新規の検出プローブ
本発明は、核酸の検出を可能にする新規のヌクレオチドプローブであって、
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖で構成され、前記検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含まず、
この２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに、検出プローブが完全な円形を有し、それにより該閉鎖配列が該プローブを該標的核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持するプローブに関する。
本発明はまた、前記プローブを利用した検出のための方法およびキットに関する。
本発明は、好ましくは、診断の分野における用途を見出す。
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖で構成され、前記検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含まず、
この２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに、検出プローブが完全な円形を有し、それにより該閉鎖配列が該プローブを該標的核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持するプローブに関する。
本発明はまた、前記プローブを利用した検出のための方法およびキットに関する。
本発明は、好ましくは、診断の分野における用途を見出す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のヌクレオチドプローブによる核酸の検出に関する。本発明は、診断の分野において用途を見出す。
【背景技術】
【０００２】
今日、標的ヌクレオチド配列を見出すことは、多くの研究室におけるおよび特に医療または食品加工分野における主な目的を表す。これらの分野では、標的配列を見出すことは、例えば、病原性生物を検出すること、食品加工過程において細菌汚染を発見すること、または遺伝的疾患もしくは癌の原因となる突然変異の診断といった目的を有する。これらの方法における主な困難は、使用される検査の特異性、感度、速さ、および再現性に関するものである。特に診断の分野では、明確な結果を示すことができることが絶対に必要不可欠である。
【０００３】
様々なタイプの方法が文献に記載されている。それらは通常、「核酸のハイブリダイゼーション」または単に「ハイブリダイゼーション」と一般に呼ばれる、核酸の相補鎖を対合させる特性に基づいている。
【０００４】
通常、生物のまたは解析しなければならない疾患の特定の配列を決定した後、試料から核酸を抽出し、場合により目的の配列を増幅および検出することが必要である。ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＳＤＡなどの、非常に多くの増幅の方法が開発されている。検出のための多くの技術もある。これらのうちの１つは、「分子ビーコン」と一般に呼ばれる、Ｔｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４：３０３−３０８）によって記載された、特殊なプローブを利用する。これらのプローブは、一本鎖「ループ」部分と二本鎖「ステム」部分とを含むヘアピン構造を有する。「ループ」部分は、標的ヌクレオチド配列に対する相補的配列を含有し、「ステム」部分は、互いに相補的である２つの配列によって形成されている。「ステム」部分の相補的配列のうちの１つの遊離末端がフルオロフォアで標識されているのに対し、「ステム」部分のもう１つの鎖のもう１つの遊離末端は蛍光クエンチャーと結合している。相補的な標的配列の非存在下では、検出プローブはヘアピン形であり、プローブは蛍光を生じず、フルオロフォアのエネルギーは蛍光クエンチャーに直接移される。このプローブが標的配列にハイブリダイズしたとき、それは、その形状を失い、５’および３’末端がさらに離れていき、蛍光クエンチャーとフルオロフォアが互いに引き離される。そのとき、放出される蛍光は、標的上でのプローブのハイブリダイゼーションを反映し、これは、その増幅の間に検出され、任意で定量される。その場合、これは、リアルタイム均一相検出と呼ばれる。しかしながら、これらの分子ビーコンプローブは、特定の汚染物質の存在下で「ステム」部分の望ましくない早過ぎる開裂を示すことがある。分子ビーコンプローブが、例えば、ＮＡＳＢＡタイプの増幅で使用される酵素のような、反応混合物中に存在する酵素と未知の機構によって相互作用することが実際に観察されている。これらの相互作用は、任意の生物学的標的の非存在下でも生じ、非特異的蛍光シグナルの増加の原因となる。
【０００５】
分子ビーコンプローブは、ステムの配列に対する非常に特別な設計を余儀なくさせる重大な合成制約を有する。実際、それらは、特に後者がＧＣ塩基に富む場合、検出される標的に非特異的にハイブリダイズし、偽陽性または相当なバックグラウンドノイズを誘導して、検出の感度に影響を与えることがある。さらに、ステムを形成させるために、２つの相補的配列を導入する必要があり；その場合、ヘアピンプローブの完全な配列は、通常２０個のヌクレオチドしか分子認識に必要でないのに、少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。したがって、これらのヘアピンプローブの合成における収量はかなり限られている。これらのプローブの別の欠点は、ループのそれ自体への折り返しと内部「ループ−ループ」相互作用とを促進する「ステム−ループ」構造のために、ヘアピン構造を設計するのが難しいことである。したがって、その場合、必要とされる熱力学特性を有する配列を見出す前に、いくつかの設計と合成が必要であることが多い。
【０００６】
ステムの非特異的なハイブリダイゼーションの問題を克服するよう努力するために、様々な解決法が提案されてきた。一例として、Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ ２００５；３３：ｅ７７）は、ステムの天然ヌクレオチドを、ステムを形成するよう互いにハイブリダイズするが、標的の天然ヌクレオチドにはハイブリダイズすることができない修飾ヌクレオチドと置き換えることを提案した。このアプローチの主な欠点は、認識配列の各末端に、少なくとも４または５ユニットのこの修飾ヌクレオチドを導入する必要性であるが、それは市販されておらず、これにより、ヘアピンプローブの合成はより複雑なものとなっている。さらに、このアプローチは、完全な配列のヌクレオチドの数の多さの問題も、ヘアピン構造を設計する難しさの問題も解決しない。
【０００７】
Ｂｒｏｗｎｅ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１９８９?１９９４）によって提案された別の解決法は、逆向きのヌクレオチドをステムの２つの配列に挿入することからなる。この実施形態では、ステムの配列は、それらが標的と同様の（パラレル）配向となるので、ループにハイブリダイズした配列に隣接する標的の配列に直接ハイブリダイズすることができない。この技術の欠点は、ステムの配列が、折り畳まれて、この相互作用に接近可能となり得る他のより離れた標的の配列と相互作用することができるということである。さらに、完全な配列のヌクレオチドの数の多さの問題とヘアピン構造の不安定性の問題は、このアプローチによって解決されない。
【０００８】
Ｔｓｏｕｒｋａｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｏｃｔ ２００２；３０：４２０８−４２１５）によって提案された別の解決法は、ステムを形成する配列の１つが認識配列の部分も形成するようにヘアピンプローブを設計することからなる。この解決法によって、プローブの完全な配列を短くすることが可能になる。しかしながら、この設計と関連する特異性の喪失が観察されている。さらに、同じ認識配列のために、この種の設計はより短いループを有し、これにより、その柔軟性が制限され、ループ−ループ相互作用が強固になり、プローブの熱力学特性がより予測しがたいものになる。
【０００９】
それゆえ、従来技術の欠点が克服されるのを可能にする新しいプローブ形式に対する真の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、標的核酸を検出するための新規のプローブであって、
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖から構成されており、前記検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含まず、この２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに、この検出プローブが完全な円形を有し、それにより該閉鎖配列が該プローブを該標的核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持する、標的核酸を検出するための新規のプローブに関する。「完全な円」は、２つの閉鎖配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成し、これらの閉鎖配列のうちの１つの末端の１つが認識配列を介してもう１つの閉鎖配列の反対の末端に接続され、全体が図１と２にあるような円を形成するプローブの立体構造を意味する。ヘアピン構造とは対照的に、この立体構造は、ループ配列を、ステムの２つの末端の間に延びた、線形配置に維持することを可能にし、これによって、ループの配列における内部相互作用が妨げられ、相補的な標的によるその接近可能性も促進される。
【００１１】
本発明の興味深い実施形態では、検出プローブは、第１のマーカーが第１の断片のヌクレオチドによって担持され、第２のマーカーが第２のまたは第３の断片のヌクレオチドによって担持され、２つの閉鎖配列がハイブリダイズするとき、この２つのヌクレオチドが近接することを特徴とする。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、検出プローブは、２つの閉鎖配列の全てまたは一部が平行にハイブリダイズすることを特徴とする。有利には、これらの閉鎖配列のうちの１つは、α−アノマーヌクレオチドで構成された配列である。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、検出プローブは、２つの閉鎖配列の全てまたは一部が逆平行にハイブリダイズすることを特徴とする。有利には、これらの閉鎖配列のうちの１つは、５’−５’または３’−３’逆方向結合によって認識配列に結合している。
【００１４】
有利には、少なくとも１つのマーカーはフルオロフォアであり、少なくとも１つの他のマーカーは蛍光クエンチャーである。したがって、２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズするとき、マーカーを担持するヌクレオチドは近接し、その結果、励起後のフルオロフォアのエネルギーの全てまたは大部分が蛍光クエンチャーに移される。好ましくは、２つのマーカーは互いに反対の位置にあるヌクレオチドによって運ばれ、これら２つのヌクレオチドは、水素結合によって結合されて塩基対合を形成するか、または１〜５ヌクレオチド離れている。
【００１５】
有利には、第１のまたは第２の閉鎖配列の全てまたは一部は、標的配列にハイブリダイズすることができる。これらの閉鎖配列のうちの１つは標的上に固定されており、２つの閉鎖配列は、それらが両方とも柔軟性のある一本鎖立体構造をしている場合と同じ程度には互いに接近することができないので、この立体構造は、フルオロフォアと蛍光クエンチャーの間のギャップのより良好な制御を提供する。この立体構造は、非特異的に相互作用することができる遊離ヌクレオチドの数を減らすおよび完全な配列のヌクレオチドの数を減らす利点も有する。有利には、プローブの長さは、２５から４０ヌクレオチドの間である。
【００１６】
前述の実施形態によれば、標的配列にハイブリダイズした時点で、プローブは、ハイブリダイゼーションに関与する閉鎖配列を有するが、もう１つの閉鎖配列は、その逆向きの配向またはαヌクレオチドの存在のために、ハイブリダイズすることができない。この立体構造により、非特異的なハイブリダイゼーションを制限することが可能になる。さらに、プローブの設計中、修飾された（αまたは逆向き）閉鎖配列のプローブの残りの部分への付加は、認識配列の設計に影響を及ぼさない。したがって、設計は、検出条件との関連において標的の適切な相補的配列を規定することと、その後、標的とのあり得る相互作用を検証する必要なしに、またはヘアピンプローブの場合のように、各末端に配列を付加する必要なしに、その末端の１つに、標的にハイブリダイズすることができるもう１つの閉鎖配列に相補的な修飾された（αまたは逆向き）閉鎖配列を付加することとに限定される。それゆえ、これにより、プローブの設計が容易になる。
【００１７】
また有利には、閉鎖配列の長さは、６から３０ヌクレオチドの間、好ましくは６から１５ヌクレオチドの間である。
【００１８】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、検出プローブに付加される。好ましくは、それは、天然の閉鎖配列の末端に、すなわち、逆向きでもなく、αヌクレオチドで構成されてもいない配列に付加される。したがって、本発明による検出プローブを、特許出願ＷＯ−Ａ−０７／１１４９８６に従って「触角プローブ」と呼ばれるプローブ設計に適合させることができる。
【００１９】
本発明による検出プローブを、ヌクレオチドプローブが標的核酸を検出するために使用される任意の検査で利用することができる。したがって、本発明の別の目的は、試料中に存在し得る標的配列を検出するための方法であって、以下の段階：
− 該試料を本発明による検出プローブと接触させること、
− 該試料中の該標的配列の存在を示す、検出プローブと標的配列の間のハイブリッドの形成を検出すること
を含む、方法に関する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、検出は、標的配列の増幅の反応とともに実施され；その場合、これは、リアルタイム検出と呼ばれる。別の実施形態では、検出は、標的配列の増幅の反応の後に実施され、その場合、これは、「終点」検出と呼ばれる。増幅反応は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＳＤＡ、ＲＣＡなどの、線形のまたは指数関数的な、任意の増幅の方法に基づくことができる。好ましくは、増幅の方法は、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡまたは非対称性ＰＣＲなどの、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸を生じさせる増幅の方法である。
【００２１】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの本発明による検出プローブを含む標的配列を検出するためのキットに関する。このキットは、増幅反応を実施するために必要な試薬とプライマー配列を任意で含有することができる。例えば、ＮＡＳＢＡ増幅に好適な、本発明によるキットは、ヌクレオチドと、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの増幅酵素とを含有することができる。
【００２２】
以下の定義は、本発明のより良い理解を提供するであろう。
【００２３】
「核酸」または「ヌクレオチド配列」という用語は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを任意で含む少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの鎖を意味する。このポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、例えば、α−オリゴヌクレオチド（ＦＲ ２ ６０７ ５０７）またはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１８９５−１８９７，１９９２）または２’−Ｏ−アルキルリボースおよびＬＮＡ（ＢＷ，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１６０−４１６９，４３，２００４）などの骨格のレベルで修飾することもできる。核酸は、天然または合成のもの、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、
・特許ＵＳ−Ａ−４，６８３、１９５、ＵＳ−Ａ−４，６８３、２０２およびＵＳ−Ａ−４，８００，１５９に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ならびに特許ＥＰ−Ｂ−０，５６９，２７２に記載されているような、特に１段階方式の、その派生的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、
・例えば、特許出願ＥＰ−Ａ−０，２０１，１８４に開示されている、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９に記載されている、ＲＣＲ（修復連鎖反応）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５に関する３ＳＲ（自己持続性配列複製）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８に関するＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、
・特許ＵＳ−Ａ−５，３９９，４９１に関するＴＭＡ（転写媒介増幅）、ならびに
・特許ＵＳ−６，５７６，４４８に記載されているＲＣＡ（ローリングサイクル増幅）
などの酵素的増幅技術によって得られる核酸であることができる。
【００２４】
本発明の意味において、「標的」または「標的核酸」は、ヌクレオチド単位の鎖の少なくとも１つの部分が、使用される検出プローブのヌクレオチド配列に特異的でかつ相補的であるヌクレオチド配列を意味する。標的は、天然であるかまたはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）もしくは当業者により知られている任意の他の技術などの、インビトロでの酵素的増幅の反応から得ることができる。標的配列がインビトロでの酵素的増幅の反応から生じるとき、この増幅によって生じる配列は、「アンプリコン」と呼ばれる。
【００２５】
「検出プローブ」は、１０〜１００ヌクレオチド単位、特に１０〜５０ヌクレオチド単位および好ましくは２５〜４０ヌクレオチドの核酸配列を意味する。このプローブは、ヌクレオチド単位の鎖の少なくとも１つの部分が標的のヌクレオチド配列に特異的でかつ相補的である、第２の断片と呼ばれるヌクレオチド断片を含む。このプローブは、その長さが６から３０ヌクレオチドの間および好ましくは６から１５ヌクレオチドの間である閉鎖配列を各々有する、第１の断片および第３の断片と呼ばれる２つの他の断片も含む。
【００２６】
「第１の断片」は、相補的であり、かつ後者が存在するときに該第３の部分に好適な極性であることができるヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
「第２の断片」は、標的の配列に好適な極性の相補的ヌクレオチド配列を意味する。
【００２８】
「第３の断片」は、該第１の部分に好適な極性の相補的ヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「マーカー」は、ヌクレオチドによって運ばれる分子を意味する。マーカーとヌクレオチドの間の結合を、当業者により知られている様々な方法で達成することができる。手動カップリングは、対応する反応基（例えば、アミンもしくはチオール）を担持する修飾された内部ヌクレオチドに、またはこれらの同じ反応基で修飾されたヌクレオチド鎖の１つの末端にカップリングされた、活性化基、典型的にはカルボキシルまたはチオールを担持するマーカーを用いて行なわれる。自動カップリングは、マーカーを担持するホスホロアミダイトを用いて達成され、次に、ヌクレオチド鎖の自動合成の間に、使用されるホスホロアミダイトの種類によって、鎖の１つの末端にか、または内部位置かのいずれかにカップリングが起こる。
【００３０】
「フルオロフォア」は、それが好適な波長の光によって励起されたときに蛍光シグナルを放出する分子を意味する。フルオロフォアは、使用される測定機器に応じて、特にローダミンもしくはＴｅｘａｓ Ｒｅｄなどの誘導体、フルオレセインもしくは誘導体、Ａｌｅｘａ ５３２およびＡｌｅｘａ ６４７、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ ７００、Ａｌｅｘａ ６８０などのＡｌｅｘａファミリーのフルオロフォア、または好適である任意の他のフルオロフォアであることができる。検出プローブに利用可能なフルオロフォアは、非常に多様であり、かつ当業者により知られている。
【００３１】
本発明の意味において、「フルオレセイン」は、それが約４９５ｎｍの波長を有する光によって励起されたときに、約５３０ｎｍでの最大放出を有する蛍光シグナルを放出する芳香族化学分子を意味する。
【００３２】
「蛍光クエンチャー」または「クエンチャー」は、フルオロフォアによって放出された蛍光と干渉する分子を意味する。寄生放出を避けるために、このクエンチャーを非蛍光芳香族分子から選択することができる。好ましくは、該クエンチャーは、それらがフルオロフォアに物理的に近い所にあるときに蛍光の放出を妨げる非蛍光芳香族分子である、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）またはダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）または「ブラックホールクエンチャー（商標）」である。例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐ．４，Ｅｄ．Ｖ．Ｖ．Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００６，ＩＳＳＮ １０６４−３７４５に記載されているような、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の技術を使用することもできる。クエンチャーを、蛍光分子、例えば、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）から選択することもできる。
【００３３】
「極性」は、その相補的配列に対する、５’から３’へのまたは３’から５’への、ヌクレオチド配列の配向を意味する。したがって、部分を以下のように配向させることができる：
逆平行：この場合、オリゴヌクレオチドは、相補的配列に対して反対の方向でハイブリダイズしている。本発明において、実施形態の１つは、該閉鎖配列がもう１つの閉鎖配列にハイズリダイズしたときに検出プローブが円い形となるように、そのとき逆向きのヌクレオチドから構成されている閉鎖配列のうちの１つを有する。
平行：この場合、オリゴヌクレオチドは、相補的配列と同じ方向でハイブリダイズしている。本発明において、実施形態の１つは、該閉鎖配列がもう１つの閉鎖配列にハイズリダイズしたときに検出プローブが円い形となるように、そのときαヌクレオチドで構成されている閉鎖配列のうちの１つを有する。
【００３４】
「ハイブリダイゼーション」は、好適な条件において、十分に相補的である配列を完全にまたは部分的に有する２つの一本鎖ヌクレオチド断片が、核酸塩基間の水素結合によって安定化される二本鎖または「二重鎖」を形成することができる過程を意味する。ハイブリダイゼーション条件は、操作条件のストリンジェンシーと低塩分によって決定される。ハイブリダイゼーションは、それがより大きいストリンジェンシーの下で実施されるとき、より特異的である。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二重鎖の塩基組成との関連において、および２つの核酸間の誤対合の程度によって規定される。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度と種類、変性剤の性質と濃度、および／またはハイブリダイゼーション温度などの、反応変数の関数であることもできる。ハイブリダイゼーション反応が実施されなければならない条件のストリンジェンシーは、主に、使用されるハイブリダイゼーションプローブによって決まる。これらのデータは全て周知であり、適当な条件は当業者によって決定されることができる。
【００３５】
「αヌクレオチド」または「α−アノマーヌクレオチド」は、デオキシリボースのアノマー炭素によって運ばれる窒素含有塩基が、βヌクレオチドの場合のように平面より上にある代わりに、平面より下に位置する非天然のα−アノマー形状を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味する。αヌクレオチドの窒素含有塩基は、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基であることができる。αヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、または例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース、ＰＮＡおよびＬＮＡなどの、骨格のレベルで修飾することもできる。好ましくは、αヌクレオチドは、出願ＷＯ−Ａ−８８／０４３０１に記載されているものである。
【００３６】
「逆向きのヌクレオチド」は、それらを含有する配列のそれと反対の配向を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味する。慣行に従って、合成は３’から５’の方向に行なわれるが、逆向きのヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖の残りの部分の後ろまたは前に、５’から３’の方向に導入される。その後、逆向きのヌクレオチドと鎖の残りの部分は、５’−５’または３’−３’結合によって結合される。参照が、Ｋｏｇａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，５６，３７５７に対してなされてもよい。逆向きのヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを任意で含むことができる。逆向きのヌクレオチドを、例えば、ＰＮＡ、２’−Ｏ−アルキルリボースおよびＬＮＡなどの骨格のレベルで修飾することもできる。
【００３７】
「末端」は、最初または最後のヌクレオシドにより運ばれる遊離ヒドロキシルによって運ばれる数字、すなわち、３’または５’によって一般に規定されるオリゴヌクレオチドの合成の始点と終点を意味する。伸長単位（αまたはβヌクレオシドのホスホロアミダイト、逆向きであるかないかを問わない）を適切に選択すれば、オリゴヌクレオチドを３’から５’の方向にもしくは反対の方向に合成することができるし、または伸長の方向は、合成中に、交互に入れ替わることすらできることが理解される。これにより、３’−５’、５’−３’、３’−３’または５’−５’末端を担持するオリゴヌクレオチドが生じる。
【００３８】
本発明の意味において、「生物学的試料」は、核酸を含有し得る任意の試料を意味する。後者は、組織、血液、血清、唾液、患者の循環細胞から抽出することができるし、または食品、食品加工物に由来するものであることができるし、または環境起源のものであることができる。抽出は、当業者により知られている任意のプロトコルによって、例えば、特許ＥＰ−Ｂ−０，３６９，０６３に記載されている単離の方法に従って行なうことができる。
【００３９】
添付の図面は、説明的な例として示されており、決して限定的なものではない。それらは、本発明を理解するのをより容易にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明によるプローブの完全な円形の立体構造の例。Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォア小文字のヌクレオチド：αヌクレオチドＱ：蛍光クエンチャー
