新規抗体処方物
本発明は、Ｐ−セレクチンに対する抗体の医薬処方物、前記処方物の調製のためのプロセスおよび使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ−セレクチンに対する抗体の医薬処方物、前記処方物の調製のための方法および使用に関する。
【０００２】
第１の局面において、本発明は、
１〜２００mg/mLの抗体；
１〜１００mMのバッファー；
０．００１〜１％の界面活性剤；
（ａ）１０〜５００mMの安定化剤；または
（ｂ）１０〜５００mMの安定化剤および５〜５００mMの浸透圧剤；または
（ｃ）５〜５００mMの浸透圧剤
をｐＨ４．０〜７．０の範囲で含み、前記抗体はＰ−セレクチンに対する抗体である、医薬処方物に関する。
【０００３】
本発明による処方物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成した液体でありうる。
【０００４】
Ｐ−セレクチンに対する抗体は、例えば米国特許４，７８３，３９９、ＷＯ９３／０６８６３、Geng et al (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318)、ＷＯ９３／２１９５６およびＷＯ２００５／１００４０２から公知である。
【０００５】
Ｐ−セレクチンに対する例示的な抗体は、ＷＯ２００５／１００４０２に記載されており、そして前記抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が、重鎖ＣＤＲ３配列である配列番号３８、３９、４０、４１または４２からなる群より選択されることを特徴とする抗体を含む。
【０００６】
好ましい抗体は、
ｉ）可変重鎖が、ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とする、可変重鎖および可変軽鎖を含むこと（ＣＤＲ１は配列番号２９、３０、３１、３２からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号３３、３４、３５、３６、３７からなる群より選択され、ＣＤＲ３は配列番号３８、３９、４０、４１、４２からなる群より選択され、前記ＣＤＲは、互いに独立して選択される）、
ｉｉ）可変軽鎖が、ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号４３、４４から選択され、ＣＤＲ２は配列番号４５、４６から選択され、そしてＣＤＲ３は配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２から選択され、前記ＣＤＲは互いに独立して選択されること、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号９のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１４のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１３のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１６のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１５のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１８のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１７のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号２０のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１９のＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲとして配列番号２２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号２１のＣＤＲを含むこと、
ｉｖ）前記抗体がＰ−セレクチンに結合し、そして、アミノ酸配列の配列番号２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号４によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号６によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号５によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号８によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号７によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１０によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号９によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１４によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１３によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１６によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１５によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１８によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１７によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２０によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１９によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号２１によって規定される軽鎖可変ドメインからなる群より独立して選択される可変重鎖領域および可変軽鎖領域を含むこと、
ｖ）重鎖可変領域が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むこと、
ｖｉ）軽鎖可変領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする。
【０００７】
ＣＤＲ配列を、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定することができる。各鎖上のＣＤＲは、フレームワークアミノ酸によって分離されている。配列番号１〜２２のＣＤＲは、配列番号２９〜５２において示される。
【０００８】
１つの態様において、抗体はＰ−セレクチンに結合し、そして補因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃレセプターには結合しないことを特徴とする。これらの抗体は補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を誘起しない。好ましくは、この抗体はＰ−セレクチンに結合し、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含み、そして補因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする。より好ましくは、この抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０００９】
別の態様において、抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準で周知であり、そして例えばKabat (例えばJohnson and Wu, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号２４、２５、２６、２７および２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号２３のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本明細書において使用する「Ｐ−セレクチンへの結合」という用語は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)または精製Ｐ−セレクチンまたはＰ−セレクチンＣＨＯトランスフェクタントのいずれかがマイクロタイタープレート上にコーティングされているＥＬＩＳＡのいずれかにおけるＰ−セレクチンへの抗体の結合を意味する。
【００１１】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、前記抗体は表面に結合されており、そしてＰ−セレクチンの結合を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定する。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋｄ（解離定数）およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という項によって定義される。さらに別の態様において、抗体は１０−８以下、好ましくは約１０−１１〜１０−９ＭのＫＤを示す（実施例を参照されたい）。従って、好ましい抗体は前記したようなものであり、前記抗体はＰ−セレクチンにＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０−８Ｍ未満のＫＤ値で結合し、好ましくはＫＤ範囲は１０−１１〜１０−９Ｍである。
【００１２】
好ましくは、前記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒトサブタイプである。
【００１３】
より好ましくは、前記抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、あるいはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスによる番号付け）における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。
【００１４】
Ｐ−セレクチン特異的ＥＬＩＳＡにおいて、精製Ｐ−セレクチンをマイクロタイタープレート上にコーティングし、そしてＰ−セレクチンへの抗体の結合をビオチニル化抗ヒトＩｇＧおよび通常のＥＬＩＳＡ工程を用いて検出する。このアッセイにおけるＥＣ５０値は、好ましくはＰ−セレクチンＣＨＯ細胞上で０．００２〜０．０３μg/mlの範囲であり、すなわち、好ましい抗体は、Ｐ−セレクチン結合に対するＥＣ５０値が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰ−セレクチン提示ＣＨＯ細胞上で０．００２〜０．０３μg/mlの範囲であるものである。Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯトランスフェクタントがマイクロタイタープレート上にコーティングされているアッセイにおいて、ＥＣ５０値は、０．０１〜０．０８μg/ml、好ましくは０．０１〜０．０４μg/mlの範囲である。
【００１５】
Ｅ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントのＥＣ５０値は、好ましくは１００μg/ml超である。好ましい抗体は、Ｐ−およびＥ−および／またはＬ−セレクチンがマイクロタイタープレート上にコーティングされているＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０値によって測定したところ、Ｅ−および／またはＬ−セレクチンよりも少なくとも１０００倍より特異的にＰ−セレクチンに結合することを特徴とする。
