新規ニトロレダクターゼ酵素基質
本発明は、下記の式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニトロレダクターゼ活性を検出するための新規酵素基質に関する。これらの基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、物理化学的シグナルを生じる酵素還元の工程を含む適用に使用できる。
【０００２】
現在、非常に多数の培地が、微生物を検出するために存在する。特に、この検出は検出が要求される微生物の酵素に特異的な特定の基質の使用に基づいてもよい。一般に、酵素のための合成基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と標識（通常は発色標識か蛍光標識）として働く第２の部分から構成される。したがって、バクテリアの場合、基質の選択のおかげで、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。ニトロレダクターゼ活性は、バクテリアのグループ、属または種を明らかにするために特に使用されうる。また、微生物の増殖又はこの増殖の抑制にリンクした還元代謝を観察するために用いられてもよい。
【０００３】
ニトロ芳香族化合物を還元する特定のバクテリアの能力は長年知られていた。Asnis（1957）は、p-ニトロ安息香酸を還元することができた大腸菌抽出物から、プラビンタンパク質の単離を報告した。この報告以来、ニトロアリール・レダクターゼ活性は、生物のさまざまな種類で同定された。これは、シュードモナス属の種(Won et al. 1974)及びノカルジア属の種(Villanueva 1964)のような絶対好気性微生物、クロストリジウム属の種(Ancermaier 及び Simon 1983)及びベーヨネラ属の種(McCormick et al. 1976)のような絶対嫌気性微生物、あるいは菌類(Masuda & Ozaki 1993)及び真核性寄生生物（Douch 1975）を含む。細菌性のニトロアリール・レダクターゼによって還元されることができると記載された、さまざまな基質の範囲が存在する。特に、それらはp-ニトロ安息香酸、p-ニトロフェノール、p-ニトロアニリン及び2,4,6-トリニトロトルエン(McCormick et al. 1976)のようなニトロ芳香族化合物である。
【０００４】
通常、ニトロレダクターゼ酵素活性の検出は、基質または補因子の消失を測定するような間接的な方法によって行われる。例えば、Kitamura等 (1983)は、大腸菌抽出物による、メチルp-ニトロベンゾアートとさまざまな他のニトロ芳香族化合物の還元を研究した。しかしながら、この方法は、あまり感受性がなく、不均一培地における検出に適していない。また、ニトロアリール・レダクターゼ活性の直接的な検出のためのニトロクマリンに基づく蛍光発生基質を記載する出願WO00/28073を挙げることができる。このタイプのニトロ芳香族化合物は、還元後、非常に蛍光性で、そのため容易に検出可能である化合物を生じることができる。しかしながら、この基質は、不均一培地における検出に、あまり適していない。
【０００５】
従って、本発明は、微生物の検出のための改良されたニトロレダクターゼ基質を提案する。従来の基質と比較して、これらの新規基質は合成が容易であり、それらは反応培地中に拡散しない呈色を生じるので、特に微生物を検出するためのゲル培地において使用できる。
【０００６】
本発明の説明を続ける前に、下記の定義を、本発明の開示を容易にするために提供する。
「酵素基質」なる用語は、酵素によって修飾され、微生物の、細胞の、またはオルガネラの、直接的または間接的な検出を可能にする生成物を提供し得る基質を意味することを目的とする。ニトロレダクターゼ基質の場合、この基質は特に、明らかにされる酵素活性によって部分的にまたは完全に還元されるニトレート機能を含み、このニトレート機能の還元が分子の特定の物理化学的特性を修飾し、この還元が追跡されることを可能にする。
還元の生成物が酵素活性を発現している細胞に主に局在したままであるので、この活性を発現している細胞を特に計数すること、またはサンプルの残りからそれらを分離することさえ可能であるので、本発明に係る基質はフローサイトメトリーでの使用に特に適している。
【０００７】
還元の生成物が加水分解の場所に主に局在したままであるため、組織中でこの活性を発現している細胞またはオルガネラを特に同定することが可能であるので、本発明に係る基質は組織酵素学での使用に非常に適している。
低い毒性のおかげで、本発明に係る基質は、細胞培養ニトロレダクターゼ活性を観察することに非常に適している。
また、本発明に係る基質は、反応培地中に拡散しない呈色または蛍光を生じるので、検出および／または同定培地での使用に非常に適している。本出願において、「呈色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である呈色、又はある波長（λex）での吸収とより高い波長（λem）での放出である蛍光をカバーするために使用される。
本発明の基質は、塩を形成してもよく、すなわち塩化物、臭化物またはトリフルオロ酢酸塩のような塩の形態でもよい。
【０００８】
「ニトロレダクターゼ」なる用語は、ＮＯ２基を完全にまたは部分的に還元することができる酵素を意味することを目的とする。
「アルキル基」なる用語は、飽和炭化水素ベースの基の鎖、特にＣ１-Ｃ６アルキル、すなわち１から６の炭素原子を含む直鎖または分枝状アルキルを意味することを目的とする。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル及びヘキシルを挙げることができる。
「アリール基」なる用語は、芳香環、例えばＣ６-Ｃ１０芳香環、特にフェニル、ベンジル、1-ナフチルまたは2-ナフチルに由来する官能基（または置換基）を意味することを目的とする。
「カルボキシル基」なる用語は、第１の酸素原子に二重結合により、及び第２の酸素原子（それ自体が負に荷電しているか、又は水素原子に結合している）に単結合により結合された炭素原子から成る官能基を意味することを目的とする。分子のｐＫａ及び培地のｐＨに応じて、カルボキシル基はイオン化型、すなわち第２の酸素原子に結合するＨを有さず、それにより負に帯電していてもよい。
【０００９】
「反応培地」なる用語は、代謝の発現のために及び／又は微生物、細胞、またはオルガネラの増殖のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、フローサイトメトリ、組織酵素学、細胞培養等や、あるいは微生物検出および／または同定培地として使用できる。
反応培地は、固体、半固体、又は液体でもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化された培地を意味することを目的とする。寒天は微生物を培養するための微生物学における通常のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することが可能である。一定数の調製物は、例えばコロンビア寒天、トリプケース−ソイ寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天、又はさらに一般的にいえば、微生物学培地ハンドブック（the Handbook of Microbiological Media：ＣＲＣ出版）に記載されているものは、市販されている。
反応培地は、例えばアミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ソーダ塩、金属塩のような一つ以上の成分を組合せて含んでもよい。
また、培地は着色剤を含んでもよい。例として、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等を挙げることができる。
反応培地は、検出および／または同定培地、すなわち発現用培地または培養且つ発現用培地であってもよい。第１の場合において、微生物は接種の前に培養され、第２の場合において、検出および／または同定培地は培養培地をも構成する。
【００１０】
「生物試料」なる用語は、生体液標本に由来する臨床試料、又は任意の種類の食品に由来する食品試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体又は固体でもよく、血液、血漿、尿または糞便、鼻、のど、皮膚、傷又は脳脊髄液から採取された試料に由来する臨床試料、水又例えば牛乳または果汁等の飲料由来の；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズまたはチーズ由来の；魚等に由来の食品試料、あるいは、特に動物の餌のような動物飼料に由来する食品試料を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、サンプルは、臨床環境からの標本、家畜標本、食品、化粧品または薬剤生産からの標本であってもよい。「環境標本」なる用語は、特に、表層から、液体から、出発原料からまたは製品から採取される標本を意味することを目的とする。
【００１１】
本発明の目的において、「微生物」なる用語はバクテリア、特にグラム陰性菌とグラム陽性菌、酵母、寄生生物、菌類、さらに一般的にいえば、通常は単細胞生物であって、肉眼では見えず、且つ実験室で増殖させ及び操作できる生物を含む。
グラム陰性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、霊菌属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、エーロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロホモナス属、キサントモナス属及びレジオネラ属。
グラム陽性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、乳酸桿菌属、リステリア属、クロストリジウム属、ガルドネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属（Falkamia）、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリア属及びコリネバクテリウム属。
酵母について、以下の属の酵母を挙げることができる：カンジダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００１２】
本発明は、下記の式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重（1,2-ジヒドロ）あるいはニ重でもよく、好ましくはニ重である。
もちろん、本発明に係る基質は、複数の置換基、すなわち環のさまざまな位置に複数のＲ１及びＲ２基を含んでもよい。Ｒ２がＯ-ＣＨ２-Ｏであるとき、Ｒ２は環員の２つが共有されているニトロフェニルに結合する環である。Ｒ１および／またはＲ２がアルキル基またはアリール基であるとき、ＯＨ、カルボキシル、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩのような一以上の置換基によって置換されてもよい。
ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＮＸ１と４位のＯに二重結合を介して結合するＣを含む。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＸはＳである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＯである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１-ＣＯである。
本発明のある好ましい実施形態によれば、Ｒ１は５位にある。
本発明のある好ましい実施形態によれば、Ｒ２は４’位にある。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は５’位にある。
本発明の他の好ましい実施例によれば、Ｒ２は４’位及び５’位にある。
【００１４】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり：
・Ｒ１とＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり、好ましくは５位であり；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣＨ３であり、好ましくは５位であり；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３であり、好ましくは４’位と５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３であり、好ましくは５’位である。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり、好ましくは３位である；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位である。
【００１６】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
【００１７】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
