新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法。
【課題】 新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法を提供する。
【解決手段】 ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物である光活性化生理活性物質、３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍ波長の光を使用する当該光活性化生理活性物質の光活性化方法、一重項酸素のラジカル消去剤を使用する当該光活性化生理活性物質の活性阻害方法、および当該光活性化生理活性物質を使用する光線力学療法。
【解決手段】 ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物である光活性化生理活性物質、３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍ波長の光を使用する当該光活性化生理活性物質の光活性化方法、一重項酸素のラジカル消去剤を使用する当該光活性化生理活性物質の活性阻害方法、および当該光活性化生理活性物質を使用する光線力学療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法に関し、詳しくは可視光線によって活性化する光活性化生理活性物質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光線力学療法（PDT:photodynamic therapy）は光で活性が誘導される光活性化生理活性物質を利用した治療法であり、単独では何ら活性を持たない光活性化生理活性物質とその励起光の組み合わせにより行う、選択性に優れた治療法である。光線力学療法は腫瘍組織に対する選択的治療の他、ニキビなどの皮膚疾患及び表在性の種々の疾患の治療に利用されている。
【０００３】
光線力学療法の歴史は古く、１９０３年にＴａｐｐｅｉｎｅｒらによって、エオジン色素と太陽光およびランプ光にて、腫瘍が壊死したと報告されている。それ以来、現在に至るまで光線力学療法の新たな応用と利用できる光活性化生理活性物質の開発が行なわれているが、これまでに見出されている光活性化生理活性物質のほとんどがポルフィリン誘導体あるいはその前駆物質である（特許文献１〜２）。光線力学療法は選択性に優れ、副作用が少ない等の利点を有している。また、利用する光も比較的安全な可視光線であり、紫外線のように皮膚に障害を起こす心配もない。
【特許文献１】特開平９−２５５６８２号公報
【特許文献２】特開平１１−２９５７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、光線力学療法の更なる有効性の追求には、利用できる光活性化生理活性物質の発見開発が必要である。
【０００５】
そこで本発明の目的は、新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、赤潮プランクトンであるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ（Heterocapsa circularisquama）の培養物をアルコール抽出物、更には種々のクロマトグラフィーにより精製された該抽出物が可視光線によって活性化し、溶血および細胞毒性等の生理活性を実現することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の光活性化生理活性物質はヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物であることを特徴とするものである。好ましくは、前記抽出物がメタノールにより抽出された抽出物であり、また、ゲルクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーからなる群のうち少なくとも一つを用い精製を行った光活性化生理活性物質である。更に好ましくは、分子量が５８６または６０２である光活性化生理活性物質である。
【０００８】
また、本発明の光活性化生理活性物質の光活性化方法は３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍの波長の光を使用することを特徴とするものである。更に、本発明の上記光活性化生理活性物質の活性阻害方法は一重項酸素のラジカル消去剤を使用することを特徴とするものである。なお、一重項酸素のラジカル消去剤はヒスチジンを好適に使用することができる。更にまた、本発明の光線力学療法は上記本発明の光活性化生理活性物質を使用することを特徴とするものである。
【０００９】
なお、本発明の光活性化生理活性物質を生成する赤潮プランクトンであるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマはカキなどの二枚貝に対して強い毒性を発現することが知られている。ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは１９８８年高知県浦の内湾で発見され、分類学上の位置づけは以下の通りである。
【００１０】
門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）：渦鞭毛植物門（ＤＩＮＯＰＨＹＴＡ）
網（ｃｌａｓｓ）：渦鞭毛藻網（ＤＩＮＯＰＨＹＣＥＡＥ）
目（ｏｒｄｅｒ）：ペリディニウム目（ＰＥＲＩＤＥＮＡＬＥＳ）
科（ｆａｍｉｌｙ）：ペリディニウム科（ＰＥＲＩＤＩＮＩＡＣＥＡＥ）
属（ｇｅｎｕｓ）：ヘトロカプサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ）
【００１１】
細胞は洋梨型で、大きさは２０．０μｍ〜２８．８μｍ、幅は１３．８μｍ〜２０．０μｍである。細胞の外形はほぼ中央部を走る構造で円錐形の上殻と半球状の下殻とに分かれている。
【００１２】
渦鞭毛藻網のペリディニウム目に属する種類では、細胞表面がセルロース質の鎧板で覆われており、鎧板の上には丸い鱗片がびっしりとあり、細胞内にはピレノイドにつながった葉緑体を１個有し、楕円形で大きな核は細胞の左側に位置する。本種は、細胞鱗片の有無と形状、鎧板配列、核の形と位置、細胞外形などの特徴の組み合わせで比較的簡単に本邦周辺海域に分布する同属の他種から区別できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の光活性化生理活性物質は、比較的低分子化合物で、熱安定性にもすぐれ、光非存在下では全く活性は示さないが、可視光線によって活性化し、溶血やＨｅＬａ細胞（ヒト癌細胞）等に対する強い細胞毒性等の生理活性を実現し、光線力学療法にも有効である。その作用は光によって完全にコントロール可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態につき、具体的に説明する。
本発明の光活性化生理活性物質の生成に使用するヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養に使用する培地は、好ましくは海水を主体とした一般的な海洋性プランクトン用培地であり、より好ましくは、ＥＳＭ（Erd-Schreiber modified）培地である。また、培養の条件としては、光照射は好ましくは３０００〜６０００ルックスであり、より好ましくは４０００ルックス程度である。また、温度に関しては好ましくは２４〜２８℃であり、より好ましくは２７℃程度である。培養時間は培養条件により適宜決定することとなるが、好ましくは、３〜７日間である。
【００１５】
本発明の光活性化生理活性物質のヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物からの抽出方法は特に制限されるものではないが、培養物を抽出遠心分離によりプランクトン細胞を回収し、得られた細胞から溶媒により抽出することができる。この際、用いる溶媒としては親水性を有するものであり、エタノールおよびメタノールを好適に用いることができ、特に好ましくはメタノールである。なお、抽出する際、超音波処理を行うことがより好ましい。
【００１６】
得られた抽出物の精製方法は特に制限されるものではないが、不溶物を除去後、ゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を好適に用いることができる。各種クロマトグラフィーは市販のものにより、定法に従い精製することができる。なお、精製物を高純度にするためには、上記クロマトグラフィーを上記記載順に順次使用し、精製することが好ましい。ゲルクロマトグラフィーはSephadex LH-20を好適に使用できる。ＨＰＬＣによる精製を複数回行うことより、純度を高めることが可能であり、分子量５８６および６０２の化合物を得ることができる。
【００１７】
次に、本発明の光活性化方法は３５０〜５００ｎｍ、好ましくは４５０ｎｍ程度、または５７５〜６５０ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ程度の波長の光を使用し、前記本発明の光活性化生理活性物質を活性化するものである。ここで、前記分子量６０２の化合物の光活性化には、３５０〜４８０ｎｍ、好ましくは４２０ｎｍ程度の波長の光を使用することができる。
【００１８】
また、本発明の光活性化生理活性物質の活性阻害方法は、一重項酸素のラジカル消去剤を使用するものであるが、使用する一重項酸素のラジカル消去剤としてはヒスチジンを好適に使用することができる。これにより、本発明の光活性化生理活性物質は、光照射により、一重項酸素を産生していることが示唆される。
【００１９】
更に、本発明の光線力学療法は上記本発明の光活性化生理活性物質を使用するものであり、腫瘍組織に対する選択的治療の他、ニキビなどの皮膚疾患及び表在性の種々の疾患の治療に利用することが可能となる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明を行う。
ＥＳＭ培地の調製
ＥＳＭ（Ｅｒｄ−Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）培地の調製は、先ず、天然海水１０００ｍＬに対しＮａＮＯ3を１２０ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｂ1、１ｍｇ／ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｂ12、０．１ｍｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ、２６ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）、３３ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ−Ｍｎ（ＩＩ）を夫々１０μＬ、Ｔｒｉｓを１ｇ加えた後、Ｋ2ＨＰＯ4を５ｍｇ加えた。次に５ＮのＨＣｌ溶液でｐＨを８．２付近に調整し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、１０００ｍＬサンボトルに移し入れオートクレーブ（１２１℃、１５分間）で処理しＥＳＭ培地とした。
【００２１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養
三重県英虞湾で採取されたヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを用い、培養温度は２６℃、照明は白色蛍光灯を用い、照度は３０００ルックスとし、照明時間は１２時間明期１２時間暗期のサイクルで培養を行った（三洋電機メディカシステム（株）製グロースキャビネット ＭＬＲ−３５０Ｈ）。培養は耐熱性の１００ｍＬフラスコを用い、通気性のシリコン栓をしてオートクレーブ（１２１℃、１５分間）で処理した後、乾燥させて使用した。先ず、フラスコに５０ｍＬずつＥＳＭ培地を無菌的に分注した。培地へのヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの植え付け方法は、約２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞浮遊液１ｍＬをピペットを用いて無菌的に植え継いだ。なお、この際、培地を２６℃に保った。
【００２２】
溶血活性試験
本発明における溶血活性試験は以下の手順に従い行った。丸底９６ｗｅｌｌプレートを用い、ピペッティングによる２段階希釈をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で行い、試料に濃度勾配をつけたものを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ用意した。そしてＰＢＳで４％に調整したウサギ赤血球（日本バイオテスト研究所製）を５０μＬずつ加えた。なお、血液は、先ず余分な血清蛋白等を除去するためにＰＢＳで遠心分離にて充分洗浄を行った。このプレートを、グロースキャビネットの中（３０００または４０００ルックス、２６℃）に静置し、３〜５時間後に、４℃にて２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清７０μＬを平底９６ｗｅｌｌプレートに移した。常法によりマイクロプレートリーダー（５７０ｎｍの吸光度）により溶血活性を測定した。なお、光照射を行わない実施例はアルミホイルで遮光処理を行った。また、溶血活性を測定する際、ＰＢＳのみを０％溶血、最終濃度１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたものを１００％溶血の指標とした。その他の物は相対度数で溶血活性を表した。試料によっては、試料を溶解させている溶媒を最終濃度１％に調整しコントロールとして用いた場合もある。
【００２３】
α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地の調製
細胞培養に用いた培地であるα−ＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Alpha Modified Eagles Medium）の調製はオートクレーブ（１２１℃、１５分間）後、室温に戻した超純水にα−ＭＥＭ粉末（ＩＣＮ社製）を溶解させ、核酸・抗生物質を加え、濾過滅菌（０．２２μｍ）した。なお、組成は、α−ＭＥＭを一箱、チミジン、シチジン塩酸塩、アデノシン、グタノシンを夫々１０ｍｇ、ベンジルペニシリンカリウム、硫酸ストレプトマイシンを夫々１００ｍｇ、炭酸水素ナトリウムを２ｇ、純水１０００ｍＬである。また、このα−ＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍに５６℃で３０分間熱処理（補体不活化）した牛胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものをＧｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）とした。
【００２４】
細胞（ＨｅＬａ、Ｌ９２９、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、ＸＣ、ＭＤＣＫ）の培養