【００１６】
前記抗体は、好ましくは、Ｐ−セレクチンフラグメントａａ６０〜７５（スイスプロット配列Ｐ１６１０９）の存在下においてＰ−セレクチンに結合でき、そして／またはＡＴＣＣアクセッションナンバーＨＢ１１０４１と称される細胞株によって分泌される抗体のＰ−セレクチンへの結合を競合的に阻害しない。
【００１７】
前記抗体は、好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットにおいて血小板膜糖タンパク質ＧＰＩｂαとＰ−セレクチンとの相互作用を阻害しない。ＥＬＩＳＡにおいてＧＰＩｂαの可溶性細胞外部分であるグリコカリシンを、記載のように(Romo et al., J Exp Med 190:803 (1999)）、マイクロタイタープレートのウェル上に固定し、そしてＰ−セレクチンＨｕＭａｂｓとのプレインキュベーション後の精製Ｐ−セレクチンの結合を、ポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて検出した。
【００１８】
好ましい抗体は、それがＣ３タンパク質に結合しないことを特徴とし、より好ましくは補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を誘起しないことを特徴とする。さらに、前記抗体は、ＮＫエフェクター細胞上のＦｃγレセプターに結合しないことを特徴としうる。好ましくは、前記抗体は、それが、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、あるいはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスによる番号付け）における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。好ましい抗体は、それが抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を誘起しないことを特徴とする。
【００１９】
より好ましい抗体は、それらがＰ−セレクチンに結合し、そしてそれらが、アミノ酸配列の配列番号１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号４によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号５によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号６によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号７によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号８によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号９によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１４によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１５によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１６によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１７によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１８によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１９によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２によって規定される重鎖可変ドメインからなる群より独立して選択される可変領域を含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記抗体は、アミノ酸配列の配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号４によって規定される重鎖可変ドメインを含む。
【００２１】
好ましい抗体は、前記抗体が、ヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体であるか、または補因子Ｃ１ｑへの非結合を引き起こす少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むことを特徴とする。これらの変異抗体は、例えば、配列番号２５または配列番号２６および配列番号２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
「変異」抗Ｐ−セレクチン抗体は、本明細書において、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって、「親」抗Ｐ−セレクチン抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なっている分子をいう。好ましくは、前記変異体は、親抗体の１つ以上の定常領域または可変領域において、より好ましくは定常領域において１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、前記変異体は、親抗体の１つ以上の可変領域において、少なくとも１つ、例えば約１〜約１０、好ましくは約２〜約５個の置換を含みうる。通常、前記変異体は、親抗体定常および／または可変ドメイン配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するだろう。
【００２３】
この配列に対しての同一性または相同性は、本明細書において、配列をアラインさせて、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一率を達成した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、または内部における伸長、欠失または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすとは解釈されないものとする。前記変異体は、ヒトＰ−セレクチンに結合する能力を保持し、そして好ましくは、親抗体の特性よりも優れた特性を有する。例えば、前記変異体は、より強い結合親和性、重症虚血肢または末梢動脈閉塞性疾患（ＣＬＩ／ＰＡＯＤ）に関連した疾患を処置する増強された能力を有しうる。
【００２４】
本明細書において特に関心のある変異抗体は、Ｆｃγレセプターへの結合の消失のために、親抗体と比較した場合に接着アッセイにおいて少なくとも約４倍の阻害活性の増強を示すものである。
【００２５】
本明細書における「親」抗体は、前記変異体の調製のために使用されるアミノ酸配列によってコードされるものである。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、そして存在する場合には、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体でありうる。
【００２６】
本発明による抗体は、さらに、本発明による抗体の前記の特徴に影響を及ぼさないかまたは変化させない、「保存的な配列改変」であるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変を有するこのような抗体を含む。改変は、当技術分野において公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲにより媒介される突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ヒト抗Ｐ−セレクチン抗体において予測される非必須アミノ酸残基を、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができる。
【００２７】
アミノ酸置換を、Riechmann et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって行なうことができる。
【００２８】
さらに好ましい抗体は、配列番号２３によって規定されるようなκ軽鎖定常領域を含む。
【００２９】
さらに好ましい抗体は、ＩｇＧ１ｖ１（ＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１（Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓによって特定される））、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ）およびＩｇＧ４ｖ１（Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ）として定義されるものである。
【００３０】
配列表の記載
配列番号１ ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１軽鎖可変ドメイン
配列番号２ ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１重鎖可変ドメイン
配列番号３ ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２軽鎖可変ドメイン
配列番号４ ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２重鎖可変ドメイン
配列番号５ ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３軽鎖可変ドメイン
配列番号６ ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３重鎖可変ドメイン
配列番号７ ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４軽鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号８ ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４重鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号９ ＨｕＭａｂ００４（II）のＬＣ１００４−００４軽鎖（II）可変ドメイン
配列番号１０ ＨｕＭａｂ００４（II）のＬＣ１００４−００４重鎖（II）可変ドメイン
配列番号１１ ＨｕＭａｂ００５の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２ ＨｕＭａｂ００５の重鎖可変ドメイン
配列番号１３ ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１４ ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）の重鎖可変ドメイン
配列番号１５ ＨｕＭａｂ０１０（II）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１６ ＨｕＭａｂ０１０（II）の重鎖可変ドメイン
配列番号１７ ＨｕＭａｂ０１０（III）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１８ ＨｕＭａｂ０１０（III）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９ ＨｕＭａｂ０１１の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０ ＨｕＭａｂ０１１の重鎖可変ドメイン
配列番号２１ ＨｕＭａｂ０１７の軽鎖可変ドメイン
配列番号２２ ＨｕＭａｂ０１７の重鎖可変ドメイン
配列番号２３ κ軽鎖定常領域
配列番号２４ γ１重鎖定常領域
