新規レクチン及びその製造方法並びに糖鎖検出方法
【課題】血液型Ａ型糖鎖及びフォルスマン抗原糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供する。
【解決手段】本発明のレクチンは、（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチンである。
【解決手段】本発明のレクチンは、（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規レクチン及びその製造方法に関し、特にキノコ抽出物由来の新規レクチン及びその製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、植物、動物のほか菌類などにも存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性（以下、適宜「特異性」ともいう）を示す物質の総称である。レクチンは、単糖のみならず糖鎖中の糖も認識するため、有用糖鎖プロファイラーとして広く用いられている。またレクチンは糖鎖に対する特異的な結合能が高いため、これを利用した目的物質の検出が可能である。目的物質の検出をより効率よく行うために、従来のレクチンとは特異性や結合能の高さなどが異なる新規なレクチンが探索され、種々見出されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、糖鎖の研究の進歩に伴って、糖鎖が生体内外で重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。例えば、ウィルス感染や癌等の各種疾患における糖鎖の役割が重要視されてきている。このため、より詳細な糖鎖研究が求められており、糖鎖の分析や癌などの診断において、特定の糖鎖を認識可能なレクチンは、有用なツールとして利用されてきている（例えば、特許文献３及び４参照）。
強力な抗原活性を有する糖鎖としては、ヒト血液型糖脂質に属するＡ型糖鎖（GalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Glc）と、フォルスマン抗原糖鎖（GalNAc 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Gal1-4 Glc）が知られている。
【０００４】
エスカルゴレクチン（HPL）は、フォルスマン抗原糖鎖を認識するレクチンとして知られているが、フォルスマン抗原糖鎖のみならずＴ抗原にも結合することが報告されている（非特許文献１参照）。
バンデリア豆レクチン（GSL-IA）は、Ａ型糖鎖やフォルスマン抗原糖鎖を認識するレクチンとして知られているが、他のガラクトース含有糖鎖にも結合することが報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６３０４３１号公報
【特許文献２】特許第２８９５９６２号公報
【特許文献３】特開２００６−１４９３９８号公報
【特許文献４】特表２００５−５１５４４０号公報
【非特許文献１】Glycobiology, 2007 Oct;17(10): pp1077-1083. (Epub 2007 Jul 25）
【非特許文献２】Glycobiology. 1999 Nov;9(11): pp.1161-1170
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記レクチンはいずれも、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖にのみ認識するという高い特異性を示すレクチンではない。レクチンを利用して種々の糖鎖プロファイルを行う際に、検査対象とする糖鎖に結合性を有しても、異なる糖鎖に対してもある程度の結合性を示すレクチンでは、適切なプロファイルを行うことができない。現在知られているレクチンでは糖鎖に対する特異性が充分でないものがあり、特異性が高い新規なレクチンの開発に対する要請が大きくなっている。
従って本発明は、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
［１］ 以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、
（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、
（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する。
［２］ 前記レクチンのＮ−末端領域のアミノ酸配列が、配列番号１及び配列番号２の少なくとも一方である前記［１］に記載のレクチン。
［３］フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有することを特徴とする［１］又は［２］のいずれかに記載のレクチン。
【０００８】
［４］ カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られる前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチン。
［５］ 前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである前記［１］〜［４］のいずれかに記載のレクチン。
［６］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること、を含むレクチンの製造方法。
【０００９】
［７］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
［８］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
［９］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチン、前記［７］の標識レクチン又は前記［８］記載のレクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含む糖鎖検出方法。
［１０］ 前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む［９］記載の糖鎖検出方法。
［１１］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンを含む、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の有無を判定する判定薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖を含む糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌に由来し、上記（１）〜（３）の特徴を有するものである。カヤタケ属担子菌の子実体（キノコ）に由来するレクチンであることが好ましい。
【００１２】
本発明におけるカヤタケ属担子菌としては、ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis (Batsch:Fr.) Kummer）、アオイヌシメジ（Clitocybe odora (Bull. : Fr.) Kummer）カヤタケ（Clitocybe gibba (Pers.: Fr.) Kummer）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipes (Pers. : Fr.) Kummer）等を挙げることができ、このうちレクチンの糖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、特にハイイロシメジであることが好ましい。
【００１３】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００のものであり、糖鎖認識能の高さの観点から好ましくは１０，０００〜５０，０００のものであり、ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００のもの、好ましくは７０，０００〜９０，０００のものである。
ＳＤＳ電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量の測定及びゲル濾過法による分子量の測定は常法に従って行うことができる。
【００１４】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ（０．５質量％）条件下での２５℃による一般的な泳動条件下で行った場合、煮沸処理を行ったものでは、それぞれ１３，０００及び１７，０００の二種の単量体として存在し、煮沸処理を行わないものでは全体で約４０，０００〜４１，０００の多量体として存在することが好ましい。
また煮沸処理を行わないレクチンの分子量は、ゲル濾過による場合、一般的な測定条件下で、分子量推定用標準タンパクを用いて推定した結果、６０，０００〜１００，０００のものであることが好ましく、７０，０００〜９０，０００のものであることが更に好ましい。
【００１５】
また、本発明のレクチンには、上記のように二種のサブユニットが存在する。この場合、各ユニットのＮ−末端領域のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２であることが好ましい。これらのアミノ酸配列を有するレクチンはこれまでに知られてなく、従って、Met-Leu-Tyr-Leu-Val-Ser-Ile-Gly-Glu-Thr-Ala-Glu-Leu-Gln-Ser-Pro-Phe-Thr-Thr-Asp（配列番号１）又は、Thr-Ile-Asp-Asn-Thr-Ala-Phe-Asn-Leu-Ser-Asp-Leu-Gly-Gly-Asn-Val-Leu-Asn-His-Ile（配列番号２）で示されるＮ−末端領域を有するレクチンは、新規なものである。
【００１６】
本発明のレクチンは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示す。
フォルスマン抗原糖鎖は、GalNAc 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Gal1-4 Glc、特に、GalNAc α1-3 GalNAc β1-3 Gal α1-4 Galβ1-4 Glcまたは、GalNAc 1-3 GalNAc 1-3、特に、GalNAc α1-3 GalNAc β1-3 Galとして知られている抗原糖鎖であり、本発明のレクチンはこの糖鎖を認識する。好ましくは、本発明のレクチンは、末端のＧｌｃに更にセラミドが結合した糖脂質を認識する。
Ａ型糖鎖は血液型Ａ型糖鎖を意味し、GalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-4 Glc 又はGalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-4 GlcNAc 1-3 Gal 1-4 Glc で示される四糖又は六糖で構成された糖鎖であり、特に、GalNAcα 1-3 (Fucα1-2) Galβ 1-4 Glc及びGalNAcα 1-3 (Fucα1-2) Galβ 1-4 GlcNAcβ 1-3 Gal β1-4 Glcであることが好ましい。
【００１７】
このように本発明のレクチンは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示すものであり、他の糖鎖に対して特異性を示さない又は検出限界以下の非常に弱い結合である。このため、他の糖鎖配列が存在する環境下であっても、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖のみを識別することができる。このような高い選択性を示すレクチンは、これまで知られていなかった。
【００１８】
本発明における「高い特異性」とは、４９種類以上の糖鎖の組み合わせで構成された糖鎖群の中から、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては検出限界以下の非常に弱い結合または結合性を示さないことを意味し、好ましくは、１００種類以上の糖鎖の組み合わせで構成された糖鎖群の中からフォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては検出限界以下の非常に弱い結合または結合性を示さないことを意味する。
【００１９】
このような高い特異性は、例えば結合定数による親和性に基づいて評価することができる。本発明のレクチンは、好ましくは、フォルスマン抗原糖鎖又はＡ型糖鎖に対して、１．０×１０５Ｍ−１以上の親和性を示し、より好ましくは１．０×１０７Ｍ−１以上を示すことができる。この結合定数の上限は特に制限されないが、通常のレクチンの場合に示される結合定数の最大値、例えば１．０×１０１０Ｍ−１以下の親和性を示す。また本発明のレクチンの他の糖鎖に対する親和性は低く、例えば結合定数１．０×１０４Ｍ−１以下であることが好ましい。
ここで用いられる結合定数は、例えば、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等により測定することができ、本発明の場合、以下のようにして測定したものを意味する。
【００２０】
本発明のレクチンと相互作用しないことがわかっている糖鎖（標準糖鎖）の溶出前端（Ｖ０）を基準として、検出対象の糖鎖の溶出前端（Ｖ）の遅れ（Ｖ−Ｖ０）を相互作用強度として測定する。ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０及び有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求める。