【００１８】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３であり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は
であり、好ましくは５’位である。
【００１９】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＮＯ２であり、好ましくは４’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位であり；
・ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重である（1,2-ジヒドロ）。
【００２０】
好ましくは、本発明による基質は、表１に記載されている基質から選択される。
表１
表１のつづき
【００２１】
また、本発明は、上記の少なくとも一つの酵素基質を含む反応培地にも関する。
また、本発明は、上記の少なくとも一つの酵素基質を含む微生物検出および／または同定培地にも関する。好ましくは、上記基質は１と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度、好ましくは１０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記培地は、本発明に係る基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的である少なくとも一つの他の酵素基質を含む。
他の基質の酵素加水分解は検出可能なシグナルであって、本発明の基質により検出されるシグナルとは異なるシグナル、例えば異なる着色性あるいは蛍光性生成物を生じ、それにより一つ以上の微生物の検出および／または同定および／または定量のような実証を可能にする。他の特異的な基質について、微生物の検出において従来使用されている他の任意の基質を使用してもよい。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質について、容易にこのような濃度を決定することが可能である。例として、本発明に係る基質を、ペプチダーゼ、オシダーゼ、エステラーゼまたはレダクターゼ酵素基質と結合することは可能である。特に、本発明に係る基質を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコシドまたはアリザリン-β-ガラクトシドのようなオシダーゼ基質と、又は5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル・オクタノエートまたは5-ブロモ-3-インドキシル・ホスフェートのようなエステラーゼ基質と組合わせることが可能である。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記培地も、本発明に係る基質によって検出される酵素活性に特異的である、少なくとも一つの他を酵素基質を含む。
従って、基質の特定の選択に係わらず、同じ酵素活性を発現する微生物の群を同定することは可能である。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質について、容易にこのような濃度を決定することが可能である。特に、本発明に係るて基質を、出願WO00/28073に記載されているようなニトロクマリンに基づく蛍光発生基質と結合することが可能である。
【００２３】
また、本発明は、微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
また、本発明は少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、及び
ｄ）少なくとも１つのニトロレダクターゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
【００２４】
微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性及び検出される微生物に応じて、当業者は容易に選択することができる。工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ニトロレダクターゼ活性の存在を、単独で、または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
下記の実施例は、説明として示すものであり、事実上決して制限するものではない。それらは、より明らかに本発明を理解することを可能にする。
【００２５】
実施例
１−基質の合成
・「ＸはＳである」
基質２２：2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾチアゾール
１ｅｑの2-アミノフェノールとエタノールと１ｅｑの2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、油浴を用いて、温度１１０℃で１時間、還流した。 混合物は周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより中間生成物を得た。 上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１ｅｑの2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応はオーバーナイトで実行され、次に濾過後、生成物を最大で回収するために、それがＤＣＭに可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。生成物を得るために、溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００２６】
基質１５：2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾール
３．００ｇ（０．０２４モル）の2-アミノチオフェノールと４．０５ｇ（０．０２４モル）の5-ニトロ-3-フルオロベンズアルデヒドの混合物のエタノール（１５０ｍｌ）溶液を２時間、環流した。周囲温度に冷却後、溶液は減圧下で濃縮された。残った固体は水と酢酸エチルの混合物（５００ｍｌ）に希釈され、酢酸エチル（２×５０ｍｌ）を使用して更に２回抽出された。合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、エタノールから再結晶化して、粗生成物を得るために濃縮した。質量１．２８ｇのＯＦ５４Ａ２の微細な赤色の結晶が収率４７％で得られ、測定された融点は１５６−１５８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.87 (1H, t, J = 4 Hz, Ar-H), 6.89 (1H, s, Ar-H), 7.05 (1H, t, J = 4 Hz, Ar-H), 7.11 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.13 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.69 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H), 8.17 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H).
【００２７】
基質２３：2-（2'-ニトロ-5'-（N-メチルピペラジニル）フェニル）ベンゾチアゾール（ＯＦ８０Ａ）
０．３１ｇ（０．００３０モル）のN-メチルピペラジンを、０．４１ｇ（０．０１５モル）の2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾールと０．３２ｇ（０．００２３モル）のＫ２ＣＯ３の５ｍｌのジメチルスルホキシド溶液の混合物に加えられた。反応は磁気的に撹拌され、９０℃で加熱されて、その進行がＴＬＣによって確認された。
反応が完了した後（少なくとも８時間）、反応混合物は酢酸エチル（７７ｍｌ）に希釈され、このようにして得られた有機相は２×６５ｍｌの水で、次に６５ｍｌのブラインで洗われ、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより０．３６ｇの高度に静電気の橙黄色の固体（ＯＦ８０Ａ）を収率６８％で得た。カラムクロマトグラフィーによる精製は、必要に応じて実行され得る;これは今回は事実ではなかった。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 2.35 (3H, s, CH3), 2.45 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH2), 3.49 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH2), 6.85 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 6.90 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.41 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.43 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.05 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H).
LC-MS-DI m/z Found: 355.57 (C18H18N4O2S) (M+H): requires M. 354.43.
【００２８】
基質２１：2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
基質Ｎｏ．２１は、2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾール（基質Ｎｏ．１５）の合成と類似した方法で合成した。
【００２９】
・「ＸはＯである」
基質１−2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール
８．７３ｇ（０．０８００モル）の2-アミノフェノールと２０ｍｌのエタノールと１２．０９ｇ（０．０８００モル）の2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、温度１１０℃で１時間、油浴を用いて還流した。混合物は周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより１３．２５ｇの2-（2'-ニトロベンジリジンアミノ）フェノールを収率６９％で得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１２．４３ｇ（０．０５４７モル）の2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応をオーバーナイトで実施した。濾過後、生成物を最大で回収するために、それがＤＣＭに可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。 溶媒を減圧下で蒸発させ、それにより収率６４％でベージュ-茶色の固体の、８．３９ｇの2-(2-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾールを得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００３０】
基質２−2-（2'-ニトロフェニル）-5-クロロ・ベンゾオキサゾール ― VLS259
基質Ｎｏ．２は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成された。
【００３１】
基質６−2-（2'-ニトロ-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール−VLS261
１． 2-((3'-クロロ-6'-ニトロベンジリデン）アミノ）フェノール（VLS 263）の合成
２．１８ｇ（０．０２モル）の2-ヒドロキシアニリンと３．７３ｇ（０．０２モル）の2-ニトロ-5-クロロベンズアルデヒドのエタノール溶液の混合物を３−４時間、還流した。結果として生じた結晶性沈殿を集め、減圧下のデシケータにおいて乾燥した。質量１．９８ｇの微細なオレンジ色の結晶が収率８０％で得られ、測定された融点は１４４−１４６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(CDCl3) δ 6.95 (1H, t, J=8 Hz, Ph-H), 7.05 (1H, dd, J=8 Hz, J=1.2 Hz, Ph-H), 7.10 (1H, s (broad), OH), 7.28 (1H, t, J=8 Hz, Ph-H), 7.33 (1H, dd, J=8 Hz, J= 1.4 Hz, Ph-H), 7.60 (1H, dd, J=8.66 Hz, J=2.2 Hz, 4’H), 8.05 (1H, d, J=8.66 Hz, 5’H), 8.23 (1H, d, J=2.4 Hz, 2’H), 9.27 (1H, s, =CH-)
υmax cm-1 3442 (OH), 1558 (NO2), 1376 (NO2), 1521 (C=N), 1341 (OH), 1301 (OH), 1143 (C-N), 1176 (C-O), 1461 (Ar-H), 756 (C-Cl).
