【課題】ケトカロテノイドの生成に有用な新しいＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼを提供する。
【解決手段】新規のＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明のケトラーゼ遺伝子は、以前報告さたその他のＣｒｔＷケトラーゼと比較して低い相同性を示す。異種の宿主におけるカロテノイドケトラーゼの発現は、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの生成を可能にする。多岐にわたるｃｒｔＷ遺伝子を使用した同時発現実験は、所望のケトカロテノイドの生成増大をもたらす。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は、２００３年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５３１３１０号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、微生物学および分子生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、環状ケトカロテノイド化合物の微生物による生産に有用な酵素をコードする核酸断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイドは、自然界全体に遍在性で、全ての光合成生物によって、そして一部の従属栄養性生育細菌および真菌において合成される顔料である。カロテノイドは、花、野菜、昆虫、魚、および鳥に色を提供する。カロテノイドの色は黄色から赤に及び、褐色および紫のバリエーションがある。ビタミンＡの前駆物質として、カロテノイドは、我々の食餌の基礎的構成要素であり、それらはヒトの健康において追加的な重要な役割を果たす。動物は、カロテノイドを新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できないので、それらを食餌の手段によって得なくてはならない。したがって植物または細菌におけるカロテノイド生成および組成の操作は、新しいまたは改善されたカロテノイド源を提供できる。カロテノイドの工業的使用の例としては、医薬品、食品サプリメント、動物飼料添加剤、および化粧品の着色剤などが挙げられる。
【０００４】
天然で確認された６００を越える異なるカロテノイドの存在にもかかわらず、工業的には、食物色素、動物飼料、医薬品、および化粧品のためにわずかなカロテノイドが使用されるのみである。これは生産の困難さが主因である。現在、工業目的で使用されるほとんどのカロテノイドは化学合成によって生産されるが、これらの化合物は化学的に製造することが非常に困難である（非特許文献１）。天然カロテノイドは、植物材料の抽出または微生物合成のいずれかによって得ることができる。しかし商業的なカロテノイド生産にはわずかな植物種のみが広く使用され、これらの植物におけるカロテノイド合成の生産性は比較的低い。その結果、これらの植物から生成されるカロテノイドは非常に高価である。生合成の生産能力を増大させる一方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである（（非特許文献２）でレビューされている）。したがって非カロテン産生性細菌および酵母菌中でカロテノイドを生成することにより、最も適切で効率的な産生生物の質、量、および選択のコントロールを可能にすることが望ましい。後者は、消費者にとって商業的生産経済（ひいては入手可能性）のために、特に重要である。
【０００５】
カロテノイドケトラーゼは、β−カロテンなどの環状カロテノイドのイオノン環に、ケト基を導入してケトカロテノイドを生成する酵素のクラスである。ケトカロテノイドの例としては、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−γ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、およびミキソバクトン（ｍｙｘｏｂａｃｔｏｎｅ）が挙げられる。２つのクラスのケトラーゼ、ＣｒｔＷおよびＣｒｔＯが報告されている。２つのクラスは同様の官能基を有するにもかかわらず、それらは配列類似性が非常にわずかなので、独立して生じたようにみえる。ＣｒｔＷは、β−カロテンのケト−基を双方の環に付加する対称的に作用する酵素である（非特許文献３）。（非特許文献４）は、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３からのＣｒｔＯケトラーゼ酵素が、β−カロテンの２つのβ−イオノン環の１つのみにケト−基を対称的に付加することを報告した。
【０００６】
ＣｒｔＷケトラーゼのいくつかの例が、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（特許文献１）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種（特許文献２）、およびブレバンジモナス・アウランティアカム（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（特許文献３）をはじめとする種々の細菌において報告されている。しかしカンタキサンチンおよびアスタキサンチンなどの価値のあるケトカロテノイドの生成のために、遺伝子工学工業的に適切な微生物のために有用な追加的な新しいＣｒｔＷケトラーゼ遺伝子を同定する必要性がある。さらに高度に相同的な遺伝子の同時発現は、遺伝的不安定性（すなわち望ましくない相同的な遺伝子組換え）をもたらしがちなので、比較的低から中程度の配列相同性（すなわち＜６５％のヌクレオチド配列同一性）を有するＣｒｔＷタイプケトラーゼを同定する、特に重要な必要性がある。比較的低から中程度の配列相同性を有するｃｒｔＷ遺伝子を発現することによって、通常では高度に相同的な遺伝子の発現にむすびつく、遺伝的不安定性の確率が低下するはずである。これは所望の生成物（すなわちケトカロテノイド）の最適生成のために、遺伝的に安定した市販系統を開発する際に特に重要である。
【０００７】
多岐にわたるヌクレオチド配列を有するＣｒｔＷ遺伝子は、単一組換え宿主細胞中で複数のケトラーゼを発現するために最も適切である。これはケトラーゼ活性がケトカロテノイド生合成経路において律速段階になった場合、特に重要である。利用できる基質プールが無制限であると仮定して、生成宿主中で同時に発現できるｃｒｔＷ遺伝子の数を増加させることで、ケトカロテノイド生成を増大させることが期待できる。
【０００８】
さらにＣｒｔＷケトラーゼは、基質融通性を示す傾向がある。しかし異なるＣｒｔＷケトラーゼが１つ以上の可能な基質（すなわちβ−カロテン対ゼアキサンチン）に対して、優先的な活性を示すかもしれないことが想定できる。好ましい基質に基づいてそれぞれ選択された複数のＣｒｔＷケトラーゼの同時発現を、所望のケトカロテノイドの最適生成のために使用してもよい。当業者は所望のケトカロテノイドの最適生成のために、所望の宿主細胞中の入手できる基質プールを分析し、ケトラーゼの適切な組み合わせを選択的に発現することで、所望のケトカロテノイド最終生成物の生成を最適化するかもしれない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，１５０，１３０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３００８７３３７号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／０７９３９５号パンフレット
【非特許文献１】ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびリーンハー（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７０：１８１−１９１（１９９１）
【非特許文献２】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５９：１６９−１８１（１９９８）
【非特許文献３】ハンニバル（Ｈａｎｎｉｂａｌ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２：３８５０〜３８５３（２０００）
【非特許文献４】フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９７２８〜９７３３（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって解決すべき問題は、ケトカロテノイド（すなわちカンタキサンチンおよびアスタキサンチン）の工学生成のために有用な新しいｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子を同定し、単離することである。本発明は、組換え宿主細胞中におけるケトカロテノイド生成に有用な３つの新しいｃｒｔＷ遺伝子を提供することによって、既述の問題を解決した。本ＣｒｔＷケトラーゼを使用してケトカロテノイドを生成する方法もまた、提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、環状カロテノイドから環状ケトカロテノイドへの転換ができる新しいカロテノイドケトラーゼ酵素に関する。よって本発明は、
（ａ）配列番号２、４、６に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の洗浄条件で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドケトラーゼ酵素コードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
同様に本発明は、適切な調節配列に作動的に結合した単離された核酸分子、本発明の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド、および同物質を含んでなる形質転換された生成宿主細胞を含んでなる遺伝的キメラを提供する。
【００１３】
本発明は、プライマー誘導増幅またはハイブリダイゼーション法のどちらかによって、本発明の核酸分子を得る方法をさらに提供する。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の遺伝子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる、
ことを含んでなる、環状ケトカロテノイド化合物の生成方法を提供する。
【００１５】
同様に本発明は、
（ａ）適切な調節配列の制御下にある本発明のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイドの生合成が制御される条件下で生育させる、
ことを含んでなる、生物において環状ケトカロテノイド生合成を制御する方法を提供する。
【００１６】
代案の実施態様では、本発明は、
（ａ）環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の第１の遺伝子で形質転換し、
（ｃ）（ａ）の宿主細胞をＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第２の遺伝子で形質転換し、そして
（ｄ）前記（ａ）の第１の遺伝子および前記（ｂ）の第２の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第１の遺伝子または前記第２の遺伝子いずれかのみを発現する形質転換宿主細胞に比べて、環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、
ことを含んでなり、
前記第２の遺伝子が前記第１の遺伝子と比べると６５％未満の核酸配列同一性を有する、
環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法を提供する。
【００１７】
（ａ）ｉ）天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子、
ｉｉ）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチド断片の第１の集団、
ｉｉｉ）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチド断片の第２の集団
を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、制限酵素断片の混合物が生成され、
（ｂ）前記制限酵素断片の混合物を変性させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の変性した前記制限酵素断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）を反復して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子が生成される、
ことを含んでなる方法によって生成される、本発明の変異遺伝子もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】は、β−カロテンからのケトラーゼおよび水酸化酵素反応を通じたアスタキサンチン合成における可能な経路中間体を図示する。
【図２】細菌株によって生成されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析である。
【図２ａ】Ｓ．メロニス（ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８の分析からのＨＰＬＣデータを示す。
【図２ｂ】Ｂ．ベシキュラリス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３の分析からのＨＰＬＣデータを示す。
【図２ｃ】フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃの分析からのＨＰＬＣデータを示す。
【図３】多岐にわたるｃｒｔＷ遺伝子を発現するβ−カロテン蓄積大腸菌株によって生成されるカロテノイドの分析からのＨＰＬＣデータである。
【図４】多岐にわたるｃｒｔＷ遺伝子を発現するアスタキサンチン生成大腸菌株によって生成されるカロテノイドの分析からのＨＰＬＣデータである。
【図５】β−カロテン合成遺伝子によって、多岐にわたるｃｒｔＷ遺伝子を発現するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ細胞のＨＰＬＣ分析である。
【００１９】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００２０】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２１】
配列番号１は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ ｃｒｔＷ ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号２は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ ＣｒｔＷケトラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号３は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ ｃｒｔＷ ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号４は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ ＣｒｔＷケトラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５は、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ ｃｒｔＷ ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号６は、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ ＣｒｔＷケトラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号７は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定に使用されるプライマー（「ＨＫ１２」）のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号８は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定に使用されるプライマー（「ＪＣＲ１４」）のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号９は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定に使用されるプライマー（「ＪＣＲ１５」）のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１０は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１１は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１２は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（米国特許出願第６０／４７７８７４号明細書）からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢＺカロテノイド合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１３は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１４は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｒのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号１５は、Ｐ．アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号１６は、プライマーｃｒｔＷ−１８＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号１７は、プライマーｃｒｔＷ−１８＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号１８は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号１９は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２０は、プライマーｃｒｔＷ／Ｋ１−２０２ＣＦのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２１は、プライマーｃｒｔＷ／Ｋ１−２０２ＣＲのヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２２は、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｃｒｔＺ水酸化酵素遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号２３は、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号２４は、プライマーｃｒｔＺＷ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号２５は、プライマーｃｒｔＺＷ＿ｓｏｅ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号２６は、プライマーｃｒｔＺＷ＿ｓｏｅ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号２７は、プライマーｃｒｔＺＷ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号２８は、プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号２９は、プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３０は、プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号３１は、プライマーｃｒｔ−２６０Ｒ１＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３２は、プライマーｃｒｔ−２６０Ｒ１＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号３３は、プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００５４】
以下の生物学的寄託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って行った。
【００５５】
【表１】

