新規ヤロウィア属酵母及び排水の生物学的処理方法
【課題】 食品等の製造設備は定置洗浄のために酸性洗浄剤や塩基性洗浄剤等を用いることによる低ｐＨ（ペーハー）から高ｐＨの排水になやまされ、油脂を高率に除去すると共にｐＨの変動に強く、種々の細菌と共生できる酵母類が望まれている。また、化学物質などを使用しない環境に優しい排水の生物処理方法が求められており、これらに対する改善効果を有して満足できる酵母を提供し、この培養酵母を用いて排水中の油脂含有量を減じる生物処理方法を提供することにある。
【解決手段】 バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母を提供し、該酵母を含油脂排水に投入することにより油脂を低減させることを特徴とする排水の生物学的処理方法を提供することにある。
【解決手段】 バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母を提供し、該酵母を含油脂排水に投入することにより油脂を低減させることを特徴とする排水の生物学的処理方法を提供することにある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤロウィア属に属する新規な酵母及び排水の生物学的処理に関し、更に詳細には、バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で高率に動植物油脂を資化する性質を有する新規ヤロウィア属酵母及び該培養酵母を投入することにより、排水中の油脂を低減する排水の生物学的処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の食品製造工場やレストランの排水中には油脂を多く含むことが知られている。例えば、アイスクリームや生クリームを製造している乳製品工場の排水中には乳脂肪の含有量が多く、大豆等の食品加工工場では植物油脂、レストランの排水には植物油脂や動物油脂が多く含まれている。油脂含有量が多い排水は微生物処理することが困難となり、物理的、化学的に油脂を排水中から除去することが必要となり、即ち、かかる油脂含有排水の処理方法としては、ｎ−ヘキサン抽出物質として２００〜５００ｍｇ／Ｌまでは、油脂分離槽を設置して処理し、５００ｍｇ／Ｌを超える場合は加圧浮上分離槽を設置して油脂等を除去し、ｎ−ヘキサン抽出物を低下させることが望まれている。これらを公共水域に放流する場合、その後に活性汚泥処理、接触酸化処理などの処理を施し、油脂含有量を規制値以下に減じることが必要である。この結果、排水処理工程自体が複雑化し、設備費も増加することで油脂を多量に含む排水に苦慮していた。
【０００３】
そこで、種々の油脂分解資化性酵母を用いて動植物性油脂を資化分解させる方法（特許文献１、２参照）が提案されている。また、油脂資化性酵母を接触材に固定又は付着化し、油脂を含有する排水を生物学的に処理する方法（特許文献３参照）が知られている。
【特許文献１】特許番号第２９５１６８３号
【特許文献２】特許番号第２８１３２６５号
【特許文献３】特開平５−２２０４９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、各製造会社、各種事業所、家庭から排出される広範囲のｐＨ域に於いて含油脂排水中の油脂を低減したいという技術分野において、排水中の油脂を資化するには酵母が有効であることが研究されているが、従来技術では酵母処理槽や接触材に酵母を付着させなるなど特別な設備や器材を要し、またバクテリヤが混入すると活性が落ちたりするため、酵母単独又は酵母どうしが生育する至適生育環境にするための酸性化剤又は塩基性化剤や塩素剤の薬剤を排水中に添加して調整することで、設備の劣化を促進していることが大きな問題となっている。食品等の製造設備は定置洗浄のために酸性洗浄剤や塩基性洗浄剤等を用いることによる低ｐＨ（ペーハー）から高ｐＨの排水になやまされ、油脂を高率に除去すると共にｐＨの変動に強く、種々の細菌と共生できる酵母類が望まれている。また、化学物質などを使用しない環境に優しい排水の生物処理方法が求められており、これらに対する改善効果を有して満足できるような酵母を提供し、この培養酵母を用いて排水中の油脂を低減する生物処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記のような設備の劣化を促進しないと共に環境に優しい処理を可能にする広範囲のｐＨの条件下で油脂を資化する生物処理に着目し、研究を行なった結果、酵母中には特異的にバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の排水で動植物油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母が存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明は、バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母を提供し、該酵母を含油脂排水に投与し油脂を減少させることを特徴とする排水の生物学的処理方法を提供するものである。