配列番号２５ γ１重鎖定常領域ＰＶＡ２３６／ＧＬＰＳＳ３３１（ＩｇＧｖ１）
配列番号２６ γ１重鎖定常領域Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１ｖ２）
配列番号２７ γ４重鎖定常領域
配列番号２８ γ４重鎖定常領域Ｓ２２８／Ｌ２３５Ｅ（ＩｇＧ４ｖ１）
配列番号２９〜３２ 重鎖ＣＤＲ１
配列番号３３〜３７ 重鎖ＣＤＲ２
配列番号３８〜４２ 重鎖ＣＤＲ３
配列番号４３〜４４ 軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４５〜４６ 軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４７〜５２ 軽鎖ＣＤＲ３
【００３１】
１つの態様において、本発明は、前記抗体が１０〜１５０mg/mL、好ましくは１０〜５０mg/mLの範囲の量で存在する処方物を提供する。Ｐ−セレクチンに対するアンタゴニストモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞株によって産生しうる。好ましいハイブリドーマ細胞株はｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（抗体ＨｕＭａｂ００１）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（抗体ＨｕＭａｂ００２）およびｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（抗体ＨｕＭａｂ０１７）であり、これらは特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託された：
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明による処方物において有用な抗体は、好ましくは組換え手段によって、例えばＷＯ２００６／０７２５６４に記載されるものによって産生される。そのような方法は、当技術分野の水準で広く公知であり、そして、その後の抗体ポリペプチドの単離および通常は薬学的に許容されうる純度への精製を伴う、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクター中に挿入する。発現を、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはE.coli細胞のような適切な原核または真核宿主細胞中で行い、そして抗体を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および例えばＷＯ２００６／０７２５６４に記載されるような当技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって細胞（上清または溶解後の細胞）から回収する。
【００３４】
本明細書において使用する「バッファー」という用語は、医薬調製物のｐＨを安定化する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。適切なバッファーは、当技術分野において周知であり、そして文献において見出されうる。好ましい薬学的に許容されうるバッファーは、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー、およびリン酸バッファーを含むがそれらに限定されない。さらに好ましいバッファーは、当技術分野において公知の酸または塩基を用いてｐＨ調整したＬ−ヒスチジンまたはＬ−ヒスチジンとＬ−ヒスチジン塩酸塩との混合物を含む。上記のバッファーは、一般に、約１mM〜約１００mM、好ましくは約５mM〜約５０mM、より好ましくは約１０〜２０mMの量で使用される。使用するバッファーとは独立して、ｐＨを、約４．０〜約７．０、好ましくは約５．０〜約６．５、さらにより好ましくは約５．５〜約６．０を含む値に、当技術分野において公知の酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、硫酸およびクエン酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムを用いて調整することができる。
【００３５】
本明細書において使用する「界面活性剤」という用語は、撹拌および剪断のような機械的ストレスに対してタンパク質処方物を保護するために使用される薬学的に許容されうる賦形剤を示す。薬学的に許容されうる界面活性剤の例は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。好ましいポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、ポリソルベート２０（商標Ｔｗｅｅｎ２０（商標）の下に販売されている）およびポリソルベート８０（商標Ｔｗｅｅｎ８０（商標）の下に販売されている）である。好ましいポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーは、名称Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の下に販売されているものである。好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルは、商標Ｂｒｉｊ（商標）の下に販売されているものである。好ましいアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルは、商標Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの下に販売されている。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標））およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））を使用する場合、それらは、一般に、約０．００１〜約１％、好ましくは約０．００５〜約０．１％、より好ましくは約０．０１％〜約０．０４％ｗ／ｖ（重量／容量）の濃度範囲で使用される。
【００３６】
「安定化剤」という用語は、製造、貯蔵および適用の間の化学的および／または物理的分解から活性医薬成分および／または処方物を保護する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。タンパク質医薬の化学的および物理的分解経路は、Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77、Wang (1999) Int J Pharm 185(2):129-88、Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2):1-60およびChi et al. (2003) Pharm Res 20(9):1325-36によって概説されている。安定化剤は、本明細書中以下で定義するような、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えばＥＤＴＡを含むがそれらに限定されない。本明細書中上記のように、安定化剤は、約１０〜約５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００mM〜約３００mMの量で処方物中に存在することができる。
【００３７】
本明細書において使用する「糖」という用語は単糖またはオリゴ糖を示す。単糖は、酸によって加水分解可能でない単量体炭水化物であり、単純糖およびその誘導体、例えばアミノ糖を含む。単糖の例は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸を含む。オリゴ糖は、分岐または鎖状のいずれかの、グリコシド結合を介して連結された１個より多くの単量体糖単位からなる炭水化物である。オリゴ糖内の単量体糖単位は、同一であることができ、または異なることができる。単量体糖単位の数に応じて、オリゴ糖は、ジ、トリ、テトラ、ペンタなどの糖である。多糖とは対照的に、単糖およびオリゴ糖は水溶性である。オリゴ糖の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびラフィノースを含む。好ましい糖はスクロースおよびトレハロースであり、トレハロースが最も好ましい。
【００３８】
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基に対してα位に位置するアミノ部分を有する薬学的に許容されうる有機分子を示す。アミノ酸の例は、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンを含む。アミノ酸は、一般に、約１０〜５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用される。
【００３９】
本明細書において使用する「ポリオール」という用語は、１個より多いヒドロキシ基を有する薬学的に許容されうるアルコールを示す。適切なポリオールは、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびその組合せを含むがそれらに限定されない。ポリオールを、約１０mM〜約５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用することができる。
【００４０】
安定化剤内の１つのサブグループは凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）である。「凍結乾燥保護剤」という用語は、凍結乾燥プロセス、その後の貯蔵および再構成の間の不安定化条件に対して不安定な活性成分（例えばタンパク質）を保護する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。凍結乾燥保護剤は、糖、ポリオール（例えば糖アルコールのような）およびアミノ酸からなる群を含むがそれらに限定されない。好ましい凍結乾燥保護剤を、糖、例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、ノイラミン酸、アミノ糖、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−メチルグルコサミン（「メグルミン」）、ポリオール、例えばマンニトールおよびソルビトール、ならびにアミノ酸、例えばアルギニンおよびグリシンまたはその混合物からなる群より選択することができる。凍結乾燥保護剤は、一般に、約１０〜５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用される。
【００４１】
安定化剤内の１つのサブグループは抗酸化剤である。「抗酸化剤」という用語は、活性医薬成分の酸化を防止する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、クエン酸、ＥＤＴＡを含むがそれらに限定されない。抗酸化剤を、約０．０１〜約１００mMの量、好ましくは約５〜約５０mMの量、より好ましくは約５〜約２０mMの量で使用することができる。
【００４２】
本明細書において使用する「浸透圧剤」という用語は、薬学的に許容されうる浸透圧剤を示す。浸透圧剤は、処方物の浸透圧を調節するために使用される。処方物は、低張性、等張性、または高張性であることができる。等張性は、一般に、通常ヒト血清のものに対する、溶液の相対的浸透圧に関する。本発明による処方物は、低張性、等張性、または高張性であることができるが、好ましくは等張性である。等張性処方物は、液体、または固体形態から、例えば凍結乾燥形態から再構成された液体であり、そしてそれが比較される何らかの他の溶液、例えば生理塩溶液および血清と同じ浸透圧を有する溶液を示す。適切な浸透圧剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖、特にグルコースの群からの任意の成分を含むがそれらに限定されない。浸透圧剤は、一般に、約５mM〜約５００mMの量で使用される。
【００４３】
