改善されたアラビノース資化能を有するザイモモナス（ＺＹＭＯＭＯＮＡＳ）
改善されたアラビノース資化能がある株を提供することが見出されたアラビノース−プロトン共輸送体を発現するように、アラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のいくつかの株を遺伝子操作した。これらの株は、唯一の炭素源としてまたは糖混合物中の１つの糖としてのどちらかでアラビノースを含有する培地中において、改善されたエタノール生産を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利についての記述
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。さらに具体的には、アラビノース資化の改善をもたらすザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の遺伝子操作、および同株を使用してエタノールを製造する方法について記載される。
【背景技術】
【０００３】
微生物によるエタノールの生産は化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって現在の重要な研究分野である。キシロースおよびアラビノースは、発酵で使用される生体触媒のための豊富に入手できる低コスト炭素基質源を提供し得る、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖であることから、エタノールならびにその他の有用な生成物を生産する微生物は、炭素源としてキシロースおよびアラビノースを使用できることが望ましい。
【０００４】
キシロースおよびアラビノースの資化のために、天然ではこれらの糖を資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンを遺伝子操作してもよい。キシロース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする遺伝子が発現されるように株を遺伝子操作した。１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼ（特許文献１、２；非特許文献１）。アラビノース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする追加的遺伝子が導入された。１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献３】米国特許第５８４３７６０号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０〜２４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
いくつかのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株がアラビノース資化のために遺伝子操作されているが、これらの遺伝子操作株によって資化される発酵培地中には、典型的に低率のアラビノースのみが存在する。発酵がアラビノースを含有する培地中で起きる場合、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびその他の細菌エタノロジェン中におけるア
ラビノース資化を改善して、エタノール生産を増強する必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体発現のための遺伝子が導入されることで遺伝子操作されて、アラビノースを使用する改善された能力を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株、およびこれらの株を使用したエタノール生産に関する。これらの株をアラビノース含有培地中で培養すると、改善されたエタノール生産を有する。
【０００９】
したがって本発明は、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を提供し、上記微生物はアラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる。
【００１０】
これに加えて本発明は、
ａ）適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）異種性アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を（ａ）の株に導入するステップ
を含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を作成する方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様では本発明は、
ａ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースが上記株によってエタノールに変換されるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
【００１２】
別の実施態様では本発明は、
（ａ）アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株からなる群から選択される、アラビノース資化微生物を提供するステップと；
（ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を上記微生物のゲノム内に導入し、上記共輸送体が上記微生物によって発現されるステップと；（ｃ）（ｂ）の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、アラビノース−プロトン共輸送体を欠く上記微生物と比較して、上記微生物が増大した速度で上記アラビノースを代謝するステップ
を含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キシロースおよびアラビノース資化のために遺伝子操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のエタノール発酵経路のダイアグラムを示し、ｇｌｆはグルコース促進性拡散輸送体を意味する。
【図２】ｐＡＲＡ２０５のプラスミドマップの図面である。
【図３】ｐＡＲＡ３５４のプラスミドマップの図面である。
【図４Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図４Ｂ】９６時間経過中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図４Ｃ】９６時間経過中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図６】ｐＡＲＡ１１２のプラスミドマップの図面である。
【図７】ｐＡＲＡ１１３のプラスミドマップの図面である。
【図８Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図８Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図８Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６（Ｃ）の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【００１５】
配列説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１６】
【表１】
【００１７】
配列番号２１および２２は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＡ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００１８】
配列番号２３および２４は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００１９】
配列番号２５および２６は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００２０】
配列番号２７は、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２８および２９は、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号３０は、ＲＢＳおよび３’ＵＴＲを含む、ａｒａＤ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３１および３２は、ＲＢＳおよび３’ＵＴＲを含む、ａｒａＤ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３３は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＰｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号３４および３５は、ＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号３６は、ＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号３７および３８は、スペクチノマイシン耐性カセットのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号３９および４０は、付加ＮｃｏＩ部位を除去するＰｇａｐ変異誘発のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４１は、ｐＡＲＡ２０５プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号４２および４３は、ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号４４は、ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号４５および４６は、ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号４７は、ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号４８は、ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号４９は、ｐＡＲＡ３５４プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号５０および５１は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡの５’組み込みをチェックするためのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号５２および５３は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡの３’組み込みをチェックするためのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号５４および５５は、ａｒａＥコード領域ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号５６は、ａｒａＥＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号５７および５８は、ａｒａＦＧＨ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号５９は、ａｒａＦＧＨ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号６０および６１は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＰｇｉＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライ
マーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号６２は、ＰＣＲテンプレートとして使用されるプラスミド中のアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号６３は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＰｇｉＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号６４は、クロラムフェニコール耐性マーカーのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号６５は、ｐＡＲＡ１１２プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号６６は、ｐＡＲＡ１１３プラスミドのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体を発現するようにさらに遺伝子操作されてアラビノース資化能が改善された組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株と、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする遺伝子を導入することにより株を遺伝子操作する方法とについて記載する。別の態様では、本発明はアラビノース資化を改善する方法、および上記株を使用してアラビノースを含んでなる培地中でエタノールを生産する方法について記載する。アラビノース−プロトン共輸送体を発現するアラビノース資化株はアラビノース資化能が改善され、アラビノースを含んでなる培地中でのエタノール生産に有用である。
【００４９】
アラビノース資化能が改善された本株によって生成されるエタノールは、化石燃料の代替エネルギー源として使用してもよい。
【００５０】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義を使用する。
【００５１】
本明細書での用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」という用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含を範囲に含むことが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または」は包含的「または」を指し、排他的「または」を指さない。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（または存在する）Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）Ｂは真である（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００５２】
また本発明の要素または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成要素の事例（すなわち発生）の数に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数が明らかに単数形を意味する場合を除き複数形もまた含む。
【００５３】
「遺伝子」は特定タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）と、コード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を含
んでもよい。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」は、それ自身の制御配列と共に自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒には見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物中に見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００５４】
「ａｒａＥ」という用語は、Ｋｍが１．２５×１０-4Ｍである低親和性大容量アラビノース輸送体である細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする、遺伝子または遺伝子コンストラクトを指す。アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする遺伝子は非常に多様な細菌から単離されてもよく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌からのものが本発明で特に有用である。
【００５５】
「アラビノース資化」という用語は、微生物の文脈で使用される場合、その微生物が生成物、特にエタノールの生産のためにアラビノースを資化する能力を指す。
【００５６】
「適応株」という用語は、生成物の生産のために炭素源を使用する能力を改善するために、特定の炭素源上での成長について選択された微生物を指す。例えば「アラビノース適応株」は、高濃度のアラビノース上での成長について選択された微生物株である。
【００５７】
「遺伝子コンストラクト」という用語は、１つ以上の特定タンパク質の発現をコードする核酸断片を指す。遺伝子コンストラクト中では、遺伝子は天然、キメラ、または外来性であってもよい。典型的に遺伝子コンストラクトは、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００５８】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。 一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型中において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を誘導してもよいことは、当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００５９】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、遺伝子から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑止できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「過剰発現」は、通常のまたは非形質転換された生物中での生産レベルを越える、遺伝子導入生物中における遺伝子産物の生成を指す。「同時抑制」は、同一のまたは実質的に同様の外来性または内在性性遺伝子の発現を抑止できる、センスＲＮＡ転写物または断片の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６０】
「形質転換」という用語は、本明細書での用法では、遺伝的に安定した遺伝形質をもた
らす宿主生物中への核酸断片の転移を指す。転移核酸は、宿主細胞中に保持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの転移核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００６１】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書での用法では、細胞の中央代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を保有することが多い染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合されまたは組み換えられて独自構造体になり、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入できる。
【００６２】
「作動的に連結する」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を与えられる場合、それはコード配列と作動的に連結する（すなわちコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結し得る。
【００６３】
「選択可能なマーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐性に基づいて選択できる、通常、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果を使用して関心のある核酸の遺伝形質を追跡し、および／または関心のある核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。
【００６４】
本明細書での用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝コード中の性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６５】
「コドン最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子コード領域について言及される場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変化させることのない、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する遺伝子または核酸分子コード領域中のコドンの改変を指す。
【００６６】
「炭素源」という用語は、微生物がエタノールなどの生成物を生産する発酵過程において使用し得る、オリゴ糖類および単糖類などの糖（「発酵性糖」）を指す。微生物は生成物の産生のために単一炭素源を使用する能力を有してもよく、したがって同炭素源は本明細書で「唯一の」炭素源と称される。
【００６７】
「リグノセルロース誘導体」という用語は、リグニンおよびセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００６８】
「セルロース誘導体」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースをはじめとする追加的構成要素とを含んでなる組成物を指す。
【００６９】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖または炭素源の生成を指す。
【００７０】
「前処理生物由来資源」という用語は、糖化に先だって前処理された生物由来資源を意味する。
【００７１】
「生物由来資源」は、あらゆるセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含んでなる材料、および任意にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。生物由来資源はまた、タンパク質および／または脂質などの追加的構成要素を含んでなってもよい。生物由来資源は単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は１つを超える原料に由来する混合物を含んでなり得る。生物由来資源は、単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は1つ以上の原料に由来する混合物からなり得て、例えば生物由来資源は、トウモロコシの穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなり得る。生物由来資源としては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭ごみ、木材および森林廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。生物由来資源の例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガムバガスまたは茎葉、ダイズ茎葉、穀物製粉から得られる成分、木材、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および動物堆肥が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
「生物由来資源加水分解産物」は、生物由来資源の糖化から得られる生成物を指す。生物由来資源はまた、糖化に先だって前処理または前加工されてもよい。
【００７３】
「異種性」という用語は、関心のある位置に天然では見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、宿主生物中には天然では見られず、遺伝子移入によって宿主生物内に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種性核酸分子は、天然では互いに付随しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子など、天然ではキメラ遺伝子のその他のセグメントに付随して見られない核酸分子である。
【００７４】
本明細書での用法では、「単離核酸分子」は、任意に合成、非自然的または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００７５】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、一本鎖形態の核酸断片が他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、特にその中の第１１章および表１１．１で例証されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーンするために調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分間の繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分間の２回の繰り返しの一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い
温度を使用し、その中で洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されること以外は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましい組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で２回の最終洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組は、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチもあり得る。核酸をハイブリダイズさせる適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られている変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、９．５０〜９．５１）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、１１．７〜１１．８）。一実施態様ではハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素に準じて、温度および洗浄溶液塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識するであろう。
【００７７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「相当な部分」は、当業者による配列の手動評価、またはコンピュータ自動化配列比較とＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用した同定のどちらかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分である、ポリペプチドまたは遺伝子ヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に、既知のタンパク質または遺伝子と相同的なポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するには、１０以上の隣接するアミノ酸配列または１３以上のヌクレオチドが必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、遺伝子同定の配列依存法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定核酸断片を得るためのＰＣＲにおける増幅プライマーとして、１２〜１５塩基のより短いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「相当な部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、今や開示される配列の全てまたは相当な部分を使用してもよい。したがって本発明は、添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義されるこれらの配列の相当な部分を含んでなる。
【００７８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記載するのに使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００７９】
「相同性」および「相同的」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらは
、その中で１つ以上のヌクレオチド塩基の変更が、核酸断片が遺伝子発現を仲介し、または特定の表現型を生成する能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は理解するであろうように、本発明は、特定の具体的配列以上のものを包含すると理解される。
【００８０】
さらに当業者は、本発明に包含される相同的な核酸配列はまた、中程度にストリンジェントな条件（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書で例証される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等である本明細書で開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることを認識する。
【００８１】
「％同一性」という用語は、当該技術分野で知られているように、配列を比較して判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野で「同一性」はまた、場合によっては、このような配列ストリング間のマッチにより判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算され得る。１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）。
【００８２】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良のマッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化される。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖとラベルされるアラインメント法に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）をはじめとする、アルゴリズムのいくつかのバラエティーを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで「％同一性」得ることができる。さらにＣｌｕｓｔａｌ Ｗとラベルされるアラインメント法に相当して、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）ｖ６．１プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）を利用できる。多重アラインメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることができる。
【００８３】
その他の種からのポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によって良く理解され、このようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する。％同一性の有用な例としては、以下が挙げられるがこれに限定されるものではない。２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％；または２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの２４％から１００％までのあらゆる整数百分率が、本発明について記述する上で有用かもしれない。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年），１９９２年会議，１１１〜２０，編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００８５】
本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）に記載されている。
【００８６】
本発明は、アラビノース含有培地中で発酵させると改善されたアラビノース資化能を有する、アラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の遺伝子操作株と、同株を使用してエタノールを生産する方法とに関する。典型的に生物由来資源の前処理および糖化によって生成される生物由来資源加水分解産物を含む培地中における、生体触媒の発酵によるエタノール生産の改善にとって難しい課題は、アラビノースの効率的な資化を得ることである。アラビノースは、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖の１つであり、その他はキシロースである。出願人らは、発酵がアラビノースを含有する培地中である場合、アラビノース−プロトン共輸送体の発現が、アラビノース資化株によるアラビノース資化における効率増大と、ひいてはより高いエタノール収率をもたらすことを発見した。
【００８７】
アラビノース資化宿主株
アラビノースを炭素源として資化できるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）のあらゆる株を本発明の株を調製するための宿主として使用してもよい。 アラビノースのエタノールへの発酵のために遺伝子操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株が、特に有用である。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、以下をコードする遺伝子を導入することにより、アラビノース資化能のために遺伝子操作された。１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５８４３７６０号明細書；および本明細書の実施例１および２に記載される；図１のダイアグラム参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、アラビノースを代謝できるいずれの微生物から得てもよい。コード領域の起源としては、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。特に有用なのは、Ｌ−アラビノースイソメラーゼのためのａｒａＡのコード領域（コード領域配列番号２１；タンパク質配列番号２２）、Ｌ−リブロキナーゼのためのａｒａＢのコード領域（コード領域配列番号２３；タンパク質配列番号２４）、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼのためのａｒａＤのコード領域（コード領域配列番号２５；タンパク質配列番号２６）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。これらのタンパク質およびそれらのコード領域は、当業者によって、バイオインフォマティクスまたはａｒａＥについて下述する実験法を使用して、上に列挙したものなどのその他のアラビノース資化微生物中で容易に同定されてもよい。
【００８８】
さらにアラビノースからエタノールへの生合成経路中で、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性が使用される（図１参照）。トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼは、キシルロース−５−リン酸を中間体に変換するペントースリン酸経路の２つの酵素であり、中間体は五炭糖代謝を解糖作用のエントナードゥドロフ経路に連結して、アラビノースまたはキシロースのエタノールへの代謝を可能にする。これらは内在性活性であってもよく、または内在性活性がこれらの酵素の導入された活性を補足してもよい。
【００８９】
