新規なペルオキシダーゼ
【課題】過酸化水素との親和性が高く、低濃度の過酸化水素で活性を有するペルオキシダーゼを提供する。
【解決手段】下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：（ａ）特定の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；（ｂ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｃ）特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【解決手段】下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：（ａ）特定の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；（ｂ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｃ）特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来の新規なペルオキシダーゼに関し、特に、低濃度の過酸化水素で活性を有するペルオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシダーゼは、動物界、植物界、微生物界に広く分布する酵素であり、過酸化水素の存在下で有機化合物を酸化する反応を触媒する酵素である。この性質を利用して、ペルオキシダーゼは、衣料用洗剤中の漂白成分や、ＥＬＩＳＡなどの生化学的分析法用の試薬に工業的に広く使用されている（特許文献１）。
【０００３】
このような工業的に使用されるペルオキシダーゼの場合、反応に必要な過酸化水素の濃度が低くて済むこと、つまり過酸化水素との親和性が高いことが望ましい。例えば、衣料用洗剤の場合、使用するペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性が高いほど、添加する過酸化水素量が少なくて済み、製造コストを低くすることができる。また、生化学的分析用の試薬の場合、使用するペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性が高いほど、併用できる抗体などの種類が増加し、分析対象の増大や分析感度の向上が期待できる。
【０００４】
しかしながら、従来、工業的に使用されているペルオキシダーゼはいずれも過酸化水素との親和性が低く、未だ改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２３４９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、過酸化水素との親和性が高く、低濃度の過酸化水素で活性を有するペルオキシダーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、様々な植物由来のペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性について鋭意検討した結果、園芸植物のポーチュカ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）が生産するペルオキシダーゼの中に過酸化水素との親和性が高いものが二種類存在することを見出し、それらの塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の第一の側面によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
また、本発明の第一の側面によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１０】
本発明の第二の側面によれば、（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
また、本発明の第二の側面によれば、（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって提供される二種類のペルオキシダーゼは、いずれも過酸化水素との親和性が高く、低濃度の過酸化水素で活性を有するので、これらを使用した洗剤の製造コストの削減や生化学的分析の精度の向上をもたらすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で使用したプライマーを示す表１である。
【図２】ＰＲＸの遠位ヒスチジン領域の塩基配列を示す表２である。
【図３】３′ＲＡＣＥ法を示す。
【図４】５′ＲＡＣＥ法を示す。
【図５】ポーチュラカＰＲＸの発現パターンを示す。
【図６】ポーチュラカ根由来の過酸化水素高親和性ＰＲＸの解析を示す。
【図７】過酸化水素高親和性ＰＲＸの同定を示す。
【図８Ａ】ＰｏＰＲＸ１の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】ＰｏＰＲＸ２の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】ＰｏＰＲＸ３の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】ＰｏＰＲＸ４の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｅ】ＰｏＰＲＸ５の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列解析を示す。
【図１０】各ＰｏＰＲＸの特徴を示す表３である。
【図１１】実施例３．（１）で作成した遺伝子構築物の構造を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２のスクリーニングを示す。
【図１２Ｄ−Ｅ】ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２のスクリーニングを示す。
【図１３】ＰｏＰＲＸのＨ２Ｏ２親和性評価を示す。
【図１４】組換えＰｏＰＲＸ２の過酸化水素親和性解析を示す。
【図１５】組換えＰｏＰＲＸ４の過酸化水素親和性解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の二種類のペルオキシダーゼを詳細に説明する。
第一のペルオキシダーゼは、（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、第二のペルオキシダーゼは、（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。これらは、いずれもスベリヒユ科の園芸植物であるポーチュラカが生産するペルオキシダーゼである。第一のペルオキシダーゼは、実施例で単離したＰｏＰＲＸ２に相当し、第二のペルオキシダーゼは、実施例で単離したＰｏＰＲＸ４に相当する。
【００１５】
本発明のペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で有機化合物を酸化する反応を触媒する点では従来公知のペルオキシダーゼと同様であるが、その最大の特徴は、従来公知のペルオキシダーゼに比べて低過酸化水素濃度でも反応を触媒することができる点にある。従来公知のペルオキシダーゼは、一般に２〜３ｍＭ程度の過酸化水素のミカエリス定数を有するため、４〜６ｍＭ程度の濃度の過酸化水素が触媒活性の最大反応速度を発揮するために必要であるが、本発明のペルオキシダーゼは、０．７ｍＭ程度の過酸化水素のミカエリス定数を有するため、１．４ｍＭ程度の低濃度の過酸化水素条件下でも触媒活性の最大反応速度を発揮することができる。
【００１６】
本発明は、（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記第一のペルオキシダーゼの遺伝子である。また、本発明は、（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは上記第二のペルオキシダーゼの遺伝子である。
【００１７】
本発明の第一のペルオキシダーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質も包含する。本発明の第二のペルオキシダーゼは、上記（ｅ）および（ｆ）のものに限定されず、（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、または（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質も包含する。例えば、本発明者らの研究によれば、配列番号４に記載のアミノ酸配列の２６１番目のアミノ酸（Ｃｙｓ残基）をＧｌｙ残基に置換しても、置換前のペルオキシダーゼと同様の過酸化水素のミカエリス定数（０．８７ｍＭ）を示すことが確認されている。この変異型ペルオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号６２に、塩基配列を配列番号６１にそれぞれ示す。
【００１８】
また、本発明の第一のペルオキシダーゼの遺伝子は、（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含する。本発明の第二のペルオキシダーゼの遺伝子は、（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のペルオキシダーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のペルオキシダーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
【００１９】
上記（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子および上記（ｇ）のタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ配列番号３または７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列またはその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号３もしくは７の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。
【００２１】
ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子がペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば、得られた遺伝子をタバコ植物細胞に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この酵素タンパク質を精製して過酸化水素の存在下で有機化合物に添加して酸化物の生成をクロマトグラフィーなどで測定することによって確認することができる。
【００２２】
また、上記（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子および上記（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号３または７に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子がペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子の場合と同様の方法で確認することができる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
【００２４】
