新規遺伝子を同定するための方法
目的の遺伝子の標的グループから公知の遺伝子と相同領域を共有する新規遺伝子を同定するための方法および組成物を提供する。方法は、公知の遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列内の相同領域に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーを系統的に設計することと、目的の生物由来の核酸物質のＰＣＲ増幅を連続して行うこととを含む。ＰＣＲステップは、公知遺伝子および新規遺伝子を含む核酸を同定して増幅することを意図する。標的グループ内の公知の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるドットブロット分析によるさらなる評価により公知遺伝子を含む核酸分子が検出され、除去される。潜在的な新規遺伝子は、新規性を確認するためにさらに配列分析に掛けて、生物活性を評価する。本発明の組成物は、新規ポリヌクレオチドおよびそれらの変異体とフラグメントを含み、それらは新規遺伝子およびそれによってコードされるポリペプチドを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知の遺伝子（具体的には、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）Ｃｒｙ遺伝子）と相同である新規遺伝子を同定するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
害虫は、世界の農作物の損失における主要な要因である。例えば、コーンルートワーム（根切り虫）の食害およびワタミゾウムシの損害は、農業生産者にとって経済的に破壊的となり得る。根切り虫よる害虫関連作物の損害だけでも、年間１０億ドルに達している。
【０００３】
従来から、害虫集団（例えば、コーンルートワーム集団等）に影響を与える一次的方法は、輪作および広域スペクトルの合成化学農薬の使用である。しかし、消費者および政府の規制当局は、合成化学農薬の生産および使用と関連した環境ハザードにますます関心を高めている。そのような懸念のため、規制当局は、より危険な農薬の一部の使用を禁止または制限してきた。従って、従来の化学農薬に代わり、汚染および環境ハザードに対してより低い危険性を呈し、かつ従来の広域スペクトル化学殺虫剤の特性よりもより大きい標的特異性を提供する代替物の開発に多大の関心が払われている。
【０００４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物のいくつかの種は、広範囲の害虫（燐翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目他を含む）に対して殺虫活性を有することが知られている。バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）およびバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）は、中でも今までに発見された最も成功した生物的防除剤である。昆虫病原性は、複数の菌株に起因している。すなわち、バチルス・ラルバエ（Ｂ．ｌａｒｖａｅ）、パチルス・レンチモルブス（Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、パチルス・ポピリエ（Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、バチルス・スファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、Ｂｔ（非特許文献１）、およびバチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）（特許文献１）。殺虫性タンパク質は、また、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の栄養成長期から単離されているが、殺虫活性は、結晶性タンパク質副芽胞封入体に濃縮されているように見える。これらの殺虫性タンパク質をコードするいくつかの遺伝子は、単離され、特徴付けられている（例えば、特許文献２および特許文献３を参照されたい）。
【０００５】
微生物農薬（具体的にはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から得られるもの）は、化学防除に代わるものとして農業において重要な役割を果してきた。δ内毒素またはＣｒｙ毒素として知られているＢｔの菌株から単離される殺虫性タンパク質は、最初、不活性なプロトキシン毒素の形で生成される。これらのプロトキシン毒素は、昆虫の腸内でタンパク質分解酵素の作用を介して活性な毒素にタンパク分解的に変換される。非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４を参照されたい。毒素のタンパク質分解活性は、タンパク質からのＮ末端およびＣ末端のペプチドの除去、ならびにタンパク質の内部切断を含み得る。一旦活性化すると、Ｃｒｙ毒素は、昆虫腸内の上皮細胞上の受容体に対して高い親和性で結合し、それによって細胞膜に漏出チャネルを生成し、昆虫の腸の溶解、続いて飢餓性衰弱および敗血症を介して昆虫の死をもたらす。例えば、非特許文献５を参照されたい。
【０００６】
最近、農学者は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から殺虫性タンパク質を生成するために、殺虫性遺伝子を有する作物を遺伝子操作することによって虫害抵抗性が増強された作物を開発した。例えば、Ｃｒｙ毒素を生成するよう遺伝子操作されたコーンおよび綿（例えば、非特許文献６；非特許文献７を参照されたい）は、現在では米国農業で広く用いられており、かつ従来の昆虫防除方法に代わる環境に優しい代替法を農家に提供している。さらに、殺虫性Ｃｒｙ毒素を含む遺伝子操作されたジャガイモが開発されている。これらの遺伝子操作の成功例は、研究者に新規殺虫性遺伝子、具体的にはＣｒｙ遺伝子を研究するように導いてきた。従って、公知のＣｒｙ遺伝子と相同であるものならびにＣｒｙ遺伝子の新規ファミリーを表すものを含む新規殺虫性遺伝子を効率的に同定する新規方法が当該技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９６／１００８３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，３６６，８９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｒｗｏｏｋ， ｅｄ． （１９８９） Ｂａｃｉｌｌｕｓ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）， ｐ．３０６
【非特許文献２】Ｒｕｋｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８２：１０９−１１６
【非特許文献３】Ｏｐｐｅｒｔ （１９９９） Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． ４２：１−１２
【非特許文献４】Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７０：４１−４９
【非特許文献５】Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８１５−８２１
【非特許文献６】Ａｒｏｎｓｏｎ （２００２） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５９（３）：４１７−４２５
【非特許文献７】Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２（３）：７７５−８０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規遺伝子を同定する方法および組成物に向けられる。本明細書で開示する方法は、種々の生物由来の潜在的な新規遺伝子を同定するために、大量のヌクレオチド配列の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。新規遺伝子を同定する本方法は、公知の遺伝子と相同である遺伝子の同定、ならびに目的の遺伝子（殺虫性遺伝子を含む）で現在、未同定のファミリーのメンバーである可能性がある完全に新規遺伝子の同定を可能にする。本発明のある態様において、本方法は、公知の殺虫性遺伝子（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を含む）と相同である新規殺虫性遺伝子の同定を可能にする。
【００１０】
本発明の方法は、目的の公知の遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）の標的グループ内の相同領域（すなわち、特徴的配列）に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーを系統的に設計すること、ならびに、目的である生物由来の核酸物質のＰＣＲ増幅の第１ラウンドを行うこととを含む。ＰＣＲの第１ラウンドは、特徴的配列を含む公知と新規両遺伝子を増幅することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質の第２試料を取得して、遺伝子の標的グループ内の特徴的配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを用いて、ＰＣＲの第２ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離されて、結果として生じる単離された核酸はクローニングベクター（具体的には、細菌性クローニングベクター）にクローン化される。クローニングベクターは、次いで、細菌細胞等のコンピテントな宿主細胞に形質転換される。個々の宿主細胞コロニーから単離された核酸物質は、標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的である標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーション分析法で分析される。本発明の方法に関するドットブロット分析ステップは、公知の遺伝子を標的グループから同定し、さらなる考察から除外することを意図する。ＰＣＲの第２ラウンドで増幅され、ドットプロット分析によって検出されないＰＣＲ産物は、推定上の新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）またはそのフラグメントを含む。これらの核酸は、新規性を確認してヌクレオチド配列を決定するために、さらに配列分析に掛けられる。本発明の方法を用いて新規殺虫性遺伝子を同定する場合、推定上の新規遺伝子が発現され、組換えタンパク質は生物活性（例えば、殺虫活性）を評価するためにアッセイされる。本発明の方法は、自動化された高スループットスクリーニングをさらに受け入れ可能である。
【００１１】
本発明の組成物としては、単離される新規ポリヌクレオチド、およびそれらの変異体およびフラグメントが挙げられ、新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子を含む）が含まれる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供される。本明細書で開示される方法によって同定される新規殺虫性遺伝子（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）は、害虫（具体的には、害虫および害虫関連損害）から植物を保護することに有用性を見出す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書で以下に詳細に記述するように、ＰＣＲの第１および第２ラウンドならびにドットブロット分析用のオリゴヌクレオチドプローブで用いるオリゴヌクレオチドプライマーを設計の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、新規遺伝子、具体的には新規殺虫性遺伝子、より具体的には新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を同定する方法および組成物に向けられる。本発明の方法は、公知の遺伝子と相同である推定上の新規遺伝子を同定するために大量のヌクレオチド配列の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。本明細書において、用語「遺伝子の標的グループ」とは、相同領域を含む目的の任意の生物由来の公知の遺伝子の任意のコレクションをいう。一部実施形態において「標的グループ」は、公知の殺虫性遺伝子のコレクション、より具体的には、公知のＢｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子のグループを含み得る。通常は、本発明の方法は、標的グループから新規遺伝子を同定するために３つの明確なステップを含む。すなわち、ＰＣＲ（より具体的にはリアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析のステップである。特定の実施形態において、目的の生物由来の核酸物質のＰＣＲ増幅の第１ラウンドを行い、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。「特徴的配列」とは、目的の遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に存在する相同領域を意味することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質のＰＣＲの第２ラウンド用の第２試料を取得して、ＰＣＲ増幅の追加ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドは、特定の標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、通常、さらなる分析のために単離される。第３のステップは、ＰＣＲの第２ラウンドで単離される個々のＰＣＲ産物についてドットブロット分析を行うことを含む。ドットブロット分析のステップは、標的グループ内の公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて行い、従って、公知の遺伝子を検出してさらなる考察から除外することを意図する。ドットブロット分析によって検出されないＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、推定上の新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）またはそれらのフラグメントを含み、従って、新規性を確認するためにさらに配列分析に掛けられる。推定上の新規遺伝子の配列が決定され、それによってコードされるこれらの核酸分子およびタンパク質は、生物活性（例えば、殺虫活性等）を評価するためのバイオアッセイで用いられる。
【００１４】
より具体的には、新規遺伝子を同定する方法は、公知の遺伝子の標的グループ（例えば、Ｂｔ殺虫性遺伝子の標的グループ）の相同領域（すなわち、特徴的配列）に対するオリゴヌクレオチドプライマーを系統的に設計することと、目的の生物由来の核酸物質をＰＣＲ増幅する第１ラウンドでこれらのプライマーを用いることとを含む。本発明の一部態様において、目的の生物は、微生物、より具体的にはＢｔ菌株である。ＰＣＲ増幅の第１ラウンド用に設計されるプライマーは、以下により詳細に記述するように、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質の第２試料を取得して、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドに掛ける。
【００１５】
ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、また、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）を増幅するために設計される。ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、特定の長さ（例えば、約５００塩基対（ｂｐ）〜約８００ｂｐ、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、より具体的には約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐの長さ）のＰＣＲ産物を生成するように設計される。ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成される予想される長さのＰＣＲ産物は、例えば、アガロースゲル電気泳動によって単離される。従って、ＰＣＲの第２ラウンドは、特定の特徴的配列を含む公知の遺伝子および新規遺伝子、またはそれらのフラグメントの増幅を可能にし、かつさらに分析のためにこれらの核酸分子の単離を可能にする。
【００１６】
第２ラウンド増幅からの予想される長さのＰＣＲ産物は、通常、公知の遺伝子または新規遺伝子のフラグメントを含む。これらの核酸フラグメントは、クローニングベクター（例えば、細菌性クローニングベクター）にクローン化される。クローニングベクター挿入断片（すなわち、ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物）は、標的グループからの公知の遺伝子および潜在的新規遺伝子、またはそれらのあり得るフラグメントを含み、コンピテントな宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞等の細菌性細胞）の形質転換に用いられる。本発明の特定の態様において、核酸物質（例えば、プラスミドＤＮＡ）は、個々の宿主細胞（例えば、細菌性細胞）コロニーから単離され、標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的な標的オリゴヌクレオチドプローブを用いるドットブロット分析によって分析される。特定の実施形態において、本明細書で以下に詳細に記述するように、オリゴヌクレオチドプローブは、増幅の第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントと相補的になるように設計される。標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブによるドットブロット分析は、公知の遺伝子（例えば、特定の標的グループの公知のＢｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を含む核酸分子の同定を可能にする。公知の遺伝子を含む核酸は、さらなる考察から除外される。ドットブロット分析によって検出されない核酸は、推定上の新規遺伝子またはそれらのフラグメントを含み、さらに配列分析および生物活性アッセイに掛けられる。本発明の特定の実施形態において、本方法を用いて、新規殺虫性遺伝子（具体的には、新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を同定し、従って推定上新規殺虫性遺伝子は、殺虫活性に関してさらに分析される。
【００１７】
本発明のある態様において、上述のように、ＰＣＲの第２ラウンドで生成され、ドットブロット分析によって検出されないＰＣＲ産物を配列決定して、その新規性を評価するために公開データベースからの公知の配列と比較する。配列比較によってＰＣＲ産物が潜在的に新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子（例えば、新規ＢＴ Ｃｒｙ毒素遺伝子））を含むことが示される場合、全長配列を、例えばＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．）を用いて取得する。また、結果として生じる配列は、その新規性をさらに確認するために、公開データベースの配列に対して比較される。特定の実施形態において、新規遺伝子は、発現ベクターおよびそれによってコードされるタンパク質にクローン化され、推定上の新規殺虫性遺伝子の場合、生物活性（例えば、殺虫活性）がアッセイされる。
【００１８】
本発明の方法は、新規遺伝子、具体的には殺虫性遺伝子、より具体的にはＢｔ Ｃｒｙ毒素の殺虫性遺伝子を同定することに向けられる。本発明の方法は、殺虫性遺伝子の同定に関して本明細書で以下に記述するが、そのような方法は、目的の任意の生物由来の公知の遺伝子（すなわち、目的の標的グループ）の任意のグループとも相同である新規遺伝子を同定するため用いてよい。新規殺虫性遺伝子の同定に関する説明は、単に好例であることを目的とし、限定するものではない。
【００１９】
本発明の方法を用いて、公知のＣｒｙ遺伝子と相同である新規遺伝子を同定し、さらにすでに同定されているＣｒｙ遺伝子とわずかな相同性を共有し、かつＢｔ殺虫性遺伝子の新規ファミリーを実際に示す可能性のある遺伝子も同定してもよい。本発明の一実施形態において、目的のＢｔ菌株から単離される核酸物質は、殺虫性遺伝子の標的グループのすべてのメンバーに存在する相同領域（すなわち特徴的配列）に特異的である少なくとも１組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ（通常、リアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンドに掛けられる。本明細書において、「殺虫性遺伝子の標的グループ」とは、相同領域を含む公知の殺虫性遺伝子の任意のコレクションをいう。殺虫性遺伝子の標的グループのメンバーは、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために一列に並べられる。上記に示すように、殺虫性遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に存在する相同領域は、「特徴的配列」と呼ばれる。以下にさらに詳細に記述するように、殺虫性遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列内の特徴的配列は、ＰＣＲの第１および第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための基礎として役立つ。本発明のある態様において、標的グループは、鞘翅目からの昆虫に対して活性であるすべての公知の殺虫性Ｃｒｙ遺伝子（すなわち鞘翅目活性Ｃｒｙ遺伝子）を含む。他の実施形態において、標的グループは、例えば、鱗翅目および鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有するすべての公知のＢｔ遺伝子（双翅目からの昆虫に対して活性であるＣｒｙ遺伝子を除外する）を含む。殺虫性遺伝子の標的グループは、新規殺虫性遺伝子の研究の着手時に研究者によって選択され定義される。
【００２０】
殺虫性遺伝子の標的グループに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲによる増幅に適する条件下で、目的の微生物由来の核酸物質の第１試料およびＤＮＡポリメラーゼと混合される。本発明の方法は、ＰＣＲの第１ラウンドを行うことと、ＰＣＲ増幅産物の存在または非存在を検出することとをさらに含む。特定の実施形態において、ＰＣＲの第１ラウンドは、ＰＣＲ産物の存在を検出するためにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行うことを含む。
【００２１】
ＰＣＲの第１ラウンドにおいてＰＣＲ産物が検出される場合、目的の微生物由来の核酸の第２試料を取得して、ＰＣＲの第２ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて用いるオリゴヌクレオチドプライマーも、上述のように殺虫性遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列内の特徴的配列に特異的である。通常は、ＰＣＲの第１ラウンドで用いる逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲの第２ラウンドの順方向プライマーを生成し、それによってＰＣＲの第１ラウンドと第２ラウンドの間の架橋として役立たせる。ＰＣＲの第２ラウンドで用いる逆方向プライマーは、異なる特徴的配列（ＰＣＲの第１ラウンド用の逆方向プライマーを設計するために用いられる特徴的配列に対して通常３’に位置している）を標的にするように設計される。ＰＣＲの第２ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーは、特定の長さ（具体的には、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、より具体的には約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐ）のＰＣＲ産物を生成するようにさらに設計される。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドからのＰＣＲ反応物は、アガロースゲル電気泳動によって分離可能で、結果として生じる、予想される長さの核酸フラグメントを含むＰＣＲ産物は、クローニングベクター（具体的には、細菌性クローニングベクター）内に連結される。次いで、そのベクターは、コンピテントな宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細菌性細胞）に形質転換される。
【００２２】
適切な宿主細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、細菌性細胞、真菌細胞、植物細胞（双子葉類植物および単子葉植物）、ならびに動物細胞。特定の実施形態において、宿主細胞は細菌性細胞である。ポリヌクレオチドを種々の宿主細胞に送達するためのクローニングベクターは、当該技術分野で周知である。核酸分子をベクターにクローニングする方法、および宿主細胞を形質転換する方法は、当該技術分野で周知である。クローニング、パッケージング、および発現系の概要ならびに方法に関しては、以下を参照されたい。すなわち、Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９７９） Ｇｅｎｅ ８：８１−９７；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８９） Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｓ．１−３（２ｄ ｅｄ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．（１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；１９９４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ。
【００２３】
ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物を含む個々の細菌コロニー由来の核酸物質（例えば、プラスミド調製物）は、推定上の新規殺虫性遺伝子を同定するためにさらに分析に掛けられる。特定の実施形態において、個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、標的グループ内のすべての公知の殺虫性遺伝子を検出するよう設計されている標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてドットブロット分析によって分析される。オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントと相補的であるように設計される。オリゴヌクレオチドプローブは、標的グループ内の公知の殺虫性遺伝子を含む任意の核酸でも同定する（すなわち、「ドットプロット陽性」）ように設計される。ドットブロット分析を用いるこれらのオリゴヌクレオチドプローブによって検出されない任意の核酸（すなわち「ドットブロット陰性」）でも、推定上の新規殺虫性遺伝子、またはそのあり得るフラグメントを含み、その新規性を評価するためにさらに分析される。本方法に従って同定される推定上の新規殺虫性遺伝子のフラグメントは、配列決定されて、その新規性を評価するために公知の殺虫性遺伝子との配列比較に掛けられる。そのような配列分析は、当該技術分野で周知である。新規ヌクレオチド配列は、推定上の殺虫性遺伝子を取得するためにさらに分析される。一部実施形態において、推定上の新規殺虫性遺伝子を含む核酸分子は、発現ベクターにクローン化され、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドは、標準アッセイ法（例えば、本明細書で以下に記述するもの）を用いて殺虫活性をアッセイする。
【００２４】
新規殺虫性遺伝子の同定の目的で記述する上記方法は、また、目的の他の標的グループからの新規遺伝子を同定するために用いてもよい。本発明の方法を用いて非殺虫性遺伝子（具体的には非Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を同定する場合、核酸出発物質を目的の異なる生物から取得してもよい。しかし、他の方法ステップ、すなわち系統的なプライマー設計（本明細書で以下に記述する）、ＰＣＲの第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析は、目的の遺伝子の標的グループにかかわらず、基本的に同じ方法で行われる。
【００２５】
任意の１つの機序に限定する目的ではないが、本明細書で上記に明示するように、ＰＣＲ増幅の第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、特徴的配列を含む公知および新規１の両遺伝子の増幅を可能にするおよび可能性があるように設計される。これとは対照的に、本発明の第３のステップ（一般的にドットブロット分析）で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、公知の遺伝子だけを特異的に検出するように選択される。従って、ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドの間増幅される核酸物質を含むが、ドットブロット分析ステップの間検出されない生物（例えば微生物、具体的にはＢｔ菌株）は、新規遺伝子を含む可能性がある。
【００２６】
本発明の特定の態様において、本明細書で上述するＰＣＲ増幅の第１ラウンドで用いる少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することは、多段階プロセスを介して縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することを含む。ある実施形態において、遺伝子の標的グループのためのヌクレオチド配列アライメントが調製される。例えば、殺虫性遺伝子の標的グループは、鞘翅目（すなわち、鞘翅目活性遺伝子）からの昆虫に対して殺虫活性を有するすべての公知のＣｒｙ遺伝子を含み得る。標的グループ内の遺伝子は、相同ブロック（本発明では特徴的配列と呼ぶ）を共有する。特徴的配列は、以下に詳細に記述するように、オリゴヌクレオチドプライマーの設計の開始点として役立つ。特徴的配列は、遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に保存されるヌクレオチドのブロックであるが、標的グループ内の遺伝子ごとの特徴的配列においていくらかの相違が存在することもある。その結果、標的グループ内のすべての遺伝子に特異的である単一組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計できないこともある。従って、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いることで、標的グループに現れる特徴的配列のすべての可能な変異を網羅できる。遺伝子の標的グループ内の特徴的配列の配列変異のために、全標的グループ内の特徴的配列に特異的である１組のプライマーを開発することが困難であるまたは不可能な場合、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を利用することによって、特定の用途を見出す。可能な場合、標的グループ内のできるだけ多くの遺伝子に特異的である単一組のプライマーを設計して用いる。新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を同定するための本発明のある態様において、ＰＣＲの第１ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、公知のＢｔ Ｃｒｙ遺伝子の標的グループの「ドメイン１」の特徴的配列を標的化するように設計され、ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、「ドメイン２」の特徴的配列に特異的である。
【００２７】
ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いる縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することは、以下に記述するプライマー設計の適切な開始点であるいくつかの相同領域を同定するために、遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列アライメントをスキャンすることを含む。これらの相同領域は、「特徴的配列」と呼ばれる。プライマー長が約１５塩基対（ｂｐ）〜約３０ｂｐの間（例えば、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、２８ｂｐ、２９ｂｐ、および３０ｂｐ）である最初のプライマーが選択される。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーのスクリーニングの第１ラウンドが、特徴的配列のうちの１つで近接するヌクレオチドの最初の領域を観察することで行われる。最初の領域は、選択される特徴的配列の５’末端で始まり、かつ最初のプライマー長に等しい長さである。最初の領域内のヌクレオチド配列を見直して、その配列が以下の所要の配列特徴を有しているかどうかを決定する。ＰＣＲの第1ラウンドまたは第２ラウンドで用いるプライマーの適切なヌクレオチド配列は、
１）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
２）ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
３）約５０℃〜６５℃の間、より具体的には約５４℃±２℃の融解温度を有する；
４）ヘアピン構造または二量体構造を形成しない、
５）遺伝子の標的グループからの少なくとも１つのヌクレオチド配列に存在する（すなわち、上述のアライメント）、および
６）非標的グループ遺伝子からのヌクレオチド配列の間では保存されてない。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプライマーの多様性を増加させるために、１つのヌクレオチド残基は、ｎであることが許され、ここでｎはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。上述の配列特徴がすべて存在する場合、最初の領域内のヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択される。最初の領域内のヌクレオチド配列がこれらの配列特徴をすべて有しない場合、近接するヌクレオチドの隣接する領域が、特徴的配列の３’末端に向かって１塩基対ずつ最初の領域を移動させることによって選択される。隣接する領域内のヌクレオチド配列は、上述のように見直され、配列特徴のすべてが存在する場合、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択される。上記の要件を満たすヌクレオチド配列を同定するために、必要に応じてさらにスクリーニングのラウンドが行われる。所要の特徴を有する特徴的配列内のオリゴヌクレオチドは選択されて、ＰＣＲの第1ラウンドまたは第２ラウンドでオリゴヌクレオチドプライマーとして用いられる。順方向および逆方向の両プライマーは、上述のように設計される。さらに、ＰＣＲの第1ラウンドで用いる順方向および逆方向のプライマーは、標的グループの遺伝子内で、約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的であるように設計される。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドの順方向および逆方向のプライマーは、標的グループの遺伝子内で、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的であるように設計される。