【００３２】
２． 2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾオキサゾール（VLS269）の合成
１．１４ ｇ（０．００５モル）の2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（ＤＤＱ）を、周囲温度でジクロロメタン中で撹拌された2- ((3' -クロロ-6'-ニトロベンジリデン）アミノ）フェノールに、５分間にわたって加えた。混合物は、２日間撹拌したままにし、濾過して、蒸発させ、それにより、生成物を得た。質量０．９７ｇの緑がかった褐色の粉末が収率７０％で得られ、測定された融点は１３０−１３２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C13H7ClN2O3 Calculated mass of molecular ion 274.0140 (M+H)+ Measured mass: 274.0141. 1H-NMR:(CDCl3) δ 7.40-7.45 (2H, m, Ph-H), 7.56-7.61 (1H, m, Ph-H), 7.65 (1H, dd, J=8.66 Hz, J=2.23 Hz, 4’H), 7.80-7.85 (1H, m, Ph-H), 7.87 (1H, d, J=8.66 Hz, 5’H), 8.16 (1H, d, J=2.23 Hz, 2’H). υmax cm-1 1534 (NO2), 1371 (NO2), 1572 (C=N), 1616 (C=N), 1182 (C-O), 1236 (C-O), 1153 (C-N), 1461 (Ar-H), 743 (C-Cl).
【００３３】
３． 2-(3',4'-ジメトキシ-6'-ベンジリデン）アミノ）フェノール（VLS 260）の合成
３．２７ｇ（０．０３モル）の2-ヒドロキシアニリンと６．３３ｇ（０．０３モル）の6-ニトロベラトルアルデヒドの混合物のエタノール溶液を３−４時間、還流した。結果として生じた結晶性沈殿を集めて、減圧下でデシケータにおいて乾燥した。質量８．２０ｇの微細なオレンジ色の結晶が収率９０％で得られ、測定された融点は１９６−１９８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(CDCl3) δ . 1H-NMR:(CDCl3) δ 4.00 (3H, s, CH3O), 6.92 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.01 (1H, dd, J=7 Hz, J=1.4 Hz, Ph-H), 7.12 (1H, s (broad), OH), 7.22 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.32 (1H, dd, J=7 Hz, J=1.4 Hz, Ph-H), 7.62 (1H, s, 5’H), 7.69 (1H, s, 3’H), 9.25 (1H, s, =CH-). υmax cm-1 3416 (OH), 1566 (NO2), 1384 (NO2), 1589 (C=N), 1344 (OH), 1317 (OH), 1181 (C-N), 1149 (C-O), 1461 (Ar-H), 2838 (OMe).
【００３４】
４． 2-（2' -ニトロ-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール（VLS 261）の合成
２．２７ｇ（０．０１モル）の2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（ＤＤＱ）を、周囲温度でジクロロメタン中で撹拌された３．０４ｇ（０．０１モル）の2- (3',4' -ジメトキシ-6'-ベンジリデン）アミノ）フェノールに、５分間にわたって加えた。
混合物は、２日間撹拌したままにし、濾過して、蒸発させ、それにより、生成物を得た。
質量２．７６ｇの橙褐色の粉末が収率９０％で得られ、測定された融点は１４８−１４６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C15H12N2O5 Calculated mass of molecular ion 301.0819 (M+H)+Measured mass: 301.0819. 1H-NMR:(CDCl3) δ 4.00 (6H, d, J=2.7 Hz, (OCH3)2), 7.37-7.41 (2H, m, Ph-H), 7.43 (1H, s, 5’H), 7.52 (1H, s, 2’H), 7.53-7.57 (1H, m, Ph-H), 7.78-7.82 (1H, m, Ph-H). υmax cm-1 1519 (NO2), 1378 (NO2), 1582 (C=N), 1189 (C-N), 1177 (C-O), 1448 (Ar-H), 2850 (OMe).
【００３５】
基質７−2-（2' -ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾオキサゾール−OF20B
１時間の温度１１０℃で、１０．９１ｇ（０．１００モル）の2-アミノフェノールと１６．９１ｇ（０．１００モル）の2-ニトロ-5-フルオロベンズアルデヒド混合物の２００ｍｌのエタノール溶液を油浴を用いて還流した。混合物を周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。固体を減圧下のデシケータにおいて乾燥し、それにより９３％の収率で２４．０９％のＯＦ２０Ａを得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に２１．０４ｇ（０．０９２７モル）の2,3-ジシアノ-5,6 ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けで加えた。反応をオーバーナイトで実施し、ろ過後、生成物の最大量を回収するために、それがＤＣＭにおいて可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
溶媒は減圧下で蒸発させ、それにより６１％の収率で、１４．４９ｇのＯＦ２０Ｂのベージュ−茶色の固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ= 7.37 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.43 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.45 (1H, s, Ar-H), 7.59 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.82 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.96 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００３６】
基質３：2-（2'-ニトロフェニル）-5-メチルベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．３は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
基質４：2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．４は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
基質５：2-（2'-ニトロ-4',5'-ジメチレンジオキシフェニル）ベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．５は、2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
【００３７】
基質８：2-（2'-ニトロ-5'-（N-メチルピペラジニル）フェニル）ベンゾオキサゾール（OF29A）
１．０１ｇ（０．０１０モル）のN-メチルピペラジンを、１．２９ｇ（０．００５モル）の2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾオキサゾールと１．０４ｇ（０．００７５モル）のＫ２ＣＯ３の混合物の９ｍｌのジメチルスルホキシド溶液に加えた。反応は磁気的に撹拌され、９０℃で加熱され、その進行がＴＬＣによって確認された。
反応が完了した後（少なくとも８時間）、反応混合物は酢酸エチル（７７ｍｌ）に希釈し、このようにして得られた有機相は２×６５ｍｌの水で、次に６５ｍｌのブラインで、慎重に洗浄され、硫酸ナトリウムを使用して乾燥させ、７３％の収率で、１．２３ｇの黄/金色の花弁のＯＦ２９Ａを得た。 カラムクロマトグラフィーによる精製は、必要に応じて実行され得る；これは今回は事実ではなかった。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): d = 2.35 (3H, s, CH3), 2.57 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH), 3.48 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH), 6.95 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 6.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.28 (1H, s, Ar-H), 7.39 (1H, t, J = 9 Hz, Ar-H), 7.41 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.55 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 8.1 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m.p.: 122-126
LC-MS-DI m/z Found: 339.54 (C18H18N4O3) (M+H): requires M. 338.37.
【００３８】
・「ＸはＮＸ１-ＣＯである」
基質２０−2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワン1. 1,2-ジヒドロ-2（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（VLS 276）の合成
２．３１ｇ（０．０１７モル）の2-アミノベンザミドと３．１４ｇ（０．０１７モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドを、エタノール中で１時間、還流した。次に、混合物を冷却し、得られたオレンジ色の結晶はクリスタルは収集されて、減圧下のデシケータにおいて乾燥した。質量３．９７ｇの淡いオレンジ色の結晶が収率７６％で得られ、測定された融点は２３４−２３６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6’H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3’H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 304.0482
υmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl).
【００３９】
２． 2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（VLS 278）の酸化
質量９．１０ｇ（０．０３モル）の2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワンを４０ｍｌの無水アセトンに溶解し、４．７４ｇ（０．０３モル）の過マンガン酸カリウムの無水アセトン溶液によって処理した。この溶液は、周囲温度で２−３時間にわたって、混合物に滴下された。次に、反応はオーバーナイトで撹拌された。過剰なＫＭｎＯ４は、過剰の固体の亜硫酸水素ナトリウムを加えることによって除去された。次に、溶液をろ過し、蒸発させた。質量２．２６ｇのペールホワイト色の粉体が収率２５％で得られ、測定された融点は２７６−２７８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C14H8ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) δ 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3’H). υmax cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl).