【図２】本発明によるプローブの完全な円形の立体構造の例。Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォアＱ：蛍光クエンチャー小文字のヌクレオチド：逆向きのヌクレオチド
【図３】実施例１に記載されるような、インフルエンザＢモデルのα型の本発明によるプローブの熱変性の実験（セ氏温度（℃）で測定された温度の関数としての任意単位（相対蛍光単位を表すＲＦＵ）での蛍光放出）。図３ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図３ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図４】実施例１に記載されるような、ＨＩＶモデルのα型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図４ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図４ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図５】実施例２に記載されるような、インフルエンザＢモデルの逆向き型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図５ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図５ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図６】実施例２に記載されるような、ＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図６ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図６ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図７】インフルエンザＢ標的モデルでの本発明によるα型のプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてのセ氏温度で測定された融解点（「融解温度」を表すＴｍ）の値を示す。
【図８】ＨＩＶ−１Ａ標的モデルでの本発明によるα型のプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＨｏａ８（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてのセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図９】インフルエンザＢ標的モデルでの逆向き型の本発明によるプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図１０】ＨＩＶ−１Ａ標的モデルでの逆向き型の本発明によるプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＨｏｉ８（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図１１】反応混合物中の汚染物質の存在下での分子ビーコンプローブのおよび本発明によるプローブの望ましくない早過ぎる開裂の研究。図１１ａ：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の存在下でのプローブの蛍光シグナル（任意単位、各値を最小初期値で割ることにより（分で表される）時間の関数として標準化された蛍光）の測定。図１１ｂ：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の非存在下でのプローブの蛍光シグナル（任意単位、各値を最小初期値で割ることにより（分で表される）時間の関数として標準化された蛍光）の測定。
【図１２】本発明によるプローブで使用される様々な構造の表示。図１２ａ：使用される様々なヌクレオチドの構造：ヌクレオチド１＝β−アノマーヌクレオチド、ヌクレオチド２＝α−アノマーヌクレオチド、ヌクレオチド３＝逆向きのヌクレオチド。図１２ｂ：鎖の１つがαヌクレオチドで構成されているときの本発明によるプローブの閉鎖配列のハイブリダイゼーションの例（ここで、ＴはｄＴ−ＦＡＭ、すなわち、この分子のフルオロフォアであり；Ｑは蛍光クエンチャーに対応し；小文字のヌクレオチドはこの図表の右側部分にあるαヌクレオチドであり、一方、点線で引かれた円はこの図表の左側部分にあるこれらの同じα−アノマーヌクレオチドを示し；最後に、この図表の右側部分にある、大文字のヌクレオチドは、左側に、円になっていない塩基Ｂを含有する、βヌクレオチドである）。図１２ｃ：鎖の１つが逆向きのヌクレオチドで構成されているときの本発明によるプローブの閉鎖配列のハイブリダイゼーションの例（ここで、Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォア；Ｑ：蛍光クエンチャー；小文字のヌクレオチド；逆向きのヌクレオチド；点線で引かれた円は５’−５’結合を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に示される全ての実施例で使用される、本発明によるプローブ、分子ビーコンプローブおよび標的核酸を、当業者により知られている、ホスホロアミダイトを用いる合成手順に従って合成する。ホスホロアミダイトを用いる合成の方法は、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｌｙｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，２２３−２３１１，１９９２）により記載された。試薬およびホスホロアミダイトを、市販で、特に、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｓ．Ａ．（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から購入する。修飾αヌクレオチドを導入するために使用される、αホスホロアミダイトを、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号．ＡＮＰ−１６５１、ＡＮＰ−１６５２、ＡＮＰ−１６５３、ＡＮＰ−１６５４）から購入する。逆向きのヌクレオチドを導入するために使用される、逆向きのホスホロアミダイトを、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ，カタログ番号．１０−０００１、１０−０１０１、１０−０２０１、１０−０３０１）から購入する。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製した。それらの純度もＨＰＬＣ分析によりモニタリングし、それらの同一性をＭａｌｄｉ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによりモニタリングした。
【００４２】
本発明によるプローブおよび分子ビーコンで使用されるマーカーは：
− Ｄａと表記される、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）蛍光クエンチャー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号２０−５９１２）
− ＦＡＭ（フルオレセイン−アミン）フルオロフォア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｃ−２２１０
− ｄＴ−ＦＡＭと表記される、デオキシチミンヌクレオチドに付加されたＦＡＭ（フルオレセイン−アミン）フルオロフォア（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０−１０５６）
である。
【００４３】
実施例１：インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルのα型の本発明のプローブの、それらの標的配列に対するハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明のプローブが、相補的な標的配列の存在下でのハイブリダイゼーションによって蛍光シグナルを生じさせることができることを示すことである。
【００４４】
実験設計：使用したプローブは以下の通りである：
インフルエンザＢモデル − Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
ＨＩＶモデル − ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
【００４５】
下線が付されたヌクレオチド配列は、本発明のプローブの閉鎖配列に対応する。
【００４６】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【００４７】
使用した合成標的配列は以下の通りである：
インフルエンザＢモデル、標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
ＨＩＶモデル、標的ｃＨ４（配列番号４）：
５’−ＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴ−３’
【００４８】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【００４９】
最終容量は、２０μｌである。
【００５０】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【００５１】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。
【００５２】
結果：得られた結果を図３および４に示す。
【００５３】
それらのそれぞれの合成標的配列（図３ａおよび４ａ）の存在下でのプローブＯｐａ６およびＨｏａ８は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブはその標的にハイブリダイズしており、フルオロフォアはクエンチャーから最大限離れている。蛍光は最大である。高温で、プローブ／標的二重らせんは不安定化し、プローブは一本鎖になり始め、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離は減少し、蛍光の減少を引き起こす。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍは、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する。Ｔｍ−標的は、曲線の一次導関数の最小値として計算される。プローブＯｐａ６およびＨｏａ８は、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、それらの標的にハイブリダイズしたままにし、したがって、その標的配列の存在下で最大の蛍光シグナルを生じさせることを可能にするＴｍ−標的（表１参照）を有する。
【００５４】
Ｏｐａ６ｄおよびＨｏａ８プローブ単独（図３ｂおよび４ｂ）は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブは円い形で構造化され、フルオロフォアはクエンチャーの非常に近くにある。放出される蛍光は非常にわずかである。高温で、二次構造は解離し、フルオロフォアはクエンチャーから離れ、蛍光放出は徐々に増加し、二次構造が完全に変性したときにプラトーに達する。プローブの二次構造の熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する、「Ｔｍ−プローブ」の値によって示される。Ｔｍ−プローブは、曲線の一次導関数の最大値として計算される。Ｏｐａ６ｄおよびＨｏａ８プローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、閉じたままにし、したがって、その標的配列の非存在下で最小の残存蛍光を生じさせることを可能にするＴｍ−プローブ（表１参照）を有する。
【００５５】
「Ｏ／Ｃ比」とも呼ばれる、「開／閉比」により、４１℃でその標的の存在下でプローブにより生じるシグナルのレベルを測定することが可能になる。それは、プローブ単独により生じる残存シグナルに対するその標的配列の存在下でプローブにより生じるシグナルの比として計算される。
【００５６】
表１は、この実施例に記載されたプローブで得られたＴｍ−プローブ、Ｔｍ−標的およびＯ／Ｃ比の値を示す。
【００５７】
結論：単独で溶液中にある、インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルのα型の本発明によるプローブは、４１℃で安定な二次構造を形成し、フルオロフォアとクエンチャーの近接性のために、蛍光シグナルの消光をもたらす。
【００５８】
それらが、それらの合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらは、それらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。
【００５９】
実施例２：インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブのそれらの標的配列に対するハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明による修飾されたプローブが、相補的な標的配列の存在下でのハイブリダイゼーションによって蛍光シグナルを生じさせることができることを示すことである。
【００６０】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
インフルエンザＢモデル − プローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
ＨＩＶモデル − プローブＨＯｉ８ｄ（配列番号６）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
【００６１】
下線が付された配列は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００６２】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【００６３】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
インフルエンザＢモデル、標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
ＨＩＶモデル、標的ｃＨ４（配列番号４）：
５’−ＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴ−３’
【００６４】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ，ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【００６５】
最終容量は、２０μｌである。
【００６６】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【００６７】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度対蛍光のグラフの形で表す。
【００６８】
結果：得られた結果を図５および６に示す。
【００６９】
それらのそれぞれの合成標的配列（図５ａおよび６ａ）の存在下でのＯｐｉ６およびＨｏｉ８ｄプローブは、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブはその標的にハイブリダイズし、フルオロフォアをクエンチャーから離すのに十分固い二重鎖を形成する。この二重鎖において、２つの分子は最大限離れている。放出される蛍光は最大である。
【００７０】
高温で、プローブ／標的二重らせんは解離し、その後、プローブは一本鎖になり始める。この場合、このプローブ内の二次構造が解離したとしても、変性したプローブの柔軟性のために、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離は、プローブ／標的二重らせんにおけるそれよりも小さい。これが、消光による蛍光の減少を引き起こす。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する、「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、曲線の一次導関数の最小値として計算される。Ｏｐｉ６およびＨｏｉ８ｄプローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、それらの標的にハイブリダイズしたままにし、したがって、それらの標的配列の存在下で最大の蛍光シグナルを生じさせることを可能にするＴｍ−標的（表２参照）を有する。
【００７１】
Ｏｐｉ６ｄおよびＨｏｉ８ｄプローブ単独（図５ｂおよび５ｂ）は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブは円い形で構造化され、フルオロフォアはクエンチャーの非常に近くにある。放出される蛍光は非常にわずかである。高温で、二次構造は解離し、フルオロフォアはクエンチャーから離れ、蛍光放出は徐々に増加し、二次構造が完全に変性したときにプラトーに達する。プローブの二次構造の熱安定性は、曲線の転換点に対応する、「Ｔｍ−プローブ」の値によって示される。Ｔｍ−プローブは、曲線蛍光＝ｆ（温度）の一次導関数の最大値として計算される。Ｏｐｉ６ｄおよびＨｏｉ８ｄプローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、閉じたままにし、したがって、その標的配列の非存在下で最小の残存蛍光を生じさせることを可能にするＴｍ−プローブ（表２参照）を有する。
【００７２】
「Ｏ／Ｃ比」とも呼ばれる、「開／閉比」により、４１℃でその標的の存在下でプローブにより生じるシグナルのレベルを測定することが可能になる。それは、プローブ単独により生じる残存シグナルに対するその標的配列の存在下でプローブにより生じるシグナルの比として計算される。
【００７３】
表２は、この実施例に記載されたプローブで得られたＴｍ−プローブ、Ｔｍ−標的およびＯ／Ｃ比の全ての値を示す。
【００７４】
結論：単独で溶液中にある、インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブは、４１℃で安定な二次構造を形成し、フルオロフォアとクエンチャーの近接性のために、蛍光シグナルの消光をもたらす。
【００７５】
それらが、それらの合成標的配列の存在下で溶液中にある場合、それらは、それらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。
【００７６】
実施例３：α型の本発明によるプローブによる標的インフルエンザＢのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【００７７】
実験設計：増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、インフルエンザＢウイルスのゲノムの配列に対応する。
【００７８】
使用したプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ１（配列番号７）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＡ−３’
Ｐ２（配列番号８）：
５’−ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡ−３’
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
【００７９】
プライマーＰ１のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【００８０】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００８１】
Ｏｐａ６ｄプローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【００８２】
プライマーＰ１の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ２の配列は、プライマーＰ１の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ１のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ２の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【００８３】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６ ＆ ６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ１、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ２、
・０．１６μｌの１０μＭのＯｐａ６ｄプローブ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【００８４】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。全ての実験を二重に行なう。
【００８５】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェア６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、ＦＡＭフルオロフォアにより放出される蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取りながら、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアによってモニタリングした。
【００８６】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。「α３」という値は、Ｗｅｕｓｔｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００２，ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．６，ｅ２６）の論文に記載されたような「プライマー消耗時間」である。この値は、蛍光シグナルの増加が検出可能になり始める時間に対応する。増幅が速く、それゆえ、効率的になればなるほど、α３値はますます小さくなる。
【００８７】
「ＭＳＲ」という値は、「最大シグナル比」である。この値は、シグナルが増加し始める前の、初期値に対して外挿される理論的な最終蛍光値に対する増幅反応の最後に読み取られる蛍光値の比に対応する。この値は、プローブによって取得されるシグナルレベルであり、陽性とみなされるシグナルについては１よりも大きくならなければならない。これら２つの値は、各試料について、ＥａｓｙＱリーダーというソフトウェアによって自動的に計算され、表示される。
【００８８】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーの標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、４．４７の最適「ＭＳＲ」と２３分から３１分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【００８９】
結論：
本発明によるＯｐａ６ｄプローブは、４．４７（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、２３分から３１分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【００９０】
実施例４：逆向き型の本発明によるプローブによる標的インフルエンザＢのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【００９１】
実験設計：
増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、インフルエンザＢウイルスのゲノムの配列に対応する。
【００９２】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ１（配列番号７）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＡ−３’
Ｐ２（配列番号８）：
５’−ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡ−３’
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
【００９３】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００９４】
プライマーＰ１のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【００９５】
Ｏｐａ６ｄプローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【００９６】
プライマーＰ１の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ２の配列は、プライマーＰ１の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ１のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ２の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【００９７】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６及び６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ１、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ２、
・０．１６μｌの１０μＭのＯｐｉ６ｄプローブ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【００９８】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【００９９】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１００】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１０１】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーの標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、３．８８の最適「ＭＳＲ」と１８分から２６分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１０２】
結論：本発明によるプローブＯｐｉ６ｄは、３．８８（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１８分から２６分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１０３】
実施例５：α型の本発明によるプローブによる標的ＨＩＶのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【０１０４】
実験設計：増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、「ＨＩＶ」ヒト免疫不全ウイルスのゲノムの配列に対応する。
【０１０５】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ３（配列番号９）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡ−３’
Ｐ４（配列番号１０）：