典型的にアラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、キシロース資化のためにもまた遺伝子操作される。参照によって本明細書に援用する米国特許第５５１４５８３号明細書に記載されるように、典型的にキシロース代謝に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入される（図１）。これらとしては、上述のようなトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ならびにキシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる（図１参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびいくつかの酵母および真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。特に有用なのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。
【００９０】
発現では、アラビノース資化タンパク質およびキシロース資化タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中で発現されるプロモーターおよび転写ターミネーターと作動的に連結する。使用してもよいプロモーターの例としては、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素コーディング遺伝子のプロモーター（ＧＡＰプロモーター；Ｐｇａｐ）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼコーディング遺伝子のプロモーター（ＥＮＯプロモーター；Ｐｅｎｏ）、およびアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼコーディング遺伝子のプロモーター（ＧＩプロモーター、Ｐｇｉ）が挙げられる。コード領域は、典型的にキメラ遺伝子としてプロモーターから個別に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域が、同一プロモーターから発現するオペロン中で結合してもよい。得られたキメラ遺伝子および／またはオペロンは、さらなる操作のために、典型的にベクターに構築されまたは導入される。
【００９１】
ベクターについては当該技術分野で良く知られている。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のために特に有用なのは、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の双方の中で複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内の自律複製のためのプラスミドと、細胞ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドを含んでもよい。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン、標的細胞ゲノムと相同的な核酸配列領域、部位特異的組み込み配列、または組み込みを支援するその他の配列を含んでもよい。相同的組換えにおいては、本明細書の実施例２に記載されるように、標的ゲノム部位への選択可能なマーカーおよびキメラ遺伝子の挿入をもたらす、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはその他の選択可能なマーカーと、所望のキメラ遺伝
子とに境を接して、標的組み込み部位に隣接するＤＮＡ配列を配置させる。さらに選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後に耐性遺伝子をゲノムから切除してもよいように、部位特異的組み換え部位と境を接してもよい。
【００９２】
特定の用途があるキシロース資化株としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉら，（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１〜３２５）、および誘導体ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４があるＺＷ６５８（同一譲受人同時係属米国特許公開第２００８０２８６８７０号明細書；寄託ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。また参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書に記載されるＺＷ７０５を使用してもよい。使用してもよいアラビノース資化株は、参照によって本明細書に援用する米国特許第５８４３７６０号明細書で開示され、ならびに本明細書の実施例１および２に記載される。
【００９３】
アラビノース資化能の適応
上述のようにキシロースおよびアラビノースの資化のために遺伝子操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、出願人らによって、試験成長条件において、アラビノースが唯一の炭素源（５０ｇ／Ｌ）である場合は培地中のアラビノースの約３３％を資化し、２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースの混合糖を含む培地中ではアラビノースの約６８％を資化することが分かった。改善されたアラビノース資化能を有する株を得る試みにおいて、出願人らは、本明細書の実施例２に記載されるように、唯一の炭素源として５０ｇ／Ｌアラビノースがある培地中での連続成長によって、キシロースおよびアラビノース資化株からの細胞を適応させた。この方法を使用することで、アラビノースが唯一の炭素源である培地中においてアラビノース資化能にかなりの改善を有する単離株が得られ、それはアラビノース適応株である。例えば１つの株は、５０ｇ／Ｌのアラビノースが唯一の炭素源である培地中のアラビノースの約８３％を使用する。２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースを含有する混合糖培地中では改善はより少なく、約７４％のアラビノースが使用された。また混合糖培地中では、アラビノースの資化は、グルコースおよびキシロースの資化と比較して遅延された。
【００９４】
改善されたアラビノース資化能を有する株を得るために、上述のようにアラビノース資化遺伝子の発現について遺伝子操作株を約２０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ以上の濃度でアラビノースを唯一の炭素源として含有する培地中での連続成長によって適応させてもよい。適応はより低いアラビノース濃度中であってもよいが、初期成長は約２０ｇ／Ｌ以上の濃度中である。連続成長は、典型的に少なくとも約２５の倍加である。適応は、下述される異種性アラビノース−プロトン共輸送体をアラビノース資化株に導入するステップの前または後であってもよい。これに加えて細胞は、異種性アラビノース−プロトン共輸送体の導入前および後の双方において適応されてもよい。
【００９５】
改善されたアラビノース資化能を遺伝子操作するための発見
出願人らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在する２つの異なるアラビノース輸送系の発現のために、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシロースおよびアラビノース資化株を遺伝子操作した。２つの輸送系は、１）ａｒａＦＧＨによってコードされる３つのタンパク質（ａｒａＦによってコードされる３３ｋＤのペリプラスムアラビノース結合タンパク質、ａｒａＧによってコードされる５５ｋＤの膜結合ＡＴＰアーゼ、およびａｒａＨによってコードされる３４ｋＤの膜結合タンパク質）から構成されるＡＢＣ輸送体；および２）１つのタンパク質（ａｒａＥによってコードされる５２ｋＤのアラビノース−プロトン共輸送体）から構成されるアラビノース−プロトン共輸送体である。ＡＢＣ輸送体
はＫｍが３×１０−６Ｍの高親和性低容量アラビノース輸送体である一方、アラビノース−プロトン共輸送体はＫｍが１．２５×１０-4Ｍの低親和性高容量アラビノース輸送体である。出願人らは、アラビノースのみの培地中では、ＡＢＣ輸送体の発現が、実際にはアラビノース資化能の低下をもたらすことを見いだした。アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方でアラビノース資化能を増大させた。したがって出願人らは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＢＣ輸送体がアラビノース資化能を改善しない一方、アラビノース−プロトン共輸送体はアラビノース資化能を改善することを発見した。アラビノース−プロトン共輸送体の発現によって、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方で、アラビノース資化能は大きく増大した。
【００９６】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、全ての試験された株でアラビノース資化能を増大させた。これらには、適応なしのアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株、ストレス条件でキシロース資化について適応させたアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書で開示される）、および上述され実施例２に記載されるように、ストレス条件でキシロース資化とアラビノース資化についても適応されたアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が含まれる。アラビノース適応のない株では、アラビノース資化能は、アラビノースのみの培地ならびに混合糖培地中で少なくとも約２８％増大した。またアラビノース適応株では、アラビノース資化能は、混合糖培地中で少なくとも約２８％増大した。アラビノースのみの培地では、アラビノース−プロトン共輸送体の発現なしのアラビノース適応親株中のアラビノース資化能のレベルは既に約８０％であり、したがってアラビノース資化能の増大は２０％を越えることはできず約１８％であった。
【００９７】
したがってアラビノース資化株とも称される、アラビノースを資化できるあらゆるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を使用して、本株を作り出してもよい。特に有用なのは、キシロースおよびグルコースをさらに資化する株である。これらの株中では、アラビノース−プロトン共輸送体を発現することによって、アラビノース資化能は少なくとも約１０％改善される。アラビノース資化能は、少なくとも約１０％、１２％、１６％、１８％、２０％、２４％、２８％以上改善されてもよい。％改善は、培地タイプおよびアラビノース−プロトン共輸送体の発現を遺伝子操作するのに使用される親微生物をはじめとする使用される成長条件、ならびに特定の得られた改変株に応じて変動してもよい。変動を引き起こす要因としては、形質転換体の間で異なるかもしれない、導入されたアラビノース−プロトン共輸送体の発現レベル、および得られる輸送体の活性レベルが挙げられる。
【００９８】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現
本遺伝子操作ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞中では、あらゆる細菌アラビノース−プロトン共輸送体が発現されてアラビノース資化能の増大を提供してもよい。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中での発現のための細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびそれらのコード配列は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中に天然では見られないので、それらは異種性である。発現されてもよいアラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびコード配列の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（コード領域配列番号１；タンパク質配列番号２）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（コード領域配列番号３；タンパク質配列番号４）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）（コード領域配列番号５；タンパク質配列番号６）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（コード領域配列番号７；タンパク質配列番号８）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（コード領域配列番号９；タンパク質配列番号１０）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）（コード領域配列番号１１；タンパク質配列番号１２）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（コード領域配列番号１３；タンパク質配列番号１４）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（コード領域配列番号１５；タンパク質配列番号１６）、エンテロバクター・カンセロゲヌス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）（コード領域配列番号１７；タンパク質配列番号１８）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（コード領域配列番号１９；タンパク質配列番号２０）のａｒａＥ遺伝子によってコードされるものが挙げられる。
【００９９】
上に列挙して表１に示した配列番号で例証されるように、アラビノース−プロトン共輸送体コード領域およびコードされるタンパク質の配列は良く知られているので、追加的な適切なアラビノース−プロトン共輸送体は、バイオインフォマティクスアプローチを用いた配列類似性に基づいて、当業者によって容易に同定されてもよい。典型的に、本株中で使用してもよい追加的なアラビノース−プロトン共輸送体、およびそれらのコード配列を同定するのには、本明細書で提供されるものなどの既知のアラビノース−プロトン共輸送体アミノ酸配列を用いた、公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上述）検索が使用される。これらのタンパク質は、アラビノース−プロトン共輸送体活性を有する一方で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のアラビノース−プロトン共輸送体のいずれかと、少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％または９５％〜９９％の配列同一性を有してもよい。アイデンティティは、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメーターを使用した、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づく。
【０１００】
タンパク質またはコード領域配列およびバイオインフォマティクス法を使用して追加的アラビノース−プロトン共輸送体を同定するのに加えて、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で列挙される配列を使用して、自然界のその他の相同体を実験的に同定してもよい。例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体をコードする核酸断片のそれぞれを使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離については、当該技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法；２．）核酸増幅技術の様々な使用［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２年）]によって例証される、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、；および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０１】
例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列と類似したタンパク質またはポリペプチドのコード領域は、当業者に良く知られている方法を使用して、あらゆる所望の生物からのライブラリーをスクリーンするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部または一部を使用して、直接単離できる。開示される核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で知られている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）によってデザインし合成し得る。さらに配列全体を直接使用して、当業者に知られている方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術）によってＤＮＡプローブを合成し、または利用できる生体外転写系を使用してＲＮＡプローブを合成し得る。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（またはその全長）を増幅し得る。得られる増幅産物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションによって完全長ＤＮＡ断片を単離し得る。
【０１０２】
典型的にＰＣＲタイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有して互いに相補的でない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製の双方を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーのデザイン方法は一般的であり、当該技術分野で良く知られている（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編，（１９８６年）３３〜５０頁，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編，（１９９３年）第１５巻，３１〜３９頁，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１０３】
一般に、記載される配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコル中で使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンされた核酸断片のライブラリー上で実施してもよく、その中では１つのプライマーの配列が、記載される核酸断片から誘導され、その他のプライマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体をコードする微生物の遺伝子の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を活用する。
【０１０４】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物および３’または５’末端の単一点間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを作成し得る。本配列から、３’および５’方向に配向したプライマーをデザインし得る。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えばＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離し得る（Ｏｈａｒａら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１０５】
代案としては、記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列を相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基礎的構成要素としては、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５個の塩基から数万個の塩基まで変動し得て、実施される特定の試験に左右される。典型的に、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列間の相補性は、必ずしも完璧である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間では起きず、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基画分は、適切な相補的塩基と対をなさない。
【０１０６】
ハイブリダイゼーションの方法については、詳細に定義されている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくては
ならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩の存在下でプローブとサンプルを接触させるステップを伴う。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸の間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるのに十分な時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起きるのに必要な時間を左右する。プローブまたは標的濃度が高いほど、より短いハイブリダイゼーションインキュベーションが必要である。任意にカオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性阻害することで核酸を安定化する。さらにカオトロピック剤は、室温における短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在する。所望ならば、ホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で、ハイブリダイゼーション混合物に添加してもよい。
【０１０７】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用い得る。典型的に、これらは約２０〜６０容積％、好ましくは３０容積％の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９））、約０．０５〜０．２％の洗剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、断片化核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および任意に約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。多様な極性水溶剤または膨潤剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリアクリル酸メチル）、およびアニオン性糖重合体（例えば硫酸デキストラン）をはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤もまた含めてもよい。
【０１０８】
核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形態に適合できる。最も適した１つが、サンドイッチアッセイ形態である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下におけるハイブリダイゼーションに特に適合する。サンドイッチタイプアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部に相補的な核酸プローブに吸着され、またはそれと共有結合的に共役して、それを固定化する。
【０１０９】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする配列を用いて形質転換することで達成される。当該技術分野で知られているように、遺伝コードの縮重の理由から、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列中に多様性があってもよい。当業者に良く知られているように、コード配列は、標的ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）宿主細胞中における最大の発現のためにコドン最適化されてもよい。典型的に、所望のコード領域と作動的に連結してザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で活性のプロモーター、ならびに転写ターミネーターを含むキメラ遺伝子が、発現のために使用される。アラビノース資化のためのタンパク質発現のために、上で述べた例などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で活性のあらゆるプロモーターを使用してもよい。上述したようにコード領域が異なる生物からのものであるため、プロモーターおよびアラビノース−共輸送体コード領域を用いて構築されたキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中での発現について異種遺伝子である。発現および／また
は組み込みのためのベクターは、アラビノース資化のためのタンパク質発現について上述した通りである。
【０１１０】
改善されたエタノール生産
本株は、唯一の炭水化物源としてアラビノースがある培地中で、およびアラビノースを含む混合糖がある培地中で、改善されたアラビノース資化能を有する。本株はまた、改善されたエタノール生産も有する。アラビノース−プロトン共輸送体発現遺伝子の導入に先だつ親株と比較して、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する株のエタノール生産は増大する。エタノール生産の増大は、発酵で使用される培地および成長条件、ならびに生体触媒として使用されるアラビノース−プロトン共輸送体発現株次第で変動してもよい。典型的にエタノール生産は少なくとも約１０％増大してもよく、約１０％、１２％、１６％，１８％、２０％、２４％、２８％以上増大してもよい。
【０１１１】
改善されたアラビノース資化株の発酵
株に天然の生成物、または株が産生するよう遺伝子操作された生成物を生産する発酵において、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼの発現のために、アラビノース−プロトン共輸送体および遺伝子またはオペロンを発現する遺伝子操作されたアラビノース資化株を使用してもよい。例えばザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ
ｐａｌｍａｅ）は、天然のエタノロジェンである。キシロースもまた資化する、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のためにさらに遺伝子操作された株が好ましい。例として、キシロースおよびアラビノースを資化する本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの生産について記載する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、天然でグルコースもまた資化する。
【０１１２】
エタノール生産のために、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する組み換えキシロースおよびアラビノース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をアラビノース含有培地と接触させる。典型的に培地は、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含む混合糖を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、生物由来資源加水分解産物を含有してもよい。
【０１１３】
同一譲受人同時係属米国特許公開第２００８００８１３５８−Ａ１号明細書で開示されるように、成長が阻害される程に混合糖の濃度が高い場合、培地はソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールをソルビトールまたはマンニトールで置換してもよく、またはそれと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が起きてエタノールが生産される培地中で培養する。発酵は、空気、酸素、またはその他の気体の補給なしに（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）、少なくとも約２４時間実施され、３０以上時間実施されてもよい。最大のエタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在するとより長い発酵時間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の温度および約４．５〜約７．５のｐＨで実施されてもよい。
【０１１４】
本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、実験室規模の発酵槽内で、および商業的な量のエタノールが生産される大規模発酵において、アラビノースを含む混合糖を含有する培地中で培養してもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養法を応用してもよい。例えば本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大量生産は、バッチおよび連続培養法の双方によって生成されてもよい。古典的バッチ培養法は閉鎖系であり、培地組成物は培養開始時に設定され、培養過程中に人為的変更を受けない。したがって培養過程の開始時に所望の生物を培地に接種して、システムに何も添加することなく成長または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してのバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物由来資源組成物は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養中では、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期を経て、最後に成長率が減少しまたは停止する定常期に至る。処置されない場合、定常期の細胞はやがて死滅する。対数期の細胞は、いくつかのシステムにおいて、最終産物または中間体の生成の大半の責を負うことが多い。その他のシステムでは、静止期または対数後期生産があり得る。
【０１１５】
標準バッチシステムの変法が、流加システムである。流加培養過程もまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の成長に適し、培養過程の進行に伴って基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加システムは、異化代謝産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合、そして培地中に限定的量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加システム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってｐＨやＣＯ２などの廃ガス分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で良く知られており、参照によって本明細書に援用するＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，およびＢｒｏｃｋ，第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２年）に例が見られる。
【０１１６】
エタノールの商業生産はまた、連続培養を用いて達成されてもよい。連続培養は、規定培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に加工のために等量の慣熟培地が取り出される開放系である。連続の培養は、一般に、細胞が主として対数成長期にある一定の高液相密度に細胞を保つ。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、当業者に知られている天然および／または合成材料から構成される、多様な固体担体を使用して実施してもよい。
【０１１７】
連続または半連続培養は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはあらゆる数の要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、その他の全パラメーターを加減する。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に変更し得る。連続系は恒常的成長条件を保つことを目指し、したがって培地の除去による細胞損失は、培養中の細胞成長率に対して平衡状態になくてはならない。連続培養過程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法がＢｒｏｃｋ、前出で詳述されている。
【０１１８】
エタノール生産に特に適するのは、次のような発酵計画である。本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃の半天然培地中で振盪フラスコ内で培養し、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。ＯＤ６００が３〜６になるまで種培養物を種発酵槽内で嫌気的に培養してから、発酵パラメーターをエタノール生産のために最適化した生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種体積は、約２％から約２０％ｖ／ｖの範囲に及ぶ。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物またはダイズベース製品などの複合窒素源（０〜１０ｇＬ）などの最少培地構成要素を含有する。最終濃度約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。最初の炭素源バッチ（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際し、炭素源を提供するアラビノースと、グルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的糖とを含む混合糖が発酵容器に継続的に添加されて、エタノール速度と力価を最大化する。炭素源供給速度は動的に調節されて、酢酸などの毒性副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを培養が蓄積しないようにする。資化される基質から生成するエタノールの収率を最大化するために、最初にバッチ供給され、または発酵過程中に供給される一定量のリン酸塩によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、腐食性溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）および硫酸またはリン酸のどちらかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に調節される。発酵槽の温度は３０℃〜３５℃に調節される。気泡を最小限にするために、消泡剤（シリコーン基剤、有機基剤などのあらゆる種類）を必要に応じて容器に添加する。株中にそれに対する抗生物質耐性マーカーがある場合、カナマイシンなどの抗生物質を任意に使用して汚染を最小限にしてもよい。
【０１１９】
さらに発酵は、ＳＳＦ（同時糖化発酵）法を使用した糖化と同時に起きてもよい。この方法では、生物由来資源が生産生体触媒によって代謝されるにつれて、糖が生物由来資源から生成する。
【０１２０】
上述のあらゆる条件の組、さらに当該技術分野で良く知られているこれらの条件のバリエーションは、アラビノース−プロトン共輸送体の異種性コード領域を導入することによりアラビノース−プロトン共輸送体を発現するように遺伝子操作された、アラビノース資化組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株によるエタノール生産のための適切な条件である。
【実施例】
【０１２１】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。実施例は、本発明の好ましい実施態様を示唆しながら、例証としてのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１２２】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）に記載されている。
【０１２３】