【００２９】
本明細書において上述のヌレオチド残基が任意のヌクレオチド（すなわち、ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）であることを許される注意付きで、同一のヌクレオチド配列が標的ブループの少なくとも１つのメンバーのヌクレオチド配列に見出される場合、ヌクレオチド配列は、遺伝子の標的グループからの少なくとも１つのヌクレオチド配列に「存在」する。用語「殺虫性遺伝子の非標的グループ」とは、標的グループとして選択された殺虫性遺伝子を除き、殺虫性遺伝子の特定のファミリー内のすべての殺虫性遺伝子をいう。例えば、標的グループが鞘翅目活性であるすべてのＢｔ Ｃｒｙ遺伝子を含む場合、殺虫性遺伝子の対応する非標的グループは、鞘翅目からの昆虫に対して活性であるものを除くすべてのＢｔ 遺伝子を含む。同様に、「非標的遺伝子」または「遺伝子の非標的グループ」とは、標的グループとして選択されたそれらの遺伝子を除く、殺虫性遺伝子の特定のファミリー内のすべての遺伝子をいう。ヌクレオチド配列が非標的グループ内のすべてのヌクレオチド配列と少なくとも２つのヌクレオチド残基で異なる場合、それは、「非標的グループ遺伝子からのヌクレオチド配列の間で保存されていない」。本発明のある態様において、近接するヌクレオチドの特定の領域内のヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子の間で保存されていないかどうかを決定することは、遺伝子の非標的グループからの各遺伝子の全長配列を検索することを含む。一部実施形態において、遺伝子の非標的グループからの各遺伝子の全長配列は、文字検索用語として領域内のヌクレオチド配列を用いて徹底的に検索される。すなわち、領域内のヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子のどこかに現れる場合、または２つ以内の異なるヌクレオチド残基を有するヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子のどこかに現れる場合、領域内の特定のヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーとして選択されない。
【００３０】
上述のように、ＰＣＲの第１ラウンドで用いる逆方向プライマーは、ＰＣＲの第２ラウンド用の順方向プライマーを生成するために、一般的に用いる。ＰＣＲの第２ラウンド用の逆方向プライマーは、プライマー設計のための開始点として異なる特徴的配列（具体的には、ＰＣＲの第１ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられた特徴的配列に対して３’にあるもの）を用いて、上述の方法に従って設計される。ＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドのための典型的なプライマー設計の概略図を、図１に示す。
【００３１】
遺伝子の標的グループ内の特徴的配列は、一般的にすべてのメンバー間で同一でないので、これらの配列の差異を明らかにするために、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物がＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドの両方で、通常用いられる。オリゴヌクレオチドプライマーの混合物が本発明のＰＣＲ反応で用いられる場合、プライマーは、すべてのプライマーが同一のまたはほぼ同一の融解温度を有するようにさらに設計される。一部実施形態において、ＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーの融解温度は、約５４℃±２℃である。
【００３２】
「殺虫性遺伝子」とは、殺虫活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書において、用語「殺虫活性」とは、害虫の成長、摂食、または繁殖を阻害するため、ならびに／あるいは害虫を死滅させるための物質（例えば、ポリペプチド）の能力をいう。「殺虫性ポリペプチド」または「昆虫毒素」は、殺虫活性を有するタンパク質を意味することを意図する。殺虫活性は、当該技術分野で公知の日常的なアッセイによって測定できる。そのようなアッセイとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、適切な期間の間その物質を摂食させ、物質に曝露させた後の、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫撥水性、害虫誘引、および害虫の行動変化および物理的変化。一般的な方法は、囲った容器中の飼料源に実験的化合物または生物を添加することを含む。殺虫活性を評価するアッセイは、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，５７０，００５号および第６，３３９，１４４号（それら全体を参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。
【００３３】
殺虫活性を試験するための好ましい発育段階は、目的の昆虫の幼虫または未成熟の形態である。昆虫は、約２０℃〜約３０℃の温度、約３０％〜約７０％の相対湿度で、真っ暗闇で飼育されることもある。Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ （１９９０） Ｊ． Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３（６）：２４８０−２４８５に記述されるように、バイオアッセイを実施してもよい。昆虫の幼虫を飼育する方法およびバイオアッセイを実施する方法は、当業者にとって周知である。
【００３４】
本発明の一部実施形態において、目的の標的グループは、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子またはＢｔ遺伝子の特定サブセット（例えば、鞘翅目活性Ｂｔ Ｃｒｙ遺伝子等）を含む殺虫性遺伝子である。「Ｂｔ」または「バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）」遺伝子は、Ｂｔ毒素をコードするＢｔの種々の菌株に見出される広範なクラスの遺伝子を意味することを意図し、例えば、Ｃｒｙ（結晶）毒素（すなわち、δ−内毒素）およびＣｙｔ（細胞傷害性）毒素等の毒素を含む。「Ｃｒｙ毒素」および「Ｃｙｔ毒素」としては、公知のＣｒｙタンパク質またはＣｙｔタンパク質とそれぞれ相同である殺虫性ポリペプチドが挙げられる。Ｃｒｙ遺伝子としては、Ｃｒｙ毒素として分類される任意のポリペプチド（例えば、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８およびＣｒｙ９）をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：８０７−８１３およびＣｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｔｏｘｉｎ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｔ ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（それら全体を参照することにより本明細書でこれら両参考文献を援用する）を参照されたい。Ｂｔ毒素は、プロトキシン毒素として合成され、かつ副芽胞封入体として結晶化する殺虫性タンパク質のファミリーである。害虫によって経口摂取されると、微結晶構造は昆虫の中腸のアルカリ性ｐＨによって溶解され、プロトキシン毒素は昆虫の腸のプロテア−ゼによって切断されて活性毒素を生成する。活性化Ｂｔ毒素は、昆虫の腸上皮内の受容体に結合して、膜病変および付随する昆虫の腸の膨張および溶解を引き起こす。昆虫の死は、飢餓性衰弱および敗血症に起因する。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８１５−８２１を参照されたい。
【００３５】
Ｃｒｙ毒素のプロトキシン毒素の形態は、結晶形成セグメントを含む。様々な特異性の活性Ｃｒｙ毒素のアミノ酸配列を比較することにより、高度に保存された５つの配列ブロックがさらに明らかになる。構造的に、Ｃｒｙ毒素は、Ｎ末端からＣ末端に存在する３つの明確なドメインを含む。すなわち、ポア形成にかかわる７つのαヘリックスのクラスター（「ドメイン１」と呼ばれる）、細胞結合にかかわる３つの逆平行βシート（「ドメイン２」と呼ばれる）、およびβサンドイッチ（「ドメイン３」と呼ばれる）。これらのドメインの位置および特徴は、当業者にとって公知である。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１）ｓｕｐｒａおよびＭｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９：４０９−４１７を参照されたい。
【００３６】
最初のＢｔ毒素の命名法系は、殺虫活性プロファイルに基づいて毒素を分類した。この系は、アミノ酸配列相同性だけに基づく新規命名法に入れ替えられてきた。この系の下で、Ｃｒｙ毒素およびＣｙｔ毒素は、アミノ酸配列相同性に基づいてクラスまたはファミリーにグループ化され、その毒素の名称は、他の配列とその相同性に関しての情報を提供する。従って、例えば、Ｃｒｙ２ファミリーのメンバーであるＣｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、およびＣｒｙ２Ａｃの毒素は、およそ８０％のアミノ酸配列相同性を共有する。同様に、Ｃｒｙ８ファミリー毒素であるＣｒｙ８ＡａおよびＣｒｙ８Ｂａは、およそ６５％のアミノ酸配列相同性を共有する。Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， ｓｕｐｒａを参照されたい。
【００３７】
ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドの両方で用いられ、かつ本発明の方法に従って設計された目的の標的グループ（例えば、殺虫性遺伝子の標的グループ）内の特徴的配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、約５０℃〜６５℃の熱融解点（Ｔｍ）または融解温度を有するように設計される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、約５２℃〜５６℃、より具体的には約５４℃のＴｍを有する。Ｔｍを決定するためにいくつかの式が利用されている。Ｔｍを算出するための任意の式も、本方法を実行するために用いることができる。例えば、最隣接熱力学に基づくＴｍ決定のための古典的なアルゴリズムは、以下の通りである。
【００３８】
【化１】
ここで、ＥＨ０およびＥＳ０は、それぞれヘリックス形成のためのエンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒはモル気体定数（１．９８７（カロリー）（Ｋ−１）（モル−１）であり、Ｃｔは全鎖（プライマー）濃度であり、Ｘは塩濃度である。Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８（２１）：６４０９−６４１２。さらに、一部実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍは、以下の式を用いて算出される。
【００３９】
Ｔｍ＝（ＥＨ０／［ＥＳ０＋（Ｒ×Ｉｎ（Ｃｔ））］−２７３．１５＋１６．６ ｌｏｇ（［Ｘ］））×１．１１４４−１４．９６４
ここで、ＥＨ０（エンタルピー）＝Σ ΔＨ；ＥＳ０（エントロピー）＝Σ ΔＳ＋０．３６８×１９×１．５８５；Ｒ（モル気体定数）＝１．９８７；Ｃｔ（全プライマー濃度）＝ｌｏｇ（０．０００００００５／４）×１０００；およびＸ（塩濃度［Ｋ＋］）＝０．０５である。
【００４０】
本発明の方法を実施するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、対ごとに２つの個々のプライマー（すなわち、順方向プライマーと逆方向プライマー）が存在するように対をなすオリゴヌクレオチドプライマーであることを、当業者は認識するであろう。各対内の１つのプライマーは、遺伝子の標的グループからの特徴的配列の５’鎖の部分（順方向プライマー）と相補的（すなわち、ハイブリダイズ可能）であり、一方もう1つのプライマーは、特徴的配列の３’鎖の部分（逆方向プライマー）と相補的である。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅コピー（すなわち、「ＰＣＲ増幅産物」または「ＰＣＲ産物」）を生成するために適切なポリメラーゼが各３’鎖の配列を各プライマーにコピーするように、設計される。本発明の方法は、ＰＣＲ増殖のために少なくとも1対のオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。本発明のある態様において、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のプライラー対を含むオリゴヌクレオチドプライマー対の混合物が用いられる。目的の特定のヌクレオチド配列（例えば、特徴的配列）に特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを設計する方法は、当該技術分野で周知である。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）の増幅を可能にする適切な長さである。各対の個々のプライマーは、一般的に、約１５ｂｐ〜約３０ｂｐ、より具体的には約２０ｂｐ〜約２５ｂｐを含む。さらに、1対のオリゴヌクレオチドプライマーにおける個々のプライマー間の距離は、検出可能な長さのＰＣＲ産物を生成するのにも十分な距離である。従ってＰＣＲの第1ラウンドにおいて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、遺伝子の標的グループのメンバーのヌクレオチド配列内で、一般的に約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れている、より具体的には約１００ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的になるように選択される。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて、順方向ブラマーおよび逆方向プライマーは、標的グループ内のヌクレオチド配列と通常相補的であり、これらのヌクレオチド配列は、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ離れている、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ離れている、より具体的には約６００ｂｐ〜約６５０ｂｐ離れている。
【００４２】
本方法で用いる核酸物質は、目的の任意の生物から任意の方法で取得してもよい。目的の生物としては、例えば、微生物（より具体的には、Ｂｔ菌株）、植物、動物、真菌、細菌、および昆虫が挙げられる。核酸物質は、例えば、目的の生物から調製したプラスミドＤＮＡ（例えば、Ｂｔ菌株）を含む。一部実施形態において、核酸物質を取得することは、目的の生物、具体的には目的の微生物からＤＮＡを単離することを含む。核酸物質は、例えば、ゲノムＤＮＡを含んでもよい。本発明の特定の態様において、核酸物質は、Ｂｔ菌株から生成されたプラスミドライブラリーを含む。ＰＣＲ増幅の複数のラウンドを行う場合、生物由来の核酸物質の試料を新たに取得して、ＰＣＲの各ラウンドで用いてもよい。従って、例えば、新規ＤＮＡプラスミドの調製を、ＰＣＲの各ラウンドで用いるＢｔ菌株から調製してもよい。
【００４３】
ＰＣＲによる核酸増幅は、分子生物の基本的な技法である。ＰＣＲを行う方法は、当該技術分野で周知であり、かつ市販されている器具使用で実行可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９５） ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９９） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これらすべてを参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。簡単に言えば、ＰＣＲは、目的の標的配列を含む核酸物質（例えば、目的の遺伝子由来のＤＮＡ）の迅速かつ効率的な増幅を可能にする。増幅すべき核酸物質、オリゴヌクレオチドプライマー、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）は、ＰＣＲ増幅に適した条件下で混合される。ＰＣＲ反応混合物は、十分な量の４つのデオキシヌクレオシド三リン酸および塩化マグネシウムをさらに含む。ＰＣＲ用の個々の反応成分は市販されており、いくつかの会社（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ等）によって販売されている。核酸物質およびオリゴヌクレオチドプライマーをただ加えればよい、すでに調製されている反応混合物または「マスターミックス」も入手可能である。オリゴヌクレオチドプライマー間の核酸配列のコピーを検出可能な量まで生成するには、ＰＣＲを少なくとも1回実行すれば十分である。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＣＲ（具体的には、リアルタイムＰＣＲ、より具体的には定量リアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンドを行うことを含む。リアルタイムＰＣＲは、増幅反応の初期段階でＰＣＲ産物の検出を可能にする。具体的に言うと、リアルタイムＰＣＲにおいて、ＰＣＲ産物の定量化が、プラトーに達するまで核酸物質の量が対数的に増幅されるわずか数サイクルに依存する。対数期の間、標的核酸物質の量は、サイクルごとに倍加されるはずであり、限定試薬によるバイアスがない。リアルタイムＰＣＲを行う方法および器具使用は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｂｕｓｔｉｎ （２０００） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９−１９３；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１２：１２４−１２５；Ｈａｌｆｏｒｄ （１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：８３５；およびＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６（１０）：９８６−９９４を参照されたい。これら全体を参照することによってこれらすべてを本明細書に援用する。本発明のある態様において、ＰＣＲ増幅の第１ラウンドは、リアルタイムＰＣＲを行うことを含む。
【００４５】
本明細書において、ＰＣＲ増幅産物を「検出すること」とは、本発明のＰＣＲステップによって増幅される核酸の存在、非存在、または量を検出するための任意の方法を含む。検出の方法によって、増幅のレベルに関する定性的または定量的な情報を提供可能である。ＰＣＲ増幅産物を検出するためのそのような方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動アッセイ、サザンブロッティング／プローブハイブリダイゼーションアッセイ、および蛍光アッセイが挙げられる。
【００４６】
ＰＣＲモニタリングおよびＰＣＲ産物の検出のために数多くの様々な染料およびプローブが利用可能である。例えば、リアルタイムＰＣＲ増幅によって生成されるＰＣＲ産物は、種々の蛍光染料と蛍光分子を用いて共有結合標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを用いて検出可能である。そのような蛍光実体は、ＰＣＲ産物の存在を示し、ＰＣＲ産物の量に関するシグナルを表示可能である。さらに、ＰＣＲ産物の連続蛍光モニタリングを用いて、シグナルがバックグラウンドの上で検出される点（Ｃｔ、サイクル閾値）および対数期にある点を決定可能である。鋳型核酸配列が豊富であればあるほど、Ｃｔはより早く達成される。
【００４７】
二本鎖ＤＮＡに特異的な染料を用いることによって、配列特異的プローブを合成する必要なく、任意のＰＣＲ増幅においてもＰＣＲ産物の形成を検出できる。そのような染料は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に特異的に結合し、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ，ＳＹＢＲ Ｇｏｄ（登録商標），および臭化エチジウム。「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ」とは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩを含む、市販されている任意のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料をいう。ｄｓＤＮＡ染料を用いて、産物特異性を、融解曲線の分析することによってまたは非特異的産物が融解する高温で蛍光を得ることによって増加可能である。Ｒｉｒｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５：１５４−１６０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：９５４−９６２を参照されたい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光分子を用いて共有結合標識され、ＰＣＲ産物を検出するために用いられることもできる。ヘアピンプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）プライマー）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（登録商標））、およびエキソヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）は、ＰＣＲの間にモニタリング可能な二重標識蛍光オリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、同じオリゴヌクレオチド上で消光剤によるフルオロフォアの蛍光消光に依存する。ハイブリダイゼーションまたはエキソヌクレアーゼ加水分解が起こると、蛍光が増加する。
【００４９】
ＰＣＲ産物はまた、それぞれ蛍光プローブで標識化された２つのオリゴヌクレオチドを用いて検出可能である。これらのオリゴヌクレオチドと標識核酸とのハイブリダイゼーションによって、２つの蛍光プローブを近づけ、共鳴エネルギー移動が可能になる。
例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８を参照されたい。蛍光共鳴エネルギー移動対として使用可能なフルオロフォア対は、当業者にとって周知であり、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリトリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ６４０、およびフルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ７０５。
【００５０】
本発明のある態様において、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料を用いてＰＣＲの第１ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物、より具体的にはリアルタイムＰＣＲ産物を検出する。上述のように、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎはｄｓＤＮＡの副溝に結合する蛍光染料である。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染料がｄｓＤＮＡに結合すると、蛍光発光の強度が増加する。従って、二本鎖ＰＣＲ産物がさらに産生されるにつれて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの蛍光シグナルも増加する。本発明の他の態様において、５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、ＰＣＲ（具体的にはリアルタイムＰＣＲ）をモニターして、ＰＣＲ増幅産物を検出する。５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ試薬混合物に付加する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、５’末端（例えば、ＦＡＭ）に高エネルギー蛍光リポーターと、３’末端（例えば、ＴＡＭＲＡ）に低エネルギー消光剤染料とを含む。プローブがインタクトな場合、リポーター染料の蛍光発光は、消光剤の近接近によって抑制される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の特定の雛型配列にアニールするようにさらに設計される。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ポリメラーゼの経路で雛型核酸物質に結合する。ＰＣＲ増幅は、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって、消光剤を含むプローブからリポーター染料の切断および放出をもたらす。従って、放出されるリポーター染料から生成される蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物の量と比例する。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎプローブまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うための方法および器具使用（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態において、ＰＣＲ増幅の第1ラウンドからのＰＣＲ産物は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを用いて検出される。
【００５１】
上記のように、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物は、通常アガロースゲル電気泳動によって分離さる。標的グループ内の公知の遺伝子をさらなる考察から除外すために、予想される長さの核酸分子は単離されて、ドットブロット分析に掛けられる。
【００５２】
「ドットブロット分析」または「ドットブロットハイブリダイゼーション」は、分子生物の分野では標準方法である。通常は、ドットブロットハイブリダイゼーションは、例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上で核酸物質を固定化することを含む。ハイブリダイゼーションに適した条件下で、固定化した核酸物質は、標識オリゴヌクレオチドプローブに曝露され、結合したプローブの存在または非存在が検出される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ結合の検出を容易にするために、放射性標識または非放射性標識で標識化できる。種々の放射性標識および非放射性標識が当該技術分野で利用可能である。そのような標識として、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、蛍光分子、トリチウム（３Ｈ）が挙げられる。ドットブロット分析で用いる標識オリゴヌクレオチドプローブを生成する方法は、当該技術分野で周知である。
【００５３】
本発明の方法においてドットブロット分析で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、標的グループ内のすべての公知の遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）に特異的である。オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントに相補的であるように設計される。本発明のドットブロット分析のステップのためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の概略図を図１に示す。特定の実施形態において、標的グループのすべての公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの混合物を用いる。配列相違のために、全標的グループに対して特異的である単一のプローブを開発することが困難な場合、各プローブが標的グループ内の１つの遺伝子に対して特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの混合物を設計することは、特に有用性を見出す。可能な場合、標的グループ内のできるだけ多くの遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）に対して特異的である単一組のプローブを設計して用いる。さらに、複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブを、複数のフローブの混合物として単一のドットブロット膜と共にインキュベートしてもよい。あるいは、多重膜を調製して、個々のプローブと共に別々にインキュベートしてもよい。ドットブロットオリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、長さが約２０ｂｐ〜約４０ｂｐ、具体的には約２５ｂｐ〜約３５ｂｐ、より具体的には約３０ｂｐ〜役３５ｂｐである。さらに、ドットブロット分析で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、一般的に少なくとも約７０℃、具体的には少なくとも約７５℃、より具体的には少なくとも約８０℃のＴｍを有するように設計される。オリゴヌクレオチドプローブの混合物を用いる場合、それぞれのプローブは、大体同一のＴｍを有するように設計される。
【００５４】
当業者は、新規殺虫性遺伝子、より具体的には新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を含む新規遺伝子を同定するための方法または任意のステップも、自動化方法、半自動化方法、または手動方法で実行可能であることを認識する。本明細書に開示する方法は、高スループットスクリーニングアッセイで用いることもできる。
【００５５】
本発明の組成物は、新規遺伝子を有する単離したポリヌクレオチド、ならびにその変異体およびフラグメントを含む。そのような新規遺伝子は、本発明の方法を用いて同定される。本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを含むアミノ酸配列をさらに提供する。本発明で提供する方法によって同定される新規核酸分子および殺虫性ポリペプチドは、例えば、害虫関連損害から植物を保護することに有用性を見出す。
【００５６】
本発明は、単離したもしくは実質的に精製したポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を包含する。「単離した」もしくは「精製した」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、あるいはそれの生物活性の部分には、その自然発生の環境で見出されるように、ポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随して起こるまたは相互作用する成分が、実質的にもしくは本質的に存在しない。従って、単離されたもしくは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え方法によって生成される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成される場合、実質的に化学プロトキシンまたは他の化学物質を含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドの両側に（すなわち、ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する配列）自然に位置する配列（配列を最適にコードするタンパク質）がない。例えば、種々の実施形態において、単離されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドの両側に自然に位置する、およそ５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、混入タンパク質の（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物活性部分を組換えで生成する場合、最適な培養培地は、化学プロトキシンまたは非タンパク質の目的の化学物質の（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満を表す。
【００５７】
本明細書において、「核酸」は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを参照することを含み、限定しない限り、自然発生のヌクレオチドと同様の方法でそれらが一本鎖核酸にハイブリダイズするという点において、天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する公知の類似体（例えば、ペプチド核酸）を包含する。
【００５８】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明をＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定することを意図しない。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌレオチドとの組み合わせを含むことができることを当業者は認識するだろう。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、自然発生の分子および合成の類似体の両方を含む。本発明のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態等に限定されず、配列のすべての形態も包含する。
【００５９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーをいうために互換的に用いられる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が自然発生のアミノ酸に対応する人工的な化学類似体であるアミノ酸、ならびに自然発生のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６０】
本明細書において、特定のポリヌクレオチドまたはそのコードされるタンパク質に関して「全長配列」とは、天然配列の核酸配列全体またはアミノ酸配列全体を有することを意味する。「天然配列」とは、内在性配列（すなわち、生物のゲノムで見出される非操作された配列）を意味することを意図する。全長ポリヌクレオチドは、特定のタンパク質の全長形態をコードする。
【００６１】
本明細書において、特定の核酸と関連して用いる場合、用語「コードする」または「コードされる」とは、その核酸が、特定のタンパク質へのヌクレオチド配列の翻訳を方向づける必要情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸分子は、核酸分子の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むこともあり、またはそのような介在する非翻訳配列（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）がないこともある。
【００６２】
開示するポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体ならびにそれらによってコードされるたんぱく質も、本発明によって包含される。「フラグメント」とは、ポリヌクレオチドの部分またはアミノ酸配列および従ってそれによってコードされるタンパク質の部分を意味する。ポリヌクレオチドのフラグメントは、天然のタンパク質の生物活性を保持し、従って例えば殺虫活性を保有するタンパク質フラグメントをコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるポリヌクレオチドのフラグメントは、通常、生物活性を保持するフラグメントタンパク質をコードしない。従って、ポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから本発明のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでにわたることもある。