【００５６】
ここでの用法では、「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０−２２０９マナッサスのユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１のＡＴＣＣに所在する米国微生物系統保存機関国際寄託局を指す。「国際寄託名」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の登録番号である。
【００５７】
列挙した寄託株は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本ｃｒｔＷ遺伝子およびそれらの発現生成物であるカロテノイドケトラーゼは、環状ケトカロテノイド化合物を生成する能力を有する組換え生物を作り出す上で有用である。ＣｒｔＷケトラーゼをコードする核酸断片は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３、およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃをはじめとするいくつかの細菌株から単離されている。単離された核酸断片は、当業者によく知られているＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公
開データベースと比較することで同定され、特性決定された。
【００５９】
本ｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、操作されて適切な基質（すなわちβ−カロテン）を生成する遺伝子導入微生物宿主中で発現される。遺伝子の機能的発現は、異種の宿主中でのケトカロテノイド（例えばカンタキサンチンおよびアスタキサンチン）の生成によって測定された。さらに遺伝子導入宿主内のケトカロテノイド生成に対する多岐にわたるケトラーゼ同時発現の効果は、ケトカロテノイド生成の相対変化を測定することで特性決定された。
【００６０】
本発明の遺伝子および遺伝子産物は、環状ケトカロテノイド化合物の生成または制御のために多様なやり方で使用してもよい。本ｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、適切な基質を生成する能力を有する異種の宿主中におけるケトカロテノイド生成のために使用できる。さらにケトカロテノイドの最適化された生成のために、異種の宿主中で２つの以上の本ｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子が同時に発現されてもよい。本ｃｒｔＷ遺伝子の同時発現は、その他の既知のＣｒｔＷケトラーゼに対するそれらの比較的低〜中程度のヌクレオチド配列相同性のために、可能である。比較的低／中程度の相同性は、最適のケトカロテノイド生成のための組換え宿主細胞中における複数のＣｒｔＷケトラーゼの安定した発現を可能にする。
【００６１】
ここで述べる遺伝子および遺伝子配列は、ケトカロテノイドの生成を工業的に適切な宿主細胞に直接組み込むことを可能にする。この側面によって、その中にこれらの遺伝子が組み込まれたあらゆる組換え宿主は、より望ましい生成宿主になる。生成したケトカロテノイドは、動物飼料をはじめとする多様な用途で使用するために、生成宿主から単離できる。望ましい着色と健康上の利点を追加することが知られているカロテノイドの存在のために、任意に組換え宿主細胞（細胞全体、均質化、または自己融解細胞）を動物飼料に直接に組み込むことができる（カロテノイド単離ステップなし）。サケとエビの水産養殖は、カロテノイド着色がこれらの生物の価値にとって決定的に重要であるので、本発明の特に有用な用途である（Ｆ．シャヒディ（Ｓｈａｈｉｄｉ）、Ｊ．Ａ．ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、「海産食品および水産養殖におけるカロテノイド顔料（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｅａｆｏｏｄ ａｎｄ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８（１）：１〜６７（１９９８））。さらにケトカロテノイドアスタキサンチンは、強力な抗酸化剤であることが知られており、ヒトにおいて免疫機能を高め発ガンを低下させることが報告されている（ジョウノウチ（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ）ら、Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ、２３：１７１〜１８３（１９９５）；タナカ（Ｔａｎａｋａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５：４０５９〜４０６４（１９９５））。
【００６２】
本開示中では、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００６３】
ここでの用法では「含んでなる」という用語は、特許請求の範囲で言及される既述された徴群、整数、ステップ、または構成要素の存在を意味するが、１つ以上のその他の徴群、整数、ステップ、構成要素またはそれらの群の存在または添加を除外しない。
【００６４】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００６５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００６６】
ここでの用法では、「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」という用語は同義的に使用され、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の
単離された核酸断片は、１個またはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなっても良い。
【００６７】
「ｐＢＨＲ−ｃｒｔ１」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドはパントエア・スティワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ８１９９）からのｃｒｔＥＸＹＩＢカロテノイド遺伝子クラスターをｐＢＨＲ１中にクローンして構築された（ドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉｏＴｅｃｈ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、および参照によってここに援用する米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書）。得られるプラスミドは、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下で発現されるＰ．スティワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）遺伝子クラスターを含有した。
【００６８】
「ｐＤＣＱ３２９」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＸＹＩＢカロテノイド遺伝子クラスターをｐＢＨＲ１（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）中にクローンして構築された。
【００６９】
「ｐＤＣＱ３３０」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢカロテノイド遺伝子クラスターを広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１中にクローンして構築された。
【００７０】
「ｐＣＤＱ３３５」という用語は、ｐＤＣＱ３３０からのβ−カロテン合成遺伝子クラスターおよびアグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｃｒｔＺＷ遺伝子を含んでなるプラスミドを指す。プラスミドｐＤＣＱ３３５は、ｃｒｔＺＷＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子をクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下にあるオペロン中に含有する。得られるプラスミドを適切な異種の宿主中に形質転換すると、アスタキサンチンが生成できる（図１）。
【００７１】
「ｐＤＣＱ３３５ＴＡ」という用語は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ発現ベクター中にクローンされたアグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｃｒｔＷＺ遺伝子を含んでなるプラスミドを指す（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）））。
【００７２】
「ｐＤＣＱ３４０」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１中にクローンされた腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子を含有する。
【００７３】
「ｐＤＣＱ３４１ＴＡ」という用語は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされたスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドを指す（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。
【００７４】
「ｐＤＣＱ３４２ＴＡ」という用語は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされたブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドを指す（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。
【００７５】
「ｐＤＣＱ３３９ＴＡ」という用語は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクロ
ーンされたフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２ＣからのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドを指す（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。
【００７６】
化合物について言及される「イソプレノイド」または「テルペノイド」という用語は、カロテノイドおよびキサントフィルなどの炭素１０個のテルペノイドおよびそれらの誘導体をはじめとする、イソプレノイド経路から誘導されるあらゆる分子である。
【００７７】
「カロテノイド」という用語は、炭素５個のイソプレン単位から縮合したポリエン主鎖から構成される化合物を指す、「カロテノイド」は、非環状であることができ、または１個（単環式）または２個（二環式）の環状末端基で終結することができる。「カロテノイド」という用語は、カロテンおよびキサントフィルの双方を含んでも良い。「カロテン」とは、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド官能基の形態で、あるいはグリコシド、グリコシドエステル、またはスルフェート内に１つ以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、まとめて「キサントフィル」として知られている。本発明で特に適切なカロテノイドは単環式および二環式カロテノイドである。
【００７８】
「カロテノイド生合成経路」という用語は、上流イソプレノイド経路、および／または下流カロテノイド生合成経路の構成要素を構成する遺伝子を指す。
【００７９】
「上流イソプレノイド経路」および「上流経路」という用語は区別なく使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への転換に関与する酵素を指す。これらの酵素をコードする遺伝子としては、「ｄｘｓ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする）、「ｄｘｒ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする、ｉｓｐＣとしても知られている）、「ｉｓｐＤ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジル転移酵素をコードする、ｙｇｂＰとしても知られている）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼをコードする、ｙｃｈＢとしても知られている）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードする、ｙｇｂＢとしても知られている）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰシンターゼをコードする、ｉｓｐＦとしても知られている）、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与する「ｌｙｔＢ」遺伝子（ｉｓｐＨとしても知られている）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の合成に関与する「ｇｃｐＥ」遺伝子（ｉｓｐＧとしても知られている）、「ｉｄｉ」遺伝子（ＩＰＰからジメチルアリルピロリン酸への分子内転換に関与する）、およびイソプレノイド経路中の「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニル転移酵素またはファルネシル二リン酸シンターゼをコードする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
用語「下流カロテノイド生合成経路」および「下流経路」は区別なく使用され、ＦＰＰを一連のカロテノイドに転換する酵素を指す。これらとしては（合成がＣ_３０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）ジアポフィトエン、または（合成がＣ_４０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）フィトエンのいずれかの合成に関与する、遺伝子および遺伝子産物が挙げられる。様々なＣ_３０〜Ｃ_４０カロテノイド生成をもたらす全ての引き続く反応は、下流カロテノイド生合成経路に含まれる。これらの遺伝子および遺伝子産物には、ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＲ、ｃｒｔＡ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＦ、およびｃｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない「ｃｒｔ」遺伝子の全てが含まれる。最後に「下流カロテノイド生合成酵素」という用語は、ＣｒｔＭ、ＣｒｔＮ、ＣｒｔＮ２、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、Ｃｒｔ
Ｙ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＲ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、およびＣｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない、下流経路中の酵素の全部または一部を指す包括的用語である。
【００８１】
「Ｃ_３０ジアポカロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合する６個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_３０カロテノイドは、（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせによって、接合二重結合の長い中央鎖を有する非環状Ｃ_３０Ｈ_４２構造から形式的に誘導されても良い。
【００８２】
「テトラテルペン」または「Ｃ_４０カロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合した８個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_４０カロテノイドは、非環状Ｃ_４０Ｈ_５６構造から形式的に誘導されても良い。Ｃ_４０カロテノイドの制限を意図しない例としては、フィトエン、リコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびカンタキサンチンが挙げられる。
【００８３】
「ＣｒｔＥ」という用語は、ｃｒｔＥ遺伝子によってコードされ、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸をピロリン酸とラニルゲラニル二リン酸に転換する、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを指す。
【００８４】
「Ｉｄｉ」という用語は、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．３．２）を指す。
【００８５】
「ＣｒｔＹ」という用語は、ｃｒｔＹ遺伝子によってコードされ、リコペンをβ−カロテンに転換するリコペン環化酵素を指す。
【００８６】
「ＣｒｔＩ」という用語は、ｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエン不飽和化酵素を指す。ＣｒｔＩは４個の二重結合の導入により、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンの中間物を通じて、フィトエンをリコペンに転換する。
【００８７】
「ＣｒｔＢ」という用語は、プレフィトエン二リン酸からフィトエンへの反応を触媒するｃｒｔＢ遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼを指す。
【００８８】
「ＣｒｔＺ」という用語は、β−カロテンからゼアキサンチンへの水酸化反応を触媒するｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる、β−カロテン水酸化酵素を指す。
【００８９】
「ＣｒｔＷ」という用語は、環状カロテノイドのイオノン環上にケト基が導入される酸化反応を触媒するｃｒｔＷ遺伝子によってコードされる、β−カロテンケトラーゼ酵素を指す。ＣｒｔＷケトラーゼは、典型的に基質融通性を示すことが知られている。「カロテノイドケトラーゼ」または「ケトラーゼ」という用語は、ケト基を環状カロテノイドのイオノン環に付加できる酵素群を指す。
【００９０】
「ＣｒｔＸ」という用語は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに転換し、ｃｒｔＸ遺伝子によってコードされるゼアキサンチングルコシル転移酵素を指す。
【００９１】
「ケト基」または「ケトン基」という用語は区別なく使用されて、その中でカルボニル
基が２つの炭素原子に結合する群を指す：Ｒ_２Ｃ＝Ｏ（どちらがもＲがＨでなくてもよい）。
【００９２】
「ケトカロテノイド」という用語は、環状カロテノイドのイオノン環上に少なくとも１つのケト基有するカロテノイドを指す。ケトカロテノイドの例としては、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９３】
ここでの用法では、「実質的に類似した」とは、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の官能特性に影響しない核酸断片を指す。「実質的に類似した」とは、１個またはそれ以上ヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術によって、遺伝子発現の変更を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片も指す。「実質的に類似した」とは、得られる転写物の官能特性実質的に影響しない、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって本発明は特定の例示的な配列以上のものを包含するものと理解される。
【００９４】
例えば特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生産をもたらすが、コードされるタンパクの機能特性に影響しない遺伝子の変化が一般的であることは、技術分野で周知である。本発明の目的では、置換は以下の５つの群中の１つの交換として定義される。
１．小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、３．極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００９５】
したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンは、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）または疎水性がより高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されても良い。同様に、１つの負に帯電した残基を別のものにする（グルタミン酸からアスパラギン酸など）、または１つの正に帯電した残基を別のものにする（アルギニンからリジンになど）置換をもたらす変化も機能的に等しい生成物を生じることが期待できる。
【００９６】
多くの場合、タンパク分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もタンパク活性を変更させるとは考えられない。
【００９７】
それぞれの提案される変更は、十分に技術分野のルーチン技術の範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性保持の判定も同様である。さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した配列が、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、ここで例証する配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。一実施態様では、本発明の実質的に類似した核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％同一の核酸断片である。さらに別の実施態様では、実質的に類似した核酸断片は、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも約９０％同一である。なおさらに別の実施態様では、実質的に類似した核酸断片は、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも約９５％同一である。
【００９８】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の
核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１９８９）（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的配列などの中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして機能性酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。一実施態様では、ストリンジェンシー条件は、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで約１５分間に始まり、次に約４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで約３０分間を反復し、次に約５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを約３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。別の実施態様では、ストリンジェンシー条件はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を約６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。さらに別の実施態様では、高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、約６５℃での０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））ら、前述１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。別の実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、さらに別の実施態様では少なくともヌクレオチド約２０個、そしてさらにまた別の実施態様では長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【００９９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、約２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定
の核酸断片を得るために、塩基約１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、１つまたはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に知られている目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【０１００】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的である単離された核酸断片も含む。
【０１０１】
技術分野で既知の「パーセント同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）、「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）、「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（フォン・ハインェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）で述べられたものをはじめとするがこれに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。一実施態様では、同一性を判定するために使用される方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合およびパーセント同一性の計算は、ウィスコンシンマディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施しても良い。Ｃｌｕｓｔａｌ整合法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９））を使用して、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の整合を実施できる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ
ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【０１０２】
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、少なくとも約７５％同一のポリペプチドをコードする。一実施態様では、適切な核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一である。さらに別の実施態様では、核酸断片は、ここで報告
するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。さらにまた別の実施態様では、核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。なおさらに別の実施態様では、適切な核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列をコードする。本発明の適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも約２４０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０３】
本発明では、「多岐にわたる遺伝子」、「多岐にわたるケトラーゼ」、および「多岐にわたる配列」という用語は区別なく使用されて、ＣｒｔＷケトラーゼ間の核酸断片配列の同一性の欠如を指す。２つ以上のｃｒｔＷ遺伝子間のヌクレオチド配列比較によって、配列同一性の相対程度についての関連性の分類が可能になる。高度に相同的な遺伝子の同時発現は、遺伝的不安定性をもたらす（すなわち相同的遺伝子組換え率が増大する）傾向がある。中程度にまたは高度に多岐にわたる遺伝子の発現は、遺伝的安定性をもたらす可能性が高い。ここでの用法では「遺伝的安定性」または「遺伝的に安定した」は、本カロテノイドケトラーゼ遺伝子と核酸配列同一性が７５％未満、好ましくは核酸配列同一性が６５％未満のコード配列を有する複数のカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現について述べるために使用される。これは遺伝的に安定した形質転換体中でケトカロテノイド生成を増大させるために、２個以上のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を染色体性に組み込む場合に、特に重要である。一実施態様では、同時発現のために有用なｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が７５％未満のものである。別の実施態様では、同時発現のために使用されるｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約６５％未満のものである。さらに別の実施態様では、同時発現のために使用されるｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約５５％未満のものである。なおさらに別の実施態様では、同時発現のために使用されるｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約４５％未満のものである。