以下の基準式において、Ａは溶出に用いる物質、Ａ０は物質Ａの初濃度、Ｂは固定化リガンド、Ｖは溶出容量、Ｖ０は標準糖鎖の溶出前端容量、Ｂｔは有効リガンド量、Ｋｄは解離定数（結合定数の逆数）を意味する。本発明においては、物質Ａの初濃度は充分に小さいと考えられるため、下記の基準式（３）を採用する。
【００２１】
【数１】
【００２２】
また、本発明のレクチンはガラクトース結合性を示す。このため、後述する製造方法によって本発明のレクチンを得るには、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体を使用することが好ましい。即ち、本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌から得られた水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られるものであってもよい。
【００２３】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌から、公知の抽出方法、分離方法及び精製方法等を適宜組み合わせて行うことにより単離して製造することができる。
中でも、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること（抽出工程）、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること（精製工程）、を含むレクチンの製造方法により得られるレクチンであることが好ましい。
【００２４】
水系媒体としては、各種の緩衝液、水と混合しうる各種の有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。緩衝液又は有機溶媒と緩衝液の混合物を用いることが好ましい。
緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲に緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。
本発明に用いられる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。
緩衝液の塩濃度については、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜２０ｍＭであることがより好ましい。
また、緩衝液は各種の塩類を更に含むことができ、例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等を本発明における水系媒体として好ましく用いることができる。
【００２５】
また、有機溶媒としては水と混合しうる有機溶媒であれば特に制限なく用いることができるが、中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルを好ましく挙げることができる。有機溶媒と水又は緩衝液を混合する場合の有機溶媒の含有量としては１０質量％〜４０質量％であることが好ましい。
水系媒体とカヤタケ属担子菌から、水系媒体抽出物を得る手法については、特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中でカヤタケ属担子菌を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また粉砕する方法としては、ミキサーやホモジナイザー等、通常の粉砕方法を挙げることができる。
【００２６】
本発明における抽出工程は、水系媒体とカヤタケ属担子菌との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
従って、本発明における抽出工程は、得られるレクチンの純度の観点から、リン酸緩衝化生理食塩水中で、カヤタケ属担子菌を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。
【００２７】
抽出工程により得られた水系媒体抽出物は、次いで、精製工程において、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーに付して精製する。
本発明における担体としては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体であれば特に制限なく用いることができ、ラクトース−アガロース担体、酸処理セファロース担体、任意のガラクトースを含む糖や糖タンパク、糖脂質などを固定化した担体を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。
具体的には、例えば、ラクトース−アガロース担体（Ｊ−オイルミルズ社製）やセファロース担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を塩酸などの酸で処理したもの（酸処理セファロース担体）を挙げることができる。中でも、精製効率の観点から、ラクトース−アガロース担体を用いることが特に好ましい。
【００２８】
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーにおいては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体を充填剤としたカラムを用いることが好ましい。これにより、水系媒体抽出物中のレクチンは、このカラムに吸着する。次いで、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液を用いて、分離及び分画することによって、カラムに吸着したレクチンを、より効率よく精製することができる。カラムからのレクチンの溶出は通常用いられる条件下で行えばよい。
【００２９】
溶出液としては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶液であれば、特に制限なく用いることができる。ガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖類としては、例えば、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、メチルβ−ガラクトース、メチルα−ガラクトース、ガラクトスクロース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、ラクトサミン、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、ネオラクトース、ガラクトビオース等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも、目的とするレクチンの糖特異性の観点から、ガラクトース、メチルβ−ガラクトース、メチルα−ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトースを用いることが好ましく、精製におけるコストの観点からラクトースが特に好ましい。
【００３０】
前記溶出液に含まれる糖類の濃度には特に制限はないが、例えば、ラクトースを含む溶出液の場合には、溶出液中の糖類の含有量としては、精製効率の点から、溶出液全質量の０．１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．５質量％〜２質量％であることがより好ましい。また、ラクトースを含む溶出液における糖類の濃度としては、精製効率の点から、１０ｍＭ〜１０００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜５００ｍＭであることがより好ましい。なお、ラクトースは市販のものを好適に用いることができる。
【００３１】
前記精製工程としては、ラクトース−アガロース担体を充填剤としたカラムに前記水系媒体抽出物を吸着させ、緩衝液、特に、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて非吸着成分の洗浄を行った後に、ラクトースを１００ｍＭ〜２００ｍＭ含有する溶出液を用いて精製する工程であることが特に好ましい。
【００３２】
また、本発明の製造方法では、アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製工程によって得られた溶出液を再度用いて、アフィニティークロマトグラフィーを繰り返し行ってもよく、更に他のクロマトグラフィーによる追加精製を行ってもよい。
このような他のクロマトグラフィーとしては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を挙げることができる。レクチンを夾雑成分から精度よく分離できる観点から、ゲル濾過クロマトグラフィーであることがより好ましい。
【００３３】
ゲル濾過クロマトグラフィーに用いられる充填剤としては、セファデックス、セファクリル、スーパーロース、スーパーデックス、トヨパール等を用いることができる。本発明のレクチンを精製するためには、分離能の観点からトヨパールやスーパーデックス等が特に好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーの条件としては、通常用いられる条件をそのまま適用すればよく、移動相としては上述したものと同様の水系媒体、例えばリン酸緩衝液等を用いることができる。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた場合には、赤血球凝集活性等に基づいて、目的とするレクチンを含有する分画を特定することができる。
【００３４】
レクチンの製造方法は、各精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含むことができる。これにより、レクチンを高い純度で単離することができる。
透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００３５】
本発明のレクチンは、従来公知のレクチンとは物理化学的性質、及び、糖鎖への結合特異性などの生化学的性質が異なる新規のレクチンである。特にフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖を高い選択性で認識することができるので、これらの糖鎖を検出することを目的とした検査試薬、免疫調節剤、糖質の分離分析用特異的吸着剤等として用いることができる。
【００３６】
本発明の標識レクチンは、前記レクチンと標識化合物とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。標識化合物としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができる。
標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は常法によりレクチンと結合することができる。
【００３７】
本発明のレクチン固定化担体は、前記レクチンと支持担体とを少なくとも含む。支持担体を構成する材料としては、特に制限はなく、例えば、無機材料、有機材料、及びこれらの複合材料を挙げることができる。無機材料としては、金属、半導体、金属酸化物等の金属化合物、セラミックス、ガラス、シリカ等を挙げることができる。また、有機材料としては、ゴム、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン等のポリビニルポリマー類、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ゼラチン等のポリアミド類、セルロース、アガー、アガロース、デキストラン、スターチ等の多糖類等を挙げることができ、糖鎖の分別効率の観点から、アガロース等が好ましい。
また支持担体の構造としては、特に制限はなく、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造、膜構造等を挙げることができる。
【００３８】
レクチンは前記支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。固定化するレクチンの量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせることができる。
活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。
【００３９】
糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０であり、ＮａＣｌ含量が０〜０．５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２含量が０〜１０ｍＭ、好ましくは０〜５ｍＭの緩衝液である。
アフィニティーカラムの洗浄後、溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭ〜２００ｍＭ濃度である。
【００４０】
本発明の糖鎖検出方法は、前記レクチン、前記標識レクチン又は前記レクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含むものである。本発明のレクチンはフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖のみを高い特異性で認識するために、フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖を含有する糖鎖含有物を高い精度で検出することができる。ここで糖鎖含有物には、多糖類、糖脂質、糖タンパク質、細胞、細胞断片等が含まれる。なお本発明の検出方法は、前記レクチン又は前記標識レクチンを用いて、対象とするフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出すること（以下、「検出工程」という）を行うものであれば、レクチンを用いて糖鎖を検出する通常の検出方法に含まれる他の工程を含んでもよい。
【００４１】