【００６３】
タンパク質の生物活性部分をコードする本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、または２５０の近接するアミノ酸をコードする、または本発明の全長タンパク質（例えば、殺虫性タンパク質）に存在するアミノ酸の総数までをコードする。ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用であるポリヌクレオチドのフラグメントは、通常、タンパク質の生物活性部分をコードする必要がない。
【００６４】
従って、ポリヌクレオチドのフラグメントは、タンパク質の生物活性部分をコードすることもあり、または以下に開示する方法を用いてハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いることができるフラグメントでもあり得る。タンパク質の生物活性部分は、本発明のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、タンパク質のコードされた部分を発現させて（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換え発現によって）、タンパク質のコードされた部分の生物活性を評価することによって調製可能である。本発明の方法によって同定されるヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、もしくは１，４００の近接するヌクレオチド、または本明細書で開示する全長ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの数から成る。
【００６５】
「変異体」とは、実質的に同様の配列を意味することを意図する。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位で１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／あるいは天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位で１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、それぞれ自然発生のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重のために本発明のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。これらのような自然発生の対立遺伝子変異体は、周知の分子生物法（例えば、以下に概要を述べるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法およびハイブリダイゼーション法等）を用いることで同定可能である。変異体ポリヌクレオチドは、例えば、依然として本発明の生物活性タンパク質（例えば、殺虫性タンパク質）をコードする部位特異的変異誘発を用いることで生成されるポリヌクレオチド等の合成的に誘導されるポリヌクレオチドも含む。通常、本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体は、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所で記述するパラメータによって決定されるように、その特定のポリヌクレオチドに少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上の配列相同性を有する。
【００６６】
本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体（すなわち、参照ポリヌクレオチド）は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列相同性の割合を比較することによって評価可能である。従って、例えば、本発明のポリペプチドに対して所定の割合の配列相同性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。任意の２つのポリペプチド間の配列相同性の割合を、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所に記述するパラメータを用いて算出可能である。本発明のポリヌクレオチドの任意の所定の対を、それらがコードするそれら２つのポリペプチドによって共有される配列相同性の割合を比較することによって評価する場合、それら２つのコードされたポリペプチド間の配列相同性の割合は、少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列相同性である。
【００６７】
「変異体」タンパク質は、天然のタンパク質の１つ以上の内部部位で１つ以上のアミノ酸の欠失または付加によって、ならびに／あるいは天然のタンパク質の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の置換によって天然のタンパク質から得られるタンパク質を意味することを意図する。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物活性である。すなわち、本明細書に記述するように、それらのタンパク質は天然のタンパク質の所望の生物活性（例えば、殺虫活性）を所有し続ける。そのような変異体は、例えば、遺伝子多型または人間の操作から生じ得る。本発明の天然のタンパク質の生物活性変異体は、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所で記述するパラメータによって決定されるように、その天然のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上の配列相同性を有する。本発明のタンパク質の生物活性変異体は、そのタンパク質とわずか１〜１５のアミノ酸残基、わずか１〜１０（例えば６〜１０）、わずか５、わずか４、３、２、またはただ１つのアミノ酸残基が異なることもある。
【００６８】
本発明のタンパク質を、アミノ酸の置換、欠失、切り詰め、および挿入を含む種々の方法で変化させることができる。そのような操作方法は、通常、当該技術分野で公知である。例えば、殺虫性タンパク質もしくは他のタンパク質のアミノ酸配列変異体およびフラグメントは、ＤＮＡにおける変異によって調製可能である。変異誘発およびポリヌクレオチド改変の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ， ｅｄｓ． （１９８３） Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびそれらに引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、以下のモデルに見出すことができる。すなわち、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）（参照することによって本明細書に援用する）。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する）は、最適であることもある。
【００６９】
このように、本発明のポリヌクレオチドは、自然発生配列ならびに突然変異型の両方を含む。同様に、本発明のタンパク質は、自然発生のタンパク質ならびにそれらの変異体および修飾形態の両方を包含する。そのような変異体は、所望の生物活性（例えば、殺虫活性）を所有し続ける。明らかに、変異体をコードするＤＮＡにおいてなされる突然変異は、リーディングフレーム外に配列を配置すべきでなく、二次ｍＲＮＡ構造を生成可能な相補領域を最適に作製しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照されたい。
【００７０】
本発明に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、タンパク質の特徴において極端な変化をもたらすことは期待されない。しかし、実行に先駆けて置換、欠失、または挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、日常的なスクリーニングアッセイによってその効果が評価されることを認識する。例えば、新規殺虫性タンパク質の変異体の活性を、殺虫活性をアッセイすることによって評価できる。例えば、米国特許第６，５７０，００５号および第６，３３９，１４４（これらを、参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。
【００７１】
変異体ポリヌクレオチドおよびタンパク質も、変異誘発および組換え誘導方法（例えば、ＤＮＡ混合）から生じる配列およびタンパク質を包含する。そのような方法を用いて、タンパク質をコードする１つ以上の配列を操作して、所望の特性（例えば、殺虫活性）を有する新規ポリペプチドを作製可能である。この方法で、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列相同性を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組み換え可能な配列領域を含む関連する配列ポリヌクレオチドの集団から作製される。例えば、このアプローチを用いて、目的のドメインをコードする配列モチーフは、目的の改善された特性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を取得するために、本発明の遺伝子（例えば、新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）と、他の公知の関連遺伝子との間で組み替えられ得る。そのようなＤＮＡ混合のための戦略は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許５，６０５，７９３号および第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、他の生物（具体的には、他の微生物）由来の対応する配列を単離可能である。このように、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション等の方法を用いて、そのような配列を、本明細書に記載する配列とのそれらの配列相同性に基づいて同定可能である。本明細書に記載する全配列またはそれらの変異体およびフラグメントとのそれらの配列相同性に基づいて単離される配列は、本発明によって包含される。そのような配列は、開示する配列の相同分子種である配列を含む。「相同分子種」は、共通祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種に見出される遺伝子を意味することを意図する。異なる種に見出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらのコードされるタンパク質配列が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上配列相同性を共有する場合、相同分子種と考えられる。相同分子種の機能は、種の間で高度に保存されることが多い。従って、目的の生物活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェント条件下で本明細書に開示する配列またはその変異体もしくはフラグメントにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドは、本発明によって包含される。
【００７３】
ＰＣＲアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の任意の生物から抽出したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅させるために、ＰＣＲ反応で用いるように設計できる。ＰＣＲプライマーの設計方法およびＰＣＲクローニング方法は、通常、当該技術分野で公知でありＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９５） ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９９） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ＰＣＲの公知の方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、対プライマー、入れ子プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチングプライマ等を用いる様々な方法。
【００７４】
ハイブリダイゼーション法において、公知のポリヌクレオチドのすべてまたは一部を、選択した生物由来のクローン化ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、かつ検出可能なグループ（例えば、３２Ｐ、または他の任意の検出可能なマーカー）で標識化してもよい。従って、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブを、本発明の殺虫性ポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識化することによって作製してもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製方法、ならびにｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築方法は、通常、当該技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００７５】
本発明が目的の公知の遺伝子の任意の標的グループと相同領域（すなわち特徴的配列）を共有する新規遺伝子（具体的には新規殺虫性遺伝子、より特定すると新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒遺伝子）を同定するためのさらに効率的な方法を提供し、一方当業者は、当該技術分野で公知の標準方法を用いて本明細書で開示するポリヌクレオチドと相同である配列を同定できること認識するだろう。例えば、本明細書で開示される全ポリヌクレオチドまたはその1つ以上の部分は、対応するポリヌクレオチドおよびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして用いられることもある。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブは、ポリヌクレオチド配列の間でも独特であって、かつ好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を含む。そのようなプローブを用いて、選択した生物由来の対応するポリヌクレオチド（例えば、殺虫性ポリヌクレオチド）をＰＣＲによって増幅してもよい。この手法を用いて、所望の生物から付加的なコード配列を単離可能であり、または診断アッセイとして生物中のコード配列の存在を決定可能である。ハイブリダイゼーション法は、プレートに播種したＤＮＡライブラリー（プラークまたはコロニーのいずれか）のハイブリダイゼーションスクリーニングを含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００７６】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件下で行われ得る。「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、他の配列に対するよりも、ブロープがその標的配列と検出可能なより高い程度まで（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍大きい）ハイブリダイズする条件を意味することを意図する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、かつ様々な状況で異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄の条件を調節することによって、プローブと１００％相補的である標的配列が同定できる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整することよって、低度の類似性が検出されるよう、配列中のいくつかのミスマッチングを許容できる（異種プロービング）。通常、プローブは、約１０００未満のヌクレオチド長、好ましくは５００未満のヌクレオチド長である。
【００７７】
一般的に、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、通常、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩類）でありかつ短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対して温度は少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０を超えるヌクレオチド）に対しては少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェント条件は、また、脱安定化剤（例えばホルムアミド）を添加することによって達成可能である。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、３７℃で１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝溶液を用いるハイブリダゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中ストリンジェンシー条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。任意に、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続時間は、通常、約２４時間未満、普通は約４〜１２時間である。洗浄時間の持続時間は、少なくとも平衡に達するのに十分な時間である。
【００７８】
特異性は、一般的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、決定的因子はイオン強度および最終洗浄溶液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、以下のＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８：２６７−２８４の式から概算できる。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ。ここで、Ｍは一価陽イオンのモル数であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチングしたプローブにハイブリダイズする（明示したイオン強度およびｐＨで）時の温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチングごとに約１℃ずつ低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄の条件を調整して、所望の相同性を有する配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の相同性を有する配列を求める場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。通常、ストリンジェント条件は、特定の配列および明示したイオン強度およびｐＨでのその相補体ついてのＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。しかし、高度のストリンジェント条件は、そのＴｍよりも１、２、３、または４℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができ、中度のストリンジェント条件は、そのＴｍよりも６、７、８、９、または１０℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができ、低ストリンジェンシー条件は、そのＴｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができる。該式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、ならびに所望のＴｍを用いることは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の溶液のストリンジェンシーにおける変化が本質的に説明されていることを当業者は理解する。ミスマッチング結果の所望の程度が４５℃未満（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）のＴｍの結果になる場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を上げることが最適である。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲な手引書は、以下に見出される。すなわち、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；および Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａl．， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００７９】
以下の用語を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を説明する。すなわち、（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較領域」、（ｃ）「配列相同性」、および「配列相同性の割合」である。
【００８０】
（ａ）本明細書において、「参照配列」は、配列比較の基礎として用いる定義された配列である。参照配列は、特定の配列（例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントとして、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列）のサブセットまたは全体であり得る。
【００８１】
（ｂ）本明細書において、「比較領域」はポリヌクレオチド配列の近接する特定のセグメントについて言及する。ここで、ポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの最適なアライメントのための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較して、比較領域内のポリヌクレオチド配列が付加もしくは欠失（すなわちギャップ）を含み得る。通常、比較領域は、長さが少なくとも２０の近接するヌクレオチドであり、場合により、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長さであり得る。ポリヌクレオチド配列におけるギャップの封入体のために参照配列に対する高度な類似性を回避するために、一般的にギャップペナルティが導入され、マッチング数から差し引かれることを、当業者は理解する。
【００８２】
比較のための配列アライメントの方法は、当該技術分野で周知である。従って、任意の２つの配列間の配列相同性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されることができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（（１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７）、Ｓｍｉｔｈらの局所アライメントアルゴリズム（（１９８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム（（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３）、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎのサーチフォローカルアライメント法（（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−２４４８）、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（（１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７２２６４， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）が挙げられる。
【００８３】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実現は、配列の比較を利用して配列相同性を決定することができる。そのような実現としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， 米国カリフォルニア州マウンテンビューから入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（バージョン１０）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメータを使用して実行されることができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、以下に十分に記述されている。すなわち、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２４：３０７−３３１。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ｓｕｐｒａ．のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＰＡＭ１２０重量残基の表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティは、ＡＬＩＧＮプログラムを利用することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０）ｓｕｐｒａ．のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を取得するために、ＢＬＡＴＮプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を使用してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質またはポリペプチドと相同であるアミノ酸配列を取得するために、ＢＬＡＳＴＸプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップアライメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９に記述されるようにギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴバーション２．０に含まれる）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴバージョン２．０に含まれる）を使用して、分子間の距離関係を検索する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）ｓｕｐｒａ．を参照されたい。ＢＬＡＳＴを使用する場合、ギャップＧＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列に関してはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に関してはＢＬＡＳＴＸ）を使用できる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントは、検査によって手動でも行われ得る。
【００８４】
特に明記しない限り、本明細書で示す配列相同性／類似性の値は、以下のパラメータを用いてＧＡＰバージョン１０を使用して取得した値をいう。すなわち、５０のギャップ重量および３の長重量、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックを用いてヌクレオチド配列の％同一性および％類似性；８のギャップ重量および２の長重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてアミノ酸配列の％同一性および％類似性；またはそれらと同等の任意のプログラム。「同等のプログラム」とは、任意の配列比較プログラムを意味することを意図する。すなわち、ＧＡＰバージョン１０で生成した対応するアライメントと比較するとき、問題になっている任意の２つの配列に対して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチングおよび同一の配列相同性の割合を有するアライメントを生成する。
【００８５】
マッチング数を最大化しかつギャップ数を最小化する２つの完全な配列のアライメントを見出すために、ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用している。ＧＡＰは、すべての可能なアライメントおよびギャップの位置を考慮して、マッチングする最大数の塩基および最も少ないギャップでアライメントを作製する。ＧＡＰは、マッチングする塩基の単位でギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティの提供を可能にする。ＧＡＰは、それが挿入する各ギャップに対してマッチングのギャップ作製ペナルティ数の利得を上げるはずである。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティを選択すると、さらにＧＡＰは、ギャップ×ギャップ伸長ペナルティ長の挿入された各ギャップに対して利得を上げるはずである。タンパク質配列のためのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０でのデフォルトギャップ作製ペナルティ値およびギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８と２である。ヌクレオチド配列に対するデフォルトギャップ作製ペナルティは５０であり、一方でそのデフォルトギャップ伸長ペナルティは３である。ギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、０〜２００からなる整数の群から選択される整数として表されることができる。従って、例えば、ギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、またはそれ以上であり得る。
【００８６】
ＧＡＰは、最高アライメントのファミリーからの１つのメンバーを提示する。このファミリーには多数のメンバーが存在することもあるが、より良い質を有する他のメンバーはない。ＧＡＰは、アライメントに対して４つの性能指数を示す。すなわち、質、比率、同一性、および類似性である。質は、配列を整列させるための最大限の測定基準である。比率は、塩基数によって短いセグメントに分割された質である。パーセント同一性は、実際にマッチングするシンボルのパーセントである。パーセント類似性は、類似するシンボルのパーセントである。ギャップ間にわたるシンボルは、無視される。一対のシンボルに対するスコアリングマトリックス値が０．５０（類似性閾値）より大きいまたは等しい場合、類似性がスコア化される。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０で使用されるスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）である。
【００８７】
（ｃ）本明細書において、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と関連して「配列相同性」または「同一性」は、特定の比較領域の上に最大一致のために整列されたとき、同一である２つの配列中の残基を参照する。配列相同性の割合がタンパク質に関連して用いられる場合、認識されていることは、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸置換によって異なることが多いことである。この場合、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代りに用いられ、従って分子の機能特性は変わらない。保守的置換に差がある配列の場合、配列相同性の割合を上方調整して、置換の保守的性質を修正してもよい。そのような保守的置換だけが異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う方法は、当業者にとって周知である。一般的に、これは、完全ミスマッチングよりもむしろ部分ミスマッチングとして保守的置換をスコアリングすることを含み、それによって配列相同性の割合を増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、かつ非保守的置換にはゼロのスコアを与える場合、保守的置換にはゼロと１との間のスコアを与える。保守的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行されるように、算出される。
【００８８】
（ｄ）本明細書で使用するように、「配列相同性の割合」とは、比較領域の上に最適に配列された２つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較すると、比較領域内のポリヌクレオチド配列の部分が付加もしくは欠失（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がマッチングする位置の数をもたらす両配列に生じる位置の数を決定し、マッチングした位置の数を比較領域内の位置の総数で割ってから、配列相同性の割合をもたらすためにその結果に１００を掛けることによって算出される。
【００８９】
