおよびベクターを導入する宿主細胞中で結合分子の発現の促進を可能にする任意のプロモーターである。したがって、結合分子が細菌細胞で発現することを所望する場合は、プロモーターは細菌細胞中で作動可能である。同様に、結合分子を真菌発現系で発現させることを所望する場合は、プロモーターは真菌細胞で作動可能であり、構築物が哺乳類細胞培養系、昆虫細胞発現系、または植物細胞発現系に導入される場合、同様のロジックが適用される。本発明のポリヌクレオチドが作動可能に適当な転写ターミネーター領域に連結される場合、これは本発明の結合分子が発言される宿主細胞における転写終結を媒介するものである。この目的に適した転写ターミネーター領域は、技術文献に開示されている。
【００５２】
好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチドはまた、作動可能にシグナル配列に連結されてもよい。これは、当該結合分子の発現を、所望する細胞の、または細胞外の部位に向けることを可能にするものである。例えば、いくつかの態様においては、結合分子は、それが発現する細胞から分泌されることが望まれうる。この場合、シグナル配列は分泌シグナルをコードする。
適当な細菌の分泌シグナルは技術文献に記載されており、そのような一例は、ＰｅｌＢリーダー配列である。他の態様では、例えば、真核生物での発現に関連して、結合分子の発現が小胞体（ＥＲ）で保持されることが望まれうる。この場合、シグナル配列は“ＫＤＥＬ”（配列番号５４）モチーフ、特に“ＳＥＫＤＥＬ”（配列番号５５）コードする配列をコードするＥＲ保留シグナルを含有する。
本発明のポリヌクレオチドはまた、選択された特定の発現宿主に適合するように変更されたコドンバイアスを用いて、当該技術分野で容易に利用可能な方法に従って最適化された、コドンであってもよい。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、適当な方法論を用いて宿主細胞に導入することができる。真核細胞では、このような技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション法、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、またはレトロウイルス、アデノウイルスまたはその他のウイルス（例えば、小痘瘡、または昆虫細胞についてはバキュロウィルス）を用いた形質導入が挙げられる。
細菌細胞では、適当な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション法、またはバクテリオファージを使ったトランスフェクションが挙げられる。植物細胞では、形質転換される特定の植物種に依存して、アグロバクテリア媒介形質転換、エレクトロポレーション法、植物細胞およびプロトプラストの微量注射、微粒子銃、細菌ボンバートメント（特に、「ファイバー」法または「ウィスカー」法）が挙げられる。したがって、更なる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞を提供する。したがって、下記の生物体に由来し、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞は、当該態様の具体例であると考えられる。
【００５４】
本発明の結合分子の発現のための適当な発現系としては、微生物発現系（例、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現系）、および例えば酵母（例、（サッカロマイセス・セレビッシェ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピシア・スピーシーズ（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ハンゼヌラ・スピーシーズ（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ））および他の真菌発現系（例、アスパージーラス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびニューロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような糸状菌発現系、哺乳類発現系（例、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）、昆虫細胞発現系、ならびに植物発現系が挙げられる。ベニバナが植物発現系として特に好ましい。当業者は、技術文献に記載されている、これらの発現系に精通しているであろう。
【００５５】
本発明はまた、本発明の結合分子の生産方法も提供する。したがって、更なる態様においては、本明細書に記載の結合分子の生産のための方法が提供される。当該方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入、および当該結合分子が発現する条件下での当該宿主細胞の培養を含む。宿主細胞の生育および維持、ならびにこのような宿主細胞からの本発明の結合分子の発現の媒介の条件は、技術文献に完全に記載されている。ある実施態様では、当該方法は、更に結合分子の単離、および所望により更に精製を含む。
【００５６】
本発明の結合分子が、当該結合分子に化学的に結合している標識分子または毒素分子を含有する場合、当該複合化された結合分子は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入、本発明の結合分子が発現する条件下での宿主細胞の培養、結合分子の単離および単離された結合分子の適当な標識または毒素との結合によって生産できる。一般に、複合化工程は、技術文献で記述されているように、ジスルフィドまたはチオエーテル架橋をもたらすヘテロ２価架橋試薬の使用を伴う（架橋試薬の使用に関連した標準的な方法論のために、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．“ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９６を参照）。
【００５７】
当業者は、本発明のいくつかの実施態様によって、体内の結合分子の循環半減期を増加させることが望ましい可能性があることを理解するであろう。前述のように、これは、様々な方法、例えば、アルブミン等との融合タンパク質としての結合分子の構築を通じて、達成することができる。分子の血清半減期を増加させる更なる方法は周知であり、例えば、ＰＥＧ化、シアリル化、およびグリコシル化が挙げられる。したがって、本発明は、本明細書に記載の結合分子が、ＰＥＧ化、シアリル化またはグリコシル化されているものを包含する。
本発明はまた、結合分子および少なくとも１つの追加成分を含有する組成物を含む。例えば、当業者は、発現後の宿主細胞からの結合分子の単離において、実質的に精製された結合分子を含有するが、不純物、希釈分、または緩衝剤等も含んでいる組成物が得られうることを理解するであろう。このような中間的組成物は、更なる使用に直接適している場合もあり、または、それから結合分子をさらに精製してもよい。
【００５８】
本発明の組成物はまた、本発明の結合分子を、任意の適当な薬学的に受容できる担体、賦形剤、希釈剤および／または安定剤との組み合わせにおいて含有してもよい。このような成分は、技術文献に記載されており、当業者はそれに精通しているであろう。好ましくはこのような組成物は、対象への投与に適した任意の形態、特に、例えば注射または点滴等の適当な非経口投与に適した形態である。
【００５９】
組成物が注射あるいは点滴用である場合、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態であってよく、懸濁化剤、防腐剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤成分を含んでいてもよい。これにかえて、結合分子または組成物が適当な無菌液を用いて使用前に再形成する、乾燥形態であってもよい。
【００６０】
本発明の結合分子および組成物、特に多特異性結合分子およびそれを含有する組成物は、例えば、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症（移植片対宿主病を含む）、アレルギーおよびがん（例えば非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫／疾病；固形腫瘍（例えば、乳がん、卵巣がん、大腸がん、腎臓のがん腫、または胆管がんで生じているもの）；微小残存病変；転移性腫瘍（例えば、肺、骨、肝臓または脳内で転移しているもの）等の疾患の診断および／または治療に用いることができる。
【００６１】
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ１９またはＣＤ２０への特異性である本発明の多特異性結合分子は、特に非ホジキンリンパ腫の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＥＧＦＲ１に対するものである多特異性結合分子は、ＥＧＦＲ１発現が上昇または変化しているがん（例えば、乳、膀胱、頭頚部、前立腺、腎臓のがん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん腫、および膠腫）の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＴＦ−抗原に向けられたものである多特異性結合分子は、特に乳がんもしくは大腸がんおよび／または肝転移の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ３０に対するものである多特異性結合分子は、特にホジキン病の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＩＬ４受容体のα鎖（ＩＬ４Ｒα）に対するものである多特異性結合分子は、固形腫瘍、特に乳房、卵巣、腎臓系、および頭頚部のがん腫、悪性黒色腫ならびにＡＩＤＳ関連のカポジ肉腫の治療に有用である。
【００６２】
少なくとも１つの更なる特異性がＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３および／またはＥＧＦＲ２／ｎｅｕに対するものである多特異性結合分子は、特に乳がんの治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＩＧＦＲに対するものである多特異性結合分子は、特に前立腺がん、結腸直腸がん腫、卵巣がんまたは乳がんの治療に有用である。
【００６３】
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ５に対するものである多特異性結合分子は、特に慢性リンパ性白血病の治療に有用である。
【００６４】
少なくとも１つの更なる特異性がＭＵＣ−１に対するものである多特異性結合分子は、特に胃がんと卵巣がんの治療に有用である。
【００６５】
少なくとも１つの更なる特異性がＥｐＣＡＭに対するものである多特異性結合分子は、特に結腸、腎臓および乳房のがん腫の治療に有用である。
【００６６】
少なくとも１つの更なる特異性がＰＬＡＰに対するものである多特異性結合分子は、特に卵巣または睾丸がんの治療に有用である。
【００６７】
少なくとも１つの更なる特異性がＯＦＡ−ｉＬＲに対するものである多特異性結合分子は、特に転移性腫瘍の治療に有用である。
【００６８】
本発明の更なる態様においては、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、アレルギーまたはがん腫（例、非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫；固形腫瘍（例えば、乳がん、卵巣がん、大腸がん、腎臓のがん腫、または胆管がんで生じているもの）；微小残存病変；転移性腫瘍（例えば、肺、骨、肝臓または脳内で転移しているもの）の治療用の医薬の製造における前記の結合分子の使用が提供される。具体的な多特異性結合分子が、前記で具体的な疾患の治療における特定の有用性を有するものとして記載されている場合、これらの結合分子は、具体的な疾患用の薬剤の製造においても使用できる。
【００６９】
更なる態様では、本発明の結合分子はＦｃγＲＩＩＩＡを発現する細胞を染色する試薬として用いることができる。当該結合分子が少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する場合、これを、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現細胞−結合分子−抗原複合体を同定できる試薬として用いることができる。本発明の結合分子は、バイオマーカーとして、患者の生体外試料の分析および型の決定、および生体外治療のためのＮＫ細胞の単離に用いることができる。
【００７０】
したがって、更なる態様では、前記の結合分子、および、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合したとき当該結合分子を検出する手段を含有するキットが提供される。当該結合分子が放射能標識または化学発光標識で標識される場合、前記検出手段は、放射線または化学発光標識に感受性を有するフィルムを含有する。前記結合分子がヒスチジンまたはｃ−ｍｙｃタグを付加される場合、当該キットはこのタグを認識する抗体を含有してもよい。
【００７１】
本発明の種々の態様を、実施例によって、より詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱しない範囲で細部の変更がなされることが理解されよう、また当業者は、本発明における使用のための更なる抗体と抗原結合断片が本明細書の実施例２に記載のように得られ、ＦｃγＲＩＩＩの異なるアイソフォームおよびＦｃγＲＩＩＩの異なる対立遺伝子型への結合に関するそれらの性質は、本明細書の実施例のように試験できることを理解するであろう。
【００７２】
疑義の回避の目的であるが、本明細書中、“ＦｃγＲＩＩＩ”、“ＦｃγＲＩＩＩＡ”、および“ＦｃγＲＩＩＩＢ”なる用語は、“ＣＤ１６”、“ＣＤ１６Ａ”（ＣＤ１６のＡアイソフォームを意味する）および“ＣＤ１６Ｂ”（ＣＤ１６のＢアイソフォームを意味する）なる用語とそれぞれ相互に交換して用いることができる。
【実施例１】
【００７３】
ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質のトランジェントな発現および精製
分泌・可溶型のＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ１６ＡをコードするプラスミドｐＣＤＭ−ＣＤ１６−Ｆｃ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９、上掲）のトランジェントな形質転換の後、ＨＥＫ−２９３細胞中で生産した。
【００７４】
ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）を、完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、および１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（全てInvitrogen社（カールスルーエ、ドイツから入手））中、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿大気中で培養した。これらの細胞のリン酸カルシウム媒介形質転換は、下記のように行った。
【００７５】
形質転換の１日前に、１．５ｘ１０６のＨＥＫ−２９３細胞を用いて、直径１０ｃｍの細胞培養プレート中の１０ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地に播種した。１０μｇのプラスミドＤＮＡを５００μｌの２５０ｍＭ ＣａＣｌ２と混合し、ついで、これを５００μｌの２×ＨＥＢＳ緩衝液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）に滴下し、および室温で１５分間インキュベーションした。９ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地をこの形質転換カクテルに添加、混合し、および培養培地を除去したＨＥＫ−２９３細胞の１つの皿に移した。翌日、形質転換培地を無血清ＤＭＥＭ培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンおよび１×インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ａ サプリメント（全てInvitrogen社から入手）を添加したＤＭＥＭ培地と交換した。分泌ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ 融合タンパク質を含有する上静を、細胞の生育性に依存して、形質転換後２〜６日の期間内に２回回収した。各回収の後、新鮮な無血清培地を当該細胞に添加した。回収した上静を遠心分離して細胞または細胞破片を除去し、融合タンパク質の精製のための使用まで−８０℃で保存した。ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を含有する約１．２Ｌの上静を得るまで、形質転換を繰り返した。
【００７６】
組換えＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の精製を、２ｍＬ プロテインＡカラム上で実施した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。カラムを１０容量のＤＭＥＭ ｐＨ７（Invitrogen社；１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ａおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン添加）を用いて平衡化した。細胞培養上静（１２００ｍｌ）のカラムへのロード前に、０．２μｍ無菌フィルターを通過させ、および０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）の添加によりｐＨ７に調整した。カラムは、４℃で、重力流下で動作させた。次いで、カラムを１０容量のＤＭＥＭ ｐＨ７で洗浄した。溶出は、６容量の０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて実施した。１ｍｌフラクションを直接５５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）に集めた。
【００７７】
１２％ ＰＡＡゲルにおけるフラクション番号１〜１０分析は、融合タンパク質の圧倒的多数がフラクション２〜７にあることを示した。これらのフラクションを集め、５ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して２回透析した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ社、１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によるタンパク質濃度の測定により、培養上静のリットルあたり、合計収量２１ｍｇのＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合タンパク質（すなわち、１７．５ｍｇの融合タンパク質が生産されたことが明らかになった。
【実施例２】
【００７８】
ＣＤ１６−Ａ特異的抗体の同定および単離
ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、大分子ヒトＩｇＭ由来ｓｃＦｖ ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを行った。これは、前記と同様の方法を用いて生産した（Ｄｏｅｒｓａｍら，１９９７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ ４１４：７−１３、Ｌｉｔｔｌｅら，１９９９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：３−９、Ｓｃｈｗａｒｚら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８：１７０４−６）。当該ライブラリー中のクローンは、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ遺伝子とｓｃＦｖコード配列との間のヌクレオチド配列を含んだ。これは、ヘキサヒスチジンタブ、アンバー終止コドン、およびｃ−ｍｙｃエピトープをコードする。
【００７９】
５００μｇ ＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合タンパク質を、ＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュール（Amersham Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）を用いてビオチン化し、およびファージディスプレィライブラリーに対して３回の選択に用いた。ライブラリーの選択の前に、これらのタンパク質への潜在的な吸着物を除去するために、連続的にライブラリーをストレプトアビジンでコートしたポリスチレンおよびヒトＩｇＧ（シグマ−アルドリッヒ社、タウフキルヒェン、ドイツ）に予備吸着させた。当該ライブラリーからの約１０１２ファージを、ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ，２％ スキムミルク中に再懸濁し、可溶ビオチン化ＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合体とともにインキュベーションした。磁気分離器（Ｄｙｎａｌ社、オスロ、ノルウェー）を用いて、ファージ抗原複合体を、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズによって捕らえた。標的抗原に特異的に結合しなかったファージを、ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎを用いた１０回の洗浄工程によって除去した。結合物は、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２を用いて溶出させ、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０による中和後、溶出物を、対数期中期の新しく生育したＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞の感染に用いた（ＯＤ６０００．２−０．５）。ヒトｓｃＦｖをコードするファージミドの形質転換が成功した細胞を、アンピシリン耐性によって選択し、次いでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させて、続くインビトロの選択のために、ｓｃＦｖを提示する後代ファージを生じさせた。３回目の選択後、個々のコロニーを、ＰＰ−Ｍａｓｔｅｒｂｌｏｃｋ ２ｍＬ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）内で、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有するＬＢ培地で、３０℃で生育させた。細胞を遠心分離によって回収し、２００μＬの ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％ スクロース，１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。氷上の１時間のインキュベーションの間に、外膜を破壊され、ｓｃＦｖを含有する可溶性ペリプラズムタンパク質が培養培地中に放出した。遠心分離によるスフェロプラストおよび細胞砕片の除去後、ＥＬＩＳＡで、粗精製のペリプラズム抽出物を試験した。１個のクローン（５０ＮＩ）が３回の別々の機会で見出された。
【００８０】
ファージディスプレイライブラリーからのこのクローンの親和性選択をヒトＦｃ−融合タンパク質において実施したので、クローン５０ＮＩがこの分子のＣＤ１６部分に対して特異性を示すことは必然であった。
クローン５０ＮＩ由来のペリプラズマ抽出物を前記のように調製し、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ 融合タンパク質およびヒトＩｇＧへの結合能を試験した。抗−ＣＤ１６マウスモノクローナル抗体Ａ９（Ｈｏｍｂａｃｈら，１９９３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：８３０−８３６）を対照として用いた。Ｍａｘｉｓｏｒｂ（商品名）ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６中、５００ｎｇのストレプトアビジンおよび３００ｎｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）でプレコートした。次いで、３００ｎｇのビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃを３０分間、室温、ＰＢＳ中で捕捉した。
【００８１】
ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ、ストレプトアビジンおよびヒトＩｇＧを、１μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９または５０μｌのクローン５０ＮＩ由来粗精製ペリプラズム抽出物とともにインキュベーションした。ＭＡｂ Ａ９の結合をヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍＬ，Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）で検出し、一方ｓｃＦｖ ５０ＮＩの結合を抗−ペンタ Ｈｉｓ ＨＲＰ−複合体（１μｇ／ｍＬ，Ｑｉａｇｅｎ社，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）によって検出した。５０μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ社，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）をＨＲＰ−基質および発色可能な色素として用いた。反応を５０μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、吸収を４５０ｎｍで測定した。
結果を図１に示した。ＭＡｂ Ａ９およびｓｃＦｖ ５０ＮＩは明らかにビオチン化ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を認識した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、ヒトＩｇＧ上のシグナルもストレプトアビジン単独のシグナルもどちらも示さなかった。２次試薬として用いた抗−ペンタＨｉｓ ＨＲＰ−複合体は、抗原への非特異的結合を示さなかった。しかし、ＭＡｂ Ａ９ 検出用の２次試薬として用いたヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体は、ＣＤ１６融合タンパク質のヒトＦｃ部およびネガティブコントロールとして用いたヒトＩｇＧとの交差反応性によるバックグラウンド染色を起こした。これらの結果は、ｓｃＦｖ ５０ＮＩが当該融合タンパク質のＣＤ１６Ａ部に特異性を示し、Ｆｃ部に特異性を示さないことを強く示している。
【実施例３】
【００８２】
ＣＤ１６アイソフォームを安定発現している異なったＦＡＣＳセルライン、ヒトＰＢＭＣ、および顆粒球における、ｓｃＦｖ ５０ＮＩの試験
５０ＮＩ ｓｃＦｖが細胞表面上のネイティブＣＤ１６Ａタンパク質への結合を示すかどうかを確かめるため、ｓｃＦｖの粗精製ペリプラズム抽出物を、それぞれＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂを発現する２つの異なるセルラインにおけるフローサイトメトリーによって試験した。この目的のため、ＣＤ１６Ａを発現するセルラインＢＷ／ＣＤ１６Ａ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１０５５−１０６０）およびセルライン２９３−ＣＤ１６（ヒトＣＤ１６ＢアイソフォームのＮＡ−２対立形質をコードするプラスミドで安定に形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞）を用いた。５０ＮＩ ｓｃＦｖがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上で発現するＣＤ１６Ａおよび／または好中球顆粒球の表面上に存在するＣＤ１６Ｂへの結合能を有するかどうかを評価するため（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，上掲；ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）：３９１−３９７）、新たに単離した１０−２０％のＮＫ細胞を含む末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、および９５％以上のＣＤ１６Ｂポジティブの好中球顆粒球を表す多形核細胞（ＰＭＮ）への結合を、フローサイトメトリーを用いて試験した。マウスＭＡｂ Ａ９およびマウスクローンｓｃＦｖ１８ Ａ９（ＭＡｂ Ａ９から得られたｓｃＦｖ）由来のペリプラズム抽出物をコントロールとして用いた。
【００８３】
３．１ セルラインの生育ならびにＰＢＭＣおよびＰＭＮの単離
ＢＷ／ＣＤ１６Ａ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、および１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸、および５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。２９３／ＣＤ１６Ｂ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、および５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。非形質転換の親セルラインＢＷおよび２９３を、Ｇ４１８を欠く培地である以外は、安定形質転換体についての前記のように培養した。
【００８４】
健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣおよびＰＭＮを単離した。この血液をＰＢＳで２倍希釈し、１２ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（商品名）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および上部クッションの１２ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７からなる２重クッション上に重層した。遠心分離を２５分間、８００ｇで実行した。上部のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（商品名）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のクッション上に位置するＰＢＭＣ、およびＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（商品名）クッション上に位置するＰＭＮを回収し、使用前にＰＢＳで３回洗浄した。
【００８５】
３．２ ｓｃＦｖ ５０ＮＩおよびｓｃＦｖ１８ Ａ９を含有するペリプラズム抽出物の単離
粗精製のｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を５ｍＬの細菌培養物から単離した。新たに接種した細菌を、５０ｍＭのグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地中、３７度で一晩生育させた。一晩培養した培養物をアンピシリンおよびテトラサイクリンを含有するＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．１まで希釈し、更に３７℃でＯＤ６００ｎｍ＝０．８まで生育させた。この細菌を遠心分離によって回収し、０．１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、および２０μｇ／ｍＬ テトラサイクリンを含有するＬＢ培地に再懸濁した。形質導入細菌の２１℃での一晩のインキュベーション後、３００μＬのペリプラズム抽出物をＥＬＩＳＡ用に前記のように単離した。ＦＡＣＳ分析での使用の前に、ペリプラズム抽出物をＰＢＳに対して一晩透析した。
【００８６】
３．３ フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析用に、１ｘ１０６細胞のＢＷ、ＢＷ／ＣＤ１６Ａ、ＨＥＫ−２９３、２９３／ＣＤ１６Ｂ、ＰＢＭＣおよびＰＭＮを、モノクローナル抗体Ａ９、またはｓｃＦｖ１８Ａ９および５０ＮＩを含有するペリプラズム抽出物で染色した。１ｘ１０６個の細胞を１００μＬの透析した抽出物またはＭＡｂ Ａ９（１０μｇ／ｍＬ）とともに４５分間、氷上でインキュベーションした。ＰＢＭＣおよびＰＭＮとの抗体／ｓｃＦｖインキュベーションに、１ｍｇ／ｍＬのポリクローナルのヒトＩｇＧを添加し、ＰＢＭＣおよびＰＭＮのサブ集団の表面上のＦｃ受容体をブロックした。ＦＡＣＳ緩衝液（２％の熱失活ＦＣＳおよび０．１％のアジドナトリウムを添加したＰＢＳ）での洗浄の後、細胞を氷上で４５分間、０．１ｍＬの０．０１ｍｇ／ｍＬ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ １３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いて、同じ緩衝液中で、インキュベーションした。第２の洗浄サイクル後、細胞を同じ条件下で、０．１ｍＬの０．０１５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いてインキュベーションした。次いで、この細胞を再び洗浄し、０．５ ｍＬの２μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁して、死細胞を除去した。１×１０４個の染色細胞の蛍光をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥｐｉｃｓＸＬフローサイトメーターを用いて測定した。平均蛍光強度をＳｙｓｔｅｍ−ＩＩおよびＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計算した。第２試薬のみの細胞のバックグラウンド染色によって生じる蛍光を結果および分析の補助のためにプロットしたヒストグラム（図示せず）から差し引いた。
【００８７】
３．４ 結果
マウスモノクローナル抗−ＣＤ１６抗体Ａ９およびポジティブコントロールとして用いたＡ９誘導抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ１８は、非形質転換親細胞（ＢＷ）との比較においてＢＷ／ＣＤ１６Ａへの明らかな結合を示した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、Ａ９に匹敵するレベルでＢＷ／ＣＤ１６Ａ細胞の明確な染色も示した。
【００８８】
モノクローナル抗体Ａ９およびｓｃＦｖ１８ Ａ９の両方が、表面上にＣＤ１６Ｂアイソフォームを発現する２９３／ＣＤ１６Ｂ形質転換体への強い結合を示したが、５０ＮＩはこのセルラインに結合しなかった。
【００８９】
モノクローナル抗体Ａ９およびｓｃＦｖ１８ Ａ９は、ＮＫ細胞フラクションを示すＰＢＭＣの小さなサブ集団の明確な染色を示した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩも同様にこのサブ集団への結合を示した。
【００９０】
精製した顆粒球上に強いシグナルを示したＡ９およびＡ９由来のｓｃＦｖとは対照的に、５０ＮＩ ｓｃＦｖはＰＭＮに結合しなかった。
【００９１】
このデータは５０ＮＩ ｓｃＦｖが特異的にＣＤ１６Ａアイソフォームに結合し、ＣＤ１６Ｂ アイソフォームに結合しないことを示す。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、組換ＣＤ１６ＡだけでなくＮＫ細胞表面上に発現したままのネイティブ抗原も認識する。
【実施例４】
【００９２】
ヒト抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖ ５０ＮＩの高濃度化ＮＫ細胞への結合
実施例３に示すように５０ＮＩによって認識されるＰＢＭＣサブ集団がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含有することを示すため、ＮＫ細胞の高濃度化集団ＰＢＭＣから単離し、フローサイトメトリーによってｓｃＦｖ ５０ＮＩへの結合を分析した。健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣ類を単離した。血液サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のクッション上に重層し、８００ｇで２５分間、遠心分離した。界面中に位置するＰＭＢＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＮＫ細胞の単離のため、ＰＢＭＣを２％のＦＣＳ／ＰＢＳ中に再懸濁し、製造者の説明書に従い、ＥａｓｙＳＥＰ（商品名）ネガティブＮＫ細胞濃縮キット（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた１回のネガティブ選択に付した。ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞の染色ならびにサイトメトリー分析を本質的に前記実施例３の記載と同様に行った：１×１０６個の細胞を１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９または抗−ＣＤ５６モノクローナル抗体ＭＡｂ Ｂ１５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ついで１５μＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。マウスｓｃＦｖ１８ Ａ９およびヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩを５０μｇ／ｍＬの濃度で染色に用い、細胞に結合したｓｃＦｖを１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６、ついで１５μＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。全ての染色は、１ｍｇ／ｍＬのポリクローナル ヒトＩｇＧの存在下で実施した。死細胞を前記のようにヨウ化プロピジウム染色によって除外した。データ分析は、前記の実施例３に記載のように実施した。
【００９３】
４．１ 結果
抗−ＣＤ５６抗体および抗−ＣＤ１６抗体によるＰＢＭＣの染色は、ＮＫ細胞フラクションを示す小さなサブ集団を明確に同定した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、ＮＫ細胞への結合を示す類似した小さな細胞集団もまた認識した。
ＮＫ細胞のネガティブな高濃度化の後、全ての４つの抗体／ｓｃＦｖは明確な染色を示した。抗ＣＤ５６ ＭＡｂが完全なＮＫ細胞集団への結合をしめした一方で、細胞の小さなフラクションは、ＣＤ１６に対する抗体を用いて染色されなかった。これは、ＣＤ１６−ネガティブの表現型を有するいくらかの細胞の存在を反映している可能性がある。