５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
Ｈｏａ６プローブ（配列番号１１）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｃ−（ｄＴ−ＦＡＭ）−ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−Ｄａ
【０１０６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【０１０７】
プライマーＰ３のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【０１０８】
プローブＨｏａ６中の小文字で書かれたヌクレオチドは、αヌクレオチドに対応する。
【０１０９】
プライマーＰ３の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ４の配列は、プライマーＰ３の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ３のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ４の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【０１１０】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６および６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ３、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ４、
・０．１６μｌの１０μＭのプローブＨｏａ６、
反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【０１１１】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【０１１２】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１１３】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１１４】
結果：
ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーと等しいかまたはそれ未満の標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、２．５３の最適「ＭＳＲ」と１４分から２２分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１１５】
結論：
本発明によるプローブＨｏａ６は、２．５３（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１４分から２２分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１１６】
実施例６：逆向き型の本発明によるプローブによる標的ＨＩＶのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【０１１７】
実験設計：
増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、「ＨＩＶ」ヒト免疫不全ウイルスのゲノムの配列に対応する。
【０１１８】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ３（配列番号９）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡ−３’
Ｐ４（配列番号１０）：
５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
Ｈｏｉ６ｄプローブ（配列番号１２）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔ−５’
【０１１９】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【０１２０】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１２１】
プライマーＰ３のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【０１２２】
Ｈｏｉ６ｄプローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１２３】
プライマーＰ３の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ４の配列は、プライマーＰ３の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ３のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ４の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【０１２４】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６および６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ３、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ４、
・０．１６μｌの１０μＭのプローブＨｏｉ６ｄ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【０１２５】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【０１２６】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１２７】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１２８】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーと等しいかまたはそれ未満の標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、２．０３の最適「ＭＳＲ」と１５分から２１分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１２９】
結論：本発明によるプローブＨｏｉ６ｄは、２．０３（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１５分から２１分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１３０】
実施例７：インフルエンザＢモデルでの本発明によるプローブの特異性の研究
目的：プローブの特異性は、その標的のみを認識し、したがって、それを、例えば、誤対合または欠失を含む標的から区別するその能力である。分子ビーコンは、それらが、たった１つのヌクレオチドだけ異なる２つの標的の区別を可能にするので、現在、最も特異的な分子プローブである。この実験の目的は、同じ認識配列を含有する分子ビーコンプローブと比較して、本発明によるプローブの特異性のレベルを示すことである。
【０１３１】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
分子ビーコンＣＰ ＩｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐａ６プローブ（配列番号１４）：
５’−ｇａｇｃｇｔａｇｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐａ５プローブ（配列番号１５）：
５’−ｇａｇｃｔａｇｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐｉ４プローブ（配列番号１６）：
３’−ｇａｇｃｔａｇｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐｉ３ プローブ（配列番号１７）：
３’−ｇｃｔａｇｃｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＧ−３’Ｄａ
【０１３２】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列におよび分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。
【０１３３】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１３４】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１３５】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＧ（配列番号１８）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＡ（配列番号１９）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＴ（配列番号２０）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
【０１３６】
合成標的配列「ｃＣ」は、プローブの配列の一部に完全に相補的である。合成標的配列「ｃＧ」、「ｃＡ」および「ｃＴ」は、対応する文字の下線によって示される、プローブ中の相補的配列に対する誤対合を含有する。
【０１３７】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１３８】
最終容量は、２０μｌである。
【０１３９】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１４０】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度（℃）対蛍光（ＲＦＵ）のグラフの形で表す。
【０１４１】
結果：インフルエンザＢモデルについて検査されたプローブの中で、ＯＰａ６は、完全な標的（ｃＣ）と誤対合を有する標的（ｃＧ、ｃＡまたはｃＴ）の間の最も大きいＴｍ−標的の差を示すものである。
【０１４２】
この表は、得られたグラフから測定されたＴｍ値を１つにまとめている。図９は、これらのグラフの２つの例を示す。その完全な標的を含むプローブのＴｍ−標的と誤対合を有する標的を有するプローブのＴｍ−標的の間の差は、グラフ上ではっきりと見られ、プローブＯＰｉ４とＯＰａ６では１０℃に達することができる。誤対合を有する標的を含むプローブのＴｍ−標的は、プローブのＴｍ−ステムに非常に近いので、後者は、その標的とハイズリダイズする前に、それ自身に近づく。
【０１４３】
結論：本発明によるプローブは、所与の標的の特異的プローブであり、この分野でのそれらの性能は、参照分子ビーコンのそれとよく似ている。これは、所与の遺伝子における単一ヌクレオチドの変化に相当するＳＮＰすなわち単一ヌクレオチド多型の検出にとって大きな関心事となる。
【０１４４】
実施例８：ＨＩＶモデルでの本発明によるプローブの特異性の研究
目的：プローブの特異性は、その標的のみを認識し、したがって、それを、例えば、誤対合または欠失を含む標的から区別するその能力である。分子ビーコンは、それらが、たった１つのヌクレオチドだけ異なる２つの標的の区別を可能にするので、現在、最も特異的な分子プローブである。この実験の目的は、同じ認識配列を含有する分子ビーコンプローブと比較して、本発明によるプローブの特異性のレベルを示すことである。
【０１４５】
実験設計：使用されるプローブは以下の通りである：
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ６プローブ（配列番号１１）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ７（配列番号２２）：
５’−ｔｔａｃｃｃｔａｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏｉ６ｄプローブ（配列番号１２）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔ−５’
Ｈｏｉ７ｄプローブ（配列番号２３）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
Ｈｏｉ８ｄプローブ（配列番号６）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
【０１４６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列におよび分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。本発明によるプローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１４７】
本発明によるプローブ中の小文字でおよび太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１４８】
使用された合成標的配列以下の通りである：
標的ｃＨ５（配列番号２４）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＧＨ５（配列番号２５）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＡＨ５（配列番号２６）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＴＨ５（配列番号２７）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
【０１４９】
合成標的配列「ｃＨ５」は、プローブの配列の一部に完全に相補的である。合成標的配列「ｃＧＨ５」、「ｃＡＨ５」および「ｃＴＨ５」は、対応する文字の下線によって示される、プローブ中の相補的配列に対する誤対合を含有する。
【０１５０】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１５１】
最終容量は、２０μｌである。
【０１５２】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１５３】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度対蛍光のグラフの形で表す。
【０１５４】
結果：
結果を以下の表および図１０に示す。
【０１５５】
この表は、得られたグラフから測定されたＴｍ値を１つにまとめている。図１０は、これらのグラフの２つの例を示す。完全に相補的な標的でのＴｍと誤対合を含有する標的でのＴｍの間の差がはっきりと見られ、プローブＨＯｉ６ｄとＨＯｉ７ｄでは９℃に達することができる。
【０１５６】
結論：本発明によるプローブは、所与の標的の特異的プローブであり、この分野でのそれらの性能は、参照分子ビーコンＨＩＶ−１Ａのそれを上回りさえする。これは、所与の遺伝子における単一ヌクレオチドの変化に相当するＳＮＰすなわち単一ヌクレオチド多型の検出にとって大きな関心事となる。
【０１５７】
実施例９：インフルエンザＢモデルのα型の本発明によるプローブのそれらの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが分子ビーコンプローブよりも特異的に標的核酸にハイブリダイズすることを示すことである。
【０１５８】
一般に、分子ビーコンプローブを設計するとき、考慮されるＴｍは、標的配列に相補的な配列である、認識配列から計算されたＴｍ（計算Ｔｍ）である。実際、分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列は、標的核酸にハイブリダイズしないと考えられる。さて、分子ビーコンプローブの実際のＴｍは、分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列の標的配列との相互作用のために、計算されたＴｍよりもわずかに高いことがある。さらに、「ステム」部分を形成する鎖は、標的の配列に非特異的にハイブリダイズすることができ、このことは、分子ビーコンの標的へのハイブリダイゼーションの全体的な安定性を増大させ（実際のＴｍ−標的は計算されたＴｍ−標的よりも高い）、かつそれにより、このハイブリダイゼーションの特異性を低下させる効果を有する。
【０１５９】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０１６０】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０１６１】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１６２】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的６Ｂａ２Ｉ（配列番号２９）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＴＴ−３’
標的１０Ｐａ２Ｉ（配列番号３０）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＧＧＴＣ−３’
標的６Ｐａ２Ｉ（配列番号３１）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＴＴ−３’
標的１Ｂａ２Ｉ（配列番号３２）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的１Ｐａ２Ｉ（配列番号３３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的２Ｂａ２Ｉ（配列番号３４）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的２Ｐａ２Ｉ（配列番号３５）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
【０１６３】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）、または本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０１６４】
配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）は、インフルエンザＢウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。
【０１６５】
標的配列６Ｂａ２Ｉ（配列番号２９）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１６６】
標的配列１０Ｐａ２Ｉ（配列番号３０）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で強調された配列の３’に１０個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１０個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１６７】
標的配列６Ｐａ２Ｉ（配列番号３１）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１６８】
標的配列１Ｂａ２Ｉ（配列番号３２）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドに相補的である。
【０１６９】
標的配列１Ｐａ２Ｉ（配列番号３３）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１７０】
標的配列２Ｂａ２Ｉ（配列番号３４）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線で強調された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１７１】
標的配列２Ｐａ２Ｉ（配列番号３５）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１７２】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１７３】
最終容量は、２０μｌである。
【０１７４】
陰性対照は、標的配列の代わりに水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１７５】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０１７６】
結果：
結果を表５および図７に示す。表５は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）と標的Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）と標的Ｂｉｏ２ａＩ（配列番号２８）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、５７．３℃および５６．４℃に等しい。
【０１７７】
分子ビーコンプローブＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＣＰｉｎｆＢの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の増加が観察される。この増加は、分子ビーコンのステム部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に比例しており、ＣＰｉｎｆＢプローブの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列に隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０１７８】
本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）（α型のプローブ）が様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それはそれらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＯｐａ６ｄの閉鎖配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、該相補的なヌクレオチドの数にかかわらず、本発明によるプローブのＴｍ−標的の値が安定なままであることが観察される。これは、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列に隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０１７９】
結論：これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＯｐａ６ｄは、分子ビーコンプローブＣＰｉｎｆＢよりも特異的である。Ｏｐａ６ｄプローブの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０１８０】
実施例１０：ＨＩＶモデルの５’のα型の本発明による特異的プローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究
目的：この実施例における目的は、異なる標的モデルについて実施例９で既に記載されたものと同じである。
【０１８１】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
【０１８２】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０１８３】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１８４】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的５ＢＨ（配列番号３７）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＣ
標的１１ＰＨ（配列番号３８）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴ
標的５ＰＨ（配列番号３９）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＣ
標的１ＢＨ（配列番号４０）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的１ＰＨ（配列番号４１）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的２ＢＨ（配列番号４２）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的２ＰＨ（配列番号４３）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
【０１８５】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）、または本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０１８６】
標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）は、ＨＩＶウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０１８７】
標的配列５ＢＨ（配列番号３７）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１８８】
標的配列１１ＰＨ（配列番号３８）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で強調された配列の３’に１１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１１個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１８９】
標的配列５ＰＨ（配列番号３９）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９０】
標的配列１ＢＨ（配列番号４０）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１９１】
標的配列１ＰＨ（配列番号４１）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９２】
標的配列２ＢＨ（配列番号４２）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これらのヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１９３】
標的配列２ＰＨ（配列番号４３）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９４】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１９５】
最終容量は、２０μｌである。
【０１９６】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１９７】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０１９８】
結果：
結果を表６および図８に示す。以下に示す、表６は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＨｏａ８（配列番号２）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６０．６℃および６０．２℃に等しい。
【０１９９】
＊：分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と相補的標的５ＢＨ（配列番号３７）の間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２００】