本発明の方法を用いて、公知の遺伝子の任意の標的グループの相同領域を共有する新規遺伝子を同定してもよい。一実施形態において、即時方法を用いて、種々の害虫に対して効果的である新規殺虫性遺伝子を同定する。本発明の目的で、以下の害虫が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、昆虫、真菌、細菌、線虫、コナダニ、病原体原虫、動物寄生肝吸虫等である。特に興味深い害虫は、農作植物に深刻は被害をもたらす害虫である。害虫として、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、ヨコバイ亜目、半翅目、直翅目、総翅目、革翅目、等翅目、シラミ目、ノミ目、毛翅目等から選択される昆虫、具体的には鞘翅目および鱗翅目が挙げられる。農作植物のための本発明の害虫としては、以下が挙げられる。すなわち、トウモロコシ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、ハリガネムシ（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、ノーザンマスクドコガネムシ（地虫）（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、サザンマスクドコガネムシ（地虫）（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、コーンノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、コーンアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、コーンルートアブラムシ（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、移動性バッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、ダイズサヤタマバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）、コーンブロットハモグリエバエ（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ）、クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）、盗賊アリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、モロコシ：アワノメイガの一種（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ネキリムシの一種（Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、地虫（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）、ハリガネムシ（Ｅｌｅｏｄｅｓ、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ、およびＡｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、クビボソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、コーンノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、コーンアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、黄色サトウキビアブラムシ（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）、ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、コムギ：ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ウェスタンネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）クビボソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、オオツメクサタコウゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、ロシアコムギブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）、ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、移動性バッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、コムギタマバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）、ムギキカラバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、コムギバルブフライ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）、タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、ハバチの一種（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ）、チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）、ヒマワリ：サンフラワーバドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、メイガ科のガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）、キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ）、サンフワラーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ）、綿花：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ワミノハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）、オンシツコナジラミの仲間（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）、サビイロカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、米：サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ）、イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、コクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、ホソヘリカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、ダイズ：キンウワバ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）、ホソヘリカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ダイズサヤタマバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）、ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ムギモドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、茶カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ）、タネバエ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）、ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）、菜種：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、バーサアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ハナバエ類（Ｄｅｌｉａ ｓｓｐ．）。
【００９０】
線虫としては、例えば、根瘤線虫、シスト線虫、ならびに破壊線虫（ヘテロデラ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、ネコブ線虫メロイドジーン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）、およびグロボデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）を含む）を含む寄生線虫が挙げられる。具体的には、シスト線虫のメンバーとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ダイズシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅ）、ビートシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、ムギシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）、ならびにジャガイモシスト線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ）。破壊線虫としては、根腐れ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００９１】
本明細書において、用語「植物」は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生されることができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および植物中でインタクトな細胞または植物の部分（例えば、胚、花粉、胚珠、種、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯等）である植物細胞を含む。穀物は、その種を栽培または繁殖させる以外の目的で栽培業者によって生成された成熟種子を意味することを意図する。再生される植物の子孫、変異体、および突然変異体がこれらの部分が導入されるポリヌクレオチドを含むならば、これらも本発明の範囲内に含まれる。
【００９２】
即時方法を用いて、公知の遺伝子の任意の標的グループと相同である新規遺伝子を同定できるが、例えば、本発明を用いて任意の植物種でも（単子葉植物および双子植物を含むがこれらに限定されない）害虫関連の損害から保護するポリペプチドをコードする新規殺虫性遺伝子を同定できる。コーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ類（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂ． ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））（具体的にはこれらのアブラナ類は、種油の原料として有用である）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹。
【００９３】
野菜としては、以下が挙げられる。すなわち、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えばＬａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、ならびにキュウリ属のメンバー（例えば、キュウリ（Ｃ． ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ． ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ． ｍｅｌｏ））。観賞植物としては、以下が挙げられる。すなわち、ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、ラッパズイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキク。
【００９４】
本発明を実行する際に利用してもよい針葉樹としては、以下が挙げられる。すなわち、マツ（例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールマイン（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモントレーパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））、アメリカトガサワラ（（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、モミ（例えばヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））、およびシダー（例えば、ウェスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）。特定の実施形態において、本発明の植物は、作物（例えば、コーン、ムラサキウマゴヤシ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、綿花、ベニバナ、ピーナツ、モロコシ、コムギ、雑穀、タバコ等）である。他の実施形態において、コーンおよびダイズ植物が最適であり、さらに他の実施形態において、コーン植物が最適である。
【００９５】
目的の他の植物としては、目的の種子を提供する穀物植物、脂肪種子植物、および豆科植物が挙げられる。目的の種子としては、コーン、コムギ、オオムギ、米、モロコシ、ライムギ等の穀物の種子が挙げられる。脂肪種子植物としては、綿花、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、ムラサキウマゴヤシ、ヤシ、ココナツ等が挙げられる。豆科植物としては、豆およびエンドウ豆が挙げられる。豆としては、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、つるありインゲン、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンティル豆、ヒヨコ豆が挙げられる。
【００９６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうために用いられる。例として、「要素（単数形）」は、１つ以上の要素を意味する。
【００９７】
以下の例を、制限するためでなく、実例として提供する。
【実施例】
【００９８】
実験
実施例１： 新規殺虫性遺伝子の同定
ＢｔプラスミドＤＮＡの単離
種々のＢｔ菌株のグリセロール貯蔵物をＬＢ寒天板上に画線した。翌日、各菌株からの単一コロニーを、４８ウェルプレートのウェルごとに２ｍＬのＴＢ培地に播種した。このウェルプレートを２８℃で、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を、室温で１０分間６，０００ｘｇで遠心させることで収集した。細胞ペレットを、Ｐ１懸濁緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でボルテックスすることで再懸濁させた。細胞を溶解させて、Ｐ２およびＰ３緩衝液でそれぞれ中和させ、この可溶化液を、減圧を掛けてＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒｓ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。濾液をＱＩＡｐｒｅｐプレートに結合させて、ＰＢ緩衝液およびＰＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で洗浄した。プラスミド調製物をＥＢ緩衝液で溶出させて、９６ウェルプレートに収集した。
【００９９】
ＰＣＲの第１ラウンドのための縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計
新規Ｂｔ遺伝子を同定するために、公知のＣｒｙ遺伝子ならびに新規Ｃｒｙ遺伝子ファミリーを表す殺虫性遺伝子に相同である両オリゴヌクレオチドプライマーを、目標の公知のＢｔ遺伝子の標的グループ内の高相同性領域に対して設計した。本実施例において、標的グループは、鱗翅目および鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有する公知のＣｒｙ遺伝子を含むが、双翅目活性である公知のＣｒｙ遺伝子を含まない。具体的には、標的グループからのすべての公知のＢｔ Ｃｒｙ遺伝子のヌクレオチド配列を、公開データベースから収集して、これらの配列のアライメントを生成した。プライマー設計の厳しい条件に適したヌクレオチド配列に添っていくつかのＤＮＡ領域を、選択したすべてのＢｔ遺伝子で位置付けた。わずかなＤＮＡ配列（１７〜２４の連続するヌクレオチド）がすべての公知の殺虫性Ｂｔ遺伝子に存在していたので、これらの領域を殺虫性Ｂｔ遺伝子の「特徴的配列」と命名した。
【０１００】
最初のプライマー長を選択して、５４℃のＴｍを施し、選択した特徴的配列の５’末端から始まる近接するヌクレオチドの領域を観察した。具体的には、領域内のヌクレオチド配列を再度観察して、以下の配列特徴が存在するかを決定した。すなわち、
１）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
２）ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
３）５４℃±２℃で一定した融解温度Ｔｍを有する、
４）ヘアピン構造または二量体構造が形成されてない、
５）殺虫性遺伝子の標的グループからの少なくとも1つのヌクレオチド配列に存在する（すなわちアライメント）、および
６）非標的グループ殺虫性遺伝子からのヌクレオチド配列の間では保存されてない。
【０１０１】
プライマー内の多様性を増加させるために、１塩基対を、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択したｎとさせておいた。
【０１０２】
配列特徴のすべてが存在する場合、ヌクレオチドの領域内のそのヌクレオチド配列を、ＰＣＲの第１ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択した。領域内にヌクレオチド配列が所要の配列特徴を有しない場合は、次いで近接するヌクレオチドの隣接する領域を特徴配列の３’末端に向かって１塩基対ずつ移動させることによって選択し、プロセスを繰り返した。順方向および逆方向の両オリゴヌクレオチドプライマーを、本発明の方法に従って設計した。さらに、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、目的の殺虫性遺伝子中で、約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れたヌクレオチド配列に相補的になるように設計した。ＰＣＲの第1ラウンドの一般プライマーの設計方法論の概略図を図１に示す。
【０１０３】
ＰＣＲ増幅の第1ラウンド：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎステップ
Ｂｔ菌株から単離した核酸物質の第１の試料についてのＰＣＲ増幅の第１ラウンドを、上述のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行なった。具体的には、９６ウェルプレート中のＢｔプラスミド調製物を、以下の反応条件下でＰＣＲによって増幅させた。
鋳型ＤＮＡ量：１００ｎｇ
プライマー量：７．５ナノモル（５μＭ×１．５μＬ）
反応混合物の容量：２５μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ活性化：９５℃で１０分間
ＰＣＲサイクル（４０サイクル）：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。
【０１０４】
増幅の第１ラウンドからのＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料および７７００ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて当該技術分野で公知の方法に従って、検出した。Ｃｒｙ８Ｂｂ１遺伝子を含むＤＰ菌株１２１８−１からのプラスミド調製物を、陽性対照として用いた。２００１年１０月２３日に出願された係属中米国特許出願第１０／０３２，７１７号（発明の名称「Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎｓ」（その全体を参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。上述のＰＣＲ条件を用いて、１２１８−１プラスミド調製物は、７７００ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍでのＰＣＲ増幅に対して標準曲線を生成した。陽性対照に関しておよそ１３のＣｔ値を得た。鋳型ＤＮＡなしでＰＣＲ反応混合物だけを含む陰性対照を試験し、約３５のＣｔ値を生成した。１６未満のＣｔ値を生成したＢｔプラスミド調製物を、さらに分析用として選択し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ陽性と命名した。
【０１０５】
ＰＣＲの第２ラウンド
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎプライマーセットからのすべての逆方向プライマー（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンドで用いた逆方向オリゴヌクレオチドプライマー）を用いて、ＰＣＲの第２ラウンド用の順方向プライマー（すなわち、第１ラウンドプライマーの逆方向鋳型）を生成した。これらのプライマーは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎステップ（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンド）およびＰＣＲの第２ラウンド間の架橋として機能した。ＰＣＲの第２ラウンドで用いる逆方向プライマーを、基本的に第１ラウンドのオリゴヌクレオチドプライマーに関して上述したように設計した。ＰＣＲプライマーＴｍを５４℃±２℃に維持し、約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐのフラグメントを生成するように設計した。ＰＣＲの第２ラウンド用の一般プライマーの設計方法論の概略図を、図１に示す。
【０１０６】
プラスミドＤＮＡを、ＰＣＲの第１ラウンドでＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ陽性対照として同定したＢｔ菌各から単離し、次いでＰＣＲの第２ラウンドに掛けた。第２ラウンドのＰＣＲ条件は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲキットおよび上述のＢｔプラスミド調製物を用いて、以下の通りであった。すなわち、
ＤＮＡ ０．５μｇ
プログラム：
９５℃で１５分間
９４℃で３０秒間
５４℃で１．５分間
７２℃で１．５分間
ステップ２からステップ４までを３５回繰り返す
７２℃で１０分間
４℃で無制限に。
【０１０７】
第２ラウンドからのＰＣＲ反応を、１．０％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、６５０ｂｐ〜７００ｂｐの予想されるフラグメントを、次いで、平滑末端化Ｖｅｃｔｏｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細菌性クローニングベクターにクローン化した。ライゲーションの後、産物をＴｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。個々の細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製して、以下に記述するようにドットプロット分析によって分析した。
【０１０８】
ドットブロット分析
分析から公知のBｔ遺伝子を除外して、ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いた特徴的配列を含む新規殺虫性遺伝子を同定するために、ドットブロット分析を行なった。具体的には、個々の細菌コロニーから単離したプラスミドＤＮＡを正帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上にブロットした。標的グループ内のすべての殺虫性遺伝子に特異的なプローブが、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されたＤＮＡの予想される配列フラグメント内に存在するように設計した。ドットプロットステップの一般プローブの設計方法論の概略図を、図１に示す。すべてのプローブを、約７４℃±２℃のＴｍを有するように設計した。全３ステップ（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析）において、プライマー／プローブの混合物を各ステップで用いることができるようにオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのＴｍを決定した。オリゴヌクレオチドプローブを、ＤＩＧオリゴヌクレオチド３’末端標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて標識化して、公知のＢｔ遺伝子を求めてドットブロットをスクリーニングするために用いた。それぞれのプローブを、各プローブの特異性および有効性を確保するために、個別およびプローブの混合物として試験した。
【０１０９】
ドットブロット分析によって公知のＢｔ遺伝子に対して陽性と特徴付けたプラスミド調製物のすべてを、さらなる分析から除外した。ドットブロットによる分析で陰性と特徴付けたプラスミド調製物を、以下に記述するようにその新規性を評価するために、さらに配列分析に掛けた。
【０１１０】
配列分析
ＰＣＲの第２ラウンドの間生成され、ドットブロット分析によって「陰性」と特徴付けた核酸（すなわち、６５０ｂｐ〜７００ｂｐのフラグメント）を、配列決定した。これらの核酸の配列結果を、公開データベースで利用可能なヌクレオチド配列に対してＢＬＡＳＴを用いて比較した。配列分析が潜在的に新規Ｂｔ遺伝子を示す場合、その全長遺伝子のヌクレオチド配列を、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて取得した。推定上新規全長殺虫性遺伝子のヌクレオチド配列を、その新規性を確認するために、上述のようにさらに分析した。新規殺虫性遺伝子（例えば、配列番号１、３、および５に記載するもの（および、それによってコードされ、配列番号２、４、および６にそれぞれ記載するポリペプチド））を、本発明の方法によって同定した。新規殺虫性遺伝子を、以下に記述するように殺虫活性について試験した。
【０１１１】
バイオアッセイ
新規殺虫性遺伝子を発現ベクターにクローン化して、トウモロコシ害虫に対する殺虫活性をアッセイした。そのような方法は、通常、当該技術分野で公知である。鞘翅目に対する殺虫活性をアッセイする方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１５１７０９号に記述されている。鱗翅目に対する殺虫活性についてのアッセイは、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３８６８４号に開示されている。
【０１１２】
結果
バイオアッセイの結果を表１および表２に示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
明細書に記載する刊行物および特許出願のすべては、本発明が関連する当業者のレベルを示す。刊行物および特許出願のすべては、それぞれの刊行物および特許出願が参照することによって援用されることを具体的かつ個別に示されているかのように、同じ程度まで参照することによって本明細書に援用される。
【０１１５】
前述の発明は、明瞭な理解の目的で説明および実施例として多少詳しく述べているが、
いくつかの変更および修飾が添付する特許請求の範囲内で行なわれ得ることは言うまでもない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知の遺伝子（具体的には、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）Ｃｒｙ遺伝子）と相同である新規遺伝子を同定するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
害虫は、世界の農作物の損失における主要な要因である。例えば、コーンルートワーム（根切り虫）の食害およびワタミゾウムシの損害は、農業生産者にとって経済的に破壊的となり得る。根切り虫よる害虫関連作物の損害だけでも、年間１０億ドルに達している。
【０００３】
従来から、害虫集団（例えば、コーンルートワーム集団等）に影響を与える一次的方法は、輪作および広域スペクトルの合成化学農薬の使用である。しかし、消費者および政府の規制当局は、合成化学農薬の生産および使用と関連した環境ハザードにますます関心を高めている。そのような懸念のため、規制当局は、より危険な農薬の一部の使用を禁止または制限してきた。従って、従来の化学農薬に代わり、汚染および環境ハザードに対してより低い危険性を呈し、かつ従来の広域スペクトル化学殺虫剤の特性よりもより大きい標的特異性を提供する代替物の開発に多大の関心が払われている。
【０００４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物のいくつかの種は、広範囲の害虫（燐翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目他を含む）に対して殺虫活性を有することが知られている。バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）およびバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）は、中でも今までに発見された最も成功した生物的防除剤である。昆虫病原性は、複数の菌株に起因している。すなわち、バチルス・ラルバエ（Ｂ．ｌａｒｖａｅ）、パチルス・レンチモルブス（Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、パチルス・ポピリエ（Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、バチルス・スファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、Ｂｔ（非特許文献１）、およびバチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）（特許文献１）。殺虫性タンパク質は、また、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の栄養成長期から単離されているが、殺虫活性は、結晶性タンパク質副芽胞封入体に濃縮されているように見える。これらの殺虫性タンパク質をコードするいくつかの遺伝子は、単離され、特徴付けられている（例えば、特許文献２および特許文献３を参照されたい）。
【０００５】
微生物農薬（具体的にはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から得られるもの）は、化学防除に代わるものとして農業において重要な役割を果してきた。δ内毒素またはＣｒｙ毒素として知られているＢｔの菌株から単離される殺虫性タンパク質は、最初、不活性なプロトキシン毒素の形で生成される。これらのプロトキシン毒素は、昆虫の腸内でタンパク質分解酵素の作用を介して活性な毒素にタンパク分解的に変換される。非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４を参照されたい。毒素のタンパク質分解活性は、タンパク質からのＮ末端およびＣ末端のペプチドの除去、ならびにタンパク質の内部切断を含み得る。一旦活性化すると、Ｃｒｙ毒素は、昆虫腸内の上皮細胞上の受容体に対して高い親和性で結合し、それによって細胞膜に漏出チャネルを生成し、昆虫の腸の溶解、続いて飢餓性衰弱および敗血症を介して昆虫の死をもたらす。例えば、非特許文献５を参照されたい。
【０００６】
最近、農学者は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から殺虫性タンパク質を生成するために、殺虫性遺伝子を有する作物を遺伝子操作することによって虫害抵抗性が増強された作物を開発した。例えば、Ｃｒｙ毒素を生成するよう遺伝子操作されたコーンおよび綿（例えば、非特許文献６；非特許文献７を参照されたい）は、現在では米国農業で広く用いられており、かつ従来の昆虫防除方法に代わる環境に優しい代替法を農家に提供している。さらに、殺虫性Ｃｒｙ毒素を含む遺伝子操作されたジャガイモが開発されている。これらの遺伝子操作の成功例は、研究者に新規殺虫性遺伝子、具体的にはＣｒｙ遺伝子を研究するように導いてきた。従って、公知のＣｒｙ遺伝子と相同であるものならびにＣｒｙ遺伝子の新規ファミリーを表すものを含む新規殺虫性遺伝子を効率的に同定する新規方法が当該技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９６／１００８３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，３６６，８９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｒｗｏｏｋ， ｅｄ． （１９８９） Ｂａｃｉｌｌｕｓ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）， ｐ．３０６
【非特許文献２】Ｒｕｋｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８２：１０９−１１６
【非特許文献３】Ｏｐｐｅｒｔ （１９９９） Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． ４２：１−１２
【非特許文献４】Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７０：４１−４９
【非特許文献５】Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８１５−８２１
【非特許文献６】Ａｒｏｎｓｏｎ （２００２） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５９（３）：４１７−４２５
【非特許文献７】Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２（３）：７７５−８０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規遺伝子を同定する方法および組成物に向けられる。本明細書で開示する方法は、種々の生物由来の潜在的な新規遺伝子を同定するために、大量のヌクレオチド配列の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。新規遺伝子を同定する本方法は、公知の遺伝子と相同である遺伝子の同定、ならびに目的の遺伝子（殺虫性遺伝子を含む）で現在、未同定のファミリーのメンバーである可能性がある完全に新規遺伝子の同定を可能にする。本発明のある態様において、本方法は、公知の殺虫性遺伝子（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を含む）と相同である新規殺虫性遺伝子の同定を可能にする。
【００１０】
本発明の方法は、目的の公知の遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）の標的グループ内の相同領域（すなわち、特徴的配列）に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーを系統的に設計すること、ならびに、目的である生物由来の核酸物質のＰＣＲ増幅の第１ラウンドを行うこととを含む。ＰＣＲの第１ラウンドは、特徴的配列を含む公知と新規両遺伝子を増幅することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質の第２試料を取得して、遺伝子の標的グループ内の特徴的配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを用いて、ＰＣＲの第２ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離されて、結果として生じる単離された核酸はクローニングベクター（具体的には、細菌性クローニングベクター）にクローン化される。クローニングベクターは、次いで、細菌細胞等のコンピテントな宿主細胞に形質転換される。個々の宿主細胞コロニーから単離された核酸物質は、標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的である標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーション分析法で分析される。本発明の方法に関するドットブロット分析ステップは、公知の遺伝子を標的グループから同定し、さらなる考察から除外することを意図する。ＰＣＲの第２ラウンドで増幅され、ドットプロット分析によって検出されないＰＣＲ産物は、推定上の新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）またはそのフラグメントを含む。これらの核酸は、新規性を確認してヌクレオチド配列を決定するために、さらに配列分析に掛けられる。本発明の方法を用いて新規殺虫性遺伝子を同定する場合、推定上の新規遺伝子が発現され、組換えタンパク質は生物活性（例えば、殺虫活性）を評価するためにアッセイされる。本発明の方法は、自動化された高スループットスクリーニングをさらに受け入れ可能である。
【００１１】