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のペルオキシダーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物細胞などが挙げられ、より好ましくは高等植物細胞が挙げられ、特に好ましくはタバコ植物細胞が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
【００２５】
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のペルオキシダーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
【００２６】
形質転換体中に蓄積した本発明のペルオキシダーゼは、未精製のまま使用することができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２８】
材料および方法
１．使用植物、菌株、ベクター
（１）使用植物
Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ポーチュラカ）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ２（タバコ培養細胞）（以下、ＢＹ２と称する）
【００２９】
（２）使用菌株
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α ｄｅｏＲ，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋），
ｒｅｃＡ１，ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，
Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，φ８０ｌａｃＺΔＭ１５，
Ｆ−，λ−Ｍ１５，Ｆ−，λ−
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＥＨＡ１０５ Ｃｍｒ
ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ
ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ
ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎａｒｙ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ
【００３０】
（３）使用ベクター
Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ− ａｍｐｒ，ｌａｃＺ
ｐＵＣ１８ ａｎｄ １９ ａｍｐｒ，ｌａｃＺ
ｐＢＩ１２１ Ｋｍｒ
【００３１】
２．培地
（１）大腸菌用培地
（ｉ）ＬＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ
平板培地に、１５ｇ／ｌの精製寒天粉末を加えた。オートクレーブ後、必要に応じて、濾過滅菌した抗生物質（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）を加えた。
【００３２】
（ｉｉ）２×ＹＴ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ
平板培地に、１５ｇ／ｌの精製寒天粉末を加えた。オートクレーブ後、必要に応じて、濾過滅菌した抗生物質（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）を加えた。
【００３３】
（ｉｉｉ）ＳＯＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｉｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５８４ｇ／ｌ，ＫＣｌ ０．１８６ｇ／ｌ
オートクレーブ後、濾過滅菌した１Ｍ ＭｇＳＯ４，１Ｍ ＭｇＣｌ２を１ｌに対して１０ｍｌずつ加えた。
【００３４】
（２）植物体用培地
（ｉ）ＭＳ基本培地
必要に応じて植物ホルモンのＮＡＡおよびＢＡを以下に示す量だけ加え、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した後、３ｇ／ｌのゲランガムを加えた。オートクレーブ後、必要に応じてカルベニシリン２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｍｌを加えて用いた。
【００３５】
（ｉｉ）ＢＹ２用培地
ＫＯＨでｐＨ５．７に調整した後、オートクレーブして用いた。
平板培地を、ｐＨ５．７に調整した後、ゲランガム３ｇ／ｌを加えた。オートクレーブ後、必要に応じてカルベニシリン２５０ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌを加えて用いた。
【００３６】
（３）アグロバクテリウム用培地
（ｉ）ＹＥＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ，Ｂｅａｆ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ／ｌ，Ｓｕｃｒｏｓｅ ５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブして用いた。必要に応じて、濾過滅菌したカナマイシン５０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｌを加えた。
【００３７】
（ｉｉ）ＹＥＰ培地
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブして用いた。
【００３８】
３．実験試薬
実験試薬は特に指定のない限り、和光純薬工業またはナカライテスクのものを用いた。制限酵素、修飾酵素は、東洋紡、タカラバイオ、ニッポンジーン、ファルマシア、シグマ、ＮＥＢ、またはＢＲＬのものをそれぞれの説明書に従って使用した。
【００３９】
４．大腸菌からのプラスミド調製
大腸菌からのプラスミドＤＮＡ調製は、添付のマニュアルに従い、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡）を用いて行った。
【００４０】
５．アガロースゲルを用いたＤＮＡの電気泳動
泳動ゲルは、ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒにアガロースゲルを融解させたものを使用した。試料にＧｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを１／１０量加え、ゲルのウェルに注入した。泳動装置は、Ｍｕｐｉｄ−α（コスモ・バイオ）を用い、１×ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ中、定電圧１００Ｖで行った。泳動後、エチジウムブロマイド０．５μｇ／ｍｌを含むＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ中でゲルを染色し、トランスイルミネーター上で観察した。
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒおよびＧｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの組成を以下に示す。
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．２５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ，０．２５％ Ｘｙｌｅｎｅ ｃｙａｎｏｌ，４０％（ｗ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
【００４１】
６．アガロースゲルからのＤＮＡの回収
目的のＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをメスで切り出し、エッペンドルフチューブに入れ、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、添付のプロトコールに従ってＤＮＡ断片を回収した。
【００４２】
７．大腸菌の形質転換
（１）コンピテントセルの調製
コンピテントセルは、Ｉｎｏｕｅらの方法（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）に従い調製した。大腸菌のシングルコロニーを５ｍｌのＬＢ培地に滅菌済みの楊枝を用いて植菌し、３７℃で１晩培養した。この大腸菌培養液のうち、２ｍｌを坂口フラスコ内の２００ｍｌのＳＯＢ培地に植菌し、６６０ｎｍにおける濁度が０．４−０．８になるまで室温で振盪培養した（２５−３０℃、２００ｒｐｍ）。培養液を氷中で５分間冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、冷却したＴＢ ｂｕｆｆｅｒを１／３量（６７ｍｌ）加えて穏やかに懸濁してから、１０分間氷中に静置した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、再び冷却したＴＢ ｂｕｆｆｅｒを１６ｍｌ加えて穏やかに懸濁した。続いて７％（約１．２ｍｌ）となるようにＤＭＳＯをゆっくり混ぜながら加えた後、１０分間氷中に静置した。氷上で１００μｌずつエッペンドルフチューブに分注し、直ちに液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
ＴＢ ｂｕｆｆｅｒの組成を以下に示す。
ＴＢ ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，１５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，
２５０ｍＭ ＫＣｌ，５５ｍＭ ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
【００４３】
（２）形質転換
コンピテントセルを氷中で解凍後、コンピテントセルの１／１０量以下（１−２０μｌ）のＤＮＡ溶液を加え、氷中に３０分間静置した。４２℃に３０秒間置き、直ちに氷中に戻して２分間静置した後５００μｌの２×ＹＴ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した。スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に広げ、３７℃で１晩培養した。
【００４４】
８．ＰＣＲ
ＰＣＲ反応は、ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）およびＰｈｕｓｉｏｎ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ）を用い、添付のプロトコールに従い、目的遺伝子が増幅する条件で行った。使用したプライマーを表１に示す。
【００４５】
９．ポーチュラカのペルオキシダーゼ（以下ＰＲＸと称する）遺伝子の単離
（１）ＲＮＡの調製
ポーチュラカ組織からのＲＮＡ抽出は、Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。ゲノムＤＮＡを除去するため、抽出したｔｏｔａｌＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ｔｏｔａｌＲＮＡ２５μｌ、１０×ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，６０ｍＭ ＭｇＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９）５μｌ、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／μｌ）２μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）１μｌ、滅菌したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水１７μｌを混合し、３７℃で３０分間、保温した。酵素を失活させるため、フェノールクロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を１回行った。エタノール沈殿を行い、沈殿を１０μｌの滅菌ＤＥＰＣ水に溶解した。