安定化剤および浸透圧剤内に、両方の方法で機能することができる化合物の群が存在する。すなわち、それらは同時に安定化剤および浸透圧剤であることができる。その例を、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、ポリエチレングリコールおよび塩の群において見出すことができる。同時に安定化剤および浸透圧剤であることができる糖の一例はトレハロースである。
【００４４】
組成物はまた、補助剤、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、および様々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっての両方で保証されうる。保存料は、一般に、約０．００１〜約２％（ｗ／ｖ）の量で使用される。保存料は、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムを含むがそれらに限定されない。
【００４５】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「液体」という用語は、大気圧下で少なくとも約２〜約８℃の温度で液体である処方物を示す。
【００４６】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「凍結乾燥物」という用語は、それ自体当技術分野において公知の凍結乾燥方法によって製造される処方物を示す。溶媒（例えば水）は、凍結およびそれに続く真空下での昇華および上昇した温度での残存する水の脱着によって除去される。凍結乾燥物は、通常、約０．１〜５％（ｗ／ｗ）の残存水分を有し、そして粉末または物理的安定ケーク（cake）として存在する。凍結乾燥物は、再構成媒質の添加後の急速な溶解によって特徴付けられる。
【００４７】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「再構成処方物」という用語は、凍結乾燥され、そして再構成媒質の添加によって再溶解される処方物を示す。再構成媒質は、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば５％グルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝溶液）を含むがそれらに限定されない。
【００４８】
本発明による処方物は、喘息またはアレルギー性疾患に罹患した患者のために利点をもたらす新たなそして発明性の特性を有する。
【００４９】
本発明はさらに、喘息の処置のための医薬の製造のための本発明による処方物の使用を含む。
【００５０】
本発明の組成物を、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。
【００５１】
特定の投与経路によって本発明の組成物を投与するために、組成物を希釈剤中で希釈することが必要でありうる。薬学的に許容されうる希釈剤は、生理食塩水、グルコース、リンゲルおよび水性緩衝溶液を含む。
【００５２】
本明細書において使用する「非経口的投与」および「非経口で投与される」という用語は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含むがそれらに限定されない。
【００５３】
前記組成物は無菌でなければならず、そして組成物がシリンジによって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張性緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物であることができる。
【００５４】
本発明による処方物を、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）または医薬の技術分野において公知のもののような任意の他の非経口投与手段によって投与することができる。
【００５５】
本発明による処方物を、当技術分野において公知の方法、例えば限外濾過−透析濾過、透析、添加および混合、凍結乾燥、再構成、およびその組合せによって調製することができる。本発明による処方物の調製の例を、本明細書中以下に見出すことができる。
【００５６】
実施例
実施例１：液体処方物の調製
ＷＯ２００５／１００４０２に記載のように調製しそして発酵しそして精製したｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンは、約６．０のｐＨの２０mMヒスチジンバッファー中または約５．２のｐＨの２０mM酢酸バッファー中約２２〜２７mg/mLの濃度で提供された。
【００５７】
液体処方物ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンの調製のために、賦形剤（例えばトレハロース）を抗体溶液に２〜１０倍ストック溶液として添加した。次いで、界面活性剤を、２〜２００倍ストック溶液としてまたは純粋な界面活性剤として添加した。最後に、タンパク質濃度を、バッファーを用いて約１５mg/mLの最終ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン濃度に調整した。
【００５８】
全処方物を、０．２２μm低タンパク質結合フィルターを通して無菌濾過し、そしてＥＴＦＥ（エチレンおよびテトラフルオロエチレンのコポリマー）コートゴム栓およびalucrimpキャップで閉じた無菌６mLガラスバイアル中に窒素雰囲気下で無菌的に充填した。充填容量は約２．４mLであった。これらの処方物を様々なＩＣＨ気候条件下で（５℃、２５℃および４０℃）様々な時間間隔で貯蔵し、そして振とう（５℃で２００分−１の振とう頻度で１週間）および凍結融解ストレス方法によってストレスをかけた。試料をストレス試験を適用する前および後に、分析方法１）ＵＶ分光光度法、および２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００５９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、処方物中の可溶性高分子量種（凝集物）および低分子量加水分解産物（ＬＭＷ）を検出した。前記方法を、TOSOH BIOSCIENCE TSK G3000 SWXLカラムを備えたWater Alliance 2795 HPLC機器で行った。インタクトな単量体、凝集物および加水分解産物を、アイソクラチック溶出プロファイルによって、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、０．２５Ｍ ＫＣＬ、ｐＨ７．０を移動相として使用して分離し、そして２８０nmの波長で検出した。タンパク質含量の決定のために使用したＵＶ分光光度法を、Varian Cary BioＵＶ分光光度計で、２４０nm〜４００nmの波長範囲で行った。原液（neat）のタンパク質試料を、対応する処方バッファーを用いて約０．５mg/mLに希釈した。タンパク質濃度を式１に従って算出した。
【００６０】
【数１】
【００６１】
２８０nmでのＵＶ光吸収を、３２０nmでの光散乱について補正し、そしてそれに原液の試料および希釈バッファーの評量した質量および密度から決定した希釈因子を掛けた。分子を、キュベットの経路長ｄおよび吸光係数εの積で割った。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例２：凍結乾燥処方物および凍結乾燥処方物から再構成された液体処方物の調製
ＷＯ２００５／１００４０２に記載のように調製しそして発酵しそして精製したｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンを、約６．０のｐＨの２０mMヒスチジンバッファー中または約５．２のｐＨの２０mMコハク酸バッファー中約２２〜２７mg/mLの濃度で提供し、そして表２において報告した凍結−乾燥サイクルを使用して凍結乾燥した。
【００６４】
【表３】
【００６５】
産物をまず室温から約５℃に冷却し（前冷却）、続いて約１℃／分のプレート冷却速度での−４０℃での凍結工程、続いて−４０℃で約２時間の保持工程を行った。第１の乾燥工程を約−２５℃のプレート温度および約８０μｂａｒのチャンバー圧で約６５時間行った。その後、第２の乾燥工程を−２５℃から２５℃まで０．２℃／分の温度勾配で開始し、続いて２５℃で少なくとも５時間、約８０μｂａｒのチャンバー圧での保持工程を行った。
【００６６】
凍結乾燥をUsifroid SMH-90 LN2凍結乾燥機(Usifroid, Maurepas, France)中で行った。全ての凍結乾燥ケークは、Karl-Fischer法によって決定したところ、約０．１〜２．０％の残存含水量を有していた。凍結乾燥試料を様々な温度で様々な時間間隔でインキュベートした。
【００６７】
凍結乾燥処方物を、注射用水（ＷＦＩ）を用いて５．３mLの最終容量に再構成し、約１５mg/mLの抗体濃度を有する等張性処方物を得た。凍結乾燥ケークの再構成時間は１分未満であった。再構成試料の分析を再構成の直後、または２５℃での再構成液体試料の２４時間のインキュベーション期間の後のいずれかで行った。
【００６８】
試料を１）ＵＶ分光光度法および２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００６９】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ−セレクチンに対する抗体の医薬処方物、前記処方物の調製のための方法および使用に関する。
【０００２】
第１の局面において、本発明は、
１〜２００mg/mLの抗体；
１〜１００mMのバッファー；
０．００１〜１％の界面活性剤；
（ａ）１０〜５００mMの安定化剤；または
（ｂ）１０〜５００mMの安定化剤および５〜５００mMの浸透圧剤；または
（ｃ）５〜５００mMの浸透圧剤
をｐＨ４．０〜７．０の範囲で含み、前記抗体はＰ−セレクチンに対する抗体である、医薬処方物に関する。
【０００３】
本発明による処方物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成した液体でありうる。
【０００４】
Ｐ−セレクチンに対する抗体は、例えば米国特許４，７８３，３９９、ＷＯ９３／０６８６３、Geng et al (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318)、ＷＯ９３／２１９５６およびＷＯ２００５／１００４０２から公知である。
【０００５】
Ｐ−セレクチンに対する例示的な抗体は、ＷＯ２００５／１００４０２に記載されており、そして前記抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が、重鎖ＣＤＲ３配列である配列番号３８、３９、４０、４１または４２からなる群より選択されることを特徴とする抗体を含む。
【０００６】
好ましい抗体は、
ｉ）可変重鎖が、ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とする、可変重鎖および可変軽鎖を含むこと（ＣＤＲ１は配列番号２９、３０、３１、３２からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号３３、３４、３５、３６、３７からなる群より選択され、ＣＤＲ３は配列番号３８、３９、４０、４１、４２からなる群より選択され、前記ＣＤＲは、互いに独立して選択される）、