【０１０４】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード中の性質を指す。したがって本発明は、配列番号２、４、および６で示される本微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【０１０５】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成しても良い。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが生体外で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好まれるコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１０６】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびその後ろの調節配列（３’非コード配列）を含めた特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。「
天然遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される調節配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された調節配列およびコード配列を含んでなっても良い。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、通常では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【０１０７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでも良い。
【０１０８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構築プロモーター」と称される。ほとんどの場合、調節配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
【０１０９】
「３’非翻訳配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（通常では真核細胞に限られる）およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加（通常では真核細胞に限られる）に影響することで特徴づけられる。
【０１１０】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５０，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【０１１１】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結できる。
【０１１２】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。
【０１１３】
「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物ゲノム中への核酸断片の転移を指す。ここでの用法では宿主細胞ゲノムは、宿主細胞内の染色体または染色体外（すなわちベクター）遺伝子の双方を含む。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１１４】
「接合」とは、１つの細菌細胞（すなわち「供与体」）から別の（すなわち「受容体」）細菌細胞への一方向性のＤＮＡ転位（例えば細菌プラスミドからの）が起きる、特定のタイプの形質転換を意味する。プロセスは直接的な細胞と細胞の接触を伴う。
【０１１５】
「炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることができる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。用語「Ｃ_１炭素基質」は、炭素−炭素結合を欠くあらゆる炭素含有分子を指す。制限を意図しない例は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルマート、メチル化アミン（例えばモノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、および二酸化炭素である。一実施態様では、Ｃ_１炭素基質はメタノールおよび／またはメタンである。
【０１１６】
「Ｃ_１代謝個体」という用語は、その唯一のエネルギーおよび生物量源として、単一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ_１代謝個体は、典型的にメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。「Ｃ_１代謝性細菌」という用語は、それらの唯一のエネルギーおよび生物量源として単一炭素基質を使用する能力を有する細菌を指す。Ｃ_１代謝個体のサブセットであるＣ_１代謝性細菌は、典型的にメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。一実施態様では、Ｃ_１代謝個体はメチトローフであり、単一炭素基質はメタンおよび／またはメタノールよりなる群から選択される。別の実施態様では、Ｃ_１代謝個体はメタノトローフであり、単一炭素基質はメタンおよび／またはメタノールよりなる群から選択される。
【０１１７】
「メチロトローフ」という用語は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できる生物を意味する。メチロトローフがＣＨ_４を酸化できる場合、メチロトローフはメタノトローフでもある。
【０１１８】
「メタノトローフ」または「メタノトローフ細菌」という用語は、その主要な炭素およびエネルギー源として、メタンを利用できる原核生物を意味する。メタンから二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解経路によって起きる。本発明で有用な典型的なメタノトローフの例としては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびメチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられる（が、これに限定されるものではない）。
【０１１９】
「高生育メタノトローフ細菌株」という用語は、メタンおよび／またはメタノールを唯一の炭素およびエネルギー源として生育でき、機能的エムデンマイヤーホフ炭素流束経路を有して、高い生育速度と、代謝されるＣ_１基質のグラム当たりの高細胞量生成量とが得られる細菌を指す（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）。ここで述べられる特定の「高生育メタノトローフ細菌株」は、「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」、「１６ａ」または「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ」と称され、それらの用語は区別なく使用されて、本発明で使用されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株を指す。
【０１２０】
「ＣｒｔＮ１」という用語は、ｃｒｔＮ１遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ２およびａｌｄを含んでなるオペロン内に位置する。
【０１２１】
「ＡＬＤ」という用語は、ａｌｄ遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ１およびｃｒｔＮ２を含んでなるオペロン内に位置する。
【０１２２】
「ＣｒｔＮ２」という用語は、ｃｒｔＮ２遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ１およびａｌｄを含んでなるオペロン内に位置する。
【０１２３】
「ＣｒｔＮ３」という用語は、ｃｒｔＮ３遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成において活性である酵素を指す。この遺伝子はｃｒｔ遺伝子クラスター内に位置せず、代わりにこの遺伝子はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムの異なる位置に存在する。
【０１２４】
「ｃｒｔＮ１遺伝子クラスター」、「Ｃ_３０ｃｒｔ遺伝子クラスター」、「ｃｒｔ遺伝子クラスター」、および「内在性メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔ遺伝子クラスター」という用語は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路内で活性であるｃｒｔＮ１、ａｌｄ、およびｃｒｔＮ２遺伝子を含んでなるオペロンを指す。
【０１２５】
「ＭＷＭ１２００（Δｃｒｔクラスタープロモーター＋ΔｃｒｔＮ３）」という用語は、その中でＣ_３０ｃｒｔクラスタープロモーターおよびｃｒｔＮ３遺伝子が中断されているメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの変異体を指す。天然Ｃ_３０カロテノイド生合成経路の中断は、Ｃ_４０カロテノイド生成を操作するための適切な背景をもたらす。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＭＷＭ１２００株が以前作り出されており、適切なカロテノイド生成宿主である（米国特許出願第６０／５２７０８３号明細書、参照によってここに援用する）。「無着色」または「白色変異体」という用語は、その中で天然ピンク顔料（例えばＣ_３０カロテノイド）が生成されないメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ細菌を指す。したがって細菌細胞は、色がピンクとは対照的に白色であるように見える。
【０１２６】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、多くは細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を保有して、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、その中でいくつかのヌクレオチド配列がユニークな構造に結合または組換えられた、あらゆる供給源から誘導される直線または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡであってもよい。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主におけるその遺伝子の増強された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１２７】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＧＣＧパッケージプログラム（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ））バージョン９．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、およびウィスコンシン州５３７１５マディソン、サウスパーク通り１２２８のＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８
Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、およびスミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［国際シンポジウム議事録］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、（製造業者によって設定されるような）あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【０１２８】
本発明は、カロテノイドケトラーゼをコードする新たに発見されたｃｒｔＷ遺伝子を提供する。本ＣｒｔＷケトラーゼは、環状カロテノイド化合物からのケトカロテノイド生成のために、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および／または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用してもよい。
【０１２９】
スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８
ｃｒｔＷヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公開データベースとの比較からは、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アライメントアルゴリズムを使用して、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸２４９個の長さにわたり約５７％同一であることが明らかにされた（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍ Ｒｅｓ．、［国際シンポジウム議事録］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【０１３０】
ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ ｃｒｔＷヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公開データベースとの比較からは、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アライメントアルゴリズムを使用して、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸２６０個の長さにわたり約６３％同一であることが明らかにされた。
【０１３１】
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ ｃｒｔＷヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と、公開データベースとの比較からは、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アライメントアルゴリズムを使用して
、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸２５６個の長さにわたり約４７％同一であることが明らかにされた。
【０１３２】
一実施態様では、本発明は、ここでの配列と少なくとも約７５％〜８５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％〜約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。さらに別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。さらにまた別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。
【０１３３】
同様に、適切な核酸断片は、ここで報告される核酸配列と少なくとも約８０％同一である、対応する活性ＣｒｔＷケトラーゼをコードする核酸配列を含んでなるものである。一実施態様では、適切なｃｒｔＷ核酸断片は、ここでの核酸配列と少なくとも約９０％同一の核酸配列を有するものである。別の実施態様では、適切なｃｒｔＷ核酸断片は、ここでの核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を有するものである。さらに別の実施態様では、適切なｃｒｔＷ核酸断片は、ここで報告される核酸配列と少なくとも約９９％同一の核酸配列を有するものである。
【０１３４】
相同体の単離
本発明の核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離しても良い。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。核酸ハイブリダイゼーション法、および様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボール（Ｔａｂｏｒ）Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２（１９９２））。
【０１３５】
例えば、本発明のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に良く知られている方法を使用して、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の細菌からのライブラリーをスクリーニングして直接単離できる。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインして合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））。さらに利用できる生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、末端標識技術またはＲＮＡプローブなどの当業者に知られている方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切な厳密さ条件下で完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１３６】
典型的にＰＣＲタイプ増幅技術ではプライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、技術分野で周知である（「ヒト遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、からテイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）
著、「遺伝病における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、（１９８６）、３３〜５０ページ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）；リュクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．「分子生物学的方法：ＰＣＲプロトコル：現行の方法と応用（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」第１５巻、３１〜３９ページ、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編（１９９３）、Ｈｕｍａｎｉａ Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１３７】
概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応は、１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、別のプライマーの配列が真核生物遺伝子のｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸のトラクトの存在を利用する、クローン化された核酸断片のライブラリーにおいて実施しても良い。ポリアデニル化ｍＲＮＡを欠く微生物遺伝子の場合、ランダムプライマーを使用してもよい。ランダムプライマーはまた、ＤＮＡからの増幅にも有用かもしれない。
【０１３８】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローン化ベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
【０１３９】
代案としては、相同体の同定のために、ハイブリダイゼーション形成試薬として本配列を用いても良い。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的である必要がある。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１４０】
ハイブリダイゼーション法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化さ
せる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感応性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ
Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１４１】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％、好ましくは３０％容積の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ範囲約６〜９）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％の界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識のキャリア核酸、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなどの断片化核ＤＮＡ、および場合により約０．５〜２％重量／容積のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールなどの多様な極性水溶性剤または膨潤剤をはじめとする容積排除剤、例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性糖ポリマーなどその他の添加剤を含めても良い。
【０１４２】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補的な固定核酸プローブを有する。
【０１４３】
本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本アミノ酸配列の一部を代表する合成ペプチドを合成しても良い。これらのペプチドを用して、動物を免疫し、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成できる。次にこれらの抗体を使用して、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長ＤＮＡクローンを単離する（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。
【０１４４】
カロテノイド生成に関与する遺伝子
カロテノイドの生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への転換を提供する上流イソプレノイド経路、およびフィトエンの合成と、全ての引き続いて生成されるカロテノイドを提供する下流カロテノイド生合成経路の２つの部分に都合良く分けることができる。上流経路は多くの非カロテノイド産生性微生物に遍在性であり、これらの場合、所望のカロテノイド生合成のための下流経路を含んでなる遺伝子を導入することだけが必要である。２つの経路間の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸塩の合成に関わる。ＦＰＰが天然に存在する場合、下流カロテノイド経路の要素のみが必要である。しかしカロテノイド生成において下流経路カロテノイド遺伝子が効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベ
ルのＦＰＰを有することが必要なことが理解される。別の実施態様では、イソプレノイド生合成遺伝子を任意にアップレギュレートされて、利用できるカロテノイド生合成のＦＰＰのレベルが増大されてもよい。ＦＰＰ合成が宿主細胞によって提供されない場合、ＦＰＰの生成に必要な遺伝子を導入することが必要である。これらの各経路について下で詳細に述べる。
【０１４５】
上流イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、一般的なＣ_５イソプレンサブユニットであるイソペンテニルピロリン酸塩（ＩＰＰ）を生じる２つの経路のどちらかを通じて起きる。最初に良く知られている酢酸／メバロン酸経路を通じてＩＰＰを合成しても良い。しかし最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物で作動しているわけではないことを実証している。ＩＰＰ生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されている（ホルバック（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５〜１４０（１９９３）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７〜５２４（１９９３）；シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３〜８０（１９９６）；およびアイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１〜６４３６（１９９６））。
【０１４６】
メバロン酸非依存イソプレノイド経路中の多くのステップが知られている。例えばＩＰＰの生成をもたらす代案の経路の最初のステップは、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７〜５４４（１９９８））によって結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において研究されている。経路の第１のステップは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られている五炭素化合物を生じる、２つの三炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の縮合を伴う。この反応はｄｘｓ遺伝子によってコードされるＤＸＳ酵素によって起きる。次にＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元から、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸が生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒによってコードされるＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）（ｉｓｐＣとしても知られている）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸を引き続いて、注釈なしの遺伝子ｙｇｂＰでコードされる酵素によって、ＣＴＰ−依存反応において４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに転換する。しかし最近ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｑ４６８９３）。
【０１４７】
次にｙｃｈＢ遺伝子によってコードされる酵素によって、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの第２位のヒドロキシ基をＡＴＰ−依存反応においてリン酸化できる。ＹｃｈＢは４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをリン酸化して、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸が得られる。ｙｃｈＢ遺伝子もまたｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ２４２０９）。ＹｃｈＢはＣＴＰ−依存様式で、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸に転換する。この遺伝子もまた最近ｉｓｐＦ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ３６６６３）と改名されている。
【０１４８】
ｇｃｐＥ（ｉｓｐＧとしても知られている）およびｌｙｔＢ（ｉｓｐＨとしても知られている）（およびおそらくはその他の）遺伝子によってコードされる酵素はイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成をもたらす反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるＩＰＰイソメラーゼを通じてＤＭＡＰＰに異性化しても良い。しかしこの酵素は生存には必須では
なく、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用するいくつかの細菌では不在でも良い。最近の証拠はＭＥＰ経路がＩＰＰの前に分岐して、ｌｙｔＢ遺伝子産物を通じてＩＰＰとＤＭＡＰＰを別個に生成することを示唆する。ｌｙｔＢノックアウト変異は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの双方を補った培地中以外では、大腸菌に対して致死性である。
【０１４９】
ＦＰＰの合成は、ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸への異性化を通じて起きる。この反応に、ｉｓｐＡによって触媒される２つのプレニル転移酵素反応手順が続き、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ、炭素数１０の分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、炭素数１５の分子）の生成をもたらす。
【０１５０】
上流経路の要素をコードする遺伝子は、表１に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。
【０１５１】
【表２】