【０００７】
強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母は、排水中あるいは土壌中から、例えば、以下に示すスクリーニング法により分離・採取することが出来る。ヤロウィア属に属する酵母は石油を資化して、タンパク質を利用できることが研究されており、幅広い排水の浄化に利用できると共に酵母を飼料として利用できる利点がある。なお、本明細書において、油脂の資化又は油脂を低減するとはｎ−ヘキサン抽出物を減ずることを言う。また、共生とは他のバクテリヤが存在しても１×１０６個／ｍｌ以上の該酵母数が存在することを言い、強酸性とはｐＨ３以下、強塩基性とはｐＨ１０以上を示すことを言い、油脂を高率に資化するとは１リットル中にある約１，０００ｍｇの油脂を９０％以上減少させることを言う。
【０００８】
当該酵母のスクリーニング法としては、酵母は一般的に中性から酸性を好むのであがｐＨを９〜１０に調整して塩基性に生育できるものを選別し、加えてバクテリヤと共生することができる酵母を選別するために抗バクテリヤ剤は一次培養では使用せず、純粋分離時のプレートに使用することが特徴である。例えば食品製造会社から出ている排水や土壌から酵母を分離するのであるが、まず、油脂を資化する酵母をスクリーニングする培養液を作成するが、イオン交換水に硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸水素ニカリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、炭酸カルシウム５．０ｇを溶解し１リットルとし１２１℃２０分間滅菌し、これに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液を坂口フラスコに入れ、適温にて振とう培養する。上記培養液を一白金耳とり、抗生物質を適量加えたサブロー培地に画線して培養する。出現したコロニーをとり、ｐＨ３〜４に調整した前記培養液を用い再度培養し、その培養液を一白金耳とり、分離培養することでバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母を得る。ここからヤロウィア属酵母を選出するにはＤＮＡ分析にて行なえばよい。
【０００９】
本処理法は一般的な活性汚泥法を適用することが出来る。まず、排水は調整槽へ導き、ここで活性汚泥微生物の生育に適するようにｐＨの調整をしたり、栄養源濃度の調整を行い、調整の済んだ排水は曝気槽に送り、酸素を充分に送り込んで汚泥微生物を活動させ有機物を分解させ、処理液を沈殿槽にためて汚泥を沈降させ、上澄液を分離し放水する。沈殿分離した汚泥の一部は、曝気槽に送り返送汚泥として再度利用する。この工程の中でヤロウィア属酵母を投入する場所は、調整槽及び曝気槽が適切である。また、接触曝気法であれば、同様に調整槽及び接触曝気槽が適切である。なお、ヤロウィア属酵母を使用する場合は、調整槽のｐＨの調整は１．８〜１０．０以内であれば必要ない。
【００１０】
次に上記スクリーニング法より選抜した一代表例としてヤロウィアＹＨ−０１（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．ＹＨ−０１）酵母の菌学的性質を示す。
【００１１】
ＤＮＡ解析
ＹＭ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）平板培地で２５℃で１週間培養した検体からゲノムＤＮＡを抽出（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０とＦａｓｔ ＤＮＡ Ｋｉｔを使用）し、類似の塩基配列を国際ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）から検索するため、ＢＬＡＳＴによる相同性検索をおこなった。その結果、ＤＮＡ分析（２８ Ｓｒ ＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２）においては、ヤロウィアＹＨ−０１の塩基配列が子嚢菌酵母（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｙｅａｓｔｓ）の一種であるヤロウィア属リポリティカ種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の塩基配列と９９．６〜１００％の相同率を示し、同種と推定された。
【００１２】
培養性状及び形態学的特長
ＹＭ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）平板培地に接種し、２５℃１週間から１ヶ月間培養し、コロニー性状の観察は肉眼及び実体顕微鏡にて行った。微視的特長の観察項目はＢａｒｎｅｔｔ等（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎとＦｅｌｌ（１９９８）に準拠した。
（１）湿性で白色コロニー
（２）卵形から楕円形の栄養細胞（３〜５μ×２〜３．５μ）
（３）両極又は多極出芽
（４）仮性菌糸（偽菌糸および真菌糸）の形成は認められず。