ＮＡ：適用できない。本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）と相補的標的１ＢＨ（配列番号４０）の間のＴｍの値は、プロファイルが、本発明者らの方法を用いて測定可能な標準に対応しないので、測定することができなかった。この値は、グラフの経験的読取りから決定されたものであり、６０℃である。
【０２０１】
分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＨＩＶ−１Ａの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の増加が観察される。この増加は、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に比例しており、これらのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２０２】
（α型の）本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）が様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それはこれらの配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的がＨＯａ８プローブの閉鎖配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、α型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２０３】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＨＯａ８は、分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａよりも特異的である。ＨＯａ８プローブの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２０４】
実施例１１：インフルエンザＢモデルの３’の逆向き型の本発明による特異的プローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究
目的：
この実施例における目的は、実施例９で記載されたものと同じであるが、本発明によるプローブの異なる設計を用いている。
【０２０５】
実験設計：
使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０２０６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０２０７】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【０２０８】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的６ＢｉＩ（配列番号４５）：
ＴＴＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１０ＰｉＩ（配列番号４６）：
ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的６ＰｉＩ（配列番号４７）：
ＴＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１ＢｉＩ（配列番号４８）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１ＰｉＩ（配列番号４９）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
【０２０９】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）、または本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号５）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０２１０】
標的配列ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）は、インフルエンザＢウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列に相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０２１１】
標的配列６ＢｉＩ（配列番号４５）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１２】
標的配列１０ＰｉＩ（配列番号４６）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１０個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１０個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２１３】
標的配列６ＰｉＩ（配列番号４７）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１４】
標的配列１ＢｉＩ（配列番号４８）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１５】
標的配列１ＰｉＩ（配列番号４９）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２１６】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０２１７】
最終容量は、２０μｌである。
【０２１８】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱタイプの超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０２１９】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０２２０】
結果：
結果を表７および図９に示す。表７は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）と標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）と標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６２℃および６２．９℃に等しい。
【０２２１】
＊：分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）と相補的標的６ＢｉＩ（配列番号４５）の間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２２２】
分子ビーコンプローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンプローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、本発明者らは、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に対する分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の値の比例的増加を観察する。これは、プローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２２３】
（逆向き型の）本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＯｐｉ６ｄの閉鎖配列（配列番号５）の１つの相補的ヌクレオチドを含有するとき、逆向き型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２２４】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄは、分子ビーコンプローブＣＰｉｎｆＢよりも特異的である。プローブＯｐｉ６ｄの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２２５】
実施例１２：ＨＩＶモデルの５’の逆向き型の本発明によるプローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究。
目的：
この実施例における目的は、実施例９で記載されたものと同じであるが、本発明によるプローブの異なる設計と標的の異なるモデルとを用いている。
【０２２６】
実験設計：
使用されたプローブは以下の通りである：
ＨＯｉ８プローブ（配列番号５０）：
３’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
ＨＩＶ−１Ａ参照分子ビーコン（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
【０２２７】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０２２８】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【０２２９】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的５ＢＨ（配列番号３７）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１１ＰＨ（配列番号３８）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴ−３’
標的５ＰＨ（配列番号３９）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１ＢＨ（配列番号４０）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１ＰＨ（配列番号４１）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的２ＢＨ（配列番号４２）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的２ＰＨ（配列番号４３）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
【０２３０】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）または本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０２３１】
標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）は、ＨＩＶウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列に相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０２３２】
標的配列５ＢＨ（配列番号３７）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３３】
標的配列１１ＰＨ（配列番号３８）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１１個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３４】
標的配列５ＰＨ（配列番号３９）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３５】
標的配列１ＢＨ（配列番号４０）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３６】
標的配列１ＰＨ（配列番号４１）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３７】
標的配列２ＢＨ（配列番号４２）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３８】
標的配列２ＰＨ（配列番号４３）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３９】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０２４０】
最終容量は、２０μｌである。
【０２４１】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱタイプの超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０２４２】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０２４３】
結果：
結果を表８および図１０に示す。表８は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたＴｍ−標的値におよびＨＯｉ８（配列番号５０）によるプローブと標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６０．６℃および６１．１℃に等しい。
【０２４４】
＊：分子ビーコンＨＩＶ−１Ａと相補的標的５ＢＨの間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２４５】
分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的が、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に対して比例的に増加することが観察される。これは、プローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２４６】
（逆向き型の）本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＨＯｉ８の閉鎖配列（配列番号５０）のうちの１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、逆向き型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２４７】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＨｏｉ８ｄは、分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａよりも特異的である。プローブＨｏｉ８の分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２４８】
一般的結論：
これらの実施例は、本発明によるプローブの設計とは無関係に、後者が分子ビーコンプローブのそれよりも大きいハイブリダイゼーションの特異性を示すことを示している。ヌクレオチドの性質（αヌクレオチドまたは逆向きのヌクレオチド）および本発明によるプローブの第２の断片に対するそれらの位置（３’での位置または５’での位置）は、本発明によるプローブの設計の質または本発明によるプローブのハイブリダイゼーションのその標的核酸に対する特異性に影響を与えない。
【０２４９】
実施例１３：本発明によるプローブを用いることによる酵素に起因する非特異的シグナルの低下の研究。
目的：
この実施例の目的は、該プローブの早過ぎる開裂という望ましくない現象に関連した本発明によるプローブの感度を研究することである。
【０２５０】
実験設計：
プローブを、その組成が以下に記載されている、反応混合物中での、ＮＡＳＢＡで使用されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素とともに、４１℃で４時間、蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中でインキュベートする。反応混合物の組成は以下の通りである：
・供給元の取扱説明書に従って、６４μｌの基本キット試薬スフェア希釈液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号７０３５２）に希釈したＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ＥＱ基本キット試薬スフェア（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステルＮＬ，商品番号６００８５１１０）から調製した、１０μＬの「試薬ミックス」、
・３．７６マイクロリットルのソルビトール（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５１９２）、
・０．２マイクロリットルの８０ユニット／マイクロリットルの濃度の酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号７２２３６）、
・２マイクロリットルの２マイクロモルの初期濃度のプローブ。
・最終容量２０マイクロリットルにするための十分な量の「酵素ミックス溶液」。
【０２５１】
酵素以外の全ての構成要素を含有する、参照反応混合物を調製し、これを等量の「酵素ミックス溶液」と置き換える。
【０２５２】
以下のような、いくつかの他の溶液を混合することによって、「酵素ミックス溶液」を調製した：
８０μｌのＲＴ保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３４１）、
１１４μｌのＴ７保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３７）、
２０μｌのＲＨ保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３９）、
４１１μｌのプレミックス溶液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３５）、
６２５μｌのミリＱタイプの超純水。
【０２５３】
蛍光シグナルは、フルオレセインの放出波長で、４１℃で４時間記録される。
【０２５４】
使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
ＨＯｉ８プローブ（配列番号５０）：
３’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０２５５】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。
【０２５６】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０２５７】
結果：
蛍光放出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の存在下（図１１ａ）または非存在下（図１１ｂ）で、様々なプローブのインキュベーション中に測定される。
【０２５８】
標的核酸の非存在下かつＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの非存在下（図１１ｂ）では、本発明によるプローブの場合であれ、分子ビーコンプローブの場合であれ、蛍光シグナルは検出されない。これは、これらの実験条件において、フルオロフォアとクエンチャーが互いに近くにあり、蛍光の「クエンチング」が可能になることを意味する。それゆえ、分子ビーコンプローブは閉じた立体構造をしている、すなわち、ヘアピン形の二次構造を有する。
【０２５９】
本発明によるプローブは、環状立体構造と呼ばれる、閉じた立体構造をしている。
【０２６０】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下かつ任意の標的核酸の非存在下では、本発明によるプローブにより放出される蛍光は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの非存在下かつ任意の標的核酸の非存在下で測定されるものと同じである。蛍光の「クエンチング」はここでも観察される。本発明によるプローブは、酵素の存在下でさえも、依然としてそれらの最初の立体構造、すなわち、環状立体構造をしている。
【０２６１】
逆に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素を、分子ビーコンプローブを含有する反応混合物に添加したとき、蛍光シグナルの増加が観察される。これは、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離が増加したことを意味する。分子ビーコンの立体構造の変化は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの添加中に起こった。分子ビーコンプローブは開裂した。それらは、まるでそれらがそれらの標的核酸にハイブリダイズしてしまったかのように、線状の立体構造を有する。
【０２６２】
結論：
これらの結果は、解析された２つの分子ビーコン、ＣＰｉｎｆＢおよびＨＩＶ−１Ａが、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下でのそれらのインキュベーション中にシグナルの増加をもたらすのに対し、同じ条件で解析された本発明によるプローブはこの同じシグナルの増加をもたらさないということを示している。それらが３’で修飾された閉鎖配列を有するにせよ、５’で修飾された閉鎖配列を有するにせよ、およびそれらがαヌクレオチドを含有するにせよ、逆向きのヌクレオチドを含有するにせよ、この結果は、検査された全ての本発明によるプローブについて確認される。それゆえ、本発明によるプローブは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの混入物質の作用に感受性がない。本発明によるプローブの望ましくない自発的開裂はなく、それゆえ、非特異的シグナルの放出がない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のヌクレオチドプローブによる核酸の検出に関する。本発明は、診断の分野において用途を見出す。
【背景技術】
【０００２】
今日、標的ヌクレオチド配列を見出すことは、多くの研究室におけるおよび特に医療または食品加工分野における主な目的を表す。これらの分野では、標的配列を見出すことは、例えば、病原性生物を検出すること、食品加工過程において細菌汚染を発見すること、または遺伝的疾患もしくは癌の原因となる突然変異の診断といった目的を有する。これらの方法における主な困難は、使用される検査の特異性、感度、速さ、および再現性に関するものである。特に診断の分野では、明確な結果を示すことができることが絶対に必要不可欠である。
【０００３】
様々なタイプの方法が文献に記載されている。それらは通常、「核酸のハイブリダイゼーション」または単に「ハイブリダイゼーション」と一般に呼ばれる、核酸の相補鎖を対合させる特性に基づいている。
【０００４】
通常、生物のまたは解析しなければならない疾患の特定の配列を決定した後、試料から核酸を抽出し、場合により目的の配列を増幅および検出することが必要である。ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＳＤＡなどの、非常に多くの増幅の方法が開発されている。検出のための多くの技術もある。これらのうちの１つは、「分子ビーコン」と一般に呼ばれる、Ｔｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４：３０３−３０８）によって記載された、特殊なプローブを利用する。これらのプローブは、一本鎖「ループ」部分と二本鎖「ステム」部分とを含むヘアピン構造を有する。「ループ」部分は、標的ヌクレオチド配列に対する相補的配列を含有し、「ステム」部分は、互いに相補的である２つの配列によって形成されている。「ステム」部分の相補的配列のうちの１つの遊離末端がフルオロフォアで標識されているのに対し、「ステム」部分のもう１つの鎖のもう１つの遊離末端は蛍光クエンチャーと結合している。相補的な標的配列の非存在下では、検出プローブはヘアピン形であり、プローブは蛍光を生じず、フルオロフォアのエネルギーは蛍光クエンチャーに直接移される。このプローブが標的配列にハイブリダイズしたとき、それは、その形状を失い、５’および３’末端がさらに離れていき、蛍光クエンチャーとフルオロフォアが互いに引き離される。そのとき、放出される蛍光は、標的上でのプローブのハイブリダイゼーションを反映し、これは、その増幅の間に検出され、任意で定量される。その場合、これは、リアルタイム均一相検出と呼ばれる。しかしながら、これらの分子ビーコンプローブは、特定の汚染物質の存在下で「ステム」部分の望ましくない早過ぎる開裂を示すことがある。分子ビーコンプローブが、例えば、ＮＡＳＢＡタイプの増幅で使用される酵素のような、反応混合物中に存在する酵素と未知の機構によって相互作用することが実際に観察されている。これらの相互作用は、任意の生物学的標的の非存在下でも生じ、非特異的蛍光シグナルの増加の原因となる。
【０００５】
分子ビーコンプローブは、ステムの配列に対する非常に特別な設計を余儀なくさせる重大な合成制約を有する。実際、それらは、特に後者がＧＣ塩基に富む場合、検出される標的に非特異的にハイブリダイズし、偽陽性または相当なバックグラウンドノイズを誘導して、検出の感度に影響を与えることがある。さらに、ステムを形成させるために、２つの相補的配列を導入する必要があり；その場合、ヘアピンプローブの完全な配列は、通常２０個のヌクレオチドしか分子認識に必要でないのに、少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。したがって、これらのヘアピンプローブの合成における収量はかなり限られている。これらのプローブの別の欠点は、ループのそれ自体への折り返しと内部「ループ−ループ」相互作用とを促進する「ステム−ループ」構造のために、ヘアピン構造を設計するのが難しいことである。したがって、その場合、必要とされる熱力学特性を有する配列を見出す前に、いくつかの設計と合成が必要であることが多い。
【０００６】
ステムの非特異的なハイブリダイゼーションの問題を克服するよう努力するために、様々な解決法が提案されてきた。一例として、Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ ２００５；３３：ｅ７７）は、ステムの天然ヌクレオチドを、ステムを形成するよう互いにハイブリダイズするが、標的の天然ヌクレオチドにはハイブリダイズすることができない修飾ヌクレオチドと置き換えることを提案した。このアプローチの主な欠点は、認識配列の各末端に、少なくとも４または５ユニットのこの修飾ヌクレオチドを導入する必要性であるが、それは市販されておらず、これにより、ヘアピンプローブの合成はより複雑なものとなっている。さらに、このアプローチは、完全な配列のヌクレオチドの数の多さの問題も、ヘアピン構造を設計する難しさの問題も解決しない。
【０００７】
Ｂｒｏｗｎｅ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１９８９?１９９４）によって提案された別の解決法は、逆向きのヌクレオチドをステムの２つの配列に挿入することからなる。この実施形態では、ステムの配列は、それらが標的と同様の（パラレル）配向となるので、ループにハイブリダイズした配列に隣接する標的の配列に直接ハイブリダイズすることができない。この技術の欠点は、ステムの配列が、折り畳まれて、この相互作用に接近可能となり得る他のより離れた標的の配列と相互作用することができるということである。さらに、完全な配列のヌクレオチドの数の多さの問題とヘアピン構造の不安定性の問題は、このアプローチによって解決されない。
【０００８】
Ｔｓｏｕｒｋａｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｏｃｔ ２００２；３０：４２０８−４２１５）によって提案された別の解決法は、ステムを形成する配列の１つが認識配列の部分も形成するようにヘアピンプローブを設計することからなる。この解決法によって、プローブの完全な配列を短くすることが可能になる。しかしながら、この設計と関連する特異性の喪失が観察されている。さらに、同じ認識配列のために、この種の設計はより短いループを有し、これにより、その柔軟性が制限され、ループ−ループ相互作用が強固になり、プローブの熱力学特性がより予測しがたいものになる。