略語の意味は次の通り。「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感応性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感応性を意味し、「ＵＴＲ」は非翻訳領域を意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味する。
【０１２４】
プライマーは、特に断りのない限りＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）によって合成された。
【０１２５】
実施例１
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のアラビノース資化タンパク質のためのオペロンの構築および発現
アラビノース資化のためにザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を遺伝子操作するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＣコード領域をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プロモーターと共にオペロン中で構築し、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中のプラスミド上で発現させた。ＡｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤは、それぞれタンパク質Ｌ−リブロースキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼをコードし、それはトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性と併せて、アラビノース同化作用経路を提供する（図１参照）。
【０１２６】
１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤコード配列およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターをクローニングする
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤコード領域（それぞれ配列番号２３、２１、および２５）は、ａｒａＢＡＤオペロン中に存在する。それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーａｒａ１（配列番号２８）およびａｒａ２（配列番号２９）を使用して、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片（ａｒａＢＡ；配列番号２７）を調製した。プライマーａｒａ１は、ａｒａＢコード領域の開始コドンＡＴＧの前にヌクレオチドＣＣを付加してＮｃｏＩ部位を作り出す。プライマーａｒａ２は、ａｒａＡコード領域の停止コドンの後にＸｂａＩ部位を付加する。ａｒａＤ ＤＮＡ断片（配列番号３０）は、それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーａｒａ３（配列番号３１）およびプライマーａｒａ４（配列番号３２）を使用して調製された。プライマーａｒａ３は、ａｒａＤコード領域に対して５’である、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列の５’末端にＸｂａ部位を付加する。プライマーａｒａ４は、ａｒａＤコード領域に対して３’である、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加する。ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマー、およびＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ番号７００９２６；Ｋ１２株）から調製された２μＬ（約５０〜１００ｎｇ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを含む、標準ＰＣＲ反応において各プライマー対を使用した。プライマーａｒａ１およびａｒａ２を使用した反応を９５℃で５分間実施し、３５サイクルの９５℃で３０秒間／５６℃で３０秒間／６８℃で３．５分間がそれに続き、６８℃で７分間で終了した。それは５’ＮｃｏＩ部位およびａ３’ＸｂａＩ部位がある３２２６ｂｐのａｒａＢ−ａｒａＡ断片をもたらした（配列番号２７）。６８℃での延長時間が１．５分間に短縮されたこと以外は同様のプログラムを使用して、プライマーａｒａ３およびａｒａ４を使用した別の反応を実施した。それは５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位がある８８９ｂｐのａｒａＤ断片（ａｒａＤ３’ＵＴＲを含む）を生じた（配列番号３０）。
【０１２７】
ａｒａＢＡＤオペロンのための天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターは誘導性プロ
モーターであり、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での所望の発現に適さない。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のための強力な構成的プロモーターであることから、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）プロモーター（Ｐｇａｐ；配列番号３３）を使用した。オリゴヌクレオチドプライマーａｒａ１０およびａｒａ１１を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐを含有するＤＮＡ断片を調製した。プライマーａｒａ１０（配列番号３４）は、プロモーターＤＮＡ断片の５’末端にＳａｃＩおよびＡｐｅＩ部位を付加する順方向プライマーである。プライマーａｒａ１１（配列番号３５）は、プロモーターの最後の２つのヌクレオチドをＡＣからＣＣに変化させる逆方向プライマーであり、したがってそれはプロモーターＤＮＡ断片の３’末端にＮｃｏＩ部位を付加する。ＤＮＡテンプレートとしてＰｇａｐを含有するプラスミドを使用し、これらの２つのプライマーを上述したような標準ＰＣＲ反応で使用して、５’ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位および３’ＮｃｏＩ部位がある３２３ｂｐのＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片（配列番号３６）を作成した。
【０１２８】
これらの各ＰＣＲ産物を製造業者の使用説明書に従って、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローンした。得られたプラスミドｐＴＰ−ａｒａＢ−ａｒａＡ、ｐＴＰ−ａｒａＤ、およびｐＴＰ−Ｐｇａｐを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してそれぞれを調製した。それらの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２９】
２．シャトルベクター内でＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをアセンブルする
ベクターｐＺＢ１８８（Ｚｈａｎｇら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０〜２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書）をベースとし、ベクターがザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で複製できるようにする複製領域を含有する、２，５８２ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を含む、ｐＺＢ１８８ａａｄａと称されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター内で、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをアセンブルした。ｐＺＢ１８８ａａｄａ中では、テトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃｒ−カセット）ｐＺＢ１８８が、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃｒ−カセット）で置換された。プラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎら，（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２〜１０８７）をテンプレートとして、プライマー１（配列番号３２ｆｒｏｍＣＬ４２３６）および２（配列番号３３ｆｒｏｍＣＬ４２３６）を使用したＰＣＲによって、Ｓｐｅｃｒ−カセットを作成した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするＴｒａｎｐｏｓｏｎ Ｔｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３）の公開された配列をベースとする、Ｓｐｅｃｒ−カセットおよびそのプロモーターのための完全なヌクレオチド配列を含有する。
プライマー１（配列番号３７）：
【化１】
プライマー２（配列番号３８）：
【化２】
【０１３０】
プライマー１（順方向プライマー）の下線付き塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットのプロモーターのすぐ上流で（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３のｎｔｓ４〜２２に）ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に相当する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線付き塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの停止コドンの約１３０塩基下流で（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３のｎｔｓ１００２〜１０２０に）ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に相当する。ＰＣＲにより生じた１０４８ｂｐのＳｐｅｃｒ−カセットをＣｌａＩとＡｆｌＩＩＩで二重消化し、得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）と供給業者の推奨プロトコルを使用して精製した。（（ｄａｍメチル化に感応性の）ＣｌａＩで切断するため、非メチル化プラスミドＤＮＡを得るために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）から単離された）プラスミドｐＺＢ１８８をＣｌａＩとＢｓｓＨＩＩで二重消化してＴｃｒ−カセットを除去し、得られた大きなベクター断片をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。次にこのＤＮＡ断片と精製ＰＣＲ産物を共に連結させ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した化学的コンピテント細胞（カタログ番号２００２３９）を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０中に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「付着末端」を発生させるが、それらが共に連結すると、どちらの部位も破壊されることに留意されたい。スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に形質転換体を播種して、３７℃で培養した。正確なサイズの挿入断片があるプラスミドを含有する、スペクチノマイシン耐性形質転換体をＮｏｔＩを用いた制限酵素消化分析によって同定し、ｐＺＢ１８８／ａａｄａと命名した。
【０１３１】
ｐＴＰ−ＰｇａｐＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇａｐ断片、ｐＴＰ−ａｒａＢ−ａｒａＡ ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ａｒａＢ−ａｒａＡ断片、およびｐＴＰ−ａｒａＤ ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ ａｒａＤ断片を全てＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクターにクローンして、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを含有するｐＺＢ１８８ａａｄａベースのシャトルベクターを形成した。ｐＡＲＡ２０１と称される得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。Ｐｇａｐの３’末端のヌクレオチドをＣＣから元のＡＣヌクレオチドに戻すことによって、ｐＡＲＡ２０５（図２；配列番号４１）をｐＡＲＡ２０１から調製した。これはＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施した。この変異誘発では、順方向プライマーａｒａ３１（配列番号３０）および逆方向プライマーａｒａ３２（配列番号４０）を使用して、製造業者の使用説明書に従って改変を行った。ｐＡＲＡ２０５を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。
【０１３２】
３．ａｒａＢＡＤをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で発現する
Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤがＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で機能するオペロンであることを確認するために、ｐＡＲＡ２０５を発現のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４に導入した。ＺＷ８０１−４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化株である。ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４株の構築および特性解析は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２００８０２８６８７０−Ａ１号明細書に記載される。逐次遺伝子転位事象を通じて、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）ゲノムに組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地上で適応させることで、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）を構築した。ＺＷ８００はＺＷ６５８の誘導体であり、それはグルコース−果糖オキシド還元酵素（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列中にスペクチノマイシン耐性カセットの二重交叉挿入を有して、この活性をノックアウトする。ＺＷ８０１−４はＺＷ８００の誘導体であり、その中ではスペクチノマイシン耐性カセットが部位特異的遺伝子組み換えによって欠失しており、タンパク質を時期尚早に切り詰めるインフレームの停止コドンが残されている。
【０１３３】
ＺＷ８０１−４のコンピテント細胞は、種細胞をＭＲＭ３Ｇ５（１％酵母抽出物、１５ｍＭＫＨ２ＰＯ４、４ｍＭＭｇＳＯ４、および５０ｇ／Ｌグルコース）中において１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でＯＤ６００値が５近くになるまで一晩培養することによって調製した。細胞を収集し、新鮮な培地にＯＤ６００値０．０５に再懸濁した。それらを同一条件下で、対数初期または中期（ＯＤ６００が０．５に近い）までさらに培養した。細胞を収集して、氷冷水で２回、次に氷冷１０％グリセロールで１回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷１０％グリセロールにＯＤ６００値１００近くに再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には非メチル化ＤＮＡを要するので、ｐＡＲＡ２０５プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換細胞の１つのコロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢブロス）中で３７℃で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、１０ｍＬの培養物からＤＮＡを調製した。
【０１３４】
１ＭＭ電気穿孔キュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で、およそ５００ｎｇの非メチル化ｐＡＲＡ２０５プラスミドＤＮＡを５０μＬのＺＷ８０１−４コンピテント細胞と混合した。ＢＴ７２０ Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを２．０ＫＶで細胞中に電気穿孔した。形質転換細胞を１ｍＬのＭＭＧ５培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）中において３０℃で４時間回復させ、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）内で、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上で３０℃で２日間培養した。個々のコロニーをＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０（ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０と同一であるがグルコースが５０ｇ／Ｌアラビノースによって置換されている）プレート上、および新しいＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に二連で画線塗抹した。上述したのと同一条件下で画線培養は良好に成長したが、ＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上の成長にはより長時間かかった。これはＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンが発現したことを示唆した。
【０１３５】
ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に成長した形質転換細胞の２本の画線培養（ＺＷ８０１−ａｒａ２０５−４およびＺＷ８０１−ａｒａ２０５−５）を７２時間成長アッセイのために選択した。アッセイでは、各画線培養からの細胞を２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加ＭＲＭ３Ｇ５）中において１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５（ＭＲＭ３Ｇ５と同一であるがグルコースがアラビノースによって置換されている）で洗浄し、ＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有するＭＲＭ３Ａ５）に再懸濁して、０．１の開始ＯＤ６００を得た。４ｍＬの懸濁液を１４ｍＬの蓋付きＦａｌｃｏｎ管に入れて、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間培養した。培養の終わりにＯＤ６００を測定した。次に１ｍＬの培養物を１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で、５５℃で０．６ｍＬ／分の速度で０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を用いてＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を通過させて分析し、エタノールおよび糖濃度を判定した。並行して、対照としてＺＷ８０１−４を（抗生物質なしで）培養し分析した。表２に示す結果は、ａｒａＢＡＤの発現がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４を成長できるようにし、唯一の炭素源としてアラビノースを使用してエタノールを生成できるようにしたことを実証する。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
実施例２
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへのアラビノース資化オペロンの組み込みおよび得られた株の特性解析
この実施例は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の２つのキシロース資化株へのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンの安定した組み込みについて記載する。
【０１３８】
１．Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを自殺ベクターに構築する
Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノムに組み込むために、ＤＣＯ（二重交叉）相同的組換えのための自殺ベクターを調製した。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤに加えて、このベクターは、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込みを導くＤＣＯ相同的組換え断片と、スペクチノマイシン耐性のための選択的マーカーを提供するａａｄＡ遺伝子とを含んだ。我々は挿入部位としてｌｄｈＡ遺伝子座を選んだ。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４ ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＤＣＯ、ＬＤＨ−Ｌ、およびＬＤＨ−Ｒのための２つのｌｄｈＡ ＤＮＡ断片をＰＣＲによって合成した。反応はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｍｉｘを使用して、実施例１に記載される標準ＰＣＲ手順に従った。ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２０（配列番号４２）および逆方向プライマーａｒａ２１（配列番号４３）を使用して合成された。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域に対して５’の配列、およびｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド１〜４９３を含む８９５ｂｐのＤＮＡ断片であり、５’ＳａｃＩ部位および３’ＳｐｅＩ部位があった（配列番号４４）。ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２２（配列番号４５）および逆方向プライマーａｒａ２３（配列番号４６）を使用して合成した。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド４９４〜９９６、およびｌｄｈＡコード領域に対して３’の配列を含む１１６９ｂｐの断片であり、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＮｏｔＩ部位があった（配列番号４７）。
【０１３９】
ｐＢＳベクターはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で複製できないことから、ｐＢＳ ＳＫ（＋）（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を自殺ベクターとして使用した。ｐＡＲＡ２０５のＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロン、ＬＤＨ−Ｌ断片、およびＬＤＨ−Ｒ断片をｐＢＳＳＫ（＋）中にクローニングすることで、ｐＡＲＡ３５４（配列番号４９）を構築した。さらに野性型ＬｏｘＰ部位（ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ断片；配列番号４８）によって境界される、（スペクチノマイシン耐性のための）ａａｄＡマーカーを含有するＤＮＡ断片をｐＡＲＡ３５４に含めた。ｐＡＲＡ３５４はＬＤＨ−ＬとＬＤＨ−Ｒ配列との間に位置する、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンおよびＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗマーカー断片を有する。
【０１４０】
図３は１０，４４１ｂｐのｐＡＲＡ３５４のマップを示す。これはｆ１（＋）ｏｒｉｇ
ｉｎと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを有する。ＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒは、それぞれｌｄｈＡコード配列の最初の４９３塩基対と残りの５０３塩基対を有したので、 交叉型組み換えによって、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のｌｄｈＡコード配列に、ヌクレオチド＃４９３と＃４９４の間でＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤおよびａａｄＡを直接挿入するために、ｐＡＲＡ３５４がデザインされた。
【０１４１】
２．Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株を作成する
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ７０５はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子操作株であり、ストレス条件下で改善されたキシロース資化能があり、参照によって本明細書に援用する同時係属同一譲受人の米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書に記載されるように、連続培養中での適応によってＺＷ８０１−４から誘導される。ＺＷ８０１−４キシロース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を少なくとも約５０ｇ／Ｌのキシロースを含んでなる培地中で連続培養して、エタノールを含んでなる培養物を生成し、次にアンモニアおよび酢酸を添加してストレス培養物を作成した。細胞をストレス培養中でさらに連続培養して、ＺＷ７０５株をはじめとする改善されたキシロース資化能を有する細胞を単離した。
【０１４２】
ｐＡＲＡ３５４をＺＷ７０５およびＺＷ８０１−４株の双方に形質転換するために、各株から調製された５０μＬコンピテント細胞中に、８００ｎｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを電気穿孔した。ＤＮＡ脱メチル化、コンピテント細胞調製、および電気穿孔は、実施例１に記載されるように実施した。各株の形質転換細胞のコロニーをＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内において、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上で３０℃で２日間培養した。ｐＡＲＡ３５４はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で複製できないので、スペクチノマイシン耐性は、これらのコロニーが組み込み株であることを示唆した。コロニーを新らしいＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートおよびＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートの上に二連で画線塗抹し、それぞれ２日間および４日間培養した。ＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上のそれらの成長もまた、組み込みを示唆した。組み込みをさらに実証するために、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡ断片とＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡとの間の接合部をＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、一対のプライマー、および試験する形質転換細胞を含有する標準３５サイクルＰＣＲ反応によって検査した。１つのＰＣＲサイクルは、９５℃で４５秒間の変性、５８℃で４５秒間のアニーリング、および７２℃で２分間の延長を含んだ。プライマーａｒａ４５（配列番号５０）およびプライマーａｒａ４２（配列番号５１）は、それぞれ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ中のＬＤＨ−Ｌ配列の上流に位置する順方向プライマー、およびｐＡＲＡ３５４のａｒａＢ遺伝子中に位置する逆方向プライマーであった。このプライマー対は、ＰＣＲによって検査された全コロニーから１６９４ｂｐの断片を増幅した。それぞれＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ中のｐＡＲＡ３５４のａａｄＡ遺伝子中に位置する順方向プライマー、およびＬＤＨ−Ｒ配列の下流に位置する逆方向プライマーである、プライマーａｒａ４６（配列番号５２）およびプライマーａｒａ４３（配列番号５３）もまた使用された。このプライマー対は、ＰＣＲによって調査された全てのコロニーから１５２１ｂｐの断片を増幅した。したがってＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡ断片は、ＤＣＯアプローチによってＺＷ８０１−４およびＺＷ７０５ゲノムに成功裏に組み込まれた。ＤＣＯ相同的組換えは標的特異性組み込みであることから、ＺＷ８０１−４またはＺＷ７０５の組み込みから生じるあらゆるコロニーは同一の遺伝子型を有する。各組み込みからのコロニーを５ｍＬのＭＲＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０中において、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によって収集し、０．５ｍＬの５０％グリセロールに再懸濁して、次に−８０℃で保存した。株をＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４と命名した。
【０１４３】
組み込まれたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンの機能をさらに改善するために、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株を適応させた。この目的で、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４の一晩培養物を遠心分離によって収集し、ＭＲＭ３Ａ５で洗浄して、０．１のＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０に再懸濁した。この懸濁液４ｍＬを１４ｍＬのＦａｌｃｏｎ蓋付き管に入れて、１５０ｒｐｍの振盪機内でＯＤ６００が１を越えるまで３０℃で７２時間培養した。次に培養物を４ｍＬの新鮮なＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０を含有する新しいＦａｌｃｏｎ管に接種して、２回目の培養のために開始ＯＤ６００を０．１近くにした。全部で９回の連続培養を完了した。各培養はＯＤ６００をおよそ０．１から１以上にし、細胞がはるかにより緩慢に成長したために６日かかった４回目の培養を除いて、３〜４日間を要した。適応株を特性解析するために、９回目の培養を１００倍に希釈して、１０μＬの希釈液をＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に塗布し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で３０℃で３日間培養した。個々のコロニー（すなわち適応株）を拾って、１５０ｒｐｍの振盪機上で、３ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０中において３０℃で一晩培養した。実施例１記載されるように、それらにＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０中での７２時間成長アッセイを施した。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株は、アッセイ中で対照として使用した。５つの適応株（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ４〜Ａ８）の分析データは表３に提示され、全ての適応株がＺＷ７０５−ａｒａ３５４よりも良い成績を示した。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７は、成長、エタノール生産、およびアラビノース資化の観点から最良の株であった。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
３．適応ありまたはなしのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中、および混合糖を含有する培地中において、アラビノースを資化して細胞成長とエタノール生産を支える能力について、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株をさらに特性解析した。唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中においてこれらの株を特性解析するために、最初にＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７細胞を１５０ｒｐｍ振盪機内で２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０中において３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、０．１の開始ＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０に再懸濁した。２０ｍＬの懸濁液を５０ｍＬねじ蓋付きＶＷＲ遠心管に入れて１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間にわたって培養した。時間経過中に、ＯＤ６００をそれぞれ０、２４、４８、７２、および９６時間目に測定した。各時点において、１ｍＬの培養物を取り出して１０，０００×ｇで遠心分離し、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上において５５℃で０．６ｍＬ／分間の速度を使用して、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを通過させて、エタノールおよび糖濃度について分析した。並行してＺＷ７０５を抗生物質なしの培地中で培養し、対照として分析した。結果を図４に示す。これらの結果は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤなしではＺＷ７０５がアラビノースを代謝できず、アラビノースが唯一の炭素源である場合、成長できないことを示唆する（図４Ａ）。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込み後、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４はアラビノースを資化して、成長およびエタノール生産を支えることができる（図４Ｂ）。アラビノース消費の最大速度は０．２ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３２．８％低下して３４ｇ／Ｌになった。適応はＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中のアラビノース資化能、細胞成長、およびエタノール生産を大幅に改善した。アラビノース消費最大速度は、０．７３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は８３．４％低下して８．４ｇ／Ｌになった。
【０１４６】