【実施例５】
【００９４】
ｓｃＦｖ ５０ＮＩ結合後のＣａ２＋フラックス測定
ＩｇＧに対する低親和性受容体であるＣＤ１６Ａは、ＦｃεＲＩ由来のγ鎖またはＴＣＲ／ＣＤ３由来のζ鎖を含有する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に関連して、多数のヒト末梢血ＮＫ細胞上で発現する。抗体または免疫複合体へのＣＤ１６Ａの結合は、ＮＫ細胞傷害性およびサイトカイン分泌のきっかけとなる。この活性化は、γ鎖またはζ鎖の各々のリン酸化、およびこれに続く細胞内のシグナル変換（例、Ｃａ２＋動員）のきっかけとなる。
【００９５】
ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩがＮＫを活性化する性質を有するかどうかを試験するため、表面受容体の抗−ＣＤ１６ モノクローナル抗体またはｓｃＦｖｗとの連結後に、新たに単離したＮＫ細胞を用い、Ｃａ２＋フラックス測定を実施した。いくつかの抗−ＣＤ１６抗体は、細胞内カルシウムの明確な増加の誘起のために、２次試薬による架橋を必要とするので、抗−ｍｙｃおよび抗−（Ｈｉｓ）６を抗−マウスＩｇＧと組み合わせて、細胞−結合抗−ＣＤ１６抗体の架橋に用いた。
【００９６】
ＮＫ調製のため、健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣ類を単離した。血液サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（商品名）のクッション上に重層し、８００ｇで２５分間、遠心分離した。界面中に位置するＰＭＢＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＮＫ細胞の単離のため、ＰＢＭＣを２％のＦＣＳ／ＰＢＳ中に再懸濁し、製造者の説明書に従い、ＥａｓｙＳＥＰ（商品名）ネガティブＮＫ細胞濃縮キット（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた１回のネガティブ選択に付した。ＮＫ細胞をＨＢＳＳで１回洗浄し、その後カルシウムインジケーターであるフルオ−４−アセトキシメチル（ＡＭ）エステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を２μＭの濃度で、３０分間、室温、暗環境で標識した。ＨＢＳＳ洗浄後、この細胞を更に２０分間ＨＢＳＳ中でインキュベーションし、完全に細胞内ＡＭエステルを脱エステル化させ、再度ＨＢＳＳで洗浄した。細胞内カルシウム変化のフローサイトメトリー分析のため、一定量の標識化ＮＫ細胞を最初に抗体無しでＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬサイトメーター上で測定し、バックグラウンド蛍光を決定した。約６０秒後、抗−ＣＤ１６抗体（２μｇ ＭＡｂ Ａ９または５μｇ ｓｃＦｖ１８ Ａ９または５μｇ ５０ＮＩ ｓｃＦｖ）を添加し、測定を続けた。開始１８０秒後、２０μｇのポリクローン性ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＧＡＭ）をＭＡｂ Ａ９サンプルに添加し、ＮＫ細胞表面上のＣＤ６に結合しているＡ９を架橋した。ｓｃＦｖの架橋のため、２．５μｇ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ １３／４５／３１−２および２．５μｇ 抗−ｃ−ｍｙｃ ＭＡｂ ９Ｅ１０を、継続する測定の前にアプライした。ｓｃＦｖを有するサンプルの場合、２０μｇのポリクローン性ヤギ抗−マウスＩｇＧ 抗体をより遅い時点で添加し、抗−（Ｈｉｓ）６および／または抗−ｃ−ｍｙｃ ＭＡｂｓをｓｃＦｖに更に架橋させた。短時間の間隔からの平均蛍光強度をＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社，Ｋｒｅｆｅｌｄ，ドイツ）を用いて決定し、時間に対してプロットした（図示せず）。
新たに単離したＮＫ細胞で得られた蛍光トレーシングは、明確に、ＭＡｂ Ａ９が、抗−マウスＩｇＧ抗体との架橋において細胞内カルシウム濃度の強い増加を誘起することを示した。これは、より高い蛍光シグナルによって反映される。ＭＡｂ Ａ９と対照的に、Ａ９由来のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１８ Ａ９）は、抗−（Ｈｉｓ）６、抗−ｃ−ｍｙｃおよび抗−マウスＩｇＧ抗体との架橋後も、ほとんどまたは全く細胞内カルシウムの増加を誘導しなかった。しかし、ヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩは、細胞表面に結合したｓｃＦｖの、架橋抗体への連結の後に、明確な（しかし若干弱い）蛍光シグナルを誘導した。このことは、ヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩが、ＣＤ１６Ａを介するＮＫ細胞活性の作動のために適当な結合特性を有することを示す。
【実施例６】
【００９７】
軽鎖シャッフリングによる５０ＮＩ ｓｃＦｖの親和性変異
親和性が増加している抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを得るため、５０ＮＩ ＶＨ 鎖のＶＬ遺伝子レパートリーとの再編成により、クローン５０ＮＩに基づくチェーン・シャッフルド・ライブラリー（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を生産した。ＶκおよびＶλ遺伝子レパートリーを、前記の巨大なヒト・ナイーブｓｃＦｖライブラリー（Ｓｃｈｗａｒｚら，上掲、２００４）を由来とするｐＥＸＨＡＭ１ ＤＮＡから切り出した。このレパートリーは、それぞれ約１０５の個々のＶκおよびＶλ鎖を反映する。ｐＥＸＨＡＭのＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ部位へのクローニングによる５０ＮＩ重鎖を用いた再編成と、１μｇのＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅへの形質転換（１．８ｋＶ，０．１ｃｍギャップキュベット、２５μＦ、２００Ω）により、２．６×１０６（Ｖκ）および２．２×１０６（Ｖλ）の数のライブラリーを得た。
形質転換後にランダムに選択した３２クローンの配列分析は、各クローンが個々の軽鎖を含有することを示し、および２４クローンが、抗−Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタン・ブロット（Ｑｉａｇｅｎ社，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）において、検出可能な完全長のｓｃＦｖの発現を示した。
【００９８】
実施例２に記載のビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質において、４回の選択を実施した。高親和性結合体に有利に働く選択圧は、抗体濃度の連続的な制限（第１回２０ｎＭ、第２回１ｎＭ、第３回０．１ｎＭ、第４回０．０１ｎＭ）によって作り出した。κおよびλの再編成ライブラリーは、別々に保存した。
【００９９】
ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮ／２％スキムミルク中に再懸濁したライブラリーからの約１０８個のファージをビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合体とともにインキュベーションした。ファージ抗原複合体を、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズの添加によってレスキューし、ファージに結合している非特異的抗原を、ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮを用いた１０回の洗浄工程によって除去した。第１段階では、結合体は、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２によって溶出させた。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８による中和後、低ｐＨで除去できないファージの回復のために、新たに生育させたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（対数期中期ＯＤ６０００．２−０．５）を添加した。酸性溶出液によって溶出した細胞もまた、対数増殖中のＸＬ１ ｂｌｕｅ宿主細胞と混合した。
【０１００】
ヒトｓｃＦｖをコードするファージミドによる形質導入が成功した細胞を、アンピシリン耐性で選択し、ついでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで形質転換して、次のインビトロでの選択のためのｓｃＦｖを示すファージを生じさせた。次の回の選択では、酸性溶出液によって回収されたファージおよびＸＬ１ ｂｌｕｅの形質転換を別々に取り扱った。第３および第４の回の親和性選択の後、個々のコロニーを実施例２に記載のＥＬＩＳＡで試験した。
【０１０１】
再編成κ−ライブラリー由来の試験したクローンは、同じマスターブロックで参照として生育させた親クローン５０ＮＩ超える、優位なシグナルを示さなかった。しかし、いくつかのクローンを配列決定し、親クローンと同一であることを証明し、結合特性を改良する適当なκ−鎖が見出されなったことが示された。
【０１０２】
対照的に、再編成λ−ライブラリー由来のクローンの分析は、参照の５倍までのシグナルを生じる多くのクローンを明らかにした。３０クローンを第３回のバイオパンニング後の配列決定用に、３４クローンを第４回のバイオパンニング後の配列決定用に、選択した。配列決定は、製造者のガイドラインに従って、Ｄｅａｚａ Ｋｉｔ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，Ｔｏｒｏｎｔｏ，カナダ）を用いたＬｏｎｇ Ｒｅａｄ Ｔｏｗｅｒ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，Ｔｏｒｏｎｔｏ，カナダ）で実施した。結合ファージ粒子の酸性溶出液または宿主細胞の直接形質転換は、クローンの後の分布に明確な影響を有さなかった。５つの異なるグループの高濃度化したクローンおよび数個の個体を同定した。表２は、これらの異なるグループの概要を示す。
表２：下記の例のあるグループを示すクローンの記号を太字でハイライトしている。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
グループＡを形成するクローンは、親ベクターの再連結および非切断、またはライブラリー構築中の再編成が原因で、シャッフルド・ライブラリーにも存在する。この知見は、このグループのクローンが最も弱いＥＬＩＳＡシグナルを生じた事実と相関する。
他の全てのグループは、親クローンに比べて増強したＥＬＩＳＡシグナルを示す新たに編成された軽鎖を含有する。グループＣおよびＤからのクローンは、第３回および第４回の選択後、同程度の数が見出された。
Ｖ−ベース・アラインメント・ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を用いた配列の分析により、全ての新たなＶλ鎖が、親クローンのＶＬ鎖と同様に、ＶＬ３ファミリーに属することが明らかになった。
全てのクローンが持つ共通のＶＨ鎖のアミノ酸配列は、本明細書中で、配列番号９として、ならびにクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の特異的ＶＬ鎖は、本明細書中で、それぞれ配列番号１０〜１６として与えられる。共通のＶＨ鎖をコードする核酸配列は、本明細書中で、配列番号１として、ならびにクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の個々のＶＬ鎖は、本明細書中で、それぞれ配列番号２〜８として与えられる。個々の重鎖および軽鎖ＣＤＲは表１に与えられ、共通の重鎖ＣＤＲは、この上の最初の項目として示され、ついでクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の軽鎖ＣＤＲが示されている（それぞれ、項目２〜８として示される）。
【実施例７】
【０１０５】
ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂで形質転換されたセルラインにおける親和性成熟ｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析
全ての個体クローン由来の粗精製のペリプラズム抽出物を用いた予備的なＦＡＣＳ分析は、全てのチェーン・シャッフルドｓｃＦｖがＣＤ１６Ａ結合能を保持していることを示した。この試験には、ＣＤ１６Ａでトランジェントに形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を用いた（データは示さず）。この試験に基づき、更なる性質評価のために、クローン３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１を選択した。
【０１０６】
これらのｓｃＦｖをコードする核酸配列を、Ｎ−末ＰｅｌＢリーダー配列、およびＣ−待つヘキサ−ヒスチジンおよびｃ−ｍｙｃタグとインフレームで、発現ベクターｐＳＫＫ２にサブクローンした。これらのサブクローンの核酸配列は、下記の通りである：
【０１０７】
pSKK2-50NI (配列番号36)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１０８】
pSKK2-3-LB3 (配列番号37)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１０９】
pSKK2-3-LB5 (配列番号38)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctgggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１０】
pSKK2-3-LB6 (配列番号39)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacaggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１１】
pSKK2-3-LS49 (配列番号40)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgcccccccggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１２】
pSKK2-4-LS14 (配列番号41)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１３】
pSKK2-4-LS21 (配列番号42)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１４】
ＰｅｌＢリーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、ａｔｇａａａｔａｃｃｔａｔｔｇｃｃｔａｃｇｇｃａｇｃｃｇｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃａｇｃｃｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ（配列番号４３）である。
【０１１５】
各ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の間のリンカー領域をコードするヌクレオチド配列は、ｇａａｇａａｇｇｔｇａａｔｔｔｔｃａｇａａｇｃａ（配列番号４４）である。
【０１１６】
ｃ−ｍｙｃタグおよびヘキサ−ヒスチジンタグは、それぞれ、ｇａａｃａａａａｇｃｔｇａｔｃｔｃａｇａａｇａａｇａｃｃｔａ（配列番号４５）、およびｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ（配列番号４６）である。
サブクローンを含有するベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８に形質転換し、２Ｌ振とうフラスコ培養で発現させ、Ｌｅ Ｇａｌｌら（２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８５：１１１−１２７）に従い、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０１１７】
チェーン・シャッフルドｓｃＦｖが、実施例３で５０ＮＩについて示されているようにＣＤ１６Ａへの特異性を保持しているかどうか評価するため、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂを発現する形質転換セルラインをＩＭＡＣ精製ｓｃＦｖを用いて試験した。フローサイトメトリー分析のため、下記のセルラインを用いた：ＢＷおよびＢＷ／ＣＤ１６Ａ形質転換体を前記のように培養した。２９３細胞および２９３−ＣＤ１６Ｂ形質転換体を前記のように取り扱った。それぞれ，ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞膜貫通および細胞質内領域に融合したＣＤ１６ＡまたはＮＫｐ４６の細胞外領域をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＣＤ１６Ａ−ゼータおよびｐｃＤＮＡ３−ＮＫｐ４６−ゼータ，Ｄｒ．Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ大学，Ｉｓｒａｅｌから入手）を用いた、２９３細胞のトランジェントの形質転換によって，２９３−ＣＤ１６Ａおよび２９３−ＮＫｐ４６を作成した。実施例１に記載のリン酸カルシウム法を用いてトランジェントの形質転換を行い、トランジェントの形質転換の２日後、フローサイトメトリー染色および分析に用いた。フローサイトメトリー染色および分析は、基本的に前記のように行った。１×１０６個の指示細胞を、５０μｇ／ｍＬの精製ｓｃＦｖ、次いで１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ １３／４５／３１−２（抗−ヘキサＨｉｓ）および１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。
【０１１８】
形質転換細胞が細胞表面上に対応する抗原を発現することを示すために、細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９および抗−ＮＫｐ４６ モノクローナル，ＭＡｂ １９５３１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，ドイツ）のパラレルで染色した。ＭＡｂｓ Ａ９および１９５３１４を１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を２次試薬のみによる着色からの蛍光値を差し引いて補正し、結果を図２に示した。
【０１１９】
ポジティブコントロール染色として用いたＭＡｂ Ａ９は、予想通り、アイソフォームと関係なく、ＣＤ１６で形質転換した全てのセルラインに結合した。ＮＫｐ４６−形質転換体への結合は観察されず、一方、ＮＫｐ４６に対するＭＡｂ １９５３１４での染色は、明らかに、コントロールプラスミドを用いたこの細胞の形質転換が成功したことを示した。
【０１２０】
参照として用いた親ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、表面上にＣＤ１６Ａを発現する２つのセルライン（ＢＷ／ＣＤ１６Ａおよび２９３／ＣＤ１６Ａ細胞）の弱い染色を示した。対照的に、新たに単離した、再編成軽鎖を有するｓｃＦｖは、これらの細胞への高度に改良された結合を示した。ＣＤ１６Ｂで安定に形質転換した２９３細胞に結合した新たな変種は無く、ＣＤ１６のアイソフォームＡへの特異性を示した。
【実施例８】
【０１２１】
新たに単離したＰＭＮおよび高濃度化ＮＫ−細胞における親和性成熟ｓｃＦｖフラグメントの試験
改良ｓｃＦｖが、真核細胞で発現したＣＤ１６Ａへの特異的結合能を保持しているかどうか評価するため、ドナー血液から新たに単離したＰＭＮおよび強化ＮＫ細胞を前記のようにＩＭＡＣ−精製ｓｃＦｖを用いて染色した。ＮＫ細胞の濃縮は、前記のネガティブ選択によって実施した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を図５に示した。
【０１２２】
抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９および抗−ＣＤ５６ ＭＡｂ Ｂ１５９を用いた濃縮した真核細胞集団の染色は、この集団がＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋末梢血ＮＫ細胞からなることを明らかに示した。ＭＡｂ Ａ９およびＡ９由来のマウスｓｃＦｖは、ＣＤ１６Ａ−陽性ＮＫ細胞フラクションを染色し、ＣＤ１６Ｂ−陽性顆粒球において更に強いシグナルを示した。
【０１２３】
ＭＡｂ Ａ９はＣＤ１６−陽性ＮＫ細胞に対応するＰＢＭＣのサブ集団（１８．５％）を認識した。強化ＮＫおよび単離顆粒球で強い結合が観察された（データ示さず）。
【０１２４】
親クローン５０ＮＩは、弱いが明らかな、強化ＮＫ−細胞への結合を示した。一方、顆粒球の染色は見られなかった。親和性成熟変種３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１は、５０ＮＩと似た染色パターンを示したが、結合シグナルが改善されていた。このデータは、親和性成熟ｓｃＦｖがＣＤ１６の２つのアイソフォームを区別し、ＣＤ１６Ａに特異的に結合できる事実に対してさらなるサポートを与える。
【実施例９】
【０１２５】
組換ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６ＢにおけるＥＬＩＳＡ
ｓｃＦｖのＣＤ１６Ａ特異性に関する更なるサポートデータを得るため、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質（実施例１）および市販の組換ＣＤ１６Ｂ−Ｆｃ（対立遺伝子ＮＡ−２；ＢＳＡフリー；ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。ｇｐ３４−Ｆｃ融合タンパク質をネガティブコントロールとして用いた。この組換タンパク質を、ｐＨ８．８で、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中、８０ ｎＭの濃度で一晩、コートした。
【０１２６】
抗−ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、組換タンパク質に結合したｓｃＦｖの検出を、実施した。ポジティブコントロールは、ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）、次いでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．５μ／ｍＬ）を含んだ。組換ＣＤ１６Ｂへの結合を抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）を用いた直接染色によって試験し、およびＦｃ−融合タンパク質への結合を抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（０．１５μｇ／ｍＬ）によって試験した。全てのｓｃＦｖがＣＤ１６Ａ−Ｆｃへの強い結合を示し、一方、ＣＤ１６Ｂへの結合は観察されなかった（図３）。ｇｐ３４−Ｆｃで、わずかに増加したバックグラウンド結合が見られた。単独で試験された全ての２次抗体もまたｇｐ３４−Ｆｃにおいてわずかに増加したバックグラウンドシグナルを示したので、おそらく、これはｇｐ３４−Ｆｃへの少量の非特異的結合によるものだろう。予想通り、Ａ９はＣＤ１６Ａ−Ｆｃを強く認識した。しかし、２次ヤギ抗−マウスＨＲＰ−融合タンパク質は、ヒトＦｃ融合体との有意な交差反応性を示すと考えるべきである（ヤギ抗マウス−ＨＲＰのみでのコントロールを参照）。ヒトＩｇＧへの最小の交差反応性を有する（データは示さず）予備吸着ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ 複合体を用いたこの分析の再現性は、有意なバックグラウンド結合の減少を示さなかった。ＭＡｂ Ａ９は、ＣＤ１６Ｂにおいて明らかなシグナルを示した。これは、２次試薬によって影響されなかった。
【実施例１０】
【０１２７】
還元および非還元条件下での組換ＣＤ１６Ａ−Ｆｃにおけるウェスタン・ブロット
更なる性質決定のため、組換ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＮＫｐ４６−Ｆｃにおけるウェスタン・ブロットでの結合について、全ての抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖを試験した。ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびネガティブコントロールとしてのＮＫｐ４６−Ｆｃを、還元条件下の１２％ ＳＤＳ−ゲルおよび非還元条件下の８％ゲルによって分離した。これらのタンパク質を、エレクトロブロッティングによって、ニトロセルロース膜に移した。ポンソーＳ染色後、この膜を５ｍｍ幅片に切断した。各ニトロセルロース片をＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ、２％スキムミルク中のｓｃＦｖ（４μｇ／ｍｌ）とともに個々にインキュベーションした。検出は、抗−ペンタＨｉｓ ＨＲＰ−複合体（１μｇ／ｍＬ）を用い、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼを基質として用いて行った。コントロール片をＡ９（１μｇ／ｍＬ）または抗−ＮＫｐ４６ １９５３１４、ついでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．２μｇ／ｍＬ，最小交叉反応性）と共にインキュベーションした。更なるポジティブコントロールとして、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．１６μｇ／ｍＬ）を、融合タンパク質のＦｃ部の検出に用いた。モノクローナル抗体Ａ９および１９５３１４は、非還元条件下と同様に還元条件下で、それらの抗原を認識した。
【０１２８】
ＭＡｂ Ａ９に対する２次試薬として用いたヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体は、わずかにＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部と交叉反応性を示した。対照的に、抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの結合は、非還元条件下で観察されただけであり、ジスルフィド架橋によって安定化された２次構造が認識に必要とされることを示した。親クローン５０ＮＩは、親和性成熟ｓｃＦｖに比べて、より弱いシグナルを示した。ｓｃＦｖ ３−ＬＢ６の結合は検出されず、ＮＫｐ４６−Ｆｃ対照タンパク質との交叉反応性を示すｓｃＦｖは無く、ＣＤ１６への特異性が確認された。
【実施例１１】
【０１２９】
スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによるｓｃＦｖの分析
scFv変種のより高い親和性が主に改良された一価結合によるかどうかを決定するため、タンパク質調製物を、そのオリゴマー組成物について、スーパーデックス200ゲルろ過カラムにおいて分析した。LMWゲルろ過キャリブレーションキット(Ａｍｅｒｓｈａｍ・Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ)をスタンダードに用いた。表３は、個々のタンパク質調製物に存在する分子形式の概要を示す。
【０１３０】
表３：個々のタンパク質調製物において存在するｓｃＦｖの分子形式。３−ＬＢ５は、低タンパク質濃度のため、分析されなかった。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
サイズ排除クロマトグラフィーは、明らかに、ｓｃＦｖ ３−ＬＢ６および４−ＬＳ２１がもっぱらモノマーであることを示した。
【０１３３】
対照的に、３−ＬＳ４９、３−ＬＢ３および４−ＬＳ１４は、ダイマー分子の有意な比率を示した。これらの分子の改良された結合特性は、３−ＬＢ６および４−ＬＳ２１へのより高い親和性だけでなく、２量体形成による結合活性効果も反映しうる。
【実施例１２】
【０１３４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるｓｃＦｖ親和性の測定
ｓｃＦｖの親和性定数（ＫＤ値）を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００バイオセンサーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたＳＰＲによって測定した。ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質およびネガティブコントロールとして用いたＢＳＡをアミンカップリング法のための慣用のＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いてカルボキシメチルデキストランでコートしたセンサーチップＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社）上に固定化した。精製ｓｃＦｖをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で希釈した。固定化抗原に対して、ｓｃＦｖ抗体の変動濃度（１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭおよび１６００ｎＭ）の経過により、結合データを生じさせた。ポジティブコントロールとして抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９を用いた。全てのＳＰＲ測定は、２０μｌ／ｍｉｎの一定の流速で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、２５℃で行った。各注入試料（１００μｌ）は、抗原に５分間接触した。ついで、解離は３０分間であった。各サイクルの後、センサーチップ表面をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液でフラッシングした。ＢＳＡでコートされたコントロールチャネルからのシグナルを自動的に差し引いた。速度定数を、１／１ ラングミュア結合モデルにしたがってＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ バージョン３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用い、計算した。計算されたオフーおよびオン−速度定数、および各ＫＤ値を表３にまとめた。ＭＡｂ Ａ９について、コントロールとして用いて、１．７５×１０−９ＭのＫＤを、文献記載の１．５５×１０−９Ｍの値（Ｒｅｎｎｅｒら，２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１０２−１０８）と関連付けて計算した。更に、ｓｃＦｖ ５０ＮＩ、４−ＬＳ２１および３−ＬＢ６のＳＰＲデータについての定常状態分析から，平衡解離定数を推論した。
【０１３５】
表４ 個々のｓｃＦｖへの結合動態データ
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
これらの２つの方法によって独立して計算された速度定数はよく相関し、親クローン５０ＮＩとの直接の比較は、軽鎖シャッフリングによる２０倍以上の親和性の改善を示した。全ての３つのｓｃＦｖ型はもっぱら単量体タンパク質集団を形成し（表３、実施例１１と比較）、改善した結合特性が結合力効果ではなく、抗原ｓｃＦｖ接合面の最適化に基づく、より高い親和性によることを示した。ｓｃＦｖ ３−ＬＳ４９、３−ＬＢ−３および３−ＬＳ１４は、同等のＫＤ値を示したが、有意なパーセンテージの２量体分子を含有する不均質分子集団（表２、実施例１３との比較）を示した。したがって、これらの抗体の改善された親和性は、少なくとも部分的に多価結合による。
【実施例１３】
【０１３８】
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの結合による、ＮＫ細胞におけるＣａ２＋流の誘導
親抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩについて示されている親和性成熟ｓｃＦｖが末梢血ＮＫ細胞におけるＣａ２＋動員を誘発する能力を保持しているかどうかを評価するために、末梢血からＮＫ細胞を単離および濃縮し、および実施例５に前記記載のフローサイトメトリーによるＣａ２＋流量測定に用いた。
【０１３９】
この結果は、明らかに、ＭＡｂ抗−（Ｈｉｓ）６、ついでポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＧＡＭ）のみの添加は、新たに単離したＮＫ細胞における細胞内カルシウム濃度の優位な変化を誘導しなかったことを示す。しかし、すでに実施例５で示したように、ｓｃＦｖ ５０ＮＩが添加され、およびＭＡｂ抗−（Ｈｉｓ）６、ついでＧＡＭによる架橋が形成されたとき、蛍光シグナルの明らかな増加が観察された。
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ（３−ＬＳ４９または４−ＬＳ２１、参照例として用いられる）が適用された場合、抗−（Ｈｉｓ）６ついでＧＡＭによる架橋後に誘導されたシグナルの増加は５０ＮＩによって引き起こされたシグナルと少なくとも同じ強さであった。したがって、鎖−シャッフリングによってヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩから導かれた全てのｓｃＦｖがＮＫ細胞を活性化し、およびＣＤ１６Ａへの結合による細胞内カルシウムカルシウム動員のきっかけとなる能力を保持することが結論付けられる。
【実施例１４】
【０１４０】
新たに単離したＮＫ細胞における細胞溶解活性のトリガリング
ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞に媒介される抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与する。インビトロでは、ＣＤ１６に特異的なＩｇＧアイソタイプのモノクローナル抗体の活性化が、ＦｃＲ−ポジティブ標的セルラインの殺滅を引き起こせることが示された。ＮＫ細胞においてカルシウム動員を誘導する親和性成熟抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖがＮＫ細胞傷害性も媒介できるかどうかを確認するため、これらのｓｃＦｖを、マウスＦｃＲ−ポジティブＰ８１５細胞に対して新たに単離したＮＫ細胞を用いたリダイレクトされた殺細胞アッセイにおいて試験した。ｓｃＦｖは、ＩｇＧのＦｃ部を欠くので、抗−（Ｈｉｓ）６ マウスモノクローナル抗体と一緒に用いた。このリダイレクトされた細胞溶解を、カルセイン−放出アッセイで測定した。
【０１４１】
ＮＫ細胞を、健常なドナーのＰＢＭＣから単離および濃縮した。フローサイトメトリー分析は、ＮＫ集団が８１％のＣＤ１６−ポジティブ細胞および９４％のＣＤ５６−ポジティブ細胞からなることを示した；ＣＤ３−ポジティブまたはＣＤ１９−ポジティブ細胞は、有意な量で検出されなかった（データを示さず）。マウスＰ８１５セルライン（Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツから親切に提供を受けた）を、１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシン、および５０μＭ β−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。分析用に、Ｐ８１５標的細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地中（ＦＣＳ無し、３０分間、３７℃）で、１０μＭ カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識した。ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、標識化Ｐ８１５細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に１ｘ１０６／ｍＬの濃度まで再懸濁した。この懸濁液から，１ｘ１０４細胞に相当する５０μｌを９６ウエルの丸底マイクロタイタープレートの個々のウエルに播種した。１ｘ１０５の新たに単離したＮＫ細胞を５０μｌでウエルに加え、１０：１のエフェクター対標的比にした。抗−ＣＤ１６抗体およびコントロール抗体をウエルに加えて、１μｇ／ｍＬの最終濃度にし、ここで指示１μｇ／ｍＬ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ１３／４５／３１−２をアプライした。モノクローナル抗体ＯＫＴ３（抗−ＣＤ３ ＭＡｂ）、Ａ９および１３／４５／３１−２ 抗−（Ｈｉｓ）６はＤｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツからの親切な贈り物である。抗体 Ｂ１５９抗−ＣＤ５６は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）か購入し、および１９５３１４ 抗−ＮＫｐ４６はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）から購入した。プレートを、５％ ＣＯ２の湿雰囲気中で、３時間、３７℃でインキュベーションした。いくつかウエルに対して、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加して（Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）、標的細胞の最大溶解を得た。エフェクター細胞無し、および抗体無しで、標的細胞をインキュベートすることにより、自然発生的なカルセイン放出を測定した。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを５００ｇで５分間遠心分離し、１００μｌの上静を回収して、放出されたカルセインの蛍光（Ｆ）、５２０ｎｍでマルチラベル・リーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｄｇａｕ、ドイツ）を用いて測定した。溶解のパーセンテージを式：［Ｆ（試料）−Ｆ（自然発生的）］／［Ｆ（最大）−Ｆ（自然発生的）］ｘ１００％に従って計算した。平均値および標準偏差を３回のサンプルから決定し、図４にプロットした。
【０１４２】
予測したとおり、コントロール抗体として用いたＯＫＴ３ 抗−ＣＤ３、Ｂ１５９ 抗−ＣＤ５６および抗−（Ｈｉｓ）６ ＭＡｂｓは、抗体無しの試料と類似のバックグラウンド殺滅のみを誘導した。
【０１４３】