【００４６】
（２）ＲＮＡの電気泳動
調製したｔｏｔａｌＲＮＡが分解されていないかどうかを確認するため、電気泳動を行った。ＲＮＡサンプル５μｌにＲＮＡと等量のホルムアミドを加え、６５℃で５分間熱処理し、氷上で５分間静置した。Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを１／１０量、エチジウムブロマイド（５００ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ加えた。１％アガロースゲルおよびＴＡＥバッファーを用いて電気泳動を行った。
【００４７】
（３）３′ＲＡＣＥ法
種々のＰＲＸ遺伝子間に高度に保存された遠位ヒスチジン領域に相当する塩基配列を、遺伝子特異的プライマーとして使用した（表２）。ポーチュラカ根から調製したＲＮＡを出発材料として３′ＲＡＣＥ法（図３）を行った。なお、逆転写酵素として、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｄ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【００４８】
（４）塩基配列の決定
Ｂｉｇ Ｄｙｅ，Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、添付のプロトコールに従って反応を行った。蛍光シグナルの解析には、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた。
【００４９】
（５）５′ＲＡＣＥ法
３′ＲＡＣＥ法により明らかになった塩基配列情報を基に、５′末端にリン酸化修飾したＧｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ（ＧＳＰ）を設計した。ポーチュラカ根から調製したＲＮＡを出発材料として５′ＲＡＣＥ（図４）を行った。各ＰＲＸ遺伝子の増幅は、根から調製したＲＮＡをＧＳＰで逆転写し、Ｓ ＰｒｉｍｅｒとＡＳ ＰｒｉｍｅｒでＰＣＲすることにより行った。使用したＰｒｉｍｅｒは、表１に示している。
【００５０】
１０．ＲＴ−ＰＣＲ
ポーチュラカの各器官から調製したｃＤＮＡを鋳型にし、目的の遺伝子が増幅するＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｔと条件でＰＣＲを行った。また、内部標準としてユビキチン遺伝子の特異的プライマーを用いた。
【００５１】
１１．遺伝子構築物の作成
各ＰＲＸ遺伝子を発現させるための構築物を作成した。翻訳エンハンサーであるＡＤＨ ５’ＵＴＲ（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）をＮｔＡＤＨ−Ｆ ｐｒｉｍｅｒとＡＤＨ−ＮｓｉＩ−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを用いて増幅し、末端を平滑化した後、ｐＵＣ １１８のＨｉｎｃＩＩギャップに挿入した。得られたプラスミドをＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切断した後、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）で平滑化し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。各ＰＲＸ遺伝子ＯＲＦを、表１に示す各ＯＲＦ−ＦプライマーおよびＯＲＦ−Ｒプライマーを用いて増幅し、末端を平滑化した上記ベクターに挿入してＡＤＨ ５’ＵＴＲと各ＰＲＸのＯＲＦを融合した。各ＡＤＨ ５’ＵＴＲ融合ＰＲＸを、ＸｂａＩとＳａｃＩを用いてｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に挿入し、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターに連結した。
【００５２】
１２．植物培養細胞の形質転換
（１）アグロバクテリウムの形質転換
（ｉ）コンピテントセルの作製
アグロバクテリウムの単一コロニーを５ｍｌのＹＥＢ培地に植菌し、２８℃で１晩振盪培養した。この培養液を、５００ｍｌのＹＥＰ培地に植菌し、６００ｎｍにおける濁度が０．５になるまで２８℃で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため５００ｍｌの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨てた。この操作を２回繰り返した後、沈殿に２０ｍｌの冷却した滅菌１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて懸濁した。ナルゲンチューブに移し遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃ ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＡ−２０ローター）により集菌して上清を捨てた。沈殿に３ｍｌの冷却した滅菌１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて懸濁し、４０μｌずつエッペンドルフチューブに分注して、液体窒素で凍結させてから−８０℃で保存した。
【００５３】
（ｉｉ）形質転換
コンピテントセルを氷中で解凍した後、１〜２μｌのＤＮＡ溶液を加え、氷令した２ｍｍキュベットに移した。エレクトロポレーター（ＢＩＯ ＲＡＤ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）により電気パルス（２．５ＫＶ、２５μＦ、４００Ω）を与え、ＤＮＡを導入した。１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、２８℃で１時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に広げ、２８℃で２晩培養した。
【００５４】
（２）タバコ培養細胞の形質転換
ＢＹ２細胞の形質転換は、Ａｎ（Ａｎ，１９８５）の方法に従って行った。カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含む５ｍｌのＬＢ培地で２８℃、２晩培養したアグロバテリウム培養液１００μｌと、培養４日目のタバコ培養細胞懸濁液５−１０ｍｌをシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃で２晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を１５ｍｌの遠心管に移して遠心（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＧＳ−６ＫＲ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上清を取り除いた。新しい改変ＬＳ培地を入れて遠心分離（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＧＳ−６ＫＲ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、細胞を洗浄した。この操作を４回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞をカナマイシン１００ｍｇ／ｌの入った改変ＬＳ寒天培地に播種し、２５℃で暗黒下に静置して培養した。約２−３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。カナマイシン１００ｍｇ／ｌを加えた改変ＬＳ培地３０ｍｌ移し、継代培養を行った。
【００５５】
１３．タンパク質の調製
（１）ポーチュラカタンパク質サンプルの調製
無菌培養したポーチュラカの各器官（根、茎、葉、花）を液体窒素で冷やしながら乳鉢で粉末状にし、湿重量１ｇあたり１ｍｌの抽出バッファーを添加した。ボルテックスした後、氷上に２０分間静置した。１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０分間遠心し、上清を回収した。
抽出バッファーの組成を以下に示す。
抽出バッファー；１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ６．０ ａｔ２０℃
【００５６】
（２）ＢＹ２細胞タンパク質サンプルの調製
ろ紙を用いて培養液と細胞を分離した。細胞８ｇに２０ｍｌの抽出バッファーを添加し、氷上で超音波破砕（１０秒間ＯＮ／１０秒間ＯＦＦ、Ｔｏｔａｌ ８分間）し、９，０００ｒｐｍ，４℃で３０分間遠心し、回収した上清をサンプルとした。
【００５７】
（３）培養液タンパク質のサンプルの調製
ポーチュラカの水耕培養液およびＢＹ２細胞の培養液を、９，０００ｒｐｍ，４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。限外濾過カラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ＭＷＣＯ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に回収した上清を入れ、９，０００ｒｐｍ，４℃で９０分間遠心し濃縮し、培養液サンプルとした。
【００５８】
（４）タンパク質の定量
タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）に従って行った。適当量の水で希釈したタンパク質溶液１０μｌとタンパク質定量試薬５００μｌを４８ウェルプレートに入れてよく混合し、Ａｂｓ ５９５ｎｍでの吸光度を測定した。Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を用いて検量線を作成し、これに基づいてサンプルのタンパク質濃度を求めた。
【００５９】
１４．ＰＲＸの解析
（１）等電点電気泳動
ＢＩＯ−ＲＡＤのモデル１１１ミニセルを用いて行った。ＰＡＧＥゲルサポートフィルムの疎水面をガラスプレートに密着させた後、キャスティングプレートにのせた。モノマー−アンフォライト溶液および触媒溶液を混合し、サポートフィルムとキャスティングプレートのすき間に流し込み、蛍光灯光下で４５分間重合させた。作製したゲルに試料および、ＩＥＦスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１６１−０３１０）を塗布した。泳動槽の電極を蒸留水で湿らせ、ゲル面を下にしてセットした。定電圧で、１００Ｖ １５分間、２００Ｖ １５分間、４５０Ｖ ６０分間泳動した。
モノマー−アンフォライト溶液および触媒溶液の組成を以下に示す。
モノマー−アンフォライト溶液（ゲル一枚分）：
ｄＨ２Ｏ ２．７５ｍｌ
２４．２５％（ｗ／ｖ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ− １．０ｍｌ
０．７５％（Ｗ／Ｖ）ｂｉｓ
２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １．０ｍｌ
Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ ３／１０ Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ，４０％ ０．２５ｍｌ