混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ＺＷ７０５、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４、およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７を上述のように培養して分析したが、先の実験で使用したＭＲＭ３Ａ５培地は、ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５培地（２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコース添加ＭＲＭ３）によって置換された。ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中の迅速な成長のために、１０時間目の時点を添加した。分析は、アラビノース培地を使用した実験について上述したのと同様であった。結果を図５に示す。これらの結果は、ＺＷ７０５がグルコースおよびキシロースを効率的に資化して、強力な細胞成長とエタノール生産を支えるが、アラビノースは代謝できないことを示す（図５Ａ）。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込み後、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４はアラビノースを資化して、細胞成長およびエタノール生産を増強できた（図５Ｂ）。アラビノース消費の最大速度は、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は６７．９％低下して８．８ｇ／Ｌになった。適応株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中では、アラビノース資化において、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株よりもいくらかの改善があり、それはより良い成長およびエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は０．３６ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は７４．１％低下して７．１ｇ／Ｌになった。
【０１４７】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの２つのアラビノース輸送系のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のためのコンストラクト
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在してａｒａＥまたはｂｙａｒａＦＧＨによってコードされる、２つの各アラビノース輸送系をザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で発現させて、アラビノース資化を分析した。ａｒａＥはアラビノース−プロトン共輸送体をコードする一方、ａｒａＦＧＨはＡＢＣ輸送体を形成する３つのタンパク質をコードする。
【０１４８】
１．ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のためのキメラａｒａＥ遺伝子およびａｒａＦＧＨオペロンの構築
テンプレートとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ａＫ１２株：ＡＴＣＣ＃７００９２６）ＤＮＡを使用して、実施例１に記載される標準３０サイクルＰＣＲによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＥおよびａｒａＦＧＨコード配列ＤＮＡ断片を調製した。各サイクルは、９４℃で４５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリング、および７２℃で４分間の鎖延長を含んだ。順方向プライマーａｒａ１３５（配列番号：５４）および逆方向プライマーａｒａ１３６（配列番号：５５）をＰＣＲで使用して、ａｒａＥコード配列（１，４１９ｂｐ）およびその３’ＵＴＲ（１２１ｂｐ）を含む１，５５０ｂｐのａｒａＥ断片を合成し、ＮｃｏＩ部位を５’末端に、ＥｃｏＲＩ部位を３’末端に付加する（配列番号：５６）。順方向プライマーａｒａ１３７（配列番号：５７）および逆方向プライマーａｒａ１３８（配列番号：５８）をＰＣＲで使用して、３，７４４ｂｐのａｒａＦＧＨ断片（配列番号：５９）を合成する。この断片は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＦＧＨオペロンと同一であるが、プロモーターを欠いている。これは、ａｒａＦコード配列、ａｒａＧコード配列、ａｒａＨコード配列、ａｒａＨ３’ＵＴＲ、および未変化の遺伝子間領域を含んだ。プライマーは、５’ＮｃｏＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位を付加した。
【０１４９】
ａｒａＥおよびａｒａＦＧＨの発現を導くために、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーター（Ｐｇｉ）を選択した。これはキシロースイソメラーゼ遺伝子のプロモーターであり、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で弱い構成的プロモーターとして機能することが実証されている。Ａ．ミズーリエンシス（Ａ． ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）Ｐｇｉをクローンするために、１対のオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。プライマーａｒａ１２（配列番号：６０）はＰｇｉのＰＣＲのための順方向プライマーであり、それはプロモーターの５’末端にＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位を付加した。プライマーａｒａ１３（配列番号：６１）はＰｇｉのＰＣＲのための逆方向プライマーであり、プロモーターの３’末端にＮｃｏＩ部位を付加した。これらの２つのプライマーを標準ＰＣＲ反応で使用して、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーター（配列番号６２）を含有するプラスミドをテンプレートＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ反応は５’ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位および３’ＮｃｏＩ部位がある２０１ｂｐのＰｇｉＤＮＡ断片（配列番号６３）を生じ、それを製造業者の使用説明書に従ってＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローンした。得られたプラスミドｐＴＰ−Ｐｇｉを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１５０】
ｐＴＰ−ＰｇｉからのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇｉ断片と、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ ａｒａＥ ＰＣＲ断片とをクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣＭ−Ｒ；配列番号６４）と共に、ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクター中で組み合わせてｐＡＲＡ１１２（図６；配列番号６５）を作り出した。ｐＡＲＡ１１２は、ｐＺＢ１８８由来大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）シャトルベクター中にＰｇｉ−ａｒａＥキメラ遺伝子を含有する。ｐＴＰ−ＰｇｉからのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇｉ断片と、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ ａｒａＦＧＨ ＰＣＲ断片とをクロラムフェニコール耐性マーカーと共に、ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクター中で組み合わせてｐＡＲＡ１１３（図７；配列番号６６）を作り出した。得られたシャトルベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させて、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。Ｐｇｉ−ａｒａＥ遺伝子およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンは、配列決定によって確認された。
【０１５１】
実施例４
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アラビノース輸送系の発現
構築されたＰｇｉ−ａｒａＥ遺伝子およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンを発現させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２つのアラビノース輸送系のアラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に対する影響を試験した。
【０１５２】
１．ｐＡＲＡ１１２およびｐＡＲＡ１１３を用いてＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａを形質転換する
どちらも実施例３で調製されたＰｇｉ−ａｒａＥ遺伝子を含有するｐＡＲＡ１１２およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンを含有するｐＡＲＡ１１３を（実施例１および２で調製された）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の細胞に形質転換した。実施例１に記載されるようにして、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株のコンピテント細胞を調製した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には非メチル化ＤＮＡが必要なため、ｐＡＲＡ１１
２およびｐＡＲＡ１１３をそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞に形質転換し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、単一コロニーの１０ｍＬの培養物から非メチル化プラスミドＤＮＡを調製した。１ＭＭ ＶＷＲ電気穿孔キュベット内で、およそ５００ｎｇの各プラスミドＤＮＡを５０μＬのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７コンピテント細胞と別々に混合し、ＢＴ７２０ Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ Ｐｌｕｓを使用して２．０ＫＶで細胞内に電気穿孔した。
【０１５３】
ｐＡＲＡ１１２またはｐＡＲＡ１１３形質転換細胞（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３）を１ｍＬのＭＭＧ５培地中において３０℃で４時間回復させ、次にＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で、ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上において３０℃で２日間培養した。個々のコロニーを新しいＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に画線塗抹して、最後のステップと同一条件下で成長させた。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。
【０１５４】
２．形質転換された株中でＰｇｉ−ａｒａＥおよびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨを発現させる
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３の代表例を示すために、形質転換された株のいくつかの画線培養をＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレートから選択した。実施例１に記載される７２時間成長アッセイによって、Ｐｇｉ−ａｒａＥまたはＰｇｉ−ａｒａＦＧＨの発現を調べた。このアッセイでは、各画線培養からの細胞を１５０ｒｐｍで振盪しながら、２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＲＭ３Ｇ５）中において３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、ＭＲＭ３Ａ５−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＭＲＭ３Ａ５）中に０．１の開始ＯＤ６００に再懸濁した。４ｍＬの懸濁液を１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間培養した。培養終了時に、実施例１に記載されるようにして、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを使用して、ＯＤ６００を測定し代謝産物プロフィールを分析した。対照としてＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株を培養し、ＣＭ１２０をＳｐｅｃ２５０で置き換えて並行して分析した。各形質転換中の３株の結果を表４に示す。
【０１５５】
【表４】
【０１５６】
それらの親株と比較して、全てのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株は、７２時間の培養中により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長およびエタノール生産を支えた。実際には、これらのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１
１２株は、培地中のほぼ全ての利用できるアラビノースを消費した。これはａｒａＥが、遺伝子操作株中でアラビノース資化を促進したことを示唆する。他方ａｒａＦＧＨの発現は、悪影響を与えるようである。それは７２時間の培養中に、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３株中で、より少ないアラビノース資化、より低レベルの成長、およびより低いエタノール生産をもたらした。
【０１５７】
３．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株はアラビノース代謝の促進を示したので、これらの株をさらに分析した。特性解析は、実施例２．３に記載される手順に従って実施した。ａｒａＥはシャトルベクターから発現されたので、発現レベルは異なる株間で変動し得る。そのため２つの株（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３）を並べて調べた。単一糖（アラビノース）培地中において株を特性解析するために、一晩培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３培養物を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、０．１の開始ＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−ＣＭ１２０に再懸濁した。２０ｍＬの懸濁液を１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間培養した。ＯＤ６００を０、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間目に測定した。各時点で、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上のＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを使用して、代謝産物プロフィールを分析した。並行して、親株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７を１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールの代わりに２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン中で培養し、対照として分析した。結果を図８に示す。これらの結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７がアラビノースを最大速度０．９３ｇ／Ｌ／ｈｒで資化することを示唆する。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は８０．４％低下して９．８１ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３はアラビノースをより効率的に資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、１１２−２および１１２−３株中で、それぞれ１．１８ｇ／Ｌ／ｈｒおよび１．２８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２では９８％低下して１．０２ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３では９９．２％低下して０．４１ｇ／Ｌになった。実際にはＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３は、それぞれ７２時間および４８時間の培養後に、全ての利用できるアラビノースをほぼ使い果たした。
【０１５８】
混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３を培養して上述のように分析したが、ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５培地を使用した。結果を図９に示す。これらの結果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７が、全てのグルコースおよびキシロースを２４時間以内に効率的に使い果たし、強力な成長およびエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は比較的緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は、０．４３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は６２．４％低下して９ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３は、アラビノースをはるかにより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．７３ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．７８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２では９０．３％低下して２．３３ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３では９０．１％低下して２．３８ｇ／Ｌになった。それは実際には双方の株で、４８時間以内にこのレベル近くにまで低下した。したがってａｒａＥの発現は、混合糖培地中のアラビノース資化もまた促進し、それは図９に示すようにエタノール生産に寄与した。発現はグルコース代謝に顕著な影響を及ぼさなかったが、それはキシロース代謝を減速させ、どちらのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株でも培地中の全てのキシロースを消耗するのに４８時間かかったが、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株では２４時間しかかからなかった。
【０１５９】
実施例５
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４中におけるａｒａＥ発現
この実施例では、非適応アラビノース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４株中におけるａｒａＥ発現の影響を分析する。
【０１６０】
１．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４をｐＡＲＡ１１２によって形質転換する
実施例２に記載されるように、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤをｌｄｈＡ遺伝子座に導入することによりＺＷ７０５およびＺＷ８０１−４から作成された、遺伝子操作Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株である。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４は、ＭＲＭ３Ａ５中で適応されなかったＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の親株である。双方の株のコンピテント細胞を調製した。先行する実施例に記載されるようにして、ｐＡＲＡ１１２の非メチル化ＤＮＡをコンピテント細胞内に電気穿孔した。
【０１６１】
ｐＡＲＡ１１２−形質転換ＺＷ７０５−ａｒａ３５４（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２）およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４（ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２）を１ｍＬのＭＭＧ５培地中において３０℃で４時間回復させ、次にＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で、ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上において３０℃で２日間培養した。個々のコロニーを新しいＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に画線塗抹し、最終ステップと同一条件下で培養した。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。
【０１６２】
２．形質転換株中においてＰｇｉ−ａｒａＥを発現する
それぞれＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２の代表例を示すために、形質転換株のいくつかの画線培養をＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレートから選択した。ＭＲＭ３Ａ５中の７２時間成長アッセイによって、Ｐｇｉ−ａｒａＥの発現を調べた。アッセイの詳細は、先行する実施例と同一であった。対照として、増殖培地中の１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンで置き換えて、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４株を並行して培養し分析した。各形質転換からの３株の結果を表５に示す。それらの親株と比較して、全てのＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株は、７２時間の培養中に顕著により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。したがってａｒａＥは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株の双方の中で、アラビノース資化もまた促進した。
【０１６３】
【表５】
【０１６４】
３．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株を９６時間経過中のそれらの成長および代謝産物プロフィールについて、さらに特性解析した。特性解析は、実施例４．３に記載されるのと同じ手順に従って実施された。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２を調べてそれらの親株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４と比較する一方、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６を調べてそれらの親株ＺＷ８０１−ａｒａ３５４と比較した。測定および分析は、０、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間の時点で実施した。
【０１６５】
図１０は、ＭＲＭ３Ａ５中で培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４がアラビノースを最大速度０．２５ｇ／Ｌ／ｈｒで不完全に資化することを示す。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３８．１９％のみ低下して３０．２２ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２は、アラビノースをより効率的にを資化して、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．４６ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．４８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１では６５．８％低下して１６．７３ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２では６９．６１％低下して１４．８６ｇ／Ｌになった。
【０１６６】
図１１は、混合糖培地ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中で培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４がグルコースおよびキシロースを効率的に使用して、強力な成長とエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は、緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は０．２９ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は５７．３２％低下して１０．２１ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２は、アラビノースをより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．３２ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．３５ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１
では８６．３３％低下して３．２７ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２では８５．２％低下して３．５４ｇ／Ｌになった。これらの結果は、ａｒａＥの発現が、単一糖（アラビノース）培地中および混合糖培地中の双方で、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株中のアラビノース資化能を促進することを実証した。したがってａｒａＥの効果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の適応中に獲得される遺伝的背景を必要としなかった。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２中の結果と同様に、ａｒａＥの発現は、混合糖培地中で培養されたＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２中のキシロース代謝をわずかに減速させた。
【０１６７】
図１２は、ＭＲＭ３Ａ５中で培養されたＺＷ８０１−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４がアラビノースを最大速度０．２５ｇ／Ｌ／ｈｒで不完全に資化することを示唆する。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３２．９９％のみ低下して３２．７６ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６はアラビノースをより効率的に資化して、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．４９ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．４７ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５では６９．５２％低下して１４．９０ｇ／Ｌになり、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６では６５．９２％低下して１６．６６ｇ／Ｌになった。図１３は、混合糖培地ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中で培養したＺＷ８０１−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。これはＺＷ８０１−ａｒａ３５４がグルコースとキシロースを効率的に使用して、強力な成長とエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は、０．２２ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は４５．４８％低下して１３．０４ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６は、アラビノースをより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．３５ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．３６ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５では８９．９２％低下して２．４１ｇ／Ｌになり、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６では８８．３８％低下して２．７８ｇ／Ｌになった。これらの結果は、ａｒａＥの発現が、単一糖培地中および混合糖培地中の双方において、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株中のアラビノース資化能を促進することをさらに実証した。したがってａｒａＥ効果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４と誘導株に限定されなかった。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２と同様に、ａｒａＥの発現は、混合糖培地中で培養されたＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２中のキシロース代謝をわずかに減速させる。
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利についての記述
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。さらに具体的には、アラビノース資化の改善をもたらすザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の遺伝子操作、および同株を使用してエタノールを製造する方法について記載される。
【背景技術】
【０００３】
微生物によるエタノールの生産は化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって現在の重要な研究分野である。キシロースおよびアラビノースは、発酵で使用される生体触媒のための豊富に入手できる低コスト炭素基質源を提供し得る、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖であることから、エタノールならびにその他の有用な生成物を生産する微生物は、炭素源としてキシロースおよびアラビノースを使用できることが望ましい。
【０００４】
キシロースおよびアラビノースの資化のために、天然ではこれらの糖を資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンを遺伝子操作してもよい。キシロース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする遺伝子が発現されるように株を遺伝子操作した。１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼ（特許文献１、２；非特許文献１）。アラビノース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする追加的遺伝子が導入された。１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献３】米国特許第５８４３７６０号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０〜２４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
いくつかのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株がアラビノース資化のために遺伝子操作されているが、これらの遺伝子操作株によって資化される発酵培地中には、典型的に低率のアラビノースのみが存在する。発酵がアラビノースを含有する培地中で起きる場合、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびその他の細菌エタノロジェン中におけるア
ラビノース資化を改善して、エタノール生産を増強する必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体発現のための遺伝子が導入されることで遺伝子操作されて、アラビノースを使用する改善された能力を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株、およびこれらの株を使用したエタノール生産に関する。これらの株をアラビノース含有培地中で培養すると、改善されたエタノール生産を有する。
【０００９】
したがって本発明は、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を提供し、上記微生物はアラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる。
【００１０】
これに加えて本発明は、
ａ）適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）異種性アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を（ａ）の株に導入するステップ
を含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を作成する方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様では本発明は、
ａ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースが上記株によってエタノールに変換されるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
【００１２】
別の実施態様では本発明は、
（ａ）アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株からなる群から選択される、アラビノース資化微生物を提供するステップと；
（ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を上記微生物のゲノム内に導入し、上記共輸送体が上記微生物によって発現されるステップと；（ｃ）（ｂ）の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、アラビノース−プロトン共輸送体を欠く上記微生物と比較して、上記微生物が増大した速度で上記アラビノースを代謝するステップ