本発明の組成物としては、単離される新規ポリヌクレオチド、およびそれらの変異体およびフラグメントが挙げられ、新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子を含む）が含まれる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供される。本明細書で開示される方法によって同定される新規殺虫性遺伝子（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）は、害虫（具体的には、害虫および害虫関連損害）から植物を保護することに有用性を見出す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書で以下に詳細に記述するように、ＰＣＲの第１および第２ラウンドならびにドットブロット分析用のオリゴヌクレオチドプローブで用いるオリゴヌクレオチドプライマーを設計の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、新規遺伝子、具体的には新規殺虫性遺伝子、より具体的には新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を同定する方法および組成物に向けられる。本発明の方法は、公知の遺伝子と相同である推定上の新規遺伝子を同定するために大量のヌクレオチド配列の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。本明細書において、用語「遺伝子の標的グループ」とは、相同領域を含む目的の任意の生物由来の公知の遺伝子の任意のコレクションをいう。一部実施形態において「標的グループ」は、公知の殺虫性遺伝子のコレクション、より具体的には、公知のＢｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子のグループを含み得る。通常は、本発明の方法は、標的グループから新規遺伝子を同定するために３つの明確なステップを含む。すなわち、ＰＣＲ（より具体的にはリアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析のステップである。特定の実施形態において、目的の生物由来の核酸物質のＰＣＲ増幅の第１ラウンドを行い、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。「特徴的配列」とは、目的の遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に存在する相同領域を意味することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質のＰＣＲの第２ラウンド用の第２試料を取得して、ＰＣＲ増幅の追加ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドは、特定の標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、通常、さらなる分析のために単離される。第３のステップは、ＰＣＲの第２ラウンドで単離される個々のＰＣＲ産物についてドットブロット分析を行うことを含む。ドットブロット分析のステップは、標的グループ内の公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて行い、従って、公知の遺伝子を検出してさらなる考察から除外することを意図する。ドットブロット分析によって検出されないＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物は、推定上の新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）またはそれらのフラグメントを含み、従って、新規性を確認するためにさらに配列分析に掛けられる。推定上の新規遺伝子の配列が決定され、それによってコードされるこれらの核酸分子およびタンパク質は、生物活性（例えば、殺虫活性等）を評価するためのバイオアッセイで用いられる。
【００１４】
より具体的には、新規遺伝子を同定する方法は、公知の遺伝子の標的グループ（例えば、Ｂｔ殺虫性遺伝子の標的グループ）の相同領域（すなわち、特徴的配列）に対するオリゴヌクレオチドプライマーを系統的に設計することと、目的の生物由来の核酸物質をＰＣＲ増幅する第１ラウンドでこれらのプライマーを用いることとを含む。本発明の一部態様において、目的の生物は、微生物、より具体的にはＢｔ菌株である。ＰＣＲ増幅の第１ラウンド用に設計されるプライマーは、以下により詳細に記述するように、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子を増幅することを意図する。ＰＣＲ産物がＰＣＲの第１ラウンドで検出される場合、その生物由来の核酸物質の第２試料を取得して、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドに掛ける。
【００１５】
ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、また、標的化特徴的配列を含む公知および新規両遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）を増幅するために設計される。ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、特定の長さ（例えば、約５００塩基対（ｂｐ）〜約８００ｂｐ、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、より具体的には約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐの長さ）のＰＣＲ産物を生成するように設計される。ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成される予想される長さのＰＣＲ産物は、例えば、アガロースゲル電気泳動によって単離される。従って、ＰＣＲの第２ラウンドは、特定の特徴的配列を含む公知の遺伝子および新規遺伝子、またはそれらのフラグメントの増幅を可能にし、かつさらに分析のためにこれらの核酸分子の単離を可能にする。
【００１６】
第２ラウンド増幅からの予想される長さのＰＣＲ産物は、通常、公知の遺伝子または新規遺伝子のフラグメントを含む。これらの核酸フラグメントは、クローニングベクター（例えば、細菌性クローニングベクター）にクローン化される。クローニングベクター挿入断片（すなわち、ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物）は、標的グループからの公知の遺伝子および潜在的新規遺伝子、またはそれらのあり得るフラグメントを含み、コンピテントな宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞等の細菌性細胞）の形質転換に用いられる。本発明の特定の態様において、核酸物質（例えば、プラスミドＤＮＡ）は、個々の宿主細胞（例えば、細菌性細胞）コロニーから単離され、標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的な標的オリゴヌクレオチドプローブを用いるドットブロット分析によって分析される。特定の実施形態において、本明細書で以下に詳細に記述するように、オリゴヌクレオチドプローブは、増幅の第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントと相補的になるように設計される。標的グループ内のすべての公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブによるドットブロット分析は、公知の遺伝子（例えば、特定の標的グループの公知のＢｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を含む核酸分子の同定を可能にする。公知の遺伝子を含む核酸は、さらなる考察から除外される。ドットブロット分析によって検出されない核酸は、推定上の新規遺伝子またはそれらのフラグメントを含み、さらに配列分析および生物活性アッセイに掛けられる。本発明の特定の実施形態において、本方法を用いて、新規殺虫性遺伝子（具体的には、新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を同定し、従って推定上新規殺虫性遺伝子は、殺虫活性に関してさらに分析される。
【００１７】
本発明のある態様において、上述のように、ＰＣＲの第２ラウンドで生成され、ドットブロット分析によって検出されないＰＣＲ産物を配列決定して、その新規性を評価するために公開データベースからの公知の配列と比較する。配列比較によってＰＣＲ産物が潜在的に新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子（例えば、新規ＢＴ Ｃｒｙ毒素遺伝子））を含むことが示される場合、全長配列を、例えばＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．）を用いて取得する。また、結果として生じる配列は、その新規性をさらに確認するために、公開データベースの配列に対して比較される。特定の実施形態において、新規遺伝子は、発現ベクターおよびそれによってコードされるタンパク質にクローン化され、推定上の新規殺虫性遺伝子の場合、生物活性（例えば、殺虫活性）がアッセイされる。
【００１８】
本発明の方法は、新規遺伝子、具体的には殺虫性遺伝子、より具体的にはＢｔ Ｃｒｙ毒素の殺虫性遺伝子を同定することに向けられる。本発明の方法は、殺虫性遺伝子の同定に関して本明細書で以下に記述するが、そのような方法は、目的の任意の生物由来の公知の遺伝子（すなわち、目的の標的グループ）の任意のグループとも相同である新規遺伝子を同定するため用いてよい。新規殺虫性遺伝子の同定に関する説明は、単に好例であることを目的とし、限定するものではない。
【００１９】
本発明の方法を用いて、公知のＣｒｙ遺伝子と相同である新規遺伝子を同定し、さらにすでに同定されているＣｒｙ遺伝子とわずかな相同性を共有し、かつＢｔ殺虫性遺伝子の新規ファミリーを実際に示す可能性のある遺伝子も同定してもよい。本発明の一実施形態において、目的のＢｔ菌株から単離される核酸物質は、殺虫性遺伝子の標的グループのすべてのメンバーに存在する相同領域（すなわち特徴的配列）に特異的である少なくとも１組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ（通常、リアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンドに掛けられる。本明細書において、「殺虫性遺伝子の標的グループ」とは、相同領域を含む公知の殺虫性遺伝子の任意のコレクションをいう。殺虫性遺伝子の標的グループのメンバーは、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために一列に並べられる。上記に示すように、殺虫性遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に存在する相同領域は、「特徴的配列」と呼ばれる。以下にさらに詳細に記述するように、殺虫性遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列内の特徴的配列は、ＰＣＲの第１および第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための基礎として役立つ。本発明のある態様において、標的グループは、鞘翅目からの昆虫に対して活性であるすべての公知の殺虫性Ｃｒｙ遺伝子（すなわち鞘翅目活性Ｃｒｙ遺伝子）を含む。他の実施形態において、標的グループは、例えば、鱗翅目および鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有するすべての公知のＢｔ遺伝子（双翅目からの昆虫に対して活性であるＣｒｙ遺伝子を除外する）を含む。殺虫性遺伝子の標的グループは、新規殺虫性遺伝子の研究の着手時に研究者によって選択され定義される。
【００２０】
殺虫性遺伝子の標的グループに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲによる増幅に適する条件下で、目的の微生物由来の核酸物質の第１試料およびＤＮＡポリメラーゼと混合される。本発明の方法は、ＰＣＲの第１ラウンドを行うことと、ＰＣＲ増幅産物の存在または非存在を検出することとをさらに含む。特定の実施形態において、ＰＣＲの第１ラウンドは、ＰＣＲ産物の存在を検出するためにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行うことを含む。
【００２１】
ＰＣＲの第１ラウンドにおいてＰＣＲ産物が検出される場合、目的の微生物由来の核酸の第２試料を取得して、ＰＣＲの第２ラウンドに掛ける。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて用いるオリゴヌクレオチドプライマーも、上述のように殺虫性遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列内の特徴的配列に特異的である。通常は、ＰＣＲの第１ラウンドで用いる逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲの第２ラウンドの順方向プライマーを生成し、それによってＰＣＲの第１ラウンドと第２ラウンドの間の架橋として役立たせる。ＰＣＲの第２ラウンドで用いる逆方向プライマーは、異なる特徴的配列（ＰＣＲの第１ラウンド用の逆方向プライマーを設計するために用いられる特徴的配列に対して通常３’に位置している）を標的にするように設計される。ＰＣＲの第２ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーは、特定の長さ（具体的には、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、より具体的には約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐ）のＰＣＲ産物を生成するようにさらに設計される。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドからのＰＣＲ反応物は、アガロースゲル電気泳動によって分離可能で、結果として生じる、予想される長さの核酸フラグメントを含むＰＣＲ産物は、クローニングベクター（具体的には、細菌性クローニングベクター）内に連結される。次いで、そのベクターは、コンピテントな宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細菌性細胞）に形質転換される。
【００２２】
適切な宿主細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、細菌性細胞、真菌細胞、植物細胞（双子葉類植物および単子葉植物）、ならびに動物細胞。特定の実施形態において、宿主細胞は細菌性細胞である。ポリヌクレオチドを種々の宿主細胞に送達するためのクローニングベクターは、当該技術分野で周知である。核酸分子をベクターにクローニングする方法、および宿主細胞を形質転換する方法は、当該技術分野で周知である。クローニング、パッケージング、および発現系の概要ならびに方法に関しては、以下を参照されたい。すなわち、Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９７９） Ｇｅｎｅ ８：８１−９７；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８９） Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｓ．１−３（２ｄ ｅｄ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．（１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；１９９４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ。
【００２３】
ＰＣＲの第２ラウンドからのＰＣＲ産物を含む個々の細菌コロニー由来の核酸物質（例えば、プラスミド調製物）は、推定上の新規殺虫性遺伝子を同定するためにさらに分析に掛けられる。特定の実施形態において、個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、標的グループ内のすべての公知の殺虫性遺伝子を検出するよう設計されている標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてドットブロット分析によって分析される。オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントと相補的であるように設計される。オリゴヌクレオチドプローブは、標的グループ内の公知の殺虫性遺伝子を含む任意の核酸でも同定する（すなわち、「ドットプロット陽性」）ように設計される。ドットブロット分析を用いるこれらのオリゴヌクレオチドプローブによって検出されない任意の核酸（すなわち「ドットブロット陰性」）でも、推定上の新規殺虫性遺伝子、またはそのあり得るフラグメントを含み、その新規性を評価するためにさらに分析される。本方法に従って同定される推定上の新規殺虫性遺伝子のフラグメントは、配列決定されて、その新規性を評価するために公知の殺虫性遺伝子との配列比較に掛けられる。そのような配列分析は、当該技術分野で周知である。新規ヌクレオチド配列は、推定上の殺虫性遺伝子を取得するためにさらに分析される。一部実施形態において、推定上の新規殺虫性遺伝子を含む核酸分子は、発現ベクターにクローン化され、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドは、標準アッセイ法（例えば、本明細書で以下に記述するもの）を用いて殺虫活性をアッセイする。
【００２４】
新規殺虫性遺伝子の同定の目的で記述する上記方法は、また、目的の他の標的グループからの新規遺伝子を同定するために用いてもよい。本発明の方法を用いて非殺虫性遺伝子（具体的には非Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）を同定する場合、核酸出発物質を目的の異なる生物から取得してもよい。しかし、他の方法ステップ、すなわち系統的なプライマー設計（本明細書で以下に記述する）、ＰＣＲの第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析は、目的の遺伝子の標的グループにかかわらず、基本的に同じ方法で行われる。
【００２５】
任意の１つの機序に限定する目的ではないが、本明細書で上記に明示するように、ＰＣＲ増幅の第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、特徴的配列を含む公知および新規１の両遺伝子の増幅を可能にするおよび可能性があるように設計される。これとは対照的に、本発明の第３のステップ（一般的にドットブロット分析）で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、公知の遺伝子だけを特異的に検出するように選択される。従って、ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドの間増幅される核酸物質を含むが、ドットブロット分析ステップの間検出されない生物（例えば微生物、具体的にはＢｔ菌株）は、新規遺伝子を含む可能性がある。
【００２６】
本発明の特定の態様において、本明細書で上述するＰＣＲ増幅の第１ラウンドで用いる少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することは、多段階プロセスを介して縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することを含む。ある実施形態において、遺伝子の標的グループのためのヌクレオチド配列アライメントが調製される。例えば、殺虫性遺伝子の標的グループは、鞘翅目（すなわち、鞘翅目活性遺伝子）からの昆虫に対して殺虫活性を有するすべての公知のＣｒｙ遺伝子を含み得る。標的グループ内の遺伝子は、相同ブロック（本発明では特徴的配列と呼ぶ）を共有する。特徴的配列は、以下に詳細に記述するように、オリゴヌクレオチドプライマーの設計の開始点として役立つ。特徴的配列は、遺伝子の標的グループのすべてのメンバー内に保存されるヌクレオチドのブロックであるが、標的グループ内の遺伝子ごとの特徴的配列においていくらかの相違が存在することもある。その結果、標的グループ内のすべての遺伝子に特異的である単一組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計できないこともある。従って、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いることで、標的グループに現れる特徴的配列のすべての可能な変異を網羅できる。遺伝子の標的グループ内の特徴的配列の配列変異のために、全標的グループ内の特徴的配列に特異的である１組のプライマーを開発することが困難であるまたは不可能な場合、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を利用することによって、特定の用途を見出す。可能な場合、標的グループ内のできるだけ多くの遺伝子に特異的である単一組のプライマーを設計して用いる。新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を同定するための本発明のある態様において、ＰＣＲの第１ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、公知のＢｔ Ｃｒｙ遺伝子の標的グループの「ドメイン１」の特徴的配列を標的化するように設計され、ＰＣＲの第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、「ドメイン２」の特徴的配列に特異的である。
【００２７】
ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いる縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することは、以下に記述するプライマー設計の適切な開始点であるいくつかの相同領域を同定するために、遺伝子の標的グループのヌクレオチド配列アライメントをスキャンすることを含む。これらの相同領域は、「特徴的配列」と呼ばれる。プライマー長が約１５塩基対（ｂｐ）〜約３０ｂｐの間（例えば、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、２８ｂｐ、２９ｂｐ、および３０ｂｐ）である最初のプライマーが選択される。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーのスクリーニングの第１ラウンドが、特徴的配列のうちの１つで近接するヌクレオチドの最初の領域を観察することで行われる。最初の領域は、選択される特徴的配列の５’末端で始まり、かつ最初のプライマー長に等しい長さである。最初の領域内のヌクレオチド配列を見直して、その配列が以下の所要の配列特徴を有しているかどうかを決定する。ＰＣＲの第1ラウンドまたは第２ラウンドで用いるプライマーの適切なヌクレオチド配列は、
１）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
２）ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
３）約５０℃〜６５℃の間、より具体的には約５４℃±２℃の融解温度を有する；
４）ヘアピン構造または二量体構造を形成しない、
５）遺伝子の標的グループからの少なくとも１つのヌクレオチド配列に存在する（すなわち、上述のアライメント）、および
６）非標的グループ遺伝子からのヌクレオチド配列の間では保存されてない。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプライマーの多様性を増加させるために、１つのヌクレオチド残基は、ｎであることが許され、ここでｎはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。上述の配列特徴がすべて存在する場合、最初の領域内のヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択される。最初の領域内のヌクレオチド配列がこれらの配列特徴をすべて有しない場合、近接するヌクレオチドの隣接する領域が、特徴的配列の３’末端に向かって１塩基対ずつ最初の領域を移動させることによって選択される。隣接する領域内のヌクレオチド配列は、上述のように見直され、配列特徴のすべてが存在する場合、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択される。上記の要件を満たすヌクレオチド配列を同定するために、必要に応じてさらにスクリーニングのラウンドが行われる。所要の特徴を有する特徴的配列内のオリゴヌクレオチドは選択されて、ＰＣＲの第1ラウンドまたは第２ラウンドでオリゴヌクレオチドプライマーとして用いられる。順方向および逆方向の両プライマーは、上述のように設計される。さらに、ＰＣＲの第1ラウンドで用いる順方向および逆方向のプライマーは、標的グループの遺伝子内で、約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的であるように設計される。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドの順方向および逆方向のプライマーは、標的グループの遺伝子内で、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的であるように設計される。
【００２９】
本明細書において上述のヌレオチド残基が任意のヌクレオチド（すなわち、ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）であることを許される注意付きで、同一のヌクレオチド配列が標的ブループの少なくとも１つのメンバーのヌクレオチド配列に見出される場合、ヌクレオチド配列は、遺伝子の標的グループからの少なくとも１つのヌクレオチド配列に「存在」する。用語「殺虫性遺伝子の非標的グループ」とは、標的グループとして選択された殺虫性遺伝子を除き、殺虫性遺伝子の特定のファミリー内のすべての殺虫性遺伝子をいう。例えば、標的グループが鞘翅目活性であるすべてのＢｔ Ｃｒｙ遺伝子を含む場合、殺虫性遺伝子の対応する非標的グループは、鞘翅目からの昆虫に対して活性であるものを除くすべてのＢｔ 遺伝子を含む。同様に、「非標的遺伝子」または「遺伝子の非標的グループ」とは、標的グループとして選択されたそれらの遺伝子を除く、殺虫性遺伝子の特定のファミリー内のすべての遺伝子をいう。ヌクレオチド配列が非標的グループ内のすべてのヌクレオチド配列と少なくとも２つのヌクレオチド残基で異なる場合、それは、「非標的グループ遺伝子からのヌクレオチド配列の間で保存されていない」。本発明のある態様において、近接するヌクレオチドの特定の領域内のヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子の間で保存されていないかどうかを決定することは、遺伝子の非標的グループからの各遺伝子の全長配列を検索することを含む。一部実施形態において、遺伝子の非標的グループからの各遺伝子の全長配列は、文字検索用語として領域内のヌクレオチド配列を用いて徹底的に検索される。すなわち、領域内のヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子のどこかに現れる場合、または２つ以内の異なるヌクレオチド残基を有するヌクレオチド配列が、非標的グループ遺伝子のどこかに現れる場合、領域内の特定のヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーとして選択されない。
【００３０】
上述のように、ＰＣＲの第１ラウンドで用いる逆方向プライマーは、ＰＣＲの第２ラウンド用の順方向プライマーを生成するために、一般的に用いる。ＰＣＲの第２ラウンド用の逆方向プライマーは、プライマー設計のための開始点として異なる特徴的配列（具体的には、ＰＣＲの第１ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられた特徴的配列に対して３’にあるもの）を用いて、上述の方法に従って設計される。ＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドのための典型的なプライマー設計の概略図を、図１に示す。
【００３１】
遺伝子の標的グループ内の特徴的配列は、一般的にすべてのメンバー間で同一でないので、これらの配列の差異を明らかにするために、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物がＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドの両方で、通常用いられる。オリゴヌクレオチドプライマーの混合物が本発明のＰＣＲ反応で用いられる場合、プライマーは、すべてのプライマーが同一のまたはほぼ同一の融解温度を有するようにさらに設計される。一部実施形態において、ＰＣＲの第1ラウンドおよび第２ラウンドで用いるオリゴヌクレオチドプライマーの融解温度は、約５４℃±２℃である。
【００３２】
「殺虫性遺伝子」とは、殺虫活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書において、用語「殺虫活性」とは、害虫の成長、摂食、または繁殖を阻害するため、ならびに／あるいは害虫を死滅させるための物質（例えば、ポリペプチド）の能力をいう。「殺虫性ポリペプチド」または「昆虫毒素」は、殺虫活性を有するタンパク質を意味することを意図する。殺虫活性は、当該技術分野で公知の日常的なアッセイによって測定できる。そのようなアッセイとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、適切な期間の間その物質を摂食させ、物質に曝露させた後の、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫撥水性、害虫誘引、および害虫の行動変化および物理的変化。一般的な方法は、囲った容器中の飼料源に実験的化合物または生物を添加することを含む。殺虫活性を評価するアッセイは、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，５７０，００５号および第６，３３９，１４４号（それら全体を参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。
【００３３】
殺虫活性を試験するための好ましい発育段階は、目的の昆虫の幼虫または未成熟の形態である。昆虫は、約２０℃〜約３０℃の温度、約３０％〜約７０％の相対湿度で、真っ暗闇で飼育されることもある。Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ （１９９０） Ｊ． Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３（６）：２４８０−２４８５に記述されるように、バイオアッセイを実施してもよい。昆虫の幼虫を飼育する方法およびバイオアッセイを実施する方法は、当業者にとって周知である。
【００３４】
本発明の一部実施形態において、目的の標的グループは、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子またはＢｔ遺伝子の特定サブセット（例えば、鞘翅目活性Ｂｔ Ｃｒｙ遺伝子等）を含む殺虫性遺伝子である。「Ｂｔ」または「バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）」遺伝子は、Ｂｔ毒素をコードするＢｔの種々の菌株に見出される広範なクラスの遺伝子を意味することを意図し、例えば、Ｃｒｙ（結晶）毒素（すなわち、δ−内毒素）およびＣｙｔ（細胞傷害性）毒素等の毒素を含む。「Ｃｒｙ毒素」および「Ｃｙｔ毒素」としては、公知のＣｒｙタンパク質またはＣｙｔタンパク質とそれぞれ相同である殺虫性ポリペプチドが挙げられる。Ｃｒｙ遺伝子としては、Ｃｒｙ毒素として分類される任意のポリペプチド（例えば、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８およびＣｒｙ９）をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：８０７−８１３およびＣｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｔｏｘｉｎ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｔ ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（それら全体を参照することにより本明細書でこれら両参考文献を援用する）を参照されたい。Ｂｔ毒素は、プロトキシン毒素として合成され、かつ副芽胞封入体として結晶化する殺虫性タンパク質のファミリーである。害虫によって経口摂取されると、微結晶構造は昆虫の中腸のアルカリ性ｐＨによって溶解され、プロトキシン毒素は昆虫の腸のプロテア−ゼによって切断されて活性毒素を生成する。活性化Ｂｔ毒素は、昆虫の腸上皮内の受容体に結合して、膜病変および付随する昆虫の腸の膨張および溶解を引き起こす。昆虫の死は、飢餓性衰弱および敗血症に起因する。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８１５−８２１を参照されたい。
【００３５】
Ｃｒｙ毒素のプロトキシン毒素の形態は、結晶形成セグメントを含む。様々な特異性の活性Ｃｒｙ毒素のアミノ酸配列を比較することにより、高度に保存された５つの配列ブロックがさらに明らかになる。構造的に、Ｃｒｙ毒素は、Ｎ末端からＣ末端に存在する３つの明確なドメインを含む。すなわち、ポア形成にかかわる７つのαヘリックスのクラスター（「ドメイン１」と呼ばれる）、細胞結合にかかわる３つの逆平行βシート（「ドメイン２」と呼ばれる）、およびβサンドイッチ（「ドメイン３」と呼ばれる）。これらのドメインの位置および特徴は、当業者にとって公知である。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１）ｓｕｐｒａおよびＭｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９：４０９−４１７を参照されたい。
【００３６】
最初のＢｔ毒素の命名法系は、殺虫活性プロファイルに基づいて毒素を分類した。この系は、アミノ酸配列相同性だけに基づく新規命名法に入れ替えられてきた。この系の下で、Ｃｒｙ毒素およびＣｙｔ毒素は、アミノ酸配列相同性に基づいてクラスまたはファミリーにグループ化され、その毒素の名称は、他の配列とその相同性に関しての情報を提供する。従って、例えば、Ｃｒｙ２ファミリーのメンバーであるＣｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、およびＣｒｙ２Ａｃの毒素は、およそ８０％のアミノ酸配列相同性を共有する。同様に、Ｃｒｙ８ファミリー毒素であるＣｒｙ８ＡａおよびＣｒｙ８Ｂａは、およそ６５％のアミノ酸配列相同性を共有する。Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， ｓｕｐｒａを参照されたい。
【００３７】
ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドの両方で用いられ、かつ本発明の方法に従って設計された目的の標的グループ（例えば、殺虫性遺伝子の標的グループ）内の特徴的配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、約５０℃〜６５℃の熱融解点（Ｔｍ）または融解温度を有するように設計される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、約５２℃〜５６℃、より具体的には約５４℃のＴｍを有する。Ｔｍを決定するためにいくつかの式が利用されている。Ｔｍを算出するための任意の式も、本方法を実行するために用いることができる。例えば、最隣接熱力学に基づくＴｍ決定のための古典的なアルゴリズムは、以下の通りである。
【００３８】
【化１】
ここで、ＥＨ０およびＥＳ０は、それぞれヘリックス形成のためのエンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒはモル気体定数（１．９８７（カロリー）（Ｋ−１）（モル−１）であり、Ｃｔは全鎖（プライマー）濃度であり、Ｘは塩濃度である。Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８（２１）：６４０９−６４１２。さらに、一部実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍは、以下の式を用いて算出される。
【００３９】
Ｔｍ＝（ＥＨ０／［ＥＳ０＋（Ｒ×Ｉｎ（Ｃｔ））］−２７３．１５＋１６．６ ｌｏｇ（［Ｘ］））×１．１１４４−１４．９６４