（５）有性生殖器官である子のうの形成は認められず。
【００１３】
生化学性状試験
Ｂａｒｎｅｔｔ等（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎとＦｅｌｌ（１９９８）に準拠して炭素源資化性試験、窒素源資化性試験、糖類発酵性試験、ビタミン要求性試験、温度耐性試験、薬剤耐性試験を行ない、加えてｐＨ耐性試験及び油脂資化試験についての生化学性状試験を行った結果を表１から表５に示した。表中の「＋」は反応が陽性、「−」は反応が陰性、「ｗ」は弱い陽性反応を呈することを示す。温度耐性試験以外の培養温度は２５℃にて行った。尚、ヤロウィアＹＨ−０１をＹＨ−０１、ヤロウィア・リポリティカをＹ．１と記載する。
【００１４】
本発明者らが、排水より新たに分離した酵母のＤＮＡ分析（２８ Ｓｒ ＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２）においてはヤロウィアＹＨ−０１の塩基配列がヤロウィア・リポリティカの塩基配列と９９．６〜１００％の相同率を示し、同種と推定された。ヤロウィア属は一属一種であるので、Ｂａｒｎｅｔｔ等（２０００）のデータから抜粋し、ヤロウィア・リポリティカと比較した。形態学的及び培養性状的特長では、仮性菌糸（偽菌糸及び真菌糸）の形成及び有性生殖器官である子のう形成は認められなかった。また、Ｂａｒｎｅｔｔ等（２００１年）に記載されているヤロウィア・リポリティカと生化学性状を比較して表１〜表４に示したが、両者はグルコースを炭素源として資化するが、グルコースの発酵はしないなど、いくつかの項目において一致したが、窒素源の資化性、温度耐性、薬剤耐性などのかなりの項目においてヤロウィア・リポリティカと異なることが示された。
【００１５】
これらの点を考慮すると菌学的性質の比較において、ヤロウィアＹＨ−０１がヤロウィア・リポリティカであると同定することはできず、新種若しくは亜種であるとした。また、表５に示したように本酵母は強酸性から強塩基性条件下で生育して培養液中の油脂を資化し、ｎ−ヘキサン抽出物質の低減化に優れた有用性を示した。本真菌の分類学的位置はＫｉｒｋ等（２００１年）に基づけば、子嚢菌門、子嚢菌網、サッカロミケス亜網、サッカロケミス目、ジポドアスクス科、ヤロウィア属の新種若しくは亜種で新規な微生物として、本酵母は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１６年７月６日に寄託し、受領番号「ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１１４」として保管されている。
【００１６】
また、本発明に係る新規ヤロウィア属酵母を用いた排水の生物学的処理方法において、ヤロウィアＹＨ−０１を投入することが好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属酵母は、含油脂排水に投入することによりバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性のｐＨ条件下で油脂を低減化する卓越した効果を奏するものである。従って、食品製造工場の排水においては使用微生物の至適ｐＨに排水を調整するための酸、塩基性化剤やバクテリヤを抑制するための塩素剤の添加を必要とせず、これらの薬剤による設備の劣化の問題を解決し、化学物質を使用しない安全な含油脂排水の生物処理方法として油脂減量化処理のために広く環境改善に重要な役割を果たすものであり、酵母培養槽を新設することなく既設の調整槽、活性汚泥槽あるいは接触酸化槽に直接添加することができる。また、強酸性から強塩基性で生育可能であることから、この菌から抽出される酵素は広範囲のｐＨ条件下で活性を持つことが期待され、排水処理以外にも幅広い応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に実施例により本発明を説明するが、培養酵母を使用した試験例を示したが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、以下の実施例における部及び％は特に限定しない限り重量基準である。
【酵母選抜例】
【００１９】
強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母を選抜するには、イオン交換水に硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸水素ニカリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、炭酸カルシウム５．０ｇを溶解し１リットルとして（培養液Ａ）、１２１℃２０分間滅菌し、これに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液を苛性ソーダ液にてｐＨ１０に調整し、坂口フラスコにて２７℃で５日間振とう培養する。上記培養液を一白金耳とり、クロラムフェニコール（７５ｍｇ／Ｌ）及びサイクロヘキサマイド（５０ｍｇ／Ｌ）を加えたサブロー培地（栄研化学）に画線して２７℃で３〜５日間培養する。出現したコロニーをとり、前記培養液を塩酸でｐＨ３に調整し、同様に培養してその培養液を一白金耳とり、サブロー培地に画線して２７℃で３〜５日間培養し、出現したコロニーを滅菌生理食塩水にて分散して再度サブロー培地に画線培養することで、強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母としてスクリーニングした。本発明者が約２００種の排水及び土壌より選抜した結果、乳脂肪及び大豆脂肪を９０％以上資化する酵母を選抜し、この中からヤロウィア属酵母を３株取得し、これらの酵母名はＹＨ−０１、ＹＨ−０２、ＹＨ−０３とした。