【０００９】
それゆえ、従来技術の欠点が克服されるのを可能にする新しいプローブ形式に対する真の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、標的核酸を検出するための新規のプローブであって、
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖から構成されており、前記検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含まず、この２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに、この検出プローブが完全な円形を有し、それにより該閉鎖配列が該プローブを該標的核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持する、標的核酸を検出するための新規のプローブに関する。「完全な円」は、２つの閉鎖配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成し、これらの閉鎖配列のうちの１つの末端の１つが認識配列を介してもう１つの閉鎖配列の反対の末端に接続され、全体が図１と２にあるような円を形成するプローブの立体構造を意味する。ヘアピン構造とは対照的に、この立体構造は、ループ配列を、ステムの２つの末端の間に延びた、線形配置に維持することを可能にし、これによって、ループの配列における内部相互作用が妨げられ、相補的な標的によるその接近可能性も促進される。
【００１１】
本発明の興味深い実施形態では、検出プローブは、第１のマーカーが第１の断片のヌクレオチドによって担持され、第２のマーカーが第２のまたは第３の断片のヌクレオチドによって担持され、２つの閉鎖配列がハイブリダイズするとき、この２つのヌクレオチドが近接することを特徴とする。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、検出プローブは、２つの閉鎖配列の全てまたは一部が平行にハイブリダイズすることを特徴とする。有利には、これらの閉鎖配列のうちの１つは、α−アノマーヌクレオチドで構成された配列である。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、検出プローブは、２つの閉鎖配列の全てまたは一部が逆平行にハイブリダイズすることを特徴とする。有利には、これらの閉鎖配列のうちの１つは、５’−５’または３’−３’逆方向結合によって認識配列に結合している。
【００１４】
有利には、少なくとも１つのマーカーはフルオロフォアであり、少なくとも１つの他のマーカーは蛍光クエンチャーである。したがって、２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズするとき、マーカーを担持するヌクレオチドは近接し、その結果、励起後のフルオロフォアのエネルギーの全てまたは大部分が蛍光クエンチャーに移される。好ましくは、２つのマーカーは互いに反対の位置にあるヌクレオチドによって運ばれ、これら２つのヌクレオチドは、水素結合によって結合されて塩基対合を形成するか、または１〜５ヌクレオチド離れている。
【００１５】
有利には、第１のまたは第２の閉鎖配列の全てまたは一部は、標的配列にハイブリダイズすることができる。これらの閉鎖配列のうちの１つは標的上に固定されており、２つの閉鎖配列は、それらが両方とも柔軟性のある一本鎖立体構造をしている場合と同じ程度には互いに接近することができないので、この立体構造は、フルオロフォアと蛍光クエンチャーの間のギャップのより良好な制御を提供する。この立体構造は、非特異的に相互作用することができる遊離ヌクレオチドの数を減らすおよび完全な配列のヌクレオチドの数を減らす利点も有する。有利には、プローブの長さは、２５から４０ヌクレオチドの間である。
【００１６】
前述の実施形態によれば、標的配列にハイブリダイズした時点で、プローブは、ハイブリダイゼーションに関与する閉鎖配列を有するが、もう１つの閉鎖配列は、その逆向きの配向またはαヌクレオチドの存在のために、ハイブリダイズすることができない。この立体構造により、非特異的なハイブリダイゼーションを制限することが可能になる。さらに、プローブの設計中、修飾された（αまたは逆向き）閉鎖配列のプローブの残りの部分への付加は、認識配列の設計に影響を及ぼさない。したがって、設計は、検出条件との関連において標的の適切な相補的配列を規定することと、その後、標的とのあり得る相互作用を検証する必要なしに、またはヘアピンプローブの場合のように、各末端に配列を付加する必要なしに、その末端の１つに、標的にハイブリダイズすることができるもう１つの閉鎖配列に相補的な修飾された（αまたは逆向き）閉鎖配列を付加することとに限定される。それゆえ、これにより、プローブの設計が容易になる。
【００１７】
また有利には、閉鎖配列の長さは、６から３０ヌクレオチドの間、好ましくは６から１５ヌクレオチドの間である。
【００１８】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、検出プローブに付加される。好ましくは、それは、天然の閉鎖配列の末端に、すなわち、逆向きでもなく、αヌクレオチドで構成されてもいない配列に付加される。したがって、本発明による検出プローブを、特許出願ＷＯ−Ａ−０７／１１４９８６に従って「触角プローブ」と呼ばれるプローブ設計に適合させることができる。
【００１９】
本発明による検出プローブを、ヌクレオチドプローブが標的核酸を検出するために使用される任意の検査で利用することができる。したがって、本発明の別の目的は、試料中に存在し得る標的配列を検出するための方法であって、以下の段階：
− 該試料を本発明による検出プローブと接触させること、
− 該試料中の該標的配列の存在を示す、検出プローブと標的配列の間のハイブリッドの形成を検出すること
を含む、方法に関する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、検出は、標的配列の増幅の反応とともに実施され；その場合、これは、リアルタイム検出と呼ばれる。別の実施形態では、検出は、標的配列の増幅の反応の後に実施され、その場合、これは、「終点」検出と呼ばれる。増幅反応は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＳＤＡ、ＲＣＡなどの、線形のまたは指数関数的な、任意の増幅の方法に基づくことができる。好ましくは、増幅の方法は、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡまたは非対称性ＰＣＲなどの、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸を生じさせる増幅の方法である。
【００２１】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの本発明による検出プローブを含む標的配列を検出するためのキットに関する。このキットは、増幅反応を実施するために必要な試薬とプライマー配列を任意で含有することができる。例えば、ＮＡＳＢＡ増幅に好適な、本発明によるキットは、ヌクレオチドと、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの増幅酵素とを含有することができる。
【００２２】
以下の定義は、本発明のより良い理解を提供するであろう。
【００２３】
「核酸」または「ヌクレオチド配列」という用語は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを任意で含む少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの鎖を意味する。このポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、例えば、α−オリゴヌクレオチド（ＦＲ ２ ６０７ ５０７）またはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１８９５−１８９７，１９９２）または２’−Ｏ−アルキルリボースおよびＬＮＡ（ＢＷ，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１６０−４１６９，４３，２００４）などの骨格のレベルで修飾することもできる。核酸は、天然または合成のもの、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、
・特許ＵＳ−Ａ−４，６８３、１９５、ＵＳ−Ａ−４，６８３、２０２およびＵＳ−Ａ−４，８００，１５９に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ならびに特許ＥＰ−Ｂ−０，５６９，２７２に記載されているような、特に１段階方式の、その派生的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、
・例えば、特許出願ＥＰ−Ａ−０，２０１，１８４に開示されている、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９に記載されている、ＲＣＲ（修復連鎖反応）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５に関する３ＳＲ（自己持続性配列複製）、
・特許出願ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８に関するＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、
・特許ＵＳ−Ａ−５，３９９，４９１に関するＴＭＡ（転写媒介増幅）、ならびに
・特許ＵＳ−６，５７６，４４８に記載されているＲＣＡ（ローリングサイクル増幅）
などの酵素的増幅技術によって得られる核酸であることができる。
【００２４】
本発明の意味において、「標的」または「標的核酸」は、ヌクレオチド単位の鎖の少なくとも１つの部分が、使用される検出プローブのヌクレオチド配列に特異的でかつ相補的であるヌクレオチド配列を意味する。標的は、天然であるかまたはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）もしくは当業者により知られている任意の他の技術などの、インビトロでの酵素的増幅の反応から得ることができる。標的配列がインビトロでの酵素的増幅の反応から生じるとき、この増幅によって生じる配列は、「アンプリコン」と呼ばれる。
【００２５】
「検出プローブ」は、１０〜１００ヌクレオチド単位、特に１０〜５０ヌクレオチド単位および好ましくは２５〜４０ヌクレオチドの核酸配列を意味する。このプローブは、ヌクレオチド単位の鎖の少なくとも１つの部分が標的のヌクレオチド配列に特異的でかつ相補的である、第２の断片と呼ばれるヌクレオチド断片を含む。このプローブは、その長さが６から３０ヌクレオチドの間および好ましくは６から１５ヌクレオチドの間である閉鎖配列を各々有する、第１の断片および第３の断片と呼ばれる２つの他の断片も含む。
【００２６】
「第１の断片」は、相補的であり、かつ後者が存在するときに該第３の部分に好適な極性であることができるヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
「第２の断片」は、標的の配列に好適な極性の相補的ヌクレオチド配列を意味する。
【００２８】
「第３の断片」は、該第１の部分に好適な極性の相補的ヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「マーカー」は、ヌクレオチドによって運ばれる分子を意味する。マーカーとヌクレオチドの間の結合を、当業者により知られている様々な方法で達成することができる。手動カップリングは、対応する反応基（例えば、アミンもしくはチオール）を担持する修飾された内部ヌクレオチドに、またはこれらの同じ反応基で修飾されたヌクレオチド鎖の１つの末端にカップリングされた、活性化基、典型的にはカルボキシルまたはチオールを担持するマーカーを用いて行なわれる。自動カップリングは、マーカーを担持するホスホロアミダイトを用いて達成され、次に、ヌクレオチド鎖の自動合成の間に、使用されるホスホロアミダイトの種類によって、鎖の１つの末端にか、または内部位置かのいずれかにカップリングが起こる。
【００３０】
「フルオロフォア」は、それが好適な波長の光によって励起されたときに蛍光シグナルを放出する分子を意味する。フルオロフォアは、使用される測定機器に応じて、特にローダミンもしくはＴｅｘａｓ Ｒｅｄなどの誘導体、フルオレセインもしくは誘導体、Ａｌｅｘａ ５３２およびＡｌｅｘａ ６４７、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ ７００、Ａｌｅｘａ ６８０などのＡｌｅｘａファミリーのフルオロフォア、または好適である任意の他のフルオロフォアであることができる。検出プローブに利用可能なフルオロフォアは、非常に多様であり、かつ当業者により知られている。
【００３１】
本発明の意味において、「フルオレセイン」は、それが約４９５ｎｍの波長を有する光によって励起されたときに、約５３０ｎｍでの最大放出を有する蛍光シグナルを放出する芳香族化学分子を意味する。
【００３２】
「蛍光クエンチャー」または「クエンチャー」は、フルオロフォアによって放出された蛍光と干渉する分子を意味する。寄生放出を避けるために、このクエンチャーを非蛍光芳香族分子から選択することができる。好ましくは、該クエンチャーは、それらがフルオロフォアに物理的に近い所にあるときに蛍光の放出を妨げる非蛍光芳香族分子である、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）またはダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）または「ブラックホールクエンチャー（商標）」である。例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐ．４，Ｅｄ．Ｖ．Ｖ．Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００６，ＩＳＳＮ １０６４−３７４５に記載されているような、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の技術を使用することもできる。クエンチャーを、蛍光分子、例えば、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）から選択することもできる。
【００３３】
「極性」は、その相補的配列に対する、５’から３’へのまたは３’から５’への、ヌクレオチド配列の配向を意味する。したがって、部分を以下のように配向させることができる：
逆平行：この場合、オリゴヌクレオチドは、相補的配列に対して反対の方向でハイブリダイズしている。本発明において、実施形態の１つは、該閉鎖配列がもう１つの閉鎖配列にハイズリダイズしたときに検出プローブが円い形となるように、そのとき逆向きのヌクレオチドから構成されている閉鎖配列のうちの１つを有する。
平行：この場合、オリゴヌクレオチドは、相補的配列と同じ方向でハイブリダイズしている。本発明において、実施形態の１つは、該閉鎖配列がもう１つの閉鎖配列にハイズリダイズしたときに検出プローブが円い形となるように、そのときαヌクレオチドで構成されている閉鎖配列のうちの１つを有する。
【００３４】
「ハイブリダイゼーション」は、好適な条件において、十分に相補的である配列を完全にまたは部分的に有する２つの一本鎖ヌクレオチド断片が、核酸塩基間の水素結合によって安定化される二本鎖または「二重鎖」を形成することができる過程を意味する。ハイブリダイゼーション条件は、操作条件のストリンジェンシーと低塩分によって決定される。ハイブリダイゼーションは、それがより大きいストリンジェンシーの下で実施されるとき、より特異的である。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二重鎖の塩基組成との関連において、および２つの核酸間の誤対合の程度によって規定される。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度と種類、変性剤の性質と濃度、および／またはハイブリダイゼーション温度などの、反応変数の関数であることもできる。ハイブリダイゼーション反応が実施されなければならない条件のストリンジェンシーは、主に、使用されるハイブリダイゼーションプローブによって決まる。これらのデータは全て周知であり、適当な条件は当業者によって決定されることができる。
【００３５】
「αヌクレオチド」または「α−アノマーヌクレオチド」は、デオキシリボースのアノマー炭素によって運ばれる窒素含有塩基が、βヌクレオチドの場合のように平面より上にある代わりに、平面より下に位置する非天然のα−アノマー形状を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味する。αヌクレオチドの窒素含有塩基は、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基であることができる。αヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、または例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース、ＰＮＡおよびＬＮＡなどの、骨格のレベルで修飾することもできる。好ましくは、αヌクレオチドは、出願ＷＯ−Ａ−８８／０４３０１に記載されているものである。
【００３６】
「逆向きのヌクレオチド」は、それらを含有する配列のそれと反対の配向を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味する。慣行に従って、合成は３’から５’の方向に行なわれるが、逆向きのヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖の残りの部分の後ろまたは前に、５’から３’の方向に導入される。その後、逆向きのヌクレオチドと鎖の残りの部分は、５’−５’または３’−３’結合によって結合される。参照が、Ｋｏｇａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，５６，３７５７に対してなされてもよい。逆向きのヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを任意で含むことができる。逆向きのヌクレオチドを、例えば、ＰＮＡ、２’−Ｏ−アルキルリボースおよびＬＮＡなどの骨格のレベルで修飾することもできる。
【００３７】
「末端」は、最初または最後のヌクレオシドにより運ばれる遊離ヒドロキシルによって運ばれる数字、すなわち、３’または５’によって一般に規定されるオリゴヌクレオチドの合成の始点と終点を意味する。伸長単位（αまたはβヌクレオシドのホスホロアミダイト、逆向きであるかないかを問わない）を適切に選択すれば、オリゴヌクレオチドを３’から５’の方向にもしくは反対の方向に合成することができるし、または伸長の方向は、合成中に、交互に入れ替わることすらできることが理解される。これにより、３’−５’、５’−３’、３’−３’または５’−５’末端を担持するオリゴヌクレオチドが生じる。
【００３８】
本発明の意味において、「生物学的試料」は、核酸を含有し得る任意の試料を意味する。後者は、組織、血液、血清、唾液、患者の循環細胞から抽出することができるし、または食品、食品加工物に由来するものであることができるし、または環境起源のものであることができる。抽出は、当業者により知られている任意のプロトコルによって、例えば、特許ＥＰ−Ｂ−０，３６９，０６３に記載されている単離の方法に従って行なうことができる。
【００３９】
添付の図面は、説明的な例として示されており、決して限定的なものではない。それらは、本発明を理解するのをより容易にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明によるプローブの完全な円形の立体構造の例。Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォア小文字のヌクレオチド：αヌクレオチドＱ：蛍光クエンチャー
【図２】本発明によるプローブの完全な円形の立体構造の例。Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォアＱ：蛍光クエンチャー小文字のヌクレオチド：逆向きのヌクレオチド
【図３】実施例１に記載されるような、インフルエンザＢモデルのα型の本発明によるプローブの熱変性の実験（セ氏温度（℃）で測定された温度の関数としての任意単位（相対蛍光単位を表すＲＦＵ）での蛍光放出）。図３ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図３ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図４】実施例１に記載されるような、ＨＩＶモデルのα型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図４ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図４ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図５】実施例２に記載されるような、インフルエンザＢモデルの逆向き型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図５ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図５ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図６】実施例２に記載されるような、ＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブの熱変性の実験（温度（℃）の関数としての任意単位（ＲＦＵ）での蛍光放出）。図６ａ：その合成標的の存在下でのプローブ。図６ｂ：その標的を含まないプローブのみ。
【図７】インフルエンザＢ標的モデルでの本発明によるα型のプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてのセ氏温度で測定された融解点（「融解温度」を表すＴｍ）の値を示す。
【図８】ＨＩＶ−１Ａ標的モデルでの本発明によるα型のプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＨｏａ８（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてのセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図９】インフルエンザＢ標的モデルでの逆向き型の本発明によるプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図１０】ＨＩＶ−１Ａ標的モデルでの逆向き型の本発明によるプローブのハイブリダイゼーションの特異性を研究するための実験。座標は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（四角い記号）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのまたは本発明によるプローブＨｏｉ８（円い記号）の閉鎖配列のうちの１つのいずれかの相補的ヌクレオチドの数（横座標）の関数としてセ氏温度で測定された融解点（Ｔｍ）の値を示す。
【図１１】反応混合物中の汚染物質の存在下での分子ビーコンプローブのおよび本発明によるプローブの望ましくない早過ぎる開裂の研究。図１１ａ：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の存在下でのプローブの蛍光シグナル（任意単位、各値を最小初期値で割ることにより（分で表される）時間の関数として標準化された蛍光）の測定。図１１ｂ：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の非存在下でのプローブの蛍光シグナル（任意単位、各値を最小初期値で割ることにより（分で表される）時間の関数として標準化された蛍光）の測定。
【図１２】本発明によるプローブで使用される様々な構造の表示。図１２ａ：使用される様々なヌクレオチドの構造：ヌクレオチド１＝β−アノマーヌクレオチド、ヌクレオチド２＝α−アノマーヌクレオチド、ヌクレオチド３＝逆向きのヌクレオチド。図１２ｂ：鎖の１つがαヌクレオチドで構成されているときの本発明によるプローブの閉鎖配列のハイブリダイゼーションの例（ここで、ＴはｄＴ−ＦＡＭ、すなわち、この分子のフルオロフォアであり；Ｑは蛍光クエンチャーに対応し；小文字のヌクレオチドはこの図表の右側部分にあるαヌクレオチドであり、一方、点線で引かれた円はこの図表の左側部分にあるこれらの同じα−アノマーヌクレオチドを示し；最後に、この図表の右側部分にある、大文字のヌクレオチドは、左側に、円になっていない塩基Ｂを含有する、βヌクレオチドである）。図１２ｃ：鎖の１つが逆向きのヌクレオチドで構成されているときの本発明によるプローブの閉鎖配列のハイブリダイゼーションの例（ここで、Ｔ：ｄＴ−ＦＡＭ、フルオロフォア；Ｑ：蛍光クエンチャー；小文字のヌクレオチド；逆向きのヌクレオチド；点線で引かれた円は５’−５’結合を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に示される全ての実施例で使用される、本発明によるプローブ、分子ビーコンプローブおよび標的核酸を、当業者により知られている、ホスホロアミダイトを用いる合成手順に従って合成する。ホスホロアミダイトを用いる合成の方法は、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｌｙｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，２２３−２３１１，１９９２）により記載された。試薬およびホスホロアミダイトを、市販で、特に、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｓ．Ａ．（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から購入する。修飾αヌクレオチドを導入するために使用される、αホスホロアミダイトを、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号．ＡＮＰ−１６５１、ＡＮＰ−１６５２、ＡＮＰ−１６５３、ＡＮＰ−１６５４）から購入する。逆向きのヌクレオチドを導入するために使用される、逆向きのホスホロアミダイトを、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ，カタログ番号．１０−０００１、１０−０１０１、１０−０２０１、１０−０３０１）から購入する。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製した。それらの純度もＨＰＬＣ分析によりモニタリングし、それらの同一性をＭａｌｄｉ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによりモニタリングした。
【００４２】
本発明によるプローブおよび分子ビーコンで使用されるマーカーは：
− Ｄａと表記される、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）蛍光クエンチャー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号２０−５９１２）
− ＦＡＭ（フルオレセイン−アミン）フルオロフォア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｃ−２２１０
− ｄＴ−ＦＡＭと表記される、デオキシチミンヌクレオチドに付加されたＦＡＭ（フルオレセイン−アミン）フルオロフォア（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０−１０５６）
である。
【００４３】