実験に用いた細胞は、ＭＤＣＫ（イヌの腎臓由来細胞）、Ｌ９２９（マウス由来マクロファージ細胞）、ＸＣ細胞（ラットの癌細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒトの子宮癌由来細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの子宮由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サルの腎臓由来細胞）であり、細胞はすべてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入したものを使用した。細胞の培養法は、先ず、最終濃度で１０％ジメチルスルホキシドおよび１０％ＦＣＳが加えられたα−ＭＥＭで−８０℃凍結保存されているセラムチューブ中の１．５ｍＬ細胞懸濁液を滅菌ピペットで１５ｍＬ滅菌チューブに移した。このチューブにα−ＭＥＭを加え、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心をした。その上清をアスピレーターで除き、新しい培地を５ｍＬ加え細胞を分散させ、培養フラスコ（２５ｃｍ3）全体に広げた後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養を行った。２４時間後、細菌等の混入がないこと、細胞がフラスコの底に付着していることを確認して培地交換あるいは継代培養を行った。継代培養法は、フラスコ中の培養液をアスピレーターで取り除き０．２％トリプシン・０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液を５ｍＬ培養フラスコに入れ密栓し、室温で約１分間静置後、フラスコ中の溶液を取り除き３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで２分間静置した。その後、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳでピペティッングし、細胞をフラスコ底面からはがした。その細胞を新しいフラスコに移し培養した。なお、細胞の保存は、凍結保存法を用いた。細胞を培養フラスコよりはがし、あらかじめ１０％ジメチルスルホキシドを含むα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに細胞を懸濁させたものを約１．５ｍＬセラムチューブに入れ−８０℃で保存した。
【００２５】
細胞毒性試験
２４ｗｅｌｌプレートを用意し、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・０．５ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞をプレートへ０．５ｍＬずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターに静置し、細胞がプレートに付着するまで培養した。なお、プレートの中に細胞を入れると一カ所に集まるため軽く攪拌を行った。細胞数を計算するには、血球計算版（ＫＡＹＡＧＡＫＩ社製 ＥＫＤＳ・Ｂｒｉｇｈｔ−ｌｉｎｅ）を用いた。α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳをアスピレーターで取り除き、１．０μｇ／ｍＬに調整した試料と交換した。ピペッティングによる２段階あるいは３段階希釈をＰＢＳで行い、試料に濃度勾配をつけたものを４００μＬ／ｗｅｌｌずつ用意した。
【００２６】
プランクトンを培養している人工培養機の中に静置し、光処理を行った。３０分後、ＰＢＳをアスピレーターで取り除き、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを０．５ｍＬずつ入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置し、コロニーが形成されるまで３、４日間培養した。コロニー形成を確認した後、培地を捨て１％メチレンブルーを含む５０％メタノールを加え１０分間静置した。その後、染色液を洗い流し、染色されたＨｅＬａ細胞のコロニー数を数えた。カウントは目視で行い、試料を入れてないものの値をコントロール（１００％）とし、試料処理した場合の値を相対度数で表した。なお、４８ｗｅｌｌプレートを用いた場合は、細胞数１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・０．２ ｍＬで利用し、操作は同様の手順で行った。
【００２７】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞からのメタノール抽出法
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの細胞が約２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの状態になった時に、１７５ｍＬファルコンチューブを使用し、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを培養液と一緒に４℃にて３，５００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て、ピペッティングを行い、１．５ｍＬのエッペンチューブに回収した。それを、４℃にて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、アスピレーターを用い、完全に上清を取り除いた。そこへ細胞浮遊液から得られた細胞ペレットに対し、１．５ｍＬの割合でメタノールを加え、常温で１分間、ソニケーションにて細胞を破壊する。それを４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を粗抽出液とした。十分に抽出できない場合はさらにメタノールを加え、同様の操作を行った。粗抽出液の保存はエッペンチューブに入れたまま、冷凍庫に保管した。
【００２８】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）
５０ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０をメタノールの中に入れ、３時間放置して膨潤させた。この間に溶液を攪拌してデカンテーションにより、微細な粒子をすべて取り除いた。それを真空デシケーターの中に入れ、気泡を取り除き、ゲル懸濁液をカラム（３００×１５ｍｍ）に注ぎ入れ、懸濁液がゆっくりと流れるようにしながら重力でゲルが沈殿するのに任せ、ゲルのカラムを作った。カラム内に気泡が入らないようにするために、ゲル量に比して２〜３倍量のメタノール（溶媒）を用いた。メタノール抽出物をカラムの上に加え、メタノールで溶出した。溶出液は１〜２．０ｍＬ／ｔｕｂｅにて分取した。この実験の操作は全て低温室にて行った。なお、各試験管について、吸光度（分光光度計Ｕ−２００１を使用）と溶血活性（メタノールの最終濃度１．０％）を測定した。
【００２９】
ＧＣ後の画分の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
本実施例おいては上昇法による一次元展開により行った。展開槽に６０〜１００ｍＬの溶媒（クロロホルム：メタノール＝６：１）を入れ、１２時間放置し、槽内の溶媒蒸気を平衡にした。キャピラリーに試料（ＧＣで得られた画分）を取り、試料を薄層プレート（シリカゲル）にスポットした。それを展開槽の中に立てかけ蓋を閉じて、溶媒をプレートの上端から２ｃｍ内外のところまで上昇させた。薄層プレートを展開槽から取り出し、ドラフト内で溶媒を蒸発させた。展開されたスポットをゲルごと削り取り、メタノールで抽出した。４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、上清を回収した。
【００３０】
ＴＬＣ後の光活性化生理活性物質の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
薄層クロマトグラフィーにより得られたものをＨＰＬＣ試験液とし、逆相系高速液体クロマトグラフィー（Waters 625 LC System/486 Tunable Absorbance Detector）を用い分離し、Waters allianceを用い精製純度を測定した。
【００３１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞の成長曲線およびメタノール抽出物の溶血活性
５００ｍＬ三角フラスコに４５０ｍＬのＥＳＭ培地を入れ、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で滅菌処理を行った。そこにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを細胞数１００〜２００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植え継いだ。次の日、細胞数をカウントした後、２０ｍＬをファルコンチューブに取り出し遠心を行った（２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）。上清をアスピレーターで取り除き、０．５ｍＬのメタノールを加え抽出を行った。その抽出液の溶血を測定した。一日置きに同様の操作を行い、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの成長曲線およびそれに対する抽出液の溶血活性を調べた。その結果を図１に示した。図中、（●）はヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの細胞数、（□）は光照射下での、（■）は暗所での溶血活性を示す。細胞の増殖と共に抽出液の溶血活性が上昇し、光がある場合にのみ活性が発現していることが分かる。また細胞が減少するとともにメタノール抽出物の溶血活性が低下した。これらの結果から、溶血活性物質は対数増殖期の後期から定常期の間に最も効率よく得られることが分かった。
【００３２】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラムおよび溶血活性
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を用いて、ゲルクロマトグラフィーを行った。溶出した物について、吸光度（４５０ｎｍ）と各フラクションの溶血活性を測定した。その結果を図２に示した。４５０ｎｍの吸光度により２つのピークを検出することができ、溶出時間の遅かったピークと溶血活性が一致し、緑色を呈していた。一方、溶血活性が認められなかった最初のピークの前半部分には血液の凝集が見られ、褐色を呈しており、後半の部分では濃い緑色を呈し溶血活性と血液の凝集は見受けられなかった。これらをもとに５つの画分に分けた。それぞれＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５とした。
【００３３】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の溶血活性および細胞毒性
溶出パターンと溶血活性をもとに５個の画分に分けたＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成した後、溶血活性試験を常法により行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図３に示した。図中、（○）、（▲）、（□）、（●）、（△）は順にＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を表す。溶血活性はＦ−４の画分のみ濃度依存的に見られ、その他の画分では見られなかった。また、褐色を呈しているＦ−２の画分は、濃度依存的に凝集作用が見られた。
【００３４】
また、Ｆ−１〜Ｆ−５について２４ ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成しＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図４に示した。図中、（○）、（▲）、（□）、（●）、（△）は順にＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を表す。溶血と同様にＦ−４の分画のみで濃度依存的に細胞に対する毒性が発現された。なお、Ｆ−４の溶血活性および細胞毒性ともに、光依存性であり、遮光下では両活性は全く発現されなかった。
【００３５】
ＧＣ後の画分の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
Ｆ−４をシリカゲルプレートにおける薄層クロマトグラフィーにより、更に精製した。クロロホルム：メタノール＝６：１の展開溶媒が７０ｍＬ入った展開槽および、Ｆ−４をスポットしたシリカゲルプレート（ＭＥＲＣＫ社製・Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０・１０×２０ｃｍ・層厚０．２５）を用い、上昇法により行った。その結果、Ｒｆ値が０．６２、０．０８、０．０に分離し、夫々を回収した。Ｒｆ値が０．６２をＴ−２、０．０８をＴ−１、０．０をＴ−０とする。
【００３６】
メタノール抽出物のＴＬＣ精製物の溶血活性および細胞毒性
メタノールで抽出したＴ−１、Ｔ−２は、夫々３００μＬ、７００μＬまで濃縮した。Ｔ−０はコントロールとして用意した。Ｔ−０、Ｔ−１、Ｔ−２を９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図５に示した。図中、（○）はＴ−０、（△）はＴ−１、（□）はＴ−２を表す。溶血活性はＴ−１、Ｔ−２部分で濃度依存的に見られたが、Ｔ−２の方がより強く活性があった。コントロールとして用意したＴ−０には全く活性は見られなかった。
【００３７】
また、Ｔ−０、Ｔ−１、Ｔ−２を２４ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成しＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図６に示した。図中、（●）はＴ−０、（▲）はＴ−１、（■）はＴ−２を表す。溶血と同様にＴ−１、Ｔ−２で濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、Ｔ−２の方がより強い毒性があった。
【００３８】
ＴＬＣ後のメタノール抽出物（Ｔ−２）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ−１８カラム（４．６×１５０ｍｍ）を用いてＴＬＣ後の溶血活性物質を高速液体クロマトグラフィーにて精製を行った。サンプルは溶血活性、細胞毒性ともに高い活性を示したＴ−２を用いた。Ｔ−２を８０％メタノールとなるように超純水で調整した。なお、ＨＰＬＣの溶媒は８０％メタノールを使用した。結果を図７に示す。早い段階で全て溶出され、４５０ｎｍで３つのピークを検出できた。それぞれピークの部分で回収し、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３とした。
【００３９】
メタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の溶血活性および細胞毒性
Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３（８０％メタノールに溶解）の部分を夫々回収し、９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図８に示した。図中、（○）はＨ−１、（△）はＨ−２、（□）はＨ−３を表す。Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３すべてに濃度依存的に溶血活性は見られ、その中でもＨ−２、Ｈ−３がＨ−１に比べて高い溶血活性がみられた。
【００４０】