【０１５２】
【表３】

【０１５３】
【表４】

【０１５４】
【表５】

【０１５５】
下流カロテノイド生合成経路
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、いくぶん主観的である。ＦＰＰ合成はカロテン産生性および非カロテン産生性細菌の双方において一般的であるので、下流カロテノイド生合成経路中の第１のステップは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に転換する、プレニル転移酵素反応によって開始すると考えられる。ＧＧＰＰ合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥは、ＩＰＰをＦＰＰに付加して炭素数２０の分子であるＧＧＰＰを生成するこのプレニル転移酵素反応に関与する。２つのＧＧＰＰ分子の縮合反応が起きて、下流カロテノイド生合成経路における第１の炭素数４０の分子であるフィトエン（ＰＰＰＰ）が形成する。この酵素的反応は、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢによって触媒される。
【０１５６】
「赤」色のスペクトルを与えるリコペンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）によって触媒される８個の水素原子の除去によって、４回の逐次脱水素化反応を通じてフィトエンから生成する。この反応の中間体は、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンである。
【０１５７】
リコペン環化酵素（ｃｒｔＹ）リコペンをβ−カロテンに転換する。本発明では、遺伝的最終生成物としてβ−カロテンを生成するレポータープラスミドが使用される。しかし追加的遺伝子を使用して、多様なその他のカロテノイドを作り出してもよい。例えばβ−カロテンは、β−カロテン水酸化酵素（ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる）の活性がもたらす水酸化反応を通じて、ゼアキサンチンに転換される。β−クリプトキサンチンはこの反応の中間体である。
【０１５８】
β−カロテンは、ｃｒｔＷまたはｃｒｔＯ遺伝子のどちらかによってコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、カンタキサンチンに転換される。エキネノンはこの反応の中間体である。次にカンタキサンチンは、ｃｒｔＺまたはｃｒｔＲ遺伝子によってコードされるβ−カロテン水酸化酵素によってアスタキサンチンに転換できる。アドンビルブリンはこの反応の中間体である。
【０１５９】
ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに転換できる。この反応はゼアキサンチングルコシル転移酵素（ｃｒｔＸ）によって触媒される。
【０１６０】
下流カロテノイド生合成経路の要素をコードする遺伝子は、表２に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。
【０１６１】
【表６】