実施例１：インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルのα型の本発明のプローブの、それらの標的配列に対するハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明のプローブが、相補的な標的配列の存在下でのハイブリダイゼーションによって蛍光シグナルを生じさせることができることを示すことである。
【００４４】
実験設計：使用したプローブは以下の通りである：
インフルエンザＢモデル − Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
ＨＩＶモデル − ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
【００４５】
下線が付されたヌクレオチド配列は、本発明のプローブの閉鎖配列に対応する。
【００４６】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【００４７】
使用した合成標的配列は以下の通りである：
インフルエンザＢモデル、標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
ＨＩＶモデル、標的ｃＨ４（配列番号４）：
５’−ＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴ−３’
【００４８】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【００４９】
最終容量は、２０μｌである。
【００５０】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【００５１】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。
【００５２】
結果：得られた結果を図３および４に示す。
【００５３】
それらのそれぞれの合成標的配列（図３ａおよび４ａ）の存在下でのプローブＯｐａ６およびＨｏａ８は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブはその標的にハイブリダイズしており、フルオロフォアはクエンチャーから最大限離れている。蛍光は最大である。高温で、プローブ／標的二重らせんは不安定化し、プローブは一本鎖になり始め、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離は減少し、蛍光の減少を引き起こす。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍは、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する。Ｔｍ−標的は、曲線の一次導関数の最小値として計算される。プローブＯｐａ６およびＨｏａ８は、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、それらの標的にハイブリダイズしたままにし、したがって、その標的配列の存在下で最大の蛍光シグナルを生じさせることを可能にするＴｍ−標的（表１参照）を有する。
【００５４】
Ｏｐａ６ｄおよびＨｏａ８プローブ単独（図３ｂおよび４ｂ）は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブは円い形で構造化され、フルオロフォアはクエンチャーの非常に近くにある。放出される蛍光は非常にわずかである。高温で、二次構造は解離し、フルオロフォアはクエンチャーから離れ、蛍光放出は徐々に増加し、二次構造が完全に変性したときにプラトーに達する。プローブの二次構造の熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する、「Ｔｍ−プローブ」の値によって示される。Ｔｍ−プローブは、曲線の一次導関数の最大値として計算される。Ｏｐａ６ｄおよびＨｏａ８プローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、閉じたままにし、したがって、その標的配列の非存在下で最小の残存蛍光を生じさせることを可能にするＴｍ−プローブ（表１参照）を有する。
【００５５】
「Ｏ／Ｃ比」とも呼ばれる、「開／閉比」により、４１℃でその標的の存在下でプローブにより生じるシグナルのレベルを測定することが可能になる。それは、プローブ単独により生じる残存シグナルに対するその標的配列の存在下でプローブにより生じるシグナルの比として計算される。
【００５６】
表１は、この実施例に記載されたプローブで得られたＴｍ−プローブ、Ｔｍ−標的およびＯ／Ｃ比の値を示す。
【００５７】
結論：単独で溶液中にある、インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルのα型の本発明によるプローブは、４１℃で安定な二次構造を形成し、フルオロフォアとクエンチャーの近接性のために、蛍光シグナルの消光をもたらす。
【００５８】
それらが、それらの合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらは、それらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。
【００５９】
実施例２：インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブのそれらの標的配列に対するハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明による修飾されたプローブが、相補的な標的配列の存在下でのハイブリダイゼーションによって蛍光シグナルを生じさせることができることを示すことである。
【００６０】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
インフルエンザＢモデル − プローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
ＨＩＶモデル − プローブＨＯｉ８ｄ（配列番号６）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
【００６１】
下線が付された配列は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００６２】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【００６３】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
インフルエンザＢモデル、標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
ＨＩＶモデル、標的ｃＨ４（配列番号４）：
５’−ＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴ−３’
【００６４】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ，ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【００６５】
最終容量は、２０μｌである。
【００６６】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【００６７】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度対蛍光のグラフの形で表す。
【００６８】
結果：得られた結果を図５および６に示す。
【００６９】
それらのそれぞれの合成標的配列（図５ａおよび６ａ）の存在下でのＯｐｉ６およびＨｏｉ８ｄプローブは、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブはその標的にハイブリダイズし、フルオロフォアをクエンチャーから離すのに十分固い二重鎖を形成する。この二重鎖において、２つの分子は最大限離れている。放出される蛍光は最大である。
【００７０】
高温で、プローブ／標的二重らせんは解離し、その後、プローブは一本鎖になり始める。この場合、このプローブ内の二次構造が解離したとしても、変性したプローブの柔軟性のために、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離は、プローブ／標的二重らせんにおけるそれよりも小さい。これが、消光による蛍光の減少を引き起こす。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する、「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、曲線の一次導関数の最小値として計算される。Ｏｐｉ６およびＨｏｉ８ｄプローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、それらの標的にハイブリダイズしたままにし、したがって、それらの標的配列の存在下で最大の蛍光シグナルを生じさせることを可能にするＴｍ−標的（表２参照）を有する。
【００７１】
Ｏｐｉ６ｄおよびＨｏｉ８ｄプローブ単独（図５ｂおよび５ｂ）は、予想された蛍光プロファイルを示す：低温で、プローブは円い形で構造化され、フルオロフォアはクエンチャーの非常に近くにある。放出される蛍光は非常にわずかである。高温で、二次構造は解離し、フルオロフォアはクエンチャーから離れ、蛍光放出は徐々に増加し、二次構造が完全に変性したときにプラトーに達する。プローブの二次構造の熱安定性は、曲線の転換点に対応する、「Ｔｍ−プローブ」の値によって示される。Ｔｍ−プローブは、曲線蛍光＝ｆ（温度）の一次導関数の最大値として計算される。Ｏｐｉ６ｄおよびＨｏｉ８ｄプローブは、それらをＮＡＳＢＡ増幅反応の温度、４１℃で、閉じたままにし、したがって、その標的配列の非存在下で最小の残存蛍光を生じさせることを可能にするＴｍ−プローブ（表２参照）を有する。
【００７２】
「Ｏ／Ｃ比」とも呼ばれる、「開／閉比」により、４１℃でその標的の存在下でプローブにより生じるシグナルのレベルを測定することが可能になる。それは、プローブ単独により生じる残存シグナルに対するその標的配列の存在下でプローブにより生じるシグナルの比として計算される。
【００７３】
表２は、この実施例に記載されたプローブで得られたＴｍ−プローブ、Ｔｍ−標的およびＯ／Ｃ比の全ての値を示す。
【００７４】
結論：単独で溶液中にある、インフルエンザＢおよびＨＩＶモデルの逆向き型の本発明によるプローブは、４１℃で安定な二次構造を形成し、フルオロフォアとクエンチャーの近接性のために、蛍光シグナルの消光をもたらす。
【００７５】
それらが、それらの合成標的配列の存在下で溶液中にある場合、それらは、それらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。
【００７６】
実施例３：α型の本発明によるプローブによる標的インフルエンザＢのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【００７７】
実験設計：増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、インフルエンザＢウイルスのゲノムの配列に対応する。
【００７８】
使用したプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ１（配列番号７）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＡ−３’
Ｐ２（配列番号８）：
５’−ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡ−３’
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
【００７９】
プライマーＰ１のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【００８０】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００８１】
Ｏｐａ６ｄプローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【００８２】
プライマーＰ１の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ２の配列は、プライマーＰ１の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ１のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ２の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【００８３】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６ ＆ ６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ１、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ２、
・０．１６μｌの１０μＭのＯｐａ６ｄプローブ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【００８４】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。全ての実験を二重に行なう。
【００８５】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェア６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、ＦＡＭフルオロフォアにより放出される蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取りながら、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアによってモニタリングした。
【００８６】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。「α３」という値は、Ｗｅｕｓｔｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００２，ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．６，ｅ２６）の論文に記載されたような「プライマー消耗時間」である。この値は、蛍光シグナルの増加が検出可能になり始める時間に対応する。増幅が速く、それゆえ、効率的になればなるほど、α３値はますます小さくなる。
【００８７】
「ＭＳＲ」という値は、「最大シグナル比」である。この値は、シグナルが増加し始める前の、初期値に対して外挿される理論的な最終蛍光値に対する増幅反応の最後に読み取られる蛍光値の比に対応する。この値は、プローブによって取得されるシグナルレベルであり、陽性とみなされるシグナルについては１よりも大きくならなければならない。これら２つの値は、各試料について、ＥａｓｙＱリーダーというソフトウェアによって自動的に計算され、表示される。
【００８８】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーの標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、４．４７の最適「ＭＳＲ」と２３分から３１分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【００８９】
結論：
本発明によるＯｐａ６ｄプローブは、４．４７（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、２３分から３１分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【００９０】
実施例４：逆向き型の本発明によるプローブによる標的インフルエンザＢのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【００９１】
実験設計：
増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、インフルエンザＢウイルスのゲノムの配列に対応する。
【００９２】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ１（配列番号７）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＡ−３’
Ｐ２（配列番号８）：
５’−ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡ−３’
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
【００９３】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【００９４】
プライマーＰ１のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【００９５】
Ｏｐａ６ｄプローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【００９６】
プライマーＰ１の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ２の配列は、プライマーＰ１の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ１のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ２の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【００９７】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６及び６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ１、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ２、
・０．１６μｌの１０μＭのＯｐｉ６ｄプローブ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【００９８】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【００９９】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１００】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１０１】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーの標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、３．８８の最適「ＭＳＲ」と１８分から２６分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１０２】
結論：本発明によるプローブＯｐｉ６ｄは、３．８８（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１８分から２６分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１０３】
実施例５：α型の本発明によるプローブによる標的ＨＩＶのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【０１０４】
実験設計：増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、「ＨＩＶ」ヒト免疫不全ウイルスのゲノムの配列に対応する。
【０１０５】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ３（配列番号９）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡ−３’
Ｐ４（配列番号１０）：
５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
Ｈｏａ６プローブ（配列番号１１）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｃ−（ｄＴ−ＦＡＭ）−ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−Ｄａ
【０１０６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【０１０７】
プライマーＰ３のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【０１０８】
プローブＨｏａ６中の小文字で書かれたヌクレオチドは、αヌクレオチドに対応する。
【０１０９】
プライマーＰ３の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ４の配列は、プライマーＰ３の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ３のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ４の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【０１１０】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６および６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ３、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ４、
・０．１６μｌの１０μＭのプローブＨｏａ６、
反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【０１１１】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【０１１２】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１１３】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１１４】
結果：
ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーと等しいかまたはそれ未満の標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、２．５３の最適「ＭＳＲ」と１４分から２２分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１１５】
結論：
本発明によるプローブＨｏａ６は、２．５３（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１４分から２２分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１１６】
実施例６：逆向き型の本発明によるプローブによる標的ＨＩＶのＮＡＳＢＡ増幅中のリアルタイム検出の研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが、ＮＡＳＢＡ増幅中にリアルタイムでその標的配列を検出することができることを示すことである。
【０１１７】
実験設計：
増幅の標的配列は、当業者により知られているインビトロ転写技術に従ってプラスミドから転写によって合成された、２１２ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。このＲＮＡの配列は、「ＨＩＶ」ヒト免疫不全ウイルスのゲノムの配列に対応する。
【０１１８】
使用されたプライマーとプローブは以下の通りである：
プライマー：
Ｐ３（配列番号９）：
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡ−３’
Ｐ４（配列番号１０）：
５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
Ｈｏｉ６ｄプローブ（配列番号１２）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔ−５’
【０１１９】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列に対応する。
【０１２０】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１２１】
プライマーＰ３のイタリック体の部分は、ＮＡＳＢＡインビトロ酵素増幅に必要な、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターの配列に対応する。
【０１２２】
Ｈｏｉ６ｄプローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１２３】
プライマーＰ３の３’の部分は、標的ＲＮＡの配列に相補的である。プライマーＰ４の配列は、プライマーＰ３の相補的配列の５’末端上にある標的ＲＮＡの配列と同じである。ＮＡＳＢＡ増幅反応は、プライマーＰ３のハイブリダイゼーション配列とプライマーＰ４の配列に相当する配列の間の部分において、その配列が標的ＲＮＡの相補的配列に対応する、「アンプリコン」と呼ばれる、ＲＮＡ配列の多数のコピーを生成させる。本発明によるプローブは、ＮＡＳＢＡ増幅反応によって生成されるアンプリコンにハイブリダイズする認識配列を含む。したがって、プローブにより生じるシグナルは、標的ＲＮＡ配列が反応混合物中に存在し、かつ選ばれたプライマーを用いるＮＡＳＢＡによって増幅されるときにのみ検出される。
【０１２４】
ＮＡＳＢＡ増幅反応は、「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．６００７９１３６および６００８５１９２）を用いておよび製造元によって指定された条件で実施される。各増幅チューブは、以下のように構成された、２０μｌの最終容量を含有する：
・製造元によって指定された割合の８．６４μｌの「ＮＡＳＢＡ基本キット」試薬、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ３、
・０．４μｌの１０μＭのプライマーＰ４、
・０．１６μｌの１０μＭのプローブＨｏｉ６ｄ、
・反応チューブ当たり５、５０、５００または５０００コピーの最終濃度を得るのに十分な濃度の５μｌのＲＮＡ標的。
【０１２５】
全ての場合において、「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ無しの水」（カタログ番号．３２７３９，ＡＣＲＯＳ）を含有する陰性対照を調製する。
【０１２６】
６５℃で５分の変性、次に、４１℃で２分間のインキュベーションの段階の後、５μｌの「酵素ミックス」試薬（４５μｌの「酵素」希釈剤ｒｅｆ．６００８５１９２に対して１「酵素」アキュスフェアｒｅｆ．６００８５１１１、「ＮＡＳＢＡ基本キット」のパーツ）を反応混合物に添加する。次に、反応混合物を、その温度が４１℃にセットされた、蛍光リーダーに導入し、反応を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ，ボクステル、オランダ）のＤｉｒｅｃｔｏｒ ２．０ソフトウェアでモニタリングし、ＦＡＭフルオロフォアの蛍光を５２０ｎｍで９０分間読み取る。
【０１２７】
反応の最後に、各チューブについて、「α３」および「ＭＳＲ」の数値とともに、グラフの検出プロファイルが得られる。
【０１２８】
結果：ＮＡＳＢＡにおけるリアルタイムでの検出の結果は示されていないが、必要ならば入手可能である。検出の限界が５コピーと等しいかまたはそれ未満の標的転写物であることを理解することができる。陽性試料は、２．０３の最適「ＭＳＲ」と１５分から２１分の間の「α３」の値とを有する検出可能シグナルを生じさせる。
【０１２９】