また、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３を２４ｗｅｌｌプレートを用い、ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より調べた。まず二段階希釈を作成し、その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ ルックス）を３０分間行った。その結果を図９に示した。図中、（●）はＨ−１、（▲）はＨ−２、（■）はＨ−３を表す。溶血と同様にすべてに濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、Ｈ−２、Ｈ−３がＨ−１に比べて高い細胞毒性がみられた。
【００４１】
ＨＰＬＣ後のメタノール抽出物のリクロマト
次に、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３をＯＤＳ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ・Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ ３００Ｃ１８Ｔ−７）カラムで、再度ＨＰＬＣに供し、夫々の分離を試みた。遠心式エバポレーターを用い、８０％メタノールに溶けているＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３の溶媒を蒸発させ、そこへ７０％アセトニトリル（超純水で調整）を同量加え夫々を溶解させた。カラム内を７０％アセトニトリルで平衡化し、それぞれ７００μＬのＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３をインジェクトし、測定した。Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３のクロマトグラムを図１０に示した。Ｈ−１は細かくピークが分かれたのに対し、Ｈ−２、Ｈ−３は溶出時間の異なった位置に大きなピークを１つずつ検出できた。Ｈ−２、Ｈ−３のピークの部分を回収し、溶血活性と細胞毒性の試料とした。なお、夫々、Ｈ２−ａとＨ３−ａとした。
【００４２】
メタノール抽出物のリクロマト精製物の溶血活性および細胞毒性
Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａ（７０％アセトニトリル）を遠心式エバポレーターで、溶媒を完全に除去した。そしてＨ２−ａ、Ｈ３−ａの重量を測定し、１．０ｍｇ／ｍＬとなるようジメチルスルホキシドに溶解させた。９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。光照射（４０００ルックス）はプランクトンを培養しているインキュベーター内で５時間おこなった。その結果を図１１に示した。図中、（○）はＨ２−ａ、（△）はＨ３−ａを表す。Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａともに活性にはあまり差は見られなかったが、若干Ｈ２−ａの方が高かった。
【００４３】
また、Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａを２４ｗｅｌｌプレートを用い、ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より調べた。まず二段階希釈を作成し、その後プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図１２に示した。図中、（●）はＨ２−ａ、（▲）はＨ３−ａを表す。溶血と同様にＨ２−ａ、Ｈ３−ａともに濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、溶血活性と同様にＨ２−ａがＨ３−ａに比べて若干高い細胞毒性がみられた。Ｈ２−ａはＨ３−ａより溶血活性、細胞毒性ともに１．２〜１．４倍比活性が高かった。
【００４４】
メタノール抽出物のリクロマト精製物の純度および分子量測定
ＨＰＬＣとＬＣ／ＭＳ（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry）での純度測定を行った。Waters alliance (Waters2695 Sepalation Module/Waters 2996 Photodiode Array Detector)を用い、カラムはＯＤＳ Ｃ−１８（４．６×２５０ ｍｍ・Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ ３００Ｃ１８Ｔ−７）を使用した。Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａを逆相系による溶媒Ａ（超純水で０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を先に作成し、それを用いアセトニトリルを６０％に調整）から溶媒Ｂ（１００％アセトニトリル）へのリニアグラジエントで行った。最初は０．１％のＴＦＡを含む６０％のアセトニトリルを１０分間流し、４０分後に１００％のアセトニトリルになるようにグラジエントを設定した。その結果を３Ｄのクロマトグラムとして図１３に示した。Ｘ軸に溶出時間、Ｙ軸に吸光度、Ｚ軸に波長をとった時の３Ｄのクロマトグラムを解析すると、Ｈ３−ａはＨ２−ａの溶出時間と同じ所に小さいピークを確認でき、Ｈ２−ａが少し含まれることが分かった。それに対しＨ２−ａは単一なピークを検出することができ、Ｈ２−ａは広範囲の波長領域で立体的単一のピークとして溶出されていた。
【００４５】
また、同様の条件でＬＣ／ＭＳに供した。４３０ｎｍの吸光度のクロマトグラムと特定のマスナンバーでのマスクロマトグラムでＨ２−ａとＨ３−ａをそれぞれ分析すると、Ｈ３−ａはいくつかの物質が含まれてはいるがほぼ単一なものに精製されていることが分かった。それに対し、Ｈ２−ａは同じ溶出時間のところでピークを確認できたことから、単一なものに精製できたことが分かった。またマススペクトルよりＨ２−ａの分子量は６０２で、Ｈ３−ａは５８６という結果になった。この分子量の差は１６であることからＨ３−ａはＨ２−ａのデオキシ体であると推測される。Ｈ２−ａとＨ３−ａのマススペクトルの結果を図１４に示した。以上の分析の結果から、Ｈ２−ａは高純度に精製されたことが分かった。一方、Ｈ３−ａは、わずかにＨ２−ａと夾雑物の混入が確認された。
【００４６】
ＭＤＣＫ、Ｌ９２９、ＸＣ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性 ＭＤＣＫ（イヌの腎臓由来細胞）、Ｌ９２９（マウス由来マクロファージ細胞）、ＸＣ細胞（ラットの癌細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒトの子宮癌由来細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの子宮由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サルの腎臓由来細胞）を用いＨ２−ａの細胞毒性を検討した。Ｈ２−ａを最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整し、二段階希釈を作成した。２４ｗｅｌｌプレートに２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようそれぞれの細胞を付着させ、細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図１５に示した。図中、（○）はＭＤＣＫ、（△）はＬ９２９、（□）はＸＣ、（●）はＨｅＬａ、（▲）はＣＨＯ、（■）はＶｅｒｏを表す。細胞の種類によって毒性にはそれほど差はなかったが、Ｖｅｒｏ細胞が最も高い感受性を示した。
【００４７】
ＨｅＬａ細胞に対する形態変化の顕微鏡観察
３５ｍｍプラスチックディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を準備し、細胞が付着するまで培養した。細胞が付着したのを確認した後、Ｈ２−ａを０．１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで調整したものを培養液と交換した。そこへ光を照射しながら（２０００ルックス）、細胞の時間経過（０分から３０分間）ごとの形態変化を顕微鏡で観察を行った。その結果を図１６に示した。図中、（Ａ）はＰＢＳ中の細胞、（Ｂ）はＨ２−ａを含まず、ジメチルスルホキシドをＰＢＳに０．２％となるように調整したもの、（Ｃ）はＨ２−ａを添加し、光を照射したもの、（Ｄ）はＨ２−ａを添加し、遮光処理したものである。これらの結果からＨ２−ａ添加のみでは全く形態変化は誘導されず、光照射がその作用発現に必須であることが分かった。Ｈ２−ａの存在下で、そこへ光照射された細胞は、まずプレート面から徐々に離脱し、やがて球状化した。引き続いて細胞の膨化が起こり、その後細胞は死滅した。この様な形態変化から、細胞膜の損傷に伴う、膜透過性が影響を受けていると推測された。
【００４８】
吸収スペクトルおよび各波長での溶血活性と細胞毒性
濃縮したＦ−４をＰＢＳで２％となるように調整し、吸収スペクトルを測定した（２００〜８００ｎｍ）。比較例として使用するフェオホルバイドａ（Pheophorbide a タマ生化学（株）製）は水難溶性であったため、ジメチルスルホキシドを用いて１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。１ｍｇ／ｍＬに調整したフェオホルバイドａをＰＢＳで５μｇ／ｍＬとなるように調整し、Ｆ−４と同様に吸収スペクトルを測定した。次にＦ−４とフェオホルバイドａを夫々の波長での溶血活性を調べた。溶血活性はＦ−４が最終濃度１％になるように赤血球とＰＢＳを調整し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。そこへ特定の波長に調整した光源を照射した。３０分後（１５分に一回軽く攪拌）軽く攪拌後、１．５ｍＬエッペンチューブに移し、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を１００μＬずつ平底９６ｗｅｌｌプレートに入れ、マイクロプレートリーダーにて測定した。フェオホルバイドａも最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで調整し、同様の操作で実験を行った。
【００４９】
次に、Ｈ２−ａを１．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳと混合した。分光光度計（Ｕ２００１）を用い、３００ｎｍ〜７００ｎｍ（１０ｎｍ間隔）での吸収スペクトルを測定し、Ｈ２−ａの吸収スペクトルのピークとそれぞれの波長での細胞毒性を測定した。細胞毒性試験はＰＢＳで調整（６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）したＨｅＬａ細胞とＨ２−ａの最終濃度が０．５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳで１．０μｇ／ｍｌに調整）となるように混合し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。そこへ特定の波長に調整した光源を２０分間照射した。なお、照射１０分後に一回軽く攪拌した。その後、そこから５μＬ取り出し、あらかじめα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを５００μＬの入った２４ｗｅｌｌプレートに入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養した。コロニー形成を確認した後、染色しコロニーをカウントした。
【００５０】
Ｆ−４およびフェオホルバイドａの吸収スペクトルおよび溶血活性の結果を図１７に、Ｈ２−ａの吸収スペクトルおよび細胞毒性の結果を図１８に示した。Ｆ−４およびフェオホルバイドａとは明らかに異なる吸収スペクトルを示した。図１７より、溶血活性発現波長も４５０ｎｍと６３０ｎｍの２カ所に存在し、フェオホルバイドａの６８０ｎｍとは異なっていることが分かった。従ってＦ−４中の活性物質は、フェオホルバイドａの類似化合物ではないと推定された。また、図１８より、高純度に精製されたＨ２−ａでは、６３０ｎｍ付近の活性が消失していることから、活性波長の異なる物質が存在していたと考えられる。
【００５１】
ラジカル消去剤による溶血活性および細胞毒性の阻害作用
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼを用い、溶血活性と細胞毒性の阻害作用を検討した。Ｈ２−ａの二段階希釈を作成し（最終濃度を１０．０μｇ／ｍＬ）、ＳＯＤは２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、カタラーゼは４００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの最終濃度となるようＰＢＳで調整した。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行い、溶血活性試験を常法により行った。その結果を図１９に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（△）はＳＯＤ、（□）はカタラーゼの結果を表す。ＳＯＤ、カタラーゼともにＨ２−ａの活性に阻害効果をもたらすことはなかった。
【００５２】
また、２４ｗｅｌｌプレートにＨｅＬａ細胞を付着させたものを用意し、培養液をアスピレーターで取り除いた。そこへＳＯＤは２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、カタラーゼは４００ｕｎｉｔｓ／ｍＬと、最終濃度がなるようにＰＢＳで調整したものを加え、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成した（１．０μｇ／ｍＬ）。ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図２０に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（△）はＳＯＤ、（□）はカタラーゼの結果を表す。溶血活性と同様にＨ２−ａは濃度依存的に細胞毒性を発現させ、ＳＯＤとカタラーゼはＨ２−ａの活性に阻害効果をもたらすことはなかった。
【００５３】
次に、ヒスチジン（Ｍｗ＝２０９．６）、マンニトール（Ｍｗ＝１８２．１７）、アジ化ナトリウム（Ｍｗ＝６５．０１）の最終濃度が２０ｍＭとなるようＰＢＳで調整したものを用い、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成し、赤血球と混合した。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行い、溶血活性試験を常法により行った。その結果を図２１に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（○）はヒスチジン、（△）はマンニトール、（□）はアジ化ナトリウムを表す。３種類のラジカル消去剤の中でヒスチジンに顕著な溶血活性の阻害効果がみられた。
【００５４】