（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１６３−１１１２）
触媒溶液：
１０％（ｗ／ｖ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ２７．５μｌ
ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ
０．１％（ｗ／ｖ）ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ− ２５．０μｌ
５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＴＥＭＥＤ １．５μｌ
【００６０】
（２）ペルオキシダーゼ活性染色
等電点電気泳動後のゲルを活性染色液に浸し、過酸化水素の濃度を適宜変えて加え、室温で軽く振とうした。バンドを確認後、蒸留水ですすぎ、ハイブリバックに入れゲルをスキャニングした。
活性染色溶液の組成を以下に示す。
活性染色溶液：
Ａ液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ
Ｂ液：０．３％（ｗ／ｖ）４−クロロ−１−ナフトール，８５％（ｖ／ｖ）メタノール
使用直前に、Ａ液とＢ液を４：１の割合で混合し活性染色溶液とした。
【００６１】
（３）ＰＲＸ活性測定
ピロガロールの酸化によって生じるプルプロガリン（４２０ｎｍに吸収極大を持つ）を、ＤＵ６４０ ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて定量し、ＰＲＸ活性を測定した。溶液１Ｕの定義はｐＨ６．０、２０℃において２０秒間でピロガロールから１ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量とする。下記の反応溶液を混合した後、４２０ｎｍの吸光度を３０秒間隔で１０分間測定した。また、過酸化水素の終濃度が１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭの条件で測定を行い、ミカエリス定数（Ｋｍ値）を算出した。
反応溶液
１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０ ａｔ２０℃） ０．３２ｍｌ
５．０％ピロガロール ０．３２ｍｌ
過酸化水素 ０．１６ｍｌ
ＰＲＸ溶液（ｉｎ １００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｍｌ
ｐＨ６．０ ａｔ２０℃）
Ｄ．Ｗ． ２．１ｍｌ
【００６２】
実験
１．ポーチュラカＰＲＸ（以下ＰｏＰＲＸと称する）の特徴づけ
（１）ポーチュラカにおけるＰＲＸの発現解析
ＰｏＰＲＸの基礎的知見を得るために、等電点電気泳動およびＰＲＸ活性染色によってポーチュラカの根・茎・葉・花における発現パターン解析を行った（図５）。複数のバンド（根−６個）が存在した（図５のＡ）。根特異的発現を示す中性アイソザイムが存在することがわかった。また、ポーチュラカを無菌水耕培養し、培地に分泌されたＰＲＸを調べたところ、培地中に、分泌されている主なアイソザイムは、約４．５のｐＩを有する酸性アイソザイムであることがわかった（図５のＢ）。
【００６３】
（２）ＰｏＰＲＸの活性測定
ポーチュラカの根から分泌されるＰＲＸがＨ２Ｏ２高親和性であるかどうかを確認するために、ピロガロールを用いた酵素活性測定を行った。異なるＨ２Ｏ２濃度条件下で活性測定を行い、ミカエリス定数（Ｋｍ値）を算出した（図６）。その結果、ピロガロールの酸化重合反応におけるＨ２Ｏ２のＫｍ値は約０．６９ｍＭであることがわかった。
【００６４】
（３）Ｈ２Ｏ２高親和性ＰＲＸの同定
ポーチュラカの根においてＨ２Ｏ２に対する高い親和性を有するＰＲＸアイソザイムを特定するため、Ｈ２Ｏ２濃度が１０ｍＭ、１．７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．０４６ｍＭ、０ ｍＭの条件で活性染色を行った（図７）。タバコＰＲＸや、他のＰｏＰＲＸアイソザイムは、Ｈ２Ｏ２濃度の減少に伴ってＰＲＸ活性が減少しているが、ｐＩ約４．５の酸性ＰＲＸは低Ｈ２Ｏ２濃度（０．０４６ｍＭ）下でも活性を維持していることから、ｐＩ約４．５の酸性ＰＲＸは高いＨ２Ｏ２親和性を有することがわかった。
【００６５】
２．ＰｏＰＲＸの遺伝子単離
これまでの解析結果から、ポーチュラカは、Ｈ２Ｏ２との親和性が高いＰＲＸアイソザイムを有することがわかった。そこで次に、ＰｏＰＲＸの各アイソザイムをコードする遺伝子を取得し、それぞれのＰｏＰＲＸアイソザイムの機能解析を行った。ｃＤＮＡを単離する方法として、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を用いた。
【００６６】
第一段階である３′ＲＡＣＥ法では、種々のＰＲＸ遺伝子間に高度に保存された遠位ヒスチジン領域に相当する塩基配列を、遺伝子特異的プライマーとして使用した（図３，表２）。根から調製したＲＮＡを鋳型として３′ＲＡＣＥ法を行ったところ、５種類のＰＲＸ遺伝子断片ＰｏＰＲＸ１〜ＰｏＰＲＸ５が得られた。続いて、５′ＲＡＣＥ法により各ＰｏＰＲＸのｃＤＮＡ５’側の塩基配列情報を取得した（図４，表１）。根から調製したＲＮＡをＧＳＰで逆転写し、Ｓ ＰｒｉｍｅｒとＡＳ ＰｒｉｍｅｒでＰＣＲした。
【００６７】
得られたｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を図８Ａ〜８Ｅに記す。また、各ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列とセイヨウワサビＰＲＸ Ｃ１ａアイソザイムのアミノ酸配列との相同性比較解析結果を図９に示す。各ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列中には、ＰＲＸの立体構造構築に必要なシステイン残基−８箇所と、ヘムとの結合に必要なヒスチジン残基−２箇所が保存されている。また、ＰＳＯＲＴ（ＷＷＷ Ｓｅｒｖｅｒ；ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ）を用いて解析を行ったところ、いずれのＰｏＰＲＸにも分泌シグナルペプチドが存在することが確認された。また、小胞輸送経路に入ったタンパク質の一次配列上にＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘ；ＰまたはＱ以外のアミノ酸）という配列が存在するとＮ−結合型糖鎖の付加が行われるが、いずれのＰｏＰＲＸにもＮ結合型糖鎖付加配列が存在した。また、ＰｏＰＲＸ４および５は、Ｃ末端に液胞輸送シグナルを有すると推定された。ＰｏＰＲＸ２は、既知のＰＲＸよりもＮ末端のアミノ酸が多いことがわかった。また、遺伝子解析ソフトＧｅｎｅｔｙｘ（株式会社ゼネティックス）を用いて、各成熟型ＰｏＰＲＸの等電点を予測したところ、ＰｏＰＲＸ１，２および４が酸性アイソザイムであると予測された。各ＰｏＰＲＸの特徴は表３にまとめられる。
【００６８】
３．形質転換体ＢＹ２を用いたＰＯＰＲＸの酵素活性評価
【００６９】
（１）遺伝子組換えＢＹ２の作成
取得した各ＰＲＸを翻訳エンハンサーであるＡＤＨ ５’ＵＴＲ（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）と融合した。各ＡＤＨ５’ＵＴＲ融合ＰＲＸを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１に挿入し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターの間に連結した（図１１）。各コンストラクトをアグロバクテリウム法によりＢＹ２（タバコ培養細胞）に導入した。得られたカナマイシン耐性カルスから可溶性タンパク質を調製し、等電点電気泳動およびＰＲＸ活性染色を行って、クローン選抜を行った。その結果、ＰｏＰＲＸ１，２および４については各ＰＲＸに由来するバンドが確認された（図１２）ので、高発現クローン（ＰｏＰＲＸ１は＃１０，＃１３、ＰｏＰＲＸ２は＃５，＃８、ＰｏＰＲＸ４は＃３，＃１１）を液体培養にて継代培養した。ＰｏＰＲＸ３および５に関しては、導入したＰＲＸに特異的なバンドが検出できなかったので、今後の解析はＰＲＸ１、２および４を用いて行った。
【００７０】
（２）ＰｏＰＲＸのＨ２Ｏ２親和性評価
Ｈ２Ｏ２親和性を評価するため、各ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２細胞からタンパク質を調製し、等電点電気泳動で分離後、０．０５ｍＭおよび０．８ｍＭのＨ２Ｏ２濃度下でＰＲＸ活性染色を行った（図１３）。その結果、ＰｏＰＲＸ１およびＢＹ２内在性ＰＲＸは、Ｈ２Ｏ２濃度０．８ｍＭの方が０．０５ｍＭより明らかにバンドが濃いが、ＰｏＰＲＸ２および４は、Ｈ２Ｏ２濃度０．８ｍＭでのバンドの濃さとＨ２Ｏ２濃度０．０５ｍＭでのバンドの濃さはあまり変わらないことがわかった。このことから、ＰｏＰＲＸ２および４はＰｏＰＲＸ１およびＢＹ２内在性ＰＲＸ２と比べて高いＨ２Ｏ２親和性を有することが明らかになった。
【００７１】
４．組換えＰｏＰＲＸ２および４の過酸化水素Ｋｍ値の算出
ＰｏＰＲＸ２および４を分泌生産するＢＹ２細胞の培養液を、限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０，０００ ＭＷＣＯ，ミリポア）を用いて濃縮した後、Ｔｒｉｓバッファー（１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ６．０）へのバッファー交換を行った。陽イオン交換カラム（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサンプルを通し、ＢＹ２の内在性ＰＲＸ（塩基性アイソザイム）を除去して組換えＰｏＰＲＸ２および４を粗精製した（図１４Ａ、図１５Ａ）。これらのサンプルを用いて、異なる濃度の過酸化水素存在下で活性測定を行った（図１４Ｂ，図１５Ｂ）。また、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作成して、過酸化水素のＫｍ値を算出した。その結果、ＰｏＰＲＸ２は約０．７２ｍＭ、ＰｏＰＲＸ４は約１．２ｍＭの過酸化水素のＫｍ値を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のペルオキシダーゼは、低濃度の過酸化水素で活性を有するので、洗剤の漂白成分や生化学分析用の試薬などの様々な工業用途に極めて有用である。
【００７３】
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号１は、ＰｏＰＲＸ１の塩基配列を示す。
配列番号２は、ＰｏＰＲＸ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＰｏＰＲＸ２の塩基配列を示す。
配列番号４は、ＰｏＰＲＸ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＰｏＰＲＸ３の塩基配列を示す。
配列番号６は、ＰｏＰＲＸ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＰｏＰＲＸ４の塩基配列を示す。
配列番号８は、ＰｏＰＲＸ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＰｏＰＲＸ５の塩基配列を示す。
配列番号１０は、ＰｏＰＲＸ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１〜５８は、実施例で使用したプライマーの配列を示す。
配列番号５９は、ＰＲＸの遠位ヒスチジン領域のコンセンサス配列を示す。