結論：本発明によるプローブＨｏｉ６ｄは、２．０３（「ＭＳＲ」）の最適シグナルレベルを特徴とする、溶液中のその標的の存在下での検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。シグナルが検出可能になり始める時間を示す、「α３」の値は、１５分から２１分の間である。「α３」は、この値に基づいて標的を定量する可能性を提供する、存在する標的の量に比例する。
【０１３０】
実施例７：インフルエンザＢモデルでの本発明によるプローブの特異性の研究
目的：プローブの特異性は、その標的のみを認識し、したがって、それを、例えば、誤対合または欠失を含む標的から区別するその能力である。分子ビーコンは、それらが、たった１つのヌクレオチドだけ異なる２つの標的の区別を可能にするので、現在、最も特異的な分子プローブである。この実験の目的は、同じ認識配列を含有する分子ビーコンプローブと比較して、本発明によるプローブの特異性のレベルを示すことである。
【０１３１】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
分子ビーコンＣＰ ＩｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐａ６プローブ（配列番号１４）：
５’−ｇａｇｃｇｔａｇｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐａ５プローブ（配列番号１５）：
５’−ｇａｇｃｔａｇｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐｉ４プローブ（配列番号１６）：
３’−ｇａｇｃｔａｇｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
Ｏｐｉ３ プローブ（配列番号１７）：
３’−ｇｃｔａｇｃｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＧ−３’Ｄａ
【０１３２】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列におよび分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。
【０１３３】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１３４】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１３５】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ｃＣ（配列番号３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＧ（配列番号１８）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＡ（配列番号１９）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
標的ｃＴ（配列番号２０）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
【０１３６】
合成標的配列「ｃＣ」は、プローブの配列の一部に完全に相補的である。合成標的配列「ｃＧ」、「ｃＡ」および「ｃＴ」は、対応する文字の下線によって示される、プローブ中の相補的配列に対する誤対合を含有する。
【０１３７】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１３８】
最終容量は、２０μｌである。
【０１３９】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１４０】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度（℃）対蛍光（ＲＦＵ）のグラフの形で表す。
【０１４１】
結果：インフルエンザＢモデルについて検査されたプローブの中で、ＯＰａ６は、完全な標的（ｃＣ）と誤対合を有する標的（ｃＧ、ｃＡまたはｃＴ）の間の最も大きいＴｍ−標的の差を示すものである。
【０１４２】
この表は、得られたグラフから測定されたＴｍ値を１つにまとめている。図９は、これらのグラフの２つの例を示す。その完全な標的を含むプローブのＴｍ−標的と誤対合を有する標的を有するプローブのＴｍ−標的の間の差は、グラフ上ではっきりと見られ、プローブＯＰｉ４とＯＰａ６では１０℃に達することができる。誤対合を有する標的を含むプローブのＴｍ−標的は、プローブのＴｍ−ステムに非常に近いので、後者は、その標的とハイズリダイズする前に、それ自身に近づく。
【０１４３】
結論：本発明によるプローブは、所与の標的の特異的プローブであり、この分野でのそれらの性能は、参照分子ビーコンのそれとよく似ている。これは、所与の遺伝子における単一ヌクレオチドの変化に相当するＳＮＰすなわち単一ヌクレオチド多型の検出にとって大きな関心事となる。
【０１４４】
実施例８：ＨＩＶモデルでの本発明によるプローブの特異性の研究
目的：プローブの特異性は、その標的のみを認識し、したがって、それを、例えば、誤対合または欠失を含む標的から区別するその能力である。分子ビーコンは、それらが、たった１つのヌクレオチドだけ異なる２つの標的の区別を可能にするので、現在、最も特異的な分子プローブである。この実験の目的は、同じ認識配列を含有する分子ビーコンプローブと比較して、本発明によるプローブの特異性のレベルを示すことである。
【０１４５】
実験設計：使用されるプローブは以下の通りである：
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ６プローブ（配列番号１１）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ７（配列番号２２）：
５’−ｔｔａｃｃｃｔａｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
Ｈｏｉ６ｄプローブ（配列番号１２）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔ−５’
Ｈｏｉ７ｄプローブ（配列番号２３）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
Ｈｏｉ８ｄプローブ（配列番号６）：
５’−Ｄａ−ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’−（ｄＴ−ＦＡＭ）−３’−ｇｇｔａｇｔｔａｃｔｃ−５’
【０１４６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列におよび分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。本発明によるプローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１４７】
本発明によるプローブ中の小文字でおよび太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０１４８】
使用された合成標的配列以下の通りである：
標的ｃＨ５（配列番号２４）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＧＨ５（配列番号２５）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＡＨ５（配列番号２６）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
標的ｃＴＨ５（配列番号２７）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴ−３’
【０１４９】
合成標的配列「ｃＨ５」は、プローブの配列の一部に完全に相補的である。合成標的配列「ｃＧＨ５」、「ｃＡＨ５」および「ｃＴＨ５」は、対応する文字の下線によって示される、プローブ中の相補的配列に対する誤対合を含有する。
【０１５０】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１５１】
最終容量は、２０μｌである。
【０１５２】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて調製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１５３】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６５℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。結果を温度対蛍光のグラフの形で表す。
【０１５４】
結果：
結果を以下の表および図１０に示す。
【０１５５】
この表は、得られたグラフから測定されたＴｍ値を１つにまとめている。図１０は、これらのグラフの２つの例を示す。完全に相補的な標的でのＴｍと誤対合を含有する標的でのＴｍの間の差がはっきりと見られ、プローブＨＯｉ６ｄとＨＯｉ７ｄでは９℃に達することができる。
【０１５６】
結論：本発明によるプローブは、所与の標的の特異的プローブであり、この分野でのそれらの性能は、参照分子ビーコンＨＩＶ−１Ａのそれを上回りさえする。これは、所与の遺伝子における単一ヌクレオチドの変化に相当するＳＮＰすなわち単一ヌクレオチド多型の検出にとって大きな関心事となる。
【０１５７】
実施例９：インフルエンザＢモデルのα型の本発明によるプローブのそれらの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの研究
目的：この実験の目的は、本発明によるプローブが分子ビーコンプローブよりも特異的に標的核酸にハイブリダイズすることを示すことである。
【０１５８】
一般に、分子ビーコンプローブを設計するとき、考慮されるＴｍは、標的配列に相補的な配列である、認識配列から計算されたＴｍ（計算Ｔｍ）である。実際、分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列は、標的核酸にハイブリダイズしないと考えられる。さて、分子ビーコンプローブの実際のＴｍは、分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列の標的配列との相互作用のために、計算されたＴｍよりもわずかに高いことがある。さらに、「ステム」部分を形成する鎖は、標的の配列に非特異的にハイブリダイズすることができ、このことは、分子ビーコンの標的へのハイブリダイゼーションの全体的な安定性を増大させ（実際のＴｍ−標的は計算されたＴｍ−標的よりも高い）、かつそれにより、このハイブリダイゼーションの特異性を低下させる効果を有する。
【０１５９】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０１６０】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０１６１】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１６２】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的６Ｂａ２Ｉ（配列番号２９）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＴＴ−３’
標的１０Ｐａ２Ｉ（配列番号３０）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＧＧＴＣ−３’
標的６Ｐａ２Ｉ（配列番号３１）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＴＴ−３’
標的１Ｂａ２Ｉ（配列番号３２）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的１Ｐａ２Ｉ（配列番号３３）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的２Ｂａ２Ｉ（配列番号３４）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
標的２Ｐａ２Ｉ（配列番号３５）：
５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴ−３’
【０１６３】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）、または本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０１６４】
配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）は、インフルエンザＢウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。
【０１６５】
標的配列６Ｂａ２Ｉ（配列番号２９）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１６６】
標的配列１０Ｐａ２Ｉ（配列番号３０）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で強調された配列の３’に１０個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１０個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１６７】
標的配列６Ｐａ２Ｉ（配列番号３１）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１６８】
標的配列１Ｂａ２Ｉ（配列番号３２）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドに相補的である。
【０１６９】
標的配列１Ｐａ２Ｉ（配列番号３３）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１７０】
標的配列２Ｂａ２Ｉ（配列番号３４）は、配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線で強調された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１７１】
標的配列２Ｐａ２Ｉ（配列番号３５）は、標的配列Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１７２】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１７３】
最終容量は、２０μｌである。
【０１７４】
陰性対照は、標的配列の代わりに水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１７５】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０１７６】
結果：
結果を表５および図７に示す。表５は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）と標的Ｂｉｏａ２Ｉ（配列番号２８）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）と標的Ｂｉｏ２ａＩ（配列番号２８）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、５７．３℃および５６．４℃に等しい。
【０１７７】
分子ビーコンプローブＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＣＰｉｎｆＢの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の増加が観察される。この増加は、分子ビーコンのステム部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に比例しており、ＣＰｉｎｆＢプローブの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列に隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０１７８】
本発明によるプローブＯｐａ６ｄ（配列番号１）（α型のプローブ）が様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それはそれらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＯｐａ６ｄの閉鎖配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、該相補的なヌクレオチドの数にかかわらず、本発明によるプローブのＴｍ−標的の値が安定なままであることが観察される。これは、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列に隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０１７９】
結論：これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＯｐａ６ｄは、分子ビーコンプローブＣＰｉｎｆＢよりも特異的である。Ｏｐａ６ｄプローブの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０１８０】
実施例１０：ＨＩＶモデルの５’のα型の本発明による特異的プローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究
目的：この実施例における目的は、異なる標的モデルについて実施例９で既に記載されたものと同じである。
【０１８１】
実験設計：使用されたプローブは以下の通りである：
ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
【０１８２】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０１８３】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。
【０１８４】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的５ＢＨ（配列番号３７）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＣ
標的１１ＰＨ（配列番号３８）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴ
標的５ＰＨ（配列番号３９）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＣ
標的１ＢＨ（配列番号４０）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的１ＰＨ（配列番号４１）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的２ＢＨ（配列番号４２）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
標的２ＰＨ（配列番号４３）：
ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣ
【０１８５】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）、または本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０１８６】
標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）は、ＨＩＶウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０１８７】
標的配列５ＢＨ（配列番号３７）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１８８】
標的配列１１ＰＨ（配列番号３８）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で強調された配列の３’に１１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１１個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１８９】
標的配列５ＰＨ（配列番号３９）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９０】
標的配列１ＢＨ（配列番号４０）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１９１】
標的配列１ＰＨ（配列番号４１）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９２】
標的配列２ＢＨ（配列番号４２）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これらのヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０１９３】
標的配列２ＰＨ（配列番号４３）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０１９４】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０１９５】
最終容量は、２０μｌである。
【０１９６】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱ超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０１９７】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線蛍光＝ｆ（温度）の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０１９８】
結果：
結果を表６および図８に示す。以下に示す、表６は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＨｏａ８（配列番号２）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６０．６℃および６０．２℃に等しい。
【０１９９】
＊：分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と相補的標的５ＢＨ（配列番号３７）の間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２００】
ＮＡ：適用できない。本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）と相補的標的１ＢＨ（配列番号４０）の間のＴｍの値は、プロファイルが、本発明者らの方法を用いて測定可能な標準に対応しないので、測定することができなかった。この値は、グラフの経験的読取りから決定されたものであり、６０℃である。
【０２０１】
分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それらにハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＨＩＶ−１Ａの「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の増加が観察される。この増加は、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に比例しており、これらのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２０２】
（α型の）本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号２）が様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、それはこれらの配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的がＨＯａ８プローブの閉鎖配列の１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、α型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的にハイブリダイズした配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２０３】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＨＯａ８は、分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａよりも特異的である。ＨＯａ８プローブの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２０４】
実施例１１：インフルエンザＢモデルの３’の逆向き型の本発明による特異的プローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究
目的：
この実施例における目的は、実施例９で記載されたものと同じであるが、本発明によるプローブの異なる設計を用いている。
【０２０５】
実験設計：
使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０２０６】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０２０７】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【０２０８】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的６ＢｉＩ（配列番号４５）：
ＴＴＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１０ＰｉＩ（配列番号４６）：
ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的６ＰｉＩ（配列番号４７）：
ＴＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１ＢｉＩ（配列番号４８）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
標的１ＰｉＩ（配列番号４９）：
ＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
【０２０９】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）、または本発明によるプローブＨＯａ８（配列番号５）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０２１０】
標的配列ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）は、インフルエンザＢウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列に相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０２１１】
標的配列６ＢｉＩ（配列番号４５）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１２】
標的配列１０ＰｉＩ（配列番号４６）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１０個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１０個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２１３】
