抗ＲＳＶＧタンパク質抗体
【課題】ＲＳＶ感染に対する抵抗性を増強する抗体を提供する。
【解決手段】ＲＳＶのＧタンパク質の保存されたエピトープに結合し、ヒト被検体に投与したときには最小限の免疫原性である個々のモノクローナル抗体及びフラグメントは、ＲＳＶ感染を処置することに有用である。
【解決手段】ＲＳＶのＧタンパク質の保存されたエピトープに結合し、ヒト被検体に投与したときには最小限の免疫原性である個々のモノクローナル抗体及びフラグメントは、ＲＳＶ感染を処置することに有用である。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互引用】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月２５日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０００，４６９、及び２００８年８月１５日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０８９，４０１の利益を主張する。これらの出願の記載内容は、引用によって本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ＲＳウィルス（respiratory syncytial virus：ＲＳＶ）由来のＧタンパク質に含まれる機能的に重要なエピトープと免疫反応性であり、ヒト被検体に投与される場合には、最小限の免疫原性（minimally immunogenic）である抗体に向けられる。これらの抗体は、ＲＳＶ感染に対するヒト被検体の抵抗性を増強すること、並びに、既に感染した個々の感染のレベルを減少させること、もしくはＲＳＶ感染に起因する症状を改善する（ameliorate）ことに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＲＳＶ感染は、アメリカ合衆国、ヨーロッパ、オーストラリア及び日本を含む世界的で、長年にわたり、かつ悪性の問題となっている。それは、特に、未熟児、児童及び高齢者、そして、実際には弱い免疫システムを有する全ての個人において問題である。１歳未満のおよそ３分の２の子供、及び１歳から４歳までの間のほとんど全ての子供がＲＳＶに少なくとも１度は感染し、ほとんどの［子供］が医療上の注意を必要とせずに回復したと見積もられる。しかしながら、５−１０％［の子供］が慢性化した重篤な感染（幼児期の後期における喘鳴（wheezing）及び喘息様の症状に関する病因（predisposing）となることが信じられる因子）を有する。ＲＳＶは、２つの主要な表面糖タンパク質、Ｆ及びＧを有する。ＲＳＶに対する唯一の市販のモノクローナル抗体は、未熟児におけるＲＳＶによる感染を防止するための予防的な使用のためのみに認可され、Ｆタンパク質に対して向けられる。この抗体、パリビズマブ（palivizumab, Synagis（登録商標）、MedImmuneから）は、Ｆタンパク質配列のストレイン（ないし株：strain）の間の保存のため、広範囲にわたって有用である。これに対して、Ｇタンパク質は、およそ１００個のシーケンスされたストレインにおいてほとんど不変（invariant）である中央の（central）「ＣＸ３Ｃ」ドメインを除いて、極めて可変（variable）である。この領域（ないし部位：region）は、フラクタルカイン(fractalkine)受容体と相互作用することが示されているモチーフを含む。その相互作用は、ウィルスに対する有効な（ないし効果的な）免疫反応を抑制することによって、ＲＳＶに特徴的な慢性化した病気の過程に対して寄与すると信じられている：Tripp, R. A, et al., Nature Immunology (2001) 2:732-738。この領域は、また、有効な免疫反応を抑制することに寄与すると再び（again）信じられているＴｏｌｌ−様受容体４（Toll-like Receptor 4）のアンタゴニスト（ないし拮抗剤）となることも示されている：Polack, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102: 8996-9001; Shingai, et al., Int'l Immunology (2008) epub July 8。
【０００４】
ワクチン接種によるＲＳＶの予防における最初の試みは、逆効果であることがわかった。増強された病気及び肺の好酸球増加（eosinophilia）が、ホルマリンで不活性化したＲＳＶ又はＲＳＶ Ｇ糖タンパク質を用いたワクチン接種と関連し、このことは、ケモカイン フラクタルカインを模倣するＣＸ３Ｃ領域が設計されたＧタンパク質における上記の保存された配列に起因している（Haynes, L. M., et al., J. Virol. (2003) 77: 9831-9844）。ストレインの間のこのタンパク質の配列の保存の欠如のため、Ｇタンパク質に向けられた抗体を使用する受動的な免疫化は、一般的には、非実用的であると考えられている。
【０００５】
その後、同一のグループによって、ＲＳＶ感染又はワクチン接種に起因する抗Ｇタンパク質抗体の応答が、Ｇタンパク質のフラクタルカインＣＸ３Ｃ受容体への結合の阻害及びＲＳＶ Ｇタンパクが質媒介した白血球走化性の調整と関連することが確認され(Harcourt, J. L., et al., J. I. D. (2004) 190:1936-1940)、そして、この結合の阻害がＴ細胞の応答に逆に影響を与えることが確認された(Harcourt, J. L., et al, J. Immunol. (2006) 176:1600-1608)。さらに最近のワクチン研究（efforts）は、ホルマリン固定ワクチンと関連した病気の悪化を回避しているが、新規のワクチンによって与えられた免疫は、急速に衰退すること（数週間から数ヶ月で）がわかっており、天然のＲＳＶに対する免疫的な記憶が弱いことと符号する：Yu, et al., J. Virol. (2008) 82:2350-2357。反復した感染は、多くの他のウィルスとは異なり、このウィルスに共通（common）である。Ｇタンパク質の免疫抑制的な特徴は、この影響に関する原因となり得る。
【０００６】
Ｇタンパク質に対して向けられたモノクローナル抗体は、２０年より前から知られている。Anderson, L. J., et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238は、Ｆ及びＧタンパク質モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の混合物、及び個々のモノクローナル抗体のＲＳＶを中和する能力を記載する。Ｇタンパク質への結合に関連するモノクローナル抗体、特に１３１−２Ｇが、Sullender, W., Virol. (1995) 209:70-79によって、抗原性の解析において、後に研究された。この抗体は、ＲＳＶの主要なストレインを表すＲＳＶ群Ａ及びＢの両方に結合することがわかった。
【０００７】
更に、Mekseepralard, C., et al., J. Gen. Virol. (2006) 87:1267-1273は、受動的に投与されたＦ及びＧタンパク質に対する抗体が、げっ歯類のモデルにおける実験上の感染に対して保護的であることを示す初期の諸論文を概説する。これらの文献は、Routledge, et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:293-303; Stott, E. J., et al., J. Virol. (1986) 60:607-613; Taylor, G., et al., Immunol. (1994) 52: 137-142; 及び Walsh, E. E., et al., Infect. Immun. (1984) 43:756-758を含む。上記文献において、Mekseepralardらは、インビトロにおいて補体の存在下で、又はマウスにインビボで使用した場合に、ウィルスを中和するために、Ｇタンパク質に対して生産された特異的なモノクローナル抗体（１Ｃ２）は、グリコシル化を必要としたことを記載した。該著者は、Ｇタンパク質の１７３−１８６番目のアミノ酸が保存され、１Ｃ２が保存された領域（ないし部位）に対して向けられたことを記載するが、非免疫性の抗体を調製する方法は、相対的に粗い、すなわち、マウスのＦａｂのヒトＦｃ領域へのキメラ化であった。
【０００８】
更に、Corbeil, S., et al., Vaccine (1996) 14:521-525は、マウスのモノクローナル抗体１８Ａ２Ｂ２を用いた受動的な免疫化の後に、補体系がＲＳＶによるチャレンジ（攻撃）からのマウスの保護に関与することを実証するが、この抗体はインビトロにおいて中和する能力を示さない。
【０００９】
ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ００／４３０４０は、ＲＳＶによる感染に関連する気道の炎症の改善における抗サブスタンスＰ抗体の使用を記載する。公知の炎症誘発性の媒介物質であるサブスタンスＰの生産は、ＲＳＶのＧタンパク質の投与によって増強され、Ｇタンパク質が欠損したＲＳＶの変異株、又は機能を喪失するポイントミューテーションを中央の保存された領域に保有するＲＳＶの変異株には存在しない：Haynes, et al., J Virol (2003) 77:9831-9844。
【００１０】
アメリカ合衆国特許公開２００６／００１８９２５は、Ｇタンパク質のＣＸ３Ｃ領域の、その受容体との相互作用をブロックすることができる抗体及び小さい（small）ペプチドを記載し、クレームしている。これらの組成物は、ＲＳＶ感染の調節及び免疫の誘導に有用であることが示唆される。これらの抗体の治療上及び予防的な価値の実証に採用されるマウス抗体のヒトへの適合化が示唆されるけれども、そのようなヒトに適合した形態は、実際には生産されず、又は記載されていなかった。
【００１１】
Symphogen（社）によるＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００７／１０１４４１は、ＲＳＶ感染の処置のための組換え型のポリクローナル抗体に向けられる。ポリクローナルな組換え型の抗体は、ヒトの血清から単離された個々のモノクローナル抗体から構成される。この出願公開の表５は、サブタイプＡのＲＳＶ Ｇタンパク質の１６４−１７６番目のアミノ酸における「保存された領域（ないし部位）（conserved region）」に結合すると言われる１２個のモノクローナル抗体を開示する。これらの５つがＧタンパク質に対する親和性に関して試験され、１００−５００ｐＭの範囲における親和性が発見された。これらの抗体の２つは、プラーク減少中和試験（plaque reduction neutralization test：ＰＲＮＴ）を使用して、中和能力に関して試験され、１つは、およそ２．５μｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示し、他の１つは、中和の特徴を全く示さなかった。
【発明の概要】
【００１２】
［発明の開示］
Ｇタンパク質に関する高い親和性及び強力な中和能力を有し、群Ａ及びＢの両方のストレインと免疫反応性である抗体を含み、Ｆタンパク質と比べた場合にＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体が、ＲＳＶに最近感染したことが確認されたヒトのドナーから確認（ないし同定）された。更に、マウスの抗Ｇタンパク質抗体（初めてAnderson, et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238によって開示された）は、ヒト被検体に投与された場合に、免疫的な拒絶の機会を最小化するように修正（ないし変更）されている。本発明の抗体は、ヒト被検体におけるＲＳＶに対する治療製剤として、そして、ＲＳＶ抵抗性を増加することにも有用である。特に、サブタイプＡのＧタンパク質の１６０−１７６番目の位置（positions）の内の保存されたモチーフに対する抗体は、既に感染した被検体からウィルスを除去する（ないしクリアする）ことにおいて、そして、ＲＳＶ感染に特徴的な気道炎症を減少させることにおいて、並びに予防的な使用に関して、治療上有効である。
【００１３】
従って、１つの視点において、本発明は、ＲＳＶのＡストレインのＧタンパク質のおよそ１６０−１７６番目の位置の内のエピトープに結合し、そして、ヒト被検体に投与された場合に最小限の免疫原性であるモノクローナル抗体又はその免疫反応性のフラグメントに向けられる。これらの抗体は、ＲＳＶの中和に関する標準的なプラーク形成アッセイにおいて中和能力を示し、＜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは＜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは＜１００ｎｇ／ｍｌのようなアッセイにおいて、ＥＣ５０を実証する。本発明の抗体は、＜１ｎＭ、好ましくは＜５００ｐＭ、さらに好ましくは＜１００ｐＭのＲＳＶ−Ａ２のＧタンパク質に関する親和性も有する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＲＳＶの複数の（multiple）ストレインにまたがる高度なアミノ酸の同一性を有する領域（ないし部位：region）におけるＲＳＶのＧタンパク質に含まれるＣＸ３Ｃケモカインモチーフの３０個の残基の内に、又は直接的に、該モチーフの少なくとも一部分（a portion）において結合する。ＣＸ３Ｃケモカインモチーフは、ストレインＲＳＶ−Ａ２のおよそ、１８２−１８６番目のアミノ酸の位置であり、他のストレインにおけるＧタンパク質の対応する位置（position）にある。本発明の抗体がその内で結合する関連する領域は、ＲＳＶ−Ａ２のＧタンパク質の１６０−１７６番目の残基の内、及び他のストレインにおけるＧタンパク質の対応する位置の内に含まれることがわかった。この領域は、Ａストレイン内に高度に保存され、Ａ及びＢストレインの間でいくつかの（a few）アミノ酸の違いしか含まない。特に高度に保存された領域は、ＲＳＶ Ａ２の１６４−１７６番目の位置における配列：ＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣを有する。好ましくは、本発明の抗体は、配列：ＦＥＶＦＮＦ、又は、配列：ＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣを含むエピトープに結合する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、アミノ酸同一性が保存されたこの領域と免疫反応性であるため、このウィルスの群Ａストレイン及び群Ｂストレインの両方のＧタンパク質と免疫反応性であり、従って、ほとんどのストレインのＧタンパク質と免疫反応性である。
【００１４】
ＲＳＶ感染を処置するまたはＲＳＶに対する抵抗性を強める本発明の方法の使用に関して、本発明のモノクローナル抗体又はフラグメントは、群Ａ及びＢの両方における複数（ないし多数：multiplicity）のストレインと免疫反応性であり得、そして単一のモノクローナル抗体は、所望の効果を有するために十分であり得る。或いは、処置されるべき、又は抵抗性が形成されるべき被検体は、単一［種類］（single）を上回るモノクローナル抗体を投与されることができ、ここで、特にプロトコル内の１つの抗体は、群Ａのストレインとより高い反応性を有し、他の１つは、群Ｂのストレインとより高い反応性を有する。
【００１５】
本発明は、本発明の単一の抗体又は免疫反応性のフラグメント、あるいは２つを上回らない本発明の抗体又はフラグメントを活性試薬として含む、炎症の改善を含む予防又は処置に有用な医薬組成物も含む。
【００１６】
本発明の他の視点は、ヒト被検体におけるＲＳＶを処置する、又はこれらの被検体における抵抗性を誘導する抗体を使用する方法を含む。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体は、組み換え的（recombinantly）に生産することができ、従って、本発明は、そのような生産のための組み換え物質、並びにこれらの抗体の生産のための細胞系列（cell lines）、又は不死化細胞、及びヒト以外の多細胞生物（ないし組織）もしくはそれらの細胞、あるいは細菌（microbial）細胞を含む。１つの実施形態において、ヒト被検体から得られた細胞は、「不死化した（immortalized）」形態で生産され、ここで、それらを特徴づけることができ、かつクローン化された配列をコードするために十分な期間、抗体の分泌が可能なように修正されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ヒト被検体由来の種々のＲＳＶ抗原に対する抗体のｐｐｍでの頻度を示すプロットである。所望のストレインに独立的な抗Ｇ表現型（Ｇａｂ）は、ほとんどまれ、全体的にはおよそ百万個あたりに１０個（parts per million: ppm）であり、ある被検体においては１ｐｐｍと同じぐらい低い。「混合型（Mix）」とは、Ｆ及びＧの両方に結合する抗体を意味し、Ｆ及びＧが配列の相同性を有さない場合に、結合は、おそらく、共有する炭水化物決定因子に起因する。
【００１９】
【図２−Ａ】図２Ａは、ＣＸ３Ｃ領域、及び保存されたジスルフィド結合の位置（location)を指し示すＲＳＶ Ｇタンパク質の図である。模式図のバージョンは、全てのストレインに包括的であるが、位置（position）の特異的な番号は、１つのストレインから次のストレインまでわずかに異なる。
【００２０】
【図２−Ｂ】図２Ｂは、ＲＳＶ Ｇタンパク質からの１２塩基のペプチドと重複するパネルに対するＲＳＶに曝された被検体由来の血清の結合をプロットし、中央の保存された領域に免疫原性が無いことを明らかにする。
【００２１】
【図２−Ｃ】図２Ｃは、Ｇタンパク質における位置の関数としての、７５個を上回るＲＳＶのストレインのコレクションに関する多型性の頻度をプロットし、中央の保存された領域における、そして、Ｇタンパク質の可溶形態を形成する他のスプライシングサイトにおける著しい保存を明らかにする。
【００２２】
【図３】図３は、重複する配列を有するペプチドのアレイに対するイラスト的なマウスのモノクローナル抗体（１３１−２Ｇ）のプローブの結果を示す。この実験は、モノクローナル抗体が結合するエピトープを確認（ないし同定）する。図示した例において、エピトープは、ＣＸ３Ｃモチーフの３０残基内（within）にある。
【００２３】
【図４−Ａ】パネルＡ（図４Ａ）は、２人のドナー由来の血液の概略のプロットを表す。パネルＡは、Ｇａ／Ｇｂ交差反応性のクローンの有用な頻度を有するドナーを示す。プロットにおける各点は、単一のクローンの分泌された抗体フットプリントに関する３つのプローブへの相対的な結合を示す。
【図４−Ｂ】パネルＢ（図４Ｂ）は、２人のドナー由来の血液の概略のプロットを表す。パネルＢは、Ｇａ／Ｇｂ交差反応性のクローンの有用な頻度を有さないドナーを示す。プロットにおける各点は、単一のクローンの分泌された抗体フットプリントに関する３つのプローブへの相対的な結合を示す。
【図４−Ｃ】パネルＣ（図４Ｃ）は、単一のＥＢＶで形質転換されたＢ細胞の分泌したタンパク質のフットプリントの数値化した（ないし定量化した）プロファイルである。
【図４−Ｄ】パネルＤ（図４Ｄ）は、パネルＣの細胞からの抗体遺伝子で形質転換されたＨＥＫ２９３細胞由来の４つの子孫の細胞のプロファイルを示す。このプロファイルは、パネルＣにおける特性と一致し、パネルＤにおいて、複製のものによる定義されたようなアッセイの精度の内にある。
【００２４】
【図５−Ａ】図５Ａは、代表的な本発明の抗体の重鎖（パネルＡ）の配列を示す。
【図５−Ｂ】図５Ｂは、代表的な本発明の抗体の軽鎖（パネルＢ）の配列を示す。
【００２５】
【図６−Ａ】図６Ａは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＡ（図６Ａ）は、センサーの表面への抗体の結合を示す。
【図６−Ｂ】図６Ｂは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＢ（図６Ｂ）は、Ｇａタンパク質が表面を横切って流れ、そして結合した抗体によって捕獲された場合のセンサーの信号の増加を示し、その後、結合したＧａタンパク質が表面から離脱するように表面がバッファーで洗浄された場合の信号の衰退を示す。
【図６−Ｃ】図６Ｃは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＣ（図６Ｃ）は、パネルＡ及びＢ（図６Ａ及びＢ）と同様にＧｂタンパク質に関するオンレート（on-rate）及びオフレートを示す。
【図６−Ｄ】図６Ｄは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＤ（図６Ｄ）は、センサーの表面への抗体の結合を示す。
【図６−Ｅ】図６Ｅは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＥ（図６Ｅ）に示すように、抗体３Ｄ３は、Ｇタンパク質に結合し、辛うじて検出可能なオフレート（off-rate）を示さない。パネルＥ（図６Ｅ）は、Ｇａタンパク質が表面を横切って流れ、そして結合した抗体によって捕獲された場合のセンサーの信号の増加を示し、その後、結合したＧａタンパク質が表面から離脱するように表面がバッファーで洗浄された場合の信号の衰退を示す。
【図６−Ｆ】図６Ｆは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＦに示すように、抗体３Ｄ３は、Ｇタンパク質に結合し、辛うじて検出可能なオフレート（off-rate）を示さない。パネルＦ（図６Ｆ）は、パネルＤ及びＥと同様にＧｂタンパク質に関するオンレート（on-rate）及びオフレートを示す。