レクチンが結合した糖鎖含有物の検出は、例えば、標識化合物によってレクチンを予め標識化することで容易に行うことができる。中でも、感度と検出の容易さから、標識化合物を予めレクチンに結合してレクチンを標識化しておき、標識化合物を検出することによって行うことが好ましい。
標識レクチンの検出手段は、用いられた標識化合物に応じて適宜選択される。例えば、吸光度測定、発光強度測定、蛍光強度測定、目視等により行うことができ、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等を好ましく用いることができる。
【００４２】
本発明の検出方法では、検出された糖鎖含有物を他の物質と分別すること（分別工程）を更に含んでもよい。このような分別方法は、前記レクチン又はレクチン固定化担体を用いて行うことが好ましい。前記レクチンは前記フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方に対して高い特異性で結合できることから、これらの糖鎖含有物を高い精度で他の物質から分別することができる。
【００４３】
レクチンが結合する糖鎖含有物の分別は、例えば、上述したようなレクチンを固定化した担体を用いることによって更に容易に行うことができる。糖鎖化合物の分別方法は、レクチンを固定化した担体に応じて適宜選択され、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂ／Ｆ分離（ｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ分離）等により行えばよい。
なお、分別工程は必ずしも検出工程と別個独立した工程でなくてもよく、検出することと分別することとが同時に行われても、連続して行われてもよい。
【００４４】
本発明の糖鎖検出方法では、糖鎖検出感度、糖鎖分別効率の観点から、本発明のレクチンとこのレクチンにより認識される糖鎖との相互作用強度が、他の糖鎖との相互作用強度の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましく、１０００倍以上であることが更に好ましい。レクチンと糖鎖との相互作用強度は、例えば、赤血球凝集反応阻害試験、溶出までの時間の比較、結合量（重さ）等、通常、この用途に用いられる比較可能な測定法であれば、特に制限されず用いることができる。
【００４５】
なお、本発明のレクチンの製造方法及び糖鎖検出方法における糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、表面プラズモン共鳴装置、電気泳動等も、周知の方法で使用することができる。
【００４６】
本発明の判定薬は、前記レクチンを含み、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の有無を判定するものである。本発明のレクチンは、上述したようにフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖を高い精度で認識することができるので、本判定薬を用いることによって、試料中の微量なフォルスマン抗原糖鎖やＡ型糖鎖でもその有無を確実に判定することができる。
【００４７】
例えばフォルスマン抗原糖鎖は、例えばヒトに対して異種の抗原になるので、この異種抗原が対象物、例えば試料中に含まれているか否かの判定や、異種抗原が含まれている試料であるか否かの判定に利用することができる。またＡ型糖鎖は、血液型の判定や、この糖鎖が試料中に含まれているか否かの判定、この糖鎖を含む試料であるか否かの判定などに広く利用することができる。従って、本発明の判定薬を用いることによって、例えば、所定の目的物の種や型に対して適合性に欠ける又は適合性を有する試料の選別を簡便に行うことができる。
また、被検体の血液等、液体試料や、基板上にスポットされて固定化された乾燥試料に対して本発明のレクチンを接触させること及び、この接触により前記レクチンに結合し得る物質を検出すること含む検出方法も、本発明に含まれる。
【００４８】
なお、ＡＢＯ血液型（抗原）は血液だけでなく、広く各種臓器にも発現している。そのため、本発明のレクチンは、前記判定薬としてだけでなく、例えば、ＡＢＯ血液型不適合時の一時的なブロック剤や補助剤としての利用も考えられ、さらには、その合成産物等を利用した血液や臓器におけるＡ型糖鎖抗原のブロック剤や補助剤等として利用することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００５０】
［実施例１］
（１）レクチンＣＮＡ−Ｉの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体粉末（日本きのこ研究所製）０．５ｍｇに、２０ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０ ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１ ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした
Ｃカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１０×１００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約２６ｍｌ）にて洗浄した後、０．１Ｍのラクトース溶液を溶出液として用いて２５℃、０．５ｍｌ／分の条件下で溶出し、１ｍｌずつ回収し、ラクトース結合性レクチン含有画分Ｎｏ．４３〜４６を得た（合計吸着率６８％）。
レクチンを含有する各画分は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）及び後述する赤血球凝集活性を測定することによって同定した。
【００５１】
（２）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球、または、不純物を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
９６ウェルタイタープレートの一レーンにＰＢＳを各２０μｌ入れ、ウェルに、レクチン溶液又は各クロマトグラフィーにおける回収画分を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。赤血球凝集活性は、凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とした。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
上記（１）で得られたレクチン含有画分Ｎｏ．４３〜４６は、それぞれ、赤血球凝集力価（力価）６４、力価５１２、力価２５６、力価３２として、赤血球凝集活性を確認することができた。
なお、非吸着分を回収して再度ラクトース−アガロース充填したカラムに付したところ、非吸着分には、ラクトース−アガロース吸着分がほとんど含有されていなかった（０．２％吸着率）。
【００５２】
（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
上記（１）により得られたレクチン含有画分を、電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液、分子量マーカーは共に１μｌ使用し、製品プロトコール及び常法に従って泳動を行い、相対移動度から分子量を推定したところ、約１７，０００付近に複数のレクチンが存在することが示唆された。
次いで、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５３】
（３）ゲル濾過による分画
上記（１）により得られたレクチン含有画分１ｍｌ（Fr.44）を限外ろ過で２００μｌにまで濃縮し、フィルターろ過したのち、１００μｌを、ＰＢＳで平衡化したゲル濾過用カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製；φ７．８×３００ｍｍ））を用いて、２５℃で０．５ｍｌ／分の流速の条件下でゲル濾過を２回にわけて行った。ゲル濾過回収液に対して、上記と同様にして２８０ｎｍにおける吸光度及び赤血球凝集活性を測定すると共に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、赤血球凝集活性及びＯＤ２８０ｎｍが共に高い画分を特定し、回収した。回収された画分は、限外ろ過膜（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製；ＭＷＣＯ１０，０００）で濃縮した後に、各画分を凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して精製量を測定した。
上記、高い赤血球凝集活性を示したレクチン含有画分では、分子量１３，０００付近と１７，０００付近にバンドを確認したため、これをＣＮＡ−Ｉと決定した。
【００５４】
［実施例２］
（１）レクチンＣＮＡ−Ｉの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体（福島県で採取）約４００ｇを凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して、ハイイロシメジ子実体凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末２０ｇに、２００ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした。
カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１６×２００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を２５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約１００ｍｌ）にて洗浄した後、０．１Ｍのラクトース／ＰＢＳ溶液を溶出液として用いて７℃、１ｍｌ／分の条件下で溶出した。ＯＤ２８０のピーク赤血球凝集活性に基づいてレクチン含有画分を特定し、ＯＤ２８０のピークを示すと共に赤血球凝集活性の高い画分をレクチン含有画分として得た。
活性画分を回収した回収液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ：６−８，０００（平面幅１４．６ｍｍ）に入れ、１００倍量の蒸留水による７℃での透析を３回行った。
次いで、実施例１と同様にして、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５５】
（２）ゲル濾過による分画
上記（１）により得られたレクチン含有画分８０ｍｇを２ｍｌのＰＢＳに溶解した試料溶液に対し、ＰＢＳで平衡化したゲル濾過用カラム（ガラスカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ２６×８００ｍｍ）にスーパーデックス Ｇ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を４２４ｍｌ充填）を用いて、７℃で１ｍｌ／分の流速の条件下でゲル濾過を行った。ゲル濾過回収液に対して、上記と同様にしてＯＤ２８０ｎｍにおける吸光度及び赤血球凝集活性を測定すると共に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、赤血球凝集活性及びＯＤ２８０ｎｍが共に高い画分を特定し、回収した。回収された画分は、限外ろ過膜（Ultrafree、Millipore社製；UFC3LGC00、ＭＷＣＯ１０，０００）で濃縮した後に、各画分を凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して、精製量を測定した。精製できたＣＮＡ−Ｉは１１．８６ｍｇであった。更にウサギ赤血球凝集活性を測定したところ、力価 １０２４０ (１mg/ml)、および、最小凝集濃度０．０３３（μｇ／ｍｌ）であった。
【００５６】
（３）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
上記（２）で得られたレクチンＣＮＡ−Ｉに対して、煮沸処理を行ったもの（試料Ａ）及び煮沸処理を行わないもの（試料Ｂ）の２種にした以外は前述したものと同様にしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。結果を図１に示す。なお図１においてレーン１は試料Ａ、レーン２は試料Ｂ、Ｍはマーカーを示す。
その結果、試料Ａの場合には１３，０００及び１７，０００、試料Ｂの場合には４０，０００及び４１，０００にそれぞれバンドを確認することができた（図１参照）。
（４）ゲルろ過による分子量測定
上記のようにして得られたレクチンＣＮＡ−Ｉについて、標準用試料Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量：80,000）、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（分子量：67,000）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量：47,000）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ （分子量：29,000）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｂ（分子量：13,700）を用いて分子量を推定したところ、約８０，０００であった。
【００５７】
［実施例３］
実施例２で得られたレクチンＣＮＡ−Ｉについて、以下のような評価を行った。
（１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