このことは、ＣＤ５６のような非活性化受容体への抗体の結合が、ＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導に十分でないことを示す。さらに、コントロール抗体は、 Ｐ８１５標的細胞上のＦｃ受容体に結合しているがＮＫ細胞上のエフェクター分子に結合していないＩｇＧの細胞傷害性効果を除外する。対照的に、ＭＡｂ １９５３１４（抗−ＮＫｐ４６）およびＡ９（抗−ＣＤ１６）は両方とも、ＮＫ受容体活性化を標的とし、それぞれ３５％および６５％の範囲で、Ｐ８１５標的の強い溶解のきっかけとなった。抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの存在下、標的細胞の溶解は、１．８％および１１．５％の間であり、ｓｃＦｖのみではＮＫ細胞を活性化できなかった。しかし、架橋およびＦｃＲ−ポジティブＰ８１５ 標的細胞への結合を促進するＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６の添加は、全てのサンプルで、強い溶解を引き起こした。親和性成熟ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の場合、ほぼ６０％の標的細胞が溶解した。相対的に、親抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩのＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６との組み合わせは、細胞によるＰ８１５標的のリダイレクトされた殺滅のわずかな促進のみを誘導した。
【０１４４】
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを用いたリダイレクトされた細胞傷害性アッセイの結果は、抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖがＮＫ細胞におけるカルシウム動員を促進するだけでなく、ＮＫ細胞傷害性も引き起こすことを明らかに示した。
【実施例１５】
【０１４５】
ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ変種および３つの異なるヒトＣＤ１６Ｂ−Ｆｃ対立遺伝子変種をコードする核酸配列の作出
ヒトＦｃγＲＩＩＩは、２つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＩＡ（膜貫通タンパク質）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＧＰＩ−アンカー型）、として存在し、これらは、その細胞外の免疫グロブリン結合領域において９６％の配列同一性を有する（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５−２２１）。これらの２つのアイソフォームの異なる対立遺伝子変種は開示されている（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ Ｂｌｏｏｄ ９０：１１０９−１１１４；Ｋｏｅｎｅら，１９９８ Ｂｌｏｏｄ ９１：６７３−６７９）。図６は、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの対立遺伝子変種のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【０１４６】
実施例１に記載の、プラスミドｐＣＤＭ−ＣＤ１６−Ｆｃによるトランジェント形質転換後のＨＥＫ−２９３細胞において産生された、可溶性ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９、上掲）である。ヒトにおいて、このアイソフォームの１５８位に２対立遺伝子多形性（ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ １５８Ｖａｌ／Ｐｈｅ）が生じ、これはナチュラルキラー細胞上のＦｃγＲＩＩＩ−Ａ 受容体のＩｇＧに対する親和性に影響する。ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ １５８Ｖａｌについては、ＩｇＧへのより高い親和性が対立遺伝子１５８Ｐｈｅ型と比較して報告されている（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ 上掲）。
【０１４７】
ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１のＰｈｅ変種への結合を示すために、ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖの部位特異的突然変異精製を実施して、ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆを作出した。１０ｎｇのｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖプラスミドを、１２５ｎｇのプライマーＰ４１、5’ CTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTG 3’(配列番号47)およびＰ４２、5' CACATTTTTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCAG 3'（配列番号48)、２５ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２．５単位のＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともにインキュベーションした。反応を、９５℃で３０秒間実施し、ついで９５℃で３０秒間、６６℃で６０秒間、および６８℃で３１８秒間の１６サイクルを行った。生産物をＤｐｎＩ制限酵素で３時間消化し、および反応を最終的に８０℃、２０分間のインキュベーションで停止させた。２μｌの反応混合物で、ケモコンピテントＴＯＰ１０／Ｐ３細胞（Invitrogen社）を形質転換し、１５０μｌを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に広げた。ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆをコードする核酸配列を配列決定によって確認した。実施例１に記載のように、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆを発現させ、および精製した。
【０１４８】
それぞれＮＡ１、ＮＡ２およびＳＨで示される３つの異なる対立遺伝子変種（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ 上掲；Ｋｏｅｎｅら，１９９８ 上掲）としてＦｃγＲＩＩＩＢ受容体をヒトで発現させた。ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子型のヒト細胞外領域をコードする３つの合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ社（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成された。核酸配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として、受容体のＦｃ領域の核酸配列を含有するｐＳＥＣプラスミドにクローニングした。実施例１に記載のように、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨを発現させ、および精製した。
【実施例１６】
【０１４９】
ヒトCD16の異なる対立遺伝子変種におけるウェスタン・ブロット
ＣＤ１６Ａアイソフォームに対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の特異性を示すため、異なる対立遺伝子変種のＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂにおいてウエスタンブロット分析を実施した。それぞれ７５０ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＮＫｐ４６−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を非還元条件下で８％ＳＤＳゲル上にロードし、および膜上へブロッティングした。
【０１５０】
抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ Ａ９、抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１および抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ（ネガティブコントロール）をこのブロットを用いて４μｇ／ｍｌでインキュベーションした。組換タンパク質に結合したｓｃＦｖの検出は、抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍＬ）を用いて実施した。コントロールとして、ＨＲＰ 複合化抗−ヒトＩｇＧおよび抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１５１】
４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、対立遺伝子型のＣＤ１６Ａのみへの強い結合を示し、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子への結合は観察されなかった。このことは、ＣＤ１６のＡアイソフォームに対するヒト４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖの特異性と、４−ＬＳ２１が両方の対立遺伝子変種ＣＤ１６Ａを認識することとを示す。対照的に、マウス抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ Ａ９は、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂの両方の全ての対立遺伝子変種への均一な結合を示した。
【実施例１７】
【０１５２】
ヒトＣＤ１６の異なる対立遺伝子変種におけるＥＬＩＳＡ
更にＣＤ１６Ａアイソフォームに対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の特異性を示すため、異なる対立遺伝子変種を用いてＥＬＩＳＡを実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートのウエルをそれぞれ２００ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２またはＮＫｐ４６−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を含有する１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３でコーティングした。
【０１５３】
４μｇ／ｍｌの濃度で抗−ＣＤ１６Ａ ４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖおよび抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖをプレートとともにインキュベーションした。抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍｌ）を用いて、ｓｃＦｖに結合した組換タンパク質の検出を実施した。ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１は、強いＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子型への強い結合を示したが、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子への結合は観察されず（図７Ａ）、その結果、４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖのＣＤ１６Ａアイソフォームへの明確な特異性を示した。
【０１５４】
パラレルのアッセイ（図７Ｂ）で、抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍｌ）を同様にコーティングしたプレートに対してアッセイした。ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）のインキュベーションの後、ヤギ抗−マウス ＩｇＧ ＨＲＰ−複合体を０．５μｇ／ｍｌ（ヒトＦｃへの最小交叉反応性）で用いた。ＭＡｂ Ａ９は全ての対立遺伝子変種（両方のＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂ）に強く結合した。
【実施例１８】
【０１５５】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による、ヒトＣＤ１６の異なる対立遺伝子型に対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびモノクローナルＡｂ Ａ９の親和性の比較
実施例１２に記載のプロトコールに従い、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００バイオセンサーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、対立遺伝子変種ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１およびＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２についてのＳＰＲにより、ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびＭＡｂ Ａ９の親和性定数（ＫＤ値）を測定した。計算したオフ−およびオン−速度定数および各ＫＤ値を、表５にまとめた。
【０１５６】
ＭＡｂ Ａ９（コントロールとして使用）について予測したように、４−６×１０−９Ｍの範囲のＫＤを全ての対立遺伝子変種について計算したところ、全ての対立遺伝子変種の全ての型へのＭＡｂ Ａ９の乱交雑結合を示した。対照的に、ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１は、ＣＤ１６Ａアイソフォームに高度に特異的であることが再び証明された。４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖに対し、６×１０−８Ｍの範囲のＫＤを示し、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆは４×１０−８Ｍの範囲を示して、ＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子型へ４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖがほぼ等しい親和性で結合することを示した。対照的に、４−ＬＳ２１は、ＣＤ１６Ｂの対立遺伝子型にも結合を示さなかった。
表５ ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの対立遺伝子変種へのｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびＭＡｂ Ａ９の結合の反応速度のデータ
【０１５７】
【表５】
【実施例１９】
【０１５８】
バクテリアにおけるＴａｎｄＡｂ分子の発現用のプラスミドｐＳＫＫ３ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３の構築
抗−ＣＤ３０および抗−ＣＤ１６Ａ抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をコードする遺伝子を、ハイブリドーマＨＲＳ−３またはヒトｓｃＦｖライブラリーから，それぞれ、プラスミドｐＨＯＧ＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３ αＣＤ３０（ＨＲＳ−３）およびｐＳＫＫ２＿ｓｃＦｖ αＣＤ１６Ａ（ＬＳ２１）を用いて取り出した。
【０１５９】
プライマーＰ３４、5’CATCACGATATCAGAACCACCGGAGCCGCCGCTACCACCTGAGGACACGGTGACCAGGGTTCCC 3’（配列番号４９）、およびＰ３６、5’ CCGGCCATGGCGCAGGTC CAGCTGGTACAGTCTGG 3’（配列番号５０）を用いたポリメラーゼ鎖反応により、ＶＨ αＣＤ１６ＬＳ２１を増幅させ、ＰＣＲ産物の３’末端に９アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号５１）をコードする核酸配列を生じさせた。得られたＰＣＲ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ ｐＨＯＧ＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３αＣＤ３０（ＨＲＳ−３）にクローニングして、ハイブリッドプラスミドｐＨＯＧ＿ＶＨαＣＤ１６ＬＳ２１（Ｇ２Ｓ）３ＶＬαＣＤ３０（Ｇ２Ｓ）３ＶＨαＣＤ３０を作成した。
【０１６０】
プライマーＰ３５、5’ GGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTAGCGGCGGCTC CGGTGGTTCTTCCTATGTGCTGACTCAGCCATCCTC 3’（配列番号５２）、およびＰ３７、5’CCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGATCCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC 3’（配列番号５３）を用いたポリメラーゼ鎖反応によって、抗−ＣＤ１６Ａ抗体４−ＬＳ２１のＶＬを増幅させ、ＰＣＲ産物の５’末端に９アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号５２）をコードする核酸配列を生じさせた。得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｍＢＩ／ＸｂａＩで消化し、直線化されたＢｓｍＢＩ／ＸｂａＩ消化ハイブリッドプラスミドｐＨＯＧ＿ＶＨαＣＤ１６ＬＳ２１（Ｇ２Ｓ）３ＶＬαＣＤ３０（Ｇ２Ｓ）３ＶＨαＣＤ３０にクローニングし、プラスミドｐＨＯＧ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３を得た。このプラスミドをＮｃｏＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ直線化プラスミドｐＳＫＫ３にライゲーションした。
【実施例２０】
【０１６１】
バクテリアでの ＴａｎｄＡｂ分子の発現のためのプラスミドｐＳＫＫ３ ＣＤ１９×ＣＤ１６ＬＳ２１ Ｔａｎｄａｂ／（Ｇ２Ｓ）３の構築
抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をコードする遺伝子を、プラスミド ｐＳＫＫ３＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３α ＣＤ１９を使ったハイブリドーマ ＨＤ３７（ＨＤ３７）から得た。プラスミドｐＳＫＫ３＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３α ＣＤ１９（ＨＤ３７）を、ＮｃｏＩ／ＢｓｍＢＩによって切断し、挿入断片をアガロースゲルにおいて精製した。ついで、精製した断片を、制限酵素 ＥｃｏＲＶで消化した。ＥｃｏＲＶ／ＢｓｍＢＩ消化断片を直線化ＥｃｏＲＶ／ＢｓｍＢＩプラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３にクローニングし、プラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３を得た。プラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ をＮｃｏＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ 線形化プラスミド ｐＳＫＫ３にライゲーションした。得られたプラスミドは、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂをコードするｐＳＫＫ３ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＡＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３である。
【実施例２１】
【０１６２】
バクテリアにおけるＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ 分子の発現および精製
発現プラスミド ｐＳＫＫ３ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびｐＳＫＫ３ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＲＶ３０８（Ｍａｕｒｅｒら，１９８０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：１４７−１６１）のサンプルを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１００ｍＭ グルコース（２×ＹＴＧＡ）を含有する２×ＹＴ培地中、２８℃で、一晩生育させた。２ｘＹＴＧＡ中の一晩培養物の希釈物（１：５０）を、２８℃、２００ｒｐｍ振とうでフラスコ培養として生育させた。培養物が、ＯＤ６０００．８に達した時点で、細菌を９５００ｇ、１５分間、２０℃の遠心で沈降させ、同容量の新しい、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＹＴＢＳ培地（１Ｍ ソルビトールおよび２．５ｍＭ グリシンベタインを含有する２×ＹＴ；Ｂｌａｃｗｅｌｌ ＆ Ｈｏｒｇａｎ、１９９１、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９５：１０−１２）に再懸濁した。ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭで添加して、培養を２１℃、１８−２０時間継続した。細胞を、１４０００ｇ、２０分間、４℃の遠心分離で回収した。可溶性周辺質タンパク質を単離するため、沈降した細菌を５％の初期容量の氷冷２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再懸濁した。随時攪拌しながら氷上で１時間インキュベーションした後、スフェロプラストを１４０００ｇ、６０分間、４℃で遠心分離し、可溶性ペリプラズム抽出物を上清中に残し、このスフェロプラストにペレット中の不溶性ペリプラズム物質を加えた。ペリプラズム画分を開始緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール ｐＨ７．０）に対して、４℃で透析した。組換え産物を含有する透析溶液を、１４０００ｇ、３０分間、４℃で遠心分離した。Ｃｕ２＋で荷電し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（開始緩衝液）で平衡化した、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）の１ｍｌカラムを用いて、固定化した金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を４℃で、実施した。試料を、カラムを通過させることによって、ロードした。ついで、これを２０カラム容量の開始緩衝液、ついで溶出液の吸収（２８０ｎｍ）が最小（約３０カラム容量）になるまで５０ｍＭイミダゾールを含有する開始緩衝液で洗浄した。吸収された物質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０で溶出させた。このＴａｎｄＡｂ分子を含有する溶出画分を、ペンタＨｉｓ（商品名）抗体 ＢＳＡ不含有（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、ついで西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、ウエスタンブロット分析で同定した。
【０１６３】
ポジティブの画分を蓄積し、プレパックされたＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）（それぞれ、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）を用いた、５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）または５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）で緩衝液交換を行った。タンパク質溶液の濁りを遠心分離によって清澄にした。最終の精製は、０−１Ｍ ＮａＣｌ直線勾配を用いた５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）または５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）（それぞれＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）での、ＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）におけるイオン交換クロマトグラフィーで行った。ＴａｎｄＡｂ分子を含有する溶出画分を、還元１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでクマシー染色によって。ポジティブ画分を集め、プレパックされたＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、５０ｍＭ イミダゾールおよび１０ｍＭ トレハロースを含有するＰＢＳ（ｐＨ ６．０または７．０）（それぞれＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）で緩衝液交換を行った。
【実施例２２】
【０１６４】
フローサイトメトリーによる、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ Ｔａｎｄａｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３分子の性質決定
ＣＤ１６Ａへの結合を測定するため、実施例７に記載したように、ＨＥＫ−２９３ 細胞をｐｃＤＮＡ３−ＣＤ１６Ａ−ゼータ プラスミド（Ｄｒ．Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ大学、イスラエル）を用いてリン酸カルシウム法でトランジェントに形質転換し、フローサイトメトリーのため形質転換の４０時間後に回収した。有毛状細胞性白血病セルラインＪＯＫ−１（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ａｌｂｉｅｚ Ｒ，Ｄｏｒｋｅｎ Ｂ，Ｍｏｎｎｅｒ ＤＡ、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ、（１９９１） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：６２３、Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇの親切なる贈り物）を用いて、ＣＤ１９への結合を測定した。ＣＤ３０での反応性を試験するため、染色をヒト・ホジキン・セルラインＬ５４０ＣＹ（Ｖ．Ｄｉｅｈｌ博士、Ｃｏｌｏｇｎｅ大学、ドイツから親切に提供を受けた；Ｋａｐｐ Ｕ、Ｗｏｌｆ Ｊ、ｖｏｎ Ｋａｌｌｅ Ｃ、Ｔａｗａｄｒｏｓ Ｓ、Ｒｏｔｔｇｅｎ Ａ、Ｅｎｇｅｒｔ Ａ、Ｆｏｎａｔｓｃｈ Ｃ、Ｓｔｅｉｎ Ｈ、Ｄｉｅｈｌ Ｖ．（１９９２） Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． Ｓｅｐ；３ Ｓｕｐｐｌ ４：２１−３）を用いて行った。細胞の染色および分析を、基本的に上記のように行った。全ての組換え抗体を１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ 抗−ヘキサ Ｈｉｓ １３／４５／３１−２ （Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）、ついで１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ 抗−マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。
フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂおよびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ抗体の両方の、対応抗原を発現する細胞への強い結合を示した。ＴａｎｄＡｂ抗体の両方は、ＣＤ１６Ａ−発現細胞に、ほぼ等しい親和性で結合した。
【実施例２３】
【０１６５】
親和性測定
対立遺伝子変種、４８Ｒ／１５８Ｖおよび４８Ｒ／１５８Ｆ、におけるｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１のＫＤ値の測定により、表面プラスモン共鳴で測定されたように、同等の約５×１０−８ＭのＫＤ値が示され、両方の対立遺伝子変種は、ほぼ同じ親和性（実施例１２を参照）で認識されることを示した。この知見は、ＴａｎｄＡｂ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１由来の４−ＬＳ２１で確認され、これもまたＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子変種にほとんど同一の親和性での結合を示した。４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖと比較して、結合性の増加による、ファクター１０以上の親和性における改良が、ＴａｎｄＡｂ抗体で観察された。
【実施例２４】
【０１６６】
細胞障害性分析によるＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ および ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３分子の性質決定
ＮＫ細胞を標的細胞に集めること、および受容体の架橋によるＮＫ細胞の活性化によって、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ抗体が、インビトロの細胞傷害性を活性化するかどうかを確認するため、非−放射活性細胞傷害性アッセイを、基本的にＴ．Ｄｒｅｉｅｒら（２００２、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：６９０−６９７）に従って、実施した。前記のようにエフェクター細胞として用いたＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから濃縮した。それぞれのケースで濃縮したＮＫ細胞の純度および抗原発現をフローサイトメトリーでチェックした（データは示していない）。
【０１６７】
ＣＤ３０＋ Ｌ５４０ＣＹ標的細胞またはＣＤ１９＋ ＪＯＫ−１またはＲａｊｉ標的細胞を、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ならびに１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、本明細書中、ＲＰＭＩ培地と称する場合がある；全ての成分はInvitrogen社から入手した。）中で培養した。細胞傷害性アッセイのため、１０μＭ カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Invitrogen社）を用いて、３０分間、ＲＰＭＩ培地中、３７℃で細胞を標識した。緩やかに洗浄した後、標識細胞をＲＰＭＩ培地に１ｘ１０５／ｍＬの濃度に再懸濁した。ついで、１ｘ１０４の標的細胞を、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂまたはＣＤ１９ｘＣＤ１６ＡＬＳ２１のいずれかを有する、１ｘ１０５の濃縮ＮＫ細胞とともに、丸底の９６−ウエル・マイクロタイタープレートの個々のウエル中に、総量２００μｌ／ウエルで播種した。２分間、２００ｇの遠心後、アッセイ物を３時間、３７℃、５％ ＣＯ２の湿雰囲気下でインキュベーションした。インキュベーション終了の１５分前に、ＲＰＭＩ培地中１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２０μｌを、標的細胞のみを含むウエルに加えた。他の全てのウエルには、２０μｌのＲＰＭＩ培地を加えた。１００μｌの細胞培養上静を、５分間、５００ｇの更なる遠心後に各ウエルから回収し、放出されたカルセインの蛍光を蛍光プレートリーダーを用いて５２０ｎｍで測定した（Ｖｉｃｔｏｒ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。測定されたカウントに基づき、特異的細胞溶解を次式に従って計算した：［蛍光（試料）−蛍光（自然発生）］／［蛍光（最大）−蛍光（自然発生）］×１００％。蛍光（自然発生）は、エフェクター細胞および抗体不存在下での標的細胞由来の蛍光カウントを表し、および蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によって誘導された細胞溶解の合計を示す。Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてシグモイド投与応答カーブをプロットした（図８参照）
この結果は、ＴａｎｄＡｂ−活性化ＮＫ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。対照的に、ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂは、ＣＤ１９−Ｌ５４０ＣＹ標的細胞の溶解を誘導せず、逆もまた同様であり、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ＴａｎｄＡｂは、ＮＫ細胞のＣＤ３０− ＪＯＫ−１細胞の殺滅を誘導しなった。ＮＫ細胞の不存在下では、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂもＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂも標的細胞細胞傷害性活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ｓｃＦｖ５０ＮＩのストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６−Ｆｃへの結合を示すＥＬＩＳＡの結果 ＥＬＩＳＡプレートを、ウエルあたり、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６中、５００ｎｇのストレプトアビジンおよび３００ｎｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）でコートした。ついで、３００ｎｇのビオチン化ＣＤ１６Ａ−ＦｃをＰＢＳ中、室温で、３０分間、吸収させた。ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ、ストレプトアビジンおよびヒトＩｇＧを、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ ０．１％／２％ スキムミルク粉末中、１μｇ／ｍＬのマウスＭＡｂ Ａ９または５０μｌのクローン５０ＮＩ由来粗精製ペリプラズム抽出物とともに、インキュベーションした。ＭＡｂ Ａ９の結合を、ヤギ抗−マウス抗体−ＨＲＰ複合体を用いて検出した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩの結合を、抗−ペンタＨｉｓ 抗体−ＨＲＰ−複合体を用いて検出した。ＨＲＰ−基質 テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の４５０ｎｍでの吸収を、５０μｌの０．５Ｍ 硫酸での反応終結後に測定した。
【図２】ＣＤ１６Ａを発現する細胞形質転換体に結合するが、ＣＤ１６Ｂを発現する細胞に結合しない親和性成熟ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ マウスＢＷ細胞およびＣＤ１６Ａ（ＢＷ／ＣＤ１６Ａ）で安定に形質転換したＢＷ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＤ１６Ｂ（２９３／ＣＤ１６Ｂ）、ＣＤ１６Ａ（２９３／ＣＤ１６Ａ）またはＮＫｐ４６（２９３／ＮＫｐ４６）で形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９（抗−ＣＤ１６）またはＭＡｂ１９５３１４（抗−ＮＫｐ４６）で、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ １３／４５／３１−２（抗−ヘキサＨｉｓ）、ついでＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧを用いて検出した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞からの染色蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図３】組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６ＢにおけるＥＬＩＳＡ 組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６Ｂタンパク質を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８中、８０ｎＭでコートした。ウエルを、ＰＢＳ、２％ スキムミルクでブロックした。組換えタンパク質およびｇｐ３４−Ｆｃ（ネガティブコントロール）へのｓｃＦｖの結合を、抗−ｃ−Ｍｙｃ−ＨＲＰ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）、ついでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．５μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。コートされた組換えＣＤ１６Ｂを、抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）を用いた染色により直接検出しし、Ｆｃ−融合タンパク質のコーティングを、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍＬ）によって試験した。ＨＲＰ−基質として、５０μＬのＴＭＢを用いた。５０μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いた反応終結後、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【図４】新たに単離したＮＫ細胞における、ヒト親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖによってリダイレクトされた細胞傷害性のトリガリング 健常ドナーの末梢血由来のＮＫ細胞を単離、濃縮し、標的細胞としてカルセイン標識化Ｐ８１５を用いた細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。エフェクター（Ｅ）および標的（Ｔ）細胞を、１μｇ／ｍＬの指示抗体の存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で３時間インキュベーションした。特異的溶解のパーセンテージを、上清中に放出されたカルセインの測定された蛍光カウントから計算した。３回の平均値および標準偏差をプロットした.