【００２６】
【図７】図７は、マイクロプレートをコートするために生きたウィルスを使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定された、Synagis（登録商標）Ｆタンパク質結合抗体と比較したときの種々の本発明の抗体の結合のグラフである。
【００２７】
【図８】図８は、Ｘ軸のＧタンパク質への親和性に対してＹ軸のウィルスへの結合をプロットするグラフである。２つの能力は相関するが、但し、３Ｄ３は、Ｇタンパク質へのその親和性から予測されるだろう親和性よりもわずかに少ない生きたウィルスへの親和性を示す。
【００２８】
【図９−Ａ】図９Ａは、ストレインＡ２へのいくつかの抗体の結合の比較を示す。
【図９−Ｂ】図９Ｂは、ストレインＡ５へのいくつかの抗体の結合の比較を示す。
【００２９】
【図１０】図１０は、中和アッセイの結果を示す。結果は、抗体のμｇに対してプロットされたプラークの数で示される。
【００３０】
【図１１】図１１は、ＲＳＶストレインＢの中和における本発明の抗体３Ｇ１２とSynagisの比較を示す。
【００３１】
【図１２】図１２は、本発明の２つの抗体とSynagis（登録商標）市販抗体の予防的な活性の比較を示す。
【００３２】
【図１３】図１３Ａ−Ｃは、ＲＳＶの感染後モデルマウスにおけるモノクローナル抗体１３１−２Ｇの治療上の有効性を示し（感染の＋３日後の処置）、減少した肺炎の他の測定値（ないし尺度：measures）：ＮＫ細胞及びＰＭＮ細胞（パネルＢ）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）（パネルＣ）の減少、に伴うウィルス負荷の投与量依存的な減少を含む（パネルＡ）。
【００３３】
【図１４】図１４は、本発明の抗体の高い親和性の効力の利点を強調する、３Ｇ１２、３Ｄ３又はSynagis（登録商標）の抗体を低い投与量で処置したモデルマウスにおけるウィルス性の力価(titer)のタイムコースを示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、感染の＋３日後に処置した場合のＲＳＶ感染マウスの肺におけるＲＳＶのコピー数に対する抗体の影響を測定する投与量／応答曲線である。
【００３５】
【図１６】図１６は、感染の＋３日後の処置の後、感染の最後の段階でウィルス負荷を減少させる、Synagis（登録商標）、３Ｄ３及び３Ｇ１２の比較した能力を示す。
【００３６】
【図１７】図１７は、ＲＳＶ感染マウスの肺におけるＢＡＬ細胞に対するコントロール抗体、抗Ｆ抗体及び抗Ｇ抗体の影響を示す。処置は、感染の＋３日後の処置であった。
【００３７】
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、感染の＋３日後に投与された場合に、ＲＳＶ感染マウスにおける炎症の減少において、抗Ｇモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２に特異的なフラグメントが完全な形の（ないし無傷の：intact）モノクローナル抗体と同じ程度に有効であるが、ウィルス負荷の減少において有効でないことを示す。
【００３８】
【図１９】図１９Ａ−Ｃは、予防的な日（−１日）から感染の＋３日後及び＋５日後までの範囲にわたる抗体の投与の様々な時間における、抗Ｇモノクローナル抗体のＢＡＬ（気管支肺胞洗浄（液））におけるＩＦＮγの生産に対する影響を示す。
【００３９】
【図２０】図２０は、ＲＳＶに感染した高齢の患者由来のＲＳＶのＧタンパク質の中央の保存された領域に対する抗体の力価を示す。患者は、臨床上の兆候及び症状の重さ（重篤であるか、又は軽度であるか）に従って選択された。中央の保存された領域への有意（appreciable）の力価の不在は、重篤な病気に相関する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本願で使用する場合、用語「処置する（treat）」とは、ＲＳＶに既に感染している被検体におけるウィルス負荷を減らすこと、又はそのような被検体における病気の症状を改善することを意味する。そのような症状は、細気管支炎、気道炎症、肺の中のうっ血、及び呼吸困難を含む。
【００４１】
用語「抵抗性を与える（confers resistance to」」とは、予防的な影響を意味し、ここで、ＲＳＶのチャレンジ（攻撃）によるウィルス性の感染は、重症度が少なくとも減少する。
【００４２】
「不死化細胞（immortalized cells）」とは、修正されていない最初に単離された細胞よりも顕著な期間（ないし世代：passages）生存することができる細胞を意味する。本発明の文脈で使用される場合、「不死化した(immortalized)」は、非常に長い期間（period）にわたって細胞が抗体を分泌し続けることを必ずしも意味せず、最初の培養細胞よりも長く生存することができることのみを意味する。抗体の分泌が起こる期間（time）は、その確認（ないし同定）及びコードするヌクレオチド配列の回収に十分であることのみが必要である。
【００４３】
語句「ヒト被検体に投与されたときの最小限の免疫原性（minimally immunogenic when administered to human subjects）」とは、ヒトにおける投与に対する応答が、ヒト抗体又はヒトに適合した抗体がそのようなヒトに投与されたときに得られる応答と同様であることを意味する。ヒト抗体又はヒトに適合した抗体は、処置されたヒトの５−１０％において応答を誘発することが知られている。免疫応答の誘発において、あるバックグラウンドレベルの「ノイズ」があるので、ヒトから単離された抗体でさえこのことが要当する。免疫応答は、（体）液性又は細胞性、あるいはその両方であり得る。特に、サイトカインの上昇したレベルを、個々のこのパーセントにおいて見つけることができる。
【００４４】
語句「ＲＳＶ Ｇタンパク質の保存された領域（conserved region of the RSV G protein）」とは、ＣＸ３Ｃ領域のいずれかサイドに５０個以内のアミノ酸、好ましくは、３０個以内のアミノ酸、更に好ましくは、２０個以内のアミノ酸を含むアミノ酸配列を意味し、図２Ａに、特定のストレインについて示される。保存された領域は、ＣＸ３Ｃ−特異的領域からのＧタンパク質の上流部分において主に延在する。従って、ストレインＡ２のＲＳＶ Ｇタンパク質をモデルとして使用する場合には、本発明の抗体に適用可能な保存された領域は、およそ、１６０から１８８番目までの残基、好ましくは、１６０−１７６番目に延在する。
【００４５】
本発明の抗体は、いくつかの望ましい特徴を有する。第１に、それらは、複数のＲＳＶストレインからのＧタンパク質と免疫反応性であり、典型的には、Ａ型ストレイン及びＢ型ストレインの両方からのＧタンパク質と免疫反応性である。第２に、それらは、Ｇタンパク質に対して極めて高い親和性を有し、それらの中のいくつかは、＜２ｐＭの範囲内である。従って、本発明の抗体は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ、更に好ましくは、５００ｐＭ、更に好ましくは、１００ｐＭ又は５０ｐＭ、１０ｐＭ又は１ｐＭ、そして、これらの好ましい例示的な点（ないしポイント）の間の全ての値の親和性を有する。Ｆタンパク質に向けられた市販の抗体であるSynagis（登録商標）は、約５ｎＭの親和性を有することが確立されている。Ｆタンパク質に対するより高い親和性の抗体であるＮｕｍａｘ（登録商標motavizumab）は、約５０ｐＭの親和性を有するものと見積もられる。本発明の抗体は、治療剤（therapeutics）としての役割を果たす（ないし、振る舞う）優れた能力を示し、感染のピークにおいて、肺の中のウィルスの数を低下させる能力を発揮する。それらは、典型的には感染がその過程を過ぎた時点でも、この能力を発揮する。ＲＳＶ感染から回復しつつある被検体は、ウィルスを放出（shed）し続けることがあり、そのため、臨床後の期間（setting）において他のものを感染させることがあり得るので、このことは特に有用である。その抗体及びそのフラグメントは、肺における炎症を含む感染の症状も処置する。
【００４６】
本発明の抗体は、２つの実験的な仕方で取得される。１つのアプローチにおいて、Ｇタンパク質の保存された領域と免疫反応性となることが知られた上記の既存のモノクローナル抗体、１３１−２Ｇが、最初にシーケンスされ、次に、ヒトの定常領域を修正されたヒト可変領域（重鎖及び軽鎖の両方）と融合することによってヒトに適合化された。可変領域は、１３１−２Ｇ抗体由来の可変領域に対する高い相同性に基づいて選択され、次に、１３１−２Ｇ由来の高頻度可変性（hypervariable）のアミノ酸を取り込ませて修正した。そのようなヒトへの適合化の方法は一般的に知られているが、アミノ酸置換の正確な選択が決定できることを条件とする。１３１−２Ｇの場合には、オリジナルなハイブリドーマ系統は、１つを上回る軽鎖を発現するため、実際にはＲＳＶの保存されたモチーフに結合する原因となる１つの軽鎖の決定が必要である。これは、本発明の発明者らによって決定されており、１つの実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体１３１−２Ｇのヒトに適合した形態において例示される。
【００４７】
それに代わる他の方法において、本発明の抗体は、アメリカ合衆国特許７，４１３，８６８、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／０４５３９６及びＷＯ２００８／００８８５８（これらの全ては、引用によって本願に組み込まれるものとする）に開示の独占的市販の（proprietary）セルスポット（CellSpot、登録商標）方法を使用して、ヒトのドナーに感染した（ないし曝された）ＲＳＶから回収される。
【００４８】
この方法において、４０人のＲＳＶに感染したドナーのサンプルを解析し、［１回の］プロセスにおいて、１つの血液サンプルあたり、〜５００，０００個の抗体生産細胞を産出した。従って、総計では、Ｇタンパク質の保存された領域に特異的な抗体の生産のために解析された〜２０，０００，０００個の異なるＢ細胞があった。約１０％のドナーのみがＧａ／Ｇｂに特異的なクローン（すなわち、ストレインに独立的である）の有用な頻度を有し、そのようなクローンは、最大頻度の検体においてさえ、たった〜１／５０，０００細胞の比率で存在した。全体的には、所望の細胞の頻度は、〜０．００３％であり、標準的な方法によって回収するためには非現実的なほど低い頻度であるが、セルスポット（登録商標）を使用すれば容易に到達できる。図１は、２４人のドナーのＲＳＶ抗原に対する反応性のスペクトルを示す。この図において示すように、Ａ及びＢストレインの両方由来のＧタンパク質と交差反応性の抗体が発見されたこれらの個々でさえ、これらの抗体の罹病率（prevalence）は、Ｆタンパク質、あるいは、Ｇａ又はＧｂのみと免疫反応性の抗体のそれよりも低い。驚くほど多い数のクローンがＦ及びＧタンパク質の両方（「ｍｉｘ」と記載する）を認識するが、このことは共有された炭水化物の決定因子を認識するものと思われる。そのような抗炭水化物抗体の親和性は典型的には弱く、更なる考察から除外した。このドナーの集団内において発見された１ｐＭの親和性を有する最も親和性が高い抗体は、Ｇａ／Ｇｂに特異的なクローンの頻度が非常に小さい（〜１ｐｐｍ）ドナーの１人に由来する。すなわち、この高度に好ましいクローンの発見は、全てのドナー由来の全レパートリー（repertoire）の包括的なスクリーニングなしでは起こりそうになかったであろう。
【００４９】
このスクリーニングを実行するために、エプスタイン−バーウィルスでＢ細胞を不死化し、上記の方法に従って評価した（詳細は、実施例２参照）。成功裏のＢ細胞を確認（ないし同定）し、確認されたモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を取得し、シーケンスした。次に、これらを、哺乳類の細胞系列において、抗体を生産するように組み換え的に操作した。
【００５０】
Ｇタンパク質の機能の重要な視点（側面：aspect）は、５０番目の残基に近い他の（alternative）スプライシングサイトによって形成された該タンパク質の分泌形態「ｓ（Ｇ）」に存する。ウィルスがｓ（Ｇ）を欠くように操作することにより、肺浸潤細胞（pulmonary infiltrating cells）のレベルを減少させる結果となった(Maher, et al., Microbes Infect. (2004) 6:1049-1055)。その逆に、ｓ（Ｇ）によりマウスを初回抗原刺激（priming）すると、ＩＬ−５の生産及び、肺の好酸球増加（eosinophilia）を増強する(Johnson, et al., J Virol (1998) 72:2871-2880)。従って、ｓ（Ｇ）の活性を抑制することは、ＲＳＶの有効な処置に重要である。このゴールを達成することは、当該技術分野（例えば、アメリカ合衆国特許７，０８３，９５０）において一般的に知られているように、高い親和性の抗体を必要とする。中央の保存された領域が、免疫調節因子（immuno-modulatory agent）としてのｓ（Ｇ）の機能と特に関連するので、ｓ（Ｇ）に対する有効な抗体は、このモチーフをターゲットとすべきである。
【００５１】
被検体に感染したＲＳＶからのヒトＢ細胞のレパートリーの本願発明者らの調査は、ストレインＡ及びＢの両方からのＧタンパク質に結合する抗体（Ｇａ／Ｇｂと交差反応性の抗体）の調査において不偏（unbiased）である。調査が包括的である（４０人の被検体、〜５００，０００個のＢ細胞をそれぞれ調査した）ので、マッピングに適するリニア状（直線状）のエピトープと結合する全てのＧａ／Ｇｂと交差反応性の抗体が、中央の保存された領域内における互いにいくつか（a few）の残基内のエピトープを認識することは、著しい発見である。この領域は、図２Ｂ(Plotnicky-Gilquin, et al., Virology (2002) 303:130-137)に概説するように免疫原性が弱いことが知られており、本願が報告するこの領域に高い親和性のクローンの頻度が低いことと符合する。本願発明者らは、＞７５個のＲＳＶ単離体由来のＧタンパク質の公開された配列を調査することによって、この領域の更なる特徴付けを行った。該タンパク質のほとんどの残基は、このコレクションにおいて数個（several）から多数（many）の多型性を示す。２つの領域：ｓ（Ｇ）を形成する他の（alternative）スプライシングサイト、及び全てのＧａ／Ｇｂと交差反応性の抗体が結合する中央の保存された領域は、著しく多型性が無い（free）（図２Ｃ）。すなわち、本願発明者らは、決定的な（critical）機能性を指し示す高度に保存された領域も免疫原性が弱いことを発見した。種々のメカニズム、例えば、免疫システムの静止（rest）を示すための組織適合性の抗原との組合せで、この領域を効果的に表すことに適するタンパク分解性の近くの切断サイトの不在を、弱い免疫原性に関して考慮することができる。そのメカニズムが何であろうとも、この驚くべき結果：生存したこれらのウィルスがこの領域に対する低い免疫原性を示すことは明確である。そのため、本願発明者らは、適する抗体の受動的な移行（ないし受動的送達：passive transfer）によってこの領域に対する免疫システムの活性を増強することは、有効であると予測し、そして、このことは、本願発明者らの動物モデルのケースにおいて証明されている。他のスプライシングサイトは、等しく（ないし同様に）保存されていても、免疫原性が非常に低いことはなく、その重要性がｓ（Ｇ）の形成のみと関係することを示唆し、そのため、それを受動的な免疫療法の弱いターゲットにする。
【００５２】
ヒト又はヒトに適合した本発明の抗体の生産は、チャイニーズハムスター（Chinese hamster）の卵巣細胞、又は昆虫細胞などの他の真核生物の細胞系列における生産などの
従来の組み換え技術によって達成される。他には、技術が植物及びトランスジェニック動物（例えば、ウシのミルク）又は単一の細胞系由来の微生物、植物あるいは昆虫［細胞］における抗体を含む組み替え物質の生産のためにも知られている。
【００５３】
更に、抗体をコードするヌクレオチド配列を利用できるので、同様のエピトープ、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントに結合する関連するフラグメントを組み換え的に（あるいは、タンパク質それ自体のタンパク分解性の処理によって）生産することができ、その抗体は、単鎖の形態で生産することができる。組換え型の抗体の生産の操作に関する種々の技術は、本願発明の分野において知られている。
【００５４】
治療での使用のために、組み換え的に生産された抗体又はフラグメントは、適する賦形剤を使用して医薬組成物に処方され、標準的なプロトコルに従って投与される。医薬組成物は、それらの唯一の有効成分として、本発明のモノクローナル抗体又はフラグメント、特に、Ａ及びＢストレインの両方のＧタンパク質と交差反応性であるモノクローナル抗体又はフラグメントを有することができる。あるいは、１つがＡストレインのＧタンパク質とより強力に反応し、他の１つがＢストレインのＧタンパク質とより強力に反応する２つのモノクローナル抗体が唯一の有効成分であり得る。これらの全てのケースにおいて、Ｆタンパク質と免疫反応性の１以上の抗体、又は、ＲＳＶあるいは炎症に対して有効な他の治療剤を含む更なる治療剤が存在し得る。従って、ステロイド性及び非ステロイド性の両方の抗炎症性化合物などの抗炎症性剤を組成物に含ませることができる。これらの化合物は、ビタミンなどの栄養上の物質、又は抗体以外の任意の他の有益な化合物も含むことができる。
【００５５】
１つの実施形態において、感染に対する抵抗性を増加させるために、投与する製剤を使用するときに、補体含有Ｆｃ領域を含む完全抗体が採用される。典型的には、抗体は、ヒト被検体の０．０１−２０ｍｇ／ｋｇの投与レベル、又は０．０１−５ｍｇ／ｋｇの範囲内の量、あるいは、これらの範囲内の中間の量で投与される。１つの実施形態において、０．１−１．０ｍｇ／ｋｇの範囲における量が採用される。数日、数週間、又は数ヶ月隔てられた反復される投与は、有益であり得る。ブースター（追加免疫）は、１、２、５又は１０年後にも提供することができる。
【００５６】
他の実施形態において、ウィルス負荷を減少させるための治療上の効果のために、補体含有Ｆｃ領域を含有する完全抗体も採用される。そのようなプロトコルにおいて投与される量は、０．００１−５０ｍｇ／ｋｇの桁（ないしオーダー）であるか、もしくは、０．０１、１又は１０ｍｇ／ｋｇなどのこの範囲における中間の値が採用される。反復される投与も使用することができる。治療上の処置は、感染の診断後、できるだけ早急に投与されるが、数日内の投与も本発明の範囲内である。反復される投与も採用することができる。肺における炎症反応を減少させるために、抗体の免疫特異的フラグメントのみが採用される必要がある。投与量のレベルは、抗体全体（whole antibodies）についての投与量レベルと同様である。免疫特異的フラグメント及び抗体全体（entire antibodies）の混合物の投与も本発明の範囲内に含まれる。
【００５７】
本発明の抗体組成物の投与は、典型的には、注射、一般的には、静脈注射による。そのため、非経口的な投与が好ましい。しかしながら、任意の実施可能な投与の形態が含まれる。
【００５８】
製剤（formulations）は、抗体組成物の投与に関する分野で一般的に知られた方法で調整される。適切な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版, Mack Publishing Co., Easton, PA（引用によって本願に組み込まれる）などの、一般的なフォーミュラリー（formularies）において見つけることができる。典型的には、製剤（formulations）は、バッファー、抗酸化剤などを含む等張液、並びに、リポソーム、ミセル、ナノ粒子などの送達ビヒクルを含むエマルジョンを含む非経口的な投与に適するものである。
【００５９】
所望の（投与）プロトコル及び製剤は、処置する医者の判断、並びに、被検体の特異的な状態に依存する。投与量のレベルは、適正であれば、被検体の年齢、通常の健康状態、そして、感染の重症度に依存する。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定しない。
［実施例１］
１３１−２Ｇのクローニングおよびヒトへの適合化
【００６１】
モノクローナル抗体１３１−２Ｇのクローニングおよびシーケンシング。
製造元の指示（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット: Qiagen Santa Clarita, Ca）に従って、全ての（total）ｍＲＮＡを１３１−２Ｇハイブリドーマから抽出した。ＩｇγのＶＨ１からＶＨ７の遺伝子ファミリーをターゲットするように設計（ないしデザイン）した７個のファミリー特異的な５´ＶγＦＲ１プライマー、及び１個のコンセンサス３´Ｃγ１プライマーを１３１‐２Ｇ重鎖の可変領域の増幅およびシーケンスに使用した。１個のコンセンサス５´Ｖｋプライマーを、各Ｖｋファミリーを増幅するように設計し、１個のカッパー定常領域に特異的な逆（reverse）プライマーを、カッパー軽鎖の増幅とシーケンスに使用した。ＶＨおよびＶＬ転写産物を１００ｎｇの全てのＲＮＡから、逆トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction)を用いて増幅した。
【００６２】