【０１６２】
【表７】

【０１６３】
【表８】

【０１６４】
【表９】

【０１６５】
【表１０】

【０１６６】
好ましい非ｃｒｔＷカロテノイド遺伝子供給源は、パントエア・スティワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ８１９９；国際公開第０２／０７９３９５号パンフレット）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）ＤＣ２６０（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）、およびパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書）である。好ましいｃｒｔＷ遺伝子供給源は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８（配列番号１）、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３（配列番号３）、およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ（配列番号５）である。
【０１６７】
宿主生物中で十分なＦＰＰ源が利用できれば、本発明の方法を使用して、表２に示す遺伝子と、本発明の好ましいｃｒｔＷ遺伝子との様々な組み合わせを使用することで、多数の異なるカロテノイドおよびカロテノイド誘導体を作ることができる。例えば遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢは、β−カロテンの生成を可能にする。ｃｒｔＥＸＹＩＢへのｃｒｔＷ遺伝子の添加は、カンタキサンチンの生成を可能にする。
【０１６８】
本発明の有用な生成物は、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、ケト−γ−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、およびＣ_３０−ケトカロテノイドをはじめとするが、これに限定されるものではない、ここで定義されるようなあらゆるケトカロテノイド化合物を含むことが想定された。
【０１６９】
組換え発現−微生物
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種の宿主細胞中、特に微生物宿主の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物宿主中での発現は、様々な経路中間体の発現のため、宿主中に既存の経路の調節のため、またはこれまで宿主を使用して可能でなかった新しい生成の合成のために有用かもしれない。
【０１７０】
本遺伝子および核酸断片の発現のために好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、ｐＨ価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。例えばあらゆる細菌、酵母菌、および糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主であることが考察された。転写、翻訳およびタンパク質生合成器官は、それぞれの細胞供給原料に関係なく同一であるので、細胞バイオマスを生成するのに使用される炭素供給材料
に関係なく、機能性遺伝子が発現される。大規模微生物生育させるおよび機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用しても良い。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育させる条件によって、制御され、阻止され、または抑圧されても良い。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されても良い。生育させる速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であっても良い。宿主株の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの細菌、真菌または酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施態様では、適切な細菌宿主株として、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。
【０１７１】
外来性タンパクの高レベル発現を導く調節配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者には周知である。本ケトラーゼの発現のために、これらのいずれでも使用してキメラ遺伝子を構築できる。次に形質転換を通じて、これらキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１７２】
したがって適切なプロモーター制御下にある本細菌酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、増大または改変された環状ケトカロテノイド生成を実証することが期待される。本遺伝子を天然宿主細胞、ならびに異種の宿主の双方において発現することが有用であることが考察された。本ｃｒｔＷ遺伝子の天然宿主中への導入は、既存のケトカロテノイドの改変されたレベルの生成をもたらす。さらに本遺伝子はまた、既存のカロテノイド経路が操作されていてもよい非天然宿主細菌中に導入しても良い。
【０１７３】
本発明によって生成される具体的なケトカロテノイドとしては、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−γ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチ
ン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、およびミキソバクトンが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に関心が高いのは、その合成が図１で示されるアスタキサンチンおよびカンタキサンチンの生成である。本ＣｒｔＷ酵素のための特異的基質は、環状カロテノイドである。環状カロテノイドは技術分野でよく知られており、市販されている。本発明で好ましいのは、β−カロテン、γ−カロテン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、ルビキサンチン、エキネノン、およびトルレンをはじめとするが、これに限定されるものではないＣｒｔＷケトラーゼ基質である。
【０１７４】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。
【０１７５】
所望の宿主細胞において本ＯＲＦの発現を駆動させるのに有用なイニシエーション調節領域、またはプロモーターは多数有り、当業者には良く知られている。実質的にこれらの遺伝子を駆動できる、以下をはじめとするが、これに限定されるものではないあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰ_Ｌ、ｌＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびに例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、および様々なファージプロモーター、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）（米国特許出願第１０／６８９２００号明細書）における発現に有用な、ｎｒｔＡ、ｇｌｎＢ、ｍｏｘＦ、ｇｌｙｏｘＩＩ、ｈｔｐＧ、およびｈｐｓ遺伝子から単離されたプロモーター。さらにクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターなどのプロモーターもまた、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中での発現において有用かもしれない。
【０１７６】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。場合により、終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１７７】
本遺伝子の配列の知識は、このような経路を有するあらゆる生物中で、特にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａおよび大腸菌中でカロテノイド生合成経路を操作する上で有用である。遺伝的経路を操作する方法は一般的であり、技術分野でよく知られている。特定の経路中で選択された遺伝子は、種々の方法によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされてもよい。さらに競合経路生物は、遺伝子中断および類似した技術によって除外または昇華してもよい。
【０１７８】
ひとたび重要な遺伝的経路が同定および配列決定されると、特定の遺伝子をアップレギュレートして経路の産出量を増大できる。例えばｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上で、標的遺伝子の追加的コピーを宿主細胞に導入しても良い。代案としては、非天然プロモーターの調節の下におかれるように標的遺伝子を変性しても良い。経路が、細胞サイクル中または発酵生産中の特定点で作動することが所望される場合、制御されたまたは誘導性プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置き換えても良い。
同様に場合によっては、天然または内在性プロモーターを変性させて、遺伝子発現を増大させても良い。例えば内在性プロモーターは、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）突然変異、欠失、および／または置換によって変性できる（クミーク（Ｋｍｉｅｃ）の米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）らのＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号明細書を参照されたい）。
【０１７９】
代案としては、標的経路、またはエネルギーまたは炭素の競合シンクとして役割を果たすかもしれない競合経路における特定の遺伝子の発現を低下させるまたは除外することが必要かもしれない。この目的で遺伝子をダウンレギュレートする方法が探求された。中断する遺伝子配列が知られている場合、遺伝子ダウンレギュレートの最も効果的な方法の１つは、外来性ＤＮＡを構造的な遺伝子に挿入して転写を中断する、標的を定めた遺伝子中断である。これは、中断する遺伝子の一部に対して高度な相同性を有する配列で両脇を挟まれた、挿入するＤＮＡ（遺伝子マーカーであることが多い）を含んでなる遺伝子カセットの製造によってもたらされる。カセットの宿主細胞への導入は、細胞の天然ＤＮＡ複製機序を通じた、構造的遺伝子への外来性ＤＮＡの挿入をもたらす。（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
【０１８０】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子をダウンレギュレートする別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化して、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関わることを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者に知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１８１】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子をダウンレギュレートする効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしても良い。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、ＨＮＯ_２およびＮＨ_２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響する化学物質、ならびにフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響する薬剤が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野で良く文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７（１９９２）を参照されたい。
【０１８２】
別の非特異的遺伝子中断方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素
と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されても良いので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される（例えばニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１因子に基づく、プライマー・アイランド転位キット（Ｐｒｉｍｅｒ Ｉｓｌａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、マサチューセッツ州のニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、およびウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移因子に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。）
【０１８３】
微生物宿主としてのメチロトローフおよびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ
組換え微生物源からいくつかのカロテノイドが生成されている［例えばリコペン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）Ｗ．Ｒ．およびＪ．Ｃ．リヤオ（Ｌｉａｏ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：５７〜６１（２００１）；ワング（Ｗａｎｇ）Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１６：９２２〜９２６（２０００）；ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）Ｎ．およびＨ．シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９〜１８１（１９９８）；シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６７６〜２６８０（１９９８））；β−カロテン生成のための大腸菌、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１：７９１〜７９５（１９９９）；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６〜１２２９（１９９８）；米国特許第５，６９１，１９０号明細書）；ゼアキサンチン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）Ｍ．ら、前出；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｙ．ら、前出）；アスタキサンチン生成のための大腸菌およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（米国特許第５，４６６，５９９号明細書、米国特許第６，０１５，６８４号明細書、米国特許第５，１８２，２０８号明細書、米国特許第５，９７２，６４２号明細書；米国特許第５，６５６，４７２号明細書、米国特許第５，５４５，８１６号明細書、米国特許第５，５３０，１８９号明細書、米国特許第５，５３０，１８８号明細書、米国特許第５，４２９，９３９、および米国特許第６，１２４，１１３号明細書もまた参照されたい）］が、異なるｃｒｔ遺伝子の様々な組み合わせを使用したこれらのカロテノイド生成法には、低い収率と比較的高価な供給材料への依存という欠点がある。したがって微生物宿主中で安価な供給材料から、高収率のカロテノイドを製造する方法を同定することが望ましい。
【０１８４】
単一エネルギー源として単一炭素基質を利用する、いくつかの微生物がある。このような微生物はここで「Ｃ１代謝個体」と称される。これらの生物は、単一エネルギーおよびバイオマス源として炭素−炭素結合が欠如している炭素基質を使用する能力によって特徴付けられる。これらの炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルメート、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、二酸化炭素、およびその他の様々なあらゆる炭素−炭素結合が欠如し
ている還元炭素化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施態様では、単一炭素基質はメタンおよびメタノールよりなる群から選択される。全てのＣ１代謝性微生物は、概してメチロトローフとして分類される。メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できるあらゆる生物として定義されても良い。しかし通性メチロトローフ、絶対メチロトローフ、絶対メタノトローフは、全てメチロトローフの様々なサブセットである。具体的には次のようである。
・通性メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーおよびバイオマスのために、糖および複合炭水化物などのその他の炭素基質を使用しても良い。通性メチロトローフ細菌は多くの環境中に見られるが、最も一般には土壌、ごみ埋め立て、および廃棄物処理場から単離される。多くの通性メチロトローフは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβおよびγ亜群のメンバーである（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［国際シンポジウム］第７回（１９９３）、ｐ２８５〜３０２、マレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）およびドンＰ．ケリー（ＤｏｎＰ．Ｋｅｌｌｙ）編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ：Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ；マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、ブロックの微生物生物学（Ｂｒｏｃｋ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、第８版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ：Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ、ＮＪ（１９９７））。
・絶対メチロトローフは、エネルギー生成が、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物の使用に限定された生物である。
・絶対メタノトローフは、メタンを酸化する特徴的能力を有する絶対メチロトローフである。
【０１８５】
さらに単一炭素基質を利用する能力は細菌に限定されず、酵母菌および真菌にも及ぶ。いくつかの酵母菌属は、エネルギー源としてより複雑な材料に加えて単一炭素基質を使用できる（すなわちメチロトローフ酵母菌）。
【０１８６】
数多くのこれらのメチロトローフ生物が知られているが、これらの微生物のわずかなものだけが材料合成のための工業プロセスにおいて成功裏に利用されている。そして単一炭素基質は対費用効果の高いエネルギー源であるが、これらの微生物の遺伝子操作における困難さ、ならびにそれらの遺伝的機構に関する情報不足が、主に天然生成物合成のためのそれらの使用を制限している。
【０１８７】
これらの困難さにもかかわらず、多くのメタノトローフはこれらの生物が色素を合成できるようにする固有のイソプレノイド経路を含有し、様々な非内在性イソプレノイド化合物を生成するために、これらの微生物を遺伝子操作する構想の可能性を提供する。メタノトローフは単一炭素基質（すなわちメタンおよび／またははメタノール）をエネルギー源として使用できるので、これらの生物においてカロテノイドを安価に生成することが可能であろう。メタノトローフがβ−カロテン生成のために遺伝子操作される実施例の１つは、参照によってここに援用する米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書で述べられる。
【０１８８】
単一炭素基質を唯一のエネルギー源として使用できる微生物における、カロテノイド化合物生合成に関与する遺伝子発現のための方法が提供される。宿主微生物は、カロテノイドのための代謝前駆物質として、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を合成する能力を有するあらゆるＣ１代謝個体であっても良い。より具体的には、本発明で適切な通性メチロトローフ細菌としては、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａ
ｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用な具体的なメチロトローフ酵母菌としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。例示的なメタノトローフとしては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシクティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１８９】
本発明で特に興味深いのは、エネルギー的に好ましい炭素流経路を有する高生育させる絶対メタノトローフである。例えばメタノトローフの特定の株は、いくつかの経路特性を有し、それを炭素流束操作のために特に有用なものにする。この株はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ（ＡＴＣＣＰＴＡ２４０２）（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）として知られており、この特定の株およびその他の近縁メチロトローフは、Ｃ_４０カロテノイド生成に有用な本発明の遺伝子産物発現のための好ましい微生物宿主である。
【０１９０】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの最適化されたバージョンが作りされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００（米国特許出願第６０／５２７０８３号明細書）と称された。内在性Ｃ_３０カロテノイド経路がノックアウトされ（Δｃｒｔクラスタープロモーター＋ΔｃｒｔＮ３）、Ｃ_４０カロテノイド発現のための最適化されたプラットフォームが作り出された。内在性ｃｒｔクラスター（ｃｒｔＮ１−ａｌｄ−ｃｒｔＮ２クラスター）の発現に関与するプロモーターの欠失は、無着色株（天然に生成するＣ_３０カロテノイドのために通常ではピンク色の野生型株）をもたらした。この最適化された宿主内のＣ_４０カロテノイド生合成遺伝子発現は、所望のＣ_４０カロテノイドの増大する生成を可能にした。
【０１９１】
Ｃ１代謝性細菌の形質転換
Ｃ１代謝性細菌形質の転換技術は十分開発されていないが、当業者に良く知られているその他の細菌のために用いられる一般方法を応用しても良い。メチロバクテリウム・エキストロクエン（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ）Ｈ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１〜７（１９９８））、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１（キム（Ｋｉｍ）Ｃ．Ｓ．およびＴ．Ｋ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５〜１０８（１９９７））、およびメチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１２Ｓ（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２３：７８７〜７９１（２００１））の形質転換のために、電気穿孔が成功裏に使用されている。しかし当業者には良く知られているように、１つの特定のＣ１代謝性利用生物から別の生物への具体的電気穿孔パラメーターの推定は、困難かもしれない。