また、２４ｗｅｌｌプレートにＨｅＬａ細胞を付着させたものを用意し、培養液をアスピレーターで取り除いた。そこへヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムの最終濃度が２０ｍＭとなるようＰＢＳで調整したもので、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成した。ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その結果を図２２に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（○）はヒスチジン、（△）はマンニトール、（□）はアジ化ナトリウムを表す。溶血活性と同様にヒスチジンによる明らかな阻害が認められた。これらのことから、この活性物質は光照射により、一重項酸素を産生していることが示唆された。
【００５５】
Ｈ２−ａの蛍光スペクトル
Ｈ２−ａを２．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳと混合し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。励起波長を３７０ｎｍまたは４２０ｎｍに合わせ、５５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光を測定した。得られた蛍光スペクトルを図２３に示した。３７０ｎｍの励起波長を当てると、６５０ｎｍのところにピークを検出できた。また、４２０ｎｍの励起波長の方がより高く、蛍光のピークを検出することができた。
【００５６】
Ｈ２−ａを添加した細胞の蛍光観察
３５ｍｍガラス付きディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた。そこへＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａと培地を交換し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。１０分後、新しいＰＢＳに交換し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００のＵ励起波長（ＵＶ波長）にて観察を行った。図２４は得られた顕微鏡写真である。図中、（Ａ）はコントロールとしてのＰＢＳ中の細胞、（Ｂ）はＨ２−ａを添加した細胞である。Ｈ２−ａを添加した細胞にＵ励起の波長をあてると、赤い蛍光が細胞の輪郭に局在していることを観察することができた。また、Ｈ２−ａを添加していない細胞では全くこのような現象を観察することができず、Ｈ２−ａは細胞表層に付着していることが分かった。
【００５７】
Ｈ２−ａによるＨｅＬａ細胞の核変化の蛍光観察
Ｈ２−ａによるＨｅＬａ細胞の核変化の蛍光観察をヘキスト染色法により行った。先ず、３５ｍｍガラスディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を準備し、細胞が付着するまで培養した。細胞が付着しているのを確認後、ＰＢＳでＨ２−ａを０．１μｇ／ｍＬとなるように調整したものと培地を交換した。５分間インキュベーターで静置した後、新しいＰＢＳと交換し、人工気象機の中で４０００ルックスの光を当てた。次に、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換し、５％・ＣＯ2インキュベーターに静置した。３時間後、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで１５０倍に薄めたHoechst 33342 solution（１．０ ｍｇ／ｍＬ Ｈ2Ｏ）を加え、５％・ＣＯ2インキュベーターに静置した。１０分後、倒立型顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００）のＤＡＰＩ励起光で蛍光観察を行った。細胞にＨ２−ａの処理を行わないものをコントロールとし、ジメチルスルホキシドを０．２％溶かしたもの、Ｈ２−ａを細胞に添加し、その後遮光処理を行ったものも同じ操作を行った。図２５は得られた顕微鏡写真である。図中、（Ａ）は通常の培養条件下の細胞、（Ｂ）は光照射を行った０．２％ジメチルスルホキシドを添加した細胞、（Ｃ）は光照射、Ｈ２−ａを添加した細胞、（Ｄ）は遮光処理、Ｈ２−ａを添加した細胞である。０．２％ジメチルスルホキシドとＨ２−ａを添加し、その後、遮光処理したものは両者ともコントロールと同様に核に変化はなかった。Ｈ２−ａを添加し光を照射したものには、核が膨張している様子が確認できた。
【００５８】
Ｈ２−ａの結合時間およびその時の細胞毒性
２４ｗｅｌｌプレートの半数のｗｅｌｌには２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう、また半数のｗｅｌｌには２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＨｅＬａ細胞を付着させ、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａを時間経過ごとに添加した。なお、２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのものは蛍光強度の測定に、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのものは細胞毒性の測定に使用した。次に、新しいＰＢＳでウォッシングを行った。蛍光強度を測定するｗｅｌｌには、ＳＤＳを１ｍＬ加え、ピペッティングで細胞を融解後、４２０ｎｍの励起波長で蛍光強度を測定した。また細胞毒性の測定するｗｅｌｌではその時間経過ごとの毒性をコロニー染色法で測定した（光処理は４０００ルックス、３０分間）。その結果を図２６に示した。素早く細胞表層に付着しているのが蛍光強度と細胞毒性で確認でき、さらに付着する量は時間とともに増加する傾向にあった。また、５分間のインキュベーションで細胞を完全に死滅させる量のＨ２−ａが結合していることが分かった。
【００５９】
Ｈ２−ａの結合後の時間による変化
２４ｗｅｌｌプレートの半数のｗｅｌｌには２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう、また半数のｗｌｌには２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＨｅＬａ細胞を付着させ、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａを添加し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。３０分後に、ＰＢＳでウォッシングを行い、蛍光強度を測定する２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのｗｅｌｌには、ＳＤＳを１ｍＬ加え、ピペッティングで細胞を融解後、４２０ｎｍの励起波長で蛍光強度を測定した。また、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのｗｅｌｌでは３０分間のインキュベーションの後、ＰＢＳを培地に交換し、それぞれ決められた時間、さらに３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターでインキュベーションを行った。一定時間インキュベーションを行ったものの毒性をコロニー染色法で測定した（光処理は４０００ルックス、３０分間）。その結果を図２７に示した。蛍光強度と細胞毒性は時間とともに低下するという結果になり、２時間までは細胞に対する毒性は強く発現されるが、３時間ほどで毒性は半分に低下することが分かった。
【００６０】
Ｈ２−ａの毒性が発現される時間
２４ｗｅｌｌプレートに３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた。光照射の時間を異なるようにするため、一定時間経過ごとに０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬにＰＢＳで調整したＨ２−ａを培養液と交換した。光処理は４０００ルックスで行い、すべての処理を終え０．５ｍＬのα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養を行った。コロニー形成を確認後、染色液で固定しカウントを行った。その結果を図２８に示した。図中、（▲）は０．５μｇ／ｍＬ、（●）は１．０μｇ／ｍＬの結果である。溶血活性とは異なり、かなり早い段階で細胞に対する毒性が発現した。またＨ２−ａの濃度によって毒性の発現する時間は異なり、濃度が高いほど早く毒性が発現した。
【００６１】
Ｈ２−ａの活性の継続時間
Ｈ２−ａを１．０μｇ／ｍＬにＰＢＳにより調整しガラス試験管に入れ、プランクトンを培養している人工気象機の中に静置した。３０分間光処理（４０００ルックス）を行い、３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた２４ｗｅｌｌプレートに、一定時間経過ごとに添加した。すべての処理を終えた後、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。３０分後、ＰＢＳをアスピレーターで取り除きα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを０．５ｍＬずつ入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養を行った。コロニー形成を確認後、染色液で固定しカウントを行った。その結果を図２９に示した。３０分光処理を行ったＨ２−ａは活性化した状態にあると思われるが、その活性が継続する時間は極めて短いものだった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の光活性化生理活性物質は、活性が強く発現される波長が４６０ｎｍと６３０ｎｍであることから、これまで光線力学療法に利用されているポリフィリン化合物とは異なる物質であり、光線力学療法に利用できる新規な光活性化生理活性物質として幅広い応用が考えられる。一方、本物質の原料となる赤潮プランクトンは海水を主体とする安価な培地での大量培養が容易であり、将来的な量産も実行し易い。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの成長曲線およびそれに対する抽出液の溶血活性を示すグラフである。
【図２】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラムと溶血活性を示すグラフである。
【図３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＴＬＣ精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＴＬＣ精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｔ−２）のクロマトグラムである。
【図８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図９】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１０】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のクロマトグラムである。
【図１１】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図１２】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の３Ｄのクロマトグラムである。
【図１４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のマススペクトルである。
【図１５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の各細胞に対する細胞毒性
【図１６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）によるＨｅＬａ細胞の形態変化を表す顕微鏡写真である。
【図１７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｆ−４）のゲルクロマトグラフィー精製物およびフェオホルバイド aの吸収スペクトルおよび溶血活性を示すグラフである。
【図１８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の吸収スペクトルおよび細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼによる溶血活性の阻害作用を示すグラフである。
【図２０】スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼによる細胞毒性の阻害作用を示すグラフである。
【図２１】ヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムによる溶血活性の阻害作用を示すグラフである。
【図２２】ヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムによる細胞毒性の阻害作用を示すグラフである。
【図２３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の蛍光スペクトルである。
【図２４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞の核変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）とＨｅＬａ細胞との結合時間に対する蛍光強度および細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）とＨｅＬａ細胞との結合後の時間に対する蛍光強度および細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞への光照射時間と細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２９】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の活性化後のＨｅＬａ細胞に添加するまでの時間と細胞毒性の関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法に関し、詳しくは可視光線によって活性化する光活性化生理活性物質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光線力学療法（PDT:photodynamic therapy）は光で活性が誘導される光活性化生理活性物質を利用した治療法であり、単独では何ら活性を持たない光活性化生理活性物質とその励起光の組み合わせにより行う、選択性に優れた治療法である。光線力学療法は腫瘍組織に対する選択的治療の他、ニキビなどの皮膚疾患及び表在性の種々の疾患の治療に利用されている。
【０００３】
光線力学療法の歴史は古く、１９０３年にＴａｐｐｅｉｎｅｒらによって、エオジン色素と太陽光およびランプ光にて、腫瘍が壊死したと報告されている。それ以来、現在に至るまで光線力学療法の新たな応用と利用できる光活性化生理活性物質の開発が行なわれているが、これまでに見出されている光活性化生理活性物質のほとんどがポルフィリン誘導体あるいはその前駆物質である（特許文献１〜２）。光線力学療法は選択性に優れ、副作用が少ない等の利点を有している。また、利用する光も比較的安全な可視光線であり、紫外線のように皮膚に障害を起こす心配もない。
【特許文献１】特開平９−２５５６８２号公報
【特許文献２】特開平１１−２９５７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、光線力学療法の更なる有効性の追求には、利用できる光活性化生理活性物質の発見開発が必要である。