１３１‐２Ｇハイブリドーマについて：１つはカッパー軽鎖（κ）に、そして、１つは、ガンマ重鎖（γ１）に、２つのＰＣＲ反応を実行した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ワンステップＲＴ‐ＰＣＲキットを増幅に用いた（Qiagenカタログ番号210212）。抽出したＰＣＲ産物を特異的な定常領域プライマーを使用して直接シーケンスした。Ｖ‐ＢＡＳＥ２を使用して、そして、マウスの生殖系列データベースに対するＶＨおよびＶＬ遺伝子のアライメントによって、得られた配列をＩｇＶ−およびＪ−領域の公知の生殖系列｛せいしょく さいぼう けいれつ｝ＤＮＡ配列と比較した。シーケンス解析：ヌクレオチド配列情報から、１３１‐２Ｇの重鎖及び軽鎖のＶ及びＪ遺伝子セグメント（分節）に関するデータを得た。配列データに基づいて、１３１‐２ＧのＩｇＶＨおよびＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセット（複数）を設計した。Ｖ遺伝子の使用および配列解析：１３１‐２Ｇの重鎖遺伝子は、ＶＨ１生殖系列遺伝子ファミリー由来であり、Ｄ領域の生殖系列遺伝子はＤＳＰ２．２であり、そしてＪ領域はＪＨ３生殖系列由来であった。軽鎖遺伝子は、生殖系列遺伝子ファミリーである、Ｖカッパー１（Ｋ１Ａ５）及びＪカッパー４由来であった。
１３１−２Ｇは、以下に示すＩｇＨ−ＶＪ５５８ＶＨｌファミリーのＶセグメントを使用する：
１３１−２Ｇは、以下に示すＩｇκＶ１サブグループのＶセグメントを使用する。
【００６３】
１３１‐２Ｇモノクローナル抗体のヒトへの適合化。
抗体（Ａｂ）の、そのコグネイトの（cognate）抗原（Ａｇ）への結合は、高度に特異的な相互作用である。この特異性は、抗体結合サイトと抗原決定因子の間の構造的な相補性に起因する。抗体結合サイトは、主に高頻度可変（hypervariable）、又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）からの残基で構成され、時折、非高頻度可変（non-hypervariable）（又はフレームワーク：framework）領域からの残基が、全体ドメイン構造（overall domain structure）に影響を及ぼし、そして、それにより、結合サイトに影響を及ぼす。
【００６４】
マウスのＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーは、ヒトのレパートリーの２倍のサイズであり、ヒトＩｇＨ遺伝子座に比べて、より機能的な遺伝子を含む。マウス及びヒトの遺伝子座は、お互いに広範囲の類似性を有さない。ＶＨおよびＶＬドメインの最初の（first）２つのＣＤＲｓは、カノニカル構造として知られる主鎖構造の小さい（small）レパートリー構造を有する。特定のカノニカル構造の存在は、主に、ＣＤＲｓの長さ、及び、配列中の特定のサイトにおける鍵となる残基（key residues）の存在によって決定される。ＶＨ１ファミリー（ＶＨ１ １‐２）の同一のカノニカル構造の組み合わせは、ヒトのＶＨ１とマウスのＶＨ１ファミリーのメンバー間で共有される。１３１‐２Ｇの重鎖及び軽鎖の配列解析と、１３１‐２ＧがＩｇＨ−ＶＪ５５８ＶＨ１ファミリー及びＩｇκ１ファミリーのＶセグメントを使用するという事実とに基づいて、両鎖を整列させ（aligned）、ヒトＶＨ１及びＶＫ１ファミリーのメンバーと比較した。配列の相同性は、ヒトＶＨ１‐８及びＶｋ１‐１８の生殖系列配列に対して、それぞれ７０％及び７７％の同一性になることを見出した。これらの生殖系列を、ヒトに適合した１３１‐２Ｇモノクローナル抗体（mAb）のヒトのフレームワークとして選択した。
【００６５】
モノクローナル抗体１３１‐２Ｇのエピトープマッピング。
ＲＳＶ溶解物及び精製したＧａタンパク質を使用したウエスタンブロット分析は、１３１‐２Ｇがリニア状エピトープを認識することを示唆した。１３１‐２Ｇの結合ドメインを、ＲＳＶ‐ＧＡ２タンパク質配列由来の重複するペプチドのセットを使用してマップさせた。図２Ａは、保存されたＣＸ３Ｃモチーフの位置を含むＧタンパク質配列を示す。詳細なエピトープマッピングを得るために、１つの残基ずつシフトした１２‐ｍｅｒ（１２量体）のＧａ由来ペプチドのファミリーについて、スキャンを実行した。そのようなペプチドのアレイを、１μｇ／ｍｌの１３１-２Ｇモノクローナル抗体でプローブした。１３１‐２Ｇの結合を、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識抗体と、スーパーシグナル化学発光検出システム（super signal chemiluminescence detection system, Pierce, Rockford IL, USA）とを組み合わせて検出した。図３に概説するように、１３１‐２Ｇ抗体は、ＲＳＶ-Ｇａタンパク質の残基１５７から１７６までにわたる、８つの連続したペプチドと反応する。１３１‐２Ｇによって認識されるエピトープは、ペプチド配列（１５７）ＳＫＰＮＮＤＦＨＦＥＶＦ（１６９）及び（１６９）ＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩ（１７６）の内である。８つのペプチドからの共通配列に基づいて、１３１‐２Ｇの結合ドメインを、残基１６４−１６８にマップさせた。
【００６６】
３つの方法を、１３１‐２Ｇ及び類似する（analogous）ヒトモノクローナル抗体の親和性を特徴付けるために使用した。第一に、結合シグナルを、ＥＬＩＳＡ様式において、固定した量の抗体の段階希釈物に対するプローブについて測定した。この滴定曲線の中間点（midpoint）は、親和性の近似値である。１３１‐２Ｇの場合には、中間点は４ｎＭである。第二に、１３１‐２Ｇの親和性を、商業的な分析実験室において、オンレートとオフレートの割合に基づいてＢｉａｃｏｒｅ分析によって測定して、親和性を、７ｎＭとして算出した。第三に、セルスポット（登録商標）ビーズに担持したＧａタンパク質（the Ga protein on Cell Spot（登録商標） beads）の血清アルブミンでの希釈物は、多数のコピーのタンパク質が抗体フットプリントと相互作用する機会を減少させる。結果として起こる生の(raw)シグナルからの多座配位の結合活性効果（multi-dentate avidity effects）の抑制は、公知の基準に対しクローンのセットの親和性に関する順位付けを可能にする。この親和性の測定は、ヒト抗体を１３１−２Ｇと比較すること、及び高い親和性のクローンを効率よく選択することに使用することができる。これら全ての方法は、Ｇタンパク質抗原の一貫したソースの利用可能性によって改善される。本願発明者らの初期の研究では、抗原は、ウィルス感染細胞から抽出された。この仕方で調製した抗原の品質の可変性に起因して、本願発明者らは、Ｇタンパク質生産のための組み換え発現システムを開発したが、それは、より信頼性があることが証明された。
［実施例２］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対する抗体を分泌するヒトＢ細胞の単離
【００６７】
ＲＳＶ感染が確認された４０人の成人からの末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells：PBMCs）を、抗ウィルス抗体を生産するヒトＢ細胞について調査した。ＲＳＶ付着Ｇタンパク質に対する所望の抗体を有する被検体を、抗ＲＳＶ‐Ｇ特異的モノクローナル抗体のクローニングに使用した。調査の結果は、〜１０％の被検体が１／１０００００を上回る所望の細胞の頻度を有したものであった。しかしながら、低い頻度の被検体であっても目的の被検体であり、実際には、確認（ないし同定）した最も高い親和性の抗体は、所望のＢ細胞のタイプの頻度が非常に低いドナー（〜１ｐｐｍ）から由来した。
【００６８】
まれで好ましい細胞の調査及び回収を達成するために、本願発明者らは、上述のセルスポット（CellSpot登録商標）技術を使用した。セルスポット（登録商標）アッセイ法は、単一の細胞から分泌されるＩｇＧを、細胞の近隣にフットプリントとして捕らえることによって、ＥＬＩＳＡ相当のアッセイを単一の細胞の寸法に近い実際上の（virtual）ウェルにまで効率的に縮小する。結果として、何百万の細胞を容易に解析することができる。更には、顕微鏡多重化試薬（microscopic multiplexing reagents：組み合わせで着色した蛍光ラテックス微小球、ＵＳ６,６４２,０６２参照）の使用によって、各クローンの分泌抗体のフットプリントを、複数の生化学的なプローブを用いて、特異性及び/又は親和性について詳細に特徴付けることができる。定量的アッセイの忠実度は、オリジナルの確認アッセイと一致する表現型を示すクローン化された発現細胞を含む調査集団から極めてまれで好ましい細胞の回収を可能にすることに十分である。
【００６９】
スクリーニングの基準は、２つの主要なストレインのファミリーの両方からのＧタンパク質（Ｇａ及びＧｂと表記する）に結合すること、かつ、Ｆタンパク質（他の主要なウィルスコートタンパク質）には結合しないことであった。クローンを順序付ける親和性の順位付けは、血清アルブミンでビーズに担持した抗原を希釈することによっても達成することができる。これは、分泌されたＩｇＧフットプリントに対する多座配位の（multi-dentate）結合の機会（「結合活性」効果：an "avidity" effect）を減少させるため、より高い内因性の親和性を選択する。Ｇタンパク質は、２つのＲＳＶストレインの一方或いは他方に感染したベロ細胞から精製した。
【００７０】
該方法は、ヒトＢ細胞に適用され、標準的な磁石分離法（magnetic separation method）を使用してＰＢＭＣｓからＢ細胞でない細胞を欠乏させる（なくする）ことによって開始する。細胞をＩＭＤＭ／２０％ＨＩ‐ＦＣＳに１×１０６（1e6）／ｍｌで再懸濁し、ＥＢＶ（感染したＢ９５‐８細胞の上清から直接ペレットにした）を、１：１００の希釈率で加え、そして細胞を３７℃で２時間インキュベートした。余分なウィルスを、そして細胞を洗い流し、ＩＭＤＭ（２０％ＦＣＳ、２０％巨大細胞腫馴化培地（Giant cell tumor conditioned medium）、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ‐１０）において調査するだけのために培養するか、又は、磁石ポジティブ選別を使用して表面ＩｇＧに関してさらに選別した。細胞を、２００‐３００細胞／ウェルで、放射線照射したヒト肺細胞（ＭＲＣ‐５、５０００細胞／ウェル）上で、ＩＭＤＭ（２０％ＨＩ‐ＦＣＳ、２０％巨大細胞腫馴化培地（Giant cell tumor conditioned medium）、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ‐１０）において培養した。培地を２−３日毎に補充した。ウェルの二分の一（one half）の内容物を６日目に、セルスポット（登録商標）において解析した。次に、調査アッセイによりポジティブの少数のウェルの残りの細胞を、同一の支持細胞及び同一の培養条件で、１０、５、１及び、０．５細胞／ウェルまでに希釈した。４‐５日後、これら限界希釈プレートをＥＬＩＳＡ又は、セルスポット（登録商標）によって再度アッセイした。
【００７１】
次に、限界希釈におけるポジティブウェルの内容物を、逆トランスクリプターゼ‐ＰＣＲを使用して抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを回収する処理に供した。ＰＢＭＣｓを解凍してからＲＴ‐ＰＣＲ介してコードするｍＲＮＡを回収するまでの全所要時間は、１０−１２日であった。
【００７２】
図４は、この実験からのイラスト的なデータを示す。好ましいドナー及び好ましくないドナーの血液サンプルのセルスポット（登録商標）プロファイリングの例を、パネルＡ及びＢ（図４Ａ、４Ｂ）に示す。パネルＣ（図４Ｃ）に、最初の検出における好ましいクローンのプロファイルを、その細胞由来の抗体をクローン化したｃＤＮＡで形質転換したＨＥＫ２９３細胞の子孫から分泌した抗体のパネルＤ（図４Ｄ）の増殖（replicate）プロファイルと共に示す。これらのプロファイルは、アッセイの正確性の範囲内で同一であり、好ましいクローンの回収が成功したことを示す。
【００７３】
図１に示すように、抗ＲＳＶ抗体の大部分は、Ｆタンパク質、又はＦとＧとに共通する抗原決定基（ほとんどのものは、２つのタンパク質が配列相同性を有さないため、おそらく炭化水素である）に向けられる。大半がＧａ又はＧｂにのみ結合するＧタンパク質特異的抗体の［配列変動性：sequence variability］は、公知のＧタンパク質の高い配列変動性と符合する。全体的には、〜２０００万の個々のＢ細胞を調査した。１２個の最も有望な抗体をＲＴ−ＰＣＲによって回収した。かくて、全体的には、好ましいクローンの頻度は、１００万分の１未満であり、そして５０００万を上回るＥＬＩＳＡ相当のアッセイが、これらのまれなクローンを発見するために必要であった。従って、セルスポット（登録商標）技術は、他の方法で可能であろうよりも、より包括的なクローンの調査を可能にした。結果として得られたクローンの品質は、より限定的なスクリーニングによって発見されたクローンの品質よりも優れており、高品質なセットのクローンのコンセンサスな特徴は、所望の抗体の予測されない特徴を明らかにする。
［実施例３］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対するヒト抗体のクローニング
【００７４】
再配置された（rearranged）Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の遺伝子のポジティブのＥＬＩＳＡウェルからの増幅は、セミネステッドポリメラーゼ連鎖反応（semi-nested PCR）を使用して行った。ア・プリオリに未知のＶ遺伝子の再配置物の増幅のために、ヒトのＩｇ遺伝子座（Ig Locus）におけるほとんど全てのＶ遺伝子セグメントを認識するファミリー特異的Ｖ遺伝子プライマーのコレクションを構築した。５´プライマーを、Ｃγ、Ｃκ及びＣλの遺伝子セグメントに特異的なプライマー混合物と一緒に使用した。限界希釈したＲＳＶ‐Ｇ特異的Ｂ細胞のクロナリティー（clonality）を、異なった（distinct）子孫の細胞由来のＶ遺伝子増幅産物の配列比較によって明確に（ないし一義的に：unequevocally）決定し、そして増幅した全長のＶ遺伝子の再配列物を、ＩｇＧ発現ベクターにクローン化した。この方法は、また、Ｖ−、Ｄ−、及びＪ−遺伝子の使用、そして、体細胞変異体の存在及びパターン（化）などの、更なる問題（issues）に取り組むことにも有用であった。
【００７５】
方法
単離したヒトＢ細胞由来の全体の（total）ｍＲＮＡを、商業的に入手可能なＲＮＡ精製キットを使用して抽出した（RNeasy；Qiagen（Germany））。逆転写‐ＰＣＲを、全体の（total）ＲＮＡ調製物と、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドとを使用して実行した。各サンプルについて３つのＰＣＲ反応を実行した：１つは軽鎖カッパー（κ）、１つは軽鎖ラムダ（λ）、そして１つはガンマ重鎖（γ）について実行した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２１０２１２）を増幅に使用した。一組の（coupled）ＲＴ−ＰＣＲ反応において、ｃＤＮＡを、ＲＴ酵素（Omniscript（登録商標）及び、 Sensiscript（登録商標））の固有の配合（unique blend）で、Ｃ‐κ、Ｃ‐λ、又は、Ｃ‐γ遺伝子のＣＨ１領域のコンセンサス［配列］と対応するアンチセンス配列に特異的プライマーを使用して合成し、ＲＴを、５０℃で１時間実行し、次にｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、高い特異性及び感度のため、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって行った。各ＰＣＲ反応は、５´センスプライマーの混合物を使用した。プライマー配列は、ＶＨ、ＶＫ及び、ＶＬのリーダー配列に基づいた。ＰＣＲ反応は、最初のホットスタートを９５℃で１５分間で行い、次に、９５℃で３０秒間（変性）、６０℃で４５秒間（アニーリング）、そして７２℃で１分間（伸張）の２０サイクルを行った。
【００７６】
検出のためのネステッドＰＣＲ及び可変Ｉｇフラグメントの発現ベクターへのクローニング
第２ラウンドにおいて、５μｌの最初の増幅反応のアリコットを適用した。使用したプライマーは、５´ＢｇｌＩＩの制限サイト、及び３´ＸｂａＩの制限サイトを有する。３０回のＰＣＲサイクルを実行した。増幅の第１ラウンド及び第２ラウンドに、同一の条件を使用した。５マイクロリッターの各反応物を、１％アガロースゲル上に載せて分離し、そして、次に、エチジウムブロマイドで染色した。Ｖ‐Ｃ ＰＣＲ産物は、それぞれ５００及び４５０ｂｐのＶＨ及びＶＬの再配置したフラグメントを増幅することが予測される。およそ５００ｂｐの分子サイズを有するＰＣＲバンド（複数）はポジティブの結果を示した。ＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎゲル精製キット、カタログ番号２８７０４）、そして、抽出したＰＣＲ産物を、特異的な定常領域プライマーを使用して直接的にシーケンスした。クローン化したフラグメントの配列を、組み換え体の生産のために調製したプラスミドをシーケンスすることによって確認した。
【００７７】
図５Ａは、可変領域、Ｄ及びＪ結合領域、フレームワーク（ＦＲ）、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒト被検体から単離した本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列、並びに、ヒトに適合した１３１‐２Ｇの重鎖のアミノ酸配列を示す。Ａストレイン由来のＧタンパク質のみと免疫反応性である抗体３Ｆ９を除く全てのリストした抗体は、Ａ及びＢストレインの両方から由来のＧタンパク質と免疫反応性である。図５Ｂは、これらの抗体の軽鎖に関する類似の配列情報を示す。配列のリスト中のダッシュ（Dashes）は、異なる長さの遺伝子配列のアライメント補正を表す。
【００７８】
哺乳類細胞におけるインビトロの抗体生産のために、上記のＰＣＲフラグメントを消化し、ヒトガンマ１、またはヒトカッパー又はラムダの定常領域を有する個々の発現ベクターにクローン化した。重鎖及び、軽鎖をコードする発現ベクターを２９３（ヒト腎臓）細胞系列（Invitrogen）に共形質転換（co-transfected）した。発現プラスミドを、陽イオン性の脂質ベースの形質転換試薬（293 fectin（登録商標）;Invitrogen）を使用して導入した。各形質転換反応に関して、２０μｇの精製したプラスミドおよび、４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を、［それぞれ］１ｍＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（登録商標、Invitrogen）に混合して、結合する前に５分間室温でインキュベートし、そして、２０分間室温で複合体を形成させるようにした。ＤＮＡ‐２９３ｆｅｃｔｉｎ複合体を、９０ｍｍペトリプレートに蒔いた３×１０６の細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。最終工程において、上清を形質転換から７２時間が経過した後に遠心（３,０００ｇ、１５分間、４℃）によって回収して、分泌抗体を回収した。
［実施例４］
本発明の抗体のエピトープマッピング及び親和性の決定
【００７９】
前述の先行技術（prior art）の抗体１３１‐２Ｇのエピトープマッピングに関する実施例１に記載の技術を使用して、本発明の抗体に対応するエピトープを決定した。本発明の抗体の親和性は、１３１‐２Ｇモノクローナル抗体に関する実施例１に記載の方法を使用して決定した。
【００８０】
下記の表１に示すように、３つの抗体は、立体構造的なエピトープに結合する‐すなわち、それらは重複するペプチドを結合することによっては、マップしない。特異的な配列をマップする本発明の抗体を表１に示す。測定したオンレート及びオフレートから算出してｐＭで示した組み換えＧａタンパク質及びＧｂタンパク質に関する標準的なＢｉａｃｏｒｅアッセイを使用して決定した親和性定数も示す。これら抗体の２つのデータを図６に示す。パネルＡ、Ｂ及びＣ（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）は、３Ｇ１２の結合データを示し、パネルＤ、Ｅ、およびＦ（図６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ）は、３Ｄ３のデータを示す。上段の列は、抗体を用いたバイオセンサーチップのローディングを示し、中段の列は、チップにＧａタンパク質を横切って流した後に、バッファーで洗浄することから上昇するシグナルを示し、下段の列は、Ｇｂタンパク質に関する同様の結果を示す。シグナルの増加（上昇）は、オンレートの算出を許容し、一方では、洗浄中の減少は、オフレートの算出を許容する。オフレートに対するオンレートの割合は、親和性定数、Ｋｄである。
［表１］
＊１３１−２Ｇと同一のエピトープ
［実施例５］
Ｇタンパク質との結合に対するウィルス粒子（Virions）との結合の比較
【００８１】