【０１９２】
供与細胞と受容細胞の直接接触に依存する細菌接合は、Ｃ１代謝性細菌中への遺伝子の転位のために、より容易に受け入れられることが多い。簡単に述べると、この細菌接合プロセスは、「供与」細胞と「受容」細胞を互いに密接に接触させて一緒に混合することを伴う。接合は、新たに合成された供与ＤＮＡの受容細胞中への直接転位を伴う、「供与」細菌と「受容」細菌間の細胞質連絡の形成によって起きる。技術分野で良く知られている
ように、接合の受容体は、供与細菌からの水平転位を通じてＤＮＡを受容できるあらゆる細胞として定義される。接合転位中の供与体は、接合プラスミド、接合トランスポゾン、または可動性プラスミドを含有する細菌である。供与体プラスミドの物理的転位は、下で述べられる２つの様式の１つによって起きることができる。
１．場合によっては、供与体と受容体のみが接合にとって必要とされる。これは転位されるプラスミドが接合性かつ可動性である自己伝播性のプラスミドの場合（すなわちｔｒａ−遺伝子と、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子の双方を保有する）に起きる。一般にプロセスは、１．）ｏｒｉＴ中の特定部位で二本鎖プラスミドＤＮＡにニックが入れられ、２．）細孔構造または繊毛構造を通じて、一本鎖ＤＮＡが受容体に放出され、３．）ＤＮＡリラクセース酵素が二本鎖ＤＮＡをｏｒｉＴで開裂して結合し、５’末端を放出し（中間体構造としてリラクソゾームを形成する）、そして４．）引き続いて、補助タンパク質の複合体がｏｒｉＴでアセンブルして、ＤＮＡ転位プロセスを容易にする、ことを伴う。
２．代案としては、供与体プラスミドの受容体への転位のために「三親交雑」接合が必要とされる。このタイプの接合には、供与細胞、受容細胞、および「ヘルパー」プラスミドが関与する。供与細胞は、可動性プラスミドまたは接合トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッケースをコードする遺伝子であるｏｒｉＴを含有し、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしＭｏｂタンパク質は、単独ではゲノムの転位達成するのに十分でない。したがって可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド（供与体内または「ヘルパー」細胞内に位置する）によって適切な接合システムが提供されない限り、それら自身の転位を促進できない。プラスミドは、細孔または繊毛の形成に関与する転位タンパク質（Ｔｒａ）をコードするので、接合プラスミドは噛合対の形成およびＤＮＡ転位のために必要とされる。
【０１９３】
Ｃ１代謝性細菌が関与する成功裏の接合の例としては、ストリアー（Ｓｔｏｌｙａｒ）ら（Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ６４（５）：６８６〜６９１（１９９５））；モトヤマ（Ｍｏｔｏｙａｍａ），Ｈ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２（１）：６７〜７２（１９９４））；ロイド（Ｌｌｏｙｄ），Ｊ．Ｓ．ら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １７１（６）：３６４−３７０（１９９９））；およびオドム（Ｏｄｏｍ），Ｊ．Ｍ．ら（米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書）の研究が挙げられる。
【０１９４】
工業生産
本ｃｒｔＷ遺伝子を使用した環状ケトカロテノイド化合物の商業的生産が所望される場合、多様な培養方法を応用してもよい。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現する特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチおよび連続の培養方法の双方で生産してもよい。
【０１９５】
古典的なバッチ培養法は閉鎖システムであり、そこでは培地の組成が発酵の最初に設定され、培養プロセス中の人為的変化を受けない。したがって培養プロセス開始時に培地に所望の生物または生物群を接種し、生育させるまたは代謝活動を生じさせながらシステムには何も添加しない。しかし典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。システムによっては対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。その他のシステムでは、静止または対数期後生成を得ることができる。
【０１９６】
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ培養
プロセスも本発明において適切であり、培養の進行と共に基質が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ培養法は、技術分野で一般的であり周知であって、実例はトマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業微生物学テキスト（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ．、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７、（１９９２）にある。
【０１９７】
環状ケトカロテノイドの商業生産は、連続培養によって達成しても良い。連続の培養は開放システムであり、規定の培地をバイオリアクターに連続的に添加して、等量の慣熟培地を工程から同時に除去する。連続培養は、概して細胞を恒常的な高い液相密度に維持し、そこでは細胞が主に対数増殖期にある。代案としては連続培養を固定細胞で実施しても良く、そこでは炭素および養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料から構成される広範囲の固体担体を使用して実施しても良い。
【０１９８】
連続または半連続培養は、細胞生育させるまたは最終生成物濃度に影響する１つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を固定された割合に維持し、その他の全パラメーターの調節ができるようにする。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育させるに影響するいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは定常状態生育させる条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、培養中の細胞生育させる率に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０１９９】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類と、ラクトースまたはスクロースなどの二糖類と、デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖類と、乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物とが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている、二酸化炭素、メタンおよび／またはメタノールなどの一炭素基質であっても良い。一または二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物はまた、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための多様なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［国際シンポジウム］第７回（１９９３）、４１５〜３２。編集者：マレル，Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー，ドンＰ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．）、出版社：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ：Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９（１９９０））。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含しても良く、生物の選択によってのみ制限されることが考察さ
れた。
【０２００】
植物における組換え発現
植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を製造することが知られている。本発明の核酸断片を使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有する遺伝子導入植物を作り出しても良い。好ましい植物宿主は、本タンパク質の高生成レベルを支えるいずれかの品種であることができる。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、コショウ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ
ａｎｎｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および飼料としての草が挙げられるが、これに限定されるものではない。商業的に重要な宿主としては、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）などの藻類の種が挙げられるが、これに限定されるものではない。カロテノイド化合物の生成は、最初に本発明のキメラ遺伝子を構築することによって達成されても良く、その中でコード領域は、所望の発生段階で所望の組織中の遺伝子の発現を導くプロモーターに作動可能に連結される。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなっても良い。転写終止シグナルをコードする３’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために１個もしくはそれ以上のイントロンも含んでなる。
【０２０１】
コード領域の発現を誘導できるあらゆるプロモーターとあらゆるターミネーターのあらゆる組み合わせをキメラ遺伝子配列で使用しても良い。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用しても良い効率的な植物プロモーターの１タイプは、高等植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と機能的に連結するこのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できなくてはならない。本発明で使用しても良い高等植物プロモーターとしては、例えばダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小型サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３〜４９８（１９８２））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導されることが知られている（例えば「植物の遺伝子操作、農業における展望（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、Ｐｌｅｎｕｍ：ＮＹ（１９８３）、２９〜３８ページ；コルッジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１３９９（１９８３）；およびダンスミア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、２：２８５（１９８３）参照）。
【０２０２】
次に本キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築できる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を良く知っている。当業者はまた、異な
る独立形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことを認識するので（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２１８：７８〜８６（１９８９））、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数イベントをスクリーニングしなくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって達成しても良い。
【０２０３】
用途によっては、本タンパク質を異なる細胞区画に方向付けることが有用であろう。したがってトランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ），Ｋ．、Ｃｅｌｌ ５６：２４７〜２５３（１９８９））、シグナル配列または小胞体局在化をコードする配列（クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））、または核局在化シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ），Ｎ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））などの適切な細胞内標的配列を添加することで、および／または既存の標的配列を除去することで、酵素をコードするコード配列を変更して上述のキメラ遺伝子をさらに補完しても良いことが想定された。引用した参考文献はこれらの各例を示すが、リストは網羅的でなく、有用なさらに多くの標的シグナルが、将来発見されるかもしれない。
【０２０４】
タンパク質操作
本ヌクレオチドを使用して、向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察された。誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９））、部位特異的変異誘発（クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１、１図版。編集者（ら）：（アンジェレッティ，ルース・ホーグ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ Ｈｏｇｕｅ）、出版社：Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、および「遺伝子シャフリング（ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」（参照によってここに援用する米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書、および米国特許出願第１０／３７４３６６号明細書）をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。
【０２０５】
遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発と容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、関心のある遺伝子と類似したまたは違っているＤＮＡ領域の追加的集団存在下における、関心のある遺伝子の特定サイズの断片への制限エンドヌクレアーゼ開裂を伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。
【０２０６】
本発明の本微生物の配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしても良い。配列は二本鎖であるべきで、５０ｂｐ〜１０ｋＢ範囲の様々な長さであることができる。配列は技術分野で良く知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に無作為に消化されても良い（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、同上）。本微生物の配列に加えて、微生物の配列の全部または部分とハイブリダイズ可能な断片集団を添加しても良い。同様に、本配
列とハイブリダイズ可能でない断片集団を添加しても良い。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約１０〜２０倍過剰に添加される。一般にこのプロセスに従えば、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約１００〜約１０００個になる。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。その他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されても良い。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは温度は、８０℃〜１００℃である。核酸断片を冷却によって再アニールしても良い。好ましくは温度は２０℃〜７５℃である。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速できる。適切な塩濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であっても良い。次にアニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは技術分野で知られているあらゆるその他のＤＮＡポリメラーゼであっても良い。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加しても良い。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは２〜５０回反復され、より好ましくは手順は１０〜４０回反復される。得られる核酸は約５０ｂｐ〜約１００ｋＢの範囲のより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローン化および発現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしても良い（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、同上）。
【０２０７】
さらにハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を使用した、機能性領域の融合によってアセンブルできる（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、９４：１０６９〜１０７３（１９９７））。本遺伝子の機能性領域は、その他の遺伝子の機能性領域と組み合わせて、所望の触媒機能を有する新しい酵素作り出すことができる。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用してハイブリッド酵素を構築し、当業者に良く知られている技術使用して、様々な発現ベクター中にクローン化しても良い。
【０２０８】
好ましい実施態様の説明
着色微生物は、環境サンプルから単離され、標準微生物学的技術使用して培養された（実施例１）。２つの着色コロニー（ＤＣ１８およびＤＣ２６３）を選択し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を実施した。ＤＣ１８株（配列番号４）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）に対するＢＬＡＳＴＮを使用したクエリー検索として使用した。公開データベースに対する最も近い整合は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）に対して９８％同一であった。本株をスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８と命名した。ＤＣ２６３株（配列番号５）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に対して相同性（９９％同一）を示した。単離された株をブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３と命名した。第３の着色微生物株（フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ）は、ドイツ国のＪ．Ｗ．ゲーテ大学（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｅｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲルハルト・サンドマン（Ｇｅｒｈａｒｄ Ｓａｎｄｍａｎｎ）博士から得られた。この株は、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種ＫＫ１０２０Ｃとしても知られており、日本国の海洋バイオテクノロジー研究所（ＭＢＩ）から入手できる。
【０２０９】
各株からのカロテノイドサンプルをＨＰＬＣ／ＬＣ−Ｍによって分析した。スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オンと判定された。ブレバン
ジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオンと判定された。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃ中の主要カロテノイドは、フレキシキサンチンであった。全３株中の主要カロテノイドはケトカロテノイドであり、それらが全てカロテノイドケトラーゼを有することが示唆された。
【０２１０】
ｐＥＺｓｅｑベクター（実施例２）中の小型挿入物ライブラリー（４〜６ｋｂの断片）を作るために、各株からゲノムＤＮＡを調製した。それぞれのプラスミドをβ−カロテン生成プラスミドを含む大腸菌細胞中に電気穿孔した。オレンジ色の形質転換体が単離され、それぞれのカロテノイド含量が分析された。ケトカロテノイドは、各オレンジ色形質転換体によって生成される。
【０２１１】
ｐＥＺベースのプラスミド上の挿入物をランダムトランスポゾン挿入によって、および／またはプライマー歩行によって配列決定した。挿入物の配列をアセンブルし、ジェンバンク（登録商標）に対してＢＬＡＳＴ分析した（ＢＬＡＳＴＮｎｒおよびＢＬＡＳＴＸｎｒ）。ＣｒｔＷケトラーゼをコードする遺伝子を同定した（実施例３、表３）。本ｃｒｔＷ配列およびいくつかの以前報告されたｃｒｔＷｓ（表４）を使用して、ペアワイズ比較分析を行った。本ｃｒｔＷ配列は、以前報告されたカロテノイドケトラーゼに対して中程度の相同性のみを示す。
【０２１２】
本カロテノイドケトラーゼ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ発現ベクター（実施例５）中に個別にクローンした。各ｃｒｔＷ発現ベクターをβ−カロテン蓄積大腸菌株中に形質転換した。それぞれのオレンジ形質転換体のカロテン含量をＨＰＬＣによって分析した。カンタキサンチンが単独に、それぞれの形質転換体中で生成された。
【０２１３】
いくつかのβ−カロテン発現プラスミド（ｐＤＣＱ３４０、ｐＤＣＱ３３０）を作り出し、本ｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子を発現する効果を測定した（実施例４および７）。腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）ＤＣ２６０（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）またはパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書）のいずれかから、カロテノイド遺伝子クラスターをクローンして発現プラスミドを作り出した。本ＣｒｔＷケトラーゼは、β−カロテンをカンタキサンチンに転換する能力を示す。
【０２１４】