レクチンＣＮＡ−Ｉ １０μｇを、ＴＡ（０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとＣＮＡ−ＩのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてＡｕｔｏｆｌｅｘ(ブルカーダルトニクス社製)を用い、ＬＰモードでＣＮＡ−Ｉの分子量を測定した。その結果、ＣＮＡ−Ｉの分子量は１６，２６０および１１，０４２であった。
【００５８】
（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列
ＣＮＡ−ＩのＮ−末端領域のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーとしてＰＰＳＱ−２１（島津製作所社製）を用いて解析したところ、アミノ酸配列（配列番号１）又は（配列番号２）であることが分かった。得られた２つのアミノ酸配列をＦＡＳＴおよびＢＬＡＳＴで相同性検索したところ、相同性を示すタンパクがないことから、上記レクチンＣＮＡ−Ｉは、新規なレクチンであることがわかった。
【００５９】
（３）温度安定性
５０μｇのＣＮＡ−Ｉを生理食塩水１ｍｌに溶解し、各試験温度で３０分間加熱した。直ちに氷冷し１０分後に上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図２に示した。
図２から、本発明のレクチンは４℃〜６０℃まで比較的安定であり、特に４〜６０℃では殆ど温度の影響を受けないことが分かった。ただし７０℃以上で活性が急激に低くなった。
【００６０】
（４）ｐＨ安定性
５０μｇのＣＮＡ−Ｉを生理食塩水１ｍｌに溶解し、これを試験管に分取した。等量の下記の各ｐＨ緩衝液をそれぞれ加え、４℃にて２４時間インキュベートした後、上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図３に示した。図３から、本発明のレクチンＣＮＡ−ＩはｐＨ３〜１１で安定しており、特にｐＨ４〜１１で良好な安定性を示すことが分かった。
−ｐＨ緩衝液−
ｐＨ２．０ ： ２０ｍＭ 塩化カリウム−塩酸緩衝液
ｐＨ３．０ ： ２０ｍＭ 塩化カリウム−塩酸緩衝液
ｐＨ４．０ ： ２０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０ ： ２０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０ ： ２０ｍＭ リン酸緩衝液
ｐＨ７．０ ： ２０ｍＭ リン酸緩衝液
ｐＨ８．０ ： ２０ｍＭ トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)緩衝液
ｐＨ９．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１０．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１１．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
なお、各緩衝液は０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含む。
【００６１】
（５）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、血漿及び白血球および不純物を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
【００６２】
ａ）赤血球凝集活性の測定
９６ウェルタイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに、レクチン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性として表１に示した。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
【００６３】
ｂ）ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験
ウサギ赤血球凝集活性試験において、ウサギ保存血液の代わりにヒツジ保存血液（日本バイオテスト社製）、ブタ保存血液（日本バイオテスト社製）、ヒト保存血液（Biotest社製）を用いた以外は同様にして、ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験を行った。結果を表１に示した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
（６）ウサギ赤血球凝集阻害試験
表２及び表３の３２種の糖タンパク質および糖を適量秤量し、ＰＢＳを添加し、表２及び表３記載の濃度に調製した。上記（実施例２）で得られたＣＮＡ−Ｉのウサギ赤血球凝集活性を測定し、赤血球が凝集する最低希釈倍率が２〜４倍になるようこれらをＰＢＳで希釈した。次いで９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルにＰＢＳを２５μｌずつ入れ、これにレクチン溶液を５０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。このウェルにそれぞれ、上記で希釈した試料を２５μｌずつ添加し、室温で６０分間放置後、４％ウサギ赤血球液を２５μｌずつ添加し、室温で１時間放置後、凝集阻害の有無を確認した。結果を下記表２及び表３に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
上記表２および３の結果から、実施例２で得られたレクチン（ＣＮＡ−Ｉ）は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、メリビオース、ラフィノースに特異的に結合することが分かった。糖タンパクでは、ムチンに結合することがわかった。
【００６９】
［実施例４］
（７）特異性試験（糖鎖の検出）
（ａ）オリゴ糖の準備
実施例に使用したピリジルアミノ化（ＰＡ−）糖鎖を、図４及び図５に示す。ＰＡ糖鎖は、タカラバイオ社、生化学バイオビジネス社ならびに増田化学工業社などから購入した。もしくは、未標識の糖鎖や糖鎖を酵素消化して得た糖鎖等をＧｌｙｃｏＴＡＧ（登録商標、タカラバイオ社製）でピリジルアミノ化した。
その他の標識化糖鎖は、図６に示す。パラニトロフェニル（ｐＮＰ−）糖鎖およびパラメトキシフェニル（ｐＭＰ−）糖鎖は生化学バイオビジネス社、東京化成社、シグマ社、トロント・リサーチ・ケミカル社、カルビオケム社、から購入したものを使用した。
【００７０】
（ｂ）レクチンカラムの調製
０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）中にレクチンを溶解し、ＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）へその製造者マニュアルに従って結合させた。０．８％ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、ＴＢＳ緩衝液）中にレクチン−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ×１０ｍｍ，３１．４μｌ）に充填した。
【００７１】
（ｃ）フロンタルアフィニティクロマトグラフィー
ＦＡＣ自動分析装置（FAC-1、島津製作所社製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ−１装置に接続した。流速およびカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎおよび２５℃に保った。前記ＴＢＳ緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ〜４ｍｌ）のＰＡ−糖鎖（３．７５ｎＭ又は７．５ｎＭ）およびｐＮＰ−糖鎖およびｐＭＰ−糖鎖（１μＭ）を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。
【００７２】
ＰＡ糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
４９種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、図７に示すとおり、ＣＮＡ−Ｉは、フォルスマン抗原糖鎖と、Ａ型糖鎖（６糖）にのみ結合である溶出の遅れが確認できた。
【００７３】
さらに、糖鎖群を増やし、糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定する同様の実験をおこなった。
また、ｐＮＰ-糖鎖およびｐＭＰ−糖鎖はＵＶ吸収強度（検出波長 ２８０ｎｍ）でモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−Ｆｕｃ、番号１０１１）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
【００７４】
ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０および有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求めた。
【数２】
【００７５】
パラメトキシフェニル（ｐＭＰ−）標識フォルスマン抗原糖鎖（番号１１０７)を０μＭ〜０．９μＭになるようＴＢＳ緩衝液で作製した。上記同様分析を行い、各濃度における相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−Ｆｕｃ、番号１０１１）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定し、結合定数（Ｋａ）および有効リガンド量（Ｂｔ）を求めた。その結果、結合定数（Ｋａ）＝２．４４×１０６Ｍ−１および有効リガンド量（Ｂｔ）＝０．０１５ｎｍｏｌであった。結合した糖鎖の相互作用強度および結合定数を算出した。結果を表４と図８に示す。
【００７６】
１５１種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、表４と図８に示すとおり、ＣＮＡ−Ｉは、番号７１７のフォルスマン抗原糖鎖、番号７１９のＡ型糖鎖（４糖）、番号７２０のＡ型糖鎖（６糖）にのみ結合性を示した。
【００７７】
【表４】
【００７８】
従って、レクチンＣＮＡ−Ｉは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示すので、これらの糖鎖を含む糖鎖含有物のみを精度よく検出し、分別するために使用することができ、また試料中のこれらの糖鎖の有無を精度よく判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの温度安定性を示す図である。
【図３】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−ＩのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ＰＡ−）を示す図である。
【図５】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ＰＡ−）を示す図である。
【図６】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ｐＮＰ−，ｐＭＰ−）を示す図である。
【図７】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【図８】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規レクチン及びその製造方法に関し、特にキノコ抽出物由来の新規レクチン及びその製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、植物、動物のほか菌類などにも存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性（以下、適宜「特異性」ともいう）を示す物質の総称である。レクチンは、単糖のみならず糖鎖中の糖も認識するため、有用糖鎖プロファイラーとして広く用いられている。またレクチンは糖鎖に対する特異的な結合能が高いため、これを利用した目的物質の検出が可能である。目的物質の検出をより効率よく行うために、従来のレクチンとは特異性や結合能の高さなどが異なる新規なレクチンが探索され、種々見出されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、糖鎖の研究の進歩に伴って、糖鎖が生体内外で重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。例えば、ウィルス感染や癌等の各種疾患における糖鎖の役割が重要視されてきている。このため、より詳細な糖鎖研究が求められており、糖鎖の分析や癌などの診断において、特定の糖鎖を認識可能なレクチンは、有用なツールとして利用されてきている（例えば、特許文献３及び４参照）。
強力な抗原活性を有する糖鎖としては、ヒト血液型糖脂質に属するＡ型糖鎖（GalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Glc）と、フォルスマン抗原糖鎖（GalNAc 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Gal1-4 Glc）が知られている。
【０００４】
エスカルゴレクチン（HPL）は、フォルスマン抗原糖鎖を認識するレクチンとして知られているが、フォルスマン抗原糖鎖のみならずＴ抗原にも結合することが報告されている（非特許文献１参照）。
バンデリア豆レクチン（GSL-IA）は、Ａ型糖鎖やフォルスマン抗原糖鎖を認識するレクチンとして知られているが、他のガラクトース含有糖鎖にも結合することが報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６３０４３１号公報