【培養酵母製造例】
【００２０】
Ｙ．Ｍ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ ＹＭ Ａｇｅｒ）に生育させた保存酵母ヤロウィアＹＨ−０１を無菌的に取り、滅菌した培養液Ａに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液に植菌し、２７℃で４８〜７２時間通気攪拌培養した。このようにして得られた培養液をヤロウィアＹＨ−０１の培養酵母とし、又これを定法に従い凍結乾燥して凍結乾燥酵母とした。この培養酵母に含まれる菌数は１０７〜１０８個／ｍｌであり、凍結乾燥酵母に含まれる菌数は１０８〜１０９個／ｇであった。
【実施例１】
【００２１】
滅菌した培養液Ａに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加し、塩酸及び苛性ソーダ液でｐＨを２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０に調整し、あらかじめ製造例と同様に培養したヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．３×１０７／ｍｌ）を３％添加して２７℃で５日間培養した。その結果を表６に示したが、酸性域、中性域、アルカリ性域で乳脂肪及び大豆油を高率に資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２２】
バクテリヤが共存する酸性排水モデルとして、滅菌した培養液Ａを作成し、これに生きた乳酸菌が存在する市販の発酵乳で乳脂肪含有量を１，０００ｍｇ／Ｌ含むように加え、この試験液（乳酸菌数；２．４×１０６／ｍｌ）をｐＨ５．０に調整して、あらかじめ製造例と同様に培養しておいたヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．６×１０７／ｍｌ）を３％接種して２７℃で５日間培養した。この結果を表７に示したが、乳酸菌の存在下でも充分に油脂を資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。また、ヤロウィアＹＨ−０１の５日目の菌数は６．６×１０７／ｍｌ個であり、酸性条件での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。
【実施例３】
【００２３】
バクテリヤが存在する塩基性排水モデルとして、実施例２と同様な滅菌した培養液Ａを作成し、これに豆乳油脂含有量を１，０００ｍｇ／Ｌ含むように滅菌の市販豆乳を加え、培養液をｐＨ９．０に調整して、バチルス・サブチリスを加えた試験液（サブチルス菌数；５．３×１０５／ｍｌ）にあらかじめ製造例と同様に培養しておいたヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．６×１０７／ｍｌ）を３％接種し２７℃で５日間培養した。表８に結果を示したが、塩基性において他の細菌が存在しても大豆油脂を充分に資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。また、ヤロウィアＹＨ−０１の５日目の菌数は５．４×１０７／ｍｌ個であり、塩基性条件での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。
【実施例４】
【００２４】
牛乳製造工場の排水の調整槽からｎ−ヘキサン（１，１００ｍｇ／Ｌ）、ＢＯＤ（８５０ｍｇ／Ｌ）、ｐＨ８．３の排水を採取し、あらかじめ製造例と同様に作成した凍結乾燥粉末のヤロウィアＹＨ−０１（６．６×１０８／ｇ）を０．３％接種した例を示す。ここでは、一般的な活性汚泥法の調整槽及び活性汚泥槽にヤロウィアＹＨ−０１を添加したモデルとして、２７℃３日間通気攪拌培養した結果を示す。表９に示したように種々の菌が存在している排水モデルで、３日目の排水中のｎ−ヘキサン減少率は９０％以上の油脂分を減少させ、ヤロウィアＹＨ−０１の３日目の菌数は５．２×１０７／ｍｌ個であり、実排水での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。また、上記排水を９５℃にて殺菌・冷却後、同様にヤロウィアＹＨ−０１の凍結乾燥粉末を０．