別の実施態様では、多岐にわたるケトラーゼの同時発現を行った（実施例６）。実施例５で使用したβ−カロテン合成遺伝子（ｐＤＣＱ３３０）を発現するプラスミドを操作して、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷＺ遺伝子をさらに発現させた。得られたプラスミド（ｐＤＣＱ３３５）を使用して、アスタキサンチン／アドニキサンチン生成大腸菌株を作り出した。ＤＣ２６３（ｐＤＣＱ３４２ＴＡ）からのｃｒｔＷまたはＫ１−２０２Ｃ（ｐＤＣＱ３３９ＴＡ）からのｃｒｔＷのいずれかを発現するプラスミドをアスタキサンチン／アドニキサンチン生成株中に形質転換した。ｐＤＣＱ３３５のみを含む株と、追加的プラスミドｐＤＣＱ３４２ＴＡまたはｐＤＣＱ３３９ＴＡを含有する株との比較を行った。１つ以上の多岐にわたるケトラーゼ遺伝子を発現する株では、ケト基付加の効率が改善され、アスタキサンチンの生成が増大した。
【実施例】
【０２１５】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱する
ことなく、本発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。
【０２１６】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【０２１７】
細菌培養の維持および生育させるに適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）。細菌細胞の生育させるおよび維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのディフコ・ラボラトリーズ／ＢＤダイアグノスティックス（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、マサチューセッツ州ベヴァリーのニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））、カリフォルニア州カールズバッドのギブコ／ＢＲＬライフテクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【０２１８】
遺伝的配列操作は、ウィスコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から入手できる一式のプログラム（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０）を使用して達成した。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」では、ギャップ生成デフォルト値１２を使用して、ギャップ延長デフォルト値４を使用した。ＣＧＣ「ギャップ（Ｇａｐ）」ま
たは「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムでは、デフォルトギャップ生成ペナルティ５０を使用し、デフォルトギャップ延長ペナルティ３を使用した。スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラムを使用して、複数の整列化を作り出した（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍ Ｒｅｓ．、［国際シンポジウム議事録］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者（ら）：スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。これらのまたはあらゆるその他のプログラムにおいて、プログラムパラメーターについて言及されない場合は、デフォルト値を使用した。
【０２１９】
略語の意味は次のとおり。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味する。
【０２２０】
実施例１
細菌株生成するケトカロテノイド
この実施例は、ケトカロテノイドを生成する３つの細菌株の単離、およびそれらのカロテノイドの予備分析について述べる。
【０２２１】
株単離および分類
新しいカロテノイド生成細菌株を単離するために、環境サンプルのコレクションからから着色微生物を単離した。デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）の庭からのおよそ１ｇの表面土壌を１０ｍＬの水道水に再懸濁した。１０μＬのループを満たす水をルリアブロス（ＬＢ）プレート上に画線し、プレートを３０℃でインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に２回ＬＢプレートに画線して、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーから、オレンジ〜ピンクのコロニーを形成したものをＤＣ２６３株と命名した。ＤＣ１８株は、ペンシルベニア州の河川から単離した。水性サンプルの連続希釈（１０^−２、１０^−４、および１０^−６）をトリプトンおよび酵母で栄養強化した基礎培地の大型２４５×２４５ｍｍ １５％寒天プレート上に播種した。基礎培地構成要素（１リットルあたり）は次のようであった。ＮＨ_４Ｃｌ ０．８ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５ｇ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２０ ０．２ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２０ ０．１ｇ、ＮａＮＯ_３ １．３ｇ、およびＮａ_２ＳＯ_４ ０．５ｇ。原液１の構成要素（１リットルあたり）は次のようであった。ニトリロ三酢酸１２．８ｇ、ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２５４ｇ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．３１２ｇ、ＺｎＣｌ_２ ０．１ｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０１ｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０１ｇ、およびＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．１８４ｇ。１リットルの基礎培地あたり１０ミリリットルの原液１を添加した。培地を濃度１０ｇ／Ｌのトリプトンおよび５ｇ／Ｌの酵母抽出物で強化した。培地のｐＨを７に調節した。プレートを室温でインキュベートし、単一コロニーを同一プレートに２回画線した。オレンジコロニーを形成した１つの株を選択して、ＤＣ１８株と命名した。
【０２２２】
ＤＣ１８およびＤＣ２６３で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を実施した。具体的には、プライマーＨＫ１２：５’−ｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号７）およびＪＣＲ１４：５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ−３’（配列番号８）を使用して、株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。製造業者（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））の使用説明書に従ってキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用し、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を精製して自動化ＡＢＩシーケン
サー上で配列決定した。プライマーＨＫ１２、ＪＣＲ１４、およびＪＣＲ１５：５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ−３’（配列番号９）で、シーケンス反応を開始した。アセンブリされたＤＣ１８の１２９１ｂｐ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１０）およびＤＣ２６３の１２６８ｂｐ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１１）をジェンバンク（登録商標）に対するＢＬＡＳＴＮ検索（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））のクエリー配列として使用した。ＤＣ１８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）株のそれに対する相同性を示し、トップヒットはスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）と９８％同一であった。したがってこの株は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８と命名された。ＤＣ２６３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、ブレバンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）株に対して相同性を示し、トップヒットはブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）と９９％同一であった。したがってこの株は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３と命名された。
【０２２３】
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃは海洋から単離され、ドイツ国のＪ．Ｗ．ゲーテ大学（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｅｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲルハルト・サンドマン（Ｇｅｒｈａｒｄ Ｓａｎｄｍａｎｎ）博士から得られた。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃはサイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種ＫＫ１０２０２Ｃ（ＭＢＩＣ０１３９）としても知られており、日本国岩手県のの海洋バイオテクノロジー研究所（ＭＢＩ）から入手できる。
【０２２４】
カロテノイド分析
スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８を株単離について述べたのと同一の１００ｍＬの培地中で生育させた。ブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３を１００ｍＬのＬＢ中で生育させた。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｋ１−２０２Ｃをミシガン州デトロイトのディフコ（Ｄｉｆｃｏ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの１００ｍＬのマリンブロス中で生育させた。３株は全て振盪して３０℃で一晩生育させた。４０００ｇで１５ｍｉｎの遠心分離によって細胞をペレットにし、細胞ペレットを１０ｍＬのアセトンで抽出した。抽出物を窒素下で乾燥させ、１〜２ｍＬのアセトンに再溶解した。抽出物をミシガン州アナーバーのパル・コーポレーション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）aＣＲ２５ｍｍシリンジフィルターで濾過した。次にそれをカリフォルニア州フォスター・シティのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのアジレント・シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ）１１００ＬＣ／ＭＳＤＳＩを使用して、ＨＰＬＣ分析用０．１ｍＬ １０％アセトン＋９０％アセトニトリル中で濃縮した。
【０２２５】
サンプル（２０μＬ）をアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）からの１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ＺＯＲＢＡＸ Ｃ１８（３．５μｍ粒子）カラムに装填した。カラム温度を４０℃に維持した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、使用した通過溶剤プログラムは次のとおりであった。
・０〜２ｍｉｎ：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ、
・２〜１０ｍｉｎ：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂから６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配、
・１０〜１２ｍｉｎ：６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂから５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配、
・１２〜１８ｍｉｎ：５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂ、および
・１８〜２０ｍｉｎ：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ。
【０２２６】
緩衝液Ａは９５％アセトニトリルおよび５％ ｄＨ_２Ｏであり、緩衝液Ｂは１００％テトラヒドロフランであった。
【０２２７】
図２ａ、２ｂ、および２ｃは、ＤＣ１８、ＤＣ２６３、およびＫ１−２０２Ｃ中で生成するカロテノイドのＨＰＬＣプロフィールを示す。各株について主要カロテノイドの吸収スペクトルも示される。主要カロテノイドの分子量は、ＬＣ−ＭＳによって求めた。５０μＬの各サンプルをカリフォルニア州のアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡ））からのＺｏｒｂａｘ ２．１×１５０ｍｍ ＳＢ−Ｃ１８ＬＣカラムに、以下の溶剤プログラムで通過させた。
・０〜３０ｍｉｎ：７０％アセトニトリルおよび３０％水から１００％アセトニトリルへの直線濃度勾配、
・３０〜４５ｍｉｎ：１００％アセトニトリル。
【０２２８】
英国マイクロマス・リミテッド（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＵＫ））からの質量分析器マイクロマス・クアトロＬＣ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ）トリプル四重極をコロナ放電針３ＫＶおよびＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）プローブ４５０℃で、ＡＰＣＩモードにおいて０．１ｓｅｃの飛び越し走査遅延で、１００〜１０００ ＡＭＵを０．９ｓｅｃでスキャンした。ＬＣ−ＭＳ分析は、ＤＣ１８中の主要カロテノイド分子量を６１４、ＤＣ２６３中の主要カロテノイド分子量を６２８、Ｋ１−２０２Ｃ中の主要カロテノイド分子量を５８２と判定した。ＨＰＬＣ溶出時間、吸収スペクトル、および分子量に基づいて、ＤＣ１８中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オンであると予想された。ＤＣ２６３中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオンであると予想された。ＤＣ１８およびＤＣ２６３中の主要カロテノイドについて我々が判定した特性は、これらのカロテノイドに関する文献で報告されたものと一致した（ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０：２００〜２０３、（１９９６）；クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）ら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、６０：２５４〜２５８（１９７７））。Ｋ１−２０２Ｃ中の主要カロテノイドは、サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ）のグループによってフレキシキサンチンであると判定された。Ｋ１−２０２Ｃ中の主要カロテノイドについて判定された特性は、フレキシキサンチンについて報告されたものと一致した（オーセン（Ａａｓｅｎ）ら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、２０：１９７０〜１９８８（１９６６）；アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗｅｓ）ら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、Ｂ３８：３３７〜３３９（１９８４））。３つの株全てにおいて主要カロテノイドはケトカロテノイドであるので、これらの３つの株はカロテノイドケトラーゼ遺伝子の潜在的供給源である。
【０２２９】
実施例２
小型挿入物ライブラリーの構築およびスクリーニング
この実施例は、細菌株からの小型挿入物ライブラリーの構築、および潜在的にケトラーゼ遺伝子を含有する陽性クローンの同定について述べる。
【０２３０】
ライブラリー構築
実施例１で述べるようにしてＤＣ１８、ＤＣ２６３、およびＫ１−２０２Ｃの細胞を生育させた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲノムＤＮＡ調製キットを使用して、細胞からゲノムＤＮＡを調製した。部分的制限酵素消化法によって、Ｋ１−２０２Ｃ株の小型挿入物ライブラリーを調製した。Ｋ１−２０２ＣのゲノムＤＮＡをウィスコンシン州マディソンの
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＨｉｎｃＩＩで部分的に消化し、０．８％アガロース・ゲル上で分離した。４〜６ｋｂの画分をゲルから切り取って、キアゲンミンエリュート（Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ゲル抽出キットを使用して抽出した。抽出したＤＮＡをウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，ＷＩ））からのｐＥＺＳｅｑブラント（Ｂｌｕｎｔ）クローニングキットを使用して、ｐＥＺｓｅｑベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をβ−カロテン生成プラスミドｐＢＨＲ−ｃｒｔ１（米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書）を含有する、新鮮に調製した大腸菌１０Ｇのコンピテント細胞中に電気穿孔した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンと共にＬＢプレートに播種した。
【０２３１】
ＤＣ１８およびＤＣ２６３株の小型挿入物ライブラリーをランダム剪断方法によって調製した。ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）からの２９１／２Ｇインシュリンシリンジを約３００回通過させて、ＤＣ１８およびＤＣ２６３のゲノムＤＮＡを剪断し、０．８％アガロース・ゲル上で分離した。４〜６ｋｂの画分をゲルから切除し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアゲンミンエリュート（Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ゲル抽出キットを使用して抽出した。ルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ）ＤＮＡターミネーター修復キットを使用して、抽出したＤＮＡの末端を修復した。ルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ）からのｐＥＺＳｅｑブラントクローニングキットを使用して、修復したＤＮＡ挿入物をｐＥＺｓｅｑベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をβ−カロテン生成プラスミドｐＤＣＱ３２９（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書、参照によってここに援用する）を含有する、新鮮に調製した大腸菌１０Ｇのコンピテント細胞中に電気穿孔した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンと共にＬＢプレートに播種した。
【０２３２】
陽性クローンの同定および分析
各ライブラリーからおよそ２０，０００〜１００，０００個の形質転換体が得られた。各ライブラリーについて、数万の黄色コロニーからいくつかのオレンジコロニーが同定された。これらの陽性クローンをβ−カロテンをケトカロテノイドに転換するケトラーゼ遺伝子をおそらく含有するものとして同定した。各陽性株を抗生物質と共に１００ｍＬのＬＢ中で振盪して３０℃で３日間生育させた。実施例１で述べるようにして、細胞からのカロテノイドを抽出し、ＨＰＬＣで分析した。ＤＣ１８、ＤＣ２６３、およびＫ１−２０２Ｃのライブラリーから単離された陽性大腸菌クローン中で、ケトカロテノイド（カンタキサンチンおよびエキネノン）が生成された。
【０２３３】
実施例３
新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の単離
この実施例は、陽性大腸菌クローン上の挿入物の配列決定、および挿入物上にコードされる新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の同定について述べる。
【０２３４】
カロテノイド分析は、陽性クローンが、β−カロテンからカンタキサンチンおよびエキネノンへの転換に関与するケトラーゼ遺伝子をおそらく含有することを示唆した。アンピシリン抵抗性でカナマイシン感応性のクローンについて選択して、ｐＥＺベースのプラスミドをβ−カロテンレポータープラスミドから分離した。ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＥＺ−ＴＮ＜ＴＥＴ−１＞キットを使用したランダムトランスポゾン挿入、および／またはプライマー歩行によって、ｐＥＺベースのプラスミド上への挿入物を配列決定した。ミシガン州アナーバーのジーン・コーズ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）プログラムによって、配列をアセンブ
リした。
【０２３５】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（登録商標）ＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンクから誘導される配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含有される配列に対する類似性について、ＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））検索を行って、ＣｒｔＷケトラーゼをコードする遺伝子を同定した。全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含有されるあらゆる一般公開されたＤＮＡ配列に対する類似性について、配列を分析した。ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６〜２７２（１９９３））を使用して、全ての読み枠でＤＮＡ配列を翻訳し、「ｎｒ」データベースに含有されるあらゆる一般公開されたタンパク質配列に対する類似性について比較した。
【０２３６】
全ての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを使用して実施した。各遺伝子が最も高い類似性を有する配列を要約した表３に、ＢＬＡＳＴ比較の結果を示す。表３はＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを示し、値は期待値で報告される。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、ベクターＮＴＩ中の複数の配列アライメントアルゴリズムを使用して、いくつかの既知のケトラーゼ遺伝子とも比較した。表４は、ペアワイズ比較についてのヌクレオチド配列同一性およびアミノ酸配列同一性の百分率を示す。単離された３つのｃｒｔＷ遺伝子は、既知のｃｒｔＷ遺伝子と中程度の相同性のみを有する。さらにそれらは表４におけるペアワイズ比較から示されるように、互いに非常に異なる。
【０２３７】
【表１１】