を含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キシロースおよびアラビノース資化のために遺伝子操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のエタノール発酵経路のダイアグラムを示し、ｇｌｆはグルコース促進性拡散輸送体を意味する。
【図２】ｐＡＲＡ２０５のプラスミドマップの図面である。
【図３】ｐＡＲＡ３５４のプラスミドマップの図面である。
【図４Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図４Ｂ】９６時間経過中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図４Ｃ】９６時間経過中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図５Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図６】ｐＡＲＡ１１２のプラスミドマップの図面である。
【図７】ｐＡＲＡ１１３のプラスミドマップの図面である。
【図８Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図８Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図８Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図９Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１０Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１１Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１２Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ａ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ｂ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【図１３Ｃ】９６時間経過中のＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中のＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６（Ｃ）の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
【００１５】
配列説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１６】
【表１】
【００１７】
配列番号２１および２２は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＡ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００１８】
配列番号２３および２４は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００１９】
配列番号２５および２６は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。
【００２０】
配列番号２７は、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２８および２９は、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号３０は、ＲＢＳおよび３’ＵＴＲを含む、ａｒａＤ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３１および３２は、ＲＢＳおよび３’ＵＴＲを含む、ａｒａＤ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３３は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＰｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号３４および３５は、ＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号３６は、ＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号３７および３８は、スペクチノマイシン耐性カセットのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号３９および４０は、付加ＮｃｏＩ部位を除去するＰｇａｐ変異誘発のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４１は、ｐＡＲＡ２０５プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号４２および４３は、ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号４４は、ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号４５および４６は、ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号４７は、ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号４８は、ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号４９は、ｐＡＲＡ３５４プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号５０および５１は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡの５’組み込みをチェックするためのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号５２および５３は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡの３’組み込みをチェックするためのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号５４および５５は、ａｒａＥコード領域ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号５６は、ａｒａＥＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号５７および５８は、ａｒａＦＧＨ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号５９は、ａｒａＦＧＨ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号６０および６１は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＰｇｉＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライ
マーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号６２は、ＰＣＲテンプレートとして使用されるプラスミド中のアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号６３は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＰｇｉＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号６４は、クロラムフェニコール耐性マーカーのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号６５は、ｐＡＲＡ１１２プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号６６は、ｐＡＲＡ１１３プラスミドのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体を発現するようにさらに遺伝子操作されてアラビノース資化能が改善された組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株と、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする遺伝子を導入することにより株を遺伝子操作する方法とについて記載する。別の態様では、本発明はアラビノース資化を改善する方法、および上記株を使用してアラビノースを含んでなる培地中でエタノールを生産する方法について記載する。アラビノース−プロトン共輸送体を発現するアラビノース資化株はアラビノース資化能が改善され、アラビノースを含んでなる培地中でのエタノール生産に有用である。
【００４９】
アラビノース資化能が改善された本株によって生成されるエタノールは、化石燃料の代替エネルギー源として使用してもよい。
【００５０】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義を使用する。
【００５１】
本明細書での用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」という用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含を範囲に含むことが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または」は包含的「または」を指し、排他的「または」を指さない。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（または存在する）Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）Ｂは真である（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００５２】
また本発明の要素または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成要素の事例（すなわち発生）の数に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数が明らかに単数形を意味する場合を除き複数形もまた含む。
【００５３】
「遺伝子」は特定タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）と、コード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を含
んでもよい。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」は、それ自身の制御配列と共に自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒には見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物中に見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００５４】
「ａｒａＥ」という用語は、Ｋｍが１．２５×１０-4Ｍである低親和性大容量アラビノース輸送体である細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする、遺伝子または遺伝子コンストラクトを指す。アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする遺伝子は非常に多様な細菌から単離されてもよく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌からのものが本発明で特に有用である。
【００５５】
「アラビノース資化」という用語は、微生物の文脈で使用される場合、その微生物が生成物、特にエタノールの生産のためにアラビノースを資化する能力を指す。
【００５６】
「適応株」という用語は、生成物の生産のために炭素源を使用する能力を改善するために、特定の炭素源上での成長について選択された微生物を指す。例えば「アラビノース適応株」は、高濃度のアラビノース上での成長について選択された微生物株である。
【００５７】
「遺伝子コンストラクト」という用語は、１つ以上の特定タンパク質の発現をコードする核酸断片を指す。遺伝子コンストラクト中では、遺伝子は天然、キメラ、または外来性であってもよい。典型的に遺伝子コンストラクトは、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００５８】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。 一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型中において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を誘導してもよいことは、当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００５９】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、遺伝子から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑止できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「過剰発現」は、通常のまたは非形質転換された生物中での生産レベルを越える、遺伝子導入生物中における遺伝子産物の生成を指す。「同時抑制」は、同一のまたは実質的に同様の外来性または内在性性遺伝子の発現を抑止できる、センスＲＮＡ転写物または断片の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６０】
「形質転換」という用語は、本明細書での用法では、遺伝的に安定した遺伝形質をもた
らす宿主生物中への核酸断片の転移を指す。転移核酸は、宿主細胞中に保持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの転移核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００６１】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書での用法では、細胞の中央代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を保有することが多い染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合されまたは組み換えられて独自構造体になり、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入できる。
【００６２】
「作動的に連結する」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を与えられる場合、それはコード配列と作動的に連結する（すなわちコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結し得る。
【００６３】
「選択可能なマーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐性に基づいて選択できる、通常、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果を使用して関心のある核酸の遺伝形質を追跡し、および／または関心のある核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。
【００６４】
本明細書での用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝コード中の性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６５】
「コドン最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子コード領域について言及される場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変化させることのない、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する遺伝子または核酸分子コード領域中のコドンの改変を指す。
【００６６】
「炭素源」という用語は、微生物がエタノールなどの生成物を生産する発酵過程において使用し得る、オリゴ糖類および単糖類などの糖（「発酵性糖」）を指す。微生物は生成物の産生のために単一炭素源を使用する能力を有してもよく、したがって同炭素源は本明細書で「唯一の」炭素源と称される。
【００６７】
「リグノセルロース誘導体」という用語は、リグニンおよびセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００６８】
「セルロース誘導体」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースをはじめとする追加的構成要素とを含んでなる組成物を指す。
【００６９】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖または炭素源の生成を指す。
【００７０】
「前処理生物由来資源」という用語は、糖化に先だって前処理された生物由来資源を意味する。
【００７１】
「生物由来資源」は、あらゆるセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含んでなる材料、および任意にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。生物由来資源はまた、タンパク質および／または脂質などの追加的構成要素を含んでなってもよい。生物由来資源は単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は１つを超える原料に由来する混合物を含んでなり得る。生物由来資源は、単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は1つ以上の原料に由来する混合物からなり得て、例えば生物由来資源は、トウモロコシの穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなり得る。生物由来資源としては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭ごみ、木材および森林廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。生物由来資源の例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガムバガスまたは茎葉、ダイズ茎葉、穀物製粉から得られる成分、木材、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および動物堆肥が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
「生物由来資源加水分解産物」は、生物由来資源の糖化から得られる生成物を指す。生物由来資源はまた、糖化に先だって前処理または前加工されてもよい。
【００７３】
「異種性」という用語は、関心のある位置に天然では見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、宿主生物中には天然では見られず、遺伝子移入によって宿主生物内に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種性核酸分子は、天然では互いに付随しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子など、天然ではキメラ遺伝子のその他のセグメントに付随して見られない核酸分子である。
【００７４】
本明細書での用法では、「単離核酸分子」は、任意に合成、非自然的または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００７５】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、一本鎖形態の核酸断片が他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、特にその中の第１１章および表１１．１で例証されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーンするために調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分間の繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分間の２回の繰り返しの一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い
温度を使用し、その中で洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されること以外は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましい組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で２回の最終洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組は、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチもあり得る。核酸をハイブリダイズさせる適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られている変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、９．５０〜９．５１）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、１１．７〜１１．８）。一実施態様ではハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素に準じて、温度および洗浄溶液塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識するであろう。
【００７７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「相当な部分」は、当業者による配列の手動評価、またはコンピュータ自動化配列比較とＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用した同定のどちらかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分である、ポリペプチドまたは遺伝子ヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に、既知のタンパク質または遺伝子と相同的なポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するには、１０以上の隣接するアミノ酸配列または１３以上のヌクレオチドが必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、遺伝子同定の配列依存法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定核酸断片を得るためのＰＣＲにおける増幅プライマーとして、１２〜１５塩基のより短いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「相当な部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、今や開示される配列の全てまたは相当な部分を使用してもよい。したがって本発明は、添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義されるこれらの配列の相当な部分を含んでなる。
【００７８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記載するのに使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００７９】
「相同性」および「相同的」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらは
、その中で１つ以上のヌクレオチド塩基の変更が、核酸断片が遺伝子発現を仲介し、または特定の表現型を生成する能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は理解するであろうように、本発明は、特定の具体的配列以上のものを包含すると理解される。
【００８０】
さらに当業者は、本発明に包含される相同的な核酸配列はまた、中程度にストリンジェントな条件（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書で例証される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等である本明細書で開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることを認識する。
【００８１】
「％同一性」という用語は、当該技術分野で知られているように、配列を比較して判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野で「同一性」はまた、場合によっては、このような配列ストリング間のマッチにより判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算され得る。１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）。
【００８２】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良のマッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化される。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖとラベルされるアラインメント法に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）をはじめとする、アルゴリズムのいくつかのバラエティーを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで「％同一性」得ることができる。さらにＣｌｕｓｔａｌ Ｗとラベルされるアラインメント法に相当して、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）ｖ６．１プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）を利用できる。多重アラインメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることができる。
【００８３】
その他の種からのポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によって良く理解され、このようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する。％同一性の有用な例としては、以下が挙げられるがこれに限定されるものではない。２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％；または２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの２４％から１００％までのあらゆる整数百分率が、本発明について記述する上で有用かもしれない。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年），１９９２年会議，１１１〜２０，編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００８５】
本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）に記載されている。
【００８６】
本発明は、アラビノース含有培地中で発酵させると改善されたアラビノース資化能を有する、アラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の遺伝子操作株と、同株を使用してエタノールを生産する方法とに関する。典型的に生物由来資源の前処理および糖化によって生成される生物由来資源加水分解産物を含む培地中における、生体触媒の発酵によるエタノール生産の改善にとって難しい課題は、アラビノースの効率的な資化を得ることである。アラビノースは、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖の１つであり、その他はキシロースである。出願人らは、発酵がアラビノースを含有する培地中である場合、アラビノース−プロトン共輸送体の発現が、アラビノース資化株によるアラビノース資化における効率増大と、ひいてはより高いエタノール収率をもたらすことを発見した。
【００８７】
アラビノース資化宿主株
アラビノースを炭素源として資化できるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）のあらゆる株を本発明の株を調製するための宿主として使用してもよい。 アラビノースのエタノールへの発酵のために遺伝子操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株が、特に有用である。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、以下をコードする遺伝子を導入することにより、アラビノース資化能のために遺伝子操作された。１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５８４３７６０号明細書；および本明細書の実施例１および２に記載される；図１のダイアグラム参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、アラビノースを代謝できるいずれの微生物から得てもよい。コード領域の起源としては、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。特に有用なのは、Ｌ−アラビノースイソメラーゼのためのａｒａＡのコード領域（コード領域配列番号２１；タンパク質配列番号２２）、Ｌ−リブロキナーゼのためのａｒａＢのコード領域（コード領域配列番号２３；タンパク質配列番号２４）、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼのためのａｒａＤのコード領域（コード領域配列番号２５；タンパク質配列番号２６）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。これらのタンパク質およびそれらのコード領域は、当業者によって、バイオインフォマティクスまたはａｒａＥについて下述する実験法を使用して、上に列挙したものなどのその他のアラビノース資化微生物中で容易に同定されてもよい。
【００８８】
さらにアラビノースからエタノールへの生合成経路中で、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性が使用される（図１参照）。トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼは、キシルロース−５−リン酸を中間体に変換するペントースリン酸経路の２つの酵素であり、中間体は五炭糖代謝を解糖作用のエントナードゥドロフ経路に連結して、アラビノースまたはキシロースのエタノールへの代謝を可能にする。これらは内在性活性であってもよく、または内在性活性がこれらの酵素の導入された活性を補足してもよい。
【００８９】
典型的にアラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、キシロース資化のためにもまた遺伝子操作される。参照によって本明細書に援用する米国特許第５５１４５８３号明細書に記載されるように、典型的にキシロース代謝に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入される（図１）。これらとしては、上述のようなトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ならびにキシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる（図１参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびいくつかの酵母および真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。特に有用なのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。
【００９０】
発現では、アラビノース資化タンパク質およびキシロース資化タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中で発現されるプロモーターおよび転写ターミネーターと作動的に連結する。使用してもよいプロモーターの例としては、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素コーディング遺伝子のプロモーター（ＧＡＰプロモーター；Ｐｇａｐ）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼコーディング遺伝子のプロモーター（ＥＮＯプロモーター；Ｐｅｎｏ）、およびアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼコーディング遺伝子のプロモーター（ＧＩプロモーター、Ｐｇｉ）が挙げられる。コード領域は、典型的にキメラ遺伝子としてプロモーターから個別に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域が、同一プロモーターから発現するオペロン中で結合してもよい。得られたキメラ遺伝子および／またはオペロンは、さらなる操作のために、典型的にベクターに構築されまたは導入される。
【００９１】
ベクターについては当該技術分野で良く知られている。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のために特に有用なのは、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の双方の中で複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内の自律複製のためのプラスミドと、細胞ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドを含んでもよい。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン、標的細胞ゲノムと相同的な核酸配列領域、部位特異的組み込み配列、または組み込みを支援するその他の配列を含んでもよい。相同的組換えにおいては、本明細書の実施例２に記載されるように、標的ゲノム部位への選択可能なマーカーおよびキメラ遺伝子の挿入をもたらす、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはその他の選択可能なマーカーと、所望のキメラ遺伝
子とに境を接して、標的組み込み部位に隣接するＤＮＡ配列を配置させる。さらに選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後に耐性遺伝子をゲノムから切除してもよいように、部位特異的組み換え部位と境を接してもよい。
【００９２】
特定の用途があるキシロース資化株としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉら，（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１〜３２５）、および誘導体ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４があるＺＷ６５８（同一譲受人同時係属米国特許公開第２００８０２８６８７０号明細書；寄託ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。また参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書に記載されるＺＷ７０５を使用してもよい。使用してもよいアラビノース資化株は、参照によって本明細書に援用する米国特許第５８４３７６０号明細書で開示され、ならびに本明細書の実施例１および２に記載される。
【００９３】
アラビノース資化能の適応