【０００５】
そこで本発明の目的は、新規な光活性化生理活性物質、その光活性化方法、活性阻害方法およびそれを用いた光線力学療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、赤潮プランクトンであるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ（Heterocapsa circularisquama）の培養物をアルコール抽出物、更には種々のクロマトグラフィーにより精製された該抽出物が可視光線によって活性化し、溶血および細胞毒性等の生理活性を実現することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の光活性化生理活性物質はヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物であることを特徴とするものである。好ましくは、前記抽出物がメタノールにより抽出された抽出物であり、また、ゲルクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーからなる群のうち少なくとも一つを用い精製を行った光活性化生理活性物質である。更に好ましくは、分子量が５８６または６０２である光活性化生理活性物質である。
【０００８】
また、本発明の光活性化生理活性物質の光活性化方法は３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍの波長の光を使用することを特徴とするものである。更に、本発明の上記光活性化生理活性物質の活性阻害方法は一重項酸素のラジカル消去剤を使用することを特徴とするものである。なお、一重項酸素のラジカル消去剤はヒスチジンを好適に使用することができる。更にまた、本発明の光線力学療法は上記本発明の光活性化生理活性物質を使用することを特徴とするものである。
【０００９】
なお、本発明の光活性化生理活性物質を生成する赤潮プランクトンであるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマはカキなどの二枚貝に対して強い毒性を発現することが知られている。ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは１９８８年高知県浦の内湾で発見され、分類学上の位置づけは以下の通りである。
【００１０】
門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）：渦鞭毛植物門（ＤＩＮＯＰＨＹＴＡ）
網（ｃｌａｓｓ）：渦鞭毛藻網（ＤＩＮＯＰＨＹＣＥＡＥ）
目（ｏｒｄｅｒ）：ペリディニウム目（ＰＥＲＩＤＥＮＡＬＥＳ）
科（ｆａｍｉｌｙ）：ペリディニウム科（ＰＥＲＩＤＩＮＩＡＣＥＡＥ）
属（ｇｅｎｕｓ）：ヘトロカプサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ）
【００１１】
細胞は洋梨型で、大きさは２０．０μｍ〜２８．８μｍ、幅は１３．８μｍ〜２０．０μｍである。細胞の外形はほぼ中央部を走る構造で円錐形の上殻と半球状の下殻とに分かれている。
【００１２】
渦鞭毛藻網のペリディニウム目に属する種類では、細胞表面がセルロース質の鎧板で覆われており、鎧板の上には丸い鱗片がびっしりとあり、細胞内にはピレノイドにつながった葉緑体を１個有し、楕円形で大きな核は細胞の左側に位置する。本種は、細胞鱗片の有無と形状、鎧板配列、核の形と位置、細胞外形などの特徴の組み合わせで比較的簡単に本邦周辺海域に分布する同属の他種から区別できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の光活性化生理活性物質は、比較的低分子化合物で、熱安定性にもすぐれ、光非存在下では全く活性は示さないが、可視光線によって活性化し、溶血やＨｅＬａ細胞（ヒト癌細胞）等に対する強い細胞毒性等の生理活性を実現し、光線力学療法にも有効である。その作用は光によって完全にコントロール可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態につき、具体的に説明する。
本発明の光活性化生理活性物質の生成に使用するヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養に使用する培地は、好ましくは海水を主体とした一般的な海洋性プランクトン用培地であり、より好ましくは、ＥＳＭ（Erd-Schreiber modified）培地である。また、培養の条件としては、光照射は好ましくは３０００〜６０００ルックスであり、より好ましくは４０００ルックス程度である。また、温度に関しては好ましくは２４〜２８℃であり、より好ましくは２７℃程度である。培養時間は培養条件により適宜決定することとなるが、好ましくは、３〜７日間である。
【００１５】
本発明の光活性化生理活性物質のヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物からの抽出方法は特に制限されるものではないが、培養物を抽出遠心分離によりプランクトン細胞を回収し、得られた細胞から溶媒により抽出することができる。この際、用いる溶媒としては親水性を有するものであり、エタノールおよびメタノールを好適に用いることができ、特に好ましくはメタノールである。なお、抽出する際、超音波処理を行うことがより好ましい。
【００１６】
得られた抽出物の精製方法は特に制限されるものではないが、不溶物を除去後、ゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を好適に用いることができる。各種クロマトグラフィーは市販のものにより、定法に従い精製することができる。なお、精製物を高純度にするためには、上記クロマトグラフィーを上記記載順に順次使用し、精製することが好ましい。ゲルクロマトグラフィーはSephadex LH-20を好適に使用できる。ＨＰＬＣによる精製を複数回行うことより、純度を高めることが可能であり、分子量５８６および６０２の化合物を得ることができる。
【００１７】
次に、本発明の光活性化方法は３５０〜５００ｎｍ、好ましくは４５０ｎｍ程度、または５７５〜６５０ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ程度の波長の光を使用し、前記本発明の光活性化生理活性物質を活性化するものである。ここで、前記分子量６０２の化合物の光活性化には、３５０〜４８０ｎｍ、好ましくは４２０ｎｍ程度の波長の光を使用することができる。
【００１８】
また、本発明の光活性化生理活性物質の活性阻害方法は、一重項酸素のラジカル消去剤を使用するものであるが、使用する一重項酸素のラジカル消去剤としてはヒスチジンを好適に使用することができる。これにより、本発明の光活性化生理活性物質は、光照射により、一重項酸素を産生していることが示唆される。
【００１９】
更に、本発明の光線力学療法は上記本発明の光活性化生理活性物質を使用するものであり、腫瘍組織に対する選択的治療の他、ニキビなどの皮膚疾患及び表在性の種々の疾患の治療に利用することが可能となる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明を行う。
ＥＳＭ培地の調製
ＥＳＭ（Ｅｒｄ−Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）培地の調製は、先ず、天然海水１０００ｍＬに対しＮａＮＯ3を１２０ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｂ1、１ｍｇ／ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｂ12、０．１ｍｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ、２６ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）、３３ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ−Ｍｎ（ＩＩ）を夫々１０μＬ、Ｔｒｉｓを１ｇ加えた後、Ｋ2ＨＰＯ4を５ｍｇ加えた。次に５ＮのＨＣｌ溶液でｐＨを８．２付近に調整し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、１０００ｍＬサンボトルに移し入れオートクレーブ（１２１℃、１５分間）で処理しＥＳＭ培地とした。
【００２１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養
三重県英虞湾で採取されたヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを用い、培養温度は２６℃、照明は白色蛍光灯を用い、照度は３０００ルックスとし、照明時間は１２時間明期１２時間暗期のサイクルで培養を行った（三洋電機メディカシステム（株）製グロースキャビネット ＭＬＲ−３５０Ｈ）。培養は耐熱性の１００ｍＬフラスコを用い、通気性のシリコン栓をしてオートクレーブ（１２１℃、１５分間）で処理した後、乾燥させて使用した。先ず、フラスコに５０ｍＬずつＥＳＭ培地を無菌的に分注した。培地へのヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの植え付け方法は、約２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞浮遊液１ｍＬをピペットを用いて無菌的に植え継いだ。なお、この際、培地を２６℃に保った。
【００２２】
溶血活性試験
本発明における溶血活性試験は以下の手順に従い行った。丸底９６ｗｅｌｌプレートを用い、ピペッティングによる２段階希釈をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で行い、試料に濃度勾配をつけたものを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ用意した。そしてＰＢＳで４％に調整したウサギ赤血球（日本バイオテスト研究所製）を５０μＬずつ加えた。なお、血液は、先ず余分な血清蛋白等を除去するためにＰＢＳで遠心分離にて充分洗浄を行った。このプレートを、グロースキャビネットの中（３０００または４０００ルックス、２６℃）に静置し、３〜５時間後に、４℃にて２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清７０μＬを平底９６ｗｅｌｌプレートに移した。常法によりマイクロプレートリーダー（５７０ｎｍの吸光度）により溶血活性を測定した。なお、光照射を行わない実施例はアルミホイルで遮光処理を行った。また、溶血活性を測定する際、ＰＢＳのみを０％溶血、最終濃度１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたものを１００％溶血の指標とした。その他の物は相対度数で溶血活性を表した。試料によっては、試料を溶解させている溶媒を最終濃度１％に調整しコントロールとして用いた場合もある。
【００２３】
α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地の調製
細胞培養に用いた培地であるα−ＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Alpha Modified Eagles Medium）の調製はオートクレーブ（１２１℃、１５分間）後、室温に戻した超純水にα−ＭＥＭ粉末（ＩＣＮ社製）を溶解させ、核酸・抗生物質を加え、濾過滅菌（０．２２μｍ）した。なお、組成は、α−ＭＥＭを一箱、チミジン、シチジン塩酸塩、アデノシン、グタノシンを夫々１０ｍｇ、ベンジルペニシリンカリウム、硫酸ストレプトマイシンを夫々１００ｍｇ、炭酸水素ナトリウムを２ｇ、純水１０００ｍＬである。また、このα−ＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍに５６℃で３０分間熱処理（補体不活化）した牛胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものをＧｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）とした。
【００２４】
細胞（ＨｅＬａ、Ｌ９２９、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、ＸＣ、ＭＤＣＫ）の培養
実験に用いた細胞は、ＭＤＣＫ（イヌの腎臓由来細胞）、Ｌ９２９（マウス由来マクロファージ細胞）、ＸＣ細胞（ラットの癌細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒトの子宮癌由来細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの子宮由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サルの腎臓由来細胞）であり、細胞はすべてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入したものを使用した。細胞の培養法は、先ず、最終濃度で１０％ジメチルスルホキシドおよび１０％ＦＣＳが加えられたα−ＭＥＭで−８０℃凍結保存されているセラムチューブ中の１．５ｍＬ細胞懸濁液を滅菌ピペットで１５ｍＬ滅菌チューブに移した。このチューブにα−ＭＥＭを加え、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心をした。その上清をアスピレーターで除き、新しい培地を５ｍＬ加え細胞を分散させ、培養フラスコ（２５ｃｍ3）全体に広げた後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養を行った。２４時間後、細菌等の混入がないこと、細胞がフラスコの底に付着していることを確認して培地交換あるいは継代培養を行った。継代培養法は、フラスコ中の培養液をアスピレーターで取り除き０．２％トリプシン・０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液を５ｍＬ培養フラスコに入れ密栓し、室温で約１分間静置後、フラスコ中の溶液を取り除き３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで２分間静置した。その後、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳでピペティッングし、細胞をフラスコ底面からはがした。その細胞を新しいフラスコに移し培養した。なお、細胞の保存は、凍結保存法を用いた。細胞を培養フラスコよりはがし、あらかじめ１０％ジメチルスルホキシドを含むα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに細胞を懸濁させたものを約１．５ｍＬセラムチューブに入れ−８０℃で保存した。
【００２５】
細胞毒性試験
２４ｗｅｌｌプレートを用意し、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・０．５ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞をプレートへ０．５ｍＬずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターに静置し、細胞がプレートに付着するまで培養した。なお、プレートの中に細胞を入れると一カ所に集まるため軽く攪拌を行った。細胞数を計算するには、血球計算版（ＫＡＹＡＧＡＫＩ社製 ＥＫＤＳ・Ｂｒｉｇｈｔ−ｌｉｎｅ）を用いた。α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳをアスピレーターで取り除き、１．０μｇ／ｍＬに調整した試料と交換した。ピペッティングによる２段階あるいは３段階希釈をＰＢＳで行い、試料に濃度勾配をつけたものを４００μＬ／ｗｅｌｌずつ用意した。