図７は、標準的な西洋ワサビペルオキシダーゼアッセイを使用した、生ウィルスを採用して、結合を評価するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。様々なソースからのウィルスのプレップ（preps）を、１０５ＰＦＵ／ウェル以上の濃度で、ｐＨ９．６の炭酸塩バッファー中で、４℃オーバーナイトで、プレートの表面をコートすることに使用した。プレートを、ＰＢＳＴを含む５％ミルクで、１時間、室温でブロッキングした。抗体の段階的（serial）希釈液をウェルに、１時間室温でブロッキングバッファーにおいて加えた。検出のために、ヤギ抗ヒトＦｃガンマ‐ＨＲＰ（Jackson Immuno.）の１：２０００希釈物をブロッキングバッファーに１時間室温で加えた。プレートをＰＢＳＴで、十分に洗浄した。基質ＴＭＢのターンオ−バーを４５０ｎｍで測定した。図７で示すように、３Ｄ３は、いくつかの他の本発明の抗体と同様に、良く生ウィルスに結合する。実質的に弱い親和性を有するＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、抗体濃度１０４ｎｇ／ｍｌでさえ、生ウィルスに対してほんの少ししか結合しないことを示す。図８は、ウィルス粒子に対する結合と比較したときの、組み換えタンパク質に対する結合の相関関係を示す。
【００８２】
図９Ａ及び９Ｂは、上記のアッセイを使用した、本発明の抗体のストレインＡ２対Ａ５への結合の比較上の能力を実証するグラフである。図９Ａは、３Ｄ３及び３Ｇ１２が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と比較してストレインＡ２に良く結合することを示す。ＰＡＢは、全てのＲＳＶタンパク質に対する市販のポリクローナルのヤギ抗体である（Chemicon、カタログ＃ＡＢＩ１２８）。
【００８３】
図９Ｂは、これらの抗体がストレインＡ５にも結合することを示す（注、Ｘ軸の単位は、図９Ａと異なる）。同様の実験（複数）は、本発明の抗体が、多種の臨床上の分離物に結合することを示す。
［実施例６］
中和アッセイ
【００８４】
選択した本発明の抗体のインビトロにおけるウィルスを中和する能力を、標準的なプラークアッセイによって得た。ＨＥｐ２細胞を１２‐ウェルプレートに、２×１０５細胞／ウェルで蒔いた。次の日、抗体の段階希釈物を培地において産出した。およそ２００ＰＦＵ／ウェルのＲＳＶを、ウサギ補体血清の存在下で、１時間室温で抗体に加えた。次に、抗体‐ウィルスの混合物を、２００μＬ／ウェルの割合でＨＥｐ２細胞に加え、室温で２時間感染させた。この感染期間の後に、培地を取り除き、１％メチルセルロース含有培地を全てのウェルに加えた。プレートを３５℃で６日間インキュベートし、この期間の後に、以下のように、細胞を固定し、プラーク数の測定のために染色した。メチルセルロースを細胞層から吸引し、そして細胞を１００％メタノールで３０分間、室温で固定する。次に、プレートを３回、５％ミルク含有ＰＢＳで洗浄する。一次抗体（ヤギ由来抗ＲＳＶポリクローナル抗体（Chemicon Cat#AB1128））を１：５００の希釈率で、ＰＢＳ＋５％ミルクタンパク質に加え１時間保持する。プレートを３回、５％ミルク含有ＰＢＳで再び洗浄する。二次抗体（ImmunoPureペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））（Thermo Scientific, Cat#31402））を１：５００の希釈率で、５％ミルクタンパク質含有ＰＢＳに加え１時間保持する。プレートを３回、１×ＰＢＳで洗浄する。プラークを、２００μｌ／ウェルの１−ステップChloronaphthol substrate（Pierce, Cat#34012）を加え１０分間保持することによって、可視化する。プレートを水でリンスし、そして風乾する。各ウェルのプラークを計測する。
【００８５】
図１０は、ヒト抗体のμｇあたりのプラークの絶対数に関する結果を示し、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体を結果に含む。これらデータは、試験した抗体のデータを示し、３Ｄ３が最も強力である。この分析によれば、３Ｇ１２は、１５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０又は１００ｐＭの親和性を有するが、これに対して、市販の抗体であるＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）は、２ｎＭの親和性に相当する３００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）及び本発明の抗Ｇ抗体は、これらの条件下において、相乗的（synergistic）でないことを更に見出した。
【００８６】
図１１は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と比較した、ストレインＢに関する３Ｇ１２抗体の中和を示す。規格化した（normalized）データ（コントロールの％）は、１回の実験あたり、１６０‐１８０個のプラークの絶対数に基づく。インビトロにおいて、１ｐＭから５ｎＭまでの親和性を有する本発明の抗体（表１）は、１０‐１００ｎｇ／ｍｌの間のＥＣ５０値を有する。
［実施例７］
マウスでの抗Ｇ予防
【００８７】
本発明の抗体、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）及びヒトＩｇＧ１の、マウスにおけるＲＳＶ感染を防止する能力を試験した。感染前である−１日目に、コントロール群のマウスに培地及びＰＢＳを腹腔内に（i.p.）注射した。試験群に、０．１５、１．５及び、１５ｍｇ／ｋｇの抗体ｈＩｇＧ１（無免疫、アイソタイプコントロール）あるいは、３Ｇ１２、３Ｄ３又はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を注射した。これは、マウスあたり、およそ、３μｇ、３０μｇ及び、３００μｇに相当する。
【００８８】
０日目において、マウスに、１×１０６ｐｆｕのＲＳＶのｌｏｎｇストレインを経鼻投与によって接種した。０日目及び５日目に、肺、気管支肺胞洗浄（液）（bronchial alveolar lavage：ＢＡＬ）そして、血清を採取し、体重、肺重量、肺葉部（lung lobe section）におけるｐｆｕ、ウィルスの負荷（ｑＰＣＲによる）、肺の組織、白血球の総数、ＦＡＣＳ、そして、ＢＡＬのＩＦＮγを全て測定した。
【００８９】
図１２は、前述のリストからのプラークアッセイを使用した、ウィルスの肺負荷に基づく結果を示す。図１２のデータは、このアッセイにおいて、３Ｇ１２及び３Ｄ３が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と同等に有効であることを示す（Synagis（登録商標）の典型的なヒト投与量は、ヒトにおいて１５ｍｇ／ｋｇである）。
［実施例８］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対する抗体の治療効果
【００９０】
ＲＳＶ‐Ｇの保存されたモチーフに対する抗体は、治療効果を有することが示される。マウスを、０日目に、１０６ｐｆｕのＲＳＶを鼻腔内的に感染させ、次に、３日目に、３ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内に注射して処置し、そして、５日目及び７日目に、気管支肺胞洗浄（液）中のウィルスの負荷をアッセイした。このモデルにおいて、感染物はヒトに比べてより容易に自然に排除される。それにも関わらず、抗体の処置は、ＲＳＶに結合しないコントロール抗体と比較して、投与量依存的な態様で、ウィルス排除率の促進を引き起こす（図１３Ａ）。各処置群は５頭の動物を有し、結果は、統計的に有意である。
【００９１】
ＷＯ００／４３０４０に記載のように、サブスタンスＰに対する抗体は、ＲＳＶに起因する肺炎（ＲＳＶ感染の臨床上の重要な特徴である慢性化した病態の動物モデル）を軽減することに有益である。サブスタンスＰの上方への制御は、活性化Ｇタンパク質に依存する（Haynes, L. M., et al., J. Virol. （2003） 77：9831−9844）。本発明の抗体の処置の後に、炎症性ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞の総数の減少（図１３Ｂ）、並びに、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の減少（図１３Ｃ）を含む、肺炎の尺度（measures）の減少も観察されている。
【００９２】
更なる試験において、０日目に、マウスに１０６ｐｆｕのＡ型ＲＳＶ ｌｏｎｇストレインを鼻腔内投与によって接種した。
【００９３】
３日目において、４‐５匹のマウスの種々の群に以下の処置をした。
【００９４】
第１群：０日目に感染を受けず、ＰＢＳを処置したコントロール群。
【００９５】
第２群：０日目にＲＳＶ接種を受けて、そして３日にＰＢＳを処置したネガティブコントロール群。
【００９６】
第３群：０日目のにＲＳＶ接種を受けて、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体の生理食塩水溶液を腹腔内にマウスあたり１、１０又は１００μｇ、あるいは、０．０５、０．５又は５ｍｇ／ｋｇで処置した群。
【００９７】
第４群：０日目にＲＳＶを接種し、モノクローナル抗体３Ｄ３を第３群と同様のプロトコルで投与した群。
【００９８】
第５群：０日目にＲＳＶの接種を受け、３Ｇ１２を第３群及び４群と同一の量で投与した群。
【００９９】
肺、及びＢＡＬ液を、０日、３日、５日、７日、そして１０日目に採取した。更に、体重、肺重量、肺葉のｐｆｕ、ｑＰＣＲによるウィルスの負荷、肺組織、白血球の総数、ＦＡＣＳ、並びにＢＡＬのＩＦＮγを測定した。１０μｇのモノクローナル抗体を投与した群のｑＰＣＲの結果を図１４に示す。
【０１００】
図１４に示すように、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置および未処置のマウスのウィルス性の力価(titer)は、この比較的に低い抗体の投与量で同様の様態を示すが、これに対して、３Ｄ３を処置したマウス及び３Ｇ１２を処置したマウスは、感染のピークの５日目において、著しく低い力価を有した。この実験は、インビトロにおけるより高い親和性がインビボにおけるより高い効力（potency）と相関することを実証する。
【０１０１】
図１５は、７日目にｑＰＣＲによって測定したときに、３Ｇ１２及び３Ｄ３が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）よりも低い濃度において、ＲＳＶのコピー数を低くすることができたことを実証する投与量応答曲線を示す。３Ｄ３は特に強力であり、インビトロにおいて、より高い親和性を有することと再び一致した。
【０１０２】
同様に、図１６に示すように、１０日目にｑＰＣＲウィルス数を計測するときには、この時点において、ウィルス力価は、マウス免疫システムによる自然な排除に起因して、自然に非常に低いが、３Ｄ３は、様々な投与量の濃度において、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）よりもおよそ１００倍強力である。この実験は、抗原の濃度が低下した時でさえ有効であり続ける高親和性抗体の有用性を強調する。ヒトの病気の経過は、マウスよりもかなり慢性化するため、長い期間にわたりウィルスを中和し続ける抗体の使用に関する明確な動機を提供する。
【０１０３】
更なる実験において、マウス抗Ｇモノクローナル抗体又はマウス抗Ｆモノクローナル抗体をマウスに、４匹の群（複数）において処置し、各実験を３回繰り返した。マウスを、０日目に免疫化し、３日目に抗体で処置し、そして、様々な有効性の兆候を３、５、７日目に測定した。
【０１０４】
有効性の指標の１つとして、図１７に示す結果を有する３つの群における気管支肺胞洗浄（液）（ＢＡＬ）中の炎症細胞を測定した。肺あたりのＢＡＬ細胞（数）を、０から１４０×１０３までのＹ軸上にプロットする。結果は、抗Ｆモノクローナル抗体（anti-F mAb）は、アイソタイプコントロールである非免疫抗体と比較して、５日目での肺あたりのＢＡＬ細胞数を低減させたが、これに対し、抗Ｇモノクローナル抗体（anti-G mAb）は、ＢＡＬ細胞数を、実質的に更に［抗Ｆモノクローナル抗体よりも］低減させたことを示す。７日目までに、感染はその過程を進行していた。
【０１０５】
図１８Ａ及び、１８Ｂは、ペプシンでの切断及び固定したタンパク質Ａを使用したＦｃフラグメントの除去によって抗Ｇ抗体から得られた抗Ｇ Ｆ（ａｂ´）２と比較した抗Ｇモノクローナル抗体（マウス１３１‐２Ｇ）の有効性の比較を示す。インビトロでの抗Ｇ抗体の抗ウィルス効果にとって補体は重要であることを示す。このことは、抗ウィルス効果がｐｆｕ／肺組織重量（ｇ）として測定される図１８Ａにおいて確認される。アッセイは、実施例６のように実施した。補体媒介活性に必要であるＩｇＧのＦｃ部分を欠く抗Ｇ抗体のＦ（ａｂ´）２フラグメントは、ウィルスの負荷を低減させることにおいては、コントロールよりも全く優れないが、これに対して、抗Ｇモノクローナル抗体は非常に有効である。しかしながら、図１８Ｂに示すように、炎症を結果の測定として使用する場合には、抗Ｇモノクローナル抗体のＦ（ａｂ´）２フラグメントは、完全な抗体と同じ程度に十分に有効である。この実験は、Ｇタンパク質の中和は、気道炎症を低減することに重要な意味を持つことを実証する。ウィルスが活発に可溶型のＧタンパク質を分泌し、そして、高い親和性の結合が可溶性の因子の中和に重要であるため、本発明の高い親和性の抗体が抗炎症効果に対する特別な有用性を有することが予測される。
【０１０６】
図１９Ａ、Ｂ及びＣは、投与の時間の関数として、気道炎症のマーカーとしての役割を果たすサイトカインを用いたＢＡＬ中のＩＦＮγの生産に対する抗Ｇモノクローナル抗体の影響を示す。全てのケースのコントロール非免疫抗体は、気道炎症に伴うＩＦＮγ産生の増加を減少させない。しかしながら、抗Ｇモノクローナル抗体は、−１日（パネルＡ）又は３日目（パネルＢ）に投与されても、あるいは、５日目（パネルＣ）でさえも、ＩＦＮγレベルの著しい減少を７日目に結果として示す。この実験は、ウィルスの負荷のピークを十分に過ぎた炎症の処置のための、ＲＳＶ Ｇタンパク質の中心の保存されたモチーフに対する抗体の有用性を実証する。
［実施例９］
感染した被検体における内在性抗体の特異性
【０１０７】
重篤なＲＳＶ病を有する４人の高齢者、及び軽度のＲＳＶ病を有する６人の高齢者からの血清サンプルを、以下に示す、Ａ２ストレイン由来のＲＳＶ Ｇタンパク質の保存された領域を表す合成ペプチドを用いて免疫反応性に関して試験した。
アッセイを、実施例５に記載のＥＬＩＳＡプロトコルを使用して実行した。このペプチドと免疫反応性の抗体のレベルは、病気の重症度に相関し、ここで、病気の軽度の形態を有する被検体は、より重篤な感染の兆候を有する被検体よりも、非常に高い力価を発揮した（図２０参照）。これらの結果は、Ｇタンパク質のこの部分と免疫反応性の抗体が感染を改善することに有効であることを示す。
【関連出願の相互引用】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月２５日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０００，４６９、及び２００８年８月１５日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０８９，４０１の利益を主張する。これらの出願の記載内容は、引用によって本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ＲＳウィルス（respiratory syncytial virus：ＲＳＶ）由来のＧタンパク質に含まれる機能的に重要なエピトープと免疫反応性であり、ヒト被検体に投与される場合には、最小限の免疫原性（minimally immunogenic）である抗体に向けられる。これらの抗体は、ＲＳＶ感染に対するヒト被検体の抵抗性を増強すること、並びに、既に感染した個々の感染のレベルを減少させること、もしくはＲＳＶ感染に起因する症状を改善する（ameliorate）ことに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＲＳＶ感染は、アメリカ合衆国、ヨーロッパ、オーストラリア及び日本を含む世界的で、長年にわたり、かつ悪性の問題となっている。それは、特に、未熟児、児童及び高齢者、そして、実際には弱い免疫システムを有する全ての個人において問題である。１歳未満のおよそ３分の２の子供、及び１歳から４歳までの間のほとんど全ての子供がＲＳＶに少なくとも１度は感染し、ほとんどの［子供］が医療上の注意を必要とせずに回復したと見積もられる。しかしながら、５−１０％［の子供］が慢性化した重篤な感染（幼児期の後期における喘鳴（wheezing）及び喘息様の症状に関する病因（predisposing）となることが信じられる因子）を有する。ＲＳＶは、２つの主要な表面糖タンパク質、Ｆ及びＧを有する。ＲＳＶに対する唯一の市販のモノクローナル抗体は、未熟児におけるＲＳＶによる感染を防止するための予防的な使用のためのみに認可され、Ｆタンパク質に対して向けられる。この抗体、パリビズマブ（palivizumab, Synagis（登録商標）、MedImmuneから）は、Ｆタンパク質配列のストレイン（ないし株：strain）の間の保存のため、広範囲にわたって有用である。これに対して、Ｇタンパク質は、およそ１００個のシーケンスされたストレインにおいてほとんど不変（invariant）である中央の（central）「ＣＸ３Ｃ」ドメインを除いて、極めて可変（variable）である。この領域（ないし部位：region）は、フラクタルカイン(fractalkine)受容体と相互作用することが示されているモチーフを含む。その相互作用は、ウィルスに対する有効な（ないし効果的な）免疫反応を抑制することによって、ＲＳＶに特徴的な慢性化した病気の過程に対して寄与すると信じられている：Tripp, R. A, et al., Nature Immunology (2001) 2:732-738。この領域は、また、有効な免疫反応を抑制することに寄与すると再び（again）信じられているＴｏｌｌ−様受容体４（Toll-like Receptor 4）のアンタゴニスト（ないし拮抗剤）となることも示されている：Polack, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102: 8996-9001; Shingai, et al., Int'l Immunology (2008) epub July 8。
【０００４】
ワクチン接種によるＲＳＶの予防における最初の試みは、逆効果であることがわかった。増強された病気及び肺の好酸球増加（eosinophilia）が、ホルマリンで不活性化したＲＳＶ又はＲＳＶ Ｇ糖タンパク質を用いたワクチン接種と関連し、このことは、ケモカイン フラクタルカインを模倣するＣＸ３Ｃ領域が設計されたＧタンパク質における上記の保存された配列に起因している（Haynes, L. M., et al., J. Virol. (2003) 77: 9831-9844）。ストレインの間のこのタンパク質の配列の保存の欠如のため、Ｇタンパク質に向けられた抗体を使用する受動的な免疫化は、一般的には、非実用的であると考えられている。
【０００５】
その後、同一のグループによって、ＲＳＶ感染又はワクチン接種に起因する抗Ｇタンパク質抗体の応答が、Ｇタンパク質のフラクタルカインＣＸ３Ｃ受容体への結合の阻害及びＲＳＶ Ｇタンパクが質媒介した白血球走化性の調整と関連することが確認され(Harcourt, J. L., et al., J. I. D. (2004) 190:1936-1940)、そして、この結合の阻害がＴ細胞の応答に逆に影響を与えることが確認された(Harcourt, J. L., et al, J. Immunol. (2006) 176:1600-1608)。さらに最近のワクチン研究（efforts）は、ホルマリン固定ワクチンと関連した病気の悪化を回避しているが、新規のワクチンによって与えられた免疫は、急速に衰退すること（数週間から数ヶ月で）がわかっており、天然のＲＳＶに対する免疫的な記憶が弱いことと符号する：Yu, et al., J. Virol. (2008) 82:2350-2357。反復した感染は、多くの他のウィルスとは異なり、このウィルスに共通（common）である。Ｇタンパク質の免疫抑制的な特徴は、この影響に関する原因となり得る。
【０００６】
Ｇタンパク質に対して向けられたモノクローナル抗体は、２０年より前から知られている。Anderson, L. J., et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238は、Ｆ及びＧタンパク質モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の混合物、及び個々のモノクローナル抗体のＲＳＶを中和する能力を記載する。Ｇタンパク質への結合に関連するモノクローナル抗体、特に１３１−２Ｇが、Sullender, W., Virol. (1995) 209:70-79によって、抗原性の解析において、後に研究された。この抗体は、ＲＳＶの主要なストレインを表すＲＳＶ群Ａ及びＢの両方に結合することがわかった。
【０００７】
更に、Mekseepralard, C., et al., J. Gen. Virol. (2006) 87:1267-1273は、受動的に投与されたＦ及びＧタンパク質に対する抗体が、げっ歯類のモデルにおける実験上の感染に対して保護的であることを示す初期の諸論文を概説する。これらの文献は、Routledge, et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:293-303; Stott, E. J., et al., J. Virol. (1986) 60:607-613; Taylor, G., et al., Immunol. (1994) 52: 137-142; 及び Walsh, E. E., et al., Infect. Immun. (1984) 43:756-758を含む。上記文献において、Mekseepralardらは、インビトロにおいて補体の存在下で、又はマウスにインビボで使用した場合に、ウィルスを中和するために、Ｇタンパク質に対して生産された特異的なモノクローナル抗体（１Ｃ２）は、グリコシル化を必要としたことを記載した。該著者は、Ｇタンパク質の１７３−１８６番目のアミノ酸が保存され、１Ｃ２が保存された領域（ないし部位）に対して向けられたことを記載するが、非免疫性の抗体を調製する方法は、相対的に粗い、すなわち、マウスのＦａｂのヒトＦｃ領域へのキメラ化であった。