３％加えて同様に培養した結果、大きな差は認められなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤロウィア属に属する新規な酵母及び排水の生物学的処理に関し、更に詳細には、バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で高率に動植物油脂を資化する性質を有する新規ヤロウィア属酵母及び該培養酵母を投入することにより、排水中の油脂を低減する排水の生物学的処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の食品製造工場やレストランの排水中には油脂を多く含むことが知られている。例えば、アイスクリームや生クリームを製造している乳製品工場の排水中には乳脂肪の含有量が多く、大豆等の食品加工工場では植物油脂、レストランの排水には植物油脂や動物油脂が多く含まれている。油脂含有量が多い排水は微生物処理することが困難となり、物理的、化学的に油脂を排水中から除去することが必要となり、即ち、かかる油脂含有排水の処理方法としては、ｎ−ヘキサン抽出物質として２００〜５００ｍｇ／Ｌまでは、油脂分離槽を設置して処理し、５００ｍｇ／Ｌを超える場合は加圧浮上分離槽を設置して油脂等を除去し、ｎ−ヘキサン抽出物を低下させることが望まれている。これらを公共水域に放流する場合、その後に活性汚泥処理、接触酸化処理などの処理を施し、油脂含有量を規制値以下に減じることが必要である。この結果、排水処理工程自体が複雑化し、設備費も増加することで油脂を多量に含む排水に苦慮していた。
【０００３】
そこで、種々の油脂分解資化性酵母を用いて動植物性油脂を資化分解させる方法（特許文献１、２参照）が提案されている。また、油脂資化性酵母を接触材に固定又は付着化し、油脂を含有する排水を生物学的に処理する方法（特許文献３参照）が知られている。
【特許文献１】特許番号第２９５１６８３号
【特許文献２】特許番号第２８１３２６５号
【特許文献３】特開平５−２２０４９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、各製造会社、各種事業所、家庭から排出される広範囲のｐＨ域に於いて含油脂排水中の油脂を低減したいという技術分野において、排水中の油脂を資化するには酵母が有効であることが研究されているが、従来技術では酵母処理槽や接触材に酵母を付着させなるなど特別な設備や器材を要し、またバクテリヤが混入すると活性が落ちたりするため、酵母単独又は酵母どうしが生育する至適生育環境にするための酸性化剤又は塩基性化剤や塩素剤の薬剤を排水中に添加して調整することで、設備の劣化を促進していることが大きな問題となっている。食品等の製造設備は定置洗浄のために酸性洗浄剤や塩基性洗浄剤等を用いることによる低ｐＨ（ペーハー）から高ｐＨの排水になやまされ、油脂を高率に除去すると共にｐＨの変動に強く、種々の細菌と共生できる酵母類が望まれている。また、化学物質などを使用しない環境に優しい排水の生物処理方法が求められており、これらに対する改善効果を有して満足できるような酵母を提供し、この培養酵母を用いて排水中の油脂を低減する生物処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記のような設備の劣化を促進しないと共に環境に優しい処理を可能にする広範囲のｐＨの条件下で油脂を資化する生物処理に着目し、研究を行なった結果、酵母中には特異的にバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の排水で動植物油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母が存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明は、バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母を提供し、該酵母を含油脂排水に投与し油脂を減少させることを特徴とする排水の生物学的処理方法を提供するものである。
【０００７】
強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母は、排水中あるいは土壌中から、例えば、以下に示すスクリーニング法により分離・採取することが出来る。ヤロウィア属に属する酵母は石油を資化して、タンパク質を利用できることが研究されており、幅広い排水の浄化に利用できると共に酵母を飼料として利用できる利点がある。なお、本明細書において、油脂の資化又は油脂を低減するとはｎ−ヘキサン抽出物を減ずることを言う。また、共生とは他のバクテリヤが存在しても１×１０６個／ｍｌ以上の該酵母数が存在することを言い、強酸性とはｐＨ３以下、強塩基性とはｐＨ１０以上を示すことを言い、油脂を高率に資化するとは１リットル中にある約１，０００ｍｇの油脂を９０％以上減少させることを言う。
【０００８】