【特許文献２】特許第２８９５９６２号公報
【特許文献３】特開２００６−１４９３９８号公報
【特許文献４】特表２００５−５１５４４０号公報
【非特許文献１】Glycobiology, 2007 Oct;17(10): pp1077-1083. (Epub 2007 Jul 25）
【非特許文献２】Glycobiology. 1999 Nov;9(11): pp.1161-1170
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記レクチンはいずれも、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖にのみ認識するという高い特異性を示すレクチンではない。レクチンを利用して種々の糖鎖プロファイルを行う際に、検査対象とする糖鎖に結合性を有しても、異なる糖鎖に対してもある程度の結合性を示すレクチンでは、適切なプロファイルを行うことができない。現在知られているレクチンでは糖鎖に対する特異性が充分でないものがあり、特異性が高い新規なレクチンの開発に対する要請が大きくなっている。
従って本発明は、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
［１］ 以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、
（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、
（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する。
［２］ 前記レクチンのＮ−末端領域のアミノ酸配列が、配列番号１及び配列番号２の少なくとも一方である前記［１］に記載のレクチン。
［３］フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有することを特徴とする［１］又は［２］のいずれかに記載のレクチン。
【０００８】
［４］ カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られる前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチン。
［５］ 前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである前記［１］〜［４］のいずれかに記載のレクチン。
［６］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること、を含むレクチンの製造方法。
【０００９】
［７］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
［８］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
［９］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチン、前記［７］の標識レクチン又は前記［８］記載のレクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含む糖鎖検出方法。
［１０］ 前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む［９］記載の糖鎖検出方法。
［１１］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のレクチンを含む、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の有無を判定する判定薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖を含む糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌に由来し、上記（１）〜（３）の特徴を有するものである。カヤタケ属担子菌の子実体（キノコ）に由来するレクチンであることが好ましい。
【００１２】
本発明におけるカヤタケ属担子菌としては、ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis (Batsch:Fr.) Kummer）、アオイヌシメジ（Clitocybe odora (Bull. : Fr.) Kummer）カヤタケ（Clitocybe gibba (Pers.: Fr.) Kummer）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipes (Pers. : Fr.) Kummer）等を挙げることができ、このうちレクチンの糖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、特にハイイロシメジであることが好ましい。
【００１３】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００のものであり、糖鎖認識能の高さの観点から好ましくは１０，０００〜５０，０００のものであり、ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００のもの、好ましくは７０，０００〜９０，０００のものである。
ＳＤＳ電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量の測定及びゲル濾過法による分子量の測定は常法に従って行うことができる。
【００１４】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ（０．５質量％）条件下での２５℃による一般的な泳動条件下で行った場合、煮沸処理を行ったものでは、それぞれ１３，０００及び１７，０００の二種の単量体として存在し、煮沸処理を行わないものでは全体で約４０，０００〜４１，０００の多量体として存在することが好ましい。
また煮沸処理を行わないレクチンの分子量は、ゲル濾過による場合、一般的な測定条件下で、分子量推定用標準タンパクを用いて推定した結果、６０，０００〜１００，０００のものであることが好ましく、７０，０００〜９０，０００のものであることが更に好ましい。
【００１５】
また、本発明のレクチンには、上記のように二種のサブユニットが存在する。この場合、各ユニットのＮ−末端領域のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２であることが好ましい。これらのアミノ酸配列を有するレクチンはこれまでに知られてなく、従って、Met-Leu-Tyr-Leu-Val-Ser-Ile-Gly-Glu-Thr-Ala-Glu-Leu-Gln-Ser-Pro-Phe-Thr-Thr-Asp（配列番号１）又は、Thr-Ile-Asp-Asn-Thr-Ala-Phe-Asn-Leu-Ser-Asp-Leu-Gly-Gly-Asn-Val-Leu-Asn-His-Ile（配列番号２）で示されるＮ−末端領域を有するレクチンは、新規なものである。
【００１６】
本発明のレクチンは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示す。
フォルスマン抗原糖鎖は、GalNAc 1-3 GalNAc 1-3 Gal 1-4 Gal1-4 Glc、特に、GalNAc α1-3 GalNAc β1-3 Gal α1-4 Galβ1-4 Glcまたは、GalNAc 1-3 GalNAc 1-3、特に、GalNAc α1-3 GalNAc β1-3 Galとして知られている抗原糖鎖であり、本発明のレクチンはこの糖鎖を認識する。好ましくは、本発明のレクチンは、末端のＧｌｃに更にセラミドが結合した糖脂質を認識する。
Ａ型糖鎖は血液型Ａ型糖鎖を意味し、GalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-4 Glc 又はGalNAc 1-3 (Fuc1-2) Gal 1-4 GlcNAc 1-3 Gal 1-4 Glc で示される四糖又は六糖で構成された糖鎖であり、特に、GalNAcα 1-3 (Fucα1-2) Galβ 1-4 Glc及びGalNAcα 1-3 (Fucα1-2) Galβ 1-4 GlcNAcβ 1-3 Gal β1-4 Glcであることが好ましい。
【００１７】
このように本発明のレクチンは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示すものであり、他の糖鎖に対して特異性を示さない又は検出限界以下の非常に弱い結合である。このため、他の糖鎖配列が存在する環境下であっても、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖のみを識別することができる。このような高い選択性を示すレクチンは、これまで知られていなかった。
【００１８】
本発明における「高い特異性」とは、４９種類以上の糖鎖の組み合わせで構成された糖鎖群の中から、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては検出限界以下の非常に弱い結合または結合性を示さないことを意味し、好ましくは、１００種類以上の糖鎖の組み合わせで構成された糖鎖群の中からフォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては検出限界以下の非常に弱い結合または結合性を示さないことを意味する。
【００１９】
このような高い特異性は、例えば結合定数による親和性に基づいて評価することができる。本発明のレクチンは、好ましくは、フォルスマン抗原糖鎖又はＡ型糖鎖に対して、１．０×１０５Ｍ−１以上の親和性を示し、より好ましくは１．０×１０７Ｍ−１以上を示すことができる。この結合定数の上限は特に制限されないが、通常のレクチンの場合に示される結合定数の最大値、例えば１．０×１０１０Ｍ−１以下の親和性を示す。また本発明のレクチンの他の糖鎖に対する親和性は低く、例えば結合定数１．０×１０４Ｍ−１以下であることが好ましい。
ここで用いられる結合定数は、例えば、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等により測定することができ、本発明の場合、以下のようにして測定したものを意味する。
【００２０】
本発明のレクチンと相互作用しないことがわかっている糖鎖（標準糖鎖）の溶出前端（Ｖ０）を基準として、検出対象の糖鎖の溶出前端（Ｖ）の遅れ（Ｖ−Ｖ０）を相互作用強度として測定する。ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０及び有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求める。
以下の基準式において、Ａは溶出に用いる物質、Ａ０は物質Ａの初濃度、Ｂは固定化リガンド、Ｖは溶出容量、Ｖ０は標準糖鎖の溶出前端容量、Ｂｔは有効リガンド量、Ｋｄは解離定数（結合定数の逆数）を意味する。本発明においては、物質Ａの初濃度は充分に小さいと考えられるため、下記の基準式（３）を採用する。
【００２１】
【数１】
【００２２】
また、本発明のレクチンはガラクトース結合性を示す。このため、後述する製造方法によって本発明のレクチンを得るには、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体を使用することが好ましい。即ち、本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌から得られた水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られるものであってもよい。
【００２３】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌から、公知の抽出方法、分離方法及び精製方法等を適宜組み合わせて行うことにより単離して製造することができる。
中でも、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること（抽出工程）、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること（精製工程）、を含むレクチンの製造方法により得られるレクチンであることが好ましい。
【００２４】
水系媒体としては、各種の緩衝液、水と混合しうる各種の有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。緩衝液又は有機溶媒と緩衝液の混合物を用いることが好ましい。
緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲に緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。
本発明に用いられる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。
緩衝液の塩濃度については、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜２０ｍＭであることがより好ましい。
また、緩衝液は各種の塩類を更に含むことができ、例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等を本発明における水系媒体として好ましく用いることができる。
【００２５】
また、有機溶媒としては水と混合しうる有機溶媒であれば特に制限なく用いることができるが、中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルを好ましく挙げることができる。有機溶媒と水又は緩衝液を混合する場合の有機溶媒の含有量としては１０質量％〜４０質量％であることが好ましい。