【００２６】
プランクトンを培養している人工培養機の中に静置し、光処理を行った。３０分後、ＰＢＳをアスピレーターで取り除き、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを０．５ｍＬずつ入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置し、コロニーが形成されるまで３、４日間培養した。コロニー形成を確認した後、培地を捨て１％メチレンブルーを含む５０％メタノールを加え１０分間静置した。その後、染色液を洗い流し、染色されたＨｅＬａ細胞のコロニー数を数えた。カウントは目視で行い、試料を入れてないものの値をコントロール（１００％）とし、試料処理した場合の値を相対度数で表した。なお、４８ｗｅｌｌプレートを用いた場合は、細胞数１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・０．２ ｍＬで利用し、操作は同様の手順で行った。
【００２７】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞からのメタノール抽出法
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの細胞が約２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの状態になった時に、１７５ｍＬファルコンチューブを使用し、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを培養液と一緒に４℃にて３，５００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て、ピペッティングを行い、１．５ｍＬのエッペンチューブに回収した。それを、４℃にて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、アスピレーターを用い、完全に上清を取り除いた。そこへ細胞浮遊液から得られた細胞ペレットに対し、１．５ｍＬの割合でメタノールを加え、常温で１分間、ソニケーションにて細胞を破壊する。それを４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を粗抽出液とした。十分に抽出できない場合はさらにメタノールを加え、同様の操作を行った。粗抽出液の保存はエッペンチューブに入れたまま、冷凍庫に保管した。
【００２８】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）
５０ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０をメタノールの中に入れ、３時間放置して膨潤させた。この間に溶液を攪拌してデカンテーションにより、微細な粒子をすべて取り除いた。それを真空デシケーターの中に入れ、気泡を取り除き、ゲル懸濁液をカラム（３００×１５ｍｍ）に注ぎ入れ、懸濁液がゆっくりと流れるようにしながら重力でゲルが沈殿するのに任せ、ゲルのカラムを作った。カラム内に気泡が入らないようにするために、ゲル量に比して２〜３倍量のメタノール（溶媒）を用いた。メタノール抽出物をカラムの上に加え、メタノールで溶出した。溶出液は１〜２．０ｍＬ／ｔｕｂｅにて分取した。この実験の操作は全て低温室にて行った。なお、各試験管について、吸光度（分光光度計Ｕ−２００１を使用）と溶血活性（メタノールの最終濃度１．０％）を測定した。
【００２９】
ＧＣ後の画分の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
本実施例おいては上昇法による一次元展開により行った。展開槽に６０〜１００ｍＬの溶媒（クロロホルム：メタノール＝６：１）を入れ、１２時間放置し、槽内の溶媒蒸気を平衡にした。キャピラリーに試料（ＧＣで得られた画分）を取り、試料を薄層プレート（シリカゲル）にスポットした。それを展開槽の中に立てかけ蓋を閉じて、溶媒をプレートの上端から２ｃｍ内外のところまで上昇させた。薄層プレートを展開槽から取り出し、ドラフト内で溶媒を蒸発させた。展開されたスポットをゲルごと削り取り、メタノールで抽出した。４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、上清を回収した。
【００３０】
ＴＬＣ後の光活性化生理活性物質の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
薄層クロマトグラフィーにより得られたものをＨＰＬＣ試験液とし、逆相系高速液体クロマトグラフィー（Waters 625 LC System/486 Tunable Absorbance Detector）を用い分離し、Waters allianceを用い精製純度を測定した。
【００３１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞の成長曲線およびメタノール抽出物の溶血活性
５００ｍＬ三角フラスコに４５０ｍＬのＥＳＭ培地を入れ、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で滅菌処理を行った。そこにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを細胞数１００〜２００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植え継いだ。次の日、細胞数をカウントした後、２０ｍＬをファルコンチューブに取り出し遠心を行った（２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）。上清をアスピレーターで取り除き、０．５ｍＬのメタノールを加え抽出を行った。その抽出液の溶血を測定した。一日置きに同様の操作を行い、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの成長曲線およびそれに対する抽出液の溶血活性を調べた。その結果を図１に示した。図中、（●）はヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの細胞数、（□）は光照射下での、（■）は暗所での溶血活性を示す。細胞の増殖と共に抽出液の溶血活性が上昇し、光がある場合にのみ活性が発現していることが分かる。また細胞が減少するとともにメタノール抽出物の溶血活性が低下した。これらの結果から、溶血活性物質は対数増殖期の後期から定常期の間に最も効率よく得られることが分かった。
【００３２】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラムおよび溶血活性
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を用いて、ゲルクロマトグラフィーを行った。溶出した物について、吸光度（４５０ｎｍ）と各フラクションの溶血活性を測定した。その結果を図２に示した。４５０ｎｍの吸光度により２つのピークを検出することができ、溶出時間の遅かったピークと溶血活性が一致し、緑色を呈していた。一方、溶血活性が認められなかった最初のピークの前半部分には血液の凝集が見られ、褐色を呈しており、後半の部分では濃い緑色を呈し溶血活性と血液の凝集は見受けられなかった。これらをもとに５つの画分に分けた。それぞれＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５とした。
【００３３】
メタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の溶血活性および細胞毒性
溶出パターンと溶血活性をもとに５個の画分に分けたＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成した後、溶血活性試験を常法により行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図３に示した。図中、（○）、（▲）、（□）、（●）、（△）は順にＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を表す。溶血活性はＦ−４の画分のみ濃度依存的に見られ、その他の画分では見られなかった。また、褐色を呈しているＦ−２の画分は、濃度依存的に凝集作用が見られた。
【００３４】
また、Ｆ−１〜Ｆ−５について２４ ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成しＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図４に示した。図中、（○）、（▲）、（□）、（●）、（△）は順にＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を表す。溶血と同様にＦ−４の分画のみで濃度依存的に細胞に対する毒性が発現された。なお、Ｆ−４の溶血活性および細胞毒性ともに、光依存性であり、遮光下では両活性は全く発現されなかった。
【００３５】
ＧＣ後の画分の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
Ｆ−４をシリカゲルプレートにおける薄層クロマトグラフィーにより、更に精製した。クロロホルム：メタノール＝６：１の展開溶媒が７０ｍＬ入った展開槽および、Ｆ−４をスポットしたシリカゲルプレート（ＭＥＲＣＫ社製・Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０・１０×２０ｃｍ・層厚０．２５）を用い、上昇法により行った。その結果、Ｒｆ値が０．６２、０．０８、０．０に分離し、夫々を回収した。Ｒｆ値が０．６２をＴ−２、０．０８をＴ−１、０．０をＴ−０とする。
【００３６】
メタノール抽出物のＴＬＣ精製物の溶血活性および細胞毒性
メタノールで抽出したＴ−１、Ｔ−２は、夫々３００μＬ、７００μＬまで濃縮した。Ｔ−０はコントロールとして用意した。Ｔ−０、Ｔ−１、Ｔ−２を９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図５に示した。図中、（○）はＴ−０、（△）はＴ−１、（□）はＴ−２を表す。溶血活性はＴ−１、Ｔ−２部分で濃度依存的に見られたが、Ｔ−２の方がより強く活性があった。コントロールとして用意したＴ−０には全く活性は見られなかった。
【００３７】
また、Ｔ−０、Ｔ−１、Ｔ−２を２４ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成しＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図６に示した。図中、（●）はＴ−０、（▲）はＴ−１、（■）はＴ−２を表す。溶血と同様にＴ−１、Ｔ−２で濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、Ｔ−２の方がより強い毒性があった。
【００３８】
ＴＬＣ後のメタノール抽出物（Ｔ−２）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ−１８カラム（４．６×１５０ｍｍ）を用いてＴＬＣ後の溶血活性物質を高速液体クロマトグラフィーにて精製を行った。サンプルは溶血活性、細胞毒性ともに高い活性を示したＴ−２を用いた。Ｔ−２を８０％メタノールとなるように超純水で調整した。なお、ＨＰＬＣの溶媒は８０％メタノールを使用した。結果を図７に示す。早い段階で全て溶出され、４５０ｎｍで３つのピークを検出できた。それぞれピークの部分で回収し、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３とした。
【００３９】
メタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の溶血活性および細胞毒性
Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３（８０％メタノールに溶解）の部分を夫々回収し、９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行った。その結果を図８に示した。図中、（○）はＨ−１、（△）はＨ−２、（□）はＨ−３を表す。Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３すべてに濃度依存的に溶血活性は見られ、その中でもＨ−２、Ｈ−３がＨ−１に比べて高い溶血活性がみられた。
【００４０】
また、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３を２４ｗｅｌｌプレートを用い、ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より調べた。まず二段階希釈を作成し、その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ ルックス）を３０分間行った。その結果を図９に示した。図中、（●）はＨ−１、（▲）はＨ−２、（■）はＨ−３を表す。溶血と同様にすべてに濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、Ｈ−２、Ｈ−３がＨ−１に比べて高い細胞毒性がみられた。
【００４１】
ＨＰＬＣ後のメタノール抽出物のリクロマト
次に、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３をＯＤＳ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ・Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ ３００Ｃ１８Ｔ−７）カラムで、再度ＨＰＬＣに供し、夫々の分離を試みた。遠心式エバポレーターを用い、８０％メタノールに溶けているＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３の溶媒を蒸発させ、そこへ７０％アセトニトリル（超純水で調整）を同量加え夫々を溶解させた。カラム内を７０％アセトニトリルで平衡化し、それぞれ７００μＬのＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３をインジェクトし、測定した。Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３のクロマトグラムを図１０に示した。Ｈ−１は細かくピークが分かれたのに対し、Ｈ−２、Ｈ−３は溶出時間の異なった位置に大きなピークを１つずつ検出できた。Ｈ−２、Ｈ−３のピークの部分を回収し、溶血活性と細胞毒性の試料とした。なお、夫々、Ｈ２−ａとＨ３−ａとした。
【００４２】
メタノール抽出物のリクロマト精製物の溶血活性および細胞毒性
Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａ（７０％アセトニトリル）を遠心式エバポレーターで、溶媒を完全に除去した。そしてＨ２−ａ、Ｈ３−ａの重量を測定し、１．０ｍｇ／ｍＬとなるようジメチルスルホキシドに溶解させた。９６ｗｅｌｌプレートを用い、二段階希釈を作成し溶血活性試験を常法により行った。光照射（４０００ルックス）はプランクトンを培養しているインキュベーター内で５時間おこなった。その結果を図１１に示した。図中、（○）はＨ２−ａ、（△）はＨ３−ａを表す。Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａともに活性にはあまり差は見られなかったが、若干Ｈ２−ａの方が高かった。