上述のようにキシロースおよびアラビノースの資化のために遺伝子操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、出願人らによって、試験成長条件において、アラビノースが唯一の炭素源（５０ｇ／Ｌ）である場合は培地中のアラビノースの約３３％を資化し、２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースの混合糖を含む培地中ではアラビノースの約６８％を資化することが分かった。改善されたアラビノース資化能を有する株を得る試みにおいて、出願人らは、本明細書の実施例２に記載されるように、唯一の炭素源として５０ｇ／Ｌアラビノースがある培地中での連続成長によって、キシロースおよびアラビノース資化株からの細胞を適応させた。この方法を使用することで、アラビノースが唯一の炭素源である培地中においてアラビノース資化能にかなりの改善を有する単離株が得られ、それはアラビノース適応株である。例えば１つの株は、５０ｇ／Ｌのアラビノースが唯一の炭素源である培地中のアラビノースの約８３％を使用する。２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースを含有する混合糖培地中では改善はより少なく、約７４％のアラビノースが使用された。また混合糖培地中では、アラビノースの資化は、グルコースおよびキシロースの資化と比較して遅延された。
【００９４】
改善されたアラビノース資化能を有する株を得るために、上述のようにアラビノース資化遺伝子の発現について遺伝子操作株を約２０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ以上の濃度でアラビノースを唯一の炭素源として含有する培地中での連続成長によって適応させてもよい。適応はより低いアラビノース濃度中であってもよいが、初期成長は約２０ｇ／Ｌ以上の濃度中である。連続成長は、典型的に少なくとも約２５の倍加である。適応は、下述される異種性アラビノース−プロトン共輸送体をアラビノース資化株に導入するステップの前または後であってもよい。これに加えて細胞は、異種性アラビノース−プロトン共輸送体の導入前および後の双方において適応されてもよい。
【００９５】
改善されたアラビノース資化能を遺伝子操作するための発見
出願人らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在する２つの異なるアラビノース輸送系の発現のために、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシロースおよびアラビノース資化株を遺伝子操作した。２つの輸送系は、１）ａｒａＦＧＨによってコードされる３つのタンパク質（ａｒａＦによってコードされる３３ｋＤのペリプラスムアラビノース結合タンパク質、ａｒａＧによってコードされる５５ｋＤの膜結合ＡＴＰアーゼ、およびａｒａＨによってコードされる３４ｋＤの膜結合タンパク質）から構成されるＡＢＣ輸送体；および２）１つのタンパク質（ａｒａＥによってコードされる５２ｋＤのアラビノース−プロトン共輸送体）から構成されるアラビノース−プロトン共輸送体である。ＡＢＣ輸送体
はＫｍが３×１０−６Ｍの高親和性低容量アラビノース輸送体である一方、アラビノース−プロトン共輸送体はＫｍが１．２５×１０-4Ｍの低親和性高容量アラビノース輸送体である。出願人らは、アラビノースのみの培地中では、ＡＢＣ輸送体の発現が、実際にはアラビノース資化能の低下をもたらすことを見いだした。アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方でアラビノース資化能を増大させた。したがって出願人らは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＢＣ輸送体がアラビノース資化能を改善しない一方、アラビノース−プロトン共輸送体はアラビノース資化能を改善することを発見した。アラビノース−プロトン共輸送体の発現によって、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方で、アラビノース資化能は大きく増大した。
【００９６】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、全ての試験された株でアラビノース資化能を増大させた。これらには、適応なしのアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株、ストレス条件でキシロース資化について適応させたアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書で開示される）、および上述され実施例２に記載されるように、ストレス条件でキシロース資化とアラビノース資化についても適応されたアラビノースおよびキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が含まれる。アラビノース適応のない株では、アラビノース資化能は、アラビノースのみの培地ならびに混合糖培地中で少なくとも約２８％増大した。またアラビノース適応株では、アラビノース資化能は、混合糖培地中で少なくとも約２８％増大した。アラビノースのみの培地では、アラビノース−プロトン共輸送体の発現なしのアラビノース適応親株中のアラビノース資化能のレベルは既に約８０％であり、したがってアラビノース資化能の増大は２０％を越えることはできず約１８％であった。
【００９７】
したがってアラビノース資化株とも称される、アラビノースを資化できるあらゆるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を使用して、本株を作り出してもよい。特に有用なのは、キシロースおよびグルコースをさらに資化する株である。これらの株中では、アラビノース−プロトン共輸送体を発現することによって、アラビノース資化能は少なくとも約１０％改善される。アラビノース資化能は、少なくとも約１０％、１２％、１６％、１８％、２０％、２４％、２８％以上改善されてもよい。％改善は、培地タイプおよびアラビノース−プロトン共輸送体の発現を遺伝子操作するのに使用される親微生物をはじめとする使用される成長条件、ならびに特定の得られた改変株に応じて変動してもよい。変動を引き起こす要因としては、形質転換体の間で異なるかもしれない、導入されたアラビノース−プロトン共輸送体の発現レベル、および得られる輸送体の活性レベルが挙げられる。
【００９８】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現
本遺伝子操作ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞中では、あらゆる細菌アラビノース−プロトン共輸送体が発現されてアラビノース資化能の増大を提供してもよい。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中での発現のための細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびそれらのコード配列は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中に天然では見られないので、それらは異種性である。発現されてもよいアラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびコード配列の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（コード領域配列番号１；タンパク質配列番号２）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（コード領域配列番号３；タンパク質配列番号４）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）（コード領域配列番号５；タンパク質配列番号６）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（コード領域配列番号７；タンパク質配列番号８）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（コード領域配列番号９；タンパク質配列番号１０）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）（コード領域配列番号１１；タンパク質配列番号１２）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（コード領域配列番号１３；タンパク質配列番号１４）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（コード領域配列番号１５；タンパク質配列番号１６）、エンテロバクター・カンセロゲヌス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）（コード領域配列番号１７；タンパク質配列番号１８）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（コード領域配列番号１９；タンパク質配列番号２０）のａｒａＥ遺伝子によってコードされるものが挙げられる。
【００９９】
上に列挙して表１に示した配列番号で例証されるように、アラビノース−プロトン共輸送体コード領域およびコードされるタンパク質の配列は良く知られているので、追加的な適切なアラビノース−プロトン共輸送体は、バイオインフォマティクスアプローチを用いた配列類似性に基づいて、当業者によって容易に同定されてもよい。典型的に、本株中で使用してもよい追加的なアラビノース−プロトン共輸送体、およびそれらのコード配列を同定するのには、本明細書で提供されるものなどの既知のアラビノース−プロトン共輸送体アミノ酸配列を用いた、公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上述）検索が使用される。これらのタンパク質は、アラビノース−プロトン共輸送体活性を有する一方で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のアラビノース−プロトン共輸送体のいずれかと、少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％または９５％〜９９％の配列同一性を有してもよい。アイデンティティは、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメーターを使用した、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づく。
【０１００】
タンパク質またはコード領域配列およびバイオインフォマティクス法を使用して追加的アラビノース−プロトン共輸送体を同定するのに加えて、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で列挙される配列を使用して、自然界のその他の相同体を実験的に同定してもよい。例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体をコードする核酸断片のそれぞれを使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離については、当該技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法；２．）核酸増幅技術の様々な使用［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２年）]によって例証される、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、；および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０１】
例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列と類似したタンパク質またはポリペプチドのコード領域は、当業者に良く知られている方法を使用して、あらゆる所望の生物からのライブラリーをスクリーンするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部または一部を使用して、直接単離できる。開示される核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で知られている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）によってデザインし合成し得る。さらに配列全体を直接使用して、当業者に知られている方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術）によってＤＮＡプローブを合成し、または利用できる生体外転写系を使用してＲＮＡプローブを合成し得る。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（またはその全長）を増幅し得る。得られる増幅産物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションによって完全長ＤＮＡ断片を単離し得る。
【０１０２】
典型的にＰＣＲタイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有して互いに相補的でない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製の双方を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーのデザイン方法は一般的であり、当該技術分野で良く知られている（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編，（１９８６年）３３〜５０頁，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編，（１９９３年）第１５巻，３１〜３９頁，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１０３】
一般に、記載される配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコル中で使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンされた核酸断片のライブラリー上で実施してもよく、その中では１つのプライマーの配列が、記載される核酸断片から誘導され、その他のプライマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体をコードする微生物の遺伝子の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を活用する。
【０１０４】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物および３’または５’末端の単一点間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを作成し得る。本配列から、３’および５’方向に配向したプライマーをデザインし得る。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えばＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離し得る（Ｏｈａｒａら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１０５】
代案としては、記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列を相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基礎的構成要素としては、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５個の塩基から数万個の塩基まで変動し得て、実施される特定の試験に左右される。典型的に、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列間の相補性は、必ずしも完璧である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間では起きず、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基画分は、適切な相補的塩基と対をなさない。
【０１０６】
ハイブリダイゼーションの方法については、詳細に定義されている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくては
ならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩の存在下でプローブとサンプルを接触させるステップを伴う。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸の間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるのに十分な時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起きるのに必要な時間を左右する。プローブまたは標的濃度が高いほど、より短いハイブリダイゼーションインキュベーションが必要である。任意にカオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性阻害することで核酸を安定化する。さらにカオトロピック剤は、室温における短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在する。所望ならば、ホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で、ハイブリダイゼーション混合物に添加してもよい。
【０１０７】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用い得る。典型的に、これらは約２０〜６０容積％、好ましくは３０容積％の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９））、約０．０５〜０．２％の洗剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、断片化核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および任意に約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。多様な極性水溶剤または膨潤剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリアクリル酸メチル）、およびアニオン性糖重合体（例えば硫酸デキストラン）をはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤もまた含めてもよい。
【０１０８】
核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形態に適合できる。最も適した１つが、サンドイッチアッセイ形態である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下におけるハイブリダイゼーションに特に適合する。サンドイッチタイプアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部に相補的な核酸プローブに吸着され、またはそれと共有結合的に共役して、それを固定化する。
【０１０９】
アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする配列を用いて形質転換することで達成される。当該技術分野で知られているように、遺伝コードの縮重の理由から、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列中に多様性があってもよい。当業者に良く知られているように、コード配列は、標的ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）宿主細胞中における最大の発現のためにコドン最適化されてもよい。典型的に、所望のコード領域と作動的に連結してザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で活性のプロモーター、ならびに転写ターミネーターを含むキメラ遺伝子が、発現のために使用される。アラビノース資化のためのタンパク質発現のために、上で述べた例などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で活性のあらゆるプロモーターを使用してもよい。上述したようにコード領域が異なる生物からのものであるため、プロモーターおよびアラビノース−共輸送体コード領域を用いて構築されたキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）中での発現について異種遺伝子である。発現および／また
は組み込みのためのベクターは、アラビノース資化のためのタンパク質発現について上述した通りである。
【０１１０】
改善されたエタノール生産
本株は、唯一の炭水化物源としてアラビノースがある培地中で、およびアラビノースを含む混合糖がある培地中で、改善されたアラビノース資化能を有する。本株はまた、改善されたエタノール生産も有する。アラビノース−プロトン共輸送体発現遺伝子の導入に先だつ親株と比較して、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する株のエタノール生産は増大する。エタノール生産の増大は、発酵で使用される培地および成長条件、ならびに生体触媒として使用されるアラビノース−プロトン共輸送体発現株次第で変動してもよい。典型的にエタノール生産は少なくとも約１０％増大してもよく、約１０％、１２％、１６％，１８％、２０％、２４％、２８％以上増大してもよい。
【０１１１】
改善されたアラビノース資化株の発酵
株に天然の生成物、または株が産生するよう遺伝子操作された生成物を生産する発酵において、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼの発現のために、アラビノース−プロトン共輸送体および遺伝子またはオペロンを発現する遺伝子操作されたアラビノース資化株を使用してもよい。例えばザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ
ｐａｌｍａｅ）は、天然のエタノロジェンである。キシロースもまた資化する、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のためにさらに遺伝子操作された株が好ましい。例として、キシロースおよびアラビノースを資化する本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの生産について記載する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、天然でグルコースもまた資化する。
【０１１２】
エタノール生産のために、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する組み換えキシロースおよびアラビノース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をアラビノース含有培地と接触させる。典型的に培地は、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含む混合糖を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、生物由来資源加水分解産物を含有してもよい。
【０１１３】
同一譲受人同時係属米国特許公開第２００８００８１３５８−Ａ１号明細書で開示されるように、成長が阻害される程に混合糖の濃度が高い場合、培地はソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールをソルビトールまたはマンニトールで置換してもよく、またはそれと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が起きてエタノールが生産される培地中で培養する。発酵は、空気、酸素、またはその他の気体の補給なしに（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）、少なくとも約２４時間実施され、３０以上時間実施されてもよい。最大のエタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在するとより長い発酵時間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の温度および約４．５〜約７．５のｐＨで実施されてもよい。
【０１１４】
本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、実験室規模の発酵槽内で、および商業的な量のエタノールが生産される大規模発酵において、アラビノースを含む混合糖を含有する培地中で培養してもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養法を応用してもよい。例えば本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大量生産は、バッチおよび連続培養法の双方によって生成されてもよい。古典的バッチ培養法は閉鎖系であり、培地組成物は培養開始時に設定され、培養過程中に人為的変更を受けない。したがって培養過程の開始時に所望の生物を培地に接種して、システムに何も添加することなく成長または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してのバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物由来資源組成物は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養中では、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期を経て、最後に成長率が減少しまたは停止する定常期に至る。処置されない場合、定常期の細胞はやがて死滅する。対数期の細胞は、いくつかのシステムにおいて、最終産物または中間体の生成の大半の責を負うことが多い。その他のシステムでは、静止期または対数後期生産があり得る。
【０１１５】
標準バッチシステムの変法が、流加システムである。流加培養過程もまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の成長に適し、培養過程の進行に伴って基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加システムは、異化代謝産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合、そして培地中に限定的量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加システム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってｐＨやＣＯ２などの廃ガス分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で良く知られており、参照によって本明細書に援用するＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，およびＢｒｏｃｋ，第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２年）に例が見られる。
【０１１６】
エタノールの商業生産はまた、連続培養を用いて達成されてもよい。連続培養は、規定培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に加工のために等量の慣熟培地が取り出される開放系である。連続の培養は、一般に、細胞が主として対数成長期にある一定の高液相密度に細胞を保つ。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、当業者に知られている天然および／または合成材料から構成される、多様な固体担体を使用して実施してもよい。
【０１１７】
連続または半連続培養は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはあらゆる数の要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、その他の全パラメーターを加減する。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に変更し得る。連続系は恒常的成長条件を保つことを目指し、したがって培地の除去による細胞損失は、培養中の細胞成長率に対して平衡状態になくてはならない。連続培養過程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法がＢｒｏｃｋ、前出で詳述されている。
【０１１８】
エタノール生産に特に適するのは、次のような発酵計画である。本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃の半天然培地中で振盪フラスコ内で培養し、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。ＯＤ６００が３〜６になるまで種培養物を種発酵槽内で嫌気的に培養してから、発酵パラメーターをエタノール生産のために最適化した生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種体積は、約２％から約２０％ｖ／ｖの範囲に及ぶ。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物またはダイズベース製品などの複合窒素源（０〜１０ｇＬ）などの最少培地構成要素を含有する。最終濃度約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。最初の炭素源バッチ（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際し、炭素源を提供するアラビノースと、グルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的糖とを含む混合糖が発酵容器に継続的に添加されて、エタノール速度と力価を最大化する。炭素源供給速度は動的に調節されて、酢酸などの毒性副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを培養が蓄積しないようにする。資化される基質から生成するエタノールの収率を最大化するために、最初にバッチ供給され、または発酵過程中に供給される一定量のリン酸塩によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、腐食性溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）および硫酸またはリン酸のどちらかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に調節される。発酵槽の温度は３０℃〜３５℃に調節される。気泡を最小限にするために、消泡剤（シリコーン基剤、有機基剤などのあらゆる種類）を必要に応じて容器に添加する。株中にそれに対する抗生物質耐性マーカーがある場合、カナマイシンなどの抗生物質を任意に使用して汚染を最小限にしてもよい。
【０１１９】
さらに発酵は、ＳＳＦ（同時糖化発酵）法を使用した糖化と同時に起きてもよい。この方法では、生物由来資源が生産生体触媒によって代謝されるにつれて、糖が生物由来資源から生成する。
【０１２０】
上述のあらゆる条件の組、さらに当該技術分野で良く知られているこれらの条件のバリエーションは、アラビノース−プロトン共輸送体の異種性コード領域を導入することによりアラビノース−プロトン共輸送体を発現するように遺伝子操作された、アラビノース資化組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株によるエタノール生産のための適切な条件である。
【実施例】
【０１２１】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。実施例は、本発明の好ましい実施態様を示唆しながら、例証としてのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１２２】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）に記載されている。
【０１２３】
略語の意味は次の通り。「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感応性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感応性を意味し、「ＵＴＲ」は非翻訳領域を意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味する。
【０１２４】
プライマーは、特に断りのない限りＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）によって合成された。
【０１２５】
実施例１
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のアラビノース資化タンパク質のためのオペロンの構築および発現
アラビノース資化のためにザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を遺伝子操作するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＣコード領域をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プロモーターと共にオペロン中で構築し、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中のプラスミド上で発現させた。ＡｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤは、それぞれタンパク質Ｌ−リブロースキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼをコードし、それはトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性と併せて、アラビノース同化作用経路を提供する（図１参照）。
【０１２６】
１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤコード配列およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターをクローニングする
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤコード領域（それぞれ配列番号２３、２１、および２５）は、ａｒａＢＡＤオペロン中に存在する。それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーａｒａ１（配列番号２８）およびａｒａ２（配列番号２９）を使用して、ａｒａＢ−ａｒａＡ ＤＮＡ断片（ａｒａＢＡ；配列番号２７）を調製した。プライマーａｒａ１は、ａｒａＢコード領域の開始コドンＡＴＧの前にヌクレオチドＣＣを付加してＮｃｏＩ部位を作り出す。プライマーａｒａ２は、ａｒａＡコード領域の停止コドンの後にＸｂａＩ部位を付加する。ａｒａＤ ＤＮＡ断片（配列番号３０）は、それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーａｒａ３（配列番号３１）およびプライマーａｒａ４（配列番号３２）を使用して調製された。プライマーａｒａ３は、ａｒａＤコード領域に対して５’である、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列の５’末端にＸｂａ部位を付加する。プライマーａｒａ４は、ａｒａＤコード領域に対して３’である、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加する。ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマー、およびＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ番号７００９２６；Ｋ１２株）から調製された２μＬ（約５０〜１００ｎｇ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを含む、標準ＰＣＲ反応において各プライマー対を使用した。プライマーａｒａ１およびａｒａ２を使用した反応を９５℃で５分間実施し、３５サイクルの９５℃で３０秒間／５６℃で３０秒間／６８℃で３．５分間がそれに続き、６８℃で７分間で終了した。それは５’ＮｃｏＩ部位およびａ３’ＸｂａＩ部位がある３２２６ｂｐのａｒａＢ−ａｒａＡ断片をもたらした（配列番号２７）。６８℃での延長時間が１．５分間に短縮されたこと以外は同様のプログラムを使用して、プライマーａｒａ３およびａｒａ４を使用した別の反応を実施した。それは５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位がある８８９ｂｐのａｒａＤ断片（ａｒａＤ３’ＵＴＲを含む）を生じた（配列番号３０）。
【０１２７】