当該酵母のスクリーニング法としては、酵母は一般的に中性から酸性を好むのであがｐＨを９〜１０に調整して塩基性に生育できるものを選別し、加えてバクテリヤと共生することができる酵母を選別するために抗バクテリヤ剤は一次培養では使用せず、純粋分離時のプレートに使用することが特徴である。例えば食品製造会社から出ている排水や土壌から酵母を分離するのであるが、まず、油脂を資化する酵母をスクリーニングする培養液を作成するが、イオン交換水に硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸水素ニカリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、炭酸カルシウム５．０ｇを溶解し１リットルとし１２１℃２０分間滅菌し、これに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液を坂口フラスコに入れ、適温にて振とう培養する。上記培養液を一白金耳とり、抗生物質を適量加えたサブロー培地に画線して培養する。出現したコロニーをとり、ｐＨ３〜４に調整した前記培養液を用い再度培養し、その培養液を一白金耳とり、分離培養することでバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母を得る。ここからヤロウィア属酵母を選出するにはＤＮＡ分析にて行なえばよい。
【０００９】
本処理法は一般的な活性汚泥法を適用することが出来る。まず、排水は調整槽へ導き、ここで活性汚泥微生物の生育に適するようにｐＨの調整をしたり、栄養源濃度の調整を行い、調整の済んだ排水は曝気槽に送り、酸素を充分に送り込んで汚泥微生物を活動させ有機物を分解させ、処理液を沈殿槽にためて汚泥を沈降させ、上澄液を分離し放水する。沈殿分離した汚泥の一部は、曝気槽に送り返送汚泥として再度利用する。この工程の中でヤロウィア属酵母を投入する場所は、調整槽及び曝気槽が適切である。また、接触曝気法であれば、同様に調整槽及び接触曝気槽が適切である。なお、ヤロウィア属酵母を使用する場合は、調整槽のｐＨの調整は１．８〜１０．０以内であれば必要ない。
【００１０】
次に上記スクリーニング法より選抜した一代表例としてヤロウィアＹＨ−０１（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．ＹＨ−０１）酵母の菌学的性質を示す。
【００１１】
ＤＮＡ解析
ＹＭ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）平板培地で２５℃で１週間培養した検体からゲノムＤＮＡを抽出（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０とＦａｓｔ ＤＮＡ Ｋｉｔを使用）し、類似の塩基配列を国際ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）から検索するため、ＢＬＡＳＴによる相同性検索をおこなった。その結果、ＤＮＡ分析（２８ Ｓｒ ＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２）においては、ヤロウィアＹＨ−０１の塩基配列が子嚢菌酵母（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｙｅａｓｔｓ）の一種であるヤロウィア属リポリティカ種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の塩基配列と９９．６〜１００％の相同率を示し、同種と推定された。
【００１２】
培養性状及び形態学的特長
ＹＭ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）平板培地に接種し、２５℃１週間から１ヶ月間培養し、コロニー性状の観察は肉眼及び実体顕微鏡にて行った。微視的特長の観察項目はＢａｒｎｅｔｔ等（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎとＦｅｌｌ（１９９８）に準拠した。
（１）湿性で白色コロニー
（２）卵形から楕円形の栄養細胞（３〜５μ×２〜３．５μ）
（３）両極又は多極出芽
（４）仮性菌糸（偽菌糸および真菌糸）の形成は認められず。
（５）有性生殖器官である子のうの形成は認められず。
【００１３】
生化学性状試験
Ｂａｒｎｅｔｔ等（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎとＦｅｌｌ（１９９８）に準拠して炭素源資化性試験、窒素源資化性試験、糖類発酵性試験、ビタミン要求性試験、温度耐性試験、薬剤耐性試験を行ない、加えてｐＨ耐性試験及び油脂資化試験についての生化学性状試験を行った結果を表１から表５に示した。表中の「＋」は反応が陽性、「−」は反応が陰性、「ｗ」は弱い陽性反応を呈することを示す。温度耐性試験以外の培養温度は２５℃にて行った。尚、ヤロウィアＹＨ−０１をＹＨ−０１、ヤロウィア・リポリティカをＹ．１と記載する。
【００１４】
本発明者らが、排水より新たに分離した酵母のＤＮＡ分析（２８ Ｓｒ ＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２）においてはヤロウィアＹＨ−０１の塩基配列がヤロウィア・リポリティカの塩基配列と９９．６〜１００％の相同率を示し、同種と推定された。ヤロウィア属は一属一種であるので、Ｂａｒｎｅｔｔ等（２０００）のデータから抜粋し、ヤロウィア・リポリティカと比較した。形態学的及び培養性状的特長では、仮性菌糸（偽菌糸及び真菌糸）の形成及び有性生殖器官である子のう形成は認められなかった。また、Ｂａｒｎｅｔｔ等（２００１年）に記載されているヤロウィア・リポリティカと生化学性状を比較して表１〜表４に示したが、両者はグルコースを炭素源として資化するが、グルコースの発酵はしないなど、いくつかの項目において一致したが、窒素源の資化性、温度耐性、薬剤耐性などのかなりの項目においてヤロウィア・リポリティカと異なることが示された。