【０００８】
更に、Corbeil, S., et al., Vaccine (1996) 14:521-525は、マウスのモノクローナル抗体１８Ａ２Ｂ２を用いた受動的な免疫化の後に、補体系がＲＳＶによるチャレンジ（攻撃）からのマウスの保護に関与することを実証するが、この抗体はインビトロにおいて中和する能力を示さない。
【０００９】
ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ００／４３０４０は、ＲＳＶによる感染に関連する気道の炎症の改善における抗サブスタンスＰ抗体の使用を記載する。公知の炎症誘発性の媒介物質であるサブスタンスＰの生産は、ＲＳＶのＧタンパク質の投与によって増強され、Ｇタンパク質が欠損したＲＳＶの変異株、又は機能を喪失するポイントミューテーションを中央の保存された領域に保有するＲＳＶの変異株には存在しない：Haynes, et al., J Virol (2003) 77:9831-9844。
【００１０】
アメリカ合衆国特許公開２００６／００１８９２５は、Ｇタンパク質のＣＸ３Ｃ領域の、その受容体との相互作用をブロックすることができる抗体及び小さい（small）ペプチドを記載し、クレームしている。これらの組成物は、ＲＳＶ感染の調節及び免疫の誘導に有用であることが示唆される。これらの抗体の治療上及び予防的な価値の実証に採用されるマウス抗体のヒトへの適合化が示唆されるけれども、そのようなヒトに適合した形態は、実際には生産されず、又は記載されていなかった。
【００１１】
Symphogen（社）によるＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００７／１０１４４１は、ＲＳＶ感染の処置のための組換え型のポリクローナル抗体に向けられる。ポリクローナルな組換え型の抗体は、ヒトの血清から単離された個々のモノクローナル抗体から構成される。この出願公開の表５は、サブタイプＡのＲＳＶ Ｇタンパク質の１６４−１７６番目のアミノ酸における「保存された領域（ないし部位）（conserved region）」に結合すると言われる１２個のモノクローナル抗体を開示する。これらの５つがＧタンパク質に対する親和性に関して試験され、１００−５００ｐＭの範囲における親和性が発見された。これらの抗体の２つは、プラーク減少中和試験（plaque reduction neutralization test：ＰＲＮＴ）を使用して、中和能力に関して試験され、１つは、およそ２．５μｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示し、他の１つは、中和の特徴を全く示さなかった。
【発明の概要】
【００１２】
［発明の開示］
Ｇタンパク質に関する高い親和性及び強力な中和能力を有し、群Ａ及びＢの両方のストレインと免疫反応性である抗体を含み、Ｆタンパク質と比べた場合にＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体が、ＲＳＶに最近感染したことが確認されたヒトのドナーから確認（ないし同定）された。更に、マウスの抗Ｇタンパク質抗体（初めてAnderson, et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238によって開示された）は、ヒト被検体に投与された場合に、免疫的な拒絶の機会を最小化するように修正（ないし変更）されている。本発明の抗体は、ヒト被検体におけるＲＳＶに対する治療製剤として、そして、ＲＳＶ抵抗性を増加することにも有用である。特に、サブタイプＡのＧタンパク質の１６０−１７６番目の位置（positions）の内の保存されたモチーフに対する抗体は、既に感染した被検体からウィルスを除去する（ないしクリアする）ことにおいて、そして、ＲＳＶ感染に特徴的な気道炎症を減少させることにおいて、並びに予防的な使用に関して、治療上有効である。
【００１３】
従って、１つの視点において、本発明は、ＲＳＶのＡストレインのＧタンパク質のおよそ１６０−１７６番目の位置の内のエピトープに結合し、そして、ヒト被検体に投与された場合に最小限の免疫原性であるモノクローナル抗体又はその免疫反応性のフラグメントに向けられる。これらの抗体は、ＲＳＶの中和に関する標準的なプラーク形成アッセイにおいて中和能力を示し、＜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは＜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは＜１００ｎｇ／ｍｌのようなアッセイにおいて、ＥＣ５０を実証する。本発明の抗体は、＜１ｎＭ、好ましくは＜５００ｐＭ、さらに好ましくは＜１００ｐＭのＲＳＶ−Ａ２のＧタンパク質に関する親和性も有する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＲＳＶの複数の（multiple）ストレインにまたがる高度なアミノ酸の同一性を有する領域（ないし部位：region）におけるＲＳＶのＧタンパク質に含まれるＣＸ３Ｃケモカインモチーフの３０個の残基の内に、又は直接的に、該モチーフの少なくとも一部分（a portion）において結合する。ＣＸ３Ｃケモカインモチーフは、ストレインＲＳＶ−Ａ２のおよそ、１８２−１８６番目のアミノ酸の位置であり、他のストレインにおけるＧタンパク質の対応する位置（position）にある。本発明の抗体がその内で結合する関連する領域は、ＲＳＶ−Ａ２のＧタンパク質の１６０−１７６番目の残基の内、及び他のストレインにおけるＧタンパク質の対応する位置の内に含まれることがわかった。この領域は、Ａストレイン内に高度に保存され、Ａ及びＢストレインの間でいくつかの（a few）アミノ酸の違いしか含まない。特に高度に保存された領域は、ＲＳＶ Ａ２の１６４−１７６番目の位置における配列：ＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣを有する。好ましくは、本発明の抗体は、配列：ＦＥＶＦＮＦ、又は、配列：ＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣを含むエピトープに結合する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、アミノ酸同一性が保存されたこの領域と免疫反応性であるため、このウィルスの群Ａストレイン及び群Ｂストレインの両方のＧタンパク質と免疫反応性であり、従って、ほとんどのストレインのＧタンパク質と免疫反応性である。
【００１４】
ＲＳＶ感染を処置するまたはＲＳＶに対する抵抗性を強める本発明の方法の使用に関して、本発明のモノクローナル抗体又はフラグメントは、群Ａ及びＢの両方における複数（ないし多数：multiplicity）のストレインと免疫反応性であり得、そして単一のモノクローナル抗体は、所望の効果を有するために十分であり得る。或いは、処置されるべき、又は抵抗性が形成されるべき被検体は、単一［種類］（single）を上回るモノクローナル抗体を投与されることができ、ここで、特にプロトコル内の１つの抗体は、群Ａのストレインとより高い反応性を有し、他の１つは、群Ｂのストレインとより高い反応性を有する。
【００１５】
本発明は、本発明の単一の抗体又は免疫反応性のフラグメント、あるいは２つを上回らない本発明の抗体又はフラグメントを活性試薬として含む、炎症の改善を含む予防又は処置に有用な医薬組成物も含む。
【００１６】
本発明の他の視点は、ヒト被検体におけるＲＳＶを処置する、又はこれらの被検体における抵抗性を誘導する抗体を使用する方法を含む。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体は、組み換え的（recombinantly）に生産することができ、従って、本発明は、そのような生産のための組み換え物質、並びにこれらの抗体の生産のための細胞系列（cell lines）、又は不死化細胞、及びヒト以外の多細胞生物（ないし組織）もしくはそれらの細胞、あるいは細菌（microbial）細胞を含む。１つの実施形態において、ヒト被検体から得られた細胞は、「不死化した（immortalized）」形態で生産され、ここで、それらを特徴づけることができ、かつクローン化された配列をコードするために十分な期間、抗体の分泌が可能なように修正されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ヒト被検体由来の種々のＲＳＶ抗原に対する抗体のｐｐｍでの頻度を示すプロットである。所望のストレインに独立的な抗Ｇ表現型（Ｇａｂ）は、ほとんどまれ、全体的にはおよそ百万個あたりに１０個（parts per million: ppm）であり、ある被検体においては１ｐｐｍと同じぐらい低い。「混合型（Mix）」とは、Ｆ及びＧの両方に結合する抗体を意味し、Ｆ及びＧが配列の相同性を有さない場合に、結合は、おそらく、共有する炭水化物決定因子に起因する。
【００１９】
【図２−Ａ】図２Ａは、ＣＸ３Ｃ領域、及び保存されたジスルフィド結合の位置（location)を指し示すＲＳＶ Ｇタンパク質の図である。模式図のバージョンは、全てのストレインに包括的であるが、位置（position）の特異的な番号は、１つのストレインから次のストレインまでわずかに異なる。
【００２０】
【図２−Ｂ】図２Ｂは、ＲＳＶ Ｇタンパク質からの１２塩基のペプチドと重複するパネルに対するＲＳＶに曝された被検体由来の血清の結合をプロットし、中央の保存された領域に免疫原性が無いことを明らかにする。
【００２１】
【図２−Ｃ】図２Ｃは、Ｇタンパク質における位置の関数としての、７５個を上回るＲＳＶのストレインのコレクションに関する多型性の頻度をプロットし、中央の保存された領域における、そして、Ｇタンパク質の可溶形態を形成する他のスプライシングサイトにおける著しい保存を明らかにする。
【００２２】
【図３】図３は、重複する配列を有するペプチドのアレイに対するイラスト的なマウスのモノクローナル抗体（１３１−２Ｇ）のプローブの結果を示す。この実験は、モノクローナル抗体が結合するエピトープを確認（ないし同定）する。図示した例において、エピトープは、ＣＸ３Ｃモチーフの３０残基内（within）にある。
【００２３】
【図４−Ａ】パネルＡ（図４Ａ）は、２人のドナー由来の血液の概略のプロットを表す。パネルＡは、Ｇａ／Ｇｂ交差反応性のクローンの有用な頻度を有するドナーを示す。プロットにおける各点は、単一のクローンの分泌された抗体フットプリントに関する３つのプローブへの相対的な結合を示す。
【図４−Ｂ】パネルＢ（図４Ｂ）は、２人のドナー由来の血液の概略のプロットを表す。パネルＢは、Ｇａ／Ｇｂ交差反応性のクローンの有用な頻度を有さないドナーを示す。プロットにおける各点は、単一のクローンの分泌された抗体フットプリントに関する３つのプローブへの相対的な結合を示す。
【図４−Ｃ】パネルＣ（図４Ｃ）は、単一のＥＢＶで形質転換されたＢ細胞の分泌したタンパク質のフットプリントの数値化した（ないし定量化した）プロファイルである。
【図４−Ｄ】パネルＤ（図４Ｄ）は、パネルＣの細胞からの抗体遺伝子で形質転換されたＨＥＫ２９３細胞由来の４つの子孫の細胞のプロファイルを示す。このプロファイルは、パネルＣにおける特性と一致し、パネルＤにおいて、複製のものによる定義されたようなアッセイの精度の内にある。
【００２４】
【図５−Ａ】図５Ａは、代表的な本発明の抗体の重鎖（パネルＡ）の配列を示す。
【図５−Ｂ】図５Ｂは、代表的な本発明の抗体の軽鎖（パネルＢ）の配列を示す。
【００２５】
【図６−Ａ】図６Ａは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＡ（図６Ａ）は、センサーの表面への抗体の結合を示す。
【図６−Ｂ】図６Ｂは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＢ（図６Ｂ）は、Ｇａタンパク質が表面を横切って流れ、そして結合した抗体によって捕獲された場合のセンサーの信号の増加を示し、その後、結合したＧａタンパク質が表面から離脱するように表面がバッファーで洗浄された場合の信号の衰退を示す。
【図６−Ｃ】図６Ｃは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＣ（図６Ｃ）は、パネルＡ及びＢ（図６Ａ及びＢ）と同様にＧｂタンパク質に関するオンレート（on-rate）及びオフレートを示す。
【図６−Ｄ】図６Ｄは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＤ（図６Ｄ）は、センサーの表面への抗体の結合を示す。
【図６−Ｅ】図６Ｅは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＥ（図６Ｅ）に示すように、抗体３Ｄ３は、Ｇタンパク質に結合し、辛うじて検出可能なオフレート（off-rate）を示さない。パネルＥ（図６Ｅ）は、Ｇａタンパク質が表面を横切って流れ、そして結合した抗体によって捕獲された場合のセンサーの信号の増加を示し、その後、結合したＧａタンパク質が表面から離脱するように表面がバッファーで洗浄された場合の信号の衰退を示す。
【図６−Ｆ】図６Ｆは、本発明の２つの抗体の親和性の測定のＢｉａｃｏｒｅを用いた結果を示す。パネルＦに示すように、抗体３Ｄ３は、Ｇタンパク質に結合し、辛うじて検出可能なオフレート（off-rate）を示さない。パネルＦ（図６Ｆ）は、パネルＤ及びＥと同様にＧｂタンパク質に関するオンレート（on-rate）及びオフレートを示す。
【００２６】
【図７】図７は、マイクロプレートをコートするために生きたウィルスを使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定された、Synagis（登録商標）Ｆタンパク質結合抗体と比較したときの種々の本発明の抗体の結合のグラフである。
【００２７】
【図８】図８は、Ｘ軸のＧタンパク質への親和性に対してＹ軸のウィルスへの結合をプロットするグラフである。２つの能力は相関するが、但し、３Ｄ３は、Ｇタンパク質へのその親和性から予測されるだろう親和性よりもわずかに少ない生きたウィルスへの親和性を示す。
【００２８】
【図９−Ａ】図９Ａは、ストレインＡ２へのいくつかの抗体の結合の比較を示す。
【図９−Ｂ】図９Ｂは、ストレインＡ５へのいくつかの抗体の結合の比較を示す。
【００２９】
【図１０】図１０は、中和アッセイの結果を示す。結果は、抗体のμｇに対してプロットされたプラークの数で示される。
【００３０】
【図１１】図１１は、ＲＳＶストレインＢの中和における本発明の抗体３Ｇ１２とSynagisの比較を示す。
【００３１】
【図１２】図１２は、本発明の２つの抗体とSynagis（登録商標）市販抗体の予防的な活性の比較を示す。
【００３２】
【図１３】図１３Ａ−Ｃは、ＲＳＶの感染後モデルマウスにおけるモノクローナル抗体１３１−２Ｇの治療上の有効性を示し（感染の＋３日後の処置）、減少した肺炎の他の測定値（ないし尺度：measures）：ＮＫ細胞及びＰＭＮ細胞（パネルＢ）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）（パネルＣ）の減少、に伴うウィルス負荷の投与量依存的な減少を含む（パネルＡ）。
【００３３】
【図１４】図１４は、本発明の抗体の高い親和性の効力の利点を強調する、３Ｇ１２、３Ｄ３又はSynagis（登録商標）の抗体を低い投与量で処置したモデルマウスにおけるウィルス性の力価(titer)のタイムコースを示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、感染の＋３日後に処置した場合のＲＳＶ感染マウスの肺におけるＲＳＶのコピー数に対する抗体の影響を測定する投与量／応答曲線である。
【００３５】
【図１６】図１６は、感染の＋３日後の処置の後、感染の最後の段階でウィルス負荷を減少させる、Synagis（登録商標）、３Ｄ３及び３Ｇ１２の比較した能力を示す。
【００３６】
【図１７】図１７は、ＲＳＶ感染マウスの肺におけるＢＡＬ細胞に対するコントロール抗体、抗Ｆ抗体及び抗Ｇ抗体の影響を示す。処置は、感染の＋３日後の処置であった。
【００３７】
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、感染の＋３日後に投与された場合に、ＲＳＶ感染マウスにおける炎症の減少において、抗Ｇモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２に特異的なフラグメントが完全な形の（ないし無傷の：intact）モノクローナル抗体と同じ程度に有効であるが、ウィルス負荷の減少において有効でないことを示す。
【００３８】
【図１９】図１９Ａ−Ｃは、予防的な日（−１日）から感染の＋３日後及び＋５日後までの範囲にわたる抗体の投与の様々な時間における、抗Ｇモノクローナル抗体のＢＡＬ（気管支肺胞洗浄（液））におけるＩＦＮγの生産に対する影響を示す。
【００３９】
【図２０】図２０は、ＲＳＶに感染した高齢の患者由来のＲＳＶのＧタンパク質の中央の保存された領域に対する抗体の力価を示す。患者は、臨床上の兆候及び症状の重さ（重篤であるか、又は軽度であるか）に従って選択された。中央の保存された領域への有意（appreciable）の力価の不在は、重篤な病気に相関する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本願で使用する場合、用語「処置する（treat）」とは、ＲＳＶに既に感染している被検体におけるウィルス負荷を減らすこと、又はそのような被検体における病気の症状を改善することを意味する。そのような症状は、細気管支炎、気道炎症、肺の中のうっ血、及び呼吸困難を含む。
【００４１】
用語「抵抗性を与える（confers resistance to」」とは、予防的な影響を意味し、ここで、ＲＳＶのチャレンジ（攻撃）によるウィルス性の感染は、重症度が少なくとも減少する。
【００４２】
「不死化細胞（immortalized cells）」とは、修正されていない最初に単離された細胞よりも顕著な期間（ないし世代：passages）生存することができる細胞を意味する。本発明の文脈で使用される場合、「不死化した(immortalized)」は、非常に長い期間（period）にわたって細胞が抗体を分泌し続けることを必ずしも意味せず、最初の培養細胞よりも長く生存することができることのみを意味する。抗体の分泌が起こる期間（time）は、その確認（ないし同定）及びコードするヌクレオチド配列の回収に十分であることのみが必要である。
【００４３】
語句「ヒト被検体に投与されたときの最小限の免疫原性（minimally immunogenic when administered to human subjects）」とは、ヒトにおける投与に対する応答が、ヒト抗体又はヒトに適合した抗体がそのようなヒトに投与されたときに得られる応答と同様であることを意味する。ヒト抗体又はヒトに適合した抗体は、処置されたヒトの５−１０％において応答を誘発することが知られている。免疫応答の誘発において、あるバックグラウンドレベルの「ノイズ」があるので、ヒトから単離された抗体でさえこのことが要当する。免疫応答は、（体）液性又は細胞性、あるいはその両方であり得る。特に、サイトカインの上昇したレベルを、個々のこのパーセントにおいて見つけることができる。
【００４４】
語句「ＲＳＶ Ｇタンパク質の保存された領域（conserved region of the RSV G protein）」とは、ＣＸ３Ｃ領域のいずれかサイドに５０個以内のアミノ酸、好ましくは、３０個以内のアミノ酸、更に好ましくは、２０個以内のアミノ酸を含むアミノ酸配列を意味し、図２Ａに、特定のストレインについて示される。保存された領域は、ＣＸ３Ｃ−特異的領域からのＧタンパク質の上流部分において主に延在する。従って、ストレインＡ２のＲＳＶ Ｇタンパク質をモデルとして使用する場合には、本発明の抗体に適用可能な保存された領域は、およそ、１６０から１８８番目までの残基、好ましくは、１６０−１７６番目に延在する。
【００４５】
本発明の抗体は、いくつかの望ましい特徴を有する。第１に、それらは、複数のＲＳＶストレインからのＧタンパク質と免疫反応性であり、典型的には、Ａ型ストレイン及びＢ型ストレインの両方からのＧタンパク質と免疫反応性である。第２に、それらは、Ｇタンパク質に対して極めて高い親和性を有し、それらの中のいくつかは、＜２ｐＭの範囲内である。従って、本発明の抗体は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ、更に好ましくは、５００ｐＭ、更に好ましくは、１００ｐＭ又は５０ｐＭ、１０ｐＭ又は１ｐＭ、そして、これらの好ましい例示的な点（ないしポイント）の間の全ての値の親和性を有する。Ｆタンパク質に向けられた市販の抗体であるSynagis（登録商標）は、約５ｎＭの親和性を有することが確立されている。Ｆタンパク質に対するより高い親和性の抗体であるＮｕｍａｘ（登録商標motavizumab）は、約５０ｐＭの親和性を有するものと見積もられる。本発明の抗体は、治療剤（therapeutics）としての役割を果たす（ないし、振る舞う）優れた能力を示し、感染のピークにおいて、肺の中のウィルスの数を低下させる能力を発揮する。それらは、典型的には感染がその過程を過ぎた時点でも、この能力を発揮する。ＲＳＶ感染から回復しつつある被検体は、ウィルスを放出（shed）し続けることがあり、そのため、臨床後の期間（setting）において他のものを感染させることがあり得るので、このことは特に有用である。その抗体及びそのフラグメントは、肺における炎症を含む感染の症状も処置する。