ａｒａＢＡＤオペロンのための天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターは誘導性プロ
モーターであり、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での所望の発現に適さない。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のための強力な構成的プロモーターであることから、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）プロモーター（Ｐｇａｐ；配列番号３３）を使用した。オリゴヌクレオチドプライマーａｒａ１０およびａｒａ１１を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐを含有するＤＮＡ断片を調製した。プライマーａｒａ１０（配列番号３４）は、プロモーターＤＮＡ断片の５’末端にＳａｃＩおよびＡｐｅＩ部位を付加する順方向プライマーである。プライマーａｒａ１１（配列番号３５）は、プロモーターの最後の２つのヌクレオチドをＡＣからＣＣに変化させる逆方向プライマーであり、したがってそれはプロモーターＤＮＡ断片の３’末端にＮｃｏＩ部位を付加する。ＤＮＡテンプレートとしてＰｇａｐを含有するプラスミドを使用し、これらの２つのプライマーを上述したような標準ＰＣＲ反応で使用して、５’ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位および３’ＮｃｏＩ部位がある３２３ｂｐのＰｇａｐプロモーターＤＮＡ断片（配列番号３６）を作成した。
【０１２８】
これらの各ＰＣＲ産物を製造業者の使用説明書に従って、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローンした。得られたプラスミドｐＴＰ−ａｒａＢ−ａｒａＡ、ｐＴＰ−ａｒａＤ、およびｐＴＰ−Ｐｇａｐを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してそれぞれを調製した。それらの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２９】
２．シャトルベクター内でＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをアセンブルする
ベクターｐＺＢ１８８（Ｚｈａｎｇら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０〜２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書）をベースとし、ベクターがザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で複製できるようにする複製領域を含有する、２，５８２ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を含む、ｐＺＢ１８８ａａｄａと称されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター内で、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをアセンブルした。ｐＺＢ１８８ａａｄａ中では、テトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃｒ−カセット）ｐＺＢ１８８が、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃｒ−カセット）で置換された。プラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎら，（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２〜１０８７）をテンプレートとして、プライマー１（配列番号３２ｆｒｏｍＣＬ４２３６）および２（配列番号３３ｆｒｏｍＣＬ４２３６）を使用したＰＣＲによって、Ｓｐｅｃｒ−カセットを作成した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするＴｒａｎｐｏｓｏｎ Ｔｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３）の公開された配列をベースとする、Ｓｐｅｃｒ−カセットおよびそのプロモーターのための完全なヌクレオチド配列を含有する。
プライマー１（配列番号３７）：
【化１】
プライマー２（配列番号３８）：
【化２】
【０１３０】
プライマー１（順方向プライマー）の下線付き塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットのプロモーターのすぐ上流で（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３のｎｔｓ４〜２２に）ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に相当する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線付き塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの停止コドンの約１３０塩基下流で（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０４３のｎｔｓ１００２〜１０２０に）ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に相当する。ＰＣＲにより生じた１０４８ｂｐのＳｐｅｃｒ−カセットをＣｌａＩとＡｆｌＩＩＩで二重消化し、得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）と供給業者の推奨プロトコルを使用して精製した。（（ｄａｍメチル化に感応性の）ＣｌａＩで切断するため、非メチル化プラスミドＤＮＡを得るために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）から単離された）プラスミドｐＺＢ１８８をＣｌａＩとＢｓｓＨＩＩで二重消化してＴｃｒ−カセットを除去し、得られた大きなベクター断片をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。次にこのＤＮＡ断片と精製ＰＣＲ産物を共に連結させ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した化学的コンピテント細胞（カタログ番号２００２３９）を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０中に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「付着末端」を発生させるが、それらが共に連結すると、どちらの部位も破壊されることに留意されたい。スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に形質転換体を播種して、３７℃で培養した。正確なサイズの挿入断片があるプラスミドを含有する、スペクチノマイシン耐性形質転換体をＮｏｔＩを用いた制限酵素消化分析によって同定し、ｐＺＢ１８８／ａａｄａと命名した。
【０１３１】
ｐＴＰ−ＰｇａｐＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇａｐ断片、ｐＴＰ−ａｒａＢ−ａｒａＡ ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ａｒａＢ−ａｒａＡ断片、およびｐＴＰ−ａｒａＤ ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ ａｒａＤ断片を全てＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクターにクローンして、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを含有するｐＺＢ１８８ａａｄａベースのシャトルベクターを形成した。ｐＡＲＡ２０１と称される得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。Ｐｇａｐの３’末端のヌクレオチドをＣＣから元のＡＣヌクレオチドに戻すことによって、ｐＡＲＡ２０５（図２；配列番号４１）をｐＡＲＡ２０１から調製した。これはＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施した。この変異誘発では、順方向プライマーａｒａ３１（配列番号３０）および逆方向プライマーａｒａ３２（配列番号４０）を使用して、製造業者の使用説明書に従って改変を行った。ｐＡＲＡ２０５を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。
【０１３２】
３．ａｒａＢＡＤをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で発現する
Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤがＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で機能するオペロンであることを確認するために、ｐＡＲＡ２０５を発現のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４に導入した。ＺＷ８０１−４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化株である。ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４株の構築および特性解析は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２００８０２８６８７０−Ａ１号明細書に記載される。逐次遺伝子転位事象を通じて、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）ゲノムに組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地上で適応させることで、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）を構築した。ＺＷ８００はＺＷ６５８の誘導体であり、それはグルコース−果糖オキシド還元酵素（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列中にスペクチノマイシン耐性カセットの二重交叉挿入を有して、この活性をノックアウトする。ＺＷ８０１−４はＺＷ８００の誘導体であり、その中ではスペクチノマイシン耐性カセットが部位特異的遺伝子組み換えによって欠失しており、タンパク質を時期尚早に切り詰めるインフレームの停止コドンが残されている。
【０１３３】
ＺＷ８０１−４のコンピテント細胞は、種細胞をＭＲＭ３Ｇ５（１％酵母抽出物、１５ｍＭＫＨ２ＰＯ４、４ｍＭＭｇＳＯ４、および５０ｇ／Ｌグルコース）中において１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でＯＤ６００値が５近くになるまで一晩培養することによって調製した。細胞を収集し、新鮮な培地にＯＤ６００値０．０５に再懸濁した。それらを同一条件下で、対数初期または中期（ＯＤ６００が０．５に近い）までさらに培養した。細胞を収集して、氷冷水で２回、次に氷冷１０％グリセロールで１回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷１０％グリセロールにＯＤ６００値１００近くに再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には非メチル化ＤＮＡを要するので、ｐＡＲＡ２０５プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換細胞の１つのコロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢブロス）中で３７℃で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、１０ｍＬの培養物からＤＮＡを調製した。
【０１３４】
１ＭＭ電気穿孔キュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で、およそ５００ｎｇの非メチル化ｐＡＲＡ２０５プラスミドＤＮＡを５０μＬのＺＷ８０１−４コンピテント細胞と混合した。ＢＴ７２０ Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを２．０ＫＶで細胞中に電気穿孔した。形質転換細胞を１ｍＬのＭＭＧ５培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）中において３０℃で４時間回復させ、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）内で、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上で３０℃で２日間培養した。個々のコロニーをＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０（ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０と同一であるがグルコースが５０ｇ／Ｌアラビノースによって置換されている）プレート上、および新しいＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に二連で画線塗抹した。上述したのと同一条件下で画線培養は良好に成長したが、ＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上の成長にはより長時間かかった。これはＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンが発現したことを示唆した。
【０１３５】
ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に成長した形質転換細胞の２本の画線培養（ＺＷ８０１−ａｒａ２０５−４およびＺＷ８０１−ａｒａ２０５−５）を７２時間成長アッセイのために選択した。アッセイでは、各画線培養からの細胞を２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加ＭＲＭ３Ｇ５）中において１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５（ＭＲＭ３Ｇ５と同一であるがグルコースがアラビノースによって置換されている）で洗浄し、ＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有するＭＲＭ３Ａ５）に再懸濁して、０．１の開始ＯＤ６００を得た。４ｍＬの懸濁液を１４ｍＬの蓋付きＦａｌｃｏｎ管に入れて、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間培養した。培養の終わりにＯＤ６００を測定した。次に１ｍＬの培養物を１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で、５５℃で０．６ｍＬ／分の速度で０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を用いてＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を通過させて分析し、エタノールおよび糖濃度を判定した。並行して、対照としてＺＷ８０１−４を（抗生物質なしで）培養し分析した。表２に示す結果は、ａｒａＢＡＤの発現がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４を成長できるようにし、唯一の炭素源としてアラビノースを使用してエタノールを生成できるようにしたことを実証する。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
実施例２
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへのアラビノース資化オペロンの組み込みおよび得られた株の特性解析
この実施例は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の２つのキシロース資化株へのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンの安定した組み込みについて記載する。
【０１３８】
１．Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを自殺ベクターに構築する
Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノムに組み込むために、ＤＣＯ（二重交叉）相同的組換えのための自殺ベクターを調製した。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤに加えて、このベクターは、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込みを導くＤＣＯ相同的組換え断片と、スペクチノマイシン耐性のための選択的マーカーを提供するａａｄＡ遺伝子とを含んだ。我々は挿入部位としてｌｄｈＡ遺伝子座を選んだ。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４ ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＤＣＯ、ＬＤＨ−Ｌ、およびＬＤＨ−Ｒのための２つのｌｄｈＡ ＤＮＡ断片をＰＣＲによって合成した。反応はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｍｉｘを使用して、実施例１に記載される標準ＰＣＲ手順に従った。ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２０（配列番号４２）および逆方向プライマーａｒａ２１（配列番号４３）を使用して合成された。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域に対して５’の配列、およびｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド１〜４９３を含む８９５ｂｐのＤＮＡ断片であり、５’ＳａｃＩ部位および３’ＳｐｅＩ部位があった（配列番号４４）。ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２２（配列番号４５）および逆方向プライマーａｒａ２３（配列番号４６）を使用して合成した。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド４９４〜９９６、およびｌｄｈＡコード領域に対して３’の配列を含む１１６９ｂｐの断片であり、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＮｏｔＩ部位があった（配列番号４７）。
【０１３９】
ｐＢＳベクターはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で複製できないことから、ｐＢＳ ＳＫ（＋）（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を自殺ベクターとして使用した。ｐＡＲＡ２０５のＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロン、ＬＤＨ−Ｌ断片、およびＬＤＨ−Ｒ断片をｐＢＳＳＫ（＋）中にクローニングすることで、ｐＡＲＡ３５４（配列番号４９）を構築した。さらに野性型ＬｏｘＰ部位（ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ断片；配列番号４８）によって境界される、（スペクチノマイシン耐性のための）ａａｄＡマーカーを含有するＤＮＡ断片をｐＡＲＡ３５４に含めた。ｐＡＲＡ３５４はＬＤＨ−ＬとＬＤＨ−Ｒ配列との間に位置する、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンおよびＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗマーカー断片を有する。
【０１４０】
図３は１０，４４１ｂｐのｐＡＲＡ３５４のマップを示す。これはｆ１（＋）ｏｒｉｇ
ｉｎと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを有する。ＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒは、それぞれｌｄｈＡコード配列の最初の４９３塩基対と残りの５０３塩基対を有したので、 交叉型組み換えによって、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のｌｄｈＡコード配列に、ヌクレオチド＃４９３と＃４９４の間でＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤおよびａａｄＡを直接挿入するために、ｐＡＲＡ３５４がデザインされた。
【０１４１】
２．Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株を作成する
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ７０５はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子操作株であり、ストレス条件下で改善されたキシロース資化能があり、参照によって本明細書に援用する同時係属同一譲受人の米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書に記載されるように、連続培養中での適応によってＺＷ８０１−４から誘導される。ＺＷ８０１−４キシロース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を少なくとも約５０ｇ／Ｌのキシロースを含んでなる培地中で連続培養して、エタノールを含んでなる培養物を生成し、次にアンモニアおよび酢酸を添加してストレス培養物を作成した。細胞をストレス培養中でさらに連続培養して、ＺＷ７０５株をはじめとする改善されたキシロース資化能を有する細胞を単離した。
【０１４２】
ｐＡＲＡ３５４をＺＷ７０５およびＺＷ８０１−４株の双方に形質転換するために、各株から調製された５０μＬコンピテント細胞中に、８００ｎｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを電気穿孔した。ＤＮＡ脱メチル化、コンピテント細胞調製、および電気穿孔は、実施例１に記載されるように実施した。各株の形質転換細胞のコロニーをＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内において、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上で３０℃で２日間培養した。ｐＡＲＡ３５４はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で複製できないので、スペクチノマイシン耐性は、これらのコロニーが組み込み株であることを示唆した。コロニーを新らしいＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートおよびＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートの上に二連で画線塗抹し、それぞれ２日間および４日間培養した。ＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上のそれらの成長もまた、組み込みを示唆した。組み込みをさらに実証するために、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡ断片とＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡとの間の接合部をＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、一対のプライマー、および試験する形質転換細胞を含有する標準３５サイクルＰＣＲ反応によって検査した。１つのＰＣＲサイクルは、９５℃で４５秒間の変性、５８℃で４５秒間のアニーリング、および７２℃で２分間の延長を含んだ。プライマーａｒａ４５（配列番号５０）およびプライマーａｒａ４２（配列番号５１）は、それぞれ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ中のＬＤＨ−Ｌ配列の上流に位置する順方向プライマー、およびｐＡＲＡ３５４のａｒａＢ遺伝子中に位置する逆方向プライマーであった。このプライマー対は、ＰＣＲによって検査された全コロニーから１６９４ｂｐの断片を増幅した。それぞれＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ中のｐＡＲＡ３５４のａａｄＡ遺伝子中に位置する順方向プライマー、およびＬＤＨ−Ｒ配列の下流に位置する逆方向プライマーである、プライマーａｒａ４６（配列番号５２）およびプライマーａｒａ４３（配列番号５３）もまた使用された。このプライマー対は、ＰＣＲによって調査された全てのコロニーから１５２１ｂｐの断片を増幅した。したがってＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ−ａａｄＡ断片は、ＤＣＯアプローチによってＺＷ８０１−４およびＺＷ７０５ゲノムに成功裏に組み込まれた。ＤＣＯ相同的組換えは標的特異性組み込みであることから、ＺＷ８０１−４またはＺＷ７０５の組み込みから生じるあらゆるコロニーは同一の遺伝子型を有する。各組み込みからのコロニーを５ｍＬのＭＲＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０中において、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によって収集し、０．５ｍＬの５０％グリセロールに再懸濁して、次に−８０℃で保存した。株をＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４と命名した。
【０１４３】
組み込まれたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンの機能をさらに改善するために、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株を適応させた。この目的で、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４の一晩培養物を遠心分離によって収集し、ＭＲＭ３Ａ５で洗浄して、０．１のＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０に再懸濁した。この懸濁液４ｍＬを１４ｍＬのＦａｌｃｏｎ蓋付き管に入れて、１５０ｒｐｍの振盪機内でＯＤ６００が１を越えるまで３０℃で７２時間培養した。次に培養物を４ｍＬの新鮮なＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０を含有する新しいＦａｌｃｏｎ管に接種して、２回目の培養のために開始ＯＤ６００を０．１近くにした。全部で９回の連続培養を完了した。各培養はＯＤ６００をおよそ０．１から１以上にし、細胞がはるかにより緩慢に成長したために６日かかった４回目の培養を除いて、３〜４日間を要した。適応株を特性解析するために、９回目の培養を１００倍に希釈して、１０μＬの希釈液をＭＭＡ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に塗布し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で３０℃で３日間培養した。個々のコロニー（すなわち適応株）を拾って、１５０ｒｐｍの振盪機上で、３ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０中において３０℃で一晩培養した。実施例１記載されるように、それらにＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０中での７２時間成長アッセイを施した。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株は、アッセイ中で対照として使用した。５つの適応株（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ４〜Ａ８）の分析データは表３に提示され、全ての適応株がＺＷ７０５−ａｒａ３５４よりも良い成績を示した。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７は、成長、エタノール生産、およびアラビノース資化の観点から最良の株であった。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
３．適応ありまたはなしのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中、および混合糖を含有する培地中において、アラビノースを資化して細胞成長とエタノール生産を支える能力について、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組み込み株をさらに特性解析した。唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中においてこれらの株を特性解析するために、最初にＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７細胞を１５０ｒｐｍ振盪機内で２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０中において３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、０．１の開始ＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−Ｓｐｅｃ２５０に再懸濁した。２０ｍＬの懸濁液を５０ｍＬねじ蓋付きＶＷＲ遠心管に入れて１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間にわたって培養した。時間経過中に、ＯＤ６００をそれぞれ０、２４、４８、７２、および９６時間目に測定した。各時点において、１ｍＬの培養物を取り出して１０，０００×ｇで遠心分離し、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上において５５℃で０．６ｍＬ／分間の速度を使用して、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを通過させて、エタノールおよび糖濃度について分析した。並行してＺＷ７０５を抗生物質なしの培地中で培養し、対照として分析した。結果を図４に示す。これらの結果は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤなしではＺＷ７０５がアラビノースを代謝できず、アラビノースが唯一の炭素源である場合、成長できないことを示唆する（図４Ａ）。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込み後、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４はアラビノースを資化して、成長およびエタノール生産を支えることができる（図４Ｂ）。アラビノース消費の最大速度は０．２ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３２．８％低下して３４ｇ／Ｌになった。適応はＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中のアラビノース資化能、細胞成長、およびエタノール生産を大幅に改善した。アラビノース消費最大速度は、０．７３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は８３．４％低下して８．４ｇ／Ｌになった。
【０１４６】
混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ＺＷ７０５、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４、およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７を上述のように培養して分析したが、先の実験で使用したＭＲＭ３Ａ５培地は、ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５培地（２５ｇ／Ｌアラビノース、２５ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコース添加ＭＲＭ３）によって置換された。ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中の迅速な成長のために、１０時間目の時点を添加した。分析は、アラビノース培地を使用した実験について上述したのと同様であった。結果を図５に示す。これらの結果は、ＺＷ７０５がグルコースおよびキシロースを効率的に資化して、強力な細胞成長とエタノール生産を支えるが、アラビノースは代謝できないことを示す（図５Ａ）。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組み込み後、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４はアラビノースを資化して、細胞成長およびエタノール生産を増強できた（図５Ｂ）。アラビノース消費の最大速度は、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は６７．９％低下して８．８ｇ／Ｌになった。適応株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中では、アラビノース資化において、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４株よりもいくらかの改善があり、それはより良い成長およびエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は０．３６ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は７４．１％低下して７．１ｇ／Ｌになった。
【０１４７】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの２つのアラビノース輸送系のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のためのコンストラクト
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在してａｒａＥまたはｂｙａｒａＦＧＨによってコードされる、２つの各アラビノース輸送系をザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で発現させて、アラビノース資化を分析した。ａｒａＥはアラビノース−プロトン共輸送体をコードする一方、ａｒａＦＧＨはＡＢＣ輸送体を形成する３つのタンパク質をコードする。
【０１４８】
１．ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のためのキメラａｒａＥ遺伝子およびａｒａＦＧＨオペロンの構築
テンプレートとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ａＫ１２株：ＡＴＣＣ＃７００９２６）ＤＮＡを使用して、実施例１に記載される標準３０サイクルＰＣＲによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＥおよびａｒａＦＧＨコード配列ＤＮＡ断片を調製した。各サイクルは、９４℃で４５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリング、および７２℃で４分間の鎖延長を含んだ。順方向プライマーａｒａ１３５（配列番号：５４）および逆方向プライマーａｒａ１３６（配列番号：５５）をＰＣＲで使用して、ａｒａＥコード配列（１，４１９ｂｐ）およびその３’ＵＴＲ（１２１ｂｐ）を含む１，５５０ｂｐのａｒａＥ断片を合成し、ＮｃｏＩ部位を５’末端に、ＥｃｏＲＩ部位を３’末端に付加する（配列番号：５６）。順方向プライマーａｒａ１３７（配列番号：５７）および逆方向プライマーａｒａ１３８（配列番号：５８）をＰＣＲで使用して、３，７４４ｂｐのａｒａＦＧＨ断片（配列番号：５９）を合成する。この断片は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＦＧＨオペロンと同一であるが、プロモーターを欠いている。これは、ａｒａＦコード配列、ａｒａＧコード配列、ａｒａＨコード配列、ａｒａＨ３’ＵＴＲ、および未変化の遺伝子間領域を含んだ。プライマーは、５’ＮｃｏＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位を付加した。