【図５】ＰＭＮおよびＮＫ細胞における親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖのフローサイトメトリー分析 多形核細胞（ＰＭＮ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を健常ドナー由来の末梢血から単離し、フローサイトメトリー染色および分析に用いた。細胞を１０μｇ／ｍＬの抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９および抗−ＣＤ５６ ＭＡｂ Ｂ１５９、ついで１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。全てのｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬの抗−（Ｈｉｓ）６、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞染色からの蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図６】ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの対立遺伝子変種のアミノ酸配列アラインメント シグナルペプチドを影付きで示す。アスタリスクと斜体テキストは、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子変種の間での相違を示す。ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの相違を太字および下線で示す。ＣＤ１６Ａ １５８Ｖａｌ／Ｐｈｅ多形性の位置をボックスで示す。
【図７】異なるＣＤ１６アイソフォームにおけるＥＬＩＳＡ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートのウエルを、２００ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＮＫｐ４６−Ｆｃを含有する１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３でコートした。全ての抗原を、［Ａ］ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１、ついでＨＲＰ複合化抗−Ｈｉｓ抗体、または［Ｂ］ＭＡｂ Ａ９、ついでヤギ抗−マウスＨＲＰ複合体（ヒトＩｇＧとの最小交叉反応性）とインキュベーションした。一次抗体として用いた抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖは、ネガティブコントロールとして作用した。
【図８】ＴａｎｄＡｂ−活性化ＮＫ細胞による標的特異的殺滅。１×１０４の指示カルセイン標識Ｌ５４０ＣＹ（結果をパネル［Ａ］に示す）またはＪＯＫ−１標的細胞（結果をパネル［Ｂ］に示す）を、１×１０５のＮＫ細胞とともに、指示濃度のＣＤ３０×ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（黒い菱形）またはＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（白い菱形）の存在下で３時間インキュベーションした。特異的溶解の割合は、測定された放出カルセインの蛍光カウントから計算し、GraphPadPrismソフトウェアを用いて非線形回帰分析で分析した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの表面上に発現しているヒトＦｃガンマＩＩＩ受容体（すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に特異的に結合する結合分子、特に、特異的にＡ型ＦｃγＲＩＩＩに結合するがＢ型ＦｃγＲＩＩＩに結合しない結合分子、ならびに疾患の診断および治療におけるこのような結合分子の使用に関する。本発明は、更にこのような結合分子をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、およびこのような宿主細胞を用いる本発明の結合分子の製造方法まで拡張される。
【背景技術】
【０００２】
抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）に関与することが知られているいくつかのＩｇＧのＦｃ部の低親和性受容体、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩとしても知られる）は、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解の誘発に関与する、最も特徴付けられた膜受容体である（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９，ＰＮＡＳ ９６：５６４０−５６４４）。ヒトＮＫ細胞は、全リンパ球の約１５％を構成し、また、表現型上は、そのＣＤ５６の発現とＣＤ３発現の欠如とにより特徴付けられる（ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＲｉｔｚ，１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７６：２４２１−２４３８）。ヒトＮＫ細胞の多く（約９０％）は、ＣＤ５６を低密度で発現し（ＣＤ５６ｄｉｍ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を高レベルで発現する（Ｃｏｏｐｅｒら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３−６４０）。ヒトＦｃγＲＩＩＩは、２つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ、として存在し、これらは、その細胞外の免疫グロブリン結合領域において９６％の配列同一性を有する（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５−２２１）。
【０００３】
ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、マスト細胞、およびＮＫ細胞上で、膜貫通型受容体として発現する。ＮＫ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＩＡのアルファー鎖は、ＦｃεＲＩγ鎖および／またはＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３ζ鎖を含有する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合し、シグナル伝達を媒介する（Ｗｉｒｔｈｍｕｅｌｌｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１３８１−１３９０）。ＦｃγＲＩＩＩＡの、異なる組み合わせのγおよびζ鎖のホモおよびヘテロ−ダイマーとの相互作用が、ＮＫ細胞において観察され、ＮＫ細胞における、種々のＦｃγＲＩＩＩＡ複合体を介する異なるシグナル伝達経路の可能性が示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９９０、ＰＮＡＳ ８７（６）：２２７４−２２７８；Ａｃｋｅｒｌｙら，１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：１１−１４）。
【０００４】
ＦｃγＲＩＩＩＢは、多型核顆粒球（ＰＭＮ）上に、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型受容体（ＦｃγＲＩＩＩＢアイソフォーム）として存在し、これは腫瘍細胞の殺滅を引き起こすことができない（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，上掲）。さらに、ＦｃγＲＩＩＩＢは血清中で可溶性受容体として存在し、抗体への結合に基づいて、生体内で免疫複合体の形成を介して副作用を引き起こす。
【０００５】
ＦｃγＲ発現エフェクター細胞は、ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞の破壊に関与することが示されている。このことは、ＦｃγＲ活性の使用を含む、がんの治療への、いくつかの免疫治療のアプローチの開発を導いた。例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体はＦｃγＲへの結合によって誘導されたＡＤＣＣによる腫瘍細胞の破壊を介在し得、また、腫瘍細胞への一方の特異性と顆粒球上のＦｃγＲＩまたはＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩのいずれかへの他方の特異性とを有する二特異性分子もまたエフェクター細胞動員を改善するために開発が行われている（ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら，２０００ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３９１−３９７）。
【０００６】
自然免疫の細胞性のメディエーターでとして、ＮＫ細胞は、専門の細胞キラーであり、Ｔ細胞とは異なり、恒常的に、付加的な（予備）刺激を必要としない活性化状態で存在する傾向がある。対照的に、静止している細胞傷害性のＴ−細胞は、抗原−ＭＨＣ複合体の結合を介する活性化と、それに続くＣＤ２８を介する副刺激を必要とする。したがって、免疫エフェクター細胞の中で、ＮＫ細胞は、免疫治療における使用の、より魅力的な候補の一つであり、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）とＨＥＲ−２／ｎｅｕとに、またはＣＤ１６とＣＤ３０とに特異的な二特異性抗体が開発されている（Ａｒｎｄｔら，１９９９ Ｂｌｏｏｄ ９４：２５６２−２５６８；ＭｃＣａｌｌら，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６１１２−６１１７）。
【０００７】
今日まで生産されてきた抗−ＣＤ１６抗体の多くは、２つのＣＤ１６アイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）を区別できず、例外は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１Ｄ３（これは好中球上で発現するフォームのＣＤ１６、すなわちＦｃγＲＩＩＩＢ、のみを認識する）、および異なるアロタイプの型のＦｃγＲＩＩＩＢを認識するモノクローナル抗体である。（Ｏｒｙら，１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１６７６−８１；Ｈｕｉｚｉｎｇａら，１９９０ Ｂｌｏｏｄ ７５：２１３−７；Ｔａｍｍ＆Ｓｃｈｍｉｄｔ １９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ １５７：１５７６−１５８１）。しかし、これまで、特異的に、ＮＫ細胞上で発現するＦｃγＲＩＩＩＡには結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢには結合しない分子の例は無かった。
【発明の開示】
【０００８】
しかしながら，ＦｃγＲＩＩＩＡに特異的な抗体は、主にＮＫ細胞を集め、循環する可溶性のＦｃγＲＩＩＩＢには結合せず、好中球または活性化された好酸球への結合によってＮＫ細胞結合からそれないので、疾患関連細胞に対する二または多特異性結合分子のコンポーネントとして、特に有用である。ＦｃγＲＩＩＩＡ特異的抗体は、ＮＫ細胞に結合するだけでなく、結合によってそれらを活性化し、ＮＫ細胞の殺滅を効果的に媒介する。
【０００９】
我々はいくつかの新たな抗ＣＤ１６ｓｃＦｖを同定した。これらは、有用な性質を示す。すなわち、これらは、ＦｃγＲＩＩＩＡに特異的であり、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合せず、またＮＫ細胞を結合によって活性化できる。
ＦｃγＲＩＩＩＡは、特にＩｇＧ結合ドメインの４８位および１５８位において、いくつかの対立遺伝子多型を示すことが知られている。前記の抗ＣＤ１６抗体は、異なるＦｃγＲＩＩＩＡの多型フォームに異なる親和性で結合することが示され、Ｋｏｅｎｅらの研究（１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：１１０９−１１１４）は、これらの抗体のうちのいくつかの結合の違いの原因は１５８位での多型であるとしている。ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＦアレルおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖアレルの遺伝子頻度は、それぞれ約０．６および０．４であるので、任意のＣＤ１６Ａ抗体について、両方のアレル型を認識することは、あらゆる患者において、抗ＣＤ１６Ａ 抗体がＮＫ細胞集団に結合し活性化することを確実にする。
【００１０】
本明細書中、抗ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖは、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆをほぼ同じ親和性で認識するが、ＦｃγＲＩＩＩＢには結合しない。
【００１１】
本明細書に記載の新規なｓｃＦｖは前記のように新規な結合分子を生産するために用いることができ、これは治療剤として用いることができる。本明細書中、「結合分子」なる語は、抗体およびその抗原結合断片（当該抗体およびその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的または特異的に結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しない）、並びにこのような抗体または抗原結合断片、およびこのような抗体または抗原結合断片を含有するタンパク質複合体を包含する。
【００１２】
したがって、本発明の第一の態様によれば、少なくとも１つの抗原への特異性を有する結合分子（当該少なくとも１つの抗原はＦｃγＲＩＩＩＡであり、当該結合分子は特異的にＦｃγＲＩＩＩＢに結合しない）が提供される。
好ましい実施態様において、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、抗体またはその抗原結合断片によって与えられる。したがって、本発明の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡに特異性を有するが、ＦｃγＲＩＩＩＢに特異性を有さない、少なくとも一つの抗体（またはその抗原結合断片）を含有するか、ある実施態様においては、少なくとも一つの抗体（またはその抗原結合断片）からなる。
【００１３】
ＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える抗体は、自然に存在する抗体であっても、組み換え抗体であってもよい。本発明の抗体は、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体であってよい）。好ましくは、当該抗体は、ＩｇＧ抗体である。本発明の使用に適当な抗原結合断片は、自然に存在するものでも組み替え体であってもよく、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Fv、一本鎖抗体（ｓｃＦｖを包含する）、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＣＤＲを包含する。当業者は、このような抗原結合断片およびその調製に精通しているであろう。疑義を避けるためであるが、本明細書中で用いられる一本鎖抗体なる用語は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有し、適当な柔軟性のあるポリペプチドリンカーが連結している、遺伝子操作された一本鎖分子をいう。
【００１４】
ある実施態様においてはＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える抗体または抗原結合断片は、少なくとも１つのヒトＣＤＲ（好ましくは下記の表１に記載のＣＤＲから選択される）を含有する。
表１ 選択的および特異的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、ＦｃγＲＩＩＩＢに選択的に結合しないｓｃＦｖに由来するヒト軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
【００１５】
【表１】
【００１６】
当業者は、単独ＣＤＲを例外として、前記抗体および抗原結合断片が、通常、３つの軽鎖ＣＤＲおよび／または３つの重鎖ＣＤＲを構成することを理解するであろう。更なる実施態様によれば、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有する前記抗体または抗原結合断片は、３つのヒトの軽鎖ＣＤＲおよび／または３つのヒト重鎖ＣＤＲを含有する。好ましくは、ヒト軽鎖ＣＤＲ１は配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有し、ヒト軽鎖ＣＤＲ２は配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を有し、ならびにヒト軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８および配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ヒト重鎖ＣＤＲ１は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、ヒト重鎖ＣＤＲ２は配列番号１８のアミノ酸配列を有し、そしてヒト重鎖ＣＤＲ３は配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
前記抗体または前記抗原結合断片は、軽鎖の可変領域を含有するか、またはそれからなるが、下記のアミノ酸配列の１つを有していてよい。
【００１８】
配列番号１０：syelmqppsvsvssgqtasipcsgdkleekyvswyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００１９】
配列番号１１：syeltqplsesvaqgqtaritcggnniesrnvhwyqqkpgqapvlviyrdnnrpsgiperfsgsnsgnmatltisraqagdaadyycqvwdnytvlfgggtkltvl;
【００２０】
配列番号１２：
syeltqppsvavapgktaritcggnnigsknvhwyqqkpgqapvlviyrdsnrpsgiperfsgsnsgntatltisraqagdeadfycqvwdnyivlfgggtkltvl;
【００２１】
配列番号１３：
qavltqppsvsvapgqtaripcegnnigsknvhwyrqkpgqvpvlvmyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００２２】
配列番号１４：
qpvltqplsvsvapgqtaritcggnnigsknvhwyqqkpgqapvlviyrdssrpsgiperlsgsnsgdtatltisraqagdeadyycqvwddyivvfgggtkltvl;
【００２３】
配列番号１５：
syeltqppsvsvtpgqtatitcgandigkrnvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl;
【００２４】
配列番号１６：
qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl．
【００２５】
前記抗体または前記抗原結合断片は、重鎖の可変領域を含有するか、またはそれからなるが、下記のアミノ酸配列（配列番号９）：evqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvss
を有していてよい。
【００２６】
好ましい実施態様においては、ＦｃγＲＩＩＩＡへの特異性を与える前記抗体または前記抗原結合断片は、完全ヒト型である。
【００２７】
更なる好ましい実施態様においては、本発明の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を、このような細胞上に発現しているＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に基づいて、活性化できる。すなわち、結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に基づいて、生物学的応答（特に、シグナル応答）の誘発を可能にしている。好ましくは、結合分子は、このような細胞への結合によって 抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）と類似の方法で、細胞殺滅を引き起こすこともできる。
【００２８】
本発明の結合分子がＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を活性化することができるかどうかを試験するため、例えば本明細書の実施例に記載のように、末梢血ＮＫ細胞におけるカルシウム動因を誘発する能力を試験できる。NK細胞媒介細胞傷害性を引き起こす本発明の結合分子の能力は、また本明細書に記載の実施例のように、新たに単離されたＮＫ細胞を用いた、リダイレクテッド細胞溶解（re-directed cell lysis）を検出するカルセイン放出分析を用いて試験できる。
【００２９】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有し、ＦｃγＲＩＩＩＢに対する特異性を欠くだけでなく、１以上の更なる抗原への特異性も有する 、結合分子も提供する。したがって、本発明の結合分子は、多特異性である。本明細書で用いられる「多特異性」なる用語は、本発明の結合分子が、ＦｃγＲＩＩＩＢに対する特異性を欠く一方で、少なくとも２つの特異性を有し、その１つはＦｃγＲＩＩＩＡに対するものであることを意味する。したがって、本発明の多特異性結合分子は、例えば、一本鎖のダイアボディ(diabody)、(scFv)2、タンデムの二特異性抗体(TandAb)、トリボディ（tri-body）（三特異性抗体）、テトラボディ（tetrabody）（四特異性抗体）およびフレクシボディ（flexibody）のような、二特異性、三特異性、および四特異性分子を少なくとも包含する（Ｌｅ Ｇａｌｌら，１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ ４５３：１６４−１６８およびＷＯ０３／０２５０１８を参照）。
【００３０】
それらの多特異性によって、本発明のこの態様の結合分子は、マクロファージまたはNK細胞を、更なる抗原またはこのような抗原を有する細胞へ向けさせ、それによって当該抗原または抗原を有する細胞を貪食作用またはNK細胞媒介細胞殺滅によって絶滅させうる。例えば、本発明の結合分子は腫瘍特性抗原に対する更なる１以上の特異性を有しえ、これによってNK細胞を腫瘍細胞に向けうる。ＦｃγＲＩＩＩＡに結合している結合分子によって生じるＮＫ細胞の活性化は腫瘍細胞の破壊を導く。この様式によって、本発明の結合分子を、その更なる特異性または特異性に依存して、罹患細胞および病原体（例、バクテリア、真菌類、マイコプラズマ、ウイルス、寄生体、プリオン）の治療および／または排除の目的で用いることができる。
【００３１】
したがって、本発明の更なる態様において、前記のように本発明は、少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する結合分子を提供する。本発明のある実施態様では、少なくとも１つの更なる抗原は、細胞表面抗原である。本発明の実施態様によって結合分子が特異性を示す細胞表面抗体の例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体タンパク質（腫瘍胎児抗原未成熟ラミニン受容体ＯＦＡ−ｉＬＲとしても知られる）、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ−１、ＥｒｂＢ１としても知られる）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ−２、ＥｒｂＢ２、ｎｅｕとしても知られる）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ−３としても知られている）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ（胎盤アルカリホスファターゼ）、トムセン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５である。
【００３２】
更なる実施態様においては、前記「少なくとも１つの更なる抗原」は、例えば病原体由来の抗原であり、当該抗原は宿主細胞、感染細胞、細菌、真菌類、マイコプラズマ、寄生体もしくはウイルスから分泌されるか、またはそれらの外表面上に発現されたものでもよく、あるいはこのような病原体の溶解に基づいて放出されたものでもよい。例えば、本発明の結合分子は、ＣＭＶ感染細胞表面上のｇｐ３４もしくはｇｐ６８のようなウイルスタンパク質、またはインフルエンザウィルスの存在に基づく赤血球凝集素に対して更なる特異性を有してもよく、それによってウイルス感染細胞を標的とするか、または直接的にウイルスを標的とすることができる。その代わりに、病原体がプリオンである場合、プリオンタンパク質自体が抗原となりうる。
【００３３】
更なる実施態様においては、少なくとも１つの更なる抗原は、アレルゲンであるか、または循環ＩｇＥまたは（特に）肥満細胞上のＦｃεＲＩ受容体のような、アレルゲンに対する身体の応答に関与する分子である。
【００３４】
好ましくは、本発明の本態様の結合成分においては、前記少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性は、抗体またはその抗原結合断片によって与えられる。前記のように、当業者は、抗体の型（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、およびこのような抗体に由来する抗原結合断片（例えば、免疫グロブリンＬ鎖、免疫グロブリンＨ鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＣＤＲ）に精通しており、これらもまた、本発明の本態様で用いられうる。好適な実施態様において、前記抗体はＩｇＧ抗体である。
【００３５】
したがって、本発明の、多特異性の、特に二特異性の結合分子は下記のフォーマットのいずれかを有する：二特異性ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ２、（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ）２、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合タンパク質、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）２、（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、二特異性ダイアボディ、ジスフィルド安定化（ｄｓ）ダイアボディ、ノブ・イントゥ・ホール ダイアボディ（‘ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｗｈｏｌｅ’ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、フレクシボディ、ＤｉＢｉ ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、［（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ］２、（ｓｃＤｂ−ＣＨ３）２、（ｓｃＤｂ−Ｆｃ）２、ジ−ダイアボディ（Ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｔａｎｄｅｍａｂ（ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｅ Ｇａｌｌ，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，７：２３３−２４２、ならびにＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ，２００５，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：６４９−６５８でレビューされている）。好適な実施態様においては、結合分子はＴａｎｄＡｂまたはフレクシボディである。他の多くの二特異性抗体フォーマットとは異なり、ＴａｎｄＡｂは抗体可変領域のみを含有するホモダイマーであり、そのフォーメーションは異なるポリペプチド鎖上に位置するｓ相補的ＶＨおよびＶＬ領域の会合によって決定される。ＴａｎｄＡｂはダイアボディおよび（ｓｃＦｖ）２の２倍のサイズであり、二価的にエフェクターと標的細胞との両方に結合でき、例えばダイアボディーおよび（ｓｃＦｖ）２に対して、改善された薬物動態学的特徴を有し、例えば、インビトロおよびインビボの両方において、より高い安定性および促進された生物学的活性を有する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９３：４１−５６；Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：４３３６−４３４１；Ｒｅｕｓｃｈら，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２：５０９−５１８）。同じ特異性を有する同属のＶＨおよびＶＬ領域の分子間鎖の対合は、二特異性ｓｃＦｖＢ−ダイアボディＡ−ｓｃＦｖＢタンデム分子（いわゆる、“フレクシボディ”）（ＡおよびＢは、同一または異なる特異性を有してよい）の形成にも用いられうる。分子間鎖の対合に関係する相補領域の会合の厳格さおよびそれらを分けるリンカーの長さに依存して、二特異性一本鎖分子の２量体、３量体、および更に４量体が形成されうる。
本発明の本実施態様で用いられ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆タンパク質、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムセン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファー、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＩｇＥに対する特異性を示す抗体および抗体結合断片の例は、病原体に対する抗体として、公知文献に記載されている（例えば、ＥＰ−Ａ−１３１４７４１、Ｒｅｆｆら，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５、ＥＰ−Ａ−１００５８７０、ＷＯ０１／９２３４０、ＵＳ６，０３３，８７６、ＷＯ８６／０３２２３、Ｂｕｔｏら，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ １２：１−５、ＵＳ６，６９９，４７３、ＷＯ９８／５０４３３、ＵＳ５，７７０１９５、ＥＰ−Ａ−０５０２８１２、Ｃａｒｔｅｒら，１９９２ ＰＮＡＳ ８９：４２８５−４２８９、ＵＳ ５，９６８，５１１、ＷＯ ０４／１０６３８３、Ｎｏｕｒｉら，２０００ ＢＪＵ Ｉｎｔ．８６：８９４−９００、ＥＰ−Ａ−０４２９２４２、Ｒａｖｎら，２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４３：９８５−９９６、Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇら，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６３−７１、ＷＯ８８／０５０５４、ＷＯ０２／０５３５９６、ＷＯ０４／０７１５２９、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，１９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：８０５−８１４、Ｐｒｅｓｔａら，１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２を参照）。これらの引用文献は、このような抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列またはそれらをコードする核酸配列を提供するところ、当業者は本発明の結合分子の生産に直接的にこのような配列を直接利用することができる。これらの引用文献は、このような抗体または抗原結合断片を産生するハイブリドーマまたはセルラインを開示するところ、当業者は、標準的な分子生物学の技術を用いて、適当なハイブリドーマまたはセルラインから，所望する抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を得ることができ、いったん得られた核酸配列は、本発明の結合分子の構築に用いることができる。
本発明の更なる態様は、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８ＦアレルおよびＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖアレルにほぼ同じ親和性で結合可能な、前記の態様のいずれか１つ記載の結合分子を提供する。すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡの２つの１５８アレルに対する前記結合因子の親和性の違いは２倍以下である。本発明の本態様にしたがった好適な具体例において、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、本明細書に記載の４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖ由来の抗体または抗原結合断片によって与えられる。本発明のこの態様に従った好ましい実施態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は、本明細書中に記載の、４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖに由来する抗体または抗原結合断片によって与えられる。特に好ましい実施態様においては、本発明の当該態様に従った結合分子は、ＴａｎｄＡｂ型であり、本明細書中に記載の４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖに由来する抗原結合断片およびＣＤ１９またはＣＤ３０に対する特異性を有する抗原結合断片を含有する。
【００３６】
当業者は、本発明の結合分子が人の治療で使われることが意図されるところにおいて、結合分子の潜在的な免疫原性は最小にされるべきであることを理解するであろう。したがって、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／または更なる抗原に対する特異性は、抗体または抗原結合断片によって与えられるところ、抗体または抗原結合断片は、キメラ、ＣＤＲ移植ヒト化、または完全ヒト型であることが好ましい。より好ましくは、抗体または抗原結合断片は、ヒト化または完全ヒト型である。抗体のヒト化を実行する標準的な分子生物学的技術の使用は、現在では、当該技術分野においてはルーチン的なものであり、非ヒト抗体配列を用いて提供され、当業者が容易にこのような抗体のヒト化変種を製造することができる。本明細書で用いられる「完全ヒト型」なる用語は、それが抗体または抗原結合断片に関する限りにおいて、抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列がヒトから得られる（すなわち、ヒトに由来するか、またはヒトの中に見いだされうる）ことを意味する。
上記の方法に代えて、または加えて、免疫原性を減らすために用いられうるもう１つの技術が、デイムニゼーション（deimmunisation）の技術である。デイムニゼーション技術は、抗体および他のタンパク質生物学治療剤からの、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープの同定と分離を伴う。Ｔｈ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する能力を有する、タンパク質の中の短いペプチド配列を含有する。ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合剤はＴ細胞によって識別されることができ、そしてＴｈ細胞の賦活化と分化も引き起こすことができ、これは、Ｂ細胞との相互作用を介する免疫原性の獲得と維持に必要とされ、投与された生物学的治療剤に特異的に結合する抗体の分泌物をもたらす。抗体デイムニゼーションの目的で、Ｔｈ−細胞エピトープは、例えばペプチドのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合を予測するコンピューターに基づく方法によって抗体配列の中で識別される（Ａｌｔｕｖｉａら，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４９：２４４−２４５０，およびＳｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，９：１８３８−１８４６を参照）。Ｔ細胞による認識を避けるために、このようにして同定されたＴｈ細胞エピトープは、アミノ酸置換によってタンパク配列から排除される。これは、例えば、治療用タンパク質におけるＴｈ細胞エピトープをコードする核酸配列を改変する部位特異的突然変異誘発法のような標準的な分子生物学テクニックの使用を通じて達成できる。このようにして、ＨＡＭＡ（ヒトの抗マウス抗原性）および／または抗イディオタイプ応答が抑制または回避されるように、抗体または抗原結合断片を修飾できる（Ｂａｎｄｅｒら，２００３，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３０：６６７−６７６；Ｎａｎｕｓら，２００３，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１７０：Ｓ８４−Ｓ８９）。このように、更なる実施態様では、本発明の結合分子は、修飾されて、それらの配列に存在しているＴｈ細胞エピトープが除去されている。本明細書中、このような結合分子を、デイムナイズされた結合分子と称する。