【００４０】
基質１７−2-（2'-ニトロフェニル）-3-メチルキノキサゾル-4-ワン
１． 2-アミノ-N-メチルベンズアミド（VLS 291）の合成
１６．２０ｇ（０．０９９モル）の等張無水物に、ＣＯ２の放出を制御しながら、撹拌で、小分けにして、２５ｍｌの４０％メチルアミンを加えた。混合物は、周囲温度で１時間、保たれた。次に、混合物は、ＨＣｌの２Ｍ溶液によって中和し、ビュッヒ製の装置により減圧下で濾過し、水により数回を洗い、減圧下のデシケータを使用して乾燥した。質量１１．６１ｇの灰色の粉末を収率７８％で得た。
２． 2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）-3-メチルキノキサゾリン-4-ワンの合成（VLS 292）
質量７．５ｇ（０．０５モル）の2-アミノ-N-メチルベンズアミドと９．３０ｇ（０．０５モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドを、磁気的に撹拌して、２−３時間還流させた。このようにして得られたオレンジ色の結晶は、ビュッヒ製により減圧下で濾過して、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量１０．３８ｇの針状微細なオレンジ色の結晶を、収率６６％で得た。
３． ＶＬＳ ２９２の酸化（ＶＬＳ ２９５ｂ）
質量３．１７ｇ（０．０１モル）のＶＬＳ ２９２ｂを無水アセトンに溶解した。ＫＭｎＯ４の６．３２ｇ（０．０４モル）を無水アセトンに溶解し、前記の混合物に１〜２時間にわたって、滴下した。次に、反応をオーバーナイトで撹拌した。次に、混合物をメタ重亜硫酸ナトリウムにより中和し、濾過し、蒸発させ、それにより過剰なアセトンを除去した。質量の２．６０ｇの白色粉体は、収率８０％で得た。
【００４１】
・「ＸはＮＸ１である」
基質１４−2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール）
１． N-フェニルエチル-2-ニトロアニリン（VLS 209）
質量４．８ｇ（０．０４モル）の2-フェニルエチルアミンを、周囲温度で、５．６ｇ（０．０４モル）の2-フルオロニトロベンゼンと１１．０６ｇ（０．０８モル）の無水炭酸カリウムの３０ｍｌのＤＭＳＯ溶液の混合物に滴下された。混合物を、１００℃で３時間、加熱した。次に、混合物を周囲温度に冷却し、１００ｍｌの水を加え、ライトオレンジ色の化合物の沈殿物を生じた。固体を濾過により回収し、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。９．４ｇのオレンジ色の結晶を収率９８％で得た。求められた融点は、理論上の値、すなわち６４−６６℃と合致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 6.65 (1H, m, Ph-H), δ 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), δ 8.10 (1H, s(broad), NH), δ 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
【００４２】
２． N-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼン（VLS 210）
周囲温度の窒素下、磁気的に撹拌しながら、水素化ホウ素ナトリウムの０．３８ｇ（０．０１モル）の溶液は、エタノールの銅のアセチルアセトネートの０．５２ｇ（０．００２モル）の懸濁液に加えられた。この溶液に、ＶＬＳ ２０９の２．４２ｇ（０．０１モル）のニトロ化合物のエタノール溶液を、続いて０．７６ｇ（０．０２モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を加えた。混合物は、周囲温度で窒素下、オーバーナイトで撹拌した。次に、混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮し、水は加えた。つぎに、抽出を２×２０ｍｌのＤＣＭによって実行し、有機相を水で数回洗い、炭酸カリウムを使用して乾燥させて、回転蒸発装置で濃縮した。質量１．６９ｇの黒っぽい油性液体で、続いて凝固したものを収率８０％で得た。求められた融点は、理論上の値、すなわち４２−４４℃と合致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.27 (2H, s (broad), NH2), δ 3.38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.69 (3H, m, Ph-H), δ 6.82 (1H, m, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H).
【００４３】
３． 2-（2' -ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3 -フェネチルベンズイミダゾール（VLS 213）（または2-（2' -ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェネチルベンズイミダゾール）
８．６０ｇ（０．０１４モル）のオキソン（モノ過硫酸カリウム）を、５．０８ｇ（０．０２４モル）のN-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼンと４．８ｇ（０．０２４モル）の6-ニトロピペロナールの２５ｍｌＤＭＦ溶液と１ｍｌの水溶液に、周囲温度で１５分間にわたって磁気的に撹拌しながら加えた。反応が発熱性だったので、混合物を水槽で冷却し、オーバーナイトで撹拌しておいた。次に水を混合物に加え、ＤＣＭで２回連続した抽出を実行した。混合した有機相を複数回水によって洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、それにより黄／茶色の粗生成物を得た。エタノールによる再結晶化を、化合物を精製するために実行した。質量６．１９ｇの茶色の結晶を収率６７％で得て、測定された融点は１６２−１６４℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H17N3O4 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 4.20 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 6.02 (1H, s, Ph-H), δ 6.18 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.48 (1H, m, Ph-H), δ 7.65 (1H, s, Ph-H), δ 7.80 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2).
基質１２−2-（2'-ニトロフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール ― ５４
基質Ｎｏ．１２を、2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成した（基質Ｎｏ．１４）。
【００４４】
２−ニトロレダクターゼ活性を検出するための本発明に係る基質の使用（基質Ｎｏ．１;２; ３; ４; ５; ６; ７; ８; １５; １２; ２１; ２３）
ａ）培地の調製
質量４０ｍｇの各基質を、４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。この溶液は、前もってオートクレーブされた４００ｍｌのコロンビア寒天に完全に混ぜて、５０℃に溶解して保った。各基質の最終濃度は、１００ｍｇ／ｌであった。各々の培地を、９０ｍｍシャーレに、シャーレつき２０ｍｌの割合で分配した。
ｂ）接種とインキュベーション
コレクションに由来する、バクテリアと酵母のさまざまな種類に属する１８の微生物菌株は、１０μｌの１／２０に希釈された０．５マクファーランドの懸濁液の半定量的隔離によって、これらの培地に接種された。培地は３７℃で２４時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは３６０−３６５ｎｍのＵＶ照射下で視覚的に調べられた。
ｃ）結果の記録
得られた結果を表２から５に示す。
【００４５】
表２
表２のつづき
【００４６】
表３
【００４７】
表４
【００４８】
表５
【００４９】
7-ニトロクマリン（ＡＭＣ）（例えば7-ニトロクマリン-3-カルボン酸）に基づく基質で観察されることとは反対に、試験された本発明に係る全ての基質では、蛍光はコロニーのみに、又はすぐ近辺に局在化していた。 これらの結果は、基質Ｎｏ．２、３、４、６、７、８、１５及び２１が、特にＭＲＳＡ菌株（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）を、大部分の他のグラム陽性菌から、区別するかまたは同定することを可能にすることを示す。
この種の医学的な重要性により、これは、臨床検査標本だけでなくの食品標本の黄色ブドウ球菌（S.アウレウス）の迅速且つ特異的な検出に、非常に役立ち得る。
【００５０】
さらに、芳香環における置換基に応じて、グラム陰性菌に関する本発明に係る基質の特異性は、可変的である。例えば、基質２、７及び１５は、アシネトバクター・バウマニーからシュードモナス・アエルギノーサ（緑濃菌）を区別できる；サルモネラ・チフィムリウム（ネズミチフス菌）は基質７及び１５では強く陽性であり、基質２、６及び１２では陰性である。基質１２は、モルガネラ・モルガニーに特異的である。
【００５１】
ｄ）結論
本発明に係る基質は、微生物学のための反応培地に使用することができる。これらの培地は、医学的、工業的、環境的に興味のある微生物の検出、計数および／または同定に非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はニトロレダクターゼ活性を検出するための新規酵素基質に関する。これらの基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、物理化学的シグナルを生じる酵素還元の工程を含む適用に使用できる。
【０００２】
現在、非常に多数の培地が、微生物を検出するために存在する。特に、この検出は検出が要求される微生物の酵素に特異的な特定の基質の使用に基づいてもよい。一般に、酵素のための合成基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と標識（通常は発色標識か蛍光標識）として働く第２の部分から構成される。したがって、バクテリアの場合、基質の選択のおかげで、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。ニトロレダクターゼ活性は、バクテリアのグループ、属または種を明らかにするために特に使用されうる。また、微生物の増殖又はこの増殖の抑制にリンクした還元代謝を観察するために用いられてもよい。
【０００３】
ニトロ芳香族化合物を還元する特定のバクテリアの能力は長年知られていた。Asnis（1957）は、p-ニトロ安息香酸を還元することができた大腸菌抽出物から、プラビンタンパク質の単離を報告した。この報告以来、ニトロアリール・レダクターゼ活性は、生物のさまざまな種類で同定された。これは、シュードモナス属の種(Won et al. 1974)及びノカルジア属の種(Villanueva 1964)のような絶対好気性微生物、クロストリジウム属の種(Ancermaier 及び Simon 1983)及びベーヨネラ属の種(McCormick et al. 1976)のような絶対嫌気性微生物、あるいは菌類(Masuda & Ozaki 1993)及び真核性寄生生物（Douch 1975）を含む。細菌性のニトロアリール・レダクターゼによって還元されることができると記載された、さまざまな基質の範囲が存在する。特に、それらはp-ニトロ安息香酸、p-ニトロフェノール、p-ニトロアニリン及び2,4,6-トリニトロトルエン(McCormick et al. 1976)のようなニトロ芳香族化合物である。
【０００４】
通常、ニトロレダクターゼ酵素活性の検出は、基質または補因子の消失を測定するような間接的な方法によって行われる。例えば、Kitamura等 (1983)は、大腸菌抽出物による、メチルp-ニトロベンゾアートとさまざまな他のニトロ芳香族化合物の還元を研究した。しかしながら、この方法は、あまり感受性がなく、不均一培地における検出に適していない。また、ニトロアリール・レダクターゼ活性の直接的な検出のためのニトロクマリンに基づく蛍光発生基質を記載する出願WO00/28073を挙げることができる。このタイプのニトロ芳香族化合物は、還元後、非常に蛍光性で、そのため容易に検出可能である化合物を生じることができる。しかしながら、この基質は、不均一培地における検出に、あまり適していない。
【０００５】