ｉｉ）可変軽鎖が、ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号４３、４４から選択され、ＣＤＲ２は配列番号４５、４６から選択され、そしてＣＤＲ３は配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２から選択され、前記ＣＤＲは互いに独立して選択されること、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号９のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１４のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１３のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１６のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１５のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１８のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１７のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号２０のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号１９のＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲとして配列番号２２のＣＤＲそして軽鎖ＣＤＲとして配列番号２１のＣＤＲを含むこと、
ｉｖ）前記抗体がＰ−セレクチンに結合し、そして、アミノ酸配列の配列番号２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号４によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号６によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号５によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号８によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号７によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１０によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号９によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１４によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１３によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１６によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１５によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１８によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１７によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２０によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号１９によって規定される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２２によって規定される重鎖可変ドメインおよび配列番号２１によって規定される軽鎖可変ドメインからなる群より独立して選択される可変重鎖領域および可変軽鎖領域を含むこと、
ｖ）重鎖可変領域が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むこと、
ｖｉ）軽鎖可変領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする。
【０００７】
ＣＤＲ配列を、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定することができる。各鎖上のＣＤＲは、フレームワークアミノ酸によって分離されている。配列番号１〜２２のＣＤＲは、配列番号２９〜５２において示される。
【０００８】
１つの態様において、抗体はＰ−セレクチンに結合し、そして補因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃレセプターには結合しないことを特徴とする。これらの抗体は補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を誘起しない。好ましくは、この抗体はＰ−セレクチンに結合し、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含み、そして補因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする。より好ましくは、この抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０００９】
別の態様において、抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準で周知であり、そして例えばKabat (例えばJohnson and Wu, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号２４、２５、２６、２７および２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号２３のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本明細書において使用する「Ｐ−セレクチンへの結合」という用語は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)または精製Ｐ−セレクチンまたはＰ−セレクチンＣＨＯトランスフェクタントのいずれかがマイクロタイタープレート上にコーティングされているＥＬＩＳＡのいずれかにおけるＰ−セレクチンへの抗体の結合を意味する。
【００１１】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、前記抗体は表面に結合されており、そしてＰ−セレクチンの結合を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定する。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋｄ（解離定数）およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という項によって定義される。さらに別の態様において、抗体は１０−８以下、好ましくは約１０−１１〜１０−９ＭのＫＤを示す（実施例を参照されたい）。従って、好ましい抗体は前記したようなものであり、前記抗体はＰ−セレクチンにＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０−８Ｍ未満のＫＤ値で結合し、好ましくはＫＤ範囲は１０−１１〜１０−９Ｍである。
【００１２】
好ましくは、前記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒトサブタイプである。
【００１３】
より好ましくは、前記抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、あるいはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスによる番号付け）における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。
【００１４】
Ｐ−セレクチン特異的ＥＬＩＳＡにおいて、精製Ｐ−セレクチンをマイクロタイタープレート上にコーティングし、そしてＰ−セレクチンへの抗体の結合をビオチニル化抗ヒトＩｇＧおよび通常のＥＬＩＳＡ工程を用いて検出する。このアッセイにおけるＥＣ５０値は、好ましくはＰ−セレクチンＣＨＯ細胞上で０．００２〜０．０３μg/mlの範囲であり、すなわち、好ましい抗体は、Ｐ−セレクチン結合に対するＥＣ５０値が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰ−セレクチン提示ＣＨＯ細胞上で０．００２〜０．０３μg/mlの範囲であるものである。Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯトランスフェクタントがマイクロタイタープレート上にコーティングされているアッセイにおいて、ＥＣ５０値は、０．０１〜０．０８μg/ml、好ましくは０．０１〜０．０４μg/mlの範囲である。
【００１５】
Ｅ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントのＥＣ５０値は、好ましくは１００μg/ml超である。好ましい抗体は、Ｐ−およびＥ−および／またはＬ−セレクチンがマイクロタイタープレート上にコーティングされているＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０値によって測定したところ、Ｅ−および／またはＬ−セレクチンよりも少なくとも１０００倍より特異的にＰ−セレクチンに結合することを特徴とする。
【００１６】
前記抗体は、好ましくは、Ｐ−セレクチンフラグメントａａ６０〜７５（スイスプロット配列Ｐ１６１０９）の存在下においてＰ−セレクチンに結合でき、そして／またはＡＴＣＣアクセッションナンバーＨＢ１１０４１と称される細胞株によって分泌される抗体のＰ−セレクチンへの結合を競合的に阻害しない。
【００１７】
前記抗体は、好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットにおいて血小板膜糖タンパク質ＧＰＩｂαとＰ−セレクチンとの相互作用を阻害しない。ＥＬＩＳＡにおいてＧＰＩｂαの可溶性細胞外部分であるグリコカリシンを、記載のように(Romo et al., J Exp Med 190:803 (1999)）、マイクロタイタープレートのウェル上に固定し、そしてＰ−セレクチンＨｕＭａｂｓとのプレインキュベーション後の精製Ｐ−セレクチンの結合を、ポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて検出した。
【００１８】
好ましい抗体は、それがＣ３タンパク質に結合しないことを特徴とし、より好ましくは補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を誘起しないことを特徴とする。さらに、前記抗体は、ＮＫエフェクター細胞上のＦｃγレセプターに結合しないことを特徴としうる。好ましくは、前記抗体は、それが、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、あるいはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスによる番号付け）における少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。好ましい抗体は、それが抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を誘起しないことを特徴とする。
【００１９】