【００４６】
本発明の抗体は、２つの実験的な仕方で取得される。１つのアプローチにおいて、Ｇタンパク質の保存された領域と免疫反応性となることが知られた上記の既存のモノクローナル抗体、１３１−２Ｇが、最初にシーケンスされ、次に、ヒトの定常領域を修正されたヒト可変領域（重鎖及び軽鎖の両方）と融合することによってヒトに適合化された。可変領域は、１３１−２Ｇ抗体由来の可変領域に対する高い相同性に基づいて選択され、次に、１３１−２Ｇ由来の高頻度可変性（hypervariable）のアミノ酸を取り込ませて修正した。そのようなヒトへの適合化の方法は一般的に知られているが、アミノ酸置換の正確な選択が決定できることを条件とする。１３１−２Ｇの場合には、オリジナルなハイブリドーマ系統は、１つを上回る軽鎖を発現するため、実際にはＲＳＶの保存されたモチーフに結合する原因となる１つの軽鎖の決定が必要である。これは、本発明の発明者らによって決定されており、１つの実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体１３１−２Ｇのヒトに適合した形態において例示される。
【００４７】
それに代わる他の方法において、本発明の抗体は、アメリカ合衆国特許７，４１３，８６８、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／０４５３９６及びＷＯ２００８／００８８５８（これらの全ては、引用によって本願に組み込まれるものとする）に開示の独占的市販の（proprietary）セルスポット（CellSpot、登録商標）方法を使用して、ヒトのドナーに感染した（ないし曝された）ＲＳＶから回収される。
【００４８】
この方法において、４０人のＲＳＶに感染したドナーのサンプルを解析し、［１回の］プロセスにおいて、１つの血液サンプルあたり、〜５００，０００個の抗体生産細胞を産出した。従って、総計では、Ｇタンパク質の保存された領域に特異的な抗体の生産のために解析された〜２０，０００，０００個の異なるＢ細胞があった。約１０％のドナーのみがＧａ／Ｇｂに特異的なクローン（すなわち、ストレインに独立的である）の有用な頻度を有し、そのようなクローンは、最大頻度の検体においてさえ、たった〜１／５０，０００細胞の比率で存在した。全体的には、所望の細胞の頻度は、〜０．００３％であり、標準的な方法によって回収するためには非現実的なほど低い頻度であるが、セルスポット（登録商標）を使用すれば容易に到達できる。図１は、２４人のドナーのＲＳＶ抗原に対する反応性のスペクトルを示す。この図において示すように、Ａ及びＢストレインの両方由来のＧタンパク質と交差反応性の抗体が発見されたこれらの個々でさえ、これらの抗体の罹病率（prevalence）は、Ｆタンパク質、あるいは、Ｇａ又はＧｂのみと免疫反応性の抗体のそれよりも低い。驚くほど多い数のクローンがＦ及びＧタンパク質の両方（「ｍｉｘ」と記載する）を認識するが、このことは共有された炭水化物の決定因子を認識するものと思われる。そのような抗炭水化物抗体の親和性は典型的には弱く、更なる考察から除外した。このドナーの集団内において発見された１ｐＭの親和性を有する最も親和性が高い抗体は、Ｇａ／Ｇｂに特異的なクローンの頻度が非常に小さい（〜１ｐｐｍ）ドナーの１人に由来する。すなわち、この高度に好ましいクローンの発見は、全てのドナー由来の全レパートリー（repertoire）の包括的なスクリーニングなしでは起こりそうになかったであろう。
【００４９】
このスクリーニングを実行するために、エプスタイン−バーウィルスでＢ細胞を不死化し、上記の方法に従って評価した（詳細は、実施例２参照）。成功裏のＢ細胞を確認（ないし同定）し、確認されたモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を取得し、シーケンスした。次に、これらを、哺乳類の細胞系列において、抗体を生産するように組み換え的に操作した。
【００５０】
Ｇタンパク質の機能の重要な視点（側面：aspect）は、５０番目の残基に近い他の（alternative）スプライシングサイトによって形成された該タンパク質の分泌形態「ｓ（Ｇ）」に存する。ウィルスがｓ（Ｇ）を欠くように操作することにより、肺浸潤細胞（pulmonary infiltrating cells）のレベルを減少させる結果となった(Maher, et al., Microbes Infect. (2004) 6:1049-1055)。その逆に、ｓ（Ｇ）によりマウスを初回抗原刺激（priming）すると、ＩＬ−５の生産及び、肺の好酸球増加（eosinophilia）を増強する(Johnson, et al., J Virol (1998) 72:2871-2880)。従って、ｓ（Ｇ）の活性を抑制することは、ＲＳＶの有効な処置に重要である。このゴールを達成することは、当該技術分野（例えば、アメリカ合衆国特許７，０８３，９５０）において一般的に知られているように、高い親和性の抗体を必要とする。中央の保存された領域が、免疫調節因子（immuno-modulatory agent）としてのｓ（Ｇ）の機能と特に関連するので、ｓ（Ｇ）に対する有効な抗体は、このモチーフをターゲットとすべきである。
【００５１】
被検体に感染したＲＳＶからのヒトＢ細胞のレパートリーの本願発明者らの調査は、ストレインＡ及びＢの両方からのＧタンパク質に結合する抗体（Ｇａ／Ｇｂと交差反応性の抗体）の調査において不偏（unbiased）である。調査が包括的である（４０人の被検体、〜５００，０００個のＢ細胞をそれぞれ調査した）ので、マッピングに適するリニア状（直線状）のエピトープと結合する全てのＧａ／Ｇｂと交差反応性の抗体が、中央の保存された領域内における互いにいくつか（a few）の残基内のエピトープを認識することは、著しい発見である。この領域は、図２Ｂ(Plotnicky-Gilquin, et al., Virology (2002) 303:130-137)に概説するように免疫原性が弱いことが知られており、本願が報告するこの領域に高い親和性のクローンの頻度が低いことと符合する。本願発明者らは、＞７５個のＲＳＶ単離体由来のＧタンパク質の公開された配列を調査することによって、この領域の更なる特徴付けを行った。該タンパク質のほとんどの残基は、このコレクションにおいて数個（several）から多数（many）の多型性を示す。２つの領域：ｓ（Ｇ）を形成する他の（alternative）スプライシングサイト、及び全てのＧａ／Ｇｂと交差反応性の抗体が結合する中央の保存された領域は、著しく多型性が無い（free）（図２Ｃ）。すなわち、本願発明者らは、決定的な（critical）機能性を指し示す高度に保存された領域も免疫原性が弱いことを発見した。種々のメカニズム、例えば、免疫システムの静止（rest）を示すための組織適合性の抗原との組合せで、この領域を効果的に表すことに適するタンパク分解性の近くの切断サイトの不在を、弱い免疫原性に関して考慮することができる。そのメカニズムが何であろうとも、この驚くべき結果：生存したこれらのウィルスがこの領域に対する低い免疫原性を示すことは明確である。そのため、本願発明者らは、適する抗体の受動的な移行（ないし受動的送達：passive transfer）によってこの領域に対する免疫システムの活性を増強することは、有効であると予測し、そして、このことは、本願発明者らの動物モデルのケースにおいて証明されている。他のスプライシングサイトは、等しく（ないし同様に）保存されていても、免疫原性が非常に低いことはなく、その重要性がｓ（Ｇ）の形成のみと関係することを示唆し、そのため、それを受動的な免疫療法の弱いターゲットにする。
【００５２】
ヒト又はヒトに適合した本発明の抗体の生産は、チャイニーズハムスター（Chinese hamster）の卵巣細胞、又は昆虫細胞などの他の真核生物の細胞系列における生産などの
従来の組み換え技術によって達成される。他には、技術が植物及びトランスジェニック動物（例えば、ウシのミルク）又は単一の細胞系由来の微生物、植物あるいは昆虫［細胞］における抗体を含む組み替え物質の生産のためにも知られている。
【００５３】
更に、抗体をコードするヌクレオチド配列を利用できるので、同様のエピトープ、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントに結合する関連するフラグメントを組み換え的に（あるいは、タンパク質それ自体のタンパク分解性の処理によって）生産することができ、その抗体は、単鎖の形態で生産することができる。組換え型の抗体の生産の操作に関する種々の技術は、本願発明の分野において知られている。
【００５４】
治療での使用のために、組み換え的に生産された抗体又はフラグメントは、適する賦形剤を使用して医薬組成物に処方され、標準的なプロトコルに従って投与される。医薬組成物は、それらの唯一の有効成分として、本発明のモノクローナル抗体又はフラグメント、特に、Ａ及びＢストレインの両方のＧタンパク質と交差反応性であるモノクローナル抗体又はフラグメントを有することができる。あるいは、１つがＡストレインのＧタンパク質とより強力に反応し、他の１つがＢストレインのＧタンパク質とより強力に反応する２つのモノクローナル抗体が唯一の有効成分であり得る。これらの全てのケースにおいて、Ｆタンパク質と免疫反応性の１以上の抗体、又は、ＲＳＶあるいは炎症に対して有効な他の治療剤を含む更なる治療剤が存在し得る。従って、ステロイド性及び非ステロイド性の両方の抗炎症性化合物などの抗炎症性剤を組成物に含ませることができる。これらの化合物は、ビタミンなどの栄養上の物質、又は抗体以外の任意の他の有益な化合物も含むことができる。
【００５５】
１つの実施形態において、感染に対する抵抗性を増加させるために、投与する製剤を使用するときに、補体含有Ｆｃ領域を含む完全抗体が採用される。典型的には、抗体は、ヒト被検体の０．０１−２０ｍｇ／ｋｇの投与レベル、又は０．０１−５ｍｇ／ｋｇの範囲内の量、あるいは、これらの範囲内の中間の量で投与される。１つの実施形態において、０．１−１．０ｍｇ／ｋｇの範囲における量が採用される。数日、数週間、又は数ヶ月隔てられた反復される投与は、有益であり得る。ブースター（追加免疫）は、１、２、５又は１０年後にも提供することができる。
【００５６】
他の実施形態において、ウィルス負荷を減少させるための治療上の効果のために、補体含有Ｆｃ領域を含有する完全抗体も採用される。そのようなプロトコルにおいて投与される量は、０．００１−５０ｍｇ／ｋｇの桁（ないしオーダー）であるか、もしくは、０．０１、１又は１０ｍｇ／ｋｇなどのこの範囲における中間の値が採用される。反復される投与も使用することができる。治療上の処置は、感染の診断後、できるだけ早急に投与されるが、数日内の投与も本発明の範囲内である。反復される投与も採用することができる。肺における炎症反応を減少させるために、抗体の免疫特異的フラグメントのみが採用される必要がある。投与量のレベルは、抗体全体（whole antibodies）についての投与量レベルと同様である。免疫特異的フラグメント及び抗体全体（entire antibodies）の混合物の投与も本発明の範囲内に含まれる。
【００５７】
本発明の抗体組成物の投与は、典型的には、注射、一般的には、静脈注射による。そのため、非経口的な投与が好ましい。しかしながら、任意の実施可能な投与の形態が含まれる。
【００５８】
製剤（formulations）は、抗体組成物の投与に関する分野で一般的に知られた方法で調整される。適切な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版, Mack Publishing Co., Easton, PA（引用によって本願に組み込まれる）などの、一般的なフォーミュラリー（formularies）において見つけることができる。典型的には、製剤（formulations）は、バッファー、抗酸化剤などを含む等張液、並びに、リポソーム、ミセル、ナノ粒子などの送達ビヒクルを含むエマルジョンを含む非経口的な投与に適するものである。
【００５９】
所望の（投与）プロトコル及び製剤は、処置する医者の判断、並びに、被検体の特異的な状態に依存する。投与量のレベルは、適正であれば、被検体の年齢、通常の健康状態、そして、感染の重症度に依存する。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定しない。
［実施例１］
１３１−２Ｇのクローニングおよびヒトへの適合化
【００６１】
モノクローナル抗体１３１−２Ｇのクローニングおよびシーケンシング。
製造元の指示（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット: Qiagen Santa Clarita, Ca）に従って、全ての（total）ｍＲＮＡを１３１−２Ｇハイブリドーマから抽出した。ＩｇγのＶＨ１からＶＨ７の遺伝子ファミリーをターゲットするように設計（ないしデザイン）した７個のファミリー特異的な５´ＶγＦＲ１プライマー、及び１個のコンセンサス３´Ｃγ１プライマーを１３１‐２Ｇ重鎖の可変領域の増幅およびシーケンスに使用した。１個のコンセンサス５´Ｖｋプライマーを、各Ｖｋファミリーを増幅するように設計し、１個のカッパー定常領域に特異的な逆（reverse）プライマーを、カッパー軽鎖の増幅とシーケンスに使用した。ＶＨおよびＶＬ転写産物を１００ｎｇの全てのＲＮＡから、逆トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction)を用いて増幅した。
【００６２】
１３１‐２Ｇハイブリドーマについて：１つはカッパー軽鎖（κ）に、そして、１つは、ガンマ重鎖（γ１）に、２つのＰＣＲ反応を実行した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ワンステップＲＴ‐ＰＣＲキットを増幅に用いた（Qiagenカタログ番号210212）。抽出したＰＣＲ産物を特異的な定常領域プライマーを使用して直接シーケンスした。Ｖ‐ＢＡＳＥ２を使用して、そして、マウスの生殖系列データベースに対するＶＨおよびＶＬ遺伝子のアライメントによって、得られた配列をＩｇＶ−およびＪ−領域の公知の生殖系列｛せいしょく さいぼう けいれつ｝ＤＮＡ配列と比較した。シーケンス解析：ヌクレオチド配列情報から、１３１‐２Ｇの重鎖及び軽鎖のＶ及びＪ遺伝子セグメント（分節）に関するデータを得た。配列データに基づいて、１３１‐２ＧのＩｇＶＨおよびＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセット（複数）を設計した。Ｖ遺伝子の使用および配列解析：１３１‐２Ｇの重鎖遺伝子は、ＶＨ１生殖系列遺伝子ファミリー由来であり、Ｄ領域の生殖系列遺伝子はＤＳＰ２．２であり、そしてＪ領域はＪＨ３生殖系列由来であった。軽鎖遺伝子は、生殖系列遺伝子ファミリーである、Ｖカッパー１（Ｋ１Ａ５）及びＪカッパー４由来であった。
１３１−２Ｇは、以下に示すＩｇＨ−ＶＪ５５８ＶＨｌファミリーのＶセグメントを使用する：
１３１−２Ｇは、以下に示すＩｇκＶ１サブグループのＶセグメントを使用する。
【００６３】
１３１‐２Ｇモノクローナル抗体のヒトへの適合化。
抗体（Ａｂ）の、そのコグネイトの（cognate）抗原（Ａｇ）への結合は、高度に特異的な相互作用である。この特異性は、抗体結合サイトと抗原決定因子の間の構造的な相補性に起因する。抗体結合サイトは、主に高頻度可変（hypervariable）、又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）からの残基で構成され、時折、非高頻度可変（non-hypervariable）（又はフレームワーク：framework）領域からの残基が、全体ドメイン構造（overall domain structure）に影響を及ぼし、そして、それにより、結合サイトに影響を及ぼす。
【００６４】
マウスのＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーは、ヒトのレパートリーの２倍のサイズであり、ヒトＩｇＨ遺伝子座に比べて、より機能的な遺伝子を含む。マウス及びヒトの遺伝子座は、お互いに広範囲の類似性を有さない。ＶＨおよびＶＬドメインの最初の（first）２つのＣＤＲｓは、カノニカル構造として知られる主鎖構造の小さい（small）レパートリー構造を有する。特定のカノニカル構造の存在は、主に、ＣＤＲｓの長さ、及び、配列中の特定のサイトにおける鍵となる残基（key residues）の存在によって決定される。ＶＨ１ファミリー（ＶＨ１ １‐２）の同一のカノニカル構造の組み合わせは、ヒトのＶＨ１とマウスのＶＨ１ファミリーのメンバー間で共有される。１３１‐２Ｇの重鎖及び軽鎖の配列解析と、１３１‐２ＧがＩｇＨ−ＶＪ５５８ＶＨ１ファミリー及びＩｇκ１ファミリーのＶセグメントを使用するという事実とに基づいて、両鎖を整列させ（aligned）、ヒトＶＨ１及びＶＫ１ファミリーのメンバーと比較した。配列の相同性は、ヒトＶＨ１‐８及びＶｋ１‐１８の生殖系列配列に対して、それぞれ７０％及び７７％の同一性になることを見出した。これらの生殖系列を、ヒトに適合した１３１‐２Ｇモノクローナル抗体（mAb）のヒトのフレームワークとして選択した。
【００６５】
モノクローナル抗体１３１‐２Ｇのエピトープマッピング。
ＲＳＶ溶解物及び精製したＧａタンパク質を使用したウエスタンブロット分析は、１３１‐２Ｇがリニア状エピトープを認識することを示唆した。１３１‐２Ｇの結合ドメインを、ＲＳＶ‐ＧＡ２タンパク質配列由来の重複するペプチドのセットを使用してマップさせた。図２Ａは、保存されたＣＸ３Ｃモチーフの位置を含むＧタンパク質配列を示す。詳細なエピトープマッピングを得るために、１つの残基ずつシフトした１２‐ｍｅｒ（１２量体）のＧａ由来ペプチドのファミリーについて、スキャンを実行した。そのようなペプチドのアレイを、１μｇ／ｍｌの１３１-２Ｇモノクローナル抗体でプローブした。１３１‐２Ｇの結合を、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識抗体と、スーパーシグナル化学発光検出システム（super signal chemiluminescence detection system, Pierce, Rockford IL, USA）とを組み合わせて検出した。図３に概説するように、１３１‐２Ｇ抗体は、ＲＳＶ-Ｇａタンパク質の残基１５７から１７６までにわたる、８つの連続したペプチドと反応する。１３１‐２Ｇによって認識されるエピトープは、ペプチド配列（１５７）ＳＫＰＮＮＤＦＨＦＥＶＦ（１６９）及び（１６９）ＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩ（１７６）の内である。８つのペプチドからの共通配列に基づいて、１３１‐２Ｇの結合ドメインを、残基１６４−１６８にマップさせた。
【００６６】
３つの方法を、１３１‐２Ｇ及び類似する（analogous）ヒトモノクローナル抗体の親和性を特徴付けるために使用した。第一に、結合シグナルを、ＥＬＩＳＡ様式において、固定した量の抗体の段階希釈物に対するプローブについて測定した。この滴定曲線の中間点（midpoint）は、親和性の近似値である。１３１‐２Ｇの場合には、中間点は４ｎＭである。第二に、１３１‐２Ｇの親和性を、商業的な分析実験室において、オンレートとオフレートの割合に基づいてＢｉａｃｏｒｅ分析によって測定して、親和性を、７ｎＭとして算出した。第三に、セルスポット（登録商標）ビーズに担持したＧａタンパク質（the Ga protein on Cell Spot（登録商標） beads）の血清アルブミンでの希釈物は、多数のコピーのタンパク質が抗体フットプリントと相互作用する機会を減少させる。結果として起こる生の(raw)シグナルからの多座配位の結合活性効果（multi-dentate avidity effects）の抑制は、公知の基準に対しクローンのセットの親和性に関する順位付けを可能にする。この親和性の測定は、ヒト抗体を１３１−２Ｇと比較すること、及び高い親和性のクローンを効率よく選択することに使用することができる。これら全ての方法は、Ｇタンパク質抗原の一貫したソースの利用可能性によって改善される。本願発明者らの初期の研究では、抗原は、ウィルス感染細胞から抽出された。この仕方で調製した抗原の品質の可変性に起因して、本願発明者らは、Ｇタンパク質生産のための組み換え発現システムを開発したが、それは、より信頼性があることが証明された。
［実施例２］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対する抗体を分泌するヒトＢ細胞の単離
【００６７】
ＲＳＶ感染が確認された４０人の成人からの末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells：PBMCs）を、抗ウィルス抗体を生産するヒトＢ細胞について調査した。ＲＳＶ付着Ｇタンパク質に対する所望の抗体を有する被検体を、抗ＲＳＶ‐Ｇ特異的モノクローナル抗体のクローニングに使用した。調査の結果は、〜１０％の被検体が１／１０００００を上回る所望の細胞の頻度を有したものであった。しかしながら、低い頻度の被検体であっても目的の被検体であり、実際には、確認（ないし同定）した最も高い親和性の抗体は、所望のＢ細胞のタイプの頻度が非常に低いドナー（〜１ｐｐｍ）から由来した。
【００６８】