【０２３８】
【表１２】

【０２３９】
実施例４
β−カロテン合成プラスミドｐＤＣＱ３３０の構築
Ｐ．アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４は、カロテノイド合成遺伝子クラスターｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢＺ（配列番号１２）（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書参照）を含有する環境単離物であった。
【０２４０】
デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）の宅地野菜畑からの土壌を収集して、ＬＢ培地に再懸濁した。１０μＬのループを満たす再懸濁液をＬＢプレート上に画線し、プレートを３０℃でインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に２回ＬＢプレートに画線して、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーから、淡黄色のなめらかで半透明なコロニーを形成したものを「ＤＣ４０４株」と命名した。
【０２４１】
Ｐ．アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）株ＤＣ４０４を２５ｍＬのＬＢ培地中で３０℃で一晩通気して生育させた。細菌細胞を４，０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。細胞ペレットを５ｍＬの５０ｍＭトリス−１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に穏やかに再懸濁し、リゾチームを最終濃度２ｍｇ／ｍＬに添加した。懸濁液を３７℃で１ｈｒインキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度１％に、タンパク質分解酵素Ｋを１００μｇ／ｍＬに添加した。懸濁液を５５℃で２ｈインキュベートした。懸濁液は透明になり、透明溶解産物を等容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。４，０００ｒｐｍで２０ｍｉｎの遠心処理後、水性相を注意深く除去して新しい試験管に移した。２倍量のエタノールを添加して、ＤＮＡを密封したガラスパスツールピペットで穏やかに巻き取った。７０％エタノールを含有する試験管にＤＮＡを浸した。風乾後、ＤＮＡをＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍＬ）と共に４００μＬのＴＥ（１０ｍＭトリス−１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、４℃で保存した。ＤＮＡの濃度および純度は、分光光度法によりＯＤ_２６０／ＯＤ_２８０で判定した。
【０２４２】
ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＷＥＢコスミドクローニングキットを使用して、製造業者の使用説明書に従って、ＤＣ４０４のコスミドライブラリーを構築した。シリンジ針を通過させてゲノムＤＮＡを剪断した。剪断されたＤＮＡを末端修復し、低融点アガロース上で４０ｋＢの標準と比較してサイズ選択した。大きさがおよそ４０ｋＢのＤＮＡ断片を精製して、ブラントエンドクローニング−レディｐＷＥＢコスミドベクター中にライゲートした。超高効率マックスプラックス（ＭａｘＰｌａｘ）ラムダパッケージング抽出物を使用して、ライブラリーをパッケージングし、ＥＰＩ１００大腸菌細胞上に播種した。コスミドライブラリークローンから２つの黄色コロニーが同定された。２つのクローンからのコスミドＤＮＡは、類似した制限酵素消化パターンを有した。ここでｐＷＥＢ−４０４と称されるこのコスミドＤＮＡは、配列番号１２として示されるｃｒｔＷＥｉｄｉＹＩＢＺ遺伝子クラスターを含有した。
【０２４３】
プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号１３）およびｐＷＥＢ４０４Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号１４）を使用して、ＰＣＲによって、ｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子（配列番号１５）を含有するＤＣ４０４からの断片を増幅した。コスミドＤＮＡｐＷＥＢ−４０４をテンプレートとして、カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのプロターボ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ）^ＴＭポリメラーゼ、および９２℃（５ｍｉｎ）、９４℃（１ｍｉｎ）、６０℃（１ｍｉｎ）、７２℃（９ｍｉｎ）を２５回、および７
２℃（１０ｍｉｎ）の加熱サイクル条件と共に使用した。ゲル電気泳動に続いて、およそ５．６ｋＢの単一生成物が観察された。インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））からのＴａｑポリメラーゼを７２℃で１０分間の反応において使用し、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ中へのＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））クローニングのために、追加的３’アデノシンヌクレオチドを断片に付加した。大腸菌ＴＯＰ１０細胞への形質転換に続いて、いくつかのコロニーの色は明るい黄色に見え、それらがカロテノイド化合物を生成していることが示唆された。次に遺伝子クラスターをフロリダ州マルコアイランドのモビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ，ＬＬＣ（Ｍａｒｃｏ Ｉｓｌａｎｄ，ＦＬ））からの広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１中にサブクローンし、ウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，ＷＩ））からの大腸菌１０Ｇ細胞中に電気穿孔した。得られるプラスミドｐＤＣＱ３３０を含有する形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地上で選択した。ｐＤＣＱ３３０では、ｃｒｔＥ上流でユニークなＳｐｅＩ部位を操作した。
【０２４４】
実施例５
大腸菌中における新しいＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現
この実施例は、β−カロテンを生成する大腸菌株における、新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現について述べる。ケトラーゼ遺伝子の機能は、β−カロテンのカンタキサンチンへの転換によって実証された。
【０２４５】
この実験で使用されたβ−カロテン生成株は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書）からのβ−カロテン合成遺伝子クラスターを運ぶプラスミドｐＤＣＱ３３０を含有する大腸菌株であった。３つの細菌株からの推定上のケトラーゼ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅された。ＤＣ１８からのｃｒｔＷは、プライマーｃｒｔＷ−１８＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＣＧＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号１６）およびｃｒｔＷ−１８＿Ｒ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１７）を使用して増幅された。ＤＣ２６３からのｃｒｔＷは、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号１８）およびｃｒｔＷ−２６３＿Ｒ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１９）を使用して増幅された。Ｋ１−２０２ＣからのｃｒｔＷは、プライマーｃｒｔＷ／Ｋ１−２０２ＣＦ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号２０）およびｃｒｔＷ／Ｋ１−２０２ＣＲ：５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＴ−３’（配列番号２１）を使用して増幅された。ＰＣＲ生成物をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ベクター中にクローンして、挿入物を順方向に含有するクローンについてスクリーンした。これらはＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するｐＤＣＱ３４１ＴＡ、ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するｐＤＣＱ３４２ＴＡ、およびＫ１−２０２ＣからのｃｒｔＷ遺伝子を発現するｐＤＣＱ３３９ＴＡをもたらした。これらのコンストラクトをｐＤＣＱ３３０を含有するβ−カロテン蓄積大腸菌株に形質転換した。オレンジ形質転換体を得て、それらのカロテノイドを実施例１で述べるようにＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ結果を図３に示す。７．２９ｍｉｎで溶出されたカンタキサンチンは、それぞれの株で限定的に生成されたカロテノイドであった。カンタキサンチン標準は、スイス国ルプシンゲンのカロテナチュア（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。これは３つの新しいｃｒｔＷ遺伝子のケトラーゼ機能を明らかに実証した。
【０２４６】
実施例６
大腸菌中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現
この実施例は、アスタキサンチンおよび中間体を生成する大腸菌株中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現について述べる。追加的ケトラーゼ遺伝子の発現は、アスタキサンチン生成を増大させた。
【０２４７】
アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷおよびｃｒｔＺ遺伝子を使用して、大腸菌などの異種の宿主中においてアスタキサンチンを生成した。我々は、多岐にわたるｃｒｔＷの同時発現がアスタキサンチン転換を改善するかどうか評価した。３つの新たに単離されたＤＣ１８、ＤＣ２６３、およびＫ１−２０２Ｃからのカロテノイドケトラーゼ遺伝子は、表４に示すようにいくつかの既知のｃｒｔＷケトラーゼ遺伝子と中程度の相同性しか有さない。具体的にはＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子は、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷ遺伝子（配列番号２３）に対して、５７％のＤＮＡ配列同一性および４８％のアミノ酸配列同一性を有する。ＤＣ２６３からのｃｒｔＷは、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷ遺伝子に対して、５５％のＤＮＡ配列同一性および４５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｋ１−２０２ＣからのｃｒｔＷは、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷ遺伝子に対して、３９％のＤＮＡ配列同一性および３１％のアミノ酸配列同一性を有する。それらの相互の中程度〜低い相同性のために、単一宿主中のｃｒｔＷ遺伝子の複数のコピーの存在が不安定性の問題を引き起こす可能性は低い。
【０２４８】
プラスミドｐＤＣＱ３３５は、ｐＤＣＱ３３０中のβ−カロテン合成遺伝子クラスター中への合成アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＺＷ遺伝子のクローニングによって構築された。ｃｒｔＺ（配列番号２２）およびｃｒｔＷ（配列番号２３）遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲによって結合された。ｃｒｔＺ遺伝子は、順方向プライマーｃｒｔＺＷ＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号２４）および逆方向プライマーｃｒｔＺＷ＿ｓｏｅ＿Ｒ：５’−ＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）を使用して増幅された。ｃｒｔＷ遺伝子は、順方向プライマーｃｒｔＺＷ＿ｓｏｅ＿Ｆ：５’−ＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＣＡＣＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣＴ−３’（配列番号２６）および逆方向プライマーｃｒｔＺＷ＿Ｒ：５’−ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号２７）を使用して増幅された。２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、プライマーｃｒｔＺＷ＿ＦおよびｃｒｔＺＷ＿Ｒを使用してＰＣＲによって結合させた。１２７２ｂｐのＰＣＲ生成物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−Ｔｏｐｏベクター中にクローンして、プラスミドｐＤＣＱ３３５ＴＡを得た。ｃｒｔＺＷ遺伝子を含有するｐＤＣＱ３３５ＴＡからの約１．２ｋｂのＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ断片をｐＤＣＱ３３０中のユニークなＳｐｅＩ部位中にライゲートした。得られたコンストラクトｐＤＣＱ３３５中で、ｃｒｔＺＷＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子はオペロン中に編成され、ベクターのクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下にある。
【０２４９】
ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドｐＤＣＱ３４２ＴＡ、およびＫ１−２０２ＣからのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドｐＤＣＱ３３９ＴＡを、ｐＤＣＱ３３５を含有する大腸菌細胞中に形質転換した。アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのｃｒｔＷ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＣＱ３３５は、プラスミドｐＤＣＱ３４２ＴＡまたはｐＤＣＱ３
３９ＴＡと適合性である。ｐＤＣＱ３３５のみを含有する大腸菌株、および追加的プラスミドｐＤＣＱ３４２ＴＡまたはｐＤＣＱ３３９ＴＡを含有する株をＬＢ中で３０℃で３日間生育させ、実施例１で述べるようにしてＨＰＬＣ分析を実施した。結果を図４に示す。その溶出時間、吸収スペクトル、および分子量をミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））からの純正標準のそれらと比較して、アスタキサンチンを同定した。吸収スペクトルおよびその分子量（５８２ダルトン）に基づいて、アドニキサンチンの存在を予測した。ｐＤＣＱ３３５のみを含有する大腸菌株では、生成された全カロテノイドのおよそ２４％がアスタキサンチン（５．０ｍｉｎ）であり、カロテノイドの大部分（４６％）はアドニキサンチン（５．６ｍｉｎ）であった。ｐＤＣＱ３４２ＴＡまたはｐＤＣＱ３３９ＴＡと同時発現するｐＤＣＱ３３５を含有する株では、生成したカロテノイドのおよそ５０％がアスタキサンチン（４．８−４．９ｍｉｎ）であり、およそ１０％がアドニキサンチン（５．５ｍｉｎ）であった。この結果は、２つ以上の多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現が、ケト基付加の効率を改善してアスタキサンチンなどのケトカロテノイド生成を増大させることを実証した。
【０２５０】
実施例７
β−カロテン合成プラスミドｐＤＣＱ３４０の構築
この実施例の目的は、ここでｐＤＣＱ３４０と称されるβ−カロテン発現プラスミドを調製することである。腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）ＤＣ２６０（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書、参照によってここに援用する）は、天然遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢＺを含有する。β−カロテン合成に必要な遺伝子（すなわちｃｒｔＥＹＩＢ）は、ＰＣＲによって結合される。ｃｒｔＥ遺伝子は、プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆ：５−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２８）およびｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｒ：５’−ＡＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２９）を使用して増幅された。ｃｒｔＹ遺伝子は、プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｆ：５’−ＣＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号３０）およびｃｒｔ−２６０Ｒ１＿Ｒ：５’−ＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＣＧＣＴＴ−３’（配列番号３１）を使用して増幅された。ｃｒｔＩＢ遺伝子は、プライマーｃｒｔ−２６０Ｒ１＿Ｆ：５’−ＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号３２）およびｃｒｔ−２６０＿Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号３３）を使用して増幅された。ｃｒｔＹ遺伝子の３’末端に広がるプライマーに導入されたサイレント変化によって、ｃｒｔＹ遺伝子の３’末端のＥｃｏＲＩ部位を除去した。ｃｒｔＥＹ遺伝子を最初にプライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆ（配列番号２８）およびｃｒｔ−２６０Ｒ１＿Ｒ（配列番号３１）を使用して、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲによって結合した。次にｃｒｔ−２６０＿Ｆ（配列番号２８）プライマーおよびｃｒｔ−２６０＿Ｒ（配列番号３２）プライマーを使用して、ｃｒｔＩＢ遺伝子とのＰＣＲによってｃｒｔＥＹ遺伝子を結合した。最終的な４．５ｋＢのｃｒｔＥＹＩＢ断片をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンして、次にｐＢＨＲ１中にサブクローンしてｐＤＣＱ３４０を得た。ｐＤＣＱ３４０を含有する大腸菌細胞は、β−カロテンを生成することが示された。
【０２５１】
実施例８
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中における新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現
この実施例は、以前報告された方法（米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書）および（米国特許出願第６０／５２７０８３号明細書）に基づいて、当業者が、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ（ＡＴＣＣＰＴＡ−２４０２）中において、カ
ンタキサンチンなどのケトカロテノイドの生成のための新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子をどのようにして発現できるかについて述べる。
【０２５２】
スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８およびブレバンジモナス・ベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子をβ−カロテン合成プラスミドｐＤＣＱ３４０（実施例７）中に個別にクローンして、プラスミドｐＤＣＱ３４１およびｐＤＣＱ３４２をそれぞれ生成した。
【０２５３】
三親接合交配（米国特許出願第６０／５２７０８３号明細書）によって、プラスミドｐＤＣＱ３４１およびｐＤＣＱ３４２をメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａに転移した。ｐＲＫ２０１３（ＡＴＣＣＮｏ．３７１５９）を含有する大腸菌ヘルパー株、およびプラスミドｐＤＣＱ３４１またはｐＤＣＱ３４２を含有する大腸菌１０Ｇドナー株をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で一晩生育させ、ＬＢで３回洗浄し、元の培養容積のおよそ６０倍の濃度に相当する容積のＬＢに再懸濁した。
【０２５４】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００株は、天然ｃｒｔＮ１ａｌｄｃｒｔＮ２遺伝子クラスターのためのプロモーターの二重交差ノックアウト、および天然ｃｒｔＮ３遺伝子のノックアウトを含有して、天然Ｃ_３０カロテノイド（米国特許出願第６０／５２７０８３号明細書）の合成を中断する。このＭＷＭ１２００株は、米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書で述べられる一般条件を使用して、受容株として生育できる。簡単に述べると、少なくとも８：１の気体／液体比（すなわち総容積１６０ｍＬ中の２０ｍＬの硝酸塩液体「ＢＴＺ−３」培地）を使用して、３０℃で絶え間なく振盪しながら、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００株をイリノイ州ホイートンのホイートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ））からの血清ストッパーホイートン・ボトル（Ｗｈｅａｔｏｎ ｂｏｔｔｌｅｓ）中で生育させた。
【０２５５】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６Ａのための硝酸塩培地
ここで「合成培地」または「ＢＴＺ−３」培地とも称される硝酸塩液体培地は、下で示されるように（表５および６）溶液１と混合された様々な塩を含んでなり、明記される場合は、硝酸塩は１５ｍＭ塩化アンモニウムで置き換えられた。溶液１は、微量元素の１００倍濃縮原液のための組成を提供する。
【０２５６】
【表１３】

【０２５７】
【表１４】

【０２５８】
培養のための標準気相は、空気中に２５％のメタンを含有する。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００受容株をこれらの条件下で４８時間ＢＴＺ−３培地中で培養し、ＢＴＺ−３で３回洗浄し、元の培養容積のおよそ１５０倍の濃度に相当する容積のＢＴＺ−３に再懸濁した。
【０２５９】
０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を含有するＢＴＺ−３寒天プレート表面で、ドナー、ヘルパー、および受容細胞ペーストをそれぞれ１：１：２の比率で合わせた。プレートを２５％メタン中で３０℃に１６〜７２時間維持して接合を生じさせ、その後細胞ペーストを収集してＢＴＺ−３に再懸濁した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＴＺ−３寒天に希釈溶液を播種して、２５％メタン中で３０℃で１週間までインキュベートし
た。橙赤色の接合完了体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と共にＢＴＺ−３寒天上に画線した。
【０２６０】
カロテノイド組成物の分析のために、接合完了体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する２５ｍＬＢＴＺ−３中で培養し、唯一の炭素源として２５％メタン中で３０℃で１週間までインキュベートして、細胞を遠心分離によって採取して−２０℃で凍結した。解凍後実施例１に述べるようにペレットを抽出し、ＨＰＬＣでカロテノイド含量を分析した。
【０２６１】
ｐＤＣＱ３４０を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００からの抽出物のＨＰＬＣ分析（図５）は、β−カロテンの合成を示した。ｐＤＣＱ３４１またはｐＤＣＱ３４２のいずれかを含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００はカンタキサンチンを合成し、それはこのメタノトローフ宿主中の新しいケトラーゼのケトラーゼ活性を証明した。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、および６に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の洗浄条件で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、および配列番号５よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて少なくとも７５％の同一性を有する、少なくともアミノ酸２４９個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて少なくとも７５％の同一性を有する、少なくともアミノ酸２６０個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列。
【請求項６】
配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７５％の同一性を有する、少なくともアミノ酸２６０個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列。
【請求項７】
適切な調節配列に作動的に結合した、請求項１、２、５、または６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞がＣ_１代謝性細菌である、請求項９の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項９の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）ゲノムライブラリーを請求項１、２、４、５または６のいずれか一項に記載の核酸分子でプローブし、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の洗浄条件で、請求項１、２、４、５または６のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
そして
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する、ことを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする、
カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）の核酸分子が、配列番号２、配列番号４、および配列番号６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５よりなる群から選択される配列の一部分に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅する、
ことを含んでなり、
増幅された挿入物がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする、
カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法の生成物。
【請求項１７】
（ａ）環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項１、２、４、５または６のいずれか一項に記載の遺伝子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる
、ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成方法。
【請求項１８】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号２、配列番号４、および配列番号６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
環状ケトカロテノイド化合物が、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−γ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、ミキソバクトンよりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
環状カロテノイドが、β−カロテン、γ−カロテン、ゼアキサンチン、β−クリプトザンチン、アドニキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ルビキサンチン、エキネノンおよびトルレンよりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
形質転換された宿主が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
形質転換宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
形質転換宿主細胞がＣ_１代謝性細菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジ
ャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）適切な調節配列の制御下にある請求項１、２、４、５または６のいずれか一項に記載のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞中に導入し、そして
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイド生合成が制御される条件下で生育させる、
ことを含んでなる、生物において環状ケトカロテノイド生合成を制御する方法。
【請求項２６】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号２、配列番号４、および配列番号６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子がアップレギュレートされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子がマルチコピープラスミド上に過剰発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が誘導可能プロモーターまたは調節プロモーターに作動的に結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子がダウンレギュレートされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子がアンチセンス方向で発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子がコード領域への外来性ＤＮＡの挿入によって中断される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）ｉ）天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子、
ii）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチド断片の第１の集団、
iii）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチド断片の第２の集団
を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、
制限酵素断片の混合物が生成され、
（ｂ）前記制限酵素断片の混合物を変性させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の変性させた前記制限酵素断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）を反復して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子が生成される、
ことを含んでなる方法によって生成される、改変された生物学的活性を有するカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする変異遺伝子。
【請求項３４】
（ａ）環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞をＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項１、２、４、５または６のいずれか一項に記載の遺伝子から選択される第１の遺伝子で形質
転換し、
（ｃ）（ａ）の宿主細胞を前記第１の遺伝子と比較すると６５％未満の核酸配列同一性を有し、ＣｒｔＷカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第２の遺伝子で形質転換し、そして
（ｄ）前記（ａ）の第１の遺伝子および前記（ｂ）の第２の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第１の遺伝子または前記第２の遺伝子のみを発現する形質転換宿主細胞に比べて環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、
ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法。
【請求項３５】
宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
形質転換宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
形質転換宿主細胞が、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）よりなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される請求項３５に記載の方法。

【図１】

【図２ａ】

【図２ｂ】

【図２ｃ】

【図３】

【図４】

【図５】

【公開番号】特開２０１２−４００３１（Ｐ２０１２−４００３１Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６４１９８（Ｐ２０１１−２６４１９８）
【出願日】平成２３年１２月２日（２０１１．１２．２）
【分割の表示】特願２００６−５４５５８６（Ｐ２００６−５４５５８６）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】