水系媒体とカヤタケ属担子菌から、水系媒体抽出物を得る手法については、特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中でカヤタケ属担子菌を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また粉砕する方法としては、ミキサーやホモジナイザー等、通常の粉砕方法を挙げることができる。
【００２６】
本発明における抽出工程は、水系媒体とカヤタケ属担子菌との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
従って、本発明における抽出工程は、得られるレクチンの純度の観点から、リン酸緩衝化生理食塩水中で、カヤタケ属担子菌を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。
【００２７】
抽出工程により得られた水系媒体抽出物は、次いで、精製工程において、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーに付して精製する。
本発明における担体としては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体であれば特に制限なく用いることができ、ラクトース−アガロース担体、酸処理セファロース担体、任意のガラクトースを含む糖や糖タンパク、糖脂質などを固定化した担体を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。
具体的には、例えば、ラクトース−アガロース担体（Ｊ−オイルミルズ社製）やセファロース担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を塩酸などの酸で処理したもの（酸処理セファロース担体）を挙げることができる。中でも、精製効率の観点から、ラクトース−アガロース担体を用いることが特に好ましい。
【００２８】
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーにおいては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含む担体を充填剤としたカラムを用いることが好ましい。これにより、水系媒体抽出物中のレクチンは、このカラムに吸着する。次いで、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液を用いて、分離及び分画することによって、カラムに吸着したレクチンを、より効率よく精製することができる。カラムからのレクチンの溶出は通常用いられる条件下で行えばよい。
【００２９】
溶出液としては、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶液であれば、特に制限なく用いることができる。ガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖類としては、例えば、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、メチルβ−ガラクトース、メチルα−ガラクトース、ガラクトスクロース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、ラクトサミン、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、ネオラクトース、ガラクトビオース等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも、目的とするレクチンの糖特異性の観点から、ガラクトース、メチルβ−ガラクトース、メチルα−ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトースを用いることが好ましく、精製におけるコストの観点からラクトースが特に好ましい。
【００３０】
前記溶出液に含まれる糖類の濃度には特に制限はないが、例えば、ラクトースを含む溶出液の場合には、溶出液中の糖類の含有量としては、精製効率の点から、溶出液全質量の０．１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．５質量％〜２質量％であることがより好ましい。また、ラクトースを含む溶出液における糖類の濃度としては、精製効率の点から、１０ｍＭ〜１０００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜５００ｍＭであることがより好ましい。なお、ラクトースは市販のものを好適に用いることができる。
【００３１】
前記精製工程としては、ラクトース−アガロース担体を充填剤としたカラムに前記水系媒体抽出物を吸着させ、緩衝液、特に、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて非吸着成分の洗浄を行った後に、ラクトースを１００ｍＭ〜２００ｍＭ含有する溶出液を用いて精製する工程であることが特に好ましい。
【００３２】
また、本発明の製造方法では、アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製工程によって得られた溶出液を再度用いて、アフィニティークロマトグラフィーを繰り返し行ってもよく、更に他のクロマトグラフィーによる追加精製を行ってもよい。
このような他のクロマトグラフィーとしては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を挙げることができる。レクチンを夾雑成分から精度よく分離できる観点から、ゲル濾過クロマトグラフィーであることがより好ましい。
【００３３】
ゲル濾過クロマトグラフィーに用いられる充填剤としては、セファデックス、セファクリル、スーパーロース、スーパーデックス、トヨパール等を用いることができる。本発明のレクチンを精製するためには、分離能の観点からトヨパールやスーパーデックス等が特に好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーの条件としては、通常用いられる条件をそのまま適用すればよく、移動相としては上述したものと同様の水系媒体、例えばリン酸緩衝液等を用いることができる。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた場合には、赤血球凝集活性等に基づいて、目的とするレクチンを含有する分画を特定することができる。
【００３４】
レクチンの製造方法は、各精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含むことができる。これにより、レクチンを高い純度で単離することができる。
透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００３５】
本発明のレクチンは、従来公知のレクチンとは物理化学的性質、及び、糖鎖への結合特異性などの生化学的性質が異なる新規のレクチンである。特にフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖を高い選択性で認識することができるので、これらの糖鎖を検出することを目的とした検査試薬、免疫調節剤、糖質の分離分析用特異的吸着剤等として用いることができる。
【００３６】
本発明の標識レクチンは、前記レクチンと標識化合物とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。標識化合物としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができる。
標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は常法によりレクチンと結合することができる。
【００３７】
本発明のレクチン固定化担体は、前記レクチンと支持担体とを少なくとも含む。支持担体を構成する材料としては、特に制限はなく、例えば、無機材料、有機材料、及びこれらの複合材料を挙げることができる。無機材料としては、金属、半導体、金属酸化物等の金属化合物、セラミックス、ガラス、シリカ等を挙げることができる。また、有機材料としては、ゴム、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン等のポリビニルポリマー類、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ゼラチン等のポリアミド類、セルロース、アガー、アガロース、デキストラン、スターチ等の多糖類等を挙げることができ、糖鎖の分別効率の観点から、アガロース等が好ましい。
また支持担体の構造としては、特に制限はなく、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造、膜構造等を挙げることができる。
【００３８】
レクチンは前記支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。固定化するレクチンの量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせることができる。
活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。
【００３９】
糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０であり、ＮａＣｌ含量が０〜０．５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２含量が０〜１０ｍＭ、好ましくは０〜５ｍＭの緩衝液である。
アフィニティーカラムの洗浄後、溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭ〜２００ｍＭ濃度である。
【００４０】
本発明の糖鎖検出方法は、前記レクチン、前記標識レクチン又は前記レクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含むものである。本発明のレクチンはフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖のみを高い特異性で認識するために、フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖を含有する糖鎖含有物を高い精度で検出することができる。ここで糖鎖含有物には、多糖類、糖脂質、糖タンパク質、細胞、細胞断片等が含まれる。なお本発明の検出方法は、前記レクチン又は前記標識レクチンを用いて、対象とするフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出すること（以下、「検出工程」という）を行うものであれば、レクチンを用いて糖鎖を検出する通常の検出方法に含まれる他の工程を含んでもよい。
【００４１】
レクチンが結合した糖鎖含有物の検出は、例えば、標識化合物によってレクチンを予め標識化することで容易に行うことができる。中でも、感度と検出の容易さから、標識化合物を予めレクチンに結合してレクチンを標識化しておき、標識化合物を検出することによって行うことが好ましい。
標識レクチンの検出手段は、用いられた標識化合物に応じて適宜選択される。例えば、吸光度測定、発光強度測定、蛍光強度測定、目視等により行うことができ、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等を好ましく用いることができる。
【００４２】
本発明の検出方法では、検出された糖鎖含有物を他の物質と分別すること（分別工程）を更に含んでもよい。このような分別方法は、前記レクチン又はレクチン固定化担体を用いて行うことが好ましい。前記レクチンは前記フォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖の少なくとも一方に対して高い特異性で結合できることから、これらの糖鎖含有物を高い精度で他の物質から分別することができる。
【００４３】
レクチンが結合する糖鎖含有物の分別は、例えば、上述したようなレクチンを固定化した担体を用いることによって更に容易に行うことができる。糖鎖化合物の分別方法は、レクチンを固定化した担体に応じて適宜選択され、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂ／Ｆ分離（ｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ分離）等により行えばよい。
なお、分別工程は必ずしも検出工程と別個独立した工程でなくてもよく、検出することと分別することとが同時に行われても、連続して行われてもよい。
【００４４】
本発明の糖鎖検出方法では、糖鎖検出感度、糖鎖分別効率の観点から、本発明のレクチンとこのレクチンにより認識される糖鎖との相互作用強度が、他の糖鎖との相互作用強度の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましく、１０００倍以上であることが更に好ましい。レクチンと糖鎖との相互作用強度は、例えば、赤血球凝集反応阻害試験、溶出までの時間の比較、結合量（重さ）等、通常、この用途に用いられる比較可能な測定法であれば、特に制限されず用いることができる。
【００４５】
なお、本発明のレクチンの製造方法及び糖鎖検出方法における糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、表面プラズモン共鳴装置、電気泳動等も、周知の方法で使用することができる。
【００４６】
本発明の判定薬は、前記レクチンを含み、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の有無を判定するものである。本発明のレクチンは、上述したようにフォルスマン抗原糖鎖とＡ型糖鎖を高い精度で認識することができるので、本判定薬を用いることによって、試料中の微量なフォルスマン抗原糖鎖やＡ型糖鎖でもその有無を確実に判定することができる。