まれで好ましい細胞の調査及び回収を達成するために、本願発明者らは、上述のセルスポット（CellSpot登録商標）技術を使用した。セルスポット（登録商標）アッセイ法は、単一の細胞から分泌されるＩｇＧを、細胞の近隣にフットプリントとして捕らえることによって、ＥＬＩＳＡ相当のアッセイを単一の細胞の寸法に近い実際上の（virtual）ウェルにまで効率的に縮小する。結果として、何百万の細胞を容易に解析することができる。更には、顕微鏡多重化試薬（microscopic multiplexing reagents：組み合わせで着色した蛍光ラテックス微小球、ＵＳ６,６４２,０６２参照）の使用によって、各クローンの分泌抗体のフットプリントを、複数の生化学的なプローブを用いて、特異性及び/又は親和性について詳細に特徴付けることができる。定量的アッセイの忠実度は、オリジナルの確認アッセイと一致する表現型を示すクローン化された発現細胞を含む調査集団から極めてまれで好ましい細胞の回収を可能にすることに十分である。
【００６９】
スクリーニングの基準は、２つの主要なストレインのファミリーの両方からのＧタンパク質（Ｇａ及びＧｂと表記する）に結合すること、かつ、Ｆタンパク質（他の主要なウィルスコートタンパク質）には結合しないことであった。クローンを順序付ける親和性の順位付けは、血清アルブミンでビーズに担持した抗原を希釈することによっても達成することができる。これは、分泌されたＩｇＧフットプリントに対する多座配位の（multi-dentate）結合の機会（「結合活性」効果：an "avidity" effect）を減少させるため、より高い内因性の親和性を選択する。Ｇタンパク質は、２つのＲＳＶストレインの一方或いは他方に感染したベロ細胞から精製した。
【００７０】
該方法は、ヒトＢ細胞に適用され、標準的な磁石分離法（magnetic separation method）を使用してＰＢＭＣｓからＢ細胞でない細胞を欠乏させる（なくする）ことによって開始する。細胞をＩＭＤＭ／２０％ＨＩ‐ＦＣＳに１×１０６（1e6）／ｍｌで再懸濁し、ＥＢＶ（感染したＢ９５‐８細胞の上清から直接ペレットにした）を、１：１００の希釈率で加え、そして細胞を３７℃で２時間インキュベートした。余分なウィルスを、そして細胞を洗い流し、ＩＭＤＭ（２０％ＦＣＳ、２０％巨大細胞腫馴化培地（Giant cell tumor conditioned medium）、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ‐１０）において調査するだけのために培養するか、又は、磁石ポジティブ選別を使用して表面ＩｇＧに関してさらに選別した。細胞を、２００‐３００細胞／ウェルで、放射線照射したヒト肺細胞（ＭＲＣ‐５、５０００細胞／ウェル）上で、ＩＭＤＭ（２０％ＨＩ‐ＦＣＳ、２０％巨大細胞腫馴化培地（Giant cell tumor conditioned medium）、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ‐１０）において培養した。培地を２−３日毎に補充した。ウェルの二分の一（one half）の内容物を６日目に、セルスポット（登録商標）において解析した。次に、調査アッセイによりポジティブの少数のウェルの残りの細胞を、同一の支持細胞及び同一の培養条件で、１０、５、１及び、０．５細胞／ウェルまでに希釈した。４‐５日後、これら限界希釈プレートをＥＬＩＳＡ又は、セルスポット（登録商標）によって再度アッセイした。
【００７１】
次に、限界希釈におけるポジティブウェルの内容物を、逆トランスクリプターゼ‐ＰＣＲを使用して抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを回収する処理に供した。ＰＢＭＣｓを解凍してからＲＴ‐ＰＣＲ介してコードするｍＲＮＡを回収するまでの全所要時間は、１０−１２日であった。
【００７２】
図４は、この実験からのイラスト的なデータを示す。好ましいドナー及び好ましくないドナーの血液サンプルのセルスポット（登録商標）プロファイリングの例を、パネルＡ及びＢ（図４Ａ、４Ｂ）に示す。パネルＣ（図４Ｃ）に、最初の検出における好ましいクローンのプロファイルを、その細胞由来の抗体をクローン化したｃＤＮＡで形質転換したＨＥＫ２９３細胞の子孫から分泌した抗体のパネルＤ（図４Ｄ）の増殖（replicate）プロファイルと共に示す。これらのプロファイルは、アッセイの正確性の範囲内で同一であり、好ましいクローンの回収が成功したことを示す。
【００７３】
図１に示すように、抗ＲＳＶ抗体の大部分は、Ｆタンパク質、又はＦとＧとに共通する抗原決定基（ほとんどのものは、２つのタンパク質が配列相同性を有さないため、おそらく炭化水素である）に向けられる。大半がＧａ又はＧｂにのみ結合するＧタンパク質特異的抗体の［配列変動性：sequence variability］は、公知のＧタンパク質の高い配列変動性と符合する。全体的には、〜２０００万の個々のＢ細胞を調査した。１２個の最も有望な抗体をＲＴ−ＰＣＲによって回収した。かくて、全体的には、好ましいクローンの頻度は、１００万分の１未満であり、そして５０００万を上回るＥＬＩＳＡ相当のアッセイが、これらのまれなクローンを発見するために必要であった。従って、セルスポット（登録商標）技術は、他の方法で可能であろうよりも、より包括的なクローンの調査を可能にした。結果として得られたクローンの品質は、より限定的なスクリーニングによって発見されたクローンの品質よりも優れており、高品質なセットのクローンのコンセンサスな特徴は、所望の抗体の予測されない特徴を明らかにする。
［実施例３］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対するヒト抗体のクローニング
【００７４】
再配置された（rearranged）Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の遺伝子のポジティブのＥＬＩＳＡウェルからの増幅は、セミネステッドポリメラーゼ連鎖反応（semi-nested PCR）を使用して行った。ア・プリオリに未知のＶ遺伝子の再配置物の増幅のために、ヒトのＩｇ遺伝子座（Ig Locus）におけるほとんど全てのＶ遺伝子セグメントを認識するファミリー特異的Ｖ遺伝子プライマーのコレクションを構築した。５´プライマーを、Ｃγ、Ｃκ及びＣλの遺伝子セグメントに特異的なプライマー混合物と一緒に使用した。限界希釈したＲＳＶ‐Ｇ特異的Ｂ細胞のクロナリティー（clonality）を、異なった（distinct）子孫の細胞由来のＶ遺伝子増幅産物の配列比較によって明確に（ないし一義的に：unequevocally）決定し、そして増幅した全長のＶ遺伝子の再配列物を、ＩｇＧ発現ベクターにクローン化した。この方法は、また、Ｖ−、Ｄ−、及びＪ−遺伝子の使用、そして、体細胞変異体の存在及びパターン（化）などの、更なる問題（issues）に取り組むことにも有用であった。
【００７５】
方法
単離したヒトＢ細胞由来の全体の（total）ｍＲＮＡを、商業的に入手可能なＲＮＡ精製キットを使用して抽出した（RNeasy；Qiagen（Germany））。逆転写‐ＰＣＲを、全体の（total）ＲＮＡ調製物と、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドとを使用して実行した。各サンプルについて３つのＰＣＲ反応を実行した：１つは軽鎖カッパー（κ）、１つは軽鎖ラムダ（λ）、そして１つはガンマ重鎖（γ）について実行した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２１０２１２）を増幅に使用した。一組の（coupled）ＲＴ−ＰＣＲ反応において、ｃＤＮＡを、ＲＴ酵素（Omniscript（登録商標）及び、 Sensiscript（登録商標））の固有の配合（unique blend）で、Ｃ‐κ、Ｃ‐λ、又は、Ｃ‐γ遺伝子のＣＨ１領域のコンセンサス［配列］と対応するアンチセンス配列に特異的プライマーを使用して合成し、ＲＴを、５０℃で１時間実行し、次にｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、高い特異性及び感度のため、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって行った。各ＰＣＲ反応は、５´センスプライマーの混合物を使用した。プライマー配列は、ＶＨ、ＶＫ及び、ＶＬのリーダー配列に基づいた。ＰＣＲ反応は、最初のホットスタートを９５℃で１５分間で行い、次に、９５℃で３０秒間（変性）、６０℃で４５秒間（アニーリング）、そして７２℃で１分間（伸張）の２０サイクルを行った。
【００７６】
検出のためのネステッドＰＣＲ及び可変Ｉｇフラグメントの発現ベクターへのクローニング
第２ラウンドにおいて、５μｌの最初の増幅反応のアリコットを適用した。使用したプライマーは、５´ＢｇｌＩＩの制限サイト、及び３´ＸｂａＩの制限サイトを有する。３０回のＰＣＲサイクルを実行した。増幅の第１ラウンド及び第２ラウンドに、同一の条件を使用した。５マイクロリッターの各反応物を、１％アガロースゲル上に載せて分離し、そして、次に、エチジウムブロマイドで染色した。Ｖ‐Ｃ ＰＣＲ産物は、それぞれ５００及び４５０ｂｐのＶＨ及びＶＬの再配置したフラグメントを増幅することが予測される。およそ５００ｂｐの分子サイズを有するＰＣＲバンド（複数）はポジティブの結果を示した。ＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎゲル精製キット、カタログ番号２８７０４）、そして、抽出したＰＣＲ産物を、特異的な定常領域プライマーを使用して直接的にシーケンスした。クローン化したフラグメントの配列を、組み換え体の生産のために調製したプラスミドをシーケンスすることによって確認した。
【００７７】
図５Ａは、可変領域、Ｄ及びＪ結合領域、フレームワーク（ＦＲ）、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒト被検体から単離した本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列、並びに、ヒトに適合した１３１‐２Ｇの重鎖のアミノ酸配列を示す。Ａストレイン由来のＧタンパク質のみと免疫反応性である抗体３Ｆ９を除く全てのリストした抗体は、Ａ及びＢストレインの両方から由来のＧタンパク質と免疫反応性である。図５Ｂは、これらの抗体の軽鎖に関する類似の配列情報を示す。配列のリスト中のダッシュ（Dashes）は、異なる長さの遺伝子配列のアライメント補正を表す。
【００７８】
哺乳類細胞におけるインビトロの抗体生産のために、上記のＰＣＲフラグメントを消化し、ヒトガンマ１、またはヒトカッパー又はラムダの定常領域を有する個々の発現ベクターにクローン化した。重鎖及び、軽鎖をコードする発現ベクターを２９３（ヒト腎臓）細胞系列（Invitrogen）に共形質転換（co-transfected）した。発現プラスミドを、陽イオン性の脂質ベースの形質転換試薬（293 fectin（登録商標）;Invitrogen）を使用して導入した。各形質転換反応に関して、２０μｇの精製したプラスミドおよび、４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を、［それぞれ］１ｍＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（登録商標、Invitrogen）に混合して、結合する前に５分間室温でインキュベートし、そして、２０分間室温で複合体を形成させるようにした。ＤＮＡ‐２９３ｆｅｃｔｉｎ複合体を、９０ｍｍペトリプレートに蒔いた３×１０６の細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。最終工程において、上清を形質転換から７２時間が経過した後に遠心（３,０００ｇ、１５分間、４℃）によって回収して、分泌抗体を回収した。
［実施例４］
本発明の抗体のエピトープマッピング及び親和性の決定
【００７９】
前述の先行技術（prior art）の抗体１３１‐２Ｇのエピトープマッピングに関する実施例１に記載の技術を使用して、本発明の抗体に対応するエピトープを決定した。本発明の抗体の親和性は、１３１‐２Ｇモノクローナル抗体に関する実施例１に記載の方法を使用して決定した。
【００８０】
下記の表１に示すように、３つの抗体は、立体構造的なエピトープに結合する‐すなわち、それらは重複するペプチドを結合することによっては、マップしない。特異的な配列をマップする本発明の抗体を表１に示す。測定したオンレート及びオフレートから算出してｐＭで示した組み換えＧａタンパク質及びＧｂタンパク質に関する標準的なＢｉａｃｏｒｅアッセイを使用して決定した親和性定数も示す。これら抗体の２つのデータを図６に示す。パネルＡ、Ｂ及びＣ（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）は、３Ｇ１２の結合データを示し、パネルＤ、Ｅ、およびＦ（図６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ）は、３Ｄ３のデータを示す。上段の列は、抗体を用いたバイオセンサーチップのローディングを示し、中段の列は、チップにＧａタンパク質を横切って流した後に、バッファーで洗浄することから上昇するシグナルを示し、下段の列は、Ｇｂタンパク質に関する同様の結果を示す。シグナルの増加（上昇）は、オンレートの算出を許容し、一方では、洗浄中の減少は、オフレートの算出を許容する。オフレートに対するオンレートの割合は、親和性定数、Ｋｄである。
［表１］
＊１３１−２Ｇと同一のエピトープ
［実施例５］
Ｇタンパク質との結合に対するウィルス粒子（Virions）との結合の比較
【００８１】
図７は、標準的な西洋ワサビペルオキシダーゼアッセイを使用した、生ウィルスを採用して、結合を評価するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。様々なソースからのウィルスのプレップ（preps）を、１０５ＰＦＵ／ウェル以上の濃度で、ｐＨ９．６の炭酸塩バッファー中で、４℃オーバーナイトで、プレートの表面をコートすることに使用した。プレートを、ＰＢＳＴを含む５％ミルクで、１時間、室温でブロッキングした。抗体の段階的（serial）希釈液をウェルに、１時間室温でブロッキングバッファーにおいて加えた。検出のために、ヤギ抗ヒトＦｃガンマ‐ＨＲＰ（Jackson Immuno.）の１：２０００希釈物をブロッキングバッファーに１時間室温で加えた。プレートをＰＢＳＴで、十分に洗浄した。基質ＴＭＢのターンオ−バーを４５０ｎｍで測定した。図７で示すように、３Ｄ３は、いくつかの他の本発明の抗体と同様に、良く生ウィルスに結合する。実質的に弱い親和性を有するＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、抗体濃度１０４ｎｇ／ｍｌでさえ、生ウィルスに対してほんの少ししか結合しないことを示す。図８は、ウィルス粒子に対する結合と比較したときの、組み換えタンパク質に対する結合の相関関係を示す。
【００８２】
図９Ａ及び９Ｂは、上記のアッセイを使用した、本発明の抗体のストレインＡ２対Ａ５への結合の比較上の能力を実証するグラフである。図９Ａは、３Ｄ３及び３Ｇ１２が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と比較してストレインＡ２に良く結合することを示す。ＰＡＢは、全てのＲＳＶタンパク質に対する市販のポリクローナルのヤギ抗体である（Chemicon、カタログ＃ＡＢＩ１２８）。
【００８３】
図９Ｂは、これらの抗体がストレインＡ５にも結合することを示す（注、Ｘ軸の単位は、図９Ａと異なる）。同様の実験（複数）は、本発明の抗体が、多種の臨床上の分離物に結合することを示す。
［実施例６］
中和アッセイ
【００８４】
選択した本発明の抗体のインビトロにおけるウィルスを中和する能力を、標準的なプラークアッセイによって得た。ＨＥｐ２細胞を１２‐ウェルプレートに、２×１０５細胞／ウェルで蒔いた。次の日、抗体の段階希釈物を培地において産出した。およそ２００ＰＦＵ／ウェルのＲＳＶを、ウサギ補体血清の存在下で、１時間室温で抗体に加えた。次に、抗体‐ウィルスの混合物を、２００μＬ／ウェルの割合でＨＥｐ２細胞に加え、室温で２時間感染させた。この感染期間の後に、培地を取り除き、１％メチルセルロース含有培地を全てのウェルに加えた。プレートを３５℃で６日間インキュベートし、この期間の後に、以下のように、細胞を固定し、プラーク数の測定のために染色した。メチルセルロースを細胞層から吸引し、そして細胞を１００％メタノールで３０分間、室温で固定する。次に、プレートを３回、５％ミルク含有ＰＢＳで洗浄する。一次抗体（ヤギ由来抗ＲＳＶポリクローナル抗体（Chemicon Cat#AB1128））を１：５００の希釈率で、ＰＢＳ＋５％ミルクタンパク質に加え１時間保持する。プレートを３回、５％ミルク含有ＰＢＳで再び洗浄する。二次抗体（ImmunoPureペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））（Thermo Scientific, Cat#31402））を１：５００の希釈率で、５％ミルクタンパク質含有ＰＢＳに加え１時間保持する。プレートを３回、１×ＰＢＳで洗浄する。プラークを、２００μｌ／ウェルの１−ステップChloronaphthol substrate（Pierce, Cat#34012）を加え１０分間保持することによって、可視化する。プレートを水でリンスし、そして風乾する。各ウェルのプラークを計測する。
【００８５】
図１０は、ヒト抗体のμｇあたりのプラークの絶対数に関する結果を示し、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体を結果に含む。これらデータは、試験した抗体のデータを示し、３Ｄ３が最も強力である。この分析によれば、３Ｇ１２は、１５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０又は１００ｐＭの親和性を有するが、これに対して、市販の抗体であるＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）は、２ｎＭの親和性に相当する３００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）及び本発明の抗Ｇ抗体は、これらの条件下において、相乗的（synergistic）でないことを更に見出した。
【００８６】
図１１は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と比較した、ストレインＢに関する３Ｇ１２抗体の中和を示す。規格化した（normalized）データ（コントロールの％）は、１回の実験あたり、１６０‐１８０個のプラークの絶対数に基づく。インビトロにおいて、１ｐＭから５ｎＭまでの親和性を有する本発明の抗体（表１）は、１０‐１００ｎｇ／ｍｌの間のＥＣ５０値を有する。
［実施例７］
マウスでの抗Ｇ予防
【００８７】
本発明の抗体、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）及びヒトＩｇＧ１の、マウスにおけるＲＳＶ感染を防止する能力を試験した。感染前である−１日目に、コントロール群のマウスに培地及びＰＢＳを腹腔内に（i.p.）注射した。試験群に、０．１５、１．５及び、１５ｍｇ／ｋｇの抗体ｈＩｇＧ１（無免疫、アイソタイプコントロール）あるいは、３Ｇ１２、３Ｄ３又はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を注射した。これは、マウスあたり、およそ、３μｇ、３０μｇ及び、３００μｇに相当する。
【００８８】
０日目において、マウスに、１×１０６ｐｆｕのＲＳＶのｌｏｎｇストレインを経鼻投与によって接種した。０日目及び５日目に、肺、気管支肺胞洗浄（液）（bronchial alveolar lavage：ＢＡＬ）そして、血清を採取し、体重、肺重量、肺葉部（lung lobe section）におけるｐｆｕ、ウィルスの負荷（ｑＰＣＲによる）、肺の組織、白血球の総数、ＦＡＣＳ、そして、ＢＡＬのＩＦＮγを全て測定した。
【００８９】
図１２は、前述のリストからのプラークアッセイを使用した、ウィルスの肺負荷に基づく結果を示す。図１２のデータは、このアッセイにおいて、３Ｇ１２及び３Ｄ３が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）と同等に有効であることを示す（Synagis（登録商標）の典型的なヒト投与量は、ヒトにおいて１５ｍｇ／ｋｇである）。
［実施例８］
ＲＳＶ‐Ｇａ／Ｇｂに対する抗体の治療効果
【００９０】
ＲＳＶ‐Ｇの保存されたモチーフに対する抗体は、治療効果を有することが示される。マウスを、０日目に、１０６ｐｆｕのＲＳＶを鼻腔内的に感染させ、次に、３日目に、３ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内に注射して処置し、そして、５日目及び７日目に、気管支肺胞洗浄（液）中のウィルスの負荷をアッセイした。このモデルにおいて、感染物はヒトに比べてより容易に自然に排除される。それにも関わらず、抗体の処置は、ＲＳＶに結合しないコントロール抗体と比較して、投与量依存的な態様で、ウィルス排除率の促進を引き起こす（図１３Ａ）。各処置群は５頭の動物を有し、結果は、統計的に有意である。
【００９１】
ＷＯ００／４３０４０に記載のように、サブスタンスＰに対する抗体は、ＲＳＶに起因する肺炎（ＲＳＶ感染の臨床上の重要な特徴である慢性化した病態の動物モデル）を軽減することに有益である。サブスタンスＰの上方への制御は、活性化Ｇタンパク質に依存する（Haynes, L. M., et al., J. Virol. （2003） 77：9831−9844）。本発明の抗体の処置の後に、炎症性ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞の総数の減少（図１３Ｂ）、並びに、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の減少（図１３Ｃ）を含む、肺炎の尺度（measures）の減少も観察されている。