ここで、ＥＨ０（エンタルピー）＝Σ ΔＨ；ＥＳ０（エントロピー）＝Σ ΔＳ＋０．３６８×１９×１．５８５；Ｒ（モル気体定数）＝１．９８７；Ｃｔ（全プライマー濃度）＝ｌｏｇ（０．０００００００５／４）×１０００；およびＸ（塩濃度［Ｋ＋］）＝０．０５である。
【００４０】
本発明の方法を実施するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、対ごとに２つの個々のプライマー（すなわち、順方向プライマーと逆方向プライマー）が存在するように対をなすオリゴヌクレオチドプライマーであることを、当業者は認識するであろう。各対内の１つのプライマーは、遺伝子の標的グループからの特徴的配列の５’鎖の部分（順方向プライマー）と相補的（すなわち、ハイブリダイズ可能）であり、一方もう1つのプライマーは、特徴的配列の３’鎖の部分（逆方向プライマー）と相補的である。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅コピー（すなわち、「ＰＣＲ増幅産物」または「ＰＣＲ産物」）を生成するために適切なポリメラーゼが各３’鎖の配列を各プライマーにコピーするように、設計される。本発明の方法は、ＰＣＲ増殖のために少なくとも1対のオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。本発明のある態様において、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のプライラー対を含むオリゴヌクレオチドプライマー対の混合物が用いられる。目的の特定のヌクレオチド配列（例えば、特徴的配列）に特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを設計する方法は、当該技術分野で周知である。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、新規遺伝子（例えば、新規殺虫性遺伝子）の増幅を可能にする適切な長さである。各対の個々のプライマーは、一般的に、約１５ｂｐ〜約３０ｂｐ、より具体的には約２０ｂｐ〜約２５ｂｐを含む。さらに、1対のオリゴヌクレオチドプライマーにおける個々のプライマー間の距離は、検出可能な長さのＰＣＲ産物を生成するのにも十分な距離である。従ってＰＣＲの第1ラウンドにおいて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、遺伝子の標的グループのメンバーのヌクレオチド配列内で、一般的に約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れている、より具体的には約１００ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的になるように選択される。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて、順方向ブラマーおよび逆方向プライマーは、標的グループ内のヌクレオチド配列と通常相補的であり、これらのヌクレオチド配列は、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ離れている、具体的には約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ離れている、より具体的には約６００ｂｐ〜約６５０ｂｐ離れている。
【００４２】
本方法で用いる核酸物質は、目的の任意の生物から任意の方法で取得してもよい。目的の生物としては、例えば、微生物（より具体的には、Ｂｔ菌株）、植物、動物、真菌、細菌、および昆虫が挙げられる。核酸物質は、例えば、目的の生物から調製したプラスミドＤＮＡ（例えば、Ｂｔ菌株）を含む。一部実施形態において、核酸物質を取得することは、目的の生物、具体的には目的の微生物からＤＮＡを単離することを含む。核酸物質は、例えば、ゲノムＤＮＡを含んでもよい。本発明の特定の態様において、核酸物質は、Ｂｔ菌株から生成されたプラスミドライブラリーを含む。ＰＣＲ増幅の複数のラウンドを行う場合、生物由来の核酸物質の試料を新たに取得して、ＰＣＲの各ラウンドで用いてもよい。従って、例えば、新規ＤＮＡプラスミドの調製を、ＰＣＲの各ラウンドで用いるＢｔ菌株から調製してもよい。
【００４３】
ＰＣＲによる核酸増幅は、分子生物の基本的な技法である。ＰＣＲを行う方法は、当該技術分野で周知であり、かつ市販されている器具使用で実行可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９５） ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９９） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これらすべてを参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。簡単に言えば、ＰＣＲは、目的の標的配列を含む核酸物質（例えば、目的の遺伝子由来のＤＮＡ）の迅速かつ効率的な増幅を可能にする。増幅すべき核酸物質、オリゴヌクレオチドプライマー、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）は、ＰＣＲ増幅に適した条件下で混合される。ＰＣＲ反応混合物は、十分な量の４つのデオキシヌクレオシド三リン酸および塩化マグネシウムをさらに含む。ＰＣＲ用の個々の反応成分は市販されており、いくつかの会社（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ等）によって販売されている。核酸物質およびオリゴヌクレオチドプライマーをただ加えればよい、すでに調製されている反応混合物または「マスターミックス」も入手可能である。オリゴヌクレオチドプライマー間の核酸配列のコピーを検出可能な量まで生成するには、ＰＣＲを少なくとも1回実行すれば十分である。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＣＲ（具体的には、リアルタイムＰＣＲ、より具体的には定量リアルタイムＰＣＲ）の第１ラウンドを行うことを含む。リアルタイムＰＣＲは、増幅反応の初期段階でＰＣＲ産物の検出を可能にする。具体的に言うと、リアルタイムＰＣＲにおいて、ＰＣＲ産物の定量化が、プラトーに達するまで核酸物質の量が対数的に増幅されるわずか数サイクルに依存する。対数期の間、標的核酸物質の量は、サイクルごとに倍加されるはずであり、限定試薬によるバイアスがない。リアルタイムＰＣＲを行う方法および器具使用は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｂｕｓｔｉｎ （２０００） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９−１９３；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１２：１２４−１２５；Ｈａｌｆｏｒｄ （１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：８３５；およびＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６（１０）：９８６−９９４を参照されたい。これら全体を参照することによってこれらすべてを本明細書に援用する。本発明のある態様において、ＰＣＲ増幅の第１ラウンドは、リアルタイムＰＣＲを行うことを含む。
【００４５】
本明細書において、ＰＣＲ増幅産物を「検出すること」とは、本発明のＰＣＲステップによって増幅される核酸の存在、非存在、または量を検出するための任意の方法を含む。検出の方法によって、増幅のレベルに関する定性的または定量的な情報を提供可能である。ＰＣＲ増幅産物を検出するためのそのような方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動アッセイ、サザンブロッティング／プローブハイブリダイゼーションアッセイ、および蛍光アッセイが挙げられる。
【００４６】
ＰＣＲモニタリングおよびＰＣＲ産物の検出のために数多くの様々な染料およびプローブが利用可能である。例えば、リアルタイムＰＣＲ増幅によって生成されるＰＣＲ産物は、種々の蛍光染料と蛍光分子を用いて共有結合標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを用いて検出可能である。そのような蛍光実体は、ＰＣＲ産物の存在を示し、ＰＣＲ産物の量に関するシグナルを表示可能である。さらに、ＰＣＲ産物の連続蛍光モニタリングを用いて、シグナルがバックグラウンドの上で検出される点（Ｃｔ、サイクル閾値）および対数期にある点を決定可能である。鋳型核酸配列が豊富であればあるほど、Ｃｔはより早く達成される。
【００４７】
二本鎖ＤＮＡに特異的な染料を用いることによって、配列特異的プローブを合成する必要なく、任意のＰＣＲ増幅においてもＰＣＲ産物の形成を検出できる。そのような染料は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に特異的に結合し、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ，ＳＹＢＲ Ｇｏｄ（登録商標），および臭化エチジウム。「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ」とは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩを含む、市販されている任意のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料をいう。ｄｓＤＮＡ染料を用いて、産物特異性を、融解曲線の分析することによってまたは非特異的産物が融解する高温で蛍光を得ることによって増加可能である。Ｒｉｒｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５：１５４−１６０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：９５４−９６２を参照されたい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光分子を用いて共有結合標識され、ＰＣＲ産物を検出するために用いられることもできる。ヘアピンプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）プライマー）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（登録商標））、およびエキソヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）は、ＰＣＲの間にモニタリング可能な二重標識蛍光オリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、同じオリゴヌクレオチド上で消光剤によるフルオロフォアの蛍光消光に依存する。ハイブリダイゼーションまたはエキソヌクレアーゼ加水分解が起こると、蛍光が増加する。
【００４９】
ＰＣＲ産物はまた、それぞれ蛍光プローブで標識化された２つのオリゴヌクレオチドを用いて検出可能である。これらのオリゴヌクレオチドと標識核酸とのハイブリダイゼーションによって、２つの蛍光プローブを近づけ、共鳴エネルギー移動が可能になる。
例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８を参照されたい。蛍光共鳴エネルギー移動対として使用可能なフルオロフォア対は、当業者にとって周知であり、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリトリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ６４０、およびフルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ７０５。
【００５０】
本発明のある態様において、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料を用いてＰＣＲの第１ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物、より具体的にはリアルタイムＰＣＲ産物を検出する。上述のように、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎはｄｓＤＮＡの副溝に結合する蛍光染料である。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染料がｄｓＤＮＡに結合すると、蛍光発光の強度が増加する。従って、二本鎖ＰＣＲ産物がさらに産生されるにつれて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの蛍光シグナルも増加する。本発明の他の態様において、５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、ＰＣＲ（具体的にはリアルタイムＰＣＲ）をモニターして、ＰＣＲ増幅産物を検出する。５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ試薬混合物に付加する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、５’末端（例えば、ＦＡＭ）に高エネルギー蛍光リポーターと、３’末端（例えば、ＴＡＭＲＡ）に低エネルギー消光剤染料とを含む。プローブがインタクトな場合、リポーター染料の蛍光発光は、消光剤の近接近によって抑制される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の特定の雛型配列にアニールするようにさらに設計される。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ポリメラーゼの経路で雛型核酸物質に結合する。ＰＣＲ増幅は、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって、消光剤を含むプローブからリポーター染料の切断および放出をもたらす。従って、放出されるリポーター染料から生成される蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物の量と比例する。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎプローブまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うための方法および器具使用（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態において、ＰＣＲ増幅の第1ラウンドからのＰＣＲ産物は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを用いて検出される。
【００５１】
上記のように、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物は、通常アガロースゲル電気泳動によって分離さる。標的グループ内の公知の遺伝子をさらなる考察から除外すために、予想される長さの核酸分子は単離されて、ドットブロット分析に掛けられる。
【００５２】
「ドットブロット分析」または「ドットブロットハイブリダイゼーション」は、分子生物の分野では標準方法である。通常は、ドットブロットハイブリダイゼーションは、例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上で核酸物質を固定化することを含む。ハイブリダイゼーションに適した条件下で、固定化した核酸物質は、標識オリゴヌクレオチドプローブに曝露され、結合したプローブの存在または非存在が検出される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ結合の検出を容易にするために、放射性標識または非放射性標識で標識化できる。種々の放射性標識および非放射性標識が当該技術分野で利用可能である。そのような標識として、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、蛍光分子、トリチウム（３Ｈ）が挙げられる。ドットブロット分析で用いる標識オリゴヌクレオチドプローブを生成する方法は、当該技術分野で周知である。
【００５３】
本発明の方法においてドットブロット分析で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、標的グループ内のすべての公知の遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）に特異的である。オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されるＰＣＲ産物のフラグメントに相補的であるように設計される。本発明のドットブロット分析のステップのためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の概略図を図１に示す。特定の実施形態において、標的グループのすべての公知の遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの混合物を用いる。配列相違のために、全標的グループに対して特異的である単一のプローブを開発することが困難な場合、各プローブが標的グループ内の１つの遺伝子に対して特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの混合物を設計することは、特に有用性を見出す。可能な場合、標的グループ内のできるだけ多くの遺伝子（例えば、殺虫性遺伝子）に対して特異的である単一組のプローブを設計して用いる。さらに、複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブを、複数のフローブの混合物として単一のドットブロット膜と共にインキュベートしてもよい。あるいは、多重膜を調製して、個々のプローブと共に別々にインキュベートしてもよい。ドットブロットオリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、長さが約２０ｂｐ〜約４０ｂｐ、具体的には約２５ｂｐ〜約３５ｂｐ、より具体的には約３０ｂｐ〜役３５ｂｐである。さらに、ドットブロット分析で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、一般的に少なくとも約７０℃、具体的には少なくとも約７５℃、より具体的には少なくとも約８０℃のＴｍを有するように設計される。オリゴヌクレオチドプローブの混合物を用いる場合、それぞれのプローブは、大体同一のＴｍを有するように設計される。
【００５４】
当業者は、新規殺虫性遺伝子、より具体的には新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子を含む新規遺伝子を同定するための方法または任意のステップも、自動化方法、半自動化方法、または手動方法で実行可能であることを認識する。本明細書に開示する方法は、高スループットスクリーニングアッセイで用いることもできる。
【００５５】
本発明の組成物は、新規遺伝子を有する単離したポリヌクレオチド、ならびにその変異体およびフラグメントを含む。そのような新規遺伝子は、本発明の方法を用いて同定される。本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを含むアミノ酸配列をさらに提供する。本発明で提供する方法によって同定される新規核酸分子および殺虫性ポリペプチドは、例えば、害虫関連損害から植物を保護することに有用性を見出す。
【００５６】
本発明は、単離したもしくは実質的に精製したポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を包含する。「単離した」もしくは「精製した」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、あるいはそれの生物活性の部分には、その自然発生の環境で見出されるように、ポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随して起こるまたは相互作用する成分が、実質的にもしくは本質的に存在しない。従って、単離されたもしくは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え方法によって生成される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成される場合、実質的に化学プロトキシンまたは他の化学物質を含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドの両側に（すなわち、ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する配列）自然に位置する配列（配列を最適にコードするタンパク質）がない。例えば、種々の実施形態において、単離されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドの両側に自然に位置する、およそ５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、混入タンパク質の（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物活性部分を組換えで生成する場合、最適な培養培地は、化学プロトキシンまたは非タンパク質の目的の化学物質の（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満を表す。
【００５７】
本明細書において、「核酸」は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを参照することを含み、限定しない限り、自然発生のヌクレオチドと同様の方法でそれらが一本鎖核酸にハイブリダイズするという点において、天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する公知の類似体（例えば、ペプチド核酸）を包含する。
【００５８】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明をＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定することを意図しない。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌレオチドとの組み合わせを含むことができることを当業者は認識するだろう。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、自然発生の分子および合成の類似体の両方を含む。本発明のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態等に限定されず、配列のすべての形態も包含する。
【００５９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーをいうために互換的に用いられる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が自然発生のアミノ酸に対応する人工的な化学類似体であるアミノ酸、ならびに自然発生のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６０】
本明細書において、特定のポリヌクレオチドまたはそのコードされるタンパク質に関して「全長配列」とは、天然配列の核酸配列全体またはアミノ酸配列全体を有することを意味する。「天然配列」とは、内在性配列（すなわち、生物のゲノムで見出される非操作された配列）を意味することを意図する。全長ポリヌクレオチドは、特定のタンパク質の全長形態をコードする。
【００６１】
本明細書において、特定の核酸と関連して用いる場合、用語「コードする」または「コードされる」とは、その核酸が、特定のタンパク質へのヌクレオチド配列の翻訳を方向づける必要情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸分子は、核酸分子の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むこともあり、またはそのような介在する非翻訳配列（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）がないこともある。
【００６２】
開示するポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体ならびにそれらによってコードされるたんぱく質も、本発明によって包含される。「フラグメント」とは、ポリヌクレオチドの部分またはアミノ酸配列および従ってそれによってコードされるタンパク質の部分を意味する。ポリヌクレオチドのフラグメントは、天然のタンパク質の生物活性を保持し、従って例えば殺虫活性を保有するタンパク質フラグメントをコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるポリヌクレオチドのフラグメントは、通常、生物活性を保持するフラグメントタンパク質をコードしない。従って、ポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから本発明のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでにわたることもある。
【００６３】
タンパク質の生物活性部分をコードする本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、または２５０の近接するアミノ酸をコードする、または本発明の全長タンパク質（例えば、殺虫性タンパク質）に存在するアミノ酸の総数までをコードする。ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用であるポリヌクレオチドのフラグメントは、通常、タンパク質の生物活性部分をコードする必要がない。
【００６４】
従って、ポリヌクレオチドのフラグメントは、タンパク質の生物活性部分をコードすることもあり、または以下に開示する方法を用いてハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いることができるフラグメントでもあり得る。タンパク質の生物活性部分は、本発明のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、タンパク質のコードされた部分を発現させて（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換え発現によって）、タンパク質のコードされた部分の生物活性を評価することによって調製可能である。本発明の方法によって同定されるヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、もしくは１，４００の近接するヌクレオチド、または本明細書で開示する全長ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの数から成る。
【００６５】
「変異体」とは、実質的に同様の配列を意味することを意図する。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位で１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／あるいは天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位で１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、それぞれ自然発生のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重のために本発明のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。これらのような自然発生の対立遺伝子変異体は、周知の分子生物法（例えば、以下に概要を述べるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法およびハイブリダイゼーション法等）を用いることで同定可能である。変異体ポリヌクレオチドは、例えば、依然として本発明の生物活性タンパク質（例えば、殺虫性タンパク質）をコードする部位特異的変異誘発を用いることで生成されるポリヌクレオチド等の合成的に誘導されるポリヌクレオチドも含む。通常、本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体は、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所で記述するパラメータによって決定されるように、その特定のポリヌクレオチドに少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上の配列相同性を有する。
【００６６】
本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体（すなわち、参照ポリヌクレオチド）は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列相同性の割合を比較することによって評価可能である。従って、例えば、本発明のポリペプチドに対して所定の割合の配列相同性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。任意の２つのポリペプチド間の配列相同性の割合を、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所に記述するパラメータを用いて算出可能である。本発明のポリヌクレオチドの任意の所定の対を、それらがコードするそれら２つのポリペプチドによって共有される配列相同性の割合を比較することによって評価する場合、それら２つのコードされたポリペプチド間の配列相同性の割合は、少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列相同性である。
【００６７】
「変異体」タンパク質は、天然のタンパク質の１つ以上の内部部位で１つ以上のアミノ酸の欠失または付加によって、ならびに／あるいは天然のタンパク質の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の置換によって天然のタンパク質から得られるタンパク質を意味することを意図する。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物活性である。すなわち、本明細書に記述するように、それらのタンパク質は天然のタンパク質の所望の生物活性（例えば、殺虫活性）を所有し続ける。そのような変異体は、例えば、遺伝子多型または人間の操作から生じ得る。本発明の天然のタンパク質の生物活性変異体は、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所で記述するパラメータによって決定されるように、その天然のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上の配列相同性を有する。本発明のタンパク質の生物活性変異体は、そのタンパク質とわずか１〜１５のアミノ酸残基、わずか１〜１０（例えば６〜１０）、わずか５、わずか４、３、２、またはただ１つのアミノ酸残基が異なることもある。
【００６８】
本発明のタンパク質を、アミノ酸の置換、欠失、切り詰め、および挿入を含む種々の方法で変化させることができる。そのような操作方法は、通常、当該技術分野で公知である。例えば、殺虫性タンパク質もしくは他のタンパク質のアミノ酸配列変異体およびフラグメントは、ＤＮＡにおける変異によって調製可能である。変異誘発およびポリヌクレオチド改変の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ， ｅｄｓ． （１９８３） Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびそれらに引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、以下のモデルに見出すことができる。すなわち、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）（参照することによって本明細書に援用する）。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する）は、最適であることもある。
【００６９】
このように、本発明のポリヌクレオチドは、自然発生配列ならびに突然変異型の両方を含む。同様に、本発明のタンパク質は、自然発生のタンパク質ならびにそれらの変異体および修飾形態の両方を包含する。そのような変異体は、所望の生物活性（例えば、殺虫活性）を所有し続ける。明らかに、変異体をコードするＤＮＡにおいてなされる突然変異は、リーディングフレーム外に配列を配置すべきでなく、二次ｍＲＮＡ構造を生成可能な相補領域を最適に作製しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照されたい。
【００７０】
本発明に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、タンパク質の特徴において極端な変化をもたらすことは期待されない。しかし、実行に先駆けて置換、欠失、または挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、日常的なスクリーニングアッセイによってその効果が評価されることを認識する。例えば、新規殺虫性タンパク質の変異体の活性を、殺虫活性をアッセイすることによって評価できる。例えば、米国特許第６，５７０，００５号および第６，３３９，１４４（これらを、参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。
【００７１】
変異体ポリヌクレオチドおよびタンパク質も、変異誘発および組換え誘導方法（例えば、ＤＮＡ混合）から生じる配列およびタンパク質を包含する。そのような方法を用いて、タンパク質をコードする１つ以上の配列を操作して、所望の特性（例えば、殺虫活性）を有する新規ポリペプチドを作製可能である。この方法で、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列相同性を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組み換え可能な配列領域を含む関連する配列ポリヌクレオチドの集団から作製される。例えば、このアプローチを用いて、目的のドメインをコードする配列モチーフは、目的の改善された特性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を取得するために、本発明の遺伝子（例えば、新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒素遺伝子）と、他の公知の関連遺伝子との間で組み替えられ得る。そのようなＤＮＡ混合のための戦略は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許５，６０５，７９３号および第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、他の生物（具体的には、他の微生物）由来の対応する配列を単離可能である。このように、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション等の方法を用いて、そのような配列を、本明細書に記載する配列とのそれらの配列相同性に基づいて同定可能である。本明細書に記載する全配列またはそれらの変異体およびフラグメントとのそれらの配列相同性に基づいて単離される配列は、本発明によって包含される。そのような配列は、開示する配列の相同分子種である配列を含む。「相同分子種」は、共通祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種に見出される遺伝子を意味することを意図する。異なる種に見出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらのコードされるタンパク質配列が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上配列相同性を共有する場合、相同分子種と考えられる。相同分子種の機能は、種の間で高度に保存されることが多い。従って、目的の生物活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェント条件下で本明細書に開示する配列またはその変異体もしくはフラグメントにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドは、本発明によって包含される。