標的配列６ＰｉＩ（配列番号４７）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に６個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら６個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１４】
標的配列１ＢｉＩ（配列番号４８）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２１５】
標的配列１ＰｉＩ（配列番号４９）は、標的配列ＢｉｏＩ（配列番号４４）と比べて、点線で下線が付された配列の５’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２１６】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０２１７】
最終容量は、２０μｌである。
【０２１８】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱタイプの超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０２１９】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０２２０】
結果：
結果を表７および図９に示す。表７は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）と標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）の間で測定されたＴｍ−標的値および本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）と標的ＢｉｏｉＩ（配列番号４４）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６２℃および６２．９℃に等しい。
【０２２１】
＊：分子ビーコンＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）と相補的標的６ＢｉＩ（配列番号４５）の間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２２２】
分子ビーコンプローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンプローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、本発明者らは、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に対する分子ビーコンプローブのＴｍ−標的の値の比例的増加を観察する。これは、プローブＣＰ２ｉｎｆＢ（配列番号１３）の「ステム」部分の鎖のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２２３】
（逆向き型の）本発明によるプローブＯｐｉ６ｄ（配列番号５）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＯｐｉ６ｄの閉鎖配列（配列番号５）の１つの相補的ヌクレオチドを含有するとき、逆向き型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２２４】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＯｐｉ６ｄは、分子ビーコンプローブＣＰｉｎｆＢよりも特異的である。プローブＯｐｉ６ｄの分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２２５】
実施例１２：ＨＩＶモデルの５’の逆向き型の本発明によるプローブのそれらの標的配列へのハイブリダイゼーションの研究。
目的：
この実施例における目的は、実施例９で記載されたものと同じであるが、本発明によるプローブの異なる設計と標的の異なるモデルとを用いている。
【０２２６】
実験設計：
使用されたプローブは以下の通りである：
ＨＯｉ８プローブ（配列番号５０）：
３’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
ＨＩＶ−１Ａ参照分子ビーコン（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
【０２２７】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖に対応する。
【０２２８】
プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向き型のヌクレオチドに対応する。
【０２２９】
使用された合成標的配列は以下の通りである：
標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的５ＢＨ（配列番号３７）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１１ＰＨ（配列番号３８）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴ−３’
標的５ＰＨ（配列番号３９）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１ＢＨ（配列番号４０）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的１ＰＨ（配列番号４１）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的２ＢＨ（配列番号４２）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
標的２ＰＨ（配列番号４３）：
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣ−３’
【０２３０】
点線で下線が付された配列は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）または本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）のいずれかの認識配列にハイブリダイズすることができる部分に対応する。
【０２３１】
標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）は、ＨＩＶウイルスの生物学的標的配列の断片に対応する。それは、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分の鎖の配列に相補的なヌクレオチドを含有することができる。
【０２３２】
標的配列５ＢＨ（配列番号３７）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３３】
標的配列１１ＰＨ（配列番号３８）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら１１個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３４】
標的配列５ＰＨ（配列番号３９）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に５個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら５個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３５】
標的配列１ＢＨ（配列番号４０）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３６】
標的配列１ＰＨ（配列番号４１）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に１個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、このヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３７】
標的配列２ＢＨ（配列番号４２）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的である。
【０２３８】
標的配列２ＰＨ（配列番号４３）は、標的配列ＢｉｏＨ（配列番号３６）と比べて、点線で下線が付された配列の３’に２個のヌクレオチドを含有する。二重下線が付された、これら２個のヌクレオチドは、本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）の閉鎖配列の１つに相補的である。
【０２３９】
プローブは、
− 基本キット希釈剤（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ、ｒｅｆ．７０３５２）、
− ０．１マイクロモル濃度のプローブ、
− １．２５マイクロモル濃度の合成標的配列
を含有する溶液中に導入される。
【０２４０】
最終容量は、２０μｌである。
【０２４１】
陰性対照は、標的配列の代わりにミリＱタイプの超純水を用いて作製される。これにより、プローブのみの挙動を観察することが可能になる。
【０２４２】
溶液を蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中で６８℃に加熱し、冷めるまで５時間放置する。各溶液の蛍光を、冷却中ずっと、５２０ｎｍで測定する。プローブ／標的二重らせんの熱安定性は、曲線の転換点に対応する「Ｔｍ−標的」の値によって示される。Ｔｍ−標的は、この曲線の一次導関数の最小値として計算される。
【０２４３】
結果：
結果を表８および図１０に示す。表８は、この実施例に記載されたプローブと標的とで得られたＴｍ−標的（℃）の値を１つにまとめている。参照Ｔｍ−標的と比べたＴｍ−標的の増加は、標的とそのプローブの間でのさらなる相互作用の発生を示す。この実施例において、参照Ｔｍ−標的値は、分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）と標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたＴｍ−標的値におよびＨＯｉ８（配列番号５０）によるプローブと標的ＢｉｏＨ（配列番号３６）の間で測定されたそれに対応する。それらは、それぞれ、６０．６℃および６１．１℃に等しい。
【０２４４】
＊：分子ビーコンＨＩＶ−１Ａと相補的標的５ＢＨの間のＴｍの値は、測定可能な最大値の６８℃よりも大きかった。本実験の目的のために、本発明者らは、測定することができる最大可能値を示している。
【０２４５】
分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドを含有するとき、分子ビーコンプローブのＴｍ−標的が、「ステム」部分の鎖のうちの１つの配列に相補的なヌクレオチドの数に対して比例的に増加することが観察される。これは、プローブＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）の鎖のうちの１つの配列のヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合があることを示す。
【０２４６】
（逆向き型の）本発明によるプローブＨＯｉ８（配列番号５０）は、それが様々な合成標的配列の存在下で溶液中にあるとき、これらの合成標的配列にハイブリダイズし、測定可能な蛍光シグナルを生じさせる。合成標的が本発明によるプローブＨＯｉ８の閉鎖配列（配列番号５０）のうちの１つに相補的なヌクレオチドを含有するとき、逆向き型の本発明によるプローブのＴｍ−標的は安定なままであり、本発明によるプローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列中で隣接する相補的ヌクレオチドの間に塩基対合がないことを示す。
【０２４７】
結論：
これらのヌクレオチドが互いに相補的であるとしても、プローブの閉鎖配列のうちの１つのヌクレオチドと標的の配列の間にさらなる相互作用がないので、本発明によるプローブＨｏｉ８ｄは、分子ビーコンプローブＨＩＶ−１Ａよりも特異的である。プローブＨｏｉ８の分子認識配列に対応する標的核酸にハイブリダイズする本発明によるプローブの唯一の部分。このプローブの設計は、本発明によるプローブの標的の配列に近い配列への非特異的なハイブリダイゼーションの可能性を大いに減らす。
【０２４８】
一般的結論：
これらの実施例は、本発明によるプローブの設計とは無関係に、後者が分子ビーコンプローブのそれよりも大きいハイブリダイゼーションの特異性を示すことを示している。ヌクレオチドの性質（αヌクレオチドまたは逆向きのヌクレオチド）および本発明によるプローブの第２の断片に対するそれらの位置（３’での位置または５’での位置）は、本発明によるプローブの設計の質または本発明によるプローブのハイブリダイゼーションのその標的核酸に対する特異性に影響を与えない。
【０２４９】
実施例１３：本発明によるプローブを用いることによる酵素に起因する非特異的シグナルの低下の研究。
目的：
この実施例の目的は、該プローブの早過ぎる開裂という望ましくない現象に関連した本発明によるプローブの感度を研究することである。
【０２５０】
実験設計：
プローブを、その組成が以下に記載されている、反応混合物中での、ＮＡＳＢＡで使用されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素とともに、４１℃で４時間、蛍光リーダー（ＥａｓｙＱ ｒｅａｄｅｒ，ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、オランダ）の中でインキュベートする。反応混合物の組成は以下の通りである：
・供給元の取扱説明書に従って、６４μｌの基本キット試薬スフェア希釈液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号７０３５２）に希釈したＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ＥＱ基本キット試薬スフェア（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステルＮＬ，商品番号６００８５１１０）から調製した、１０μＬの「試薬ミックス」、
・３．７６マイクロリットルのソルビトール（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５１９２）、
・０．２マイクロリットルの８０ユニット／マイクロリットルの濃度の酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号７２２３６）、
・２マイクロリットルの２マイクロモルの初期濃度のプローブ。
・最終容量２０マイクロリットルにするための十分な量の「酵素ミックス溶液」。
【０２５１】
酵素以外の全ての構成要素を含有する、参照反応混合物を調製し、これを等量の「酵素ミックス溶液」と置き換える。
【０２５２】
以下のような、いくつかの他の溶液を混合することによって、「酵素ミックス溶液」を調製した：
８０μｌのＲＴ保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３４１）、
１１４μｌのＴ７保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３７）、
２０μｌのＲＨ保存緩衝液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３９）、
４１１μｌのプレミックス溶液（ビオメリューＢ．Ｖ．，ボクステル、ＮＬ，商品番号６００８５３３５）、
６２５μｌのミリＱタイプの超純水。
【０２５３】
蛍光シグナルは、フルオレセインの放出波長で、４１℃で４時間記録される。
【０２５４】
使用されたプローブは以下の通りである：
Ｏｐｉ６ｄプローブ（配列番号５）：
５’−Ｄａ−ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３’（ｄＴ−ＦＡＭ）３’−ｃｃｔｃｔｔｃｔｇ−５’
Ｏｐａ６ｄプローブ（配列番号１）：
５’−ｇａｃｃｇｔｃｔｇ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’Ｄａ
ＨＯｉ８プローブ（配列番号５０）：
３’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ−５’−５’−（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
ＨＯａ８プローブ（配列番号２）：
５’−ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ（ｄＴ−ＦＡＭ）ＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＨＩＶ−１Ａ（配列番号２１）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ−３’Ｄａ
分子ビーコンＣｐｉｎｆＢ（配列番号１３）：
５’−（ＦＡＭ）−ＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧ−３’Ｄａ
【０２５５】
下線が付された部分は、本発明によるプローブの閉鎖配列にまたは分子ビーコンの「ステム」部分を形成する鎖の配列に対応する。
【０２５６】
プローブ中の小文字で書かれたヌクレオチドは、α型のヌクレオチドに対応する。プローブ中の小文字でかつ太字で書かれたヌクレオチドは、逆向きのヌクレオチドに対応する。
【０２５７】
結果：
蛍光放出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の存在下（図１１ａ）または非存在下（図１１ｂ）で、様々なプローブのインキュベーション中に測定される。
【０２５８】
標的核酸の非存在下かつＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの非存在下（図１１ｂ）では、本発明によるプローブの場合であれ、分子ビーコンプローブの場合であれ、蛍光シグナルは検出されない。これは、これらの実験条件において、フルオロフォアとクエンチャーが互いに近くにあり、蛍光の「クエンチング」が可能になることを意味する。それゆえ、分子ビーコンプローブは閉じた立体構造をしている、すなわち、ヘアピン形の二次構造を有する。
【０２５９】
本発明によるプローブは、環状立体構造と呼ばれる、閉じた立体構造をしている。
【０２６０】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下かつ任意の標的核酸の非存在下では、本発明によるプローブにより放出される蛍光は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの非存在下かつ任意の標的核酸の非存在下で測定されるものと同じである。蛍光の「クエンチング」はここでも観察される。本発明によるプローブは、酵素の存在下でさえも、依然としてそれらの最初の立体構造、すなわち、環状立体構造をしている。
【０２６１】
逆に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素を、分子ビーコンプローブを含有する反応混合物に添加したとき、蛍光シグナルの増加が観察される。これは、フルオロフォアとクエンチャーの間の距離が増加したことを意味する。分子ビーコンの立体構造の変化は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの添加中に起こった。分子ビーコンプローブは開裂した。それらは、まるでそれらがそれらの標的核酸にハイブリダイズしてしまったかのように、線状の立体構造を有する。
【０２６２】
結論：
これらの結果は、解析された２つの分子ビーコン、ＣＰｉｎｆＢおよびＨＩＶ−１Ａが、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下でのそれらのインキュベーション中にシグナルの増加をもたらすのに対し、同じ条件で解析された本発明によるプローブはこの同じシグナルの増加をもたらさないということを示している。それらが３’で修飾された閉鎖配列を有するにせよ、５’で修飾された閉鎖配列を有するにせよ、およびそれらがαヌクレオチドを含有するにせよ、逆向きのヌクレオチドを含有するにせよ、この結果は、検査された全ての本発明によるプローブについて確認される。それゆえ、本発明によるプローブは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの混入物質の作用に感受性がない。本発明によるプローブの望ましくない自発的開裂はなく、それゆえ、非特異的シグナルの放出がない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を検出するためのプローブであって、
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖から構成されており、検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含んでおらず、２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに検出プローブが完全な円形を有し、それにより閉鎖配列がプローブを前記核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持する、プローブ。
【請求項２】
第１のマーカーが第１の断片のヌクレオチドによって担持され、第２のマーカーが第２のまたは第３の断片のヌクレオチドによって担持され、２つの閉鎖配列がハイブリダイズするとき、２つのヌクレオチドが近接することを特徴とする、請求項１に記載の検出プローブ。
【請求項３】
２つの閉鎖配列の全体または一部が平行にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項４】
一方の閉鎖配列の全体または一部がαヌクレオチドで構成された配列であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項５】
２つの閉鎖配列の全体または一部が逆平行ハイブリダイゼーションを経ることを特徴とする、請求項１または２に記載の検出プローブ。
【請求項６】
２つの閉鎖配列の一方が、５’−５’または３’−３’逆方向結合によって認識配列に結合していることを特徴とする、請求項１、２または５のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカーがフルオロフォアであり、少なくとも１つの他のマーカーが蛍光クエンチャーであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項８】
第１のまたは第２の閉鎖配列の全体または一部が、標的配列にハイブリダイズすることができることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、一方の閉鎖配列の末端に付加されていることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０】
試料中に存在し得る標的配列を検出する方法であって、
− 試料を請求項１から９のいずれか１項に記載の検出プローブと接触させる工程、
− 試料中の標的配列の存在を示す、検出プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーション形成を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
検出が、標的配列の増幅反応と一緒に実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
検出が、標的配列の増幅反応後に実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの検出プローブを含む標的配列を検出するためのキット。
【請求項１】
標的核酸を検出するためのプローブであって、
− 第１の閉鎖配列を有する第１の断片と
− 標的核酸を分子認識するための認識配列を、その全体または一部として有する第２の断片と
− 第２の閉鎖配列を有する第３の断片の３つの断片及び
− 少なくとも２つのマーカー
を含む標識ヌクレオチド鎖から構成されており、検出プローブの鎖の末端の１つがいかなるマーカーも含んでおらず、２つの閉鎖配列同士がハイブリダイズしたときに検出プローブが完全な円形を有し、それにより閉鎖配列がプローブを前記核酸の非存在下で検出することができない立体構造に維持する、プローブ。
【請求項２】
第１のマーカーが第１の断片のヌクレオチドによって担持され、第２のマーカーが第２のまたは第３の断片のヌクレオチドによって担持され、２つの閉鎖配列がハイブリダイズするとき、２つのヌクレオチドが近接することを特徴とする、請求項１に記載の検出プローブ。
【請求項３】
２つの閉鎖配列の全体または一部が平行にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項４】
一方の閉鎖配列の全体または一部がαヌクレオチドで構成された配列であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項５】
２つの閉鎖配列の全体または一部が逆平行ハイブリダイゼーションを経ることを特徴とする、請求項１または２に記載の検出プローブ。
【請求項６】
２つの閉鎖配列の一方が、５’−５’または３’−３’逆方向結合によって認識配列に結合していることを特徴とする、請求項１、２または５のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカーがフルオロフォアであり、少なくとも１つの他のマーカーが蛍光クエンチャーであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の検出プローブ。
【請求項８】
第１のまたは第２の閉鎖配列の全体または一部が、標的配列にハイブリダイズすることができることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、一方の閉鎖配列の末端に付加されていることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０】
試料中に存在し得る標的配列を検出する方法であって、
− 試料を請求項１から９のいずれか１項に記載の検出プローブと接触させる工程、
− 試料中の標的配列の存在を示す、検出プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーション形成を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
検出が、標的配列の増幅反応と一緒に実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
検出が、標的配列の増幅反応後に実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの検出プローブを含む標的配列を検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１２ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１２ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５２６４８８（Ｐ２０１１−５２６４８８Ａ）
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５５８３（Ｐ２０１１−５１５５８３）
【出願日】平成２１年７月３日（２００９．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００１０７４
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３日（２００９．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００１０７４
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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