【０１４９】
ａｒａＥおよびａｒａＦＧＨの発現を導くために、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーター（Ｐｇｉ）を選択した。これはキシロースイソメラーゼ遺伝子のプロモーターであり、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で弱い構成的プロモーターとして機能することが実証されている。Ａ．ミズーリエンシス（Ａ． ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）Ｐｇｉをクローンするために、１対のオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。プライマーａｒａ１２（配列番号：６０）はＰｇｉのＰＣＲのための順方向プライマーであり、それはプロモーターの５’末端にＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位を付加した。プライマーａｒａ１３（配列番号：６１）はＰｇｉのＰＣＲのための逆方向プライマーであり、プロモーターの３’末端にＮｃｏＩ部位を付加した。これらの２つのプライマーを標準ＰＣＲ反応で使用して、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＧＩプロモーター（配列番号６２）を含有するプラスミドをテンプレートＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ反応は５’ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位および３’ＮｃｏＩ部位がある２０１ｂｐのＰｇｉＤＮＡ断片（配列番号６３）を生じ、それを製造業者の使用説明書に従ってＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローンした。得られたプラスミドｐＴＰ−Ｐｇｉを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１５０】
ｐＴＰ−ＰｇｉからのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇｉ断片と、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ ａｒａＥ ＰＣＲ断片とをクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣＭ−Ｒ；配列番号６４）と共に、ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクター中で組み合わせてｐＡＲＡ１１２（図６；配列番号６５）を作り出した。ｐＡＲＡ１１２は、ｐＺＢ１８８由来大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）シャトルベクター中にＰｇｉ−ａｒａＥキメラ遺伝子を含有する。ｐＴＰ−ＰｇｉからのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ Ｐｇｉ断片と、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ ａｒａＦＧＨ ＰＣＲ断片とをクロラムフェニコール耐性マーカーと共に、ｐＺＢ１８８／ａａｄａベクター中で組み合わせてｐＡＲＡ１１３（図７；配列番号６６）を作り出した。得られたシャトルベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で増殖させて、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。Ｐｇｉ−ａｒａＥ遺伝子およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンは、配列決定によって確認された。
【０１５１】
実施例４
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７中における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アラビノース輸送系の発現
構築されたＰｇｉ−ａｒａＥ遺伝子およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンを発現させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２つのアラビノース輸送系のアラビノース資化ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に対する影響を試験した。
【０１５２】
１．ｐＡＲＡ１１２およびｐＡＲＡ１１３を用いてＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａを形質転換する
どちらも実施例３で調製されたＰｇｉ−ａｒａＥ遺伝子を含有するｐＡＲＡ１１２およびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨオペロンを含有するｐＡＲＡ１１３を（実施例１および２で調製された）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の細胞に形質転換した。実施例１に記載されるようにして、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株のコンピテント細胞を調製した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には非メチル化ＤＮＡが必要なため、ｐＡＲＡ１１
２およびｐＡＲＡ１１３をそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞に形質転換し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、単一コロニーの１０ｍＬの培養物から非メチル化プラスミドＤＮＡを調製した。１ＭＭ ＶＷＲ電気穿孔キュベット内で、およそ５００ｎｇの各プラスミドＤＮＡを５０μＬのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７コンピテント細胞と別々に混合し、ＢＴ７２０ Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ Ｐｌｕｓを使用して２．０ＫＶで細胞内に電気穿孔した。
【０１５３】
ｐＡＲＡ１１２またはｐＡＲＡ１１３形質転換細胞（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３）を１ｍＬのＭＭＧ５培地中において３０℃で４時間回復させ、次にＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で、ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上において３０℃で２日間培養した。個々のコロニーを新しいＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に画線塗抹して、最後のステップと同一条件下で成長させた。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。
【０１５４】
２．形質転換された株中でＰｇｉ−ａｒａＥおよびＰｇｉ−ａｒａＦＧＨを発現させる
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３の代表例を示すために、形質転換された株のいくつかの画線培養をＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレートから選択した。実施例１に記載される７２時間成長アッセイによって、Ｐｇｉ−ａｒａＥまたはＰｇｉ−ａｒａＦＧＨの発現を調べた。このアッセイでは、各画線培養からの細胞を１５０ｒｐｍで振盪しながら、２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＲＭ３Ｇ５）中において３０℃で一晩培養した。細胞を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、ＭＲＭ３Ａ５−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＭＲＭ３Ａ５）中に０．１の開始ＯＤ６００に再懸濁した。４ｍＬの懸濁液を１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間培養した。培養終了時に、実施例１に記載されるようにして、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを使用して、ＯＤ６００を測定し代謝産物プロフィールを分析した。対照としてＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株を培養し、ＣＭ１２０をＳｐｅｃ２５０で置き換えて並行して分析した。各形質転換中の３株の結果を表４に示す。
【０１５５】
【表４】
【０１５６】
それらの親株と比較して、全てのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株は、７２時間の培養中により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長およびエタノール生産を支えた。実際には、これらのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１
１２株は、培地中のほぼ全ての利用できるアラビノースを消費した。これはａｒａＥが、遺伝子操作株中でアラビノース資化を促進したことを示唆する。他方ａｒａＦＧＨの発現は、悪影響を与えるようである。それは７２時間の培養中に、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１３株中で、より少ないアラビノース資化、より低レベルの成長、およびより低いエタノール生産をもたらした。
【０１５７】
３．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株はアラビノース代謝の促進を示したので、これらの株をさらに分析した。特性解析は、実施例２．３に記載される手順に従って実施した。ａｒａＥはシャトルベクターから発現されたので、発現レベルは異なる株間で変動し得る。そのため２つの株（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３）を並べて調べた。単一糖（アラビノース）培地中において株を特性解析するために、一晩培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３培養物を収集してＭＲＭ３Ａ５で洗浄し、０．１の開始ＯＤ６００でＭＲＭ３Ａ５−ＣＭ１２０に再懸濁した。２０ｍＬの懸濁液を１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間培養した。ＯＤ６００を０、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間目に測定した。各時点で、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上のＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを使用して、代謝産物プロフィールを分析した。並行して、親株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７を１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールの代わりに２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン中で培養し、対照として分析した。結果を図８に示す。これらの結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７がアラビノースを最大速度０．９３ｇ／Ｌ／ｈｒで資化することを示唆する。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は８０．４％低下して９．８１ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３はアラビノースをより効率的に資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、１１２−２および１１２−３株中で、それぞれ１．１８ｇ／Ｌ／ｈｒおよび１．２８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２では９８％低下して１．０２ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３では９９．２％低下して０．４１ｇ／Ｌになった。実際にはＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３は、それぞれ７２時間および４８時間の培養後に、全ての利用できるアラビノースをほぼ使い果たした。
【０１５８】
混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３を培養して上述のように分析したが、ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５培地を使用した。結果を図９に示す。これらの結果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７が、全てのグルコースおよびキシロースを２４時間以内に効率的に使い果たし、強力な成長およびエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は比較的緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は、０．４３ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は６２．４％低下して９ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３は、アラビノースをはるかにより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．７３ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．７８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−２では９０．３％低下して２．３３ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２−３では９０．１％低下して２．３８ｇ／Ｌになった。それは実際には双方の株で、４８時間以内にこのレベル近くにまで低下した。したがってａｒａＥの発現は、混合糖培地中のアラビノース資化もまた促進し、それは図９に示すようにエタノール生産に寄与した。発現はグルコース代謝に顕著な影響を及ぼさなかったが、それはキシロース代謝を減速させ、どちらのＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２株でも培地中の全てのキシロースを消耗するのに４８時間かかったが、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７株では２４時間しかかからなかった。
【０１５９】
実施例５
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４中におけるａｒａＥ発現
この実施例では、非適応アラビノース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４株中におけるａｒａＥ発現の影響を分析する。
【０１６０】
１．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４をｐＡＲＡ１１２によって形質転換する
実施例２に記載されるように、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４は、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤをｌｄｈＡ遺伝子座に導入することによりＺＷ７０５およびＺＷ８０１−４から作成された、遺伝子操作Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株である。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４は、ＭＲＭ３Ａ５中で適応されなかったＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の親株である。双方の株のコンピテント細胞を調製した。先行する実施例に記載されるようにして、ｐＡＲＡ１１２の非メチル化ＤＮＡをコンピテント細胞内に電気穿孔した。
【０１６１】
ｐＡＲＡ１１２−形質転換ＺＷ７０５−ａｒａ３５４（ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２）およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４（ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２）を１ｍＬのＭＭＧ５培地中において３０℃で４時間回復させ、次にＡｎａｅｒｏＰａｃｋ付き嫌気性ジャー内で、ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上において３０℃で２日間培養した。個々のコロニーを新しいＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に画線塗抹し、最終ステップと同一条件下で培養した。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。
【０１６２】
２．形質転換株中においてＰｇｉ−ａｒａＥを発現する
それぞれＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２の代表例を示すために、形質転換株のいくつかの画線培養をＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレートから選択した。ＭＲＭ３Ａ５中の７２時間成長アッセイによって、Ｐｇｉ−ａｒａＥの発現を調べた。アッセイの詳細は、先行する実施例と同一であった。対照として、増殖培地中の１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンで置き換えて、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４株を並行して培養し分析した。各形質転換からの３株の結果を表５に示す。それらの親株と比較して、全てのＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株は、７２時間の培養中に顕著により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。したがってａｒａＥは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株の双方の中で、アラビノース資化もまた促進した。
【０１６３】
【表５】
【０１６４】
３．ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株を９６時間経過中のそれらの成長および代謝産物プロフィールについて、さらに特性解析した。特性解析は、実施例４．３に記載されるのと同じ手順に従って実施された。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２を調べてそれらの親株ＺＷ７０５−ａｒａ３５４と比較する一方、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６を調べてそれらの親株ＺＷ８０１−ａｒａ３５４と比較した。測定および分析は、０、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間の時点で実施した。
【０１６５】
図１０は、ＭＲＭ３Ａ５中で培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４がアラビノースを最大速度０．２５ｇ／Ｌ／ｈｒで不完全に資化することを示す。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３８．１９％のみ低下して３０．２２ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２は、アラビノースをより効率的にを資化して、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．４６ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．４８ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１では６５．８％低下して１６．７３ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２では６９．６１％低下して１４．８６ｇ／Ｌになった。
【０１６６】
図１１は、混合糖培地ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中で培養したＺＷ７０５−ａｒａ３５４およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４がグルコースおよびキシロースを効率的に使用して、強力な成長とエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は、緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は０．２９ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は５７．３２％低下して１０．２１ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２は、アラビノースをより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．３２ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．３５ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−１
では８６．３３％低下して３．２７ｇ／Ｌになり、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−２では８５．２％低下して３．５４ｇ／Ｌになった。これらの結果は、ａｒａＥの発現が、単一糖（アラビノース）培地中および混合糖培地中の双方で、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株中のアラビノース資化能を促進することを実証した。したがってａｒａＥの効果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７の適応中に獲得される遺伝的背景を必要としなかった。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２中の結果と同様に、ａｒａＥの発現は、混合糖培地中で培養されたＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２中のキシロース代謝をわずかに減速させた。
【０１６７】
図１２は、ＭＲＭ３Ａ５中で培養されたＺＷ８０１−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。結果は、Ｐｇｉ−ａｒａＥなしでは、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４がアラビノースを最大速度０．２５ｇ／Ｌ／ｈｒで不完全に資化することを示唆する。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は３２．９９％のみ低下して３２．７６ｇ／Ｌになった。ａｒａＥの発現があると、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６はアラビノースをより効率的に資化して、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．４９ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．４７ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５では６９．５２％低下して１４．９０ｇ／Ｌになり、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６では６５．９２％低下して１６．６６ｇ／Ｌになった。図１３は、混合糖培地ＭＲＭ３Ａ２．５Ｘ２．５Ｇ５中で培養したＺＷ８０１−ａｒａ３５４およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株から得られた結果を示す。これはＺＷ８０１−ａｒａ３５４がグルコースとキシロースを効率的に使用して、強力な成長とエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は、０．２２ｇ／Ｌ／ｈｒであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は４５．４８％低下して１３．０４ｇ／Ｌになった。しかしＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５およびＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６は、アラビノースをより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ０．３５ｇ／Ｌ／ｈｒおよび０．３６ｇ／Ｌ／ｈｒに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−５では８９．９２％低下して２．４１ｇ／Ｌになり、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２−６では８８．３８％低下して２．７８ｇ／Ｌになった。これらの結果は、ａｒａＥの発現が、単一糖培地中および混合糖培地中の双方において、ＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２株中のアラビノース資化能を促進することをさらに実証した。したがってａｒａＥ効果は、ＺＷ７０５−ａｒａ３５４と誘導株に限定されなかった。ＺＷ７０５−ａｒａ３５４Ａ７−ａｒａ１１２およびＺＷ７０５−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２と同様に、ａｒａＥの発現は、混合糖培地中で培養されたＺＷ８０１−ａｒａ３５４−ａｒａ１１２中のキシロース代謝をわずかに減速させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物。
【請求項２】
前記アラビノース−プロトン共輸送体が、ａｒａＥ遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
アラビノース資化能が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約１０％改善される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
株がキシロースをさらに資化してエタノールを生成する、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
ａ）適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する、組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を（ａ）の株に導入するステップと
を含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を作り出す方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前または後のどちらかで、またはステップ（ｂ）の前または後の双方で、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中での連続成長によって前記株を適応させ、それによって適応株が産生されるステップをさらに含んでなり、前記株が、適応されていない前記株と比較して、さらに改善されたアラビノース資化能を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記適応株が、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含んでなる混合糖培地中におけるエタノール生産のために、キシロースおよびグルコースをさらに資化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースがエタノールに変換されるステップと
を含んでなるエタノールを製造する方法。
【請求項９】
前記アラビノース−プロトン共輸送体がａｒａＥ遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
アラビノース資化が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約１０％改善される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）の株がキシロースおよびグルコースをさらに資化して、エタノールを生成できる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）の株が、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中の連続成長によって適応され、それによってアラビノース適応株が産生され、前記アラビノース適応株が、適応されていない（ａ）の株と比較して、増大するエタノール生産を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く組み換え親株によるアラビノースからエタノールの変換と比較して増大する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く組み換え親株と比較して少なくとも約１０％増大する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が、アラビノースを含んでなる糖混合物、または唯一の糖としてのアラビノースのどちらかを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株からなる群から選択されるアラビノース資化微生物を提供するステップと；
（ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を前記微生物のゲノムに導入し、前記共輸送体が前記微生物によって発現されるステップと；
（ｃ）（ｂ）の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、前記微生物が前記アラビノース−プロトン共輸送体を欠く前記微生物と比較して増大する速度で前記アラビノースを代謝するステップと
を含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法。
【請求項１】
アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物。
【請求項２】
前記アラビノース−プロトン共輸送体が、ａｒａＥ遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
アラビノース資化能が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約１０％改善される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
株がキシロースをさらに資化してエタノールを生成する、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
ａ）適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する、組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を（ａ）の株に導入するステップと
を含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属の組み換え微生物を作り出す方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前または後のどちらかで、またはステップ（ｂ）の前または後の双方で、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中での連続成長によって前記株を適応させ、それによって適応株が産生されるステップをさらに含んでなり、前記株が、適応されていない前記株と比較して、さらに改善されたアラビノース資化能を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記適応株が、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含んでなる混合糖培地中におけるエタノール生産のために、キシロースおよびグルコースをさらに資化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースがエタノールに変換されるステップと
を含んでなるエタノールを製造する方法。
【請求項９】
前記アラビノース−プロトン共輸送体がａｒａＥ遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
アラビノース資化が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約１０％改善される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）の株がキシロースおよびグルコースをさらに資化して、エタノールを生成できる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）の株が、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中の連続成長によって適応され、それによってアラビノース適応株が産生され、前記アラビノース適応株が、適応されていない（ａ）の株と比較して、増大するエタノール生産を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く組み換え親株によるアラビノースからエタノールの変換と比較して増大する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を欠く組み換え親株と比較して少なくとも約１０％増大する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が、アラビノースを含んでなる糖混合物、または唯一の糖としてのアラビノースのどちらかを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株からなる群から選択されるアラビノース資化微生物を提供するステップと；
（ｂ）アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を前記微生物のゲノムに導入し、前記共輸送体が前記微生物によって発現されるステップと；
（ｃ）（ｂ）の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、前記微生物が前記アラビノース−プロトン共輸送体を欠く前記微生物と比較して増大する速度で前記アラビノースを代謝するステップと
を含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５３０４９０（Ｐ２０１２−５３０４９０Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６１３７（Ｐ２０１２−５１６１３７）
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８１２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７８３５
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８１２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７８３５
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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