【００９２】
更なる試験において、０日目に、マウスに１０６ｐｆｕのＡ型ＲＳＶ ｌｏｎｇストレインを鼻腔内投与によって接種した。
【００９３】
３日目において、４‐５匹のマウスの種々の群に以下の処置をした。
【００９４】
第１群：０日目に感染を受けず、ＰＢＳを処置したコントロール群。
【００９５】
第２群：０日目にＲＳＶ接種を受けて、そして３日にＰＢＳを処置したネガティブコントロール群。
【００９６】
第３群：０日目のにＲＳＶ接種を受けて、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体の生理食塩水溶液を腹腔内にマウスあたり１、１０又は１００μｇ、あるいは、０．０５、０．５又は５ｍｇ／ｋｇで処置した群。
【００９７】
第４群：０日目にＲＳＶを接種し、モノクローナル抗体３Ｄ３を第３群と同様のプロトコルで投与した群。
【００９８】
第５群：０日目にＲＳＶの接種を受け、３Ｇ１２を第３群及び４群と同一の量で投与した群。
【００９９】
肺、及びＢＡＬ液を、０日、３日、５日、７日、そして１０日目に採取した。更に、体重、肺重量、肺葉のｐｆｕ、ｑＰＣＲによるウィルスの負荷、肺組織、白血球の総数、ＦＡＣＳ、並びにＢＡＬのＩＦＮγを測定した。１０μｇのモノクローナル抗体を投与した群のｑＰＣＲの結果を図１４に示す。
【０１００】
図１４に示すように、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置および未処置のマウスのウィルス性の力価(titer)は、この比較的に低い抗体の投与量で同様の様態を示すが、これに対して、３Ｄ３を処置したマウス及び３Ｇ１２を処置したマウスは、感染のピークの５日目において、著しく低い力価を有した。この実験は、インビトロにおけるより高い親和性がインビボにおけるより高い効力（potency）と相関することを実証する。
【０１０１】
図１５は、７日目にｑＰＣＲによって測定したときに、３Ｇ１２及び３Ｄ３が、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）よりも低い濃度において、ＲＳＶのコピー数を低くすることができたことを実証する投与量応答曲線を示す。３Ｄ３は特に強力であり、インビトロにおいて、より高い親和性を有することと再び一致した。
【０１０２】
同様に、図１６に示すように、１０日目にｑＰＣＲウィルス数を計測するときには、この時点において、ウィルス力価は、マウス免疫システムによる自然な排除に起因して、自然に非常に低いが、３Ｄ３は、様々な投与量の濃度において、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）よりもおよそ１００倍強力である。この実験は、抗原の濃度が低下した時でさえ有効であり続ける高親和性抗体の有用性を強調する。ヒトの病気の経過は、マウスよりもかなり慢性化するため、長い期間にわたりウィルスを中和し続ける抗体の使用に関する明確な動機を提供する。
【０１０３】
更なる実験において、マウス抗Ｇモノクローナル抗体又はマウス抗Ｆモノクローナル抗体をマウスに、４匹の群（複数）において処置し、各実験を３回繰り返した。マウスを、０日目に免疫化し、３日目に抗体で処置し、そして、様々な有効性の兆候を３、５、７日目に測定した。
【０１０４】
有効性の指標の１つとして、図１７に示す結果を有する３つの群における気管支肺胞洗浄（液）（ＢＡＬ）中の炎症細胞を測定した。肺あたりのＢＡＬ細胞（数）を、０から１４０×１０３までのＹ軸上にプロットする。結果は、抗Ｆモノクローナル抗体（anti-F mAb）は、アイソタイプコントロールである非免疫抗体と比較して、５日目での肺あたりのＢＡＬ細胞数を低減させたが、これに対し、抗Ｇモノクローナル抗体（anti-G mAb）は、ＢＡＬ細胞数を、実質的に更に［抗Ｆモノクローナル抗体よりも］低減させたことを示す。７日目までに、感染はその過程を進行していた。
【０１０５】
図１８Ａ及び、１８Ｂは、ペプシンでの切断及び固定したタンパク質Ａを使用したＦｃフラグメントの除去によって抗Ｇ抗体から得られた抗Ｇ Ｆ（ａｂ´）２と比較した抗Ｇモノクローナル抗体（マウス１３１‐２Ｇ）の有効性の比較を示す。インビトロでの抗Ｇ抗体の抗ウィルス効果にとって補体は重要であることを示す。このことは、抗ウィルス効果がｐｆｕ／肺組織重量（ｇ）として測定される図１８Ａにおいて確認される。アッセイは、実施例６のように実施した。補体媒介活性に必要であるＩｇＧのＦｃ部分を欠く抗Ｇ抗体のＦ（ａｂ´）２フラグメントは、ウィルスの負荷を低減させることにおいては、コントロールよりも全く優れないが、これに対して、抗Ｇモノクローナル抗体は非常に有効である。しかしながら、図１８Ｂに示すように、炎症を結果の測定として使用する場合には、抗Ｇモノクローナル抗体のＦ（ａｂ´）２フラグメントは、完全な抗体と同じ程度に十分に有効である。この実験は、Ｇタンパク質の中和は、気道炎症を低減することに重要な意味を持つことを実証する。ウィルスが活発に可溶型のＧタンパク質を分泌し、そして、高い親和性の結合が可溶性の因子の中和に重要であるため、本発明の高い親和性の抗体が抗炎症効果に対する特別な有用性を有することが予測される。
【０１０６】
図１９Ａ、Ｂ及びＣは、投与の時間の関数として、気道炎症のマーカーとしての役割を果たすサイトカインを用いたＢＡＬ中のＩＦＮγの生産に対する抗Ｇモノクローナル抗体の影響を示す。全てのケースのコントロール非免疫抗体は、気道炎症に伴うＩＦＮγ産生の増加を減少させない。しかしながら、抗Ｇモノクローナル抗体は、−１日（パネルＡ）又は３日目（パネルＢ）に投与されても、あるいは、５日目（パネルＣ）でさえも、ＩＦＮγレベルの著しい減少を７日目に結果として示す。この実験は、ウィルスの負荷のピークを十分に過ぎた炎症の処置のための、ＲＳＶ Ｇタンパク質の中心の保存されたモチーフに対する抗体の有用性を実証する。
［実施例９］
感染した被検体における内在性抗体の特異性
【０１０７】
重篤なＲＳＶ病を有する４人の高齢者、及び軽度のＲＳＶ病を有する６人の高齢者からの血清サンプルを、以下に示す、Ａ２ストレイン由来のＲＳＶ Ｇタンパク質の保存された領域を表す合成ペプチドを用いて免疫反応性に関して試験した。
アッセイを、実施例５に記載のＥＬＩＳＡプロトコルを使用して実行した。このペプチドと免疫反応性の抗体のレベルは、病気の重症度に相関し、ここで、病気の軽度の形態を有する被検体は、より重篤な感染の兆候を有する被検体よりも、非常に高い力価を発揮した（図２０参照）。これらの結果は、Ｇタンパク質のこの部分と免疫反応性の抗体が感染を改善することに有効であることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその免疫反応性のフラグメントであって、
（ａ）ＲＳウィルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）ストレインＡ２のＧタンパク質の１６０−１７６番目の残基の内のエピトープに結合すること、
（ｂ）ヒト被検体に投与されたときには、最小限の免疫原性であること、及び
（ｃ）中和のためのプラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＰＲＮＴ）アッセイにおいて５００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有すること
を特徴とするモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項２】
少なくとも１ｎＭのＲＳＶ Ａ２のＧタンパク質に関する親和性を有することを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項３】
ＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質の対応するエピトープにも結合することを特徴とする請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項４】
完全抗体の形態であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ヒトに適合した形態の１３１−２Ｇもしくはその免疫特異的フラグメントであるか、又は、１Ｆ１２、３Ｇ１２、１Ａ５、３Ｄ３、１Ｇ１、２Ｂ１１、５Ｄ８、２Ｄ１０、３Ｆ９、１Ｄ４、１Ｇ８、６Ａ１２もしくは１０Ｃ６、又はこれらの免疫特異的フラグメントであること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項６】
完全抗体であることを特徴とする請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
唯一（sole）の有効成分として、単離された請求項１に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質と免疫反応性である更なるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶと免疫反応性の抗体以外の更なる薬剤を、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記更なる薬剤が抗ＲＳＶ剤であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質と免疫反応性である更なるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、ＲＳＶと免疫反応性の抗体以外の更なる化合物及び医薬的に許容可能な賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記更なる薬剤が抗ＲＳＶ剤であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＳＶのＦタンパク質と免疫反応性の１つ以上のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを更に含むことを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＲＳＶに感染したヒト被検体において治療上の効果を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ＲＳＶに感染したヒト被検体における気道炎症を減少させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列（１つ以上）を含む１つ以上の核酸分子、又は、前記第１のヌクレオチド配列（１つ以上）に対し、その（ないしはそれらの）全長にわたって相補的な第２のヌクレオチド配列（１つ以上）を含む１つ以上の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを生産する組み換え宿主細胞又は不死化細胞。
【請求項１８】
哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞又は植物細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを生産する方法であって、
請求項１７に記載の細胞を培養するステップ、及び前記モノクローナル抗体又はフラグメントを回収するステップを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを生産することを特徴とするヒト以外のトランスジェニック動物、又はトランスジェニック植物。
【請求項２１】
ＲＳＶに感染した被検体（subject）におけるＲＳＶを処置する方法であって、
そのような処置を必要とする被検体であり、かつ、ＲＳＶに感染した被検体に、有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
ウィルス性の負荷を減少させる結果になることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体がヒトであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＳＶに感染した被検体（subject）におけるＲＳＶを処置する方法であって、
そのような処置を必要とする被検体であり、かつ、ＲＳＶに感染した被検体に、有効量の請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
ウィルス性の負荷を減少させる結果になることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被検体がヒトであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト被検体におけるＲＳＶによる感染に対する抵抗性を強める方法であって、
そのような抵抗性を必要とするヒト被検体に、有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
ヒト被検体におけるＲＳＶによる感染に対する抵抗性を強める方法であって、
そのような抵抗性を必要とするヒト被検体に、有効量の請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその免疫反応性のフラグメントであって、
（ａ）ＲＳウィルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）ストレインＡ２のＧタンパク質の１６０−１７６番目の残基の内のエピトープに結合すること、
（ｂ）ヒト被検体に投与されたときには、最小限の免疫原性であること、及び
（ｃ）中和のためのプラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＰＲＮＴ）アッセイにおいて５００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有すること
を特徴とするモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項２】
少なくとも１ｎＭのＲＳＶ Ａ２のＧタンパク質に関する親和性を有することを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項３】
ＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質の対応するエピトープにも結合することを特徴とする請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項４】
完全抗体の形態であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ヒトに適合した形態の１３１−２Ｇもしくはその免疫特異的フラグメントであるか、又は、１Ｆ１２、３Ｇ１２、１Ａ５、３Ｄ３、１Ｇ１、２Ｂ１１、５Ｄ８、２Ｄ１０、３Ｆ９、１Ｄ４、１Ｇ８、６Ａ１２もしくは１０Ｃ６、又はこれらの免疫特異的フラグメントであること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項６】
完全抗体であることを特徴とする請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
唯一（sole）の有効成分として、単離された請求項１に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質と免疫反応性である更なるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶと免疫反応性の抗体以外の更なる薬剤を、医薬的に許容可能な賦形剤と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記更なる薬剤が抗ＲＳＶ剤であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
唯一の有効成分として、請求項１に記載の前記モノクローナル抗体又はフラグメント、及びＲＳＶ群ＢストレインのＧタンパク質と免疫反応性である更なるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、ＲＳＶと免疫反応性の抗体以外の更なる化合物及び医薬的に許容可能な賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記更なる薬剤が抗ＲＳＶ剤であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＳＶのＦタンパク質と免疫反応性の１つ以上のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを更に含むことを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＲＳＶに感染したヒト被検体において治療上の効果を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ＲＳＶに感染したヒト被検体における気道炎症を減少させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列（１つ以上）を含む１つ以上の核酸分子、又は、前記第１のヌクレオチド配列（１つ以上）に対し、その（ないしはそれらの）全長にわたって相補的な第２のヌクレオチド配列（１つ以上）を含む１つ以上の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを生産する組み換え宿主細胞又は不死化細胞。
【請求項１８】
哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞又は植物細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを生産する方法であって、
請求項１７に記載の細胞を培養するステップ、及び前記モノクローナル抗体又はフラグメントを回収するステップを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを生産することを特徴とするヒト以外のトランスジェニック動物、又はトランスジェニック植物。
【請求項２１】
ＲＳＶに感染した被検体（subject）におけるＲＳＶを処置する方法であって、
そのような処置を必要とする被検体であり、かつ、ＲＳＶに感染した被検体に、有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
ウィルス性の負荷を減少させる結果になることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体がヒトであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＳＶに感染した被検体（subject）におけるＲＳＶを処置する方法であって、
そのような処置を必要とする被検体であり、かつ、ＲＳＶに感染した被検体に、有効量の請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
ウィルス性の負荷を減少させる結果になることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被検体がヒトであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト被検体におけるＲＳＶによる感染に対する抵抗性を強める方法であって、
そのような抵抗性を必要とするヒト被検体に、有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はフラグメントを投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
ヒト被検体におけるＲＳＶによる感染に対する抵抗性を強める方法であって、
そのような抵抗性を必要とするヒト被検体に、有効量の請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【図１】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図４−Ｄ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図６−Ｃ】
【図６−Ｄ】
【図６−Ｅ】
【図６−Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図４−Ｄ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図６−Ｃ】
【図６−Ｄ】
【図６−Ｅ】
【図６−Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１１−５０００９１（Ｐ２０１１−５０００９１Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１２８３（Ｐ２０１０−５３１２８３）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５７１１
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０４４０３１５０）トレリス バイオサイエンス、インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５７１１
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０４４０３１５０）トレリス バイオサイエンス、インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
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