従って、本発明は、微生物の検出のための改良されたニトロレダクターゼ基質を提案する。従来の基質と比較して、これらの新規基質は合成が容易であり、それらは反応培地中に拡散しない呈色を生じるので、特に微生物を検出するためのゲル培地において使用できる。
【０００６】
本発明の説明を続ける前に、下記の定義を、本発明の開示を容易にするために提供する。
「酵素基質」なる用語は、酵素によって修飾され、微生物の、細胞の、またはオルガネラの、直接的または間接的な検出を可能にする生成物を提供し得る基質を意味することを目的とする。ニトロレダクターゼ基質の場合、この基質は特に、明らかにされる酵素活性によって部分的にまたは完全に還元されるニトレート機能を含み、このニトレート機能の還元が分子の特定の物理化学的特性を修飾し、この還元が追跡されることを可能にする。
還元の生成物が酵素活性を発現している細胞に主に局在したままであるので、この活性を発現している細胞を特に計数すること、またはサンプルの残りからそれらを分離することさえ可能であるので、本発明に係る基質はフローサイトメトリーでの使用に特に適している。
【０００７】
還元の生成物が加水分解の場所に主に局在したままであるため、組織中でこの活性を発現している細胞またはオルガネラを特に同定することが可能であるので、本発明に係る基質は組織酵素学での使用に非常に適している。
低い毒性のおかげで、本発明に係る基質は、細胞培養ニトロレダクターゼ活性を観察することに非常に適している。
また、本発明に係る基質は、反応培地中に拡散しない呈色または蛍光を生じるので、検出および／または同定培地での使用に非常に適している。本出願において、「呈色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である呈色、又はある波長（λex）での吸収とより高い波長（λem）での放出である蛍光をカバーするために使用される。
本発明の基質は、塩を形成してもよく、すなわち塩化物、臭化物またはトリフルオロ酢酸塩のような塩の形態でもよい。
【０００８】
「ニトロレダクターゼ」なる用語は、ＮＯ２基を完全にまたは部分的に還元することができる酵素を意味することを目的とする。
「アルキル基」なる用語は、飽和炭化水素ベースの基の鎖、特にＣ１-Ｃ６アルキル、すなわち１から６の炭素原子を含む直鎖または分枝状アルキルを意味することを目的とする。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル及びヘキシルを挙げることができる。
「アリール基」なる用語は、芳香環、例えばＣ６-Ｃ１０芳香環、特にフェニル、ベンジル、1-ナフチルまたは2-ナフチルに由来する官能基（または置換基）を意味することを目的とする。
「カルボキシル基」なる用語は、第１の酸素原子に二重結合により、及び第２の酸素原子（それ自体が負に荷電しているか、又は水素原子に結合している）に単結合により結合された炭素原子から成る官能基を意味することを目的とする。分子のｐＫａ及び培地のｐＨに応じて、カルボキシル基はイオン化型、すなわち第２の酸素原子に結合するＨを有さず、それにより負に帯電していてもよい。
【０００９】
「反応培地」なる用語は、代謝の発現のために及び／又は微生物、細胞、またはオルガネラの増殖のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、フローサイトメトリ、組織酵素学、細胞培養等や、あるいは微生物検出および／または同定培地として使用できる。
反応培地は、固体、半固体、又は液体でもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化された培地を意味することを目的とする。寒天は微生物を培養するための微生物学における通常のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することが可能である。一定数の調製物は、例えばコロンビア寒天、トリプケース−ソイ寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天、又はさらに一般的にいえば、微生物学培地ハンドブック（the Handbook of Microbiological Media：ＣＲＣ出版）に記載されているものは、市販されている。
反応培地は、例えばアミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ソーダ塩、金属塩のような一つ以上の成分を組合せて含んでもよい。
また、培地は着色剤を含んでもよい。例として、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等を挙げることができる。
反応培地は、検出および／または同定培地、すなわち発現用培地または培養且つ発現用培地であってもよい。第１の場合において、微生物は接種の前に培養され、第２の場合において、検出および／または同定培地は培養培地をも構成する。
【００１０】
「生物試料」なる用語は、生体液標本に由来する臨床試料、又は任意の種類の食品に由来する食品試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体又は固体でもよく、血液、血漿、尿または糞便、鼻、のど、皮膚、傷又は脳脊髄液から採取された試料に由来する臨床試料、水又例えば牛乳または果汁等の飲料由来の；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズまたはチーズ由来の；魚等に由来の食品試料、あるいは、特に動物の餌のような動物飼料に由来する食品試料を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、サンプルは、臨床環境からの標本、家畜標本、食品、化粧品または薬剤生産からの標本であってもよい。「環境標本」なる用語は、特に、表層から、液体から、出発原料からまたは製品から採取される標本を意味することを目的とする。
【００１１】
本発明の目的において、「微生物」なる用語はバクテリア、特にグラム陰性菌とグラム陽性菌、酵母、寄生生物、菌類、さらに一般的にいえば、通常は単細胞生物であって、肉眼では見えず、且つ実験室で増殖させ及び操作できる生物を含む。
グラム陰性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、霊菌属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、エーロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロホモナス属、キサントモナス属及びレジオネラ属。
グラム陽性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、乳酸桿菌属、リステリア属、クロストリジウム属、ガルドネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属（Falkamia）、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリア属及びコリネバクテリウム属。
酵母について、以下の属の酵母を挙げることができる：カンジダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００１２】
本発明は、下記の式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重（1,2-ジヒドロ）あるいはニ重でもよく、好ましくはニ重である。
もちろん、本発明に係る基質は、複数の置換基、すなわち環のさまざまな位置に複数のＲ１及びＲ２基を含んでもよい。Ｒ２がＯ-ＣＨ２-Ｏであるとき、Ｒ２は環員の２つが共有されているニトロフェニルに結合する環である。Ｒ１および／またはＲ２がアルキル基またはアリール基であるとき、ＯＨ、カルボキシル、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩのような一以上の置換基によって置換されてもよい。
ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＮＸ１と４位のＯに二重結合を介して結合するＣを含む。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＸはＳである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＯである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１-ＣＯである。
本発明のある好ましい実施形態によれば、Ｒ１は５位にある。
本発明のある好ましい実施形態によれば、Ｒ２は４’位にある。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は５’位にある。
本発明の他の好ましい実施例によれば、Ｒ２は４’位及び５’位にある。
【００１４】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり：
・Ｒ１とＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり、好ましくは５位であり；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣＨ３であり、好ましくは５位であり；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３であり、好ましくは４’位と５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３であり、好ましくは５’位である。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり、好ましくは３位である；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり、好ましくは４’位と５’位においてニトロフェノールに結合する。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位である。
【００１６】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
【００１７】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１及びＲ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｘ１はＨであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり、好ましくは５’位である。
【００１８】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３であり、好ましくは５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は
であり、好ましくは５’位である。
【００１９】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＮＯ２であり、好ましくは４’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無し。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦであり、好ましくは５’位であり；
・ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重である（1,2-ジヒドロ）。
【００２０】
好ましくは、本発明による基質は、表１に記載されている基質から選択される。
表１
表１のつづき
【００２１】
また、本発明は、上記の少なくとも一つの酵素基質を含む反応培地にも関する。
また、本発明は、上記の少なくとも一つの酵素基質を含む微生物検出および／または同定培地にも関する。好ましくは、上記基質は１と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度、好ましくは１０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記培地は、本発明に係る基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的である少なくとも一つの他の酵素基質を含む。