【００３７】
更なる態様においては、本発明の結合分子は、更なる機能的領域を含有する。この機能的領域が結合分子にエフェクター特性を与えることができる。例えば、機能的領域は、ＦｃＲ結合ペプチドまたは抗体のＦｃ領域であってもよく、それらは、それらのＦｃ受容体結合能を通じて、結合分子にエフェクター特性を与える。代わりに、当該機能的領域はプロドラッグを活性薬物に変換できる酵素であってもよい。このようにして、本発明の結合分子を、抗体依存性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に用いることができる。更なる実施態様では、機能的領域は、結合分子の血清半減期を増加させるタンパク質またはペプチドである。このようなタンパク質の例は、ＦｃγＲｎ（新生児のＦｃ受容体）への結合能によって、結合分子の血清半減期を増加させられる結成アルブミンまたはＩｇＧのＦｃ部である。更なる実施態様では、機能的領域はサイトカインであってもよい。
更なる態様では、本発明の結合分子を、標識分子、あるいは毒素に結合させることができる。標識分子または毒素がタンパク質である場合、結合分子への結合は、ペプチド結合または化学的結合によって生じさせうる。したがって、本発明の当該態様によれば、結合分子は、標識分子または毒素が、ペプチド結合、好ましくはペプチドリンカーによって結合分子に連結された融合タンパク質の形態であるか、または化学的複合体の形態であってもよい。疑義の回避のためであるが、本明細書中、複合体なる用語は、２つのコンポーネントが、ペプチド結合（したがって、複合体は融合タンパク質を包含する）、化学結合、エステル結合、またはジスルフィド架橋によって物理的に連結されていることを意味するために用いられる。
放射能標識または螢光もしくは発光標識（化学発光を含む）のような標識分子への本発明の結合分子の結合は、当該結合分子が免疫学的染色試薬として使われることを可能にする。このような試薬は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現している組織潜入ＮＫ細胞、マクロファージ、またはマスト細胞の検出に、あるいは当該結合分子が更なる抗原に特異性を示す場合は、ＮＫ細胞−結合分子−更なる抗原の複合体の検出に用いられうる。後者の検出は、疾患の診断、または疾患の進行もしくは寛解のモニタリングにおいて、特に有用たりうる。
【００３８】
本発明の結合分子が、リボシル転移酵素、セリンプロテアーゼ、グアニルシクラーゼアクティベーター、カルモジュリン依存アデニルシクラーゼ、リボ核酸酵素、ＤＮＡアルキル化剤または有糸分裂抑制剤（例えばドキソルビシン）等のような毒素分子に連結されている場合、当該結合分子は、ＮＫ細胞と大型食細胞をターゲットにして、破壊させるために用いることができる。従って、このような結合分子は免疫抑制薬として使用できる。当業者は、本発明の当該態様において、結合分子がただ１つの抗原、すなわちＦｃγＲＩＩＩＡのみに対して特異性を示すことが好ましいことを理解するであろう。免疫系の抑制は、選択的および特異的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合する一価抗原結合断片を含有するか、またはそれからなる結合分子の使用によっても達成されうる。このような一価の結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体をブロックする分子として作用し、架橋されず、これによってＮＫ細胞またはマクロファージを活性化しないので、好ましい。好ましい一価の抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲを包含する。
【００３９】
当業者は、化学的連結を介する標識分子または毒素の付加の代わりに、ペプチド標識またはペプチド毒度もまた用いることができることを理解するであろう。例えば、本発明の結合分子は、テトラ−、ペンタ−、もしくはヘキサ−ヒスチジン・タグ、またはｃ−ｍｙｃタグ等のようなＮ−またはＣ−末ペプチド・タグとの融合タンパク質として発現してもよい。
本発明の結合分子は、任意の適当なタンパク質発現系における、それらをコードする核酸の発現によって生産されてもよい。したがって、更なる態様においては、本発明は、本発明の結合分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の当該態様における使用に特に適当なポリヌクレオチドは、前記表１に記載のＣＤＲをコードする。特に、表１の軽鎖および重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を手に入れた当業者は、下記の核酸配列から，様々な軽鎖および重鎖ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列を得ることができるだろう。
【００４０】
配列番号1:
gaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca;
【００４１】
配列番号2:
tcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４２】
配列番号3:
tcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４３】
配列番号4:
tcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctg
【００４４】
配列番号5:
caggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４５】
配列番号6:
cagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４６】
配列番号7:
tcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４７】
配列番号8:
cagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
【００４８】
配列番号１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しないヒトｓｃＦｖに由来する重鎖可変領域をコードする。配列番号２〜８は、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しないヒトｓｃＦｖに由来する軽鎖可変領域をコードする。したがって、配列番号１〜８は、また本発明のポリヌクレオチドの例であり、本発明の更なる結合分子の生産に用いることができる。
【００４９】
本発明の、多特性結合分子、特に二特異性結合分子、をコードするポリヌクレオチドは、ＦｃγＲＩＩＩＡに選択的および特異的に結合するがＦｃγＲＩＩＩＢに特異的に結合しない抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列を、更なる抗原に対する特異性を有する抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列と組み合わせて用いて、ＷＯ０３／０２５０１８に記載の方法で構築することができる。
【００５０】
適当なタンパク質発現系で結合分子を発現させるため、当該結合分子をコードするポリヌクレオチドを適当なプロモーター、および所望による適当な転写ターミネーターに、作動可能に連結する。これは、本発明のポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入し、ゲノムに存在するプロモーターを利用して当該ポリヌクレオチドの発現を促進することによって、達成できる。別法として、本発明のポリヌクレオチドを、作動可能にプロモーターおよび所望によるターミネーター領域に連結したベクター上で、宿主細胞に導入してもよい。
【００５１】
一般に、結合分子をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結するベクター中のプロモーターは、当該ポリヌクレオチドおよびベクターを導入する宿主細胞中で結合分子の発現の促進を可能にする任意のプロモーターである。したがって、結合分子が細菌細胞で発現することを所望する場合は、プロモーターは細菌細胞中で作動可能である。同様に、結合分子を真菌発現系で発現させることを所望する場合は、プロモーターは真菌細胞で作動可能であり、構築物が哺乳類細胞培養系、昆虫細胞発現系、または植物細胞発現系に導入される場合、同様のロジックが適用される。本発明のポリヌクレオチドが作動可能に適当な転写ターミネーター領域に連結される場合、これは本発明の結合分子が発言される宿主細胞における転写終結を媒介するものである。この目的に適した転写ターミネーター領域は、技術文献に開示されている。
【００５２】
好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチドはまた、作動可能にシグナル配列に連結されてもよい。これは、当該結合分子の発現を、所望する細胞の、または細胞外の部位に向けることを可能にするものである。例えば、いくつかの態様においては、結合分子は、それが発現する細胞から分泌されることが望まれうる。この場合、シグナル配列は分泌シグナルをコードする。
適当な細菌の分泌シグナルは技術文献に記載されており、そのような一例は、ＰｅｌＢリーダー配列である。他の態様では、例えば、真核生物での発現に関連して、結合分子の発現が小胞体（ＥＲ）で保持されることが望まれうる。この場合、シグナル配列は“ＫＤＥＬ”（配列番号５４）モチーフ、特に“ＳＥＫＤＥＬ”（配列番号５５）コードする配列をコードするＥＲ保留シグナルを含有する。
本発明のポリヌクレオチドはまた、選択された特定の発現宿主に適合するように変更されたコドンバイアスを用いて、当該技術分野で容易に利用可能な方法に従って最適化された、コドンであってもよい。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、適当な方法論を用いて宿主細胞に導入することができる。真核細胞では、このような技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション法、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、またはレトロウイルス、アデノウイルスまたはその他のウイルス（例えば、小痘瘡、または昆虫細胞についてはバキュロウィルス）を用いた形質導入が挙げられる。
細菌細胞では、適当な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション法、またはバクテリオファージを使ったトランスフェクションが挙げられる。植物細胞では、形質転換される特定の植物種に依存して、アグロバクテリア媒介形質転換、エレクトロポレーション法、植物細胞およびプロトプラストの微量注射、微粒子銃、細菌ボンバートメント（特に、「ファイバー」法または「ウィスカー」法）が挙げられる。したがって、更なる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞を提供する。したがって、下記の生物体に由来し、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞は、当該態様の具体例であると考えられる。
【００５４】
本発明の結合分子の発現のための適当な発現系としては、微生物発現系（例、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現系）、および例えば酵母（例、（サッカロマイセス・セレビッシェ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピシア・スピーシーズ（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ハンゼヌラ・スピーシーズ（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ））および他の真菌発現系（例、アスパージーラス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびニューロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような糸状菌発現系、哺乳類発現系（例、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）、昆虫細胞発現系、ならびに植物発現系が挙げられる。ベニバナが植物発現系として特に好ましい。当業者は、技術文献に記載されている、これらの発現系に精通しているであろう。
【００５５】
本発明はまた、本発明の結合分子の生産方法も提供する。したがって、更なる態様においては、本明細書に記載の結合分子の生産のための方法が提供される。当該方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入、および当該結合分子が発現する条件下での当該宿主細胞の培養を含む。宿主細胞の生育および維持、ならびにこのような宿主細胞からの本発明の結合分子の発現の媒介の条件は、技術文献に完全に記載されている。ある実施態様では、当該方法は、更に結合分子の単離、および所望により更に精製を含む。
【００５６】
本発明の結合分子が、当該結合分子に化学的に結合している標識分子または毒素分子を含有する場合、当該複合化された結合分子は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入、本発明の結合分子が発現する条件下での宿主細胞の培養、結合分子の単離および単離された結合分子の適当な標識または毒素との結合によって生産できる。一般に、複合化工程は、技術文献で記述されているように、ジスルフィドまたはチオエーテル架橋をもたらすヘテロ２価架橋試薬の使用を伴う（架橋試薬の使用に関連した標準的な方法論のために、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．“ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９６を参照）。
【００５７】
当業者は、本発明のいくつかの実施態様によって、体内の結合分子の循環半減期を増加させることが望ましい可能性があることを理解するであろう。前述のように、これは、様々な方法、例えば、アルブミン等との融合タンパク質としての結合分子の構築を通じて、達成することができる。分子の血清半減期を増加させる更なる方法は周知であり、例えば、ＰＥＧ化、シアリル化、およびグリコシル化が挙げられる。したがって、本発明は、本明細書に記載の結合分子が、ＰＥＧ化、シアリル化またはグリコシル化されているものを包含する。
本発明はまた、結合分子および少なくとも１つの追加成分を含有する組成物を含む。例えば、当業者は、発現後の宿主細胞からの結合分子の単離において、実質的に精製された結合分子を含有するが、不純物、希釈分、または緩衝剤等も含んでいる組成物が得られうることを理解するであろう。このような中間的組成物は、更なる使用に直接適している場合もあり、または、それから結合分子をさらに精製してもよい。
【００５８】
本発明の組成物はまた、本発明の結合分子を、任意の適当な薬学的に受容できる担体、賦形剤、希釈剤および／または安定剤との組み合わせにおいて含有してもよい。このような成分は、技術文献に記載されており、当業者はそれに精通しているであろう。好ましくはこのような組成物は、対象への投与に適した任意の形態、特に、例えば注射または点滴等の適当な非経口投与に適した形態である。
【００５９】
組成物が注射あるいは点滴用である場合、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態であってよく、懸濁化剤、防腐剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤成分を含んでいてもよい。これにかえて、結合分子または組成物が適当な無菌液を用いて使用前に再形成する、乾燥形態であってもよい。
【００６０】
本発明の結合分子および組成物、特に多特異性結合分子およびそれを含有する組成物は、例えば、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症（移植片対宿主病を含む）、アレルギーおよびがん（例えば非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫／疾病；固形腫瘍（例えば、乳がん、卵巣がん、大腸がん、腎臓のがん腫、または胆管がんで生じているもの）；微小残存病変；転移性腫瘍（例えば、肺、骨、肝臓または脳内で転移しているもの）等の疾患の診断および／または治療に用いることができる。
【００６１】
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ１９またはＣＤ２０への特異性である本発明の多特異性結合分子は、特に非ホジキンリンパ腫の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＥＧＦＲ１に対するものである多特異性結合分子は、ＥＧＦＲ１発現が上昇または変化しているがん（例えば、乳、膀胱、頭頚部、前立腺、腎臓のがん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん腫、および膠腫）の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＴＦ−抗原に向けられたものである多特異性結合分子は、特に乳がんもしくは大腸がんおよび／または肝転移の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ３０に対するものである多特異性結合分子は、特にホジキン病の治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＩＬ４受容体のα鎖（ＩＬ４Ｒα）に対するものである多特異性結合分子は、固形腫瘍、特に乳房、卵巣、腎臓系、および頭頚部のがん腫、悪性黒色腫ならびにＡＩＤＳ関連のカポジ肉腫の治療に有用である。
【００６２】
少なくとも１つの更なる特異性がＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３および／またはＥＧＦＲ２／ｎｅｕに対するものである多特異性結合分子は、特に乳がんの治療に有用である。
少なくとも１つの更なる特異性がＩＧＦＲに対するものである多特異性結合分子は、特に前立腺がん、結腸直腸がん腫、卵巣がんまたは乳がんの治療に有用である。
【００６３】
少なくとも１つの更なる特異性がＣＤ５に対するものである多特異性結合分子は、特に慢性リンパ性白血病の治療に有用である。
【００６４】
少なくとも１つの更なる特異性がＭＵＣ−１に対するものである多特異性結合分子は、特に胃がんと卵巣がんの治療に有用である。
【００６５】
少なくとも１つの更なる特異性がＥｐＣＡＭに対するものである多特異性結合分子は、特に結腸、腎臓および乳房のがん腫の治療に有用である。
【００６６】
少なくとも１つの更なる特異性がＰＬＡＰに対するものである多特異性結合分子は、特に卵巣または睾丸がんの治療に有用である。
【００６７】
少なくとも１つの更なる特異性がＯＦＡ−ｉＬＲに対するものである多特異性結合分子は、特に転移性腫瘍の治療に有用である。
【００６８】
本発明の更なる態様においては、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、アレルギーまたはがん腫（例、非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫；固形腫瘍（例えば、乳がん、卵巣がん、大腸がん、腎臓のがん腫、または胆管がんで生じているもの）；微小残存病変；転移性腫瘍（例えば、肺、骨、肝臓または脳内で転移しているもの）の治療用の医薬の製造における前記の結合分子の使用が提供される。具体的な多特異性結合分子が、前記で具体的な疾患の治療における特定の有用性を有するものとして記載されている場合、これらの結合分子は、具体的な疾患用の薬剤の製造においても使用できる。
【００６９】
更なる態様では、本発明の結合分子はＦｃγＲＩＩＩＡを発現する細胞を染色する試薬として用いることができる。当該結合分子が少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する場合、これを、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現細胞−結合分子−抗原複合体を同定できる試薬として用いることができる。本発明の結合分子は、バイオマーカーとして、患者の生体外試料の分析および型の決定、および生体外治療のためのＮＫ細胞の単離に用いることができる。
【００７０】
したがって、更なる態様では、前記の結合分子、および、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合したとき当該結合分子を検出する手段を含有するキットが提供される。当該結合分子が放射能標識または化学発光標識で標識される場合、前記検出手段は、放射線または化学発光標識に感受性を有するフィルムを含有する。前記結合分子がヒスチジンまたはｃ−ｍｙｃタグを付加される場合、当該キットはこのタグを認識する抗体を含有してもよい。
【００７１】
本発明の種々の態様を、実施例によって、より詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱しない範囲で細部の変更がなされることが理解されよう、また当業者は、本発明における使用のための更なる抗体と抗原結合断片が本明細書の実施例２に記載のように得られ、ＦｃγＲＩＩＩの異なるアイソフォームおよびＦｃγＲＩＩＩの異なる対立遺伝子型への結合に関するそれらの性質は、本明細書の実施例のように試験できることを理解するであろう。
【００７２】
疑義の回避の目的であるが、本明細書中、“ＦｃγＲＩＩＩ”、“ＦｃγＲＩＩＩＡ”、および“ＦｃγＲＩＩＩＢ”なる用語は、“ＣＤ１６”、“ＣＤ１６Ａ”（ＣＤ１６のＡアイソフォームを意味する）および“ＣＤ１６Ｂ”（ＣＤ１６のＢアイソフォームを意味する）なる用語とそれぞれ相互に交換して用いることができる。
【実施例１】
【００７３】
ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質のトランジェントな発現および精製
分泌・可溶型のＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ１６ＡをコードするプラスミドｐＣＤＭ−ＣＤ１６−Ｆｃ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９、上掲）のトランジェントな形質転換の後、ＨＥＫ−２９３細胞中で生産した。
【００７４】
ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）を、完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、および１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（全てInvitrogen社（カールスルーエ、ドイツから入手））中、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿大気中で培養した。これらの細胞のリン酸カルシウム媒介形質転換は、下記のように行った。
【００７５】
形質転換の１日前に、１．５ｘ１０６のＨＥＫ−２９３細胞を用いて、直径１０ｃｍの細胞培養プレート中の１０ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地に播種した。１０μｇのプラスミドＤＮＡを５００μｌの２５０ｍＭ ＣａＣｌ２と混合し、ついで、これを５００μｌの２×ＨＥＢＳ緩衝液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）に滴下し、および室温で１５分間インキュベーションした。９ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地をこの形質転換カクテルに添加、混合し、および培養培地を除去したＨＥＫ−２９３細胞の１つの皿に移した。翌日、形質転換培地を無血清ＤＭＥＭ培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンおよび１×インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ａ サプリメント（全てInvitrogen社から入手）を添加したＤＭＥＭ培地と交換した。分泌ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ 融合タンパク質を含有する上静を、細胞の生育性に依存して、形質転換後２〜６日の期間内に２回回収した。各回収の後、新鮮な無血清培地を当該細胞に添加した。回収した上静を遠心分離して細胞または細胞破片を除去し、融合タンパク質の精製のための使用まで−８０℃で保存した。ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を含有する約１．２Ｌの上静を得るまで、形質転換を繰り返した。
【００７６】
組換えＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の精製を、２ｍＬ プロテインＡカラム上で実施した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。カラムを１０容量のＤＭＥＭ ｐＨ７（Invitrogen社；１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ａおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン添加）を用いて平衡化した。細胞培養上静（１２００ｍｌ）のカラムへのロード前に、０．２μｍ無菌フィルターを通過させ、および０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）の添加によりｐＨ７に調整した。カラムは、４℃で、重力流下で動作させた。次いで、カラムを１０容量のＤＭＥＭ ｐＨ７で洗浄した。溶出は、６容量の０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて実施した。１ｍｌフラクションを直接５５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）に集めた。
【００７７】
１２％ ＰＡＡゲルにおけるフラクション番号１〜１０分析は、融合タンパク質の圧倒的多数がフラクション２〜７にあることを示した。これらのフラクションを集め、５ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して２回透析した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ社、１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によるタンパク質濃度の測定により、培養上静のリットルあたり、合計収量２１ｍｇのＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合タンパク質（すなわち、１７．５ｍｇの融合タンパク質が生産されたことが明らかになった。
【実施例２】
【００７８】
ＣＤ１６−Ａ特異的抗体の同定および単離
ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、大分子ヒトＩｇＭ由来ｓｃＦｖ ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを行った。これは、前記と同様の方法を用いて生産した（Ｄｏｅｒｓａｍら，１９９７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ ４１４：７−１３、Ｌｉｔｔｌｅら，１９９９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：３−９、Ｓｃｈｗａｒｚら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８：１７０４−６）。当該ライブラリー中のクローンは、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ遺伝子とｓｃＦｖコード配列との間のヌクレオチド配列を含んだ。これは、ヘキサヒスチジンタブ、アンバー終止コドン、およびｃ−ｍｙｃエピトープをコードする。
【００７９】
５００μｇ ＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合タンパク質を、ＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュール（Amersham Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）を用いてビオチン化し、およびファージディスプレィライブラリーに対して３回の選択に用いた。ライブラリーの選択の前に、これらのタンパク質への潜在的な吸着物を除去するために、連続的にライブラリーをストレプトアビジンでコートしたポリスチレンおよびヒトＩｇＧ（シグマ−アルドリッヒ社、タウフキルヒェン、ドイツ）に予備吸着させた。当該ライブラリーからの約１０１２ファージを、ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ，２％ スキムミルク中に再懸濁し、可溶ビオチン化ＣＤ１６Ａ Ｆｃ−融合体とともにインキュベーションした。磁気分離器（Ｄｙｎａｌ社、オスロ、ノルウェー）を用いて、ファージ抗原複合体を、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズによって捕らえた。標的抗原に特異的に結合しなかったファージを、ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎを用いた１０回の洗浄工程によって除去した。結合物は、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２を用いて溶出させ、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０による中和後、溶出物を、対数期中期の新しく生育したＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞の感染に用いた（ＯＤ６０００．２−０．５）。ヒトｓｃＦｖをコードするファージミドの形質転換が成功した細胞を、アンピシリン耐性によって選択し、次いでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させて、続くインビトロの選択のために、ｓｃＦｖを提示する後代ファージを生じさせた。３回目の選択後、個々のコロニーを、ＰＰ−Ｍａｓｔｅｒｂｌｏｃｋ ２ｍＬ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）内で、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有するＬＢ培地で、３０℃で生育させた。細胞を遠心分離によって回収し、２００μＬの ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％ スクロース，１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。氷上の１時間のインキュベーションの間に、外膜を破壊され、ｓｃＦｖを含有する可溶性ペリプラズムタンパク質が培養培地中に放出した。遠心分離によるスフェロプラストおよび細胞砕片の除去後、ＥＬＩＳＡで、粗精製のペリプラズム抽出物を試験した。１個のクローン（５０ＮＩ）が３回の別々の機会で見出された。
【００８０】
ファージディスプレイライブラリーからのこのクローンの親和性選択をヒトＦｃ−融合タンパク質において実施したので、クローン５０ＮＩがこの分子のＣＤ１６部分に対して特異性を示すことは必然であった。
クローン５０ＮＩ由来のペリプラズマ抽出物を前記のように調製し、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ 融合タンパク質およびヒトＩｇＧへの結合能を試験した。抗−ＣＤ１６マウスモノクローナル抗体Ａ９（Ｈｏｍｂａｃｈら，１９９３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：８３０−８３６）を対照として用いた。Ｍａｘｉｓｏｒｂ（商品名）ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６中、５００ｎｇのストレプトアビジンおよび３００ｎｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）でプレコートした。次いで、３００ｎｇのビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃを３０分間、室温、ＰＢＳ中で捕捉した。
【００８１】
ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ、ストレプトアビジンおよびヒトＩｇＧを、１μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９または５０μｌのクローン５０ＮＩ由来粗精製ペリプラズム抽出物とともにインキュベーションした。ＭＡｂ Ａ９の結合をヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍＬ，Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）で検出し、一方ｓｃＦｖ ５０ＮＩの結合を抗−ペンタ Ｈｉｓ ＨＲＰ−複合体（１μｇ／ｍＬ，Ｑｉａｇｅｎ社，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）によって検出した。５０μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ社，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）をＨＲＰ−基質および発色可能な色素として用いた。反応を５０μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、吸収を４５０ｎｍで測定した。
結果を図１に示した。ＭＡｂ Ａ９およびｓｃＦｖ ５０ＮＩは明らかにビオチン化ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を認識した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、ヒトＩｇＧ上のシグナルもストレプトアビジン単独のシグナルもどちらも示さなかった。２次試薬として用いた抗−ペンタＨｉｓ ＨＲＰ−複合体は、抗原への非特異的結合を示さなかった。しかし、ＭＡｂ Ａ９ 検出用の２次試薬として用いたヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体は、ＣＤ１６融合タンパク質のヒトＦｃ部およびネガティブコントロールとして用いたヒトＩｇＧとの交差反応性によるバックグラウンド染色を起こした。これらの結果は、ｓｃＦｖ ５０ＮＩが当該融合タンパク質のＣＤ１６Ａ部に特異性を示し、Ｆｃ部に特異性を示さないことを強く示している。
【実施例３】
【００８２】
ＣＤ１６アイソフォームを安定発現している異なったＦＡＣＳセルライン、ヒトＰＢＭＣ、および顆粒球における、ｓｃＦｖ ５０ＮＩの試験
５０ＮＩ ｓｃＦｖが細胞表面上のネイティブＣＤ１６Ａタンパク質への結合を示すかどうかを確かめるため、ｓｃＦｖの粗精製ペリプラズム抽出物を、それぞれＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂを発現する２つの異なるセルラインにおけるフローサイトメトリーによって試験した。この目的のため、ＣＤ１６Ａを発現するセルラインＢＷ／ＣＤ１６Ａ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１０５５−１０６０）およびセルライン２９３−ＣＤ１６（ヒトＣＤ１６ＢアイソフォームのＮＡ−２対立形質をコードするプラスミドで安定に形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞）を用いた。５０ＮＩ ｓｃＦｖがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上で発現するＣＤ１６Ａおよび／または好中球顆粒球の表面上に存在するＣＤ１６Ｂへの結合能を有するかどうかを評価するため（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，上掲；ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）：３９１−３９７）、新たに単離した１０−２０％のＮＫ細胞を含む末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、および９５％以上のＣＤ１６Ｂポジティブの好中球顆粒球を表す多形核細胞（ＰＭＮ）への結合を、フローサイトメトリーを用いて試験した。マウスＭＡｂ Ａ９およびマウスクローンｓｃＦｖ１８ Ａ９（ＭＡｂ Ａ９から得られたｓｃＦｖ）由来のペリプラズム抽出物をコントロールとして用いた。
【００８３】
３．１ セルラインの生育ならびにＰＢＭＣおよびＰＭＮの単離
ＢＷ／ＣＤ１６Ａ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、および１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸、および５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。２９３／ＣＤ１６Ｂ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、および５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。非形質転換の親セルラインＢＷおよび２９３を、Ｇ４１８を欠く培地である以外は、安定形質転換体についての前記のように培養した。
【００８４】