配列番号６０は、ＨＲＰ Ｃ１ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、変異型ＰｏＰＲＸ２の塩基配列を示す。
配列番号６２は、変異型ＰｏＰＲＸ２のアミノ酸配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来の新規なペルオキシダーゼに関し、特に、低濃度の過酸化水素で活性を有するペルオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシダーゼは、動物界、植物界、微生物界に広く分布する酵素であり、過酸化水素の存在下で有機化合物を酸化する反応を触媒する酵素である。この性質を利用して、ペルオキシダーゼは、衣料用洗剤中の漂白成分や、ＥＬＩＳＡなどの生化学的分析法用の試薬に工業的に広く使用されている（特許文献１）。
【０００３】
このような工業的に使用されるペルオキシダーゼの場合、反応に必要な過酸化水素の濃度が低くて済むこと、つまり過酸化水素との親和性が高いことが望ましい。例えば、衣料用洗剤の場合、使用するペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性が高いほど、添加する過酸化水素量が少なくて済み、製造コストを低くすることができる。また、生化学的分析用の試薬の場合、使用するペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性が高いほど、併用できる抗体などの種類が増加し、分析対象の増大や分析感度の向上が期待できる。
【０００４】
しかしながら、従来、工業的に使用されているペルオキシダーゼはいずれも過酸化水素との親和性が低く、未だ改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２３４９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、過酸化水素との親和性が高く、低濃度の過酸化水素で活性を有するペルオキシダーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、様々な植物由来のペルオキシダーゼの過酸化水素との親和性について鋭意検討した結果、園芸植物のポーチュカ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）が生産するペルオキシダーゼの中に過酸化水素との親和性が高いものが二種類存在することを見出し、それらの塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の第一の側面によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
また、本発明の第一の側面によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１０】
本発明の第二の側面によれば、（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
また、本発明の第二の側面によれば、（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって提供される二種類のペルオキシダーゼは、いずれも過酸化水素との親和性が高く、低濃度の過酸化水素で活性を有するので、これらを使用した洗剤の製造コストの削減や生化学的分析の精度の向上をもたらすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で使用したプライマーを示す表１である。
【図２】ＰＲＸの遠位ヒスチジン領域の塩基配列を示す表２である。
【図３】３′ＲＡＣＥ法を示す。
【図４】５′ＲＡＣＥ法を示す。
【図５】ポーチュラカＰＲＸの発現パターンを示す。
【図６】ポーチュラカ根由来の過酸化水素高親和性ＰＲＸの解析を示す。
【図７】過酸化水素高親和性ＰＲＸの同定を示す。
【図８Ａ】ＰｏＰＲＸ１の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】ＰｏＰＲＸ２の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】ＰｏＰＲＸ３の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】ＰｏＰＲＸ４の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８Ｅ】ＰｏＰＲＸ５の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列解析を示す。
【図１０】各ＰｏＰＲＸの特徴を示す表３である。
【図１１】実施例３．（１）で作成した遺伝子構築物の構造を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２のスクリーニングを示す。
【図１２Ｄ−Ｅ】ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２のスクリーニングを示す。
【図１３】ＰｏＰＲＸのＨ２Ｏ２親和性評価を示す。
【図１４】組換えＰｏＰＲＸ２の過酸化水素親和性解析を示す。
【図１５】組換えＰｏＰＲＸ４の過酸化水素親和性解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の二種類のペルオキシダーゼを詳細に説明する。
第一のペルオキシダーゼは、（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、第二のペルオキシダーゼは、（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。これらは、いずれもスベリヒユ科の園芸植物であるポーチュラカが生産するペルオキシダーゼである。第一のペルオキシダーゼは、実施例で単離したＰｏＰＲＸ２に相当し、第二のペルオキシダーゼは、実施例で単離したＰｏＰＲＸ４に相当する。
【００１５】
本発明のペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で有機化合物を酸化する反応を触媒する点では従来公知のペルオキシダーゼと同様であるが、その最大の特徴は、従来公知のペルオキシダーゼに比べて低過酸化水素濃度でも反応を触媒することができる点にある。従来公知のペルオキシダーゼは、一般に２〜３ｍＭ程度の過酸化水素のミカエリス定数を有するため、４〜６ｍＭ程度の濃度の過酸化水素が触媒活性の最大反応速度を発揮するために必要であるが、本発明のペルオキシダーゼは、０．７ｍＭ程度の過酸化水素のミカエリス定数を有するため、１．４ｍＭ程度の低濃度の過酸化水素条件下でも触媒活性の最大反応速度を発揮することができる。
【００１６】
本発明は、（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記第一のペルオキシダーゼの遺伝子である。また、本発明は、（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは上記第二のペルオキシダーゼの遺伝子である。
【００１７】
本発明の第一のペルオキシダーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質も包含する。本発明の第二のペルオキシダーゼは、上記（ｅ）および（ｆ）のものに限定されず、（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、または（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質も包含する。例えば、本発明者らの研究によれば、配列番号４に記載のアミノ酸配列の２６１番目のアミノ酸（Ｃｙｓ残基）をＧｌｙ残基に置換しても、置換前のペルオキシダーゼと同様の過酸化水素のミカエリス定数（０．８７ｍＭ）を示すことが確認されている。この変異型ペルオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号６２に、塩基配列を配列番号６１にそれぞれ示す。
【００１８】
また、本発明の第一のペルオキシダーゼの遺伝子は、（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含する。本発明の第二のペルオキシダーゼの遺伝子は、（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のペルオキシダーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のペルオキシダーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
【００１９】
上記（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子および上記（ｇ）のタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ配列番号３または７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列またはその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号３もしくは７の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。
【００２１】
ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子がペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば、得られた遺伝子をタバコ植物細胞に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この酵素タンパク質を精製して過酸化水素の存在下で有機化合物に添加して酸化物の生成をクロマトグラフィーなどで測定することによって確認することができる。
【００２２】
また、上記（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子および上記（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号３または７に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子がペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子の場合と同様の方法で確認することができる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
【００２４】
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のペルオキシダーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物細胞などが挙げられ、より好ましくは高等植物細胞が挙げられ、特に好ましくはタバコ植物細胞が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
【００２５】
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のペルオキシダーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
【００２６】
形質転換体中に蓄積した本発明のペルオキシダーゼは、未精製のまま使用することができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２８】
材料および方法
１．使用植物、菌株、ベクター
（１）使用植物
Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ポーチュラカ）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ２（タバコ培養細胞）（以下、ＢＹ２と称する）
【００２９】
（２）使用菌株
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α ｄｅｏＲ，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋），
ｒｅｃＡ１，ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，
Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，φ８０ｌａｃＺΔＭ１５，
Ｆ−，λ−Ｍ１５，Ｆ−，λ−
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＥＨＡ１０５ Ｃｍｒ
ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ
ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ
ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎａｒｙ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ
【００３０】
（３）使用ベクター
Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ− ａｍｐｒ，ｌａｃＺ
ｐＵＣ１８ ａｎｄ １９ ａｍｐｒ，ｌａｃＺ
ｐＢＩ１２１ Ｋｍｒ
【００３１】
２．培地
（１）大腸菌用培地
（ｉ）ＬＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ
平板培地に、１５ｇ／ｌの精製寒天粉末を加えた。オートクレーブ後、必要に応じて、濾過滅菌した抗生物質（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）を加えた。
【００３２】
（ｉｉ）２×ＹＴ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ
平板培地に、１５ｇ／ｌの精製寒天粉末を加えた。オートクレーブ後、必要に応じて、濾過滅菌した抗生物質（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）を加えた。
【００３３】
（ｉｉｉ）ＳＯＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｉｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５８４ｇ／ｌ，ＫＣｌ ０．１８６ｇ／ｌ
オートクレーブ後、濾過滅菌した１Ｍ ＭｇＳＯ４，１Ｍ ＭｇＣｌ２を１ｌに対して１０ｍｌずつ加えた。
【００３４】
（２）植物体用培地
（ｉ）ＭＳ基本培地
必要に応じて植物ホルモンのＮＡＡおよびＢＡを以下に示す量だけ加え、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した後、３ｇ／ｌのゲランガムを加えた。オートクレーブ後、必要に応じてカルベニシリン２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｍｌを加えて用いた。
【００３５】
（ｉｉ）ＢＹ２用培地
ＫＯＨでｐＨ５．７に調整した後、オートクレーブして用いた。
平板培地を、ｐＨ５．７に調整した後、ゲランガム３ｇ／ｌを加えた。オートクレーブ後、必要に応じてカルベニシリン２５０ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌを加えて用いた。
【００３６】
（３）アグロバクテリウム用培地
（ｉ）ＹＥＢ培地
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ，Ｂｅａｆ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ／ｌ，Ｓｕｃｒｏｓｅ ５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブして用いた。必要に応じて、濾過滅菌したカナマイシン５０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｌを加えた。
【００３７】
（ｉｉ）ＹＥＰ培地
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブして用いた。
【００３８】
３．実験試薬
実験試薬は特に指定のない限り、和光純薬工業またはナカライテスクのものを用いた。制限酵素、修飾酵素は、東洋紡、タカラバイオ、ニッポンジーン、ファルマシア、シグマ、ＮＥＢ、またはＢＲＬのものをそれぞれの説明書に従って使用した。
【００３９】
４．大腸菌からのプラスミド調製
大腸菌からのプラスミドＤＮＡ調製は、添付のマニュアルに従い、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡）を用いて行った。
【００４０】
５．アガロースゲルを用いたＤＮＡの電気泳動
泳動ゲルは、ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒにアガロースゲルを融解させたものを使用した。試料にＧｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを１／１０量加え、ゲルのウェルに注入した。泳動装置は、Ｍｕｐｉｄ−α（コスモ・バイオ）を用い、１×ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ中、定電圧１００Ｖで行った。泳動後、エチジウムブロマイド０．５μｇ／ｍｌを含むＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ中でゲルを染色し、トランスイルミネーター上で観察した。
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒおよびＧｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの組成を以下に示す。
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．２５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ，０．２５％ Ｘｙｌｅｎｅ ｃｙａｎｏｌ，４０％（ｗ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
【００４１】
６．アガロースゲルからのＤＮＡの回収
目的のＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをメスで切り出し、エッペンドルフチューブに入れ、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、添付のプロトコールに従ってＤＮＡ断片を回収した。
【００４２】
７．大腸菌の形質転換
（１）コンピテントセルの調製
コンピテントセルは、Ｉｎｏｕｅらの方法（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）に従い調製した。大腸菌のシングルコロニーを５ｍｌのＬＢ培地に滅菌済みの楊枝を用いて植菌し、３７℃で１晩培養した。この大腸菌培養液のうち、２ｍｌを坂口フラスコ内の２００ｍｌのＳＯＢ培地に植菌し、６６０ｎｍにおける濁度が０．４−０．８になるまで室温で振盪培養した（２５−３０℃、２００ｒｐｍ）。培養液を氷中で５分間冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、冷却したＴＢ ｂｕｆｆｅｒを１／３量（６７ｍｌ）加えて穏やかに懸濁してから、１０分間氷中に静置した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、再び冷却したＴＢ ｂｕｆｆｅｒを１６ｍｌ加えて穏やかに懸濁した。続いて７％（約１．２ｍｌ）となるようにＤＭＳＯをゆっくり混ぜながら加えた後、１０分間氷中に静置した。氷上で１００μｌずつエッペンドルフチューブに分注し、直ちに液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
ＴＢ ｂｕｆｆｅｒの組成を以下に示す。
ＴＢ ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，１５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，
２５０ｍＭ ＫＣｌ，５５ｍＭ ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
【００４３】
（２）形質転換
コンピテントセルを氷中で解凍後、コンピテントセルの１／１０量以下（１−２０μｌ）のＤＮＡ溶液を加え、氷中に３０分間静置した。４２℃に３０秒間置き、直ちに氷中に戻して２分間静置した後５００μｌの２×ＹＴ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した。スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に広げ、３７℃で１晩培養した。
【００４４】
８．ＰＣＲ
ＰＣＲ反応は、ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）およびＰｈｕｓｉｏｎ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ）を用い、添付のプロトコールに従い、目的遺伝子が増幅する条件で行った。使用したプライマーを表１に示す。
【００４５】
９．ポーチュラカのペルオキシダーゼ（以下ＰＲＸと称する）遺伝子の単離
（１）ＲＮＡの調製
ポーチュラカ組織からのＲＮＡ抽出は、Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。ゲノムＤＮＡを除去するため、抽出したｔｏｔａｌＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ｔｏｔａｌＲＮＡ２５μｌ、１０×ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，６０ｍＭ ＭｇＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９）５μｌ、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／μｌ）２μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）１μｌ、滅菌したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水１７μｌを混合し、３７℃で３０分間、保温した。酵素を失活させるため、フェノールクロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を１回行った。エタノール沈殿を行い、沈殿を１０μｌの滅菌ＤＥＰＣ水に溶解した。
【００４６】
（２）ＲＮＡの電気泳動
調製したｔｏｔａｌＲＮＡが分解されていないかどうかを確認するため、電気泳動を行った。ＲＮＡサンプル５μｌにＲＮＡと等量のホルムアミドを加え、６５℃で５分間熱処理し、氷上で５分間静置した。Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを１／１０量、エチジウムブロマイド（５００ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ加えた。１％アガロースゲルおよびＴＡＥバッファーを用いて電気泳動を行った。