他の基質の酵素加水分解は検出可能なシグナルであって、本発明の基質により検出されるシグナルとは異なるシグナル、例えば異なる着色性あるいは蛍光性生成物を生じ、それにより一つ以上の微生物の検出および／または同定および／または定量のような実証を可能にする。他の特異的な基質について、微生物の検出において従来使用されている他の任意の基質を使用してもよい。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質について、容易にこのような濃度を決定することが可能である。例として、本発明に係る基質を、ペプチダーゼ、オシダーゼ、エステラーゼまたはレダクターゼ酵素基質と結合することは可能である。特に、本発明に係る基質を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコシドまたはアリザリン-β-ガラクトシドのようなオシダーゼ基質と、又は5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル・オクタノエートまたは5-ブロモ-3-インドキシル・ホスフェートのようなエステラーゼ基質と組合わせることが可能である。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記培地も、本発明に係る基質によって検出される酵素活性に特異的である、少なくとも一つの他を酵素基質を含む。
従って、基質の特定の選択に係わらず、同じ酵素活性を発現する微生物の群を同定することは可能である。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質について、容易にこのような濃度を決定することが可能である。特に、本発明に係るて基質を、出願WO00/28073に記載されているようなニトロクマリンに基づく蛍光発生基質と結合することが可能である。
【００２３】
また、本発明は、微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
また、本発明は少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、及び
ｄ）少なくとも１つのニトロレダクターゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
【００２４】
微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性及び検出される微生物に応じて、当業者は容易に選択することができる。工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ニトロレダクターゼ活性の存在を、単独で、または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
下記の実施例は、説明として示すものであり、事実上決して制限するものではない。それらは、より明らかに本発明を理解することを可能にする。
【００２５】
実施例
１−基質の合成
・「ＸはＳである」
基質２２：2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾチアゾール
１ｅｑの2-アミノフェノールとエタノールと１ｅｑの2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、油浴を用いて、温度１１０℃で１時間、還流した。 混合物は周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより中間生成物を得た。 上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１ｅｑの2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応はオーバーナイトで実行され、次に濾過後、生成物を最大で回収するために、それがＤＣＭに可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。生成物を得るために、溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００２６】
基質１５：2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾール
３．００ｇ（０．０２４モル）の2-アミノチオフェノールと４．０５ｇ（０．０２４モル）の5-ニトロ-3-フルオロベンズアルデヒドの混合物のエタノール（１５０ｍｌ）溶液を２時間、環流した。周囲温度に冷却後、溶液は減圧下で濃縮された。残った固体は水と酢酸エチルの混合物（５００ｍｌ）に希釈され、酢酸エチル（２×５０ｍｌ）を使用して更に２回抽出された。合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、エタノールから再結晶化して、粗生成物を得るために濃縮した。質量１．２８ｇのＯＦ５４Ａ２の微細な赤色の結晶が収率４７％で得られ、測定された融点は１５６−１５８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.87 (1H, t, J = 4 Hz, Ar-H), 6.89 (1H, s, Ar-H), 7.05 (1H, t, J = 4 Hz, Ar-H), 7.11 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.13 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.69 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H), 8.17 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H).
【００２７】
基質２３：2-（2'-ニトロ-5'-（N-メチルピペラジニル）フェニル）ベンゾチアゾール（ＯＦ８０Ａ）
０．３１ｇ（０．００３０モル）のN-メチルピペラジンを、０．４１ｇ（０．０１５モル）の2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾールと０．３２ｇ（０．００２３モル）のＫ２ＣＯ３の５ｍｌのジメチルスルホキシド溶液の混合物に加えられた。反応は磁気的に撹拌され、９０℃で加熱されて、その進行がＴＬＣによって確認された。
反応が完了した後（少なくとも８時間）、反応混合物は酢酸エチル（７７ｍｌ）に希釈され、このようにして得られた有機相は２×６５ｍｌの水で、次に６５ｍｌのブラインで洗われ、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより０．３６ｇの高度に静電気の橙黄色の固体（ＯＦ８０Ａ）を収率６８％で得た。カラムクロマトグラフィーによる精製は、必要に応じて実行され得る;これは今回は事実ではなかった。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 2.35 (3H, s, CH3), 2.45 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH2), 3.49 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH2), 6.85 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 6.90 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.41 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.43 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.05 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H).
LC-MS-DI m/z Found: 355.57 (C18H18N4O2S) (M+H): requires M. 354.43.
【００２８】
基質２１：2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
基質Ｎｏ．２１は、2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾチアゾール（基質Ｎｏ．１５）の合成と類似した方法で合成した。
【００２９】
・「ＸはＯである」
基質１−2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール
８．７３ｇ（０．０８００モル）の2-アミノフェノールと２０ｍｌのエタノールと１２．０９ｇ（０．０８００モル）の2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、温度１１０℃で１時間、油浴を用いて還流した。混合物は周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより１３．２５ｇの2-（2'-ニトロベンジリジンアミノ）フェノールを収率６９％で得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１２．４３ｇ（０．０５４７モル）の2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応をオーバーナイトで実施した。濾過後、生成物を最大で回収するために、それがＤＣＭに可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。 溶媒を減圧下で蒸発させ、それにより収率６４％でベージュ-茶色の固体の、８．３９ｇの2-(2-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾールを得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００３０】
基質２−2-（2'-ニトロフェニル）-5-クロロ・ベンゾオキサゾール ― VLS259
基質Ｎｏ．２は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成された。
【００３１】
基質６−2-（2'-ニトロ-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール−VLS261
１． 2-((3'-クロロ-6'-ニトロベンジリデン）アミノ）フェノール（VLS 263）の合成
２．１８ｇ（０．０２モル）の2-ヒドロキシアニリンと３．７３ｇ（０．０２モル）の2-ニトロ-5-クロロベンズアルデヒドのエタノール溶液の混合物を３−４時間、還流した。結果として生じた結晶性沈殿を集め、減圧下のデシケータにおいて乾燥した。質量１．９８ｇの微細なオレンジ色の結晶が収率８０％で得られ、測定された融点は１４４−１４６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(CDCl3) δ 6.95 (1H, t, J=8 Hz, Ph-H), 7.05 (1H, dd, J=8 Hz, J=1.2 Hz, Ph-H), 7.10 (1H, s (broad), OH), 7.28 (1H, t, J=8 Hz, Ph-H), 7.33 (1H, dd, J=8 Hz, J= 1.4 Hz, Ph-H), 7.60 (1H, dd, J=8.66 Hz, J=2.2 Hz, 4’H), 8.05 (1H, d, J=8.66 Hz, 5’H), 8.23 (1H, d, J=2.4 Hz, 2’H), 9.27 (1H, s, =CH-)
υmax cm-1 3442 (OH), 1558 (NO2), 1376 (NO2), 1521 (C=N), 1341 (OH), 1301 (OH), 1143 (C-N), 1176 (C-O), 1461 (Ar-H), 756 (C-Cl).
【００３２】
２． 2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾオキサゾール（VLS269）の合成
１．１４ ｇ（０．００５モル）の2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（ＤＤＱ）を、周囲温度でジクロロメタン中で撹拌された2- ((3' -クロロ-6'-ニトロベンジリデン）アミノ）フェノールに、５分間にわたって加えた。混合物は、２日間撹拌したままにし、濾過して、蒸発させ、それにより、生成物を得た。質量０．９７ｇの緑がかった褐色の粉末が収率７０％で得られ、測定された融点は１３０−１３２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C13H7ClN2O3 Calculated mass of molecular ion 274.0140 (M+H)+ Measured mass: 274.0141. 1H-NMR:(CDCl3) δ 7.40-7.45 (2H, m, Ph-H), 7.56-7.61 (1H, m, Ph-H), 7.65 (1H, dd, J=8.66 Hz, J=2.23 Hz, 4’H), 7.80-7.85 (1H, m, Ph-H), 7.87 (1H, d, J=8.66 Hz, 5’H), 8.16 (1H, d, J=2.23 Hz, 2’H). υmax cm-1 1534 (NO2), 1371 (NO2), 1572 (C=N), 1616 (C=N), 1182 (C-O), 1236 (C-O), 1153 (C-N), 1461 (Ar-H), 743 (C-Cl).