【００４３】
また、Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａを２４ｗｅｌｌプレートを用い、ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より調べた。まず二段階希釈を作成し、その後プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図１２に示した。図中、（●）はＨ２−ａ、（▲）はＨ３−ａを表す。溶血と同様にＨ２−ａ、Ｈ３−ａともに濃度依存的に細胞に対する毒性が発現され、溶血活性と同様にＨ２−ａがＨ３−ａに比べて若干高い細胞毒性がみられた。Ｈ２−ａはＨ３−ａより溶血活性、細胞毒性ともに１．２〜１．４倍比活性が高かった。
【００４４】
メタノール抽出物のリクロマト精製物の純度および分子量測定
ＨＰＬＣとＬＣ／ＭＳ（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry）での純度測定を行った。Waters alliance (Waters2695 Sepalation Module/Waters 2996 Photodiode Array Detector)を用い、カラムはＯＤＳ Ｃ−１８（４．６×２５０ ｍｍ・Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ ３００Ｃ１８Ｔ−７）を使用した。Ｈ２−ａ、Ｈ３−ａを逆相系による溶媒Ａ（超純水で０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を先に作成し、それを用いアセトニトリルを６０％に調整）から溶媒Ｂ（１００％アセトニトリル）へのリニアグラジエントで行った。最初は０．１％のＴＦＡを含む６０％のアセトニトリルを１０分間流し、４０分後に１００％のアセトニトリルになるようにグラジエントを設定した。その結果を３Ｄのクロマトグラムとして図１３に示した。Ｘ軸に溶出時間、Ｙ軸に吸光度、Ｚ軸に波長をとった時の３Ｄのクロマトグラムを解析すると、Ｈ３−ａはＨ２−ａの溶出時間と同じ所に小さいピークを確認でき、Ｈ２−ａが少し含まれることが分かった。それに対しＨ２−ａは単一なピークを検出することができ、Ｈ２−ａは広範囲の波長領域で立体的単一のピークとして溶出されていた。
【００４５】
また、同様の条件でＬＣ／ＭＳに供した。４３０ｎｍの吸光度のクロマトグラムと特定のマスナンバーでのマスクロマトグラムでＨ２−ａとＨ３−ａをそれぞれ分析すると、Ｈ３−ａはいくつかの物質が含まれてはいるがほぼ単一なものに精製されていることが分かった。それに対し、Ｈ２−ａは同じ溶出時間のところでピークを確認できたことから、単一なものに精製できたことが分かった。またマススペクトルよりＨ２−ａの分子量は６０２で、Ｈ３−ａは５８６という結果になった。この分子量の差は１６であることからＨ３−ａはＨ２−ａのデオキシ体であると推測される。Ｈ２−ａとＨ３−ａのマススペクトルの結果を図１４に示した。以上の分析の結果から、Ｈ２−ａは高純度に精製されたことが分かった。一方、Ｈ３−ａは、わずかにＨ２−ａと夾雑物の混入が確認された。
【００４６】
ＭＤＣＫ、Ｌ９２９、ＸＣ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性 ＭＤＣＫ（イヌの腎臓由来細胞）、Ｌ９２９（マウス由来マクロファージ細胞）、ＸＣ細胞（ラットの癌細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒトの子宮癌由来細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの子宮由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サルの腎臓由来細胞）を用いＨ２−ａの細胞毒性を検討した。Ｈ２−ａを最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整し、二段階希釈を作成した。２４ｗｅｌｌプレートに２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようそれぞれの細胞を付着させ、細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図１５に示した。図中、（○）はＭＤＣＫ、（△）はＬ９２９、（□）はＸＣ、（●）はＨｅＬａ、（▲）はＣＨＯ、（■）はＶｅｒｏを表す。細胞の種類によって毒性にはそれほど差はなかったが、Ｖｅｒｏ細胞が最も高い感受性を示した。
【００４７】
ＨｅＬａ細胞に対する形態変化の顕微鏡観察
３５ｍｍプラスチックディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を準備し、細胞が付着するまで培養した。細胞が付着したのを確認した後、Ｈ２−ａを０．１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで調整したものを培養液と交換した。そこへ光を照射しながら（２０００ルックス）、細胞の時間経過（０分から３０分間）ごとの形態変化を顕微鏡で観察を行った。その結果を図１６に示した。図中、（Ａ）はＰＢＳ中の細胞、（Ｂ）はＨ２−ａを含まず、ジメチルスルホキシドをＰＢＳに０．２％となるように調整したもの、（Ｃ）はＨ２−ａを添加し、光を照射したもの、（Ｄ）はＨ２−ａを添加し、遮光処理したものである。これらの結果からＨ２−ａ添加のみでは全く形態変化は誘導されず、光照射がその作用発現に必須であることが分かった。Ｈ２−ａの存在下で、そこへ光照射された細胞は、まずプレート面から徐々に離脱し、やがて球状化した。引き続いて細胞の膨化が起こり、その後細胞は死滅した。この様な形態変化から、細胞膜の損傷に伴う、膜透過性が影響を受けていると推測された。
【００４８】
吸収スペクトルおよび各波長での溶血活性と細胞毒性
濃縮したＦ−４をＰＢＳで２％となるように調整し、吸収スペクトルを測定した（２００〜８００ｎｍ）。比較例として使用するフェオホルバイドａ（Pheophorbide a タマ生化学（株）製）は水難溶性であったため、ジメチルスルホキシドを用いて１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。１ｍｇ／ｍＬに調整したフェオホルバイドａをＰＢＳで５μｇ／ｍＬとなるように調整し、Ｆ−４と同様に吸収スペクトルを測定した。次にＦ−４とフェオホルバイドａを夫々の波長での溶血活性を調べた。溶血活性はＦ−４が最終濃度１％になるように赤血球とＰＢＳを調整し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。そこへ特定の波長に調整した光源を照射した。３０分後（１５分に一回軽く攪拌）軽く攪拌後、１．５ｍＬエッペンチューブに移し、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を１００μＬずつ平底９６ｗｅｌｌプレートに入れ、マイクロプレートリーダーにて測定した。フェオホルバイドａも最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで調整し、同様の操作で実験を行った。
【００４９】
次に、Ｈ２−ａを１．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳと混合した。分光光度計（Ｕ２００１）を用い、３００ｎｍ〜７００ｎｍ（１０ｎｍ間隔）での吸収スペクトルを測定し、Ｈ２−ａの吸収スペクトルのピークとそれぞれの波長での細胞毒性を測定した。細胞毒性試験はＰＢＳで調整（６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）したＨｅＬａ細胞とＨ２−ａの最終濃度が０．５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳで１．０μｇ／ｍｌに調整）となるように混合し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。そこへ特定の波長に調整した光源を２０分間照射した。なお、照射１０分後に一回軽く攪拌した。その後、そこから５μＬ取り出し、あらかじめα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを５００μＬの入った２４ｗｅｌｌプレートに入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養した。コロニー形成を確認した後、染色しコロニーをカウントした。
【００５０】
Ｆ−４およびフェオホルバイドａの吸収スペクトルおよび溶血活性の結果を図１７に、Ｈ２−ａの吸収スペクトルおよび細胞毒性の結果を図１８に示した。Ｆ−４およびフェオホルバイドａとは明らかに異なる吸収スペクトルを示した。図１７より、溶血活性発現波長も４５０ｎｍと６３０ｎｍの２カ所に存在し、フェオホルバイドａの６８０ｎｍとは異なっていることが分かった。従ってＦ−４中の活性物質は、フェオホルバイドａの類似化合物ではないと推定された。また、図１８より、高純度に精製されたＨ２−ａでは、６３０ｎｍ付近の活性が消失していることから、活性波長の異なる物質が存在していたと考えられる。
【００５１】
ラジカル消去剤による溶血活性および細胞毒性の阻害作用
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼを用い、溶血活性と細胞毒性の阻害作用を検討した。Ｈ２−ａの二段階希釈を作成し（最終濃度を１０．０μｇ／ｍＬ）、ＳＯＤは２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、カタラーゼは４００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの最終濃度となるようＰＢＳで調整した。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行い、溶血活性試験を常法により行った。その結果を図１９に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（△）はＳＯＤ、（□）はカタラーゼの結果を表す。ＳＯＤ、カタラーゼともにＨ２−ａの活性に阻害効果をもたらすことはなかった。
【００５２】
また、２４ｗｅｌｌプレートにＨｅＬａ細胞を付着させたものを用意し、培養液をアスピレーターで取り除いた。そこへＳＯＤは２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、カタラーゼは４００ｕｎｉｔｓ／ｍＬと、最終濃度がなるようにＰＢＳで調整したものを加え、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成した（１．０μｇ／ｍＬ）。ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を３０分間行った。その結果を図２０に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（△）はＳＯＤ、（□）はカタラーゼの結果を表す。溶血活性と同様にＨ２−ａは濃度依存的に細胞毒性を発現させ、ＳＯＤとカタラーゼはＨ２−ａの活性に阻害効果をもたらすことはなかった。
【００５３】
次に、ヒスチジン（Ｍｗ＝２０９．６）、マンニトール（Ｍｗ＝１８２．１７）、アジ化ナトリウム（Ｍｗ＝６５．０１）の最終濃度が２０ｍＭとなるようＰＢＳで調整したものを用い、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成し、赤血球と混合した。その後、プランクトンを培養しているインキュベーター内で光照射（４０００ルックス）を５時間行い、溶血活性試験を常法により行った。その結果を図２１に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（○）はヒスチジン、（△）はマンニトール、（□）はアジ化ナトリウムを表す。３種類のラジカル消去剤の中でヒスチジンに顕著な溶血活性の阻害効果がみられた。
【００５４】
また、２４ｗｅｌｌプレートにＨｅＬａ細胞を付着させたものを用意し、培養液をアスピレーターで取り除いた。そこへヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムの最終濃度が２０ｍＭとなるようＰＢＳで調整したもので、Ｈ２−ａの二段階希釈を作成した。ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性をコロニー形成阻害法より行った。その結果を図２２に示した。図中、（●）はラジカル消去剤を未添加、（○）はヒスチジン、（△）はマンニトール、（□）はアジ化ナトリウムを表す。溶血活性と同様にヒスチジンによる明らかな阻害が認められた。これらのことから、この活性物質は光照射により、一重項酸素を産生していることが示唆された。
【００５５】
Ｈ２−ａの蛍光スペクトル
Ｈ２−ａを２．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳと混合し、日立分光蛍光光度計（６５０−５０）に設置した。励起波長を３７０ｎｍまたは４２０ｎｍに合わせ、５５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光を測定した。得られた蛍光スペクトルを図２３に示した。３７０ｎｍの励起波長を当てると、６５０ｎｍのところにピークを検出できた。また、４２０ｎｍの励起波長の方がより高く、蛍光のピークを検出することができた。
【００５６】
Ｈ２−ａを添加した細胞の蛍光観察
３５ｍｍガラス付きディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた。そこへＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａと培地を交換し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。１０分後、新しいＰＢＳに交換し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００のＵ励起波長（ＵＶ波長）にて観察を行った。図２４は得られた顕微鏡写真である。図中、（Ａ）はコントロールとしてのＰＢＳ中の細胞、（Ｂ）はＨ２−ａを添加した細胞である。Ｈ２−ａを添加した細胞にＵ励起の波長をあてると、赤い蛍光が細胞の輪郭に局在していることを観察することができた。また、Ｈ２−ａを添加していない細胞では全くこのような現象を観察することができず、Ｈ２−ａは細胞表層に付着していることが分かった。
【００５７】
Ｈ２−ａによるＨｅＬａ細胞の核変化の蛍光観察