【００１５】
これらの点を考慮すると菌学的性質の比較において、ヤロウィアＹＨ−０１がヤロウィア・リポリティカであると同定することはできず、新種若しくは亜種であるとした。また、表５に示したように本酵母は強酸性から強塩基性条件下で生育して培養液中の油脂を資化し、ｎ−ヘキサン抽出物質の低減化に優れた有用性を示した。本真菌の分類学的位置はＫｉｒｋ等（２００１年）に基づけば、子嚢菌門、子嚢菌網、サッカロミケス亜網、サッカロケミス目、ジポドアスクス科、ヤロウィア属の新種若しくは亜種で新規な微生物として、本酵母は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１６年７月６日に寄託し、受領番号「ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１１４」として保管されている。
【００１６】
また、本発明に係る新規ヤロウィア属酵母を用いた排水の生物学的処理方法において、ヤロウィアＹＨ−０１を投入することが好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属酵母は、含油脂排水に投入することによりバクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性のｐＨ条件下で油脂を低減化する卓越した効果を奏するものである。従って、食品製造工場の排水においては使用微生物の至適ｐＨに排水を調整するための酸、塩基性化剤やバクテリヤを抑制するための塩素剤の添加を必要とせず、これらの薬剤による設備の劣化の問題を解決し、化学物質を使用しない安全な含油脂排水の生物処理方法として油脂減量化処理のために広く環境改善に重要な役割を果たすものであり、酵母培養槽を新設することなく既設の調整槽、活性汚泥槽あるいは接触酸化槽に直接添加することができる。また、強酸性から強塩基性で生育可能であることから、この菌から抽出される酵素は広範囲のｐＨ条件下で活性を持つことが期待され、排水処理以外にも幅広い応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に実施例により本発明を説明するが、培養酵母を使用した試験例を示したが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、以下の実施例における部及び％は特に限定しない限り重量基準である。
【酵母選抜例】
【００１９】
強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母を選抜するには、イオン交換水に硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸水素ニカリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、炭酸カルシウム５．０ｇを溶解し１リットルとして（培養液Ａ）、１２１℃２０分間滅菌し、これに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液を苛性ソーダ液にてｐＨ１０に調整し、坂口フラスコにて２７℃で５日間振とう培養する。上記培養液を一白金耳とり、クロラムフェニコール（７５ｍｇ／Ｌ）及びサイクロヘキサマイド（５０ｍｇ／Ｌ）を加えたサブロー培地（栄研化学）に画線して２７℃で３〜５日間培養する。出現したコロニーをとり、前記培養液を塩酸でｐＨ３に調整し、同様に培養してその培養液を一白金耳とり、サブロー培地に画線して２７℃で３〜５日間培養し、出現したコロニーを滅菌生理食塩水にて分散して再度サブロー培地に画線培養することで、強酸性から強塩基性にて油脂を資化する酵母としてスクリーニングした。本発明者が約２００種の排水及び土壌より選抜した結果、乳脂肪及び大豆脂肪を９０％以上資化する酵母を選抜し、この中からヤロウィア属酵母を３株取得し、これらの酵母名はＹＨ−０１、ＹＨ−０２、ＹＨ−０３とした。
【培養酵母製造例】
【００２０】
Ｙ．Ｍ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ ＹＭ Ａｇｅｒ）に生育させた保存酵母ヤロウィアＹＨ−０１を無菌的に取り、滅菌した培養液Ａに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加した培養液に植菌し、２７℃で４８〜７２時間通気攪拌培養した。このようにして得られた培養液をヤロウィアＹＨ−０１の培養酵母とし、又これを定法に従い凍結乾燥して凍結乾燥酵母とした。この培養酵母に含まれる菌数は１０７〜１０８個／ｍｌであり、凍結乾燥酵母に含まれる菌数は１０８〜１０９個／ｇであった。