【００７３】
ＰＣＲアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の任意の生物から抽出したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅させるために、ＰＣＲ反応で用いるように設計できる。ＰＣＲプライマーの設計方法およびＰＣＲクローニング方法は、通常、当該技術分野で公知でありＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９５） ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｄｓ． （１９９９） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ＰＣＲの公知の方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、対プライマー、入れ子プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチングプライマ等を用いる様々な方法。
【００７４】
ハイブリダイゼーション法において、公知のポリヌクレオチドのすべてまたは一部を、選択した生物由来のクローン化ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、かつ検出可能なグループ（例えば、３２Ｐ、または他の任意の検出可能なマーカー）で標識化してもよい。従って、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブを、本発明の殺虫性ポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識化することによって作製してもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製方法、ならびにｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築方法は、通常、当該技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００７５】
本発明が目的の公知の遺伝子の任意の標的グループと相同領域（すなわち特徴的配列）を共有する新規遺伝子（具体的には新規殺虫性遺伝子、より特定すると新規Ｂｔ Ｃｒｙ毒遺伝子）を同定するためのさらに効率的な方法を提供し、一方当業者は、当該技術分野で公知の標準方法を用いて本明細書で開示するポリヌクレオチドと相同である配列を同定できること認識するだろう。例えば、本明細書で開示される全ポリヌクレオチドまたはその1つ以上の部分は、対応するポリヌクレオチドおよびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして用いられることもある。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブは、ポリヌクレオチド配列の間でも独特であって、かつ好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を含む。そのようなプローブを用いて、選択した生物由来の対応するポリヌクレオチド（例えば、殺虫性ポリヌクレオチド）をＰＣＲによって増幅してもよい。この手法を用いて、所望の生物から付加的なコード配列を単離可能であり、または診断アッセイとして生物中のコード配列の存在を決定可能である。ハイブリダイゼーション法は、プレートに播種したＤＮＡライブラリー（プラークまたはコロニーのいずれか）のハイブリダイゼーションスクリーニングを含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００７６】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件下で行われ得る。「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、他の配列に対するよりも、ブロープがその標的配列と検出可能なより高い程度まで（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍大きい）ハイブリダイズする条件を意味することを意図する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、かつ様々な状況で異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄の条件を調節することによって、プローブと１００％相補的である標的配列が同定できる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整することよって、低度の類似性が検出されるよう、配列中のいくつかのミスマッチングを許容できる（異種プロービング）。通常、プローブは、約１０００未満のヌクレオチド長、好ましくは５００未満のヌクレオチド長である。
【００７７】
一般的に、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、通常、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩類）でありかつ短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対して温度は少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０を超えるヌクレオチド）に対しては少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェント条件は、また、脱安定化剤（例えばホルムアミド）を添加することによって達成可能である。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、３７℃で１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝溶液を用いるハイブリダゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中ストリンジェンシー条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。任意に、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続時間は、通常、約２４時間未満、普通は約４〜１２時間である。洗浄時間の持続時間は、少なくとも平衡に達するのに十分な時間である。
【００７８】
特異性は、一般的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、決定的因子はイオン強度および最終洗浄溶液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、以下のＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８：２６７−２８４の式から概算できる。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ。ここで、Ｍは一価陽イオンのモル数であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチングしたプローブにハイブリダイズする（明示したイオン強度およびｐＨで）時の温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチングごとに約１℃ずつ低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄の条件を調整して、所望の相同性を有する配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の相同性を有する配列を求める場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。通常、ストリンジェント条件は、特定の配列および明示したイオン強度およびｐＨでのその相補体ついてのＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。しかし、高度のストリンジェント条件は、そのＴｍよりも１、２、３、または４℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができ、中度のストリンジェント条件は、そのＴｍよりも６、７、８、９、または１０℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができ、低ストリンジェンシー条件は、そのＴｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いＴｍでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を活用することができる。該式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、ならびに所望のＴｍを用いることは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の溶液のストリンジェンシーにおける変化が本質的に説明されていることを当業者は理解する。ミスマッチング結果の所望の程度が４５℃未満（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）のＴｍの結果になる場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を上げることが最適である。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲な手引書は、以下に見出される。すなわち、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；および Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａl．， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００７９】
以下の用語を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を説明する。すなわち、（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較領域」、（ｃ）「配列相同性」、および「配列相同性の割合」である。
【００８０】
（ａ）本明細書において、「参照配列」は、配列比較の基礎として用いる定義された配列である。参照配列は、特定の配列（例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントとして、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列）のサブセットまたは全体であり得る。
【００８１】
（ｂ）本明細書において、「比較領域」はポリヌクレオチド配列の近接する特定のセグメントについて言及する。ここで、ポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの最適なアライメントのための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較して、比較領域内のポリヌクレオチド配列が付加もしくは欠失（すなわちギャップ）を含み得る。通常、比較領域は、長さが少なくとも２０の近接するヌクレオチドであり、場合により、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長さであり得る。ポリヌクレオチド配列におけるギャップの封入体のために参照配列に対する高度な類似性を回避するために、一般的にギャップペナルティが導入され、マッチング数から差し引かれることを、当業者は理解する。
【００８２】
比較のための配列アライメントの方法は、当該技術分野で周知である。従って、任意の２つの配列間の配列相同性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されることができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（（１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７）、Ｓｍｉｔｈらの局所アライメントアルゴリズム（（１９８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム（（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３）、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎのサーチフォローカルアライメント法（（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−２４４８）、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（（１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７２２６４， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）が挙げられる。
【００８３】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実現は、配列の比較を利用して配列相同性を決定することができる。そのような実現としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， 米国カリフォルニア州マウンテンビューから入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（バージョン１０）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメータを使用して実行されることができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、以下に十分に記述されている。すなわち、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２４：３０７−３３１。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ｓｕｐｒａ．のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＰＡＭ１２０重量残基の表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティは、ＡＬＩＧＮプログラムを利用することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０）ｓｕｐｒａ．のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を取得するために、ＢＬＡＴＮプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を使用してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質またはポリペプチドと相同であるアミノ酸配列を取得するために、ＢＬＡＳＴＸプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップアライメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９に記述されるようにギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴバーション２．０に含まれる）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴバージョン２．０に含まれる）を使用して、分子間の距離関係を検索する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）ｓｕｐｒａ．を参照されたい。ＢＬＡＳＴを使用する場合、ギャップＧＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列に関してはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に関してはＢＬＡＳＴＸ）を使用できる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントは、検査によって手動でも行われ得る。
【００８４】
特に明記しない限り、本明細書で示す配列相同性／類似性の値は、以下のパラメータを用いてＧＡＰバージョン１０を使用して取得した値をいう。すなわち、５０のギャップ重量および３の長重量、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックを用いてヌクレオチド配列の％同一性および％類似性；８のギャップ重量および２の長重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてアミノ酸配列の％同一性および％類似性；またはそれらと同等の任意のプログラム。「同等のプログラム」とは、任意の配列比較プログラムを意味することを意図する。すなわち、ＧＡＰバージョン１０で生成した対応するアライメントと比較するとき、問題になっている任意の２つの配列に対して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチングおよび同一の配列相同性の割合を有するアライメントを生成する。
【００８５】
マッチング数を最大化しかつギャップ数を最小化する２つの完全な配列のアライメントを見出すために、ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用している。ＧＡＰは、すべての可能なアライメントおよびギャップの位置を考慮して、マッチングする最大数の塩基および最も少ないギャップでアライメントを作製する。ＧＡＰは、マッチングする塩基の単位でギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティの提供を可能にする。ＧＡＰは、それが挿入する各ギャップに対してマッチングのギャップ作製ペナルティ数の利得を上げるはずである。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティを選択すると、さらにＧＡＰは、ギャップ×ギャップ伸長ペナルティ長の挿入された各ギャップに対して利得を上げるはずである。タンパク質配列のためのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０でのデフォルトギャップ作製ペナルティ値およびギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８と２である。ヌクレオチド配列に対するデフォルトギャップ作製ペナルティは５０であり、一方でそのデフォルトギャップ伸長ペナルティは３である。ギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、０〜２００からなる整数の群から選択される整数として表されることができる。従って、例えば、ギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、またはそれ以上であり得る。
【００８６】
ＧＡＰは、最高アライメントのファミリーからの１つのメンバーを提示する。このファミリーには多数のメンバーが存在することもあるが、より良い質を有する他のメンバーはない。ＧＡＰは、アライメントに対して４つの性能指数を示す。すなわち、質、比率、同一性、および類似性である。質は、配列を整列させるための最大限の測定基準である。比率は、塩基数によって短いセグメントに分割された質である。パーセント同一性は、実際にマッチングするシンボルのパーセントである。パーセント類似性は、類似するシンボルのパーセントである。ギャップ間にわたるシンボルは、無視される。一対のシンボルに対するスコアリングマトリックス値が０．５０（類似性閾値）より大きいまたは等しい場合、類似性がスコア化される。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０で使用されるスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）である。
【００８７】
（ｃ）本明細書において、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と関連して「配列相同性」または「同一性」は、特定の比較領域の上に最大一致のために整列されたとき、同一である２つの配列中の残基を参照する。配列相同性の割合がタンパク質に関連して用いられる場合、認識されていることは、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸置換によって異なることが多いことである。この場合、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代りに用いられ、従って分子の機能特性は変わらない。保守的置換に差がある配列の場合、配列相同性の割合を上方調整して、置換の保守的性質を修正してもよい。そのような保守的置換だけが異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う方法は、当業者にとって周知である。一般的に、これは、完全ミスマッチングよりもむしろ部分ミスマッチングとして保守的置換をスコアリングすることを含み、それによって配列相同性の割合を増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、かつ非保守的置換にはゼロのスコアを与える場合、保守的置換にはゼロと１との間のスコアを与える。保守的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行されるように、算出される。
【００８８】
（ｄ）本明細書で使用するように、「配列相同性の割合」とは、比較領域の上に最適に配列された２つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較すると、比較領域内のポリヌクレオチド配列の部分が付加もしくは欠失（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がマッチングする位置の数をもたらす両配列に生じる位置の数を決定し、マッチングした位置の数を比較領域内の位置の総数で割ってから、配列相同性の割合をもたらすためにその結果に１００を掛けることによって算出される。
【００８９】
本発明の方法を用いて、公知の遺伝子の任意の標的グループの相同領域を共有する新規遺伝子を同定してもよい。一実施形態において、即時方法を用いて、種々の害虫に対して効果的である新規殺虫性遺伝子を同定する。本発明の目的で、以下の害虫が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、昆虫、真菌、細菌、線虫、コナダニ、病原体原虫、動物寄生肝吸虫等である。特に興味深い害虫は、農作植物に深刻は被害をもたらす害虫である。害虫として、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、ヨコバイ亜目、半翅目、直翅目、総翅目、革翅目、等翅目、シラミ目、ノミ目、毛翅目等から選択される昆虫、具体的には鞘翅目および鱗翅目が挙げられる。農作植物のための本発明の害虫としては、以下が挙げられる。すなわち、トウモロコシ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、ハリガネムシ（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、ノーザンマスクドコガネムシ（地虫）（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、サザンマスクドコガネムシ（地虫）（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、コーンノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、コーンアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、コーンルートアブラムシ（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、移動性バッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、ダイズサヤタマバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）、コーンブロットハモグリエバエ（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ）、クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）、盗賊アリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、モロコシ：アワノメイガの一種（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ネキリムシの一種（Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、地虫（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）、ハリガネムシ（Ｅｌｅｏｄｅｓ、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ、およびＡｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、クビボソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、コーンノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、コーンアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、黄色サトウキビアブラムシ（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）、ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、コムギ：ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ウェスタンネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）クビボソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、オオツメクサタコウゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、ロシアコムギブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）、ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、移動性バッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、コムギタマバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）、ムギキカラバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、コムギバルブフライ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）、タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、ハバチの一種（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ）、チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）、ヒマワリ：サンフラワーバドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、メイガ科のガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）、キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ）、サンフワラーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ）、綿花：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ワミノハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）、オンシツコナジラミの仲間（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）、サビイロカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、米：サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ヨトウガの一種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ）、イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、コクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、ホソヘリカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、ダイズ：キンウワバ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）、ホソヘリカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、バッタの一種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ダイズサヤタマバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）、ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ムギモドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ヒメコガネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、茶カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ）、タネバエ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）、ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）、菜種：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、バーサアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ハナバエ類（Ｄｅｌｉａ ｓｓｐ．）。
【００９０】
線虫としては、例えば、根瘤線虫、シスト線虫、ならびに破壊線虫（ヘテロデラ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、ネコブ線虫メロイドジーン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）、およびグロボデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）を含む）を含む寄生線虫が挙げられる。具体的には、シスト線虫のメンバーとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ダイズシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅ）、ビートシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、ムギシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）、ならびにジャガイモシスト線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ）。破壊線虫としては、根腐れ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００９１】
本明細書において、用語「植物」は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生されることができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および植物中でインタクトな細胞または植物の部分（例えば、胚、花粉、胚珠、種、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯等）である植物細胞を含む。穀物は、その種を栽培または繁殖させる以外の目的で栽培業者によって生成された成熟種子を意味することを意図する。再生される植物の子孫、変異体、および突然変異体がこれらの部分が導入されるポリヌクレオチドを含むならば、これらも本発明の範囲内に含まれる。
【００９２】
即時方法を用いて、公知の遺伝子の任意の標的グループと相同である新規遺伝子を同定できるが、例えば、本発明を用いて任意の植物種でも（単子葉植物および双子植物を含むがこれらに限定されない）害虫関連の損害から保護するポリペプチドをコードする新規殺虫性遺伝子を同定できる。コーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ類（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂ． ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））（具体的にはこれらのアブラナ類は、種油の原料として有用である）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹。
【００９３】
野菜としては、以下が挙げられる。すなわち、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えばＬａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、ならびにキュウリ属のメンバー（例えば、キュウリ（Ｃ． ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ． ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ． ｍｅｌｏ））。観賞植物としては、以下が挙げられる。すなわち、ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、ラッパズイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキク。
【００９４】
本発明を実行する際に利用してもよい針葉樹としては、以下が挙げられる。すなわち、マツ（例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールマイン（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモントレーパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））、アメリカトガサワラ（（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、モミ（例えばヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））、およびシダー（例えば、ウェスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）。特定の実施形態において、本発明の植物は、作物（例えば、コーン、ムラサキウマゴヤシ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、綿花、ベニバナ、ピーナツ、モロコシ、コムギ、雑穀、タバコ等）である。他の実施形態において、コーンおよびダイズ植物が最適であり、さらに他の実施形態において、コーン植物が最適である。