【００３３】
３． 2-(3',4'-ジメトキシ-6'-ベンジリデン）アミノ）フェノール（VLS 260）の合成
３．２７ｇ（０．０３モル）の2-ヒドロキシアニリンと６．３３ｇ（０．０３モル）の6-ニトロベラトルアルデヒドの混合物のエタノール溶液を３−４時間、還流した。結果として生じた結晶性沈殿を集めて、減圧下でデシケータにおいて乾燥した。質量８．２０ｇの微細なオレンジ色の結晶が収率９０％で得られ、測定された融点は１９６−１９８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(CDCl3) δ . 1H-NMR:(CDCl3) δ 4.00 (3H, s, CH3O), 6.92 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.01 (1H, dd, J=7 Hz, J=1.4 Hz, Ph-H), 7.12 (1H, s (broad), OH), 7.22 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.32 (1H, dd, J=7 Hz, J=1.4 Hz, Ph-H), 7.62 (1H, s, 5’H), 7.69 (1H, s, 3’H), 9.25 (1H, s, =CH-). υmax cm-1 3416 (OH), 1566 (NO2), 1384 (NO2), 1589 (C=N), 1344 (OH), 1317 (OH), 1181 (C-N), 1149 (C-O), 1461 (Ar-H), 2838 (OMe).
【００３４】
４． 2-（2' -ニトロ-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール（VLS 261）の合成
２．２７ｇ（０．０１モル）の2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（ＤＤＱ）を、周囲温度でジクロロメタン中で撹拌された３．０４ｇ（０．０１モル）の2- (3',4' -ジメトキシ-6'-ベンジリデン）アミノ）フェノールに、５分間にわたって加えた。
混合物は、２日間撹拌したままにし、濾過して、蒸発させ、それにより、生成物を得た。
質量２．７６ｇの橙褐色の粉末が収率９０％で得られ、測定された融点は１４８−１４６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C15H12N2O5 Calculated mass of molecular ion 301.0819 (M+H)+Measured mass: 301.0819. 1H-NMR:(CDCl3) δ 4.00 (6H, d, J=2.7 Hz, (OCH3)2), 7.37-7.41 (2H, m, Ph-H), 7.43 (1H, s, 5’H), 7.52 (1H, s, 2’H), 7.53-7.57 (1H, m, Ph-H), 7.78-7.82 (1H, m, Ph-H). υmax cm-1 1519 (NO2), 1378 (NO2), 1582 (C=N), 1189 (C-N), 1177 (C-O), 1448 (Ar-H), 2850 (OMe).
【００３５】
基質７−2-（2' -ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾオキサゾール−OF20B
１時間の温度１１０℃で、１０．９１ｇ（０．１００モル）の2-アミノフェノールと１６．９１ｇ（０．１００モル）の2-ニトロ-5-フルオロベンズアルデヒド混合物の２００ｍｌのエタノール溶液を油浴を用いて還流した。混合物を周囲温度に冷却し、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。固体を減圧下のデシケータにおいて乾燥し、それにより９３％の収率で２４．０９％のＯＦ２０Ａを得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に２１．０４ｇ（０．０９２７モル）の2,3-ジシアノ-5,6 ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けで加えた。反応をオーバーナイトで実施し、ろ過後、生成物の最大量を回収するために、それがＤＣＭにおいて可溶性であるので、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
溶媒は減圧下で蒸発させ、それにより６１％の収率で、１４．４９ｇのＯＦ２０Ｂのベージュ−茶色の固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ= 7.37 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.43 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.45 (1H, s, Ar-H), 7.59 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.82 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.96 (1H, dd, J = 9 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００３６】
基質３：2-（2'-ニトロフェニル）-5-メチルベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．３は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
基質４：2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．４は、2-（2' -ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
基質５：2-（2'-ニトロ-4',5'-ジメチレンジオキシフェニル）ベンゾオキサゾール
基質Ｎｏ．５は、2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．１）の合成に類似した方法で合成した。
【００３７】
基質８：2-（2'-ニトロ-5'-（N-メチルピペラジニル）フェニル）ベンゾオキサゾール（OF29A）
１．０１ｇ（０．０１０モル）のN-メチルピペラジンを、１．２９ｇ（０．００５モル）の2-（2'-ニトロ-5'-フルオロフェニル）ベンゾオキサゾールと１．０４ｇ（０．００７５モル）のＫ２ＣＯ３の混合物の９ｍｌのジメチルスルホキシド溶液に加えた。反応は磁気的に撹拌され、９０℃で加熱され、その進行がＴＬＣによって確認された。
反応が完了した後（少なくとも８時間）、反応混合物は酢酸エチル（７７ｍｌ）に希釈し、このようにして得られた有機相は２×６５ｍｌの水で、次に６５ｍｌのブラインで、慎重に洗浄され、硫酸ナトリウムを使用して乾燥させ、７３％の収率で、１．２３ｇの黄/金色の花弁のＯＦ２９Ａを得た。 カラムクロマトグラフィーによる精製は、必要に応じて実行され得る；これは今回は事実ではなかった。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): d = 2.35 (3H, s, CH3), 2.57 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH), 3.48 (2H, t, J = 7 Hz, CH2-CH), 6.95 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 6.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.28 (1H, s, Ar-H), 7.39 (1H, t, J = 9 Hz, Ar-H), 7.41 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.55 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 8.1 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m.p.: 122-126
LC-MS-DI m/z Found: 339.54 (C18H18N4O3) (M+H): requires M. 338.37.
【００３８】
・「ＸはＮＸ１-ＣＯである」
基質２０−2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワン1. 1,2-ジヒドロ-2（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（VLS 276）の合成
２．３１ｇ（０．０１７モル）の2-アミノベンザミドと３．１４ｇ（０．０１７モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドを、エタノール中で１時間、還流した。次に、混合物を冷却し、得られたオレンジ色の結晶はクリスタルは収集されて、減圧下のデシケータにおいて乾燥した。質量３．９７ｇの淡いオレンジ色の結晶が収率７６％で得られ、測定された融点は２３４−２３６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6’H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3’H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 304.0482
υmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl).
【００３９】
２． 2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（VLS 278）の酸化
質量９．１０ｇ（０．０３モル）の2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワンを４０ｍｌの無水アセトンに溶解し、４．７４ｇ（０．０３モル）の過マンガン酸カリウムの無水アセトン溶液によって処理した。この溶液は、周囲温度で２−３時間にわたって、混合物に滴下された。次に、反応はオーバーナイトで撹拌された。過剰なＫＭｎＯ４は、過剰の固体の亜硫酸水素ナトリウムを加えることによって除去された。次に、溶液をろ過し、蒸発させた。質量２．２６ｇのペールホワイト色の粉体が収率２５％で得られ、測定された融点は２７６−２７８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C14H8ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) δ 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3’H). υmax cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl).