【実施例１】
【００２１】
滅菌した培養液Ａに脂肪量が約１，０００ｍｇ／Ｌになるように滅菌済みの市販牛乳又は滅菌済みの市販豆乳を添加し、塩酸及び苛性ソーダ液でｐＨを２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０に調整し、あらかじめ製造例と同様に培養したヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．３×１０７／ｍｌ）を３％添加して２７℃で５日間培養した。その結果を表６に示したが、酸性域、中性域、アルカリ性域で乳脂肪及び大豆油を高率に資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２２】
バクテリヤが共存する酸性排水モデルとして、滅菌した培養液Ａを作成し、これに生きた乳酸菌が存在する市販の発酵乳で乳脂肪含有量を１，０００ｍｇ／Ｌ含むように加え、この試験液（乳酸菌数；２．４×１０６／ｍｌ）をｐＨ５．０に調整して、あらかじめ製造例と同様に培養しておいたヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．６×１０７／ｍｌ）を３％接種して２７℃で５日間培養した。この結果を表７に示したが、乳酸菌の存在下でも充分に油脂を資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。また、ヤロウィアＹＨ−０１の５日目の菌数は６．６×１０７／ｍｌ個であり、酸性条件での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。
【実施例３】
【００２３】
バクテリヤが存在する塩基性排水モデルとして、実施例２と同様な滅菌した培養液Ａを作成し、これに豆乳油脂含有量を１，０００ｍｇ／Ｌ含むように滅菌の市販豆乳を加え、培養液をｐＨ９．０に調整して、バチルス・サブチリスを加えた試験液（サブチルス菌数；５．３×１０５／ｍｌ）にあらかじめ製造例と同様に培養しておいたヤロウィアＹＨ−０１の生菌体（７．６×１０７／ｍｌ）を３％接種し２７℃で５日間培養した。表８に結果を示したが、塩基性において他の細菌が存在しても大豆油脂を充分に資化し、ｎ−ヘキサン抽出物を大幅に低下させることが明らかとなった。また、ヤロウィアＹＨ−０１の５日目の菌数は５．４×１０７／ｍｌ個であり、塩基性条件での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。
【実施例４】
【００２４】
牛乳製造工場の排水の調整槽からｎ−ヘキサン（１，１００ｍｇ／Ｌ）、ＢＯＤ（８５０ｍｇ／Ｌ）、ｐＨ８．３の排水を採取し、あらかじめ製造例と同様に作成した凍結乾燥粉末のヤロウィアＹＨ−０１（６．６×１０８／ｇ）を０．３％接種した例を示す。ここでは、一般的な活性汚泥法の調整槽及び活性汚泥槽にヤロウィアＹＨ−０１を添加したモデルとして、２７℃３日間通気攪拌培養した結果を示す。表９に示したように種々の菌が存在している排水モデルで、３日目の排水中のｎ−ヘキサン減少率は９０％以上の油脂分を減少させ、ヤロウィアＹＨ−０１の３日目の菌数は５．２×１０７／ｍｌ個であり、実排水での油脂の低下とバクテリヤとの共生が明確となった。また、上記排水を９５℃にて殺菌・冷却後、同様にヤロウィアＹＨ−０１の凍結乾燥粉末を０．３％加えて同様に培養した結果、大きな差は認められなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母。
【請求項２】
ヤロウィアＹＨ−０１（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１１４）である請求項第１項に記載の酵母。
【請求項３】
請求項第１項又は第２項の培養酵母を投入することにより、油脂を低減することを特徴とする排水の生物学的処理方法。
【請求項１】
バクテリヤと共生し、強酸性から強塩基性の条件下で動植物性油脂を高率に資化するヤロウィア属に属する酵母。
【請求項２】
ヤロウィアＹＨ−０１（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１１４）である請求項第１項に記載の酵母。
【請求項３】
請求項第１項又は第２項の培養酵母を投入することにより、油脂を低減することを特徴とする排水の生物学的処理方法。
【公開番号】特開２００６−４２７７４（Ｐ２００６−４２７７４Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５１１３２（Ｐ２００４−２５１１３２）
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５９９０７２２９７）日之出産業株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５９９０７２２９７）日之出産業株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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