【００４７】
（３）３′ＲＡＣＥ法
種々のＰＲＸ遺伝子間に高度に保存された遠位ヒスチジン領域に相当する塩基配列を、遺伝子特異的プライマーとして使用した（表２）。ポーチュラカ根から調製したＲＮＡを出発材料として３′ＲＡＣＥ法（図３）を行った。なお、逆転写酵素として、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｄ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【００４８】
（４）塩基配列の決定
Ｂｉｇ Ｄｙｅ，Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、添付のプロトコールに従って反応を行った。蛍光シグナルの解析には、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた。
【００４９】
（５）５′ＲＡＣＥ法
３′ＲＡＣＥ法により明らかになった塩基配列情報を基に、５′末端にリン酸化修飾したＧｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ（ＧＳＰ）を設計した。ポーチュラカ根から調製したＲＮＡを出発材料として５′ＲＡＣＥ（図４）を行った。各ＰＲＸ遺伝子の増幅は、根から調製したＲＮＡをＧＳＰで逆転写し、Ｓ ＰｒｉｍｅｒとＡＳ ＰｒｉｍｅｒでＰＣＲすることにより行った。使用したＰｒｉｍｅｒは、表１に示している。
【００５０】
１０．ＲＴ−ＰＣＲ
ポーチュラカの各器官から調製したｃＤＮＡを鋳型にし、目的の遺伝子が増幅するＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｔと条件でＰＣＲを行った。また、内部標準としてユビキチン遺伝子の特異的プライマーを用いた。
【００５１】
１１．遺伝子構築物の作成
各ＰＲＸ遺伝子を発現させるための構築物を作成した。翻訳エンハンサーであるＡＤＨ ５’ＵＴＲ（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）をＮｔＡＤＨ−Ｆ ｐｒｉｍｅｒとＡＤＨ−ＮｓｉＩ−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを用いて増幅し、末端を平滑化した後、ｐＵＣ １１８のＨｉｎｃＩＩギャップに挿入した。得られたプラスミドをＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切断した後、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）で平滑化し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。各ＰＲＸ遺伝子ＯＲＦを、表１に示す各ＯＲＦ−ＦプライマーおよびＯＲＦ−Ｒプライマーを用いて増幅し、末端を平滑化した上記ベクターに挿入してＡＤＨ ５’ＵＴＲと各ＰＲＸのＯＲＦを融合した。各ＡＤＨ ５’ＵＴＲ融合ＰＲＸを、ＸｂａＩとＳａｃＩを用いてｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に挿入し、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターに連結した。
【００５２】
１２．植物培養細胞の形質転換
（１）アグロバクテリウムの形質転換
（ｉ）コンピテントセルの作製
アグロバクテリウムの単一コロニーを５ｍｌのＹＥＢ培地に植菌し、２８℃で１晩振盪培養した。この培養液を、５００ｍｌのＹＥＰ培地に植菌し、６００ｎｍにおける濁度が０．５になるまで２８℃で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため５００ｍｌの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＬＡ−１０，５００ローター）により集菌して上清を捨てた。この操作を２回繰り返した後、沈殿に２０ｍｌの冷却した滅菌１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて懸濁した。ナルゲンチューブに移し遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃ ＢＥＣＫＭＡＮ ＪＡ−２０ローター）により集菌して上清を捨てた。沈殿に３ｍｌの冷却した滅菌１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて懸濁し、４０μｌずつエッペンドルフチューブに分注して、液体窒素で凍結させてから−８０℃で保存した。
【００５３】
（ｉｉ）形質転換
コンピテントセルを氷中で解凍した後、１〜２μｌのＤＮＡ溶液を加え、氷令した２ｍｍキュベットに移した。エレクトロポレーター（ＢＩＯ ＲＡＤ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）により電気パルス（２．５ＫＶ、２５μＦ、４００Ω）を与え、ＤＮＡを導入した。１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、２８℃で１時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に広げ、２８℃で２晩培養した。
【００５４】
（２）タバコ培養細胞の形質転換
ＢＹ２細胞の形質転換は、Ａｎ（Ａｎ，１９８５）の方法に従って行った。カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含む５ｍｌのＬＢ培地で２８℃、２晩培養したアグロバテリウム培養液１００μｌと、培養４日目のタバコ培養細胞懸濁液５−１０ｍｌをシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃で２晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を１５ｍｌの遠心管に移して遠心（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＧＳ−６ＫＲ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上清を取り除いた。新しい改変ＬＳ培地を入れて遠心分離（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃；ＢＥＣＫＭＡＮ ＧＳ−６ＫＲ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、細胞を洗浄した。この操作を４回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞をカナマイシン１００ｍｇ／ｌの入った改変ＬＳ寒天培地に播種し、２５℃で暗黒下に静置して培養した。約２−３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。カナマイシン１００ｍｇ／ｌを加えた改変ＬＳ培地３０ｍｌ移し、継代培養を行った。
【００５５】
１３．タンパク質の調製
（１）ポーチュラカタンパク質サンプルの調製
無菌培養したポーチュラカの各器官（根、茎、葉、花）を液体窒素で冷やしながら乳鉢で粉末状にし、湿重量１ｇあたり１ｍｌの抽出バッファーを添加した。ボルテックスした後、氷上に２０分間静置した。１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０分間遠心し、上清を回収した。
抽出バッファーの組成を以下に示す。
抽出バッファー；１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ６．０ ａｔ２０℃
【００５６】
（２）ＢＹ２細胞タンパク質サンプルの調製
ろ紙を用いて培養液と細胞を分離した。細胞８ｇに２０ｍｌの抽出バッファーを添加し、氷上で超音波破砕（１０秒間ＯＮ／１０秒間ＯＦＦ、Ｔｏｔａｌ ８分間）し、９，０００ｒｐｍ，４℃で３０分間遠心し、回収した上清をサンプルとした。
【００５７】
（３）培養液タンパク質のサンプルの調製
ポーチュラカの水耕培養液およびＢＹ２細胞の培養液を、９，０００ｒｐｍ，４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。限外濾過カラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ＭＷＣＯ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に回収した上清を入れ、９，０００ｒｐｍ，４℃で９０分間遠心し濃縮し、培養液サンプルとした。
【００５８】
（４）タンパク質の定量
タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）に従って行った。適当量の水で希釈したタンパク質溶液１０μｌとタンパク質定量試薬５００μｌを４８ウェルプレートに入れてよく混合し、Ａｂｓ ５９５ｎｍでの吸光度を測定した。Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を用いて検量線を作成し、これに基づいてサンプルのタンパク質濃度を求めた。
【００５９】
１４．ＰＲＸの解析
（１）等電点電気泳動
ＢＩＯ−ＲＡＤのモデル１１１ミニセルを用いて行った。ＰＡＧＥゲルサポートフィルムの疎水面をガラスプレートに密着させた後、キャスティングプレートにのせた。モノマー−アンフォライト溶液および触媒溶液を混合し、サポートフィルムとキャスティングプレートのすき間に流し込み、蛍光灯光下で４５分間重合させた。作製したゲルに試料および、ＩＥＦスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１６１−０３１０）を塗布した。泳動槽の電極を蒸留水で湿らせ、ゲル面を下にしてセットした。定電圧で、１００Ｖ １５分間、２００Ｖ １５分間、４５０Ｖ ６０分間泳動した。
モノマー−アンフォライト溶液および触媒溶液の組成を以下に示す。
モノマー−アンフォライト溶液（ゲル一枚分）：
ｄＨ２Ｏ ２．７５ｍｌ
２４．２５％（ｗ／ｖ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ− １．０ｍｌ
０．７５％（Ｗ／Ｖ）ｂｉｓ
２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １．０ｍｌ
Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ ３／１０ Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ，４０％ ０．２５ｍｌ
（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１６３−１１１２）
触媒溶液：
１０％（ｗ／ｖ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ２７．５μｌ
ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ
０．１％（ｗ／ｖ）ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ− ２５．０μｌ
５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＴＥＭＥＤ １．５μｌ
【００６０】
（２）ペルオキシダーゼ活性染色
等電点電気泳動後のゲルを活性染色液に浸し、過酸化水素の濃度を適宜変えて加え、室温で軽く振とうした。バンドを確認後、蒸留水ですすぎ、ハイブリバックに入れゲルをスキャニングした。