【００４７】
例えばフォルスマン抗原糖鎖は、例えばヒトに対して異種の抗原になるので、この異種抗原が対象物、例えば試料中に含まれているか否かの判定や、異種抗原が含まれている試料であるか否かの判定に利用することができる。またＡ型糖鎖は、血液型の判定や、この糖鎖が試料中に含まれているか否かの判定、この糖鎖を含む試料であるか否かの判定などに広く利用することができる。従って、本発明の判定薬を用いることによって、例えば、所定の目的物の種や型に対して適合性に欠ける又は適合性を有する試料の選別を簡便に行うことができる。
また、被検体の血液等、液体試料や、基板上にスポットされて固定化された乾燥試料に対して本発明のレクチンを接触させること及び、この接触により前記レクチンに結合し得る物質を検出すること含む検出方法も、本発明に含まれる。
【００４８】
なお、ＡＢＯ血液型（抗原）は血液だけでなく、広く各種臓器にも発現している。そのため、本発明のレクチンは、前記判定薬としてだけでなく、例えば、ＡＢＯ血液型不適合時の一時的なブロック剤や補助剤としての利用も考えられ、さらには、その合成産物等を利用した血液や臓器におけるＡ型糖鎖抗原のブロック剤や補助剤等として利用することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００５０】
［実施例１］
（１）レクチンＣＮＡ−Ｉの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体粉末（日本きのこ研究所製）０．５ｍｇに、２０ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０ ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１ ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした
Ｃカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１０×１００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約２６ｍｌ）にて洗浄した後、０．１Ｍのラクトース溶液を溶出液として用いて２５℃、０．５ｍｌ／分の条件下で溶出し、１ｍｌずつ回収し、ラクトース結合性レクチン含有画分Ｎｏ．４３〜４６を得た（合計吸着率６８％）。
レクチンを含有する各画分は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）及び後述する赤血球凝集活性を測定することによって同定した。
【００５１】
（２）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球、または、不純物を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
９６ウェルタイタープレートの一レーンにＰＢＳを各２０μｌ入れ、ウェルに、レクチン溶液又は各クロマトグラフィーにおける回収画分を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。赤血球凝集活性は、凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とした。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
上記（１）で得られたレクチン含有画分Ｎｏ．４３〜４６は、それぞれ、赤血球凝集力価（力価）６４、力価５１２、力価２５６、力価３２として、赤血球凝集活性を確認することができた。
なお、非吸着分を回収して再度ラクトース−アガロース充填したカラムに付したところ、非吸着分には、ラクトース−アガロース吸着分がほとんど含有されていなかった（０．２％吸着率）。
【００５２】
（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
上記（１）により得られたレクチン含有画分を、電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液、分子量マーカーは共に１μｌ使用し、製品プロトコール及び常法に従って泳動を行い、相対移動度から分子量を推定したところ、約１７，０００付近に複数のレクチンが存在することが示唆された。
次いで、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５３】
（３）ゲル濾過による分画
上記（１）により得られたレクチン含有画分１ｍｌ（Fr.44）を限外ろ過で２００μｌにまで濃縮し、フィルターろ過したのち、１００μｌを、ＰＢＳで平衡化したゲル濾過用カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製；φ７．８×３００ｍｍ））を用いて、２５℃で０．５ｍｌ／分の流速の条件下でゲル濾過を２回にわけて行った。ゲル濾過回収液に対して、上記と同様にして２８０ｎｍにおける吸光度及び赤血球凝集活性を測定すると共に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、赤血球凝集活性及びＯＤ２８０ｎｍが共に高い画分を特定し、回収した。回収された画分は、限外ろ過膜（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製；ＭＷＣＯ１０，０００）で濃縮した後に、各画分を凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して精製量を測定した。
上記、高い赤血球凝集活性を示したレクチン含有画分では、分子量１３，０００付近と１７，０００付近にバンドを確認したため、これをＣＮＡ−Ｉと決定した。
【００５４】
［実施例２］
（１）レクチンＣＮＡ−Ｉの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体（福島県で採取）約４００ｇを凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して、ハイイロシメジ子実体凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末２０ｇに、２００ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした。
カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１６×２００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を２５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約１００ｍｌ）にて洗浄した後、０．１Ｍのラクトース／ＰＢＳ溶液を溶出液として用いて７℃、１ｍｌ／分の条件下で溶出した。ＯＤ２８０のピーク赤血球凝集活性に基づいてレクチン含有画分を特定し、ＯＤ２８０のピークを示すと共に赤血球凝集活性の高い画分をレクチン含有画分として得た。
活性画分を回収した回収液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ：６−８，０００（平面幅１４．６ｍｍ）に入れ、１００倍量の蒸留水による７℃での透析を３回行った。
次いで、実施例１と同様にして、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５５】
（２）ゲル濾過による分画
上記（１）により得られたレクチン含有画分８０ｍｇを２ｍｌのＰＢＳに溶解した試料溶液に対し、ＰＢＳで平衡化したゲル濾過用カラム（ガラスカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ２６×８００ｍｍ）にスーパーデックス Ｇ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を４２４ｍｌ充填）を用いて、７℃で１ｍｌ／分の流速の条件下でゲル濾過を行った。ゲル濾過回収液に対して、上記と同様にしてＯＤ２８０ｎｍにおける吸光度及び赤血球凝集活性を測定すると共に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、赤血球凝集活性及びＯＤ２８０ｎｍが共に高い画分を特定し、回収した。回収された画分は、限外ろ過膜（Ultrafree、Millipore社製；UFC3LGC00、ＭＷＣＯ１０，０００）で濃縮した後に、各画分を凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して、精製量を測定した。精製できたＣＮＡ−Ｉは１１．８６ｍｇであった。更にウサギ赤血球凝集活性を測定したところ、力価 １０２４０ (１mg/ml)、および、最小凝集濃度０．０３３（μｇ／ｍｌ）であった。
【００５６】
（３）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
上記（２）で得られたレクチンＣＮＡ−Ｉに対して、煮沸処理を行ったもの（試料Ａ）及び煮沸処理を行わないもの（試料Ｂ）の２種にした以外は前述したものと同様にしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。結果を図１に示す。なお図１においてレーン１は試料Ａ、レーン２は試料Ｂ、Ｍはマーカーを示す。
その結果、試料Ａの場合には１３，０００及び１７，０００、試料Ｂの場合には４０，０００及び４１，０００にそれぞれバンドを確認することができた（図１参照）。
（４）ゲルろ過による分子量測定
上記のようにして得られたレクチンＣＮＡ−Ｉについて、標準用試料Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量：80,000）、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（分子量：67,000）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量：47,000）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ （分子量：29,000）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｂ（分子量：13,700）を用いて分子量を推定したところ、約８０，０００であった。
【００５７】
［実施例３］
実施例２で得られたレクチンＣＮＡ−Ｉについて、以下のような評価を行った。
（１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
レクチンＣＮＡ−Ｉ １０μｇを、ＴＡ（０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとＣＮＡ−ＩのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてＡｕｔｏｆｌｅｘ(ブルカーダルトニクス社製)を用い、ＬＰモードでＣＮＡ−Ｉの分子量を測定した。その結果、ＣＮＡ−Ｉの分子量は１６，２６０および１１，０４２であった。
【００５８】
（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列
ＣＮＡ−ＩのＮ−末端領域のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーとしてＰＰＳＱ−２１（島津製作所社製）を用いて解析したところ、アミノ酸配列（配列番号１）又は（配列番号２）であることが分かった。得られた２つのアミノ酸配列をＦＡＳＴおよびＢＬＡＳＴで相同性検索したところ、相同性を示すタンパクがないことから、上記レクチンＣＮＡ−Ｉは、新規なレクチンであることがわかった。
【００５９】
（３）温度安定性
５０μｇのＣＮＡ−Ｉを生理食塩水１ｍｌに溶解し、各試験温度で３０分間加熱した。直ちに氷冷し１０分後に上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図２に示した。
図２から、本発明のレクチンは４℃〜６０℃まで比較的安定であり、特に４〜６０℃では殆ど温度の影響を受けないことが分かった。ただし７０℃以上で活性が急激に低くなった。
【００６０】
（４）ｐＨ安定性
５０μｇのＣＮＡ−Ｉを生理食塩水１ｍｌに溶解し、これを試験管に分取した。等量の下記の各ｐＨ緩衝液をそれぞれ加え、４℃にて２４時間インキュベートした後、上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図３に示した。図３から、本発明のレクチンＣＮＡ−ＩはｐＨ３〜１１で安定しており、特にｐＨ４〜１１で良好な安定性を示すことが分かった。
−ｐＨ緩衝液−
ｐＨ２．０ ： ２０ｍＭ 塩化カリウム−塩酸緩衝液
ｐＨ３．０ ： ２０ｍＭ 塩化カリウム−塩酸緩衝液
ｐＨ４．０ ： ２０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０ ： ２０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０ ： ２０ｍＭ リン酸緩衝液
ｐＨ７．０ ： ２０ｍＭ リン酸緩衝液
ｐＨ８．０ ： ２０ｍＭ トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)緩衝液
ｐＨ９．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１０．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１１．０ ： ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