【００９５】
目的の他の植物としては、目的の種子を提供する穀物植物、脂肪種子植物、および豆科植物が挙げられる。目的の種子としては、コーン、コムギ、オオムギ、米、モロコシ、ライムギ等の穀物の種子が挙げられる。脂肪種子植物としては、綿花、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、ムラサキウマゴヤシ、ヤシ、ココナツ等が挙げられる。豆科植物としては、豆およびエンドウ豆が挙げられる。豆としては、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、つるありインゲン、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンティル豆、ヒヨコ豆が挙げられる。
【００９６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうために用いられる。例として、「要素（単数形）」は、１つ以上の要素を意味する。
【００９７】
以下の例を、制限するためでなく、実例として提供する。
【実施例】
【００９８】
実験
実施例１： 新規殺虫性遺伝子の同定
ＢｔプラスミドＤＮＡの単離
種々のＢｔ菌株のグリセロール貯蔵物をＬＢ寒天板上に画線した。翌日、各菌株からの単一コロニーを、４８ウェルプレートのウェルごとに２ｍＬのＴＢ培地に播種した。このウェルプレートを２８℃で、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を、室温で１０分間６，０００ｘｇで遠心させることで収集した。細胞ペレットを、Ｐ１懸濁緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でボルテックスすることで再懸濁させた。細胞を溶解させて、Ｐ２およびＰ３緩衝液でそれぞれ中和させ、この可溶化液を、減圧を掛けてＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒｓ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。濾液をＱＩＡｐｒｅｐプレートに結合させて、ＰＢ緩衝液およびＰＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で洗浄した。プラスミド調製物をＥＢ緩衝液で溶出させて、９６ウェルプレートに収集した。
【００９９】
ＰＣＲの第１ラウンドのための縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計
新規Ｂｔ遺伝子を同定するために、公知のＣｒｙ遺伝子ならびに新規Ｃｒｙ遺伝子ファミリーを表す殺虫性遺伝子に相同である両オリゴヌクレオチドプライマーを、目標の公知のＢｔ遺伝子の標的グループ内の高相同性領域に対して設計した。本実施例において、標的グループは、鱗翅目および鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有する公知のＣｒｙ遺伝子を含むが、双翅目活性である公知のＣｒｙ遺伝子を含まない。具体的には、標的グループからのすべての公知のＢｔ Ｃｒｙ遺伝子のヌクレオチド配列を、公開データベースから収集して、これらの配列のアライメントを生成した。プライマー設計の厳しい条件に適したヌクレオチド配列に添っていくつかのＤＮＡ領域を、選択したすべてのＢｔ遺伝子で位置付けた。わずかなＤＮＡ配列（１７〜２４の連続するヌクレオチド）がすべての公知の殺虫性Ｂｔ遺伝子に存在していたので、これらの領域を殺虫性Ｂｔ遺伝子の「特徴的配列」と命名した。
【０１００】
最初のプライマー長を選択して、５４℃のＴｍを施し、選択した特徴的配列の５’末端から始まる近接するヌクレオチドの領域を観察した。具体的には、領域内のヌクレオチド配列を再度観察して、以下の配列特徴が存在するかを決定した。すなわち、
１）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
２）ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
３）５４℃±２℃で一定した融解温度Ｔｍを有する、
４）ヘアピン構造または二量体構造が形成されてない、
５）殺虫性遺伝子の標的グループからの少なくとも1つのヌクレオチド配列に存在する（すなわちアライメント）、および
６）非標的グループ殺虫性遺伝子からのヌクレオチド配列の間では保存されてない。
【０１０１】
プライマー内の多様性を増加させるために、１塩基対を、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択したｎとさせておいた。
【０１０２】
配列特徴のすべてが存在する場合、ヌクレオチドの領域内のそのヌクレオチド配列を、ＰＣＲの第１ラウンド用のオリゴヌクレオチドプライマーとして用いるために選択した。領域内にヌクレオチド配列が所要の配列特徴を有しない場合は、次いで近接するヌクレオチドの隣接する領域を特徴配列の３’末端に向かって１塩基対ずつ移動させることによって選択し、プロセスを繰り返した。順方向および逆方向の両オリゴヌクレオチドプライマーを、本発明の方法に従って設計した。さらに、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、目的の殺虫性遺伝子中で、約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐ離れたヌクレオチド配列に相補的になるように設計した。ＰＣＲの第1ラウンドの一般プライマーの設計方法論の概略図を図１に示す。
【０１０３】
ＰＣＲ増幅の第1ラウンド：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎステップ
Ｂｔ菌株から単離した核酸物質の第１の試料についてのＰＣＲ増幅の第１ラウンドを、上述のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行なった。具体的には、９６ウェルプレート中のＢｔプラスミド調製物を、以下の反応条件下でＰＣＲによって増幅させた。
鋳型ＤＮＡ量：１００ｎｇ
プライマー量：７．５ナノモル（５μＭ×１．５μＬ）
反応混合物の容量：２５μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ活性化：９５℃で１０分間
ＰＣＲサイクル（４０サイクル）：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。
【０１０４】
増幅の第１ラウンドからのＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料および７７００ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて当該技術分野で公知の方法に従って、検出した。Ｃｒｙ８Ｂｂ１遺伝子を含むＤＰ菌株１２１８−１からのプラスミド調製物を、陽性対照として用いた。２００１年１０月２３日に出願された係属中米国特許出願第１０／０３２，７１７号（発明の名称「Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎｓ」（その全体を参照することによって本明細書に援用する）を参照されたい。上述のＰＣＲ条件を用いて、１２１８−１プラスミド調製物は、７７００ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍでのＰＣＲ増幅に対して標準曲線を生成した。陽性対照に関しておよそ１３のＣｔ値を得た。鋳型ＤＮＡなしでＰＣＲ反応混合物だけを含む陰性対照を試験し、約３５のＣｔ値を生成した。１６未満のＣｔ値を生成したＢｔプラスミド調製物を、さらに分析用として選択し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ陽性と命名した。
【０１０５】
ＰＣＲの第２ラウンド
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎプライマーセットからのすべての逆方向プライマー（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンドで用いた逆方向オリゴヌクレオチドプライマー）を用いて、ＰＣＲの第２ラウンド用の順方向プライマー（すなわち、第１ラウンドプライマーの逆方向鋳型）を生成した。これらのプライマーは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎステップ（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンド）およびＰＣＲの第２ラウンド間の架橋として機能した。ＰＣＲの第２ラウンドで用いる逆方向プライマーを、基本的に第１ラウンドのオリゴヌクレオチドプライマーに関して上述したように設計した。ＰＣＲプライマーＴｍを５４℃±２℃に維持し、約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐのフラグメントを生成するように設計した。ＰＣＲの第２ラウンド用の一般プライマーの設計方法論の概略図を、図１に示す。
【０１０６】
プラスミドＤＮＡを、ＰＣＲの第１ラウンドでＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ陽性対照として同定したＢｔ菌各から単離し、次いでＰＣＲの第２ラウンドに掛けた。第２ラウンドのＰＣＲ条件は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲキットおよび上述のＢｔプラスミド調製物を用いて、以下の通りであった。すなわち、
ＤＮＡ ０．５μｇ
プログラム：
９５℃で１５分間
９４℃で３０秒間
５４℃で１．５分間
７２℃で１．５分間
ステップ２からステップ４までを３５回繰り返す
７２℃で１０分間
４℃で無制限に。
【０１０７】
第２ラウンドからのＰＣＲ反応を、１．０％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、６５０ｂｐ〜７００ｂｐの予想されるフラグメントを、次いで、平滑末端化Ｖｅｃｔｏｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細菌性クローニングベクターにクローン化した。ライゲーションの後、産物をＴｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。個々の細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製して、以下に記述するようにドットプロット分析によって分析した。
【０１０８】
ドットブロット分析
分析から公知のBｔ遺伝子を除外して、ＰＣＲの第１ラウンドおよび第２ラウンドで用いた特徴的配列を含む新規殺虫性遺伝子を同定するために、ドットブロット分析を行なった。具体的には、個々の細菌コロニーから単離したプラスミドＤＮＡを正帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上にブロットした。標的グループ内のすべての殺虫性遺伝子に特異的なプローブが、ＰＣＲの第２ラウンドの間に生成されたＤＮＡの予想される配列フラグメント内に存在するように設計した。ドットプロットステップの一般プローブの設計方法論の概略図を、図１に示す。すべてのプローブを、約７４℃±２℃のＴｍを有するように設計した。全３ステップ（すなわち、ＰＣＲの第１ラウンド、ＰＣＲの第２ラウンド、およびドットブロット分析）において、プライマー／プローブの混合物を各ステップで用いることができるようにオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのＴｍを決定した。オリゴヌクレオチドプローブを、ＤＩＧオリゴヌクレオチド３’末端標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて標識化して、公知のＢｔ遺伝子を求めてドットブロットをスクリーニングするために用いた。それぞれのプローブを、各プローブの特異性および有効性を確保するために、個別およびプローブの混合物として試験した。
【０１０９】
ドットブロット分析によって公知のＢｔ遺伝子に対して陽性と特徴付けたプラスミド調製物のすべてを、さらなる分析から除外した。ドットブロットによる分析で陰性と特徴付けたプラスミド調製物を、以下に記述するようにその新規性を評価するために、さらに配列分析に掛けた。
【０１１０】
配列分析
ＰＣＲの第２ラウンドの間生成され、ドットブロット分析によって「陰性」と特徴付けた核酸（すなわち、６５０ｂｐ〜７００ｂｐのフラグメント）を、配列決定した。これらの核酸の配列結果を、公開データベースで利用可能なヌクレオチド配列に対してＢＬＡＳＴを用いて比較した。配列分析が潜在的に新規Ｂｔ遺伝子を示す場合、その全長遺伝子のヌクレオチド配列を、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて取得した。推定上新規全長殺虫性遺伝子のヌクレオチド配列を、その新規性を確認するために、上述のようにさらに分析した。新規殺虫性遺伝子（例えば、配列番号１、３、および５に記載するもの（および、それによってコードされ、配列番号２、４、および６にそれぞれ記載するポリペプチド））を、本発明の方法によって同定した。新規殺虫性遺伝子を、以下に記述するように殺虫活性について試験した。
【０１１１】
バイオアッセイ
新規殺虫性遺伝子を発現ベクターにクローン化して、トウモロコシ害虫に対する殺虫活性をアッセイした。そのような方法は、通常、当該技術分野で公知である。鞘翅目に対する殺虫活性をアッセイする方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１５１７０９号に記述されている。鱗翅目に対する殺虫活性についてのアッセイは、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３８６８４号に開示されている。
【０１１２】
結果
バイオアッセイの結果を表１および表２に示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
明細書に記載する刊行物および特許出願のすべては、本発明が関連する当業者のレベルを示す。刊行物および特許出願のすべては、それぞれの刊行物および特許出願が参照することによって援用されることを具体的かつ個別に示されているかのように、同じ程度まで参照することによって本明細書に援用される。
【０１１５】
前述の発明は、明瞭な理解の目的で説明および実施例として多少詳しく述べているが、
いくつかの変更および修飾が添付する特許請求の範囲内で行なわれ得ることは言うまでもない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規殺虫性遺伝子を同定する方法であって、
ａ）殺虫性遺伝子の標的グループに特異的であるＰＣＲの第１ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループのヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｂ）目的の微生物由来の核酸物質の第１の試料を取得するステップと、
ｃ）核酸物質の前記第１の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合するステップと、
ｄ）ＰＣＲの第１ラウンドを行い、ＰＣＲ増幅産物を検出し、それによってＰＣＲ産物がＰＣＲの前記第１ラウンドで生成されたかどうかを決定するステップと、
ｅ）ＰＣＲの前記第１ラウンドでＰＣＲ産物が検出される場合、前記微生物由来の核酸物質の第２の試料を取得するステップと、
ｆ）殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｇ）核酸物質の前記第２の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合し、ＰＣＲの第２ラウンドを行うステップと、
ｈ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで生成される任意のＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、推定上の新規殺虫性遺伝子のフラグメントを含み得る核酸フラグメントをさらなる分析のために単離するステップと、
ｉ）それぞれの核酸フラグメントをクローニングベクターにクローン化するステップと、
ｊ）ステップ（ｈ）で単離される前記核酸フラグメントを含むクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換させるステップと、
ｋ）クローニングベクターを含む個々の宿主コロニーから核酸試料を調製するステップと、
ｌ）前記個々の宿主コロニーからの前記核酸試料を、前記標的グループからのすべての公知の殺虫性遺伝子に特異的である標識プローブを用いるドットブロット分析に掛け、ステップ（ｈ）で単離し前記ドットブロット分析ステップの間に検出されない核酸フラグメントが推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを含むステップと、
ｍ）前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを分析するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
目的の前記微生物がバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的の前記微生物由来の核酸物質から第１の試料および第２の試料を取得するステップが前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株からプラスミドＤＮＡを調製することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
目的の前記微生物から核酸物質を取得するステップがＤＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
殺虫性遺伝子の前記標的グループがバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的グループが鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲの前記第１ラウンドが定量リアルタイムＰＣＲを行うステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣＲの前記第１ラウンドが蛍光実体の存在下で行われ、前記蛍光実体がＰＣＲ産物の存在を示し、かつＰＣＲ産物の量に関するシグナルを提供可能な、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光実体が染料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記染料がＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ドットブロット分析で用いられる前記標的グループからのすべての公知の殺虫性遺伝子に特異的である標識プローブが、ＰＣＲの前記第２ラウンドの間に生成される前記核酸フラグメントに存在する領域に特異的であるように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ドットブロット分析で用いられる前記標識プローブが約７０℃乃至約８５℃の熱融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔｍが約８０℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子のドメイン１に存在するヌクレオチド配列に特異的であるように設計される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） Ｃｒｙ遺伝子のドメイン２に存在するヌクレオチド配列に特異的であるように設計される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＲの前記第１ラウンドおよび前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍが約５０℃乃至約６５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを分析するステップがヌクレオチド配列の分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列の分析が推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを含む核酸を配列決定するステップと、前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントの前記ヌクレオチド配列をすべての公知の殺虫性遺伝子と比較するステップと、それによって前記フラグメントが新規であるかどうかを決定するステップとを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フラグメントが新規であると決定された場合、前記推定上の新規殺虫性遺伝子の全長を配列決定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記新規殺虫性遺伝子をクローニングベクターにクローン化するステップと、前記新規殺虫性遺伝子によってコードされるポリペプチドの殺虫活性を評価するステップとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記殺虫活性を評価するステップがバイオアッセイを行うステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる殺虫性遺伝子の標的グループに特異的な少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的グループのすべてのメンバーと共有される相同領域に特異的であるプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲの前記第１ラウンドからの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲの前記第２ラウンド用の順方向オリゴヌクレオチドプライマーを生成するために用いられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲの前記第１ランウンドで用いられる前記順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、殺虫性遺伝子の前記標的グループ内の約５０塩基対（ｂｐ）乃至約１５０ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる前記オリゴヌクレオチドプライマーが約６００ｂｐ乃至約７５０ｂｐの長さのフラグメントを生成するように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる前記オリゴヌクレオチドプライマーが約６５０ｂｐ乃至約７００ｂｐの長さのフラグメントを生成するように設計される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、
ａ）前記標的グループからのすべてのヌクレオチド配列のアライメントを調製するステップと、
ｂ）前記標的グループのすべてのメンバー間で相同領域を含む特徴的配列を、殺虫性遺伝子の前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で同定するステップと、
ｃ）約１５ｂｐ乃至３０ｂｐである最初のプライマー長を選択するステップと、
ｄ）オリゴヌクレオチドプライマー配列のスクリーニングの第1ラウンドを行い、前記スクリーニングが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内の特徴的配列の近接するヌクレオチドの最初の領域を観察することを含み、前記最初の領域が前記特徴的配列の前記ヌクレチド配列の５’末端で開始されるステップと、
ｅ）前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）乃至（ｖｉ）の配列の特徴、すなわち、
ｉ）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
ｉｉｉ）約５０℃乃至６５℃のＴｍを有する、
ｉｖ）ヘアピン構造または二量体構造が形成されない、
ｖ）殺虫性遺伝子の前記標的グループからの少なくとも1つの前記ヌクレオチド配列に存在する（すなわち上述のアライメント）、および
ｖｉ）殺虫性遺伝子の非標的グループからのヌクレオチド配列の間で保存されてない、
を有しているかどうかを決定し、
再観察される前記ヌクレオチド配列内の１つのヌクレオチド残基がｎであることが許され、ここでｎがアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからなる群から選択される任意のヌクレオチドであるステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）の配列の特徴のすべてが存在する場合、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いる前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列を選択するステップと、
ｇ）前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列がステップ（ｅ）の配列の特徴のすべてを有しない場合、前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内の前記特徴的配列の３’末端に向かって前記最初の領域を１塩基対ずつ移動させることによって接近するヌクレオチドの隣接する領域を選択し、前記隣接する領域が前記最初のプライマーの長さと等しい長さであるステップと、
ｈ）前記配列の特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されるまで、または前記標的グループの全特徴的配列がスクリーニングされるまで、前記隣接する領域でステップ（ｅ）乃至（ｇ）を繰り返すステップと、
ｉ）第１の特徴的配列をスクリーニングすることによって前記特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されない場合、殺虫性遺伝子の前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で第２の特徴的配列を選択し、前記第２の特徴的配列を用いて、ステップ（ｃ）乃至（ｈ）を繰り返すことを含むスクリーニングの付加的ラウンドを行うステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、請求項２８に記載の方法に従って縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物を、それぞれの対のオリゴヌクレオチドプライマーが前記標的グループ内でできるだけ多くの殺虫性遺伝子に特異的になるように設計することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に従って設計される前記複数対のオリゴヌクレオチドプライマーの前記混合物がＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的なＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、
ａ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで順方向オリゴヌクレオチドプライマーを生成するために、ＰＣＲの前記第１ラウンドからの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いるステップと、
ｂ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、殺虫性遺伝子の前記標的グループからのすべてのヌクレオチド配列のアライメントを調製するステップと、
ｃ）前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で、前記標的グループのすべてのメンバー間で相同領域を含む特徴的配列を同定し、ＰＣＲの前記第２ラウンド用の前記逆方向プライマーを設計するために用いられる前記特徴的配列が、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる前記逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる前記特徴的配列に対して３’に位置付けられる、ステップと、
ｄ）前記配列の特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されるまで、請求項２８に記載のステップ（ｃ）乃至（ｉ）を行い、ＰＣＲの前記第２ラウンドで逆方向プライマーとして用いる前記ヌクレオチド配列を選択するステップと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、請求項３２に記載の方法に従って縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物を、それぞれの対のオリゴヌクレオチドプライマーが前記標的グループ内でできるだけ多くの殺虫性遺伝子に特異的になるように設計することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に従って設計される前記複数対のオリゴヌクレオチドプライマーの混合物が、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３０に従って設計される縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物がＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられ、かつ請求項３４に従って設計される縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物がＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
公知の遺伝子の標的グループとの相同性を共有する新規遺伝子を同定する方法であって、
ａ）遺伝子の標的グループに特異的であるＰＣＲの第１ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループのヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｂ）目的の生物由来の核酸物質の第１の試料を取得するステップと、
ｃ）核酸物質の前記第１の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合するステップと、
ｄ）ＰＣＲの第１ラウンドを行い、ＰＣＲ増幅産物を検出し、それによってＰＣＲ産物がＰＣＲの前記第１ラウンドで生成されたかどうかを決定するステップと、
ｅ）ＰＣＲの前記第１ラウンドでＰＣＲ産物が検出される場合、前記生物由来の核酸物質の第２の試料を取得するステップと、
ｆ）遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｇ）核酸物質の前記第２の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合し、ＰＣＲの第２ラウンドを行うステップと、
ｈ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで生成される任意のＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、前記標的グループの前記遺伝子との相同性を共有する推定上の新規遺伝子フラグメントを含み得る核酸フラグメントをさらなる分析のために単離するステップと、
ｉ）それぞれの核酸フラグメントをクローニングベクターにクローン化するステップと、
ｊ）ステップ（ｈ）で単離される前記核酸フラグメントを含むクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換させるステップと、
ｋ）クローニングベクターを含む個々の宿主コロニーから核酸試料を調製するステップと、
ｌ）前記個々の宿主コロニーからの前記核酸試料を、前記標的グループからのすべての公知の遺伝子に特異的である標識プローブを用いるドットブロット分析に掛け、ステップ（ｈ）で単離され、前記ドットブロット分析ステップの間に検出されない核酸フラグメントが、前記標的グループの前記遺伝子との相同性を共有する推定上の新規遺伝子フラグメントを含むステップと、
ｍ）前記推定上の新規遺伝子フラグメントを分析するステップと
を含む、方法。
【請求項１】
新規殺虫性遺伝子を同定する方法であって、
ａ）殺虫性遺伝子の標的グループに特異的であるＰＣＲの第１ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループのヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｂ）目的の微生物由来の核酸物質の第１の試料を取得するステップと、
ｃ）核酸物質の前記第１の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合するステップと、
ｄ）ＰＣＲの第１ラウンドを行い、ＰＣＲ増幅産物を検出し、それによってＰＣＲ産物がＰＣＲの前記第１ラウンドで生成されたかどうかを決定するステップと、
ｅ）ＰＣＲの前記第１ラウンドでＰＣＲ産物が検出される場合、前記微生物由来の核酸物質の第２の試料を取得するステップと、
ｆ）殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｇ）核酸物質の前記第２の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合し、ＰＣＲの第２ラウンドを行うステップと、
ｈ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで生成される任意のＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、推定上の新規殺虫性遺伝子のフラグメントを含み得る核酸フラグメントをさらなる分析のために単離するステップと、
ｉ）それぞれの核酸フラグメントをクローニングベクターにクローン化するステップと、
ｊ）ステップ（ｈ）で単離される前記核酸フラグメントを含むクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換させるステップと、
ｋ）クローニングベクターを含む個々の宿主コロニーから核酸試料を調製するステップと、
ｌ）前記個々の宿主コロニーからの前記核酸試料を、前記標的グループからのすべての公知の殺虫性遺伝子に特異的である標識プローブを用いるドットブロット分析に掛け、ステップ（ｈ）で単離し前記ドットブロット分析ステップの間に検出されない核酸フラグメントが推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを含むステップと、
ｍ）前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを分析するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
目的の前記微生物がバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的の前記微生物由来の核酸物質から第１の試料および第２の試料を取得するステップが前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株からプラスミドＤＮＡを調製することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
目的の前記微生物から核酸物質を取得するステップがＤＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
殺虫性遺伝子の前記標的グループがバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的グループが鞘