Ｈ２−ａによるＨｅＬａ細胞の核変化の蛍光観察をヘキスト染色法により行った。先ず、３５ｍｍガラスディッシュに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を準備し、細胞が付着するまで培養した。細胞が付着しているのを確認後、ＰＢＳでＨ２−ａを０．１μｇ／ｍＬとなるように調整したものと培地を交換した。５分間インキュベーターで静置した後、新しいＰＢＳと交換し、人工気象機の中で４０００ルックスの光を当てた。次に、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換し、５％・ＣＯ2インキュベーターに静置した。３時間後、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで１５０倍に薄めたHoechst 33342 solution（１．０ ｍｇ／ｍＬ Ｈ2Ｏ）を加え、５％・ＣＯ2インキュベーターに静置した。１０分後、倒立型顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００）のＤＡＰＩ励起光で蛍光観察を行った。細胞にＨ２−ａの処理を行わないものをコントロールとし、ジメチルスルホキシドを０．２％溶かしたもの、Ｈ２−ａを細胞に添加し、その後遮光処理を行ったものも同じ操作を行った。図２５は得られた顕微鏡写真である。図中、（Ａ）は通常の培養条件下の細胞、（Ｂ）は光照射を行った０．２％ジメチルスルホキシドを添加した細胞、（Ｃ）は光照射、Ｈ２−ａを添加した細胞、（Ｄ）は遮光処理、Ｈ２−ａを添加した細胞である。０．２％ジメチルスルホキシドとＨ２−ａを添加し、その後、遮光処理したものは両者ともコントロールと同様に核に変化はなかった。Ｈ２−ａを添加し光を照射したものには、核が膨張している様子が確認できた。
【００５８】
Ｈ２−ａの結合時間およびその時の細胞毒性
２４ｗｅｌｌプレートの半数のｗｅｌｌには２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう、また半数のｗｅｌｌには２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＨｅＬａ細胞を付着させ、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａを時間経過ごとに添加した。なお、２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのものは蛍光強度の測定に、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのものは細胞毒性の測定に使用した。次に、新しいＰＢＳでウォッシングを行った。蛍光強度を測定するｗｅｌｌには、ＳＤＳを１ｍＬ加え、ピペッティングで細胞を融解後、４２０ｎｍの励起波長で蛍光強度を測定した。また細胞毒性の測定するｗｅｌｌではその時間経過ごとの毒性をコロニー染色法で測定した（光処理は４０００ルックス、３０分間）。その結果を図２６に示した。素早く細胞表層に付着しているのが蛍光強度と細胞毒性で確認でき、さらに付着する量は時間とともに増加する傾向にあった。また、５分間のインキュベーションで細胞を完全に死滅させる量のＨ２−ａが結合していることが分かった。
【００５９】
Ｈ２−ａの結合後の時間による変化
２４ｗｅｌｌプレートの半数のｗｅｌｌには２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう、また半数のｗｌｌには２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＨｅＬａ細胞を付着させ、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍＬに調整したＨ２−ａを添加し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。３０分後に、ＰＢＳでウォッシングを行い、蛍光強度を測定する２０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのｗｅｌｌには、ＳＤＳを１ｍＬ加え、ピペッティングで細胞を融解後、４２０ｎｍの励起波長で蛍光強度を測定した。また、２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのｗｅｌｌでは３０分間のインキュベーションの後、ＰＢＳを培地に交換し、それぞれ決められた時間、さらに３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターでインキュベーションを行った。一定時間インキュベーションを行ったものの毒性をコロニー染色法で測定した（光処理は４０００ルックス、３０分間）。その結果を図２７に示した。蛍光強度と細胞毒性は時間とともに低下するという結果になり、２時間までは細胞に対する毒性は強く発現されるが、３時間ほどで毒性は半分に低下することが分かった。
【００６０】
Ｈ２−ａの毒性が発現される時間
２４ｗｅｌｌプレートに３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた。光照射の時間を異なるようにするため、一定時間経過ごとに０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬにＰＢＳで調整したＨ２−ａを培養液と交換した。光処理は４０００ルックスで行い、すべての処理を終え０．５ｍＬのα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換し、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養を行った。コロニー形成を確認後、染色液で固定しカウントを行った。その結果を図２８に示した。図中、（▲）は０．５μｇ／ｍＬ、（●）は１．０μｇ／ｍＬの結果である。溶血活性とは異なり、かなり早い段階で細胞に対する毒性が発現した。またＨ２−ａの濃度によって毒性の発現する時間は異なり、濃度が高いほど早く毒性が発現した。
【００６１】
Ｈ２−ａの活性の継続時間
Ｈ２−ａを１．０μｇ／ｍＬにＰＢＳにより調整しガラス試験管に入れ、プランクトンを培養している人工気象機の中に静置した。３０分間光処理（４０００ルックス）を行い、３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで調製したＨｅＬａ細胞を付着させた２４ｗｅｌｌプレートに、一定時間経過ごとに添加した。すべての処理を終えた後、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置した。３０分後、ＰＢＳをアスピレーターで取り除きα−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを０．５ｍＬずつ入れ、３７℃・５％ＣＯ2インキュベーターに静置しコロニーが形成されるまで培養を行った。コロニー形成を確認後、染色液で固定しカウントを行った。その結果を図２９に示した。３０分光処理を行ったＨ２−ａは活性化した状態にあると思われるが、その活性が継続する時間は極めて短いものだった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の光活性化生理活性物質は、活性が強く発現される波長が４６０ｎｍと６３０ｎｍであることから、これまで光線力学療法に利用されているポリフィリン化合物とは異なる物質であり、光線力学療法に利用できる新規な光活性化生理活性物質として幅広い応用が考えられる。一方、本物質の原料となる赤潮プランクトンは海水を主体とする安価な培地での大量培養が容易であり、将来的な量産も実行し易い。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの成長曲線およびそれに対する抽出液の溶血活性を示すグラフである。
【図２】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラムと溶血活性を示すグラフである。
【図３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のゲルクロマトグラフィー精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＴＬＣ精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＴＬＣ精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｔ−２）のクロマトグラムである。
【図８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図９】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のＨＰＬＣ精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１０】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のクロマトグラムである。
【図１１】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の溶血活性を示すグラフである。
【図１２】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のリクロマト精製物の３Ｄのクロマトグラムである。
【図１４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物のマススペクトルである。
【図１５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の各細胞に対する細胞毒性
【図１６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）によるＨｅＬａ細胞の形態変化を表す顕微鏡写真である。
【図１７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｆ−４）のゲルクロマトグラフィー精製物およびフェオホルバイド aの吸収スペクトルおよび溶血活性を示すグラフである。
【図１８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の吸収スペクトルおよび細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼによる溶血活性の阻害作用を示すグラフである。
【図２０】スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼによる細胞毒性の阻害作用を示すグラフである。
【図２１】ヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムによる溶血活性の阻害作用を示すグラフである。
【図２２】ヒスチジン、マンニトール、アジ化ナトリウムによる細胞毒性の阻害作用を示すグラフである。
【図２３】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の蛍光スペクトルである。
【図２４】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞の核変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）とＨｅＬａ細胞との結合時間に対する蛍光強度および細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２７】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）とＨｅＬａ細胞との結合後の時間に対する蛍光強度および細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２８】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）を添加したＨｅＬａ細胞への光照射時間と細胞毒性の関係を示すグラフである。
【図２９】ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ細胞のメタノール抽出物（Ｈ２−ａ）の活性化後のＨｅＬａ細胞に添加するまでの時間と細胞毒性の関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物であることを特徴とする光活性化生理活性物質。
【請求項２】
前記抽出物がメタノールにより抽出された抽出物である請求項１記載の光活性化生理活性物質。
【請求項３】
ゲルクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーからなる群のうち少なくとも一つを用い精製を行った請求項１または２記載の光活性化生理活性物質。
【請求項４】
分子量が５８６または６０２である請求項１〜３のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質の光活性化方法であって、３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍ波長の光を使用することを特徴とする光活性化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質の活性阻害方法であって、一重項酸素のラジカル消去剤を使用することを特徴とする活性阻害方法。
【請求項７】
前記一重項酸素のラジカル消去剤がヒスチジンである請求項６記載の活性阻害方法。
【請求項８】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質を使用することを特徴とする光線力学療法。
【請求項１】
ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養物の抽出物であることを特徴とする光活性化生理活性物質。
【請求項２】
前記抽出物がメタノールにより抽出された抽出物である請求項１記載の光活性化生理活性物質。
【請求項３】
ゲルクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーからなる群のうち少なくとも一つを用い精製を行った請求項１または２記載の光活性化生理活性物質。
【請求項４】
分子量が５８６または６０２である請求項１〜３のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質の光活性化方法であって、３５０〜５００ｎｍまたは５７５〜６５０ｎｍ波長の光を使用することを特徴とする光活性化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質の活性阻害方法であって、一重項酸素のラジカル消去剤を使用することを特徴とする活性阻害方法。
【請求項７】
前記一重項酸素のラジカル消去剤がヒスチジンである請求項６記載の活性阻害方法。
【請求項８】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の光活性化生理活性物質を使用することを特徴とする光線力学療法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図１６】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
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【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図１６】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２００６−１３７６８３（Ｐ２００６−１３７６８３Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２６５４０（Ｐ２００４−３２６５４０）
【出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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