より好ましい抗体は、それらがＰ−セレクチンに結合し、そしてそれらが、アミノ酸配列の配列番号１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号４によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号５によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号６によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号７によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号８によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号９によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１４によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１５によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１６によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１７によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号１８によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号１９によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０によって規定される重鎖可変ドメイン；アミノ酸配列の配列番号２１によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２によって規定される重鎖可変ドメインからなる群より独立して選択される可変領域を含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記抗体は、アミノ酸配列の配列番号３によって規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号４によって規定される重鎖可変ドメインを含む。
【００２１】
好ましい抗体は、前記抗体が、ヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体であるか、または補因子Ｃ１ｑへの非結合を引き起こす少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むことを特徴とする。これらの変異抗体は、例えば、配列番号２５または配列番号２６および配列番号２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
「変異」抗Ｐ−セレクチン抗体は、本明細書において、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって、「親」抗Ｐ−セレクチン抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なっている分子をいう。好ましくは、前記変異体は、親抗体の１つ以上の定常領域または可変領域において、より好ましくは定常領域において１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、前記変異体は、親抗体の１つ以上の可変領域において、少なくとも１つ、例えば約１〜約１０、好ましくは約２〜約５個の置換を含みうる。通常、前記変異体は、親抗体定常および／または可変ドメイン配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するだろう。
【００２３】
この配列に対しての同一性または相同性は、本明細書において、配列をアラインさせて、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一率を達成した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、または内部における伸長、欠失または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすとは解釈されないものとする。前記変異体は、ヒトＰ−セレクチンに結合する能力を保持し、そして好ましくは、親抗体の特性よりも優れた特性を有する。例えば、前記変異体は、より強い結合親和性、重症虚血肢または末梢動脈閉塞性疾患（ＣＬＩ／ＰＡＯＤ）に関連した疾患を処置する増強された能力を有しうる。
【００２４】
本明細書において特に関心のある変異抗体は、Ｆｃγレセプターへの結合の消失のために、親抗体と比較した場合に接着アッセイにおいて少なくとも約４倍の阻害活性の増強を示すものである。
【００２５】
本明細書における「親」抗体は、前記変異体の調製のために使用されるアミノ酸配列によってコードされるものである。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、そして存在する場合には、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体でありうる。
【００２６】
本発明による抗体は、さらに、本発明による抗体の前記の特徴に影響を及ぼさないかまたは変化させない、「保存的な配列改変」であるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変を有するこのような抗体を含む。改変は、当技術分野において公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲにより媒介される突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ヒト抗Ｐ−セレクチン抗体において予測される非必須アミノ酸残基を、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができる。
【００２７】
アミノ酸置換を、Riechmann et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって行なうことができる。
【００２８】
さらに好ましい抗体は、配列番号２３によって規定されるようなκ軽鎖定常領域を含む。
【００２９】
さらに好ましい抗体は、ＩｇＧ１ｖ１（ＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１（Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓによって特定される））、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ）およびＩｇＧ４ｖ１（Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ）として定義されるものである。
【００３０】
配列表の記載
配列番号１ ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１軽鎖可変ドメイン
配列番号２ ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１重鎖可変ドメイン
配列番号３ ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２軽鎖可変ドメイン
配列番号４ ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２重鎖可変ドメイン
配列番号５ ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３軽鎖可変ドメイン
配列番号６ ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３重鎖可変ドメイン
配列番号７ ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４軽鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号８ ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４重鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号９ ＨｕＭａｂ００４（II）のＬＣ１００４−００４軽鎖（II）可変ドメイン
配列番号１０ ＨｕＭａｂ００４（II）のＬＣ１００４−００４重鎖（II）可変ドメイン
配列番号１１ ＨｕＭａｂ００５の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２ ＨｕＭａｂ００５の重鎖可変ドメイン
配列番号１３ ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１４ ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）の重鎖可変ドメイン
配列番号１５ ＨｕＭａｂ０１０（II）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１６ ＨｕＭａｂ０１０（II）の重鎖可変ドメイン
配列番号１７ ＨｕＭａｂ０１０（III）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１８ ＨｕＭａｂ０１０（III）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９ ＨｕＭａｂ０１１の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０ ＨｕＭａｂ０１１の重鎖可変ドメイン
配列番号２１ ＨｕＭａｂ０１７の軽鎖可変ドメイン
配列番号２２ ＨｕＭａｂ０１７の重鎖可変ドメイン
配列番号２３ κ軽鎖定常領域
配列番号２４ γ１重鎖定常領域
配列番号２５ γ１重鎖定常領域ＰＶＡ２３６／ＧＬＰＳＳ３３１（ＩｇＧｖ１）
配列番号２６ γ１重鎖定常領域Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１ｖ２）
配列番号２７ γ４重鎖定常領域
配列番号２８ γ４重鎖定常領域Ｓ２２８／Ｌ２３５Ｅ（ＩｇＧ４ｖ１）
配列番号２９〜３２ 重鎖ＣＤＲ１
配列番号３３〜３７ 重鎖ＣＤＲ２
配列番号３８〜４２ 重鎖ＣＤＲ３
配列番号４３〜４４ 軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４５〜４６ 軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４７〜５２ 軽鎖ＣＤＲ３
【００３１】
１つの態様において、本発明は、前記抗体が１０〜１５０mg/mL、好ましくは１０〜５０mg/mLの範囲の量で存在する処方物を提供する。Ｐ−セレクチンに対するアンタゴニストモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞株によって産生しうる。好ましいハイブリドーマ細胞株はｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（抗体ＨｕＭａｂ００１）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（抗体ＨｕＭａｂ００２）およびｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（抗体ＨｕＭａｂ０１７）であり、これらは特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託された：
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明による処方物において有用な抗体は、好ましくは組換え手段によって、例えばＷＯ２００６／０７２５６４に記載されるものによって産生される。そのような方法は、当技術分野の水準で広く公知であり、そして、その後の抗体ポリペプチドの単離および通常は薬学的に許容されうる純度への精製を伴う、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクター中に挿入する。発現を、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはE.coli細胞のような適切な原核または真核宿主細胞中で行い、そして抗体を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および例えばＷＯ２００６／０７２５６４に記載されるような当技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって細胞（上清または溶解後の細胞）から回収する。