なお、各緩衝液は０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含む。
【００６１】
（５）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、血漿及び白血球および不純物を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
【００６２】
ａ）赤血球凝集活性の測定
９６ウェルタイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに、レクチン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性として表１に示した。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
【００６３】
ｂ）ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験
ウサギ赤血球凝集活性試験において、ウサギ保存血液の代わりにヒツジ保存血液（日本バイオテスト社製）、ブタ保存血液（日本バイオテスト社製）、ヒト保存血液（Biotest社製）を用いた以外は同様にして、ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験を行った。結果を表１に示した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
（６）ウサギ赤血球凝集阻害試験
表２及び表３の３２種の糖タンパク質および糖を適量秤量し、ＰＢＳを添加し、表２及び表３記載の濃度に調製した。上記（実施例２）で得られたＣＮＡ−Ｉのウサギ赤血球凝集活性を測定し、赤血球が凝集する最低希釈倍率が２〜４倍になるようこれらをＰＢＳで希釈した。次いで９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルにＰＢＳを２５μｌずつ入れ、これにレクチン溶液を５０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。このウェルにそれぞれ、上記で希釈した試料を２５μｌずつ添加し、室温で６０分間放置後、４％ウサギ赤血球液を２５μｌずつ添加し、室温で１時間放置後、凝集阻害の有無を確認した。結果を下記表２及び表３に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
上記表２および３の結果から、実施例２で得られたレクチン（ＣＮＡ−Ｉ）は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、メリビオース、ラフィノースに特異的に結合することが分かった。糖タンパクでは、ムチンに結合することがわかった。
【００６９】
［実施例４］
（７）特異性試験（糖鎖の検出）
（ａ）オリゴ糖の準備
実施例に使用したピリジルアミノ化（ＰＡ−）糖鎖を、図４及び図５に示す。ＰＡ糖鎖は、タカラバイオ社、生化学バイオビジネス社ならびに増田化学工業社などから購入した。もしくは、未標識の糖鎖や糖鎖を酵素消化して得た糖鎖等をＧｌｙｃｏＴＡＧ（登録商標、タカラバイオ社製）でピリジルアミノ化した。
その他の標識化糖鎖は、図６に示す。パラニトロフェニル（ｐＮＰ−）糖鎖およびパラメトキシフェニル（ｐＭＰ−）糖鎖は生化学バイオビジネス社、東京化成社、シグマ社、トロント・リサーチ・ケミカル社、カルビオケム社、から購入したものを使用した。
【００７０】
（ｂ）レクチンカラムの調製
０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）中にレクチンを溶解し、ＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）へその製造者マニュアルに従って結合させた。０．８％ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、ＴＢＳ緩衝液）中にレクチン−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ×１０ｍｍ，３１．４μｌ）に充填した。
【００７１】
（ｃ）フロンタルアフィニティクロマトグラフィー
ＦＡＣ自動分析装置（FAC-1、島津製作所社製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ−１装置に接続した。流速およびカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎおよび２５℃に保った。前記ＴＢＳ緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ〜４ｍｌ）のＰＡ−糖鎖（３．７５ｎＭ又は７．５ｎＭ）およびｐＮＰ−糖鎖およびｐＭＰ−糖鎖（１μＭ）を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。
【００７２】
ＰＡ糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
４９種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、図７に示すとおり、ＣＮＡ−Ｉは、フォルスマン抗原糖鎖と、Ａ型糖鎖（６糖）にのみ結合である溶出の遅れが確認できた。
【００７３】
さらに、糖鎖群を増やし、糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定する同様の実験をおこなった。
また、ｐＮＰ-糖鎖およびｐＭＰ−糖鎖はＵＶ吸収強度（検出波長 ２８０ｎｍ）でモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−Ｆｕｃ、番号１０１１）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
【００７４】
ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０および有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求めた。
【数２】
【００７５】
パラメトキシフェニル（ｐＭＰ−）標識フォルスマン抗原糖鎖（番号１１０７)を０μＭ〜０．９μＭになるようＴＢＳ緩衝液で作製した。上記同様分析を行い、各濃度における相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−Ｆｕｃ、番号１０１１）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定し、結合定数（Ｋａ）および有効リガンド量（Ｂｔ）を求めた。その結果、結合定数（Ｋａ）＝２．４４×１０６Ｍ−１および有効リガンド量（Ｂｔ）＝０．０１５ｎｍｏｌであった。結合した糖鎖の相互作用強度および結合定数を算出した。結果を表４と図８に示す。
【００７６】
１５１種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、表４と図８に示すとおり、ＣＮＡ−Ｉは、番号７１７のフォルスマン抗原糖鎖、番号７１９のＡ型糖鎖（４糖）、番号７２０のＡ型糖鎖（６糖）にのみ結合性を示した。
【００７７】
【表４】
【００７８】
従って、レクチンＣＮＡ−Ｉは、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して高い特異性を示すので、これらの糖鎖を含む糖鎖含有物のみを精度よく検出し、分別するために使用することができ、また試料中のこれらの糖鎖の有無を精度よく判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの温度安定性を示す図である。
【図３】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−ＩのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ＰＡ−）を示す図である。
【図５】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ＰＡ−）を示す図である。
【図６】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ｐＮＰ−，ｐＭＰ−）を示す図である。
【図７】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【図８】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−Ｉの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、
（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、
（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する。
【請求項２】
前記レクチンのＮ−末端領域のアミノ酸配列が、配列番号１及び配列番号２の少なくとも一方である請求項１に記載のレクチン。
【請求項３】
フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のレクチン。
【請求項４】
カヤタケ属担子菌から得られた水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチン。
【請求項５】
前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチン。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること、を含むレクチンの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
【請求項８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチン、請求項７に記載の標識レクチン又は請求項８記載のレクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含む糖鎖検出方法。
【請求項１０】
前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む請求項９に記載の糖鎖検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンを含む、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の存在の有無を判定する判定薬。
【請求項１】
以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜６０，０００であり、
（２）ゲル濾過法による分子量が６０，０００〜１００，０００であり、
（３）フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に結合する。
【請求項２】
前記レクチンのＮ−末端領域のアミノ酸配列が、配列番号１及び配列番号２の少なくとも一方である請求項１に記載のレクチン。
【請求項３】
フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のレクチン。
【請求項４】
カヤタケ属担子菌から得られた水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することにより得られる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチン。
【請求項５】
前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチン。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を有する糖類を含有する溶出液と、ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること、を含むレクチンの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
【請求項８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチン、請求項７に記載の標識レクチン又は請求項８記載のレクチン固定化担体を用いて、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方を含む糖鎖含有物を検出することを含む糖鎖検出方法。
【請求項１０】
前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む請求項９に記載の糖鎖検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のレクチンを含む、フォルスマン抗原糖鎖及びＡ型糖鎖の少なくとも一方の存在の有無を判定する判定薬。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２０９０７０（Ｐ２００９−２０９０７０Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２６６５（Ｐ２００８−５２６６５）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（３０４０２３３１８）国立大学法人静岡大学 (416)
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（３０４０２３３１８）国立大学法人静岡大学 (416)
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]