【００４０】
基質１７−2-（2'-ニトロフェニル）-3-メチルキノキサゾル-4-ワン
１． 2-アミノ-N-メチルベンズアミド（VLS 291）の合成
１６．２０ｇ（０．０９９モル）の等張無水物に、ＣＯ２の放出を制御しながら、撹拌で、小分けにして、２５ｍｌの４０％メチルアミンを加えた。混合物は、周囲温度で１時間、保たれた。次に、混合物は、ＨＣｌの２Ｍ溶液によって中和し、ビュッヒ製の装置により減圧下で濾過し、水により数回を洗い、減圧下のデシケータを使用して乾燥した。質量１１．６１ｇの灰色の粉末を収率７８％で得た。
２． 2-（2' -ニトロ-5' -クロロフェニル）-3-メチルキノキサゾリン-4-ワンの合成（VLS 292）
質量７．５ｇ（０．０５モル）の2-アミノ-N-メチルベンズアミドと９．３０ｇ（０．０５モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドを、磁気的に撹拌して、２−３時間還流させた。このようにして得られたオレンジ色の結晶は、ビュッヒ製により減圧下で濾過して、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量１０．３８ｇの針状微細なオレンジ色の結晶を、収率６６％で得た。
３． ＶＬＳ ２９２の酸化（ＶＬＳ ２９５ｂ）
質量３．１７ｇ（０．０１モル）のＶＬＳ ２９２ｂを無水アセトンに溶解した。ＫＭｎＯ４の６．３２ｇ（０．０４モル）を無水アセトンに溶解し、前記の混合物に１〜２時間にわたって、滴下した。次に、反応をオーバーナイトで撹拌した。次に、混合物をメタ重亜硫酸ナトリウムにより中和し、濾過し、蒸発させ、それにより過剰なアセトンを除去した。質量の２．６０ｇの白色粉体は、収率８０％で得た。
【００４１】
・「ＸはＮＸ１である」
基質１４−2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール）
１． N-フェニルエチル-2-ニトロアニリン（VLS 209）
質量４．８ｇ（０．０４モル）の2-フェニルエチルアミンを、周囲温度で、５．６ｇ（０．０４モル）の2-フルオロニトロベンゼンと１１．０６ｇ（０．０８モル）の無水炭酸カリウムの３０ｍｌのＤＭＳＯ溶液の混合物に滴下された。混合物を、１００℃で３時間、加熱した。次に、混合物を周囲温度に冷却し、１００ｍｌの水を加え、ライトオレンジ色の化合物の沈殿物を生じた。固体を濾過により回収し、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。９．４ｇのオレンジ色の結晶を収率９８％で得た。求められた融点は、理論上の値、すなわち６４−６６℃と合致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 6.65 (1H, m, Ph-H), δ 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), δ 8.10 (1H, s(broad), NH), δ 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
【００４２】
２． N-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼン（VLS 210）
周囲温度の窒素下、磁気的に撹拌しながら、水素化ホウ素ナトリウムの０．３８ｇ（０．０１モル）の溶液は、エタノールの銅のアセチルアセトネートの０．５２ｇ（０．００２モル）の懸濁液に加えられた。この溶液に、ＶＬＳ ２０９の２．４２ｇ（０．０１モル）のニトロ化合物のエタノール溶液を、続いて０．７６ｇ（０．０２モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を加えた。混合物は、周囲温度で窒素下、オーバーナイトで撹拌した。次に、混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮し、水は加えた。つぎに、抽出を２×２０ｍｌのＤＣＭによって実行し、有機相を水で数回洗い、炭酸カリウムを使用して乾燥させて、回転蒸発装置で濃縮した。質量１．６９ｇの黒っぽい油性液体で、続いて凝固したものを収率８０％で得た。求められた融点は、理論上の値、すなわち４２−４４℃と合致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.27 (2H, s (broad), NH2), δ 3.38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.69 (3H, m, Ph-H), δ 6.82 (1H, m, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H).
【００４３】
３． 2-（2' -ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3 -フェネチルベンズイミダゾール（VLS 213）（または2-（2' -ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェネチルベンズイミダゾール）
８．６０ｇ（０．０１４モル）のオキソン（モノ過硫酸カリウム）を、５．０８ｇ（０．０２４モル）のN-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼンと４．８ｇ（０．０２４モル）の6-ニトロピペロナールの２５ｍｌＤＭＦ溶液と１ｍｌの水溶液に、周囲温度で１５分間にわたって磁気的に撹拌しながら加えた。反応が発熱性だったので、混合物を水槽で冷却し、オーバーナイトで撹拌しておいた。次に水を混合物に加え、ＤＣＭで２回連続した抽出を実行した。混合した有機相を複数回水によって洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、それにより黄／茶色の粗生成物を得た。エタノールによる再結晶化を、化合物を精製するために実行した。質量６．１９ｇの茶色の結晶を収率６７％で得て、測定された融点は１６２−１６４℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H17N3O4 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 4.20 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 6.02 (1H, s, Ph-H), δ 6.18 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.48 (1H, m, Ph-H), δ 7.65 (1H, s, Ph-H), δ 7.80 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2).
基質１２−2-（2'-ニトロフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール ― ５４
基質Ｎｏ．１２を、2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成した（基質Ｎｏ．１４）。
【００４４】
２−ニトロレダクターゼ活性を検出するための本発明に係る基質の使用（基質Ｎｏ．１;２; ３; ４; ５; ６; ７; ８; １５; １２; ２１; ２３）
ａ）培地の調製
質量４０ｍｇの各基質を、４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。この溶液は、前もってオートクレーブされた４００ｍｌのコロンビア寒天に完全に混ぜて、５０℃に溶解して保った。各基質の最終濃度は、１００ｍｇ／ｌであった。各々の培地を、９０ｍｍシャーレに、シャーレつき２０ｍｌの割合で分配した。
ｂ）接種とインキュベーション
コレクションに由来する、バクテリアと酵母のさまざまな種類に属する１８の微生物菌株は、１０μｌの１／２０に希釈された０．５マクファーランドの懸濁液の半定量的隔離によって、これらの培地に接種された。培地は３７℃で２４時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは３６０−３６５ｎｍのＵＶ照射下で視覚的に調べられた。
ｃ）結果の記録
得られた結果を表２から５に示す。
【００４５】
表２
表２のつづき
【００４６】
表３
【００４７】
表４
【００４８】
表５
【００４９】
7-ニトロクマリン（ＡＭＣ）（例えば7-ニトロクマリン-3-カルボン酸）に基づく基質で観察されることとは反対に、試験された本発明に係る全ての基質では、蛍光はコロニーのみに、又はすぐ近辺に局在化していた。 これらの結果は、基質Ｎｏ．２、３、４、６、７、８、１５及び２１が、特にＭＲＳＡ菌株（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）を、大部分の他のグラム陽性菌から、区別するかまたは同定することを可能にすることを示す。
この種の医学的な重要性により、これは、臨床検査標本だけでなくの食品標本の黄色ブドウ球菌（S.アウレウス）の迅速且つ特異的な検出に、非常に役立ち得る。
【００５０】
さらに、芳香環における置換基に応じて、グラム陰性菌に関する本発明に係る基質の特異性は、可変的である。例えば、基質２、７及び１５は、アシネトバクター・バウマニーからシュードモナス・アエルギノーサ（緑濃菌）を区別できる；サルモネラ・チフィムリウム（ネズミチフス菌）は基質７及び１５では強く陽性であり、基質２、６及び１２では陰性である。基質１２は、モルガネラ・モルガニーに特異的である。
【００５１】
ｄ）結論
本発明に係る基質は、微生物学のための反応培地に使用することができる。これらの培地は、医学的、工業的、環境的に興味のある微生物の検出、計数および／または同定に非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；ＯまたはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を有するアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり、；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣＨ３であり、；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項４】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌである
酵素基質。
【請求項５】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３である
酵素基質。
【請求項６】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦである
酵素基質。
【請求項７】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３である
酵素基質。
【請求項８】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項９】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌである
酵素基質。
【請求項１０】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏである
酵素基質。
【請求項１１】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項１２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦである
酵素基質。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、反応培地。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、微生物検出および／または同定培地。
【請求項１５】
請求項１４に記載の検出培地であって、更に請求項１から１２の何れか一項に記載の基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１６】
請求項１４に記載の検出培地であって、更に請求項１から１２の何れか一項に記載の基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１７】
微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出するための、請求項１から１２の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項１４から１６の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１８】
微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１４から１６の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのニトロレダクターゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；ＯまたはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、ＣＨ３、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはアルキル、アリールまたはカルボキシルから選択される置換基であり;
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ、Ｏ-ＣＨ２-Ｏ、Ｏ-ＣＨ３、Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、カルボキシル、ＮＯ２および
から選択される置換基であり；
・Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は１から４の炭素原子を有するアルキル基であり；
・Ｘ１はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル及びアリールから選択される］
の、ニトロレダクターゼ活性を検出するための酵素基質。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり、；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣＨ３であり、；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項４】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌである
酵素基質。
【請求項５】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３である
酵素基質。
【請求項６】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦである
酵素基質。
【請求項７】
請求項１に記載の酵素基質あって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はジエチレンジアミン-ＣＨ３である
酵素基質。
【請求項８】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項９】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌである
酵素基質。
【請求項１０】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣＨ３であり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏである
酵素基質。
【請求項１１】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＮＸ１であり；
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２は無しである
酵素基質。
【請求項１２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり；
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＦである
酵素基質。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、反応培地。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、微生物検出および／または同定培地。
【請求項１５】
請求項１４に記載の検出培地であって、更に請求項１から１２の何れか一項に記載の基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１６】
請求項１４に記載の検出培地であって、更に請求項１から１２の何れか一項に記載の基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１７】
微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出するための、請求項１から１２の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項１４から１６の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１８】
微生物の少なくとも一つのニトロレダクターゼ活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１４から１６の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのニトロレダクターゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【公表番号】特表２０１０−５２７６２６（Ｐ２０１０−５２７６２６Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９８７４（Ｐ２０１０−５０９８７４）
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０９３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３０５
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０９３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３０５
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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