【００３４】
本明細書において使用する「バッファー」という用語は、医薬調製物のｐＨを安定化する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。適切なバッファーは、当技術分野において周知であり、そして文献において見出されうる。好ましい薬学的に許容されうるバッファーは、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー、およびリン酸バッファーを含むがそれらに限定されない。さらに好ましいバッファーは、当技術分野において公知の酸または塩基を用いてｐＨ調整したＬ−ヒスチジンまたはＬ−ヒスチジンとＬ−ヒスチジン塩酸塩との混合物を含む。上記のバッファーは、一般に、約１mM〜約１００mM、好ましくは約５mM〜約５０mM、より好ましくは約１０〜２０mMの量で使用される。使用するバッファーとは独立して、ｐＨを、約４．０〜約７．０、好ましくは約５．０〜約６．５、さらにより好ましくは約５．５〜約６．０を含む値に、当技術分野において公知の酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、硫酸およびクエン酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムを用いて調整することができる。
【００３５】
本明細書において使用する「界面活性剤」という用語は、撹拌および剪断のような機械的ストレスに対してタンパク質処方物を保護するために使用される薬学的に許容されうる賦形剤を示す。薬学的に許容されうる界面活性剤の例は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。好ましいポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、ポリソルベート２０（商標Ｔｗｅｅｎ２０（商標）の下に販売されている）およびポリソルベート８０（商標Ｔｗｅｅｎ８０（商標）の下に販売されている）である。好ましいポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーは、名称Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の下に販売されているものである。好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルは、商標Ｂｒｉｊ（商標）の下に販売されているものである。好ましいアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルは、商標Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの下に販売されている。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標））およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））を使用する場合、それらは、一般に、約０．００１〜約１％、好ましくは約０．００５〜約０．１％、より好ましくは約０．０１％〜約０．０４％ｗ／ｖ（重量／容量）の濃度範囲で使用される。
【００３６】
「安定化剤」という用語は、製造、貯蔵および適用の間の化学的および／または物理的分解から活性医薬成分および／または処方物を保護する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。タンパク質医薬の化学的および物理的分解経路は、Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77、Wang (1999) Int J Pharm 185(2):129-88、Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2):1-60およびChi et al. (2003) Pharm Res 20(9):1325-36によって概説されている。安定化剤は、本明細書中以下で定義するような、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えばＥＤＴＡを含むがそれらに限定されない。本明細書中上記のように、安定化剤は、約１０〜約５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００mM〜約３００mMの量で処方物中に存在することができる。
【００３７】
本明細書において使用する「糖」という用語は単糖またはオリゴ糖を示す。単糖は、酸によって加水分解可能でない単量体炭水化物であり、単純糖およびその誘導体、例えばアミノ糖を含む。単糖の例は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸を含む。オリゴ糖は、分岐または鎖状のいずれかの、グリコシド結合を介して連結された１個より多くの単量体糖単位からなる炭水化物である。オリゴ糖内の単量体糖単位は、同一であることができ、または異なることができる。単量体糖単位の数に応じて、オリゴ糖は、ジ、トリ、テトラ、ペンタなどの糖である。多糖とは対照的に、単糖およびオリゴ糖は水溶性である。オリゴ糖の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびラフィノースを含む。好ましい糖はスクロースおよびトレハロースであり、トレハロースが最も好ましい。
【００３８】
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基に対してα位に位置するアミノ部分を有する薬学的に許容されうる有機分子を示す。アミノ酸の例は、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンを含む。アミノ酸は、一般に、約１０〜５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用される。
【００３９】
本明細書において使用する「ポリオール」という用語は、１個より多いヒドロキシ基を有する薬学的に許容されうるアルコールを示す。適切なポリオールは、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびその組合せを含むがそれらに限定されない。ポリオールを、約１０mM〜約５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用することができる。
【００４０】
安定化剤内の１つのサブグループは凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）である。「凍結乾燥保護剤」という用語は、凍結乾燥プロセス、その後の貯蔵および再構成の間の不安定化条件に対して不安定な活性成分（例えばタンパク質）を保護する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。凍結乾燥保護剤は、糖、ポリオール（例えば糖アルコールのような）およびアミノ酸からなる群を含むがそれらに限定されない。好ましい凍結乾燥保護剤を、糖、例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、ノイラミン酸、アミノ糖、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−メチルグルコサミン（「メグルミン」）、ポリオール、例えばマンニトールおよびソルビトール、ならびにアミノ酸、例えばアルギニンおよびグリシンまたはその混合物からなる群より選択することができる。凍結乾燥保護剤は、一般に、約１０〜５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００〜約３００mMの量で使用される。
【００４１】
安定化剤内の１つのサブグループは抗酸化剤である。「抗酸化剤」という用語は、活性医薬成分の酸化を防止する薬学的に許容されうる賦形剤を示す。抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、クエン酸、ＥＤＴＡを含むがそれらに限定されない。抗酸化剤を、約０．０１〜約１００mMの量、好ましくは約５〜約５０mMの量、より好ましくは約５〜約２０mMの量で使用することができる。
【００４２】
本明細書において使用する「浸透圧剤」という用語は、薬学的に許容されうる浸透圧剤を示す。浸透圧剤は、処方物の浸透圧を調節するために使用される。処方物は、低張性、等張性、または高張性であることができる。等張性は、一般に、通常ヒト血清のものに対する、溶液の相対的浸透圧に関する。本発明による処方物は、低張性、等張性、または高張性であることができるが、好ましくは等張性である。等張性処方物は、液体、または固体形態から、例えば凍結乾燥形態から再構成された液体であり、そしてそれが比較される何らかの他の溶液、例えば生理塩溶液および血清と同じ浸透圧を有する溶液を示す。適切な浸透圧剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖、特にグルコースの群からの任意の成分を含むがそれらに限定されない。浸透圧剤は、一般に、約５mM〜約５００mMの量で使用される。
【００４３】
安定化剤および浸透圧剤内に、両方の方法で機能することができる化合物の群が存在する。すなわち、それらは同時に安定化剤および浸透圧剤であることができる。その例を、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、ポリエチレングリコールおよび塩の群において見出すことができる。同時に安定化剤および浸透圧剤であることができる糖の一例はトレハロースである。
【００４４】
組成物はまた、補助剤、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、および様々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっての両方で保証されうる。保存料は、一般に、約０．００１〜約２％（ｗ／ｖ）の量で使用される。保存料は、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムを含むがそれらに限定されない。
【００４５】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「液体」という用語は、大気圧下で少なくとも約２〜約８℃の温度で液体である処方物を示す。
【００４６】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「凍結乾燥物」という用語は、それ自体当技術分野において公知の凍結乾燥方法によって製造される処方物を示す。溶媒（例えば水）は、凍結およびそれに続く真空下での昇華および上昇した温度での残存する水の脱着によって除去される。凍結乾燥物は、通常、約０．１〜５％（ｗ／ｗ）の残存水分を有し、そして粉末または物理的安定ケーク（cake）として存在する。凍結乾燥物は、再構成媒質の添加後の急速な溶解によって特徴付けられる。
【００４７】
本発明による処方物に関連して本明細書において使用する「再構成処方物」という用語は、凍結乾燥され、そして再構成媒質の添加によって再溶解される処方物を示す。再構成媒質は、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば５％グルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝溶液）を含むがそれらに限定されない。
【００４８】
本発明による処方物は、喘息またはアレルギー性疾患に罹患した患者のために利点をもたらす新たなそして発明性の特性を有する。
【００４９】
本発明はさらに、喘息の処置のための医薬の製造のための本発明による処方物の使用を含む。