活性染色溶液の組成を以下に示す。
活性染色溶液：
Ａ液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ
Ｂ液：０．３％（ｗ／ｖ）４−クロロ−１−ナフトール，８５％（ｖ／ｖ）メタノール
使用直前に、Ａ液とＢ液を４：１の割合で混合し活性染色溶液とした。
【００６１】
（３）ＰＲＸ活性測定
ピロガロールの酸化によって生じるプルプロガリン（４２０ｎｍに吸収極大を持つ）を、ＤＵ６４０ ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて定量し、ＰＲＸ活性を測定した。溶液１Ｕの定義はｐＨ６．０、２０℃において２０秒間でピロガロールから１ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量とする。下記の反応溶液を混合した後、４２０ｎｍの吸光度を３０秒間隔で１０分間測定した。また、過酸化水素の終濃度が１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭの条件で測定を行い、ミカエリス定数（Ｋｍ値）を算出した。
反応溶液
１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０ ａｔ２０℃） ０．３２ｍｌ
５．０％ピロガロール ０．３２ｍｌ
過酸化水素 ０．１６ｍｌ
ＰＲＸ溶液（ｉｎ １００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｍｌ
ｐＨ６．０ ａｔ２０℃）
Ｄ．Ｗ． ２．１ｍｌ
【００６２】
実験
１．ポーチュラカＰＲＸ（以下ＰｏＰＲＸと称する）の特徴づけ
（１）ポーチュラカにおけるＰＲＸの発現解析
ＰｏＰＲＸの基礎的知見を得るために、等電点電気泳動およびＰＲＸ活性染色によってポーチュラカの根・茎・葉・花における発現パターン解析を行った（図５）。複数のバンド（根−６個）が存在した（図５のＡ）。根特異的発現を示す中性アイソザイムが存在することがわかった。また、ポーチュラカを無菌水耕培養し、培地に分泌されたＰＲＸを調べたところ、培地中に、分泌されている主なアイソザイムは、約４．５のｐＩを有する酸性アイソザイムであることがわかった（図５のＢ）。
【００６３】
（２）ＰｏＰＲＸの活性測定
ポーチュラカの根から分泌されるＰＲＸがＨ２Ｏ２高親和性であるかどうかを確認するために、ピロガロールを用いた酵素活性測定を行った。異なるＨ２Ｏ２濃度条件下で活性測定を行い、ミカエリス定数（Ｋｍ値）を算出した（図６）。その結果、ピロガロールの酸化重合反応におけるＨ２Ｏ２のＫｍ値は約０．６９ｍＭであることがわかった。
【００６４】
（３）Ｈ２Ｏ２高親和性ＰＲＸの同定
ポーチュラカの根においてＨ２Ｏ２に対する高い親和性を有するＰＲＸアイソザイムを特定するため、Ｈ２Ｏ２濃度が１０ｍＭ、１．７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．０４６ｍＭ、０ ｍＭの条件で活性染色を行った（図７）。タバコＰＲＸや、他のＰｏＰＲＸアイソザイムは、Ｈ２Ｏ２濃度の減少に伴ってＰＲＸ活性が減少しているが、ｐＩ約４．５の酸性ＰＲＸは低Ｈ２Ｏ２濃度（０．０４６ｍＭ）下でも活性を維持していることから、ｐＩ約４．５の酸性ＰＲＸは高いＨ２Ｏ２親和性を有することがわかった。
【００６５】
２．ＰｏＰＲＸの遺伝子単離
これまでの解析結果から、ポーチュラカは、Ｈ２Ｏ２との親和性が高いＰＲＸアイソザイムを有することがわかった。そこで次に、ＰｏＰＲＸの各アイソザイムをコードする遺伝子を取得し、それぞれのＰｏＰＲＸアイソザイムの機能解析を行った。ｃＤＮＡを単離する方法として、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を用いた。
【００６６】
第一段階である３′ＲＡＣＥ法では、種々のＰＲＸ遺伝子間に高度に保存された遠位ヒスチジン領域に相当する塩基配列を、遺伝子特異的プライマーとして使用した（図３，表２）。根から調製したＲＮＡを鋳型として３′ＲＡＣＥ法を行ったところ、５種類のＰＲＸ遺伝子断片ＰｏＰＲＸ１〜ＰｏＰＲＸ５が得られた。続いて、５′ＲＡＣＥ法により各ＰｏＰＲＸのｃＤＮＡ５’側の塩基配列情報を取得した（図４，表１）。根から調製したＲＮＡをＧＳＰで逆転写し、Ｓ ＰｒｉｍｅｒとＡＳ ＰｒｉｍｅｒでＰＣＲした。
【００６７】
得られたｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を図８Ａ〜８Ｅに記す。また、各ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列とセイヨウワサビＰＲＸ Ｃ１ａアイソザイムのアミノ酸配列との相同性比較解析結果を図９に示す。各ＰｏＰＲＸのアミノ酸配列中には、ＰＲＸの立体構造構築に必要なシステイン残基−８箇所と、ヘムとの結合に必要なヒスチジン残基−２箇所が保存されている。また、ＰＳＯＲＴ（ＷＷＷ Ｓｅｒｖｅｒ；ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ）を用いて解析を行ったところ、いずれのＰｏＰＲＸにも分泌シグナルペプチドが存在することが確認された。また、小胞輸送経路に入ったタンパク質の一次配列上にＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘ；ＰまたはＱ以外のアミノ酸）という配列が存在するとＮ−結合型糖鎖の付加が行われるが、いずれのＰｏＰＲＸにもＮ結合型糖鎖付加配列が存在した。また、ＰｏＰＲＸ４および５は、Ｃ末端に液胞輸送シグナルを有すると推定された。ＰｏＰＲＸ２は、既知のＰＲＸよりもＮ末端のアミノ酸が多いことがわかった。また、遺伝子解析ソフトＧｅｎｅｔｙｘ（株式会社ゼネティックス）を用いて、各成熟型ＰｏＰＲＸの等電点を予測したところ、ＰｏＰＲＸ１，２および４が酸性アイソザイムであると予測された。各ＰｏＰＲＸの特徴は表３にまとめられる。
【００６８】
３．形質転換体ＢＹ２を用いたＰＯＰＲＸの酵素活性評価
【００６９】
（１）遺伝子組換えＢＹ２の作成
取得した各ＰＲＸを翻訳エンハンサーであるＡＤＨ ５’ＵＴＲ（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）と融合した。各ＡＤＨ５’ＵＴＲ融合ＰＲＸを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１に挿入し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターの間に連結した（図１１）。各コンストラクトをアグロバクテリウム法によりＢＹ２（タバコ培養細胞）に導入した。得られたカナマイシン耐性カルスから可溶性タンパク質を調製し、等電点電気泳動およびＰＲＸ活性染色を行って、クローン選抜を行った。その結果、ＰｏＰＲＸ１，２および４については各ＰＲＸに由来するバンドが確認された（図１２）ので、高発現クローン（ＰｏＰＲＸ１は＃１０，＃１３、ＰｏＰＲＸ２は＃５，＃８、ＰｏＰＲＸ４は＃３，＃１１）を液体培養にて継代培養した。ＰｏＰＲＸ３および５に関しては、導入したＰＲＸに特異的なバンドが検出できなかったので、今後の解析はＰＲＸ１、２および４を用いて行った。
【００７０】
（２）ＰｏＰＲＸのＨ２Ｏ２親和性評価
Ｈ２Ｏ２親和性を評価するため、各ＰｏＰＲＸ発現ＢＹ２細胞からタンパク質を調製し、等電点電気泳動で分離後、０．０５ｍＭおよび０．８ｍＭのＨ２Ｏ２濃度下でＰＲＸ活性染色を行った（図１３）。その結果、ＰｏＰＲＸ１およびＢＹ２内在性ＰＲＸは、Ｈ２Ｏ２濃度０．８ｍＭの方が０．０５ｍＭより明らかにバンドが濃いが、ＰｏＰＲＸ２および４は、Ｈ２Ｏ２濃度０．８ｍＭでのバンドの濃さとＨ２Ｏ２濃度０．０５ｍＭでのバンドの濃さはあまり変わらないことがわかった。このことから、ＰｏＰＲＸ２および４はＰｏＰＲＸ１およびＢＹ２内在性ＰＲＸ２と比べて高いＨ２Ｏ２親和性を有することが明らかになった。
【００７１】
４．組換えＰｏＰＲＸ２および４の過酸化水素Ｋｍ値の算出
ＰｏＰＲＸ２および４を分泌生産するＢＹ２細胞の培養液を、限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０，０００ ＭＷＣＯ，ミリポア）を用いて濃縮した後、Ｔｒｉｓバッファー（１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ６．０）へのバッファー交換を行った。陽イオン交換カラム（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサンプルを通し、ＢＹ２の内在性ＰＲＸ（塩基性アイソザイム）を除去して組換えＰｏＰＲＸ２および４を粗精製した（図１４Ａ、図１５Ａ）。これらのサンプルを用いて、異なる濃度の過酸化水素存在下で活性測定を行った（図１４Ｂ，図１５Ｂ）。また、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作成して、過酸化水素のＫｍ値を算出した。その結果、ＰｏＰＲＸ２は約０．７２ｍＭ、ＰｏＰＲＸ４は約１．２ｍＭの過酸化水素のＫｍ値を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のペルオキシダーゼは、低濃度の過酸化水素で活性を有するので、洗剤の漂白成分や生化学分析用の試薬などの様々な工業用途に極めて有用である。
【００７３】
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号１は、ＰｏＰＲＸ１の塩基配列を示す。
配列番号２は、ＰｏＰＲＸ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＰｏＰＲＸ２の塩基配列を示す。
配列番号４は、ＰｏＰＲＸ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＰｏＰＲＸ３の塩基配列を示す。
配列番号６は、ＰｏＰＲＸ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＰｏＰＲＸ４の塩基配列を示す。
配列番号８は、ＰｏＰＲＸ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＰｏＰＲＸ５の塩基配列を示す。
配列番号１０は、ＰｏＰＲＸ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１〜５８は、実施例で使用したプライマーの配列を示す。
配列番号５９は、ＰＲＸの遠位ヒスチジン領域のコンセンサス配列を示す。
配列番号６０は、ＨＲＰ Ｃ１ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、変異型ＰｏＰＲＸ２の塩基配列を示す。
配列番号６２は、変異型ＰｏＰＲＸ２のアミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれか一つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２Ａ−Ｃ】
【図１２Ｄ−Ｅ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２Ａ−Ｃ】
【図１２Ｄ−Ｅ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−１８３８７２（Ｐ２０１０−１８３８７２Ａ）
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３００４８（Ｐ２００９−３００４８）
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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