健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣおよびＰＭＮを単離した。この血液をＰＢＳで２倍希釈し、１２ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（商品名）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および上部クッションの１２ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７からなる２重クッション上に重層した。遠心分離を２５分間、８００ｇで実行した。上部のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（商品名）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のクッション上に位置するＰＢＭＣ、およびＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（商品名）クッション上に位置するＰＭＮを回収し、使用前にＰＢＳで３回洗浄した。
【００８５】
３．２ ｓｃＦｖ ５０ＮＩおよびｓｃＦｖ１８ Ａ９を含有するペリプラズム抽出物の単離
粗精製のｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を５ｍＬの細菌培養物から単離した。新たに接種した細菌を、５０ｍＭのグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地中、３７度で一晩生育させた。一晩培養した培養物をアンピシリンおよびテトラサイクリンを含有するＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．１まで希釈し、更に３７℃でＯＤ６００ｎｍ＝０．８まで生育させた。この細菌を遠心分離によって回収し、０．１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、および２０μｇ／ｍＬ テトラサイクリンを含有するＬＢ培地に再懸濁した。形質導入細菌の２１℃での一晩のインキュベーション後、３００μＬのペリプラズム抽出物をＥＬＩＳＡ用に前記のように単離した。ＦＡＣＳ分析での使用の前に、ペリプラズム抽出物をＰＢＳに対して一晩透析した。
【００８６】
３．３ フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析用に、１ｘ１０６細胞のＢＷ、ＢＷ／ＣＤ１６Ａ、ＨＥＫ−２９３、２９３／ＣＤ１６Ｂ、ＰＢＭＣおよびＰＭＮを、モノクローナル抗体Ａ９、またはｓｃＦｖ１８Ａ９および５０ＮＩを含有するペリプラズム抽出物で染色した。１ｘ１０６個の細胞を１００μＬの透析した抽出物またはＭＡｂ Ａ９（１０μｇ／ｍＬ）とともに４５分間、氷上でインキュベーションした。ＰＢＭＣおよびＰＭＮとの抗体／ｓｃＦｖインキュベーションに、１ｍｇ／ｍＬのポリクローナルのヒトＩｇＧを添加し、ＰＢＭＣおよびＰＭＮのサブ集団の表面上のＦｃ受容体をブロックした。ＦＡＣＳ緩衝液（２％の熱失活ＦＣＳおよび０．１％のアジドナトリウムを添加したＰＢＳ）での洗浄の後、細胞を氷上で４５分間、０．１ｍＬの０．０１ｍｇ／ｍＬ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ １３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いて、同じ緩衝液中で、インキュベーションした。第２の洗浄サイクル後、細胞を同じ条件下で、０．１ｍＬの０．０１５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を用いてインキュベーションした。次いで、この細胞を再び洗浄し、０．５ ｍＬの２μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁して、死細胞を除去した。１×１０４個の染色細胞の蛍光をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥｐｉｃｓＸＬフローサイトメーターを用いて測定した。平均蛍光強度をＳｙｓｔｅｍ−ＩＩおよびＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計算した。第２試薬のみの細胞のバックグラウンド染色によって生じる蛍光を結果および分析の補助のためにプロットしたヒストグラム（図示せず）から差し引いた。
【００８７】
３．４ 結果
マウスモノクローナル抗−ＣＤ１６抗体Ａ９およびポジティブコントロールとして用いたＡ９誘導抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ１８は、非形質転換親細胞（ＢＷ）との比較においてＢＷ／ＣＤ１６Ａへの明らかな結合を示した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、Ａ９に匹敵するレベルでＢＷ／ＣＤ１６Ａ細胞の明確な染色も示した。
【００８８】
モノクローナル抗体Ａ９およびｓｃＦｖ１８ Ａ９の両方が、表面上にＣＤ１６Ｂアイソフォームを発現する２９３／ＣＤ１６Ｂ形質転換体への強い結合を示したが、５０ＮＩはこのセルラインに結合しなかった。
【００８９】
モノクローナル抗体Ａ９およびｓｃＦｖ１８ Ａ９は、ＮＫ細胞フラクションを示すＰＢＭＣの小さなサブ集団の明確な染色を示した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩも同様にこのサブ集団への結合を示した。
【００９０】
精製した顆粒球上に強いシグナルを示したＡ９およびＡ９由来のｓｃＦｖとは対照的に、５０ＮＩ ｓｃＦｖはＰＭＮに結合しなかった。
【００９１】
このデータは５０ＮＩ ｓｃＦｖが特異的にＣＤ１６Ａアイソフォームに結合し、ＣＤ１６Ｂ アイソフォームに結合しないことを示す。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、組換ＣＤ１６ＡだけでなくＮＫ細胞表面上に発現したままのネイティブ抗原も認識する。
【実施例４】
【００９２】
ヒト抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖ ５０ＮＩの高濃度化ＮＫ細胞への結合
実施例３に示すように５０ＮＩによって認識されるＰＢＭＣサブ集団がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含有することを示すため、ＮＫ細胞の高濃度化集団ＰＢＭＣから単離し、フローサイトメトリーによってｓｃＦｖ ５０ＮＩへの結合を分析した。健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣ類を単離した。血液サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のクッション上に重層し、８００ｇで２５分間、遠心分離した。界面中に位置するＰＭＢＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＮＫ細胞の単離のため、ＰＢＭＣを２％のＦＣＳ／ＰＢＳ中に再懸濁し、製造者の説明書に従い、ＥａｓｙＳＥＰ（商品名）ネガティブＮＫ細胞濃縮キット（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた１回のネガティブ選択に付した。ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞の染色ならびにサイトメトリー分析を本質的に前記実施例３の記載と同様に行った：１×１０６個の細胞を１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９または抗−ＣＤ５６モノクローナル抗体ＭＡｂ Ｂ１５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ついで１５μＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。マウスｓｃＦｖ１８ Ａ９およびヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩを５０μｇ／ｍＬの濃度で染色に用い、細胞に結合したｓｃＦｖを１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６、ついで１５μＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。全ての染色は、１ｍｇ／ｍＬのポリクローナル ヒトＩｇＧの存在下で実施した。死細胞を前記のようにヨウ化プロピジウム染色によって除外した。データ分析は、前記の実施例３に記載のように実施した。
【００９３】
４．１ 結果
抗−ＣＤ５６抗体および抗−ＣＤ１６抗体によるＰＢＭＣの染色は、ＮＫ細胞フラクションを示す小さなサブ集団を明確に同定した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、ＮＫ細胞への結合を示す類似した小さな細胞集団もまた認識した。
ＮＫ細胞のネガティブな高濃度化の後、全ての４つの抗体／ｓｃＦｖは明確な染色を示した。抗ＣＤ５６ ＭＡｂが完全なＮＫ細胞集団への結合をしめした一方で、細胞の小さなフラクションは、ＣＤ１６に対する抗体を用いて染色されなかった。これは、ＣＤ１６−ネガティブの表現型を有するいくらかの細胞の存在を反映している可能性がある。
【実施例５】
【００９４】
ｓｃＦｖ ５０ＮＩ結合後のＣａ２＋フラックス測定
ＩｇＧに対する低親和性受容体であるＣＤ１６Ａは、ＦｃεＲＩ由来のγ鎖またはＴＣＲ／ＣＤ３由来のζ鎖を含有する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に関連して、多数のヒト末梢血ＮＫ細胞上で発現する。抗体または免疫複合体へのＣＤ１６Ａの結合は、ＮＫ細胞傷害性およびサイトカイン分泌のきっかけとなる。この活性化は、γ鎖またはζ鎖の各々のリン酸化、およびこれに続く細胞内のシグナル変換（例、Ｃａ２＋動員）のきっかけとなる。
【００９５】
ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩがＮＫを活性化する性質を有するかどうかを試験するため、表面受容体の抗−ＣＤ１６ モノクローナル抗体またはｓｃＦｖｗとの連結後に、新たに単離したＮＫ細胞を用い、Ｃａ２＋フラックス測定を実施した。いくつかの抗−ＣＤ１６抗体は、細胞内カルシウムの明確な増加の誘起のために、２次試薬による架橋を必要とするので、抗−ｍｙｃおよび抗−（Ｈｉｓ）６を抗−マウスＩｇＧと組み合わせて、細胞−結合抗−ＣＤ１６抗体の架橋に用いた。
【００９６】
ＮＫ調製のため、健常ドナーのヘパリン化末梢血から密度匂配遠心によってＰＢＭＣ類を単離した。血液サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（商品名）のクッション上に重層し、８００ｇで２５分間、遠心分離した。界面中に位置するＰＭＢＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＮＫ細胞の単離のため、ＰＢＭＣを２％のＦＣＳ／ＰＢＳ中に再懸濁し、製造者の説明書に従い、ＥａｓｙＳＥＰ（商品名）ネガティブＮＫ細胞濃縮キット（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた１回のネガティブ選択に付した。ＮＫ細胞をＨＢＳＳで１回洗浄し、その後カルシウムインジケーターであるフルオ−４−アセトキシメチル（ＡＭ）エステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を２μＭの濃度で、３０分間、室温、暗環境で標識した。ＨＢＳＳ洗浄後、この細胞を更に２０分間ＨＢＳＳ中でインキュベーションし、完全に細胞内ＡＭエステルを脱エステル化させ、再度ＨＢＳＳで洗浄した。細胞内カルシウム変化のフローサイトメトリー分析のため、一定量の標識化ＮＫ細胞を最初に抗体無しでＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬサイトメーター上で測定し、バックグラウンド蛍光を決定した。約６０秒後、抗−ＣＤ１６抗体（２μｇ ＭＡｂ Ａ９または５μｇ ｓｃＦｖ１８ Ａ９または５μｇ ５０ＮＩ ｓｃＦｖ）を添加し、測定を続けた。開始１８０秒後、２０μｇのポリクローン性ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＧＡＭ）をＭＡｂ Ａ９サンプルに添加し、ＮＫ細胞表面上のＣＤ６に結合しているＡ９を架橋した。ｓｃＦｖの架橋のため、２．５μｇ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ １３／４５／３１−２および２．５μｇ 抗−ｃ−ｍｙｃ ＭＡｂ ９Ｅ１０を、継続する測定の前にアプライした。ｓｃＦｖを有するサンプルの場合、２０μｇのポリクローン性ヤギ抗−マウスＩｇＧ 抗体をより遅い時点で添加し、抗−（Ｈｉｓ）６および／または抗−ｃ−ｍｙｃ ＭＡｂｓをｓｃＦｖに更に架橋させた。短時間の間隔からの平均蛍光強度をＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社，Ｋｒｅｆｅｌｄ，ドイツ）を用いて決定し、時間に対してプロットした（図示せず）。
新たに単離したＮＫ細胞で得られた蛍光トレーシングは、明確に、ＭＡｂ Ａ９が、抗−マウスＩｇＧ抗体との架橋において細胞内カルシウム濃度の強い増加を誘起することを示した。これは、より高い蛍光シグナルによって反映される。ＭＡｂ Ａ９と対照的に、Ａ９由来のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１８ Ａ９）は、抗−（Ｈｉｓ）６、抗−ｃ−ｍｙｃおよび抗−マウスＩｇＧ抗体との架橋後も、ほとんどまたは全く細胞内カルシウムの増加を誘導しなかった。しかし、ヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩは、細胞表面に結合したｓｃＦｖの、架橋抗体への連結の後に、明確な（しかし若干弱い）蛍光シグナルを誘導した。このことは、ヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩが、ＣＤ１６Ａを介するＮＫ細胞活性の作動のために適当な結合特性を有することを示す。
【実施例６】
【００９７】
軽鎖シャッフリングによる５０ＮＩ ｓｃＦｖの親和性変異
親和性が増加している抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを得るため、５０ＮＩ ＶＨ 鎖のＶＬ遺伝子レパートリーとの再編成により、クローン５０ＮＩに基づくチェーン・シャッフルド・ライブラリー（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を生産した。ＶκおよびＶλ遺伝子レパートリーを、前記の巨大なヒト・ナイーブｓｃＦｖライブラリー（Ｓｃｈｗａｒｚら，上掲、２００４）を由来とするｐＥＸＨＡＭ１ ＤＮＡから切り出した。このレパートリーは、それぞれ約１０５の個々のＶκおよびＶλ鎖を反映する。ｐＥＸＨＡＭのＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ部位へのクローニングによる５０ＮＩ重鎖を用いた再編成と、１μｇのＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅへの形質転換（１．８ｋＶ，０．１ｃｍギャップキュベット、２５μＦ、２００Ω）により、２．６×１０６（Ｖκ）および２．２×１０６（Ｖλ）の数のライブラリーを得た。
形質転換後にランダムに選択した３２クローンの配列分析は、各クローンが個々の軽鎖を含有することを示し、および２４クローンが、抗−Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタン・ブロット（Ｑｉａｇｅｎ社，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）において、検出可能な完全長のｓｃＦｖの発現を示した。
【００９８】
実施例２に記載のビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質において、４回の選択を実施した。高親和性結合体に有利に働く選択圧は、抗体濃度の連続的な制限（第１回２０ｎＭ、第２回１ｎＭ、第３回０．１ｎＭ、第４回０．０１ｎＭ）によって作り出した。κおよびλの再編成ライブラリーは、別々に保存した。
【００９９】
ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮ／２％スキムミルク中に再懸濁したライブラリーからの約１０８個のファージをビオチン化ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合体とともにインキュベーションした。ファージ抗原複合体を、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズの添加によってレスキューし、ファージに結合している非特異的抗原を、ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮを用いた１０回の洗浄工程によって除去した。第１段階では、結合体は、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２によって溶出させた。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８による中和後、低ｐＨで除去できないファージの回復のために、新たに生育させたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（対数期中期ＯＤ６０００．２−０．５）を添加した。酸性溶出液によって溶出した細胞もまた、対数増殖中のＸＬ１ ｂｌｕｅ宿主細胞と混合した。
【０１００】
ヒトｓｃＦｖをコードするファージミドによる形質導入が成功した細胞を、アンピシリン耐性で選択し、ついでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで形質転換して、次のインビトロでの選択のためのｓｃＦｖを示すファージを生じさせた。次の回の選択では、酸性溶出液によって回収されたファージおよびＸＬ１ ｂｌｕｅの形質転換を別々に取り扱った。第３および第４の回の親和性選択の後、個々のコロニーを実施例２に記載のＥＬＩＳＡで試験した。
【０１０１】
再編成κ−ライブラリー由来の試験したクローンは、同じマスターブロックで参照として生育させた親クローン５０ＮＩ超える、優位なシグナルを示さなかった。しかし、いくつかのクローンを配列決定し、親クローンと同一であることを証明し、結合特性を改良する適当なκ−鎖が見出されなったことが示された。
【０１０２】
対照的に、再編成λ−ライブラリー由来のクローンの分析は、参照の５倍までのシグナルを生じる多くのクローンを明らかにした。３０クローンを第３回のバイオパンニング後の配列決定用に、３４クローンを第４回のバイオパンニング後の配列決定用に、選択した。配列決定は、製造者のガイドラインに従って、Ｄｅａｚａ Ｋｉｔ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，Ｔｏｒｏｎｔｏ，カナダ）を用いたＬｏｎｇ Ｒｅａｄ Ｔｏｗｅｒ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，Ｔｏｒｏｎｔｏ，カナダ）で実施した。結合ファージ粒子の酸性溶出液または宿主細胞の直接形質転換は、クローンの後の分布に明確な影響を有さなかった。５つの異なるグループの高濃度化したクローンおよび数個の個体を同定した。表２は、これらの異なるグループの概要を示す。
表２：下記の例のあるグループを示すクローンの記号を太字でハイライトしている。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
グループＡを形成するクローンは、親ベクターの再連結および非切断、またはライブラリー構築中の再編成が原因で、シャッフルド・ライブラリーにも存在する。この知見は、このグループのクローンが最も弱いＥＬＩＳＡシグナルを生じた事実と相関する。
他の全てのグループは、親クローンに比べて増強したＥＬＩＳＡシグナルを示す新たに編成された軽鎖を含有する。グループＣおよびＤからのクローンは、第３回および第４回の選択後、同程度の数が見出された。
Ｖ−ベース・アラインメント・ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を用いた配列の分析により、全ての新たなＶλ鎖が、親クローンのＶＬ鎖と同様に、ＶＬ３ファミリーに属することが明らかになった。
全てのクローンが持つ共通のＶＨ鎖のアミノ酸配列は、本明細書中で、配列番号９として、ならびにクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の特異的ＶＬ鎖は、本明細書中で、それぞれ配列番号１０〜１６として与えられる。共通のＶＨ鎖をコードする核酸配列は、本明細書中で、配列番号１として、ならびにクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の個々のＶＬ鎖は、本明細書中で、それぞれ配列番号２〜８として与えられる。個々の重鎖および軽鎖ＣＤＲは表１に与えられ、共通の重鎖ＣＤＲは、この上の最初の項目として示され、ついでクローン５０ＮＩ，３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１の軽鎖ＣＤＲが示されている（それぞれ、項目２〜８として示される）。
【実施例７】
【０１０５】
ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂで形質転換されたセルラインにおける親和性成熟ｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析
全ての個体クローン由来の粗精製のペリプラズム抽出物を用いた予備的なＦＡＣＳ分析は、全てのチェーン・シャッフルドｓｃＦｖがＣＤ１６Ａ結合能を保持していることを示した。この試験には、ＣＤ１６Ａでトランジェントに形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を用いた（データは示さず）。この試験に基づき、更なる性質評価のために、クローン３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１を選択した。
【０１０６】
これらのｓｃＦｖをコードする核酸配列を、Ｎ−末ＰｅｌＢリーダー配列、およびＣ−待つヘキサ−ヒスチジンおよびｃ−ｍｙｃタグとインフレームで、発現ベクターｐＳＫＫ２にサブクローンした。これらのサブクローンの核酸配列は、下記の通りである：
【０１０７】
pSKK2-50NI (配列番号36)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１０８】
pSKK2-3-LB3 (配列番号37)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１０９】
pSKK2-3-LB5 (配列番号38)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctgggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１０】
pSKK2-3-LB6 (配列番号39)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacaggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１１】
pSKK2-3-LS49 (配列番号40)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgcccccccggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１２】
pSKK2-4-LS14 (配列番号41)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１３】
pSKK2-4-LS21 (配列番号42)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
【０１１４】
ＰｅｌＢリーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、ａｔｇａａａｔａｃｃｔａｔｔｇｃｃｔａｃｇｇｃａｇｃｃｇｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃａｇｃｃｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ（配列番号４３）である。
【０１１５】
各ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の間のリンカー領域をコードするヌクレオチド配列は、ｇａａｇａａｇｇｔｇａａｔｔｔｔｃａｇａａｇｃａ（配列番号４４）である。
【０１１６】
ｃ−ｍｙｃタグおよびヘキサ−ヒスチジンタグは、それぞれ、ｇａａｃａａａａｇｃｔｇａｔｃｔｃａｇａａｇａａｇａｃｃｔａ（配列番号４５）、およびｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ（配列番号４６）である。
サブクローンを含有するベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８に形質転換し、２Ｌ振とうフラスコ培養で発現させ、Ｌｅ Ｇａｌｌら（２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８５：１１１−１２７）に従い、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０１１７】
チェーン・シャッフルドｓｃＦｖが、実施例３で５０ＮＩについて示されているようにＣＤ１６Ａへの特異性を保持しているかどうか評価するため、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂを発現する形質転換セルラインをＩＭＡＣ精製ｓｃＦｖを用いて試験した。フローサイトメトリー分析のため、下記のセルラインを用いた：ＢＷおよびＢＷ／ＣＤ１６Ａ形質転換体を前記のように培養した。２９３細胞および２９３−ＣＤ１６Ｂ形質転換体を前記のように取り扱った。それぞれ，ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞膜貫通および細胞質内領域に融合したＣＤ１６ＡまたはＮＫｐ４６の細胞外領域をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＣＤ１６Ａ−ゼータおよびｐｃＤＮＡ３−ＮＫｐ４６−ゼータ，Ｄｒ．Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ大学，Ｉｓｒａｅｌから入手）を用いた、２９３細胞のトランジェントの形質転換によって，２９３−ＣＤ１６Ａおよび２９３−ＮＫｐ４６を作成した。実施例１に記載のリン酸カルシウム法を用いてトランジェントの形質転換を行い、トランジェントの形質転換の２日後、フローサイトメトリー染色および分析に用いた。フローサイトメトリー染色および分析は、基本的に前記のように行った。１×１０６個の指示細胞を、５０μｇ／ｍＬの精製ｓｃＦｖ、次いで１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ １３／４５／３１−２（抗−ヘキサＨｉｓ）および１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。
【０１１８】
形質転換細胞が細胞表面上に対応する抗原を発現することを示すために、細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９および抗−ＮＫｐ４６ モノクローナル，ＭＡｂ １９５３１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，ドイツ）のパラレルで染色した。ＭＡｂｓ Ａ９および１９５３１４を１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を２次試薬のみによる着色からの蛍光値を差し引いて補正し、結果を図２に示した。
【０１１９】
ポジティブコントロール染色として用いたＭＡｂ Ａ９は、予想通り、アイソフォームと関係なく、ＣＤ１６で形質転換した全てのセルラインに結合した。ＮＫｐ４６−形質転換体への結合は観察されず、一方、ＮＫｐ４６に対するＭＡｂ １９５３１４での染色は、明らかに、コントロールプラスミドを用いたこの細胞の形質転換が成功したことを示した。
【０１２０】
参照として用いた親ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩは、表面上にＣＤ１６Ａを発現する２つのセルライン（ＢＷ／ＣＤ１６Ａおよび２９３／ＣＤ１６Ａ細胞）の弱い染色を示した。対照的に、新たに単離した、再編成軽鎖を有するｓｃＦｖは、これらの細胞への高度に改良された結合を示した。ＣＤ１６Ｂで安定に形質転換した２９３細胞に結合した新たな変種は無く、ＣＤ１６のアイソフォームＡへの特異性を示した。
【実施例８】
【０１２１】
新たに単離したＰＭＮおよび高濃度化ＮＫ−細胞における親和性成熟ｓｃＦｖフラグメントの試験
改良ｓｃＦｖが、真核細胞で発現したＣＤ１６Ａへの特異的結合能を保持しているかどうか評価するため、ドナー血液から新たに単離したＰＭＮおよび強化ＮＫ細胞を前記のようにＩＭＡＣ−精製ｓｃＦｖを用いて染色した。ＮＫ細胞の濃縮は、前記のネガティブ選択によって実施した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を図５に示した。
【０１２２】
抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９および抗−ＣＤ５６ ＭＡｂ Ｂ１５９を用いた濃縮した真核細胞集団の染色は、この集団がＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋末梢血ＮＫ細胞からなることを明らかに示した。ＭＡｂ Ａ９およびＡ９由来のマウスｓｃＦｖは、ＣＤ１６Ａ−陽性ＮＫ細胞フラクションを染色し、ＣＤ１６Ｂ−陽性顆粒球において更に強いシグナルを示した。
【０１２３】
ＭＡｂ Ａ９はＣＤ１６−陽性ＮＫ細胞に対応するＰＢＭＣのサブ集団（１８．５％）を認識した。強化ＮＫおよび単離顆粒球で強い結合が観察された（データ示さず）。
【０１２４】
親クローン５０ＮＩは、弱いが明らかな、強化ＮＫ−細胞への結合を示した。一方、顆粒球の染色は見られなかった。親和性成熟変種３−ＬＢ３，３−ＬＢ５，３−ＬＢ６，３−ＬＳ４９，４−ＬＳ１４および４−ＬＳ２１は、５０ＮＩと似た染色パターンを示したが、結合シグナルが改善されていた。このデータは、親和性成熟ｓｃＦｖがＣＤ１６の２つのアイソフォームを区別し、ＣＤ１６Ａに特異的に結合できる事実に対してさらなるサポートを与える。
【実施例９】
【０１２５】
組換ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６ＢにおけるＥＬＩＳＡ
ｓｃＦｖのＣＤ１６Ａ特異性に関する更なるサポートデータを得るため、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質（実施例１）および市販の組換ＣＤ１６Ｂ−Ｆｃ（対立遺伝子ＮＡ−２；ＢＳＡフリー；ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。ｇｐ３４−Ｆｃ融合タンパク質をネガティブコントロールとして用いた。この組換タンパク質を、ｐＨ８．８で、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中、８０ ｎＭの濃度で一晩、コートした。
【０１２６】
抗−ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、組換タンパク質に結合したｓｃＦｖの検出を、実施した。ポジティブコントロールは、ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）、次いでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．５μ／ｍＬ）を含んだ。組換ＣＤ１６Ｂへの結合を抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）を用いた直接染色によって試験し、およびＦｃ−融合タンパク質への結合を抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（０．１５μｇ／ｍＬ）によって試験した。全てのｓｃＦｖがＣＤ１６Ａ−Ｆｃへの強い結合を示し、一方、ＣＤ１６Ｂへの結合は観察されなかった（図３）。ｇｐ３４−Ｆｃで、わずかに増加したバックグラウンド結合が見られた。単独で試験された全ての２次抗体もまたｇｐ３４−Ｆｃにおいてわずかに増加したバックグラウンドシグナルを示したので、おそらく、これはｇｐ３４−Ｆｃへの少量の非特異的結合によるものだろう。予想通り、Ａ９はＣＤ１６Ａ−Ｆｃを強く認識した。しかし、２次ヤギ抗−マウスＨＲＰ−融合タンパク質は、ヒトＦｃ融合体との有意な交差反応性を示すと考えるべきである（ヤギ抗マウス−ＨＲＰのみでのコントロールを参照）。ヒトＩｇＧへの最小の交差反応性を有する（データは示さず）予備吸着ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ 複合体を用いたこの分析の再現性は、有意なバックグラウンド結合の減少を示さなかった。ＭＡｂ Ａ９は、ＣＤ１６Ｂにおいて明らかなシグナルを示した。これは、２次試薬によって影響されなかった。
【実施例１０】
【０１２７】
還元および非還元条件下での組換ＣＤ１６Ａ−Ｆｃにおけるウェスタン・ブロット
更なる性質決定のため、組換ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＮＫｐ４６−Ｆｃにおけるウェスタン・ブロットでの結合について、全ての抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖを試験した。ＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびネガティブコントロールとしてのＮＫｐ４６−Ｆｃを、還元条件下の１２％ ＳＤＳ−ゲルおよび非還元条件下の８％ゲルによって分離した。これらのタンパク質を、エレクトロブロッティングによって、ニトロセルロース膜に移した。ポンソーＳ染色後、この膜を５ｍｍ幅片に切断した。各ニトロセルロース片をＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ、２％スキムミルク中のｓｃＦｖ（４μｇ／ｍｌ）とともに個々にインキュベーションした。検出は、抗−ペンタＨｉｓ ＨＲＰ−複合体（１μｇ／ｍＬ）を用い、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼを基質として用いて行った。コントロール片をＡ９（１μｇ／ｍＬ）または抗−ＮＫｐ４６ １９５３１４、ついでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．２μｇ／ｍＬ，最小交叉反応性）と共にインキュベーションした。更なるポジティブコントロールとして、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．１６μｇ／ｍＬ）を、融合タンパク質のＦｃ部の検出に用いた。モノクローナル抗体Ａ９および１９５３１４は、非還元条件下と同様に還元条件下で、それらの抗原を認識した。
【０１２８】
ＭＡｂ Ａ９に対する２次試薬として用いたヤギ抗−マウス−ＨＲＰ複合体は、わずかにＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部と交叉反応性を示した。対照的に、抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの結合は、非還元条件下で観察されただけであり、ジスルフィド架橋によって安定化された２次構造が認識に必要とされることを示した。親クローン５０ＮＩは、親和性成熟ｓｃＦｖに比べて、より弱いシグナルを示した。ｓｃＦｖ ３−ＬＢ６の結合は検出されず、ＮＫｐ４６−Ｆｃ対照タンパク質との交叉反応性を示すｓｃＦｖは無く、ＣＤ１６への特異性が確認された。
【実施例１１】
【０１２９】
スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによるｓｃＦｖの分析
scFv変種のより高い親和性が主に改良された一価結合によるかどうかを決定するため、タンパク質調製物を、そのオリゴマー組成物について、スーパーデックス200ゲルろ過カラムにおいて分析した。LMWゲルろ過キャリブレーションキット(Ａｍｅｒｓｈａｍ・Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ)をスタンダードに用いた。表３は、個々のタンパク質調製物に存在する分子形式の概要を示す。
【０１３０】
表３：個々のタンパク質調製物において存在するｓｃＦｖの分子形式。３−ＬＢ５は、低タンパク質濃度のため、分析されなかった。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
サイズ排除クロマトグラフィーは、明らかに、ｓｃＦｖ ３−ＬＢ６および４−ＬＳ２１がもっぱらモノマーであることを示した。
【０１３３】
対照的に、３−ＬＳ４９、３−ＬＢ３および４−ＬＳ１４は、ダイマー分子の有意な比率を示した。これらの分子の改良された結合特性は、３−ＬＢ６および４−ＬＳ２１へのより高い親和性だけでなく、２量体形成による結合活性効果も反映しうる。
【実施例１２】
【０１３４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるｓｃＦｖ親和性の測定
ｓｃＦｖの親和性定数（ＫＤ値）を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００バイオセンサーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたＳＰＲによって測定した。ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質およびネガティブコントロールとして用いたＢＳＡをアミンカップリング法のための慣用のＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いてカルボキシメチルデキストランでコートしたセンサーチップＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社）上に固定化した。精製ｓｃＦｖをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で希釈した。固定化抗原に対して、ｓｃＦｖ抗体の変動濃度（１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭおよび１６００ｎＭ）の経過により、結合データを生じさせた。ポジティブコントロールとして抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９を用いた。全てのＳＰＲ測定は、２０μｌ／ｍｉｎの一定の流速で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、２５℃で行った。各注入試料（１００μｌ）は、抗原に５分間接触した。ついで、解離は３０分間であった。各サイクルの後、センサーチップ表面をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液でフラッシングした。ＢＳＡでコートされたコントロールチャネルからのシグナルを自動的に差し引いた。速度定数を、１／１ ラングミュア結合モデルにしたがってＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ バージョン３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用い、計算した。計算されたオフーおよびオン−速度定数、および各ＫＤ値を表３にまとめた。ＭＡｂ Ａ９について、コントロールとして用いて、１．７５×１０−９ＭのＫＤを、文献記載の１．５５×１０−９Ｍの値（Ｒｅｎｎｅｒら，２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１０２−１０８）と関連付けて計算した。更に、ｓｃＦｖ ５０ＮＩ、４−ＬＳ２１および３−ＬＢ６のＳＰＲデータについての定常状態分析から，平衡解離定数を推論した。
【０１３５】
表４ 個々のｓｃＦｖへの結合動態データ
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
これらの２つの方法によって独立して計算された速度定数はよく相関し、親クローン５０ＮＩとの直接の比較は、軽鎖シャッフリングによる２０倍以上の親和性の改善を示した。全ての３つのｓｃＦｖ型はもっぱら単量体タンパク質集団を形成し（表３、実施例１１と比較）、改善した結合特性が結合力効果ではなく、抗原ｓｃＦｖ接合面の最適化に基づく、より高い親和性によることを示した。ｓｃＦｖ ３−ＬＳ４９、３−ＬＢ−３および３−ＬＳ１４は、同等のＫＤ値を示したが、有意なパーセンテージの２量体分子を含有する不均質分子集団（表２、実施例１３との比較）を示した。したがって、これらの抗体の改善された親和性は、少なくとも部分的に多価結合による。
【実施例１３】
【０１３８】
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの結合による、ＮＫ細胞におけるＣａ２＋流の誘導
親抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩについて示されている親和性成熟ｓｃＦｖが末梢血ＮＫ細胞におけるＣａ２＋動員を誘発する能力を保持しているかどうかを評価するために、末梢血からＮＫ細胞を単離および濃縮し、および実施例５に前記記載のフローサイトメトリーによるＣａ２＋流量測定に用いた。
【０１３９】
この結果は、明らかに、ＭＡｂ抗−（Ｈｉｓ）６、ついでポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＧＡＭ）のみの添加は、新たに単離したＮＫ細胞における細胞内カルシウム濃度の優位な変化を誘導しなかったことを示す。しかし、すでに実施例５で示したように、ｓｃＦｖ ５０ＮＩが添加され、およびＭＡｂ抗−（Ｈｉｓ）６、ついでＧＡＭによる架橋が形成されたとき、蛍光シグナルの明らかな増加が観察された。
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ（３−ＬＳ４９または４−ＬＳ２１、参照例として用いられる）が適用された場合、抗−（Ｈｉｓ）６ついでＧＡＭによる架橋後に誘導されたシグナルの増加は５０ＮＩによって引き起こされたシグナルと少なくとも同じ強さであった。したがって、鎖−シャッフリングによってヒトｓｃＦｖ ５０ＮＩから導かれた全てのｓｃＦｖがＮＫ細胞を活性化し、およびＣＤ１６Ａへの結合による細胞内カルシウムカルシウム動員のきっかけとなる能力を保持することが結論付けられる。
【実施例１４】
【０１４０】
新たに単離したＮＫ細胞における細胞溶解活性のトリガリング
ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞に媒介される抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与する。インビトロでは、ＣＤ１６に特異的なＩｇＧアイソタイプのモノクローナル抗体の活性化が、ＦｃＲ−ポジティブ標的セルラインの殺滅を引き起こせることが示された。ＮＫ細胞においてカルシウム動員を誘導する親和性成熟抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖがＮＫ細胞傷害性も媒介できるかどうかを確認するため、これらのｓｃＦｖを、マウスＦｃＲ−ポジティブＰ８１５細胞に対して新たに単離したＮＫ細胞を用いたリダイレクトされた殺細胞アッセイにおいて試験した。ｓｃＦｖは、ＩｇＧのＦｃ部を欠くので、抗−（Ｈｉｓ）６ マウスモノクローナル抗体と一緒に用いた。このリダイレクトされた細胞溶解を、カルセイン−放出アッセイで測定した。
【０１４１】
ＮＫ細胞を、健常なドナーのＰＢＭＣから単離および濃縮した。フローサイトメトリー分析は、ＮＫ集団が８１％のＣＤ１６−ポジティブ細胞および９４％のＣＤ５６−ポジティブ細胞からなることを示した；ＣＤ３−ポジティブまたはＣＤ１９−ポジティブ細胞は、有意な量で検出されなかった（データを示さず）。マウスＰ８１５セルライン（Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツから親切に提供を受けた）を、１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシン、および５０μＭ β−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。分析用に、Ｐ８１５標的細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地中（ＦＣＳ無し、３０分間、３７℃）で、１０μＭ カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識した。ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、標識化Ｐ８１５細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に１ｘ１０６／ｍＬの濃度まで再懸濁した。この懸濁液から，１ｘ１０４細胞に相当する５０μｌを９６ウエルの丸底マイクロタイタープレートの個々のウエルに播種した。１ｘ１０５の新たに単離したＮＫ細胞を５０μｌでウエルに加え、１０：１のエフェクター対標的比にした。抗−ＣＤ１６抗体およびコントロール抗体をウエルに加えて、１μｇ／ｍＬの最終濃度にし、ここで指示１μｇ／ｍＬ 抗−（Ｈｉｓ）６マウスＭＡｂ１３／４５／３１−２をアプライした。モノクローナル抗体ＯＫＴ３（抗−ＣＤ３ ＭＡｂ）、Ａ９および１３／４５／３１−２ 抗−（Ｈｉｓ）６はＤｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツからの親切な贈り物である。抗体 Ｂ１５９抗−ＣＤ５６は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）か購入し、および１９５３１４ 抗−ＮＫｐ４６はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）から購入した。プレートを、５％ ＣＯ２の湿雰囲気中で、３時間、３７℃でインキュベーションした。いくつかウエルに対して、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加して（Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）、標的細胞の最大溶解を得た。エフェクター細胞無し、および抗体無しで、標的細胞をインキュベートすることにより、自然発生的なカルセイン放出を測定した。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを５００ｇで５分間遠心分離し、１００μｌの上静を回収して、放出されたカルセインの蛍光（Ｆ）、５２０ｎｍでマルチラベル・リーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｄｇａｕ、ドイツ）を用いて測定した。溶解のパーセンテージを式：［Ｆ（試料）−Ｆ（自然発生的）］／［Ｆ（最大）−Ｆ（自然発生的）］ｘ１００％に従って計算した。平均値および標準偏差を３回のサンプルから決定し、図４にプロットした。
【０１４２】
予測したとおり、コントロール抗体として用いたＯＫＴ３ 抗−ＣＤ３、Ｂ１５９ 抗−ＣＤ５６および抗−（Ｈｉｓ）６ ＭＡｂｓは、抗体無しの試料と類似のバックグラウンド殺滅のみを誘導した。
【０１４３】
このことは、ＣＤ５６のような非活性化受容体への抗体の結合が、ＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導に十分でないことを示す。さらに、コントロール抗体は、 Ｐ８１５標的細胞上のＦｃ受容体に結合しているがＮＫ細胞上のエフェクター分子に結合していないＩｇＧの細胞傷害性効果を除外する。対照的に、ＭＡｂ １９５３１４（抗−ＮＫｐ４６）およびＡ９（抗−ＣＤ１６）は両方とも、ＮＫ受容体活性化を標的とし、それぞれ３５％および６５％の範囲で、Ｐ８１５標的の強い溶解のきっかけとなった。抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖの存在下、標的細胞の溶解は、１．８％および１１．５％の間であり、ｓｃＦｖのみではＮＫ細胞を活性化できなかった。しかし、架橋およびＦｃＲ−ポジティブＰ８１５ 標的細胞への結合を促進するＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６の添加は、全てのサンプルで、強い溶解を引き起こした。親和性成熟ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の場合、ほぼ６０％の標的細胞が溶解した。相対的に、親抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ５０ＮＩのＭＡｂ 抗−（Ｈｉｓ）６との組み合わせは、細胞によるＰ８１５標的のリダイレクトされた殺滅のわずかな促進のみを誘導した。
【０１４４】
親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを用いたリダイレクトされた細胞傷害性アッセイの結果は、抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖがＮＫ細胞におけるカルシウム動員を促進するだけでなく、ＮＫ細胞傷害性も引き起こすことを明らかに示した。
【実施例１５】
【０１４５】
ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ変種および３つの異なるヒトＣＤ１６Ｂ−Ｆｃ対立遺伝子変種をコードする核酸配列の作出
ヒトＦｃγＲＩＩＩは、２つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＩＡ（膜貫通タンパク質）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＧＰＩ−アンカー型）、として存在し、これらは、その細胞外の免疫グロブリン結合領域において９６％の配列同一性を有する（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌおよびＣａｐｅｌ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５−２２１）。これらの２つのアイソフォームの異なる対立遺伝子変種は開示されている（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ Ｂｌｏｏｄ ９０：１１０９−１１１４；Ｋｏｅｎｅら，１９９８ Ｂｌｏｏｄ ９１：６７３−６７９）。図６は、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの対立遺伝子変種のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【０１４６】
実施例１に記載の、プラスミドｐＣＤＭ−ＣＤ１６−Ｆｃによるトランジェント形質転換後のＨＥＫ−２９３細胞において産生された、可溶性ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，１９９９、上掲）である。ヒトにおいて、このアイソフォームの１５８位に２対立遺伝子多形性（ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ １５８Ｖａｌ／Ｐｈｅ）が生じ、これはナチュラルキラー細胞上のＦｃγＲＩＩＩ−Ａ 受容体のＩｇＧに対する親和性に影響する。ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ １５８Ｖａｌについては、ＩｇＧへのより高い親和性が対立遺伝子１５８Ｐｈｅ型と比較して報告されている（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ 上掲）。
【０１４７】
ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１のＰｈｅ変種への結合を示すために、ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖの部位特異的突然変異精製を実施して、ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆを作出した。１０ｎｇのｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖプラスミドを、１２５ｎｇのプライマーＰ４１、5’ CTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTG 3’(配列番号47)およびＰ４２、5' CACATTTTTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCAG 3'（配列番号48)、２５ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２．５単位のＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともにインキュベーションした。反応を、９５℃で３０秒間実施し、ついで９５℃で３０秒間、６６℃で６０秒間、および６８℃で３１８秒間の１６サイクルを行った。生産物をＤｐｎＩ制限酵素で３時間消化し、および反応を最終的に８０℃、２０分間のインキュベーションで停止させた。２μｌの反応混合物で、ケモコンピテントＴＯＰ１０／Ｐ３細胞（Invitrogen社）を形質転換し、１５０μｌを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に広げた。ｐＣＤＭ−ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆをコードする核酸配列を配列決定によって確認した。実施例１に記載のように、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆを発現させ、および精製した。
【０１４８】
それぞれＮＡ１、ＮＡ２およびＳＨで示される３つの異なる対立遺伝子変種（Ｋｏｅｎｅら，１９９７ 上掲；Ｋｏｅｎｅら，１９９８ 上掲）としてＦｃγＲＩＩＩＢ受容体をヒトで発現させた。ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子型のヒト細胞外領域をコードする３つの合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ社（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成された。核酸配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として、受容体のＦｃ領域の核酸配列を含有するｐＳＥＣプラスミドにクローニングした。実施例１に記載のように、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨを発現させ、および精製した。
【実施例１６】
【０１４９】
ヒトCD16の異なる対立遺伝子変種におけるウェスタン・ブロット
ＣＤ１６Ａアイソフォームに対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の特異性を示すため、異なる対立遺伝子変種のＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂにおいてウエスタンブロット分析を実施した。それぞれ７５０ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＮＫｐ４６−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を非還元条件下で８％ＳＤＳゲル上にロードし、および膜上へブロッティングした。
【０１５０】
抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ Ａ９、抗−ＣＤ１６Ａ ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１および抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ（ネガティブコントロール）をこのブロットを用いて４μｇ／ｍｌでインキュベーションした。組換タンパク質に結合したｓｃＦｖの検出は、抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍＬ）を用いて実施した。コントロールとして、ＨＲＰ 複合化抗−ヒトＩｇＧおよび抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１５１】
４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、対立遺伝子型のＣＤ１６Ａのみへの強い結合を示し、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子への結合は観察されなかった。このことは、ＣＤ１６のＡアイソフォームに対するヒト４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖの特異性と、４−ＬＳ２１が両方の対立遺伝子変種ＣＤ１６Ａを認識することとを示す。対照的に、マウス抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ Ａ９は、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂの両方の全ての対立遺伝子変種への均一な結合を示した。
【実施例１７】
【０１５２】
ヒトＣＤ１６の異なる対立遺伝子変種におけるＥＬＩＳＡ
更にＣＤ１６Ａアイソフォームに対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１の特異性を示すため、異なる対立遺伝子変種を用いてＥＬＩＳＡを実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートのウエルをそれぞれ２００ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２またはＮＫｐ４６−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を含有する１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３でコーティングした。
【０１５３】
４μｇ／ｍｌの濃度で抗−ＣＤ１６Ａ ４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖおよび抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖをプレートとともにインキュベーションした。抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体（１μｇ／ｍｌ）を用いて、ｓｃＦｖに結合した組換タンパク質の検出を実施した。ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１は、強いＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子型への強い結合を示したが、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子への結合は観察されず（図７Ａ）、その結果、４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖのＣＤ１６Ａアイソフォームへの明確な特異性を示した。
【０１５４】
パラレルのアッセイ（図７Ｂ）で、抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍｌ）を同様にコーティングしたプレートに対してアッセイした。ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）のインキュベーションの後、ヤギ抗−マウス ＩｇＧ ＨＲＰ−複合体を０．５μｇ／ｍｌ（ヒトＦｃへの最小交叉反応性）で用いた。ＭＡｂ Ａ９は全ての対立遺伝子変種（両方のＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂ）に強く結合した。
【実施例１８】
【０１５５】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による、ヒトＣＤ１６の異なる対立遺伝子型に対するｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびモノクローナルＡｂ Ａ９の親和性の比較
実施例１２に記載のプロトコールに従い、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００バイオセンサーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、対立遺伝子変種ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１およびＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２についてのＳＰＲにより、ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびＭＡｂ Ａ９の親和性定数（ＫＤ値）を測定した。計算したオフ−およびオン−速度定数および各ＫＤ値を、表５にまとめた。
【０１５６】
ＭＡｂ Ａ９（コントロールとして使用）について予測したように、４−６×１０−９Ｍの範囲のＫＤを全ての対立遺伝子変種について計算したところ、全ての対立遺伝子変種の全ての型へのＭＡｂ Ａ９の乱交雑結合を示した。対照的に、ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１は、ＣＤ１６Ａアイソフォームに高度に特異的であることが再び証明された。４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖに対し、６×１０−８Ｍの範囲のＫＤを示し、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆは４×１０−８Ｍの範囲を示して、ＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子型へ４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖがほぼ等しい親和性で結合することを示した。対照的に、４−ＬＳ２１は、ＣＤ１６Ｂの対立遺伝子型にも結合を示さなかった。
表５ ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの対立遺伝子変種へのｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１およびＭＡｂ Ａ９の結合の反応速度のデータ
【０１５７】
【表５】
【実施例１９】
【０１５８】
バクテリアにおけるＴａｎｄＡｂ分子の発現用のプラスミドｐＳＫＫ３ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３の構築
抗−ＣＤ３０および抗−ＣＤ１６Ａ抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をコードする遺伝子を、ハイブリドーマＨＲＳ−３またはヒトｓｃＦｖライブラリーから，それぞれ、プラスミドｐＨＯＧ＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３ αＣＤ３０（ＨＲＳ−３）およびｐＳＫＫ２＿ｓｃＦｖ αＣＤ１６Ａ（ＬＳ２１）を用いて取り出した。
【０１５９】
プライマーＰ３４、5’CATCACGATATCAGAACCACCGGAGCCGCCGCTACCACCTGAGGACACGGTGACCAGGGTTCCC 3’（配列番号４９）、およびＰ３６、5’ CCGGCCATGGCGCAGGTC CAGCTGGTACAGTCTGG 3’（配列番号５０）を用いたポリメラーゼ鎖反応により、ＶＨ αＣＤ１６ＬＳ２１を増幅させ、ＰＣＲ産物の３’末端に９アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号５１）をコードする核酸配列を生じさせた。得られたＰＣＲ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ ｐＨＯＧ＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３αＣＤ３０（ＨＲＳ−３）にクローニングして、ハイブリッドプラスミドｐＨＯＧ＿ＶＨαＣＤ１６ＬＳ２１（Ｇ２Ｓ）３ＶＬαＣＤ３０（Ｇ２Ｓ）３ＶＨαＣＤ３０を作成した。
【０１６０】
プライマーＰ３５、5’ GGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTAGCGGCGGCTC CGGTGGTTCTTCCTATGTGCTGACTCAGCCATCCTC 3’（配列番号５２）、およびＰ３７、5’CCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGATCCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC 3’（配列番号５３）を用いたポリメラーゼ鎖反応によって、抗−ＣＤ１６Ａ抗体４−ＬＳ２１のＶＬを増幅させ、ＰＣＲ産物の５’末端に９アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号５２）をコードする核酸配列を生じさせた。得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｍＢＩ／ＸｂａＩで消化し、直線化されたＢｓｍＢＩ／ＸｂａＩ消化ハイブリッドプラスミドｐＨＯＧ＿ＶＨαＣＤ１６ＬＳ２１（Ｇ２Ｓ）３ＶＬαＣＤ３０（Ｇ２Ｓ）３ＶＨαＣＤ３０にクローニングし、プラスミドｐＨＯＧ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３を得た。このプラスミドをＮｃｏＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ直線化プラスミドｐＳＫＫ３にライゲーションした。
【実施例２０】
【０１６１】
バクテリアでの ＴａｎｄＡｂ分子の発現のためのプラスミドｐＳＫＫ３ ＣＤ１９×ＣＤ１６ＬＳ２１ Ｔａｎｄａｂ／（Ｇ２Ｓ）３の構築
抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をコードする遺伝子を、プラスミド ｐＳＫＫ３＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３α ＣＤ１９を使ったハイブリドーマ ＨＤ３７（ＨＤ３７）から得た。プラスミドｐＳＫＫ３＿ｓｃＦｖ（Ｇ２Ｓ）３α ＣＤ１９（ＨＤ３７）を、ＮｃｏＩ／ＢｓｍＢＩによって切断し、挿入断片をアガロースゲルにおいて精製した。ついで、精製した断片を、制限酵素 ＥｃｏＲＶで消化した。ＥｃｏＲＶ／ＢｓｍＢＩ消化断片を直線化ＥｃｏＲＶ／ＢｓｍＢＩプラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３にクローニングし、プラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３を得た。プラスミド ｐＨＯＧ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ をＮｃｏＩ／ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ 線形化プラスミド ｐＳＫＫ３にライゲーションした。得られたプラスミドは、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂをコードするｐＳＫＫ３ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＡＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３である。
【実施例２１】
【０１６２】
バクテリアにおけるＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ 分子の発現および精製
発現プラスミド ｐＳＫＫ３ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびｐＳＫＫ３ ＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＲＶ３０８（Ｍａｕｒｅｒら，１９８０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：１４７−１６１）のサンプルを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１００ｍＭ グルコース（２×ＹＴＧＡ）を含有する２×ＹＴ培地中、２８℃で、一晩生育させた。２ｘＹＴＧＡ中の一晩培養物の希釈物（１：５０）を、２８℃、２００ｒｐｍ振とうでフラスコ培養として生育させた。培養物が、ＯＤ６０００．８に達した時点で、細菌を９５００ｇ、１５分間、２０℃の遠心で沈降させ、同容量の新しい、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＹＴＢＳ培地（１Ｍ ソルビトールおよび２．５ｍＭ グリシンベタインを含有する２×ＹＴ；Ｂｌａｃｗｅｌｌ ＆ Ｈｏｒｇａｎ、１９９１、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９５：１０−１２）に再懸濁した。ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭで添加して、培養を２１℃、１８−２０時間継続した。細胞を、１４０００ｇ、２０分間、４℃の遠心分離で回収した。可溶性周辺質タンパク質を単離するため、沈降した細菌を５％の初期容量の氷冷２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再懸濁した。随時攪拌しながら氷上で１時間インキュベーションした後、スフェロプラストを１４０００ｇ、６０分間、４℃で遠心分離し、可溶性ペリプラズム抽出物を上清中に残し、このスフェロプラストにペレット中の不溶性ペリプラズム物質を加えた。ペリプラズム画分を開始緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール ｐＨ７．０）に対して、４℃で透析した。組換え産物を含有する透析溶液を、１４０００ｇ、３０分間、４℃で遠心分離した。Ｃｕ２＋で荷電し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（開始緩衝液）で平衡化した、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）の１ｍｌカラムを用いて、固定化した金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を４℃で、実施した。試料を、カラムを通過させることによって、ロードした。ついで、これを２０カラム容量の開始緩衝液、ついで溶出液の吸収（２８０ｎｍ）が最小（約３０カラム容量）になるまで５０ｍＭイミダゾールを含有する開始緩衝液で洗浄した。吸収された物質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０で溶出させた。このＴａｎｄＡｂ分子を含有する溶出画分を、ペンタＨｉｓ（商品名）抗体 ＢＳＡ不含有（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、ついで西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、ウエスタンブロット分析で同定した。
【０１６３】
ポジティブの画分を蓄積し、プレパックされたＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）（それぞれ、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）を用いた、５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）または５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）で緩衝液交換を行った。タンパク質溶液の濁りを遠心分離によって清澄にした。最終の精製は、０−１Ｍ ＮａＣｌ直線勾配を用いた５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）または５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）（それぞれＣＤ３０ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）での、ＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）におけるイオン交換クロマトグラフィーで行った。ＴａｎｄＡｂ分子を含有する溶出画分を、還元１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでクマシー染色によって。ポジティブ画分を集め、プレパックされたＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、５０ｍＭ イミダゾールおよび１０ｍＭ トレハロースを含有するＰＢＳ（ｐＨ ６．０または７．０）（それぞれＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３）で緩衝液交換を行った。
【実施例２２】
【０１６４】
フローサイトメトリーによる、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ Ｔａｎｄａｂ／（Ｇ２Ｓ）３およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３分子の性質決定
ＣＤ１６Ａへの結合を測定するため、実施例７に記載したように、ＨＥＫ−２９３ 細胞をｐｃＤＮＡ３−ＣＤ１６Ａ−ゼータ プラスミド（Ｄｒ．Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ大学、イスラエル）を用いてリン酸カルシウム法でトランジェントに形質転換し、フローサイトメトリーのため形質転換の４０時間後に回収した。有毛状細胞性白血病セルラインＪＯＫ−１（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ａｌｂｉｅｚ Ｒ，Ｄｏｒｋｅｎ Ｂ，Ｍｏｎｎｅｒ ＤＡ、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ、（１９９１） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：６２３、Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇの親切なる贈り物）を用いて、ＣＤ１９への結合を測定した。ＣＤ３０での反応性を試験するため、染色をヒト・ホジキン・セルラインＬ５４０ＣＹ（Ｖ．Ｄｉｅｈｌ博士、Ｃｏｌｏｇｎｅ大学、ドイツから親切に提供を受けた；Ｋａｐｐ Ｕ、Ｗｏｌｆ Ｊ、ｖｏｎ Ｋａｌｌｅ Ｃ、Ｔａｗａｄｒｏｓ Ｓ、Ｒｏｔｔｇｅｎ Ａ、Ｅｎｇｅｒｔ Ａ、Ｆｏｎａｔｓｃｈ Ｃ、Ｓｔｅｉｎ Ｈ、Ｄｉｅｈｌ Ｖ．（１９９２） Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． Ｓｅｐ；３ Ｓｕｐｐｌ ４：２１−３）を用いて行った。細胞の染色および分析を、基本的に上記のように行った。全ての組換え抗体を１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ 抗−ヘキサ Ｈｉｓ １３／４５／３１−２ （Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）、ついで１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ 抗−マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。
フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂおよびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ抗体の両方の、対応抗原を発現する細胞への強い結合を示した。ＴａｎｄＡｂ抗体の両方は、ＣＤ１６Ａ−発現細胞に、ほぼ等しい親和性で結合した。
【実施例２３】
【０１６５】
親和性測定
対立遺伝子変種、４８Ｒ／１５８Ｖおよび４８Ｒ／１５８Ｆ、におけるｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１のＫＤ値の測定により、表面プラスモン共鳴で測定されたように、同等の約５×１０−８ＭのＫＤ値が示され、両方の対立遺伝子変種は、ほぼ同じ親和性（実施例１２を参照）で認識されることを示した。この知見は、ＴａｎｄＡｂ ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１由来の４−ＬＳ２１で確認され、これもまたＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子変種にほとんど同一の親和性での結合を示した。４−ＬＳ２１ ｓｃＦｖと比較して、結合性の増加による、ファクター１０以上の親和性における改良が、ＴａｎｄＡｂ抗体で観察された。
【実施例２４】
【０１６６】
細胞障害性分析によるＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３ および ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ／（Ｇ２Ｓ）３分子の性質決定
ＮＫ細胞を標的細胞に集めること、および受容体の架橋によるＮＫ細胞の活性化によって、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１およびＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂ抗体が、インビトロの細胞傷害性を活性化するかどうかを確認するため、非−放射活性細胞傷害性アッセイを、基本的にＴ．Ｄｒｅｉｅｒら（２００２、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：６９０−６９７）に従って、実施した。前記のようにエフェクター細胞として用いたＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから濃縮した。それぞれのケースで濃縮したＮＫ細胞の純度および抗原発現をフローサイトメトリーでチェックした（データは示していない）。
【０１６７】
ＣＤ３０＋ Ｌ５４０ＣＹ標的細胞またはＣＤ１９＋ ＪＯＫ−１またはＲａｊｉ標的細胞を、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ならびに１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、本明細書中、ＲＰＭＩ培地と称する場合がある；全ての成分はInvitrogen社から入手した。）中で培養した。細胞傷害性アッセイのため、１０μＭ カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Invitrogen社）を用いて、３０分間、ＲＰＭＩ培地中、３７℃で細胞を標識した。緩やかに洗浄した後、標識細胞をＲＰＭＩ培地に１ｘ１０５／ｍＬの濃度に再懸濁した。ついで、１ｘ１０４の標的細胞を、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂまたはＣＤ１９ｘＣＤ１６ＡＬＳ２１のいずれかを有する、１ｘ１０５の濃縮ＮＫ細胞とともに、丸底の９６−ウエル・マイクロタイタープレートの個々のウエル中に、総量２００μｌ／ウエルで播種した。２分間、２００ｇの遠心後、アッセイ物を３時間、３７℃、５％ ＣＯ２の湿雰囲気下でインキュベーションした。インキュベーション終了の１５分前に、ＲＰＭＩ培地中１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２０μｌを、標的細胞のみを含むウエルに加えた。他の全てのウエルには、２０μｌのＲＰＭＩ培地を加えた。１００μｌの細胞培養上静を、５分間、５００ｇの更なる遠心後に各ウエルから回収し、放出されたカルセインの蛍光を蛍光プレートリーダーを用いて５２０ｎｍで測定した（Ｖｉｃｔｏｒ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。測定されたカウントに基づき、特異的細胞溶解を次式に従って計算した：［蛍光（試料）−蛍光（自然発生）］／［蛍光（最大）−蛍光（自然発生）］×１００％。蛍光（自然発生）は、エフェクター細胞および抗体不存在下での標的細胞由来の蛍光カウントを表し、および蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によって誘導された細胞溶解の合計を示す。Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてシグモイド投与応答カーブをプロットした（図８参照）
この結果は、ＴａｎｄＡｂ−活性化ＮＫ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。対照的に、ＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂは、ＣＤ１９−Ｌ５４０ＣＹ標的細胞の溶解を誘導せず、逆もまた同様であり、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ＴａｎｄＡｂは、ＮＫ細胞のＣＤ３０− ＪＯＫ−１細胞の殺滅を誘導しなった。ＮＫ細胞の不存在下では、ＣＤ３０ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂもＣＤ１９ｘＣＤ１６ＬＳ２１ ＴａｎｄＡｂも標的細胞細胞傷害性活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ｓｃＦｖ５０ＮＩのストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６−Ｆｃへの結合を示すＥＬＩＳＡの結果 ＥＬＩＳＡプレートを、ウエルあたり、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６中、５００ｎｇのストレプトアビジンおよび３００ｎｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）でコートした。ついで、３００ｎｇのビオチン化ＣＤ１６Ａ−ＦｃをＰＢＳ中、室温で、３０分間、吸収させた。ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ、ストレプトアビジンおよびヒトＩｇＧを、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ ０．１％／２％ スキムミルク粉末中、１μｇ／ｍＬのマウスＭＡｂ Ａ９または５０μｌのクローン５０ＮＩ由来粗精製ペリプラズム抽出物とともに、インキュベーションした。ＭＡｂ Ａ９の結合を、ヤギ抗−マウス抗体−ＨＲＰ複合体を用いて検出した。ｓｃＦｖ ５０ＮＩの結合を、抗−ペンタＨｉｓ 抗体−ＨＲＰ−複合体を用いて検出した。ＨＲＰ−基質 テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の４５０ｎｍでの吸収を、５０μｌの０．５Ｍ 硫酸での反応終結後に測定した。
【図２】ＣＤ１６Ａを発現する細胞形質転換体に結合するが、ＣＤ１６Ｂを発現する細胞に結合しない親和性成熟ヒト抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ マウスＢＷ細胞およびＣＤ１６Ａ（ＢＷ／ＣＤ１６Ａ）で安定に形質転換したＢＷ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＤ１６Ｂ（２９３／ＣＤ１６Ｂ）、ＣＤ１６Ａ（２９３／ＣＤ１６Ａ）またはＮＫｐ４６（２９３／ＮＫｐ４６）で形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ Ａ９（抗−ＣＤ１６）またはＭＡｂ１９５３１４（抗−ＮＫｐ４６）で、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬ ＭＡｂ １３／４５／３１−２（抗−ヘキサＨｉｓ）、ついでＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧを用いて検出した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞からの染色蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図３】組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６ＢにおけるＥＬＩＳＡ 組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６Ｂタンパク質を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８中、８０ｎＭでコートした。ウエルを、ＰＢＳ、２％ スキムミルクでブロックした。組換えタンパク質およびｇｐ３４−Ｆｃ（ネガティブコントロール）へのｓｃＦｖの結合を、抗−ｃ−Ｍｙｃ−ＨＲＰ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９（１μｇ／ｍＬ）、ついでヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ−複合体（０．５μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。コートされた組換えＣＤ１６Ｂを、抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）を用いた染色により直接検出しし、Ｆｃ−融合タンパク質のコーティングを、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍＬ）によって試験した。ＨＲＰ−基質として、５０μＬのＴＭＢを用いた。５０μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いた反応終結後、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【図４】新たに単離したＮＫ細胞における、ヒト親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖによってリダイレクトされた細胞傷害性のトリガリング 健常ドナーの末梢血由来のＮＫ細胞を単離、濃縮し、標的細胞としてカルセイン標識化Ｐ８１５を用いた細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。エフェクター（Ｅ）および標的（Ｔ）細胞を、１μｇ／ｍＬの指示抗体の存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で３時間インキュベーションした。特異的溶解のパーセンテージを、上清中に放出されたカルセインの測定された蛍光カウントから計算した。３回の平均値および標準偏差をプロットした.
【図５】ＰＭＮおよびＮＫ細胞における親和性成熟抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖのフローサイトメトリー分析 多形核細胞（ＰＭＮ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を健常ドナー由来の末梢血から単離し、フローサイトメトリー染色および分析に用いた。細胞を１０μｇ／ｍＬの抗−ＣＤ１６ ＭＡｂ Ａ９および抗−ＣＤ５６ ＭＡｂ Ｂ１５９、ついで１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。全てのｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬの抗−（Ｈｉｓ）６、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞染色からの蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図６】ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの対立遺伝子変種のアミノ酸配列アラインメント シグナルペプチドを影付きで示す。アスタリスクと斜体テキストは、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子変種の間での相違を示す。ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの相違を太字および下線で示す。ＣＤ１６Ａ １５８Ｖａｌ／Ｐｈｅ多形性の位置をボックスで示す。
【図７】異なるＣＤ１６アイソフォームにおけるＥＬＩＳＡ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートのウエルを、２００ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＮＫｐ４６−Ｆｃを含有する１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３でコートした。全ての抗原を、［Ａ］ｓｃＦｖ ４−ＬＳ２１、ついでＨＲＰ複合化抗−Ｈｉｓ抗体、または［Ｂ］ＭＡｂ Ａ９、ついでヤギ抗−マウスＨＲＰ複合体（ヒトＩｇＧとの最小交叉反応性）とインキュベーションした。一次抗体として用いた抗−ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖは、ネガティブコントロールとして作用した。
【図８】ＴａｎｄＡｂ−活性化ＮＫ細胞による標的特異的殺滅。１×１０４の指示カルセイン標識Ｌ５４０ＣＹ（結果をパネル［Ａ］に示す）またはＪＯＫ−１標的細胞（結果をパネル［Ｂ］に示す）を、１×１０５のＮＫ細胞とともに、指示濃度のＣＤ３０×ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（黒い菱形）またはＣＤ１９ｘＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（白い菱形）の存在下で３時間インキュベーションした。特異的溶解の割合は、測定された放出カルセインの蛍光カウントから計算し、GraphPadPrismソフトウェアを用いて非線形回帰分析で分析した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原に対する特異性を有する結合分子であって、当該少なくとも１つの抗原がＦｃγＲＩＩＩＡであり、かつ特異的にＦｃγＲＩＩＩＢに結合しない結合分子。
【請求項２】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性が抗体またはその抗原結合断片によって与えられる請求項１記載の結合分子。
【請求項３】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性が抗原結合断片によって与えられる請求項２記載の結合分子。
【請求項４】
抗原結合断片が、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＣＤＲからなる群から選択される、請求項３記載の結合分子。
【請求項５】
抗体または抗原結合断片が、少なくとも１つのヒトＣＤＲを含有する、請求項２〜４のいずれか１項記載の結合分子。
【請求項６】
ＣＤＲが、配列番号２０、２３、２６、２９、３３、３４、２１、２４、２７、３０、３１、３５、２２、２５、２８、３２、１７、１８、および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５記載の結合分子。
【請求項７】
抗原結合断片の抗体が、３つのヒト軽鎖ＣＤＲを含有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
ヒト軽鎖ＣＤＲ１の配列が、配列番号２０、２３、２６、２９、３３、および３４からなる群から選択され、ヒト軽鎖ＣＤＲ２の配列が、配列番号２１、２４、２７、３０、３１、および３５からなる群から選択され、ならびにヒト軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２２、２５、２８、および３２からなる群から選択される、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
抗原結合断片または抗体が、３つのヒト重鎖ＣＤＲを含有する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１０】
ヒト重鎖ＣＤＲ２の配列が配列番号１８であり、ヒト重鎖ＣＤＲ１の配列が配列番号１７であり、およびヒト重鎖ＣＤＲ３の配列が配列番号１９である、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
抗体または抗原結合断片がヒト軽鎖可変部を含有する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１２】
ヒト軽鎖可変部が配列番号１０〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の結合分子。
【請求項１３】
抗体または抗原結合断片がヒト重鎖可変部を含有する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１４】
ヒト重鎖可変部が配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１３記載の結合分子。
【請求項１５】
抗体または抗原結合断片が完全ヒト型である、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１６】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を活性化できる、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１７】
ＮＫ細胞媒介細胞殺滅を誘導可能な請求項１６記載の結合分子。
【請求項１８】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞の活性化を阻害する請求項１５記載の結合分子。
【請求項１９】
結合分子が少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２０】
少なくとも１つの更なる抗原が細胞表面抗原である請求項１９記載の結合分子。
【請求項２１】
細胞表面抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムセン−フリーデンライヒ抗原、ＭＵＣ−１、ＩＬ４−Ｒアルファー、ＩＬ１３−Ｒ、ＩＧＦＲ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５から選択される、請求項２０記載の結合分子。
【請求項２２】
細胞表面抗原がＣＤ１９またはＣＤ３０である請求項２０または請求項２１記載の結合分子。
【請求項２３】
少なくとも１つの更なる抗原が病原体由来である請求項１９または請求項２０記載の結合分子。
【請求項２４】
病原体がウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、寄生体またはプリオンである請求項２３記載の結合分子。
【請求項２５】
更なる抗原に対する特異性が抗体またはその抗原結合断片によって与えられる請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２６】
抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択される請求項２５記載の結合分子。
【請求項２７】
少なくとも１つの更なる抗原に対する特性が抗原結合断片によって与えられる請求項２５または請求項２６記載の結合分子。
【請求項２８】
抗原結合断片が免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＣＤＲから選択される請求項２６記載の結合分子。
【請求項２９】
ダイアボディまたはＴａｎｄＡｂである請求項２７または請求項２８記載の結合分子。
【請求項３０】
前記結合分子が更に機能ドメインを含有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３１】
機能ドメインが、抗体Ｆｃドメイン、抗体依存酵素プロドラッグ治療における使用のための酵素、Ｆｃ受容体に結合可能なペプチド、結合分子の血中半減期を増加させるためのタンパク質またはペプチドから選択される、請求項３０記載の結合分子。
【請求項３２】
前記結合分子が、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖ対立形質変種に結合する親和性とほぼ同じ親和性で、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆ対立形質変種に結合可能である、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３３】
結合分子が標識分子または毒素に結合している、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３４】
標識分子が放射能標識、蛍光標識、または発光標識である請求項３３記載の結合分子。
【請求項３５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子、および少なくとも１つの更なる成分を含有する組成物
【請求項３６】
適当な薬学的担体、賦形剤、希釈剤および／または安定剤を含有する請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３８】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有する抗体または抗原結合断片が
ａ）配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされるヒト軽鎖可変領域および／または；
ｂ）配列番号１の核酸配列によってコードされるヒト重鎖可変領域
を含有する請求項３７記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ１９に対する親和性を有する、請求項３７または請求項３８記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ３０に対する親和性を有する、請求項３７または請求項３８記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
作動可能にプロモーター領域および所望により転写終結領域に連結された請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドが作動可能にプロモーター領域およびシグナル配列に連結された請求項４１記載のベクター。
【請求項４３】
請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項４４】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または植物細胞から選択される、請求項４３記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを宿主細胞へ導入することと、結合分子が発現される条件下で宿主細胞を培養培養することとを含有する、結合分子の製造方法。
【請求項４６】
更に結合分子の単離および所望による精製を含有する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを宿主細胞へ導入すること、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の結合分子が発現される条件下で宿主細胞を培養すること、
（ｃ）工程（ｂ）で発現した結合分子を単離すること、および
（ｄ）工程（ｃ）で単離した結合分子を標識または毒素と複合化すること
を含有する、請求項３３記載の結合分子の製造方法。
【請求項４８】
自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、アレルギーまたはがんの診断または治療における使用のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項３５または請求項３６記載の組成物。
【請求項４９】
がんが、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ肉芽腫症、固形腫瘍、微小残存病変、および転移性腫瘍からなる群から選択される、請求項４８記載の結合分子又は組成物。
【請求項５０】
非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ肉芽腫症、固形腫瘍、微小残存病変、または転移性腫瘍の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項３５もしくは請求項３６に記載の組成物の使用。
【請求項５１】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現する細胞の染色、生体外での患者細胞プロファイルの分析、または生体外治療のためのＮＫ細胞の単離のための試薬としての請求項３３または請求項３４記載の結合分子の使用。
【請求項５２】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子およびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合時の結合分子を検出する手段を含有するキット。
【請求項１】
少なくとも１つの抗原に対する特異性を有する結合分子であって、当該少なくとも１つの抗原がＦｃγＲＩＩＩＡであり、かつ特異的にＦｃγＲＩＩＩＢに結合しない結合分子。
【請求項２】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性が抗体またはその抗原結合断片によって与えられる請求項１記載の結合分子。
【請求項３】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性が抗原結合断片によって与えられる請求項２記載の結合分子。
【請求項４】
抗原結合断片が、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＣＤＲからなる群から選択される、請求項３記載の結合分子。
【請求項５】
抗体または抗原結合断片が、少なくとも１つのヒトＣＤＲを含有する、請求項２〜４のいずれか１項記載の結合分子。
【請求項６】
ＣＤＲが、配列番号２０、２３、２６、２９、３３、３４、２１、２４、２７、３０、３１、３５、２２、２５、２８、３２、１７、１８、および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５記載の結合分子。
【請求項７】
抗原結合断片の抗体が、３つのヒト軽鎖ＣＤＲを含有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
ヒト軽鎖ＣＤＲ１の配列が、配列番号２０、２３、２６、２９、３３、および３４からなる群から選択され、ヒト軽鎖ＣＤＲ２の配列が、配列番号２１、２４、２７、３０、３１、および３５からなる群から選択され、ならびにヒト軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２２、２５、２８、および３２からなる群から選択される、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
抗原結合断片または抗体が、３つのヒト重鎖ＣＤＲを含有する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１０】
ヒト重鎖ＣＤＲ２の配列が配列番号１８であり、ヒト重鎖ＣＤＲ１の配列が配列番号１７であり、およびヒト重鎖ＣＤＲ３の配列が配列番号１９である、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
抗体または抗原結合断片がヒト軽鎖可変部を含有する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１２】
ヒト軽鎖可変部が配列番号１０〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の結合分子。
【請求項１３】
抗体または抗原結合断片がヒト重鎖可変部を含有する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１４】
ヒト重鎖可変部が配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１３記載の結合分子。
【請求項１５】
抗体または抗原結合断片が完全ヒト型である、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１６】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を活性化できる、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１７】
ＮＫ細胞媒介細胞殺滅を誘導可能な請求項１６記載の結合分子。
【請求項１８】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞の活性化を阻害する請求項１５記載の結合分子。
【請求項１９】
結合分子が少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２０】
少なくとも１つの更なる抗原が細胞表面抗原である請求項１９記載の結合分子。
【請求項２１】
細胞表面抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムセン−フリーデンライヒ抗原、ＭＵＣ−１、ＩＬ４−Ｒアルファー、ＩＬ１３−Ｒ、ＩＧＦＲ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５から選択される、請求項２０記載の結合分子。
【請求項２２】
細胞表面抗原がＣＤ１９またはＣＤ３０である請求項２０または請求項２１記載の結合分子。
【請求項２３】
少なくとも１つの更なる抗原が病原体由来である請求項１９または請求項２０記載の結合分子。
【請求項２４】
病原体がウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、寄生体またはプリオンである請求項２３記載の結合分子。
【請求項２５】
更なる抗原に対する特異性が抗体またはその抗原結合断片によって与えられる請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２６】
抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択される請求項２５記載の結合分子。
【請求項２７】
少なくとも１つの更なる抗原に対する特性が抗原結合断片によって与えられる請求項２５または請求項２６記載の結合分子。
【請求項２８】
抗原結合断片が免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＣＤＲから選択される請求項２６記載の結合分子。
【請求項２９】
ダイアボディまたはＴａｎｄＡｂである請求項２７または請求項２８記載の結合分子。
【請求項３０】
前記結合分子が更に機能ドメインを含有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３１】
機能ドメインが、抗体Ｆｃドメイン、抗体依存酵素プロドラッグ治療における使用のための酵素、Ｆｃ受容体に結合可能なペプチド、結合分子の血中半減期を増加させるためのタンパク質またはペプチドから選択される、請求項３０記載の結合分子。
【請求項３２】
前記結合分子が、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖ対立形質変種に結合する親和性とほぼ同じ親和性で、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆ対立形質変種に結合可能である、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３３】
結合分子が標識分子または毒素に結合している、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３４】
標識分子が放射能標識、蛍光標識、または発光標識である請求項３３記載の結合分子。
【請求項３５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子、および少なくとも１つの更なる成分を含有する組成物
【請求項３６】
適当な薬学的担体、賦形剤、希釈剤および／または安定剤を含有する請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３８】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有する抗体または抗原結合断片が
ａ）配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされるヒト軽鎖可変領域および／または；
ｂ）配列番号１の核酸配列によってコードされるヒト重鎖可変領域
を含有する請求項３７記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ１９に対する親和性を有する、請求項３７または請求項３８記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ３０に対する親和性を有する、請求項３７または請求項３８記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
作動可能にプロモーター領域および所望により転写終結領域に連結された請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドが作動可能にプロモーター領域およびシグナル配列に連結された請求項４１記載のベクター。
【請求項４３】
請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項４４】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または植物細胞から選択される、請求項４３記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを宿主細胞へ導入することと、結合分子が発現される条件下で宿主細胞を培養培養することとを含有する、結合分子の製造方法。
【請求項４６】
更に結合分子の単離および所望による精製を含有する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１記載もしくは請求項４２のベクターを宿主細胞へ導入すること、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の結合分子が発現される条件下で宿主細胞を培養すること、
（ｃ）工程（ｂ）で発現した結合分子を単離すること、および
（ｄ）工程（ｃ）で単離した結合分子を標識または毒素と複合化すること
を含有する、請求項３３記載の結合分子の製造方法。
【請求項４８】
自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、アレルギーまたはがんの診断または治療における使用のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項３５または請求項３６記載の組成物。
【請求項４９】
がんが、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ肉芽腫症、固形腫瘍、微小残存病変、および転移性腫瘍からなる群から選択される、請求項４８記載の結合分子又は組成物。
【請求項５０】
非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ肉芽腫症、固形腫瘍、微小残存病変、または転移性腫瘍の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項３５もしくは請求項３６に記載の組成物の使用。
【請求項５１】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現する細胞の染色、生体外での患者細胞プロファイルの分析、または生体外治療のためのＮＫ細胞の単離のための試薬としての請求項３３または請求項３４記載の結合分子の使用。
【請求項５２】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の結合分子およびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合時の結合分子を検出する手段を含有するキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５４１７１４（Ｐ２００８−５４１７１４Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１２７８１（Ｐ２００８−５１２７８１）
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５６６８
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０５０８４６４２）アフィメート テラポイティクス アーゲー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５６６８
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０５０８４６４２）アフィメート テラポイティクス アーゲー (2)
【Ｆターム（参考）】
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