【００５０】
本発明の組成物を、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。
【００５１】
特定の投与経路によって本発明の組成物を投与するために、組成物を希釈剤中で希釈することが必要でありうる。薬学的に許容されうる希釈剤は、生理食塩水、グルコース、リンゲルおよび水性緩衝溶液を含む。
【００５２】
本明細書において使用する「非経口的投与」および「非経口で投与される」という用語は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含むがそれらに限定されない。
【００５３】
前記組成物は無菌でなければならず、そして組成物がシリンジによって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張性緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物であることができる。
【００５４】
本発明による処方物を、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）または医薬の技術分野において公知のもののような任意の他の非経口投与手段によって投与することができる。
【００５５】
本発明による処方物を、当技術分野において公知の方法、例えば限外濾過−透析濾過、透析、添加および混合、凍結乾燥、再構成、およびその組合せによって調製することができる。本発明による処方物の調製の例を、本明細書中以下に見出すことができる。
【００５６】
実施例
実施例１：液体処方物の調製
ＷＯ２００５／１００４０２に記載のように調製しそして発酵しそして精製したｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンは、約６．０のｐＨの２０mMヒスチジンバッファー中または約５．２のｐＨの２０mM酢酸バッファー中約２２〜２７mg/mLの濃度で提供された。
【００５７】
液体処方物ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンの調製のために、賦形剤（例えばトレハロース）を抗体溶液に２〜１０倍ストック溶液として添加した。次いで、界面活性剤を、２〜２００倍ストック溶液としてまたは純粋な界面活性剤として添加した。最後に、タンパク質濃度を、バッファーを用いて約１５mg/mLの最終ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン濃度に調整した。
【００５８】
全処方物を、０．２２μm低タンパク質結合フィルターを通して無菌濾過し、そしてＥＴＦＥ（エチレンおよびテトラフルオロエチレンのコポリマー）コートゴム栓およびalucrimpキャップで閉じた無菌６mLガラスバイアル中に窒素雰囲気下で無菌的に充填した。充填容量は約２．４mLであった。これらの処方物を様々なＩＣＨ気候条件下で（５℃、２５℃および４０℃）様々な時間間隔で貯蔵し、そして振とう（５℃で２００分−１の振とう頻度で１週間）および凍結融解ストレス方法によってストレスをかけた。試料をストレス試験を適用する前および後に、分析方法１）ＵＶ分光光度法、および２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００５９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、処方物中の可溶性高分子量種（凝集物）および低分子量加水分解産物（ＬＭＷ）を検出した。前記方法を、TOSOH BIOSCIENCE TSK G3000 SWXLカラムを備えたWater Alliance 2795 HPLC機器で行った。インタクトな単量体、凝集物および加水分解産物を、アイソクラチック溶出プロファイルによって、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、０．２５Ｍ ＫＣＬ、ｐＨ７．０を移動相として使用して分離し、そして２８０nmの波長で検出した。タンパク質含量の決定のために使用したＵＶ分光光度法を、Varian Cary BioＵＶ分光光度計で、２４０nm〜４００nmの波長範囲で行った。原液（neat）のタンパク質試料を、対応する処方バッファーを用いて約０．５mg/mLに希釈した。タンパク質濃度を式１に従って算出した。
【００６０】
【数１】
【００６１】
２８０nmでのＵＶ光吸収を、３２０nmでの光散乱について補正し、そしてそれに原液の試料および希釈バッファーの評量した質量および密度から決定した希釈因子を掛けた。分子を、キュベットの経路長ｄおよび吸光係数εの積で割った。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例２：凍結乾燥処方物および凍結乾燥処方物から再構成された液体処方物の調製
ＷＯ２００５／１００４０２に記載のように調製しそして発酵しそして精製したｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチンを、約６．０のｐＨの２０mMヒスチジンバッファー中または約５．２のｐＨの２０mMコハク酸バッファー中約２２〜２７mg/mLの濃度で提供し、そして表２において報告した凍結−乾燥サイクルを使用して凍結乾燥した。
【００６４】
【表３】
【００６５】
産物をまず室温から約５℃に冷却し（前冷却）、続いて約１℃／分のプレート冷却速度での−４０℃での凍結工程、続いて−４０℃で約２時間の保持工程を行った。第１の乾燥工程を約−２５℃のプレート温度および約８０μｂａｒのチャンバー圧で約６５時間行った。その後、第２の乾燥工程を−２５℃から２５℃まで０．２℃／分の温度勾配で開始し、続いて２５℃で少なくとも５時間、約８０μｂａｒのチャンバー圧での保持工程を行った。
【００６６】
凍結乾燥をUsifroid SMH-90 LN2凍結乾燥機(Usifroid, Maurepas, France)中で行った。全ての凍結乾燥ケークは、Karl-Fischer法によって決定したところ、約０．１〜２．０％の残存含水量を有していた。凍結乾燥試料を様々な温度で様々な時間間隔でインキュベートした。
【００６７】
凍結乾燥処方物を、注射用水（ＷＦＩ）を用いて５．３mLの最終容量に再構成し、約１５mg/mLの抗体濃度を有する等張性処方物を得た。凍結乾燥ケークの再構成時間は１分未満であった。再構成試料の分析を再構成の直後、または２５℃での再構成液体試料の２４時間のインキュベーション期間の後のいずれかで行った。
【００６８】
試料を１）ＵＶ分光光度法および２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００６９】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜２００mg/mLの抗体；
１〜１００mMのバッファー；
０．００１〜１％の界面活性剤；
（ａ）１０〜５００mMの安定化剤；または
（ｂ）１０〜５００mMの安定化剤および５〜５００mMの浸透圧剤；または
（ｃ）５〜５００mMの浸透圧剤
をｐＨ４．０〜７．０の範囲で含み、
前記抗体はＰ−セレクチンに対する抗体である、医薬処方物。
【請求項２】
液体処方物または凍結乾燥処方物または凍結乾燥処方物から再構成された液体処方物である、請求項１記載の処方物。
【請求項３】
前記抗体濃度が１０mg/mL〜１５０mg/mlの範囲である、請求項１または２記載の処方物。
【請求項４】
前記安定化剤がトレハロースである、請求項１〜３のいずれか１項記載の処方物。
【請求項５】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項１〜４のいずれか１項記載の処方物。
【請求項６】
前記バッファーがヒスチジンバッファーである、請求項１〜５のいずれか１項記載の処方物。
【請求項７】
浸透圧剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の処方物。
【請求項８】
前記浸透圧剤がトレハロースである、請求項１〜７のいずれか１項記載の処方物。
【請求項９】
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM酢酸ナトリウム、１４０mMトレハロース、７５mMグリシン、０．０４％ポリソルベート２０（ｐＨ５．２）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mMスクシネート、２４０mMトレハロース、２０mMアルギニン、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）
を含む、請求項１の処方物。
【請求項１０】
喘息またはアレルギーを処置するために有用な医薬の調製のための請求項１〜２０のいずれか１項記載の処方物の使用。
【請求項１１】
本明細書中に前記した本発明。
【請求項１】
１〜２００mg/mLの抗体；
１〜１００mMのバッファー；
０．００１〜１％の界面活性剤；
（ａ）１０〜５００mMの安定化剤；または
（ｂ）１０〜５００mMの安定化剤および５〜５００mMの浸透圧剤；または
（ｃ）５〜５００mMの浸透圧剤
をｐＨ４．０〜７．０の範囲で含み、
前記抗体はＰ−セレクチンに対する抗体である、医薬処方物。
【請求項２】
液体処方物または凍結乾燥処方物または凍結乾燥処方物から再構成された液体処方物である、請求項１記載の処方物。
【請求項３】
前記抗体濃度が１０mg/mL〜１５０mg/mlの範囲である、請求項１または２記載の処方物。
【請求項４】
前記安定化剤がトレハロースである、請求項１〜３のいずれか１項記載の処方物。
【請求項５】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項１〜４のいずれか１項記載の処方物。
【請求項６】
前記バッファーがヒスチジンバッファーである、請求項１〜５のいずれか１項記載の処方物。
【請求項７】
浸透圧剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の処方物。
【請求項８】
前記浸透圧剤がトレハロースである、請求項１〜７のいずれか１項記載の処方物。
【請求項９】
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM酢酸ナトリウム、１４０mMトレハロース、７５mMグリシン、０．０４％ポリソルベート２０（ｐＨ５．２）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mM Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）；
または
１〜５０mg/mL ｈｕＭＡｂ−Ｐ−セレクチン、２０mMスクシネート、２４０mMトレハロース、２０mMアルギニン、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）
を含む、請求項１の処方物。
【請求項１０】
喘息またはアレルギーを処置するために有用な医薬の調製のための請求項１〜２０のいずれか１項記載の処方物の使用。
【請求項１１】
本明細書中に前記した本発明。
【公表番号】特表２０１２−５０２９４２（Ｐ２０１２−５０２９４２Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７２９４（Ｐ２０１１−５２７２９４）
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１６９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７２０
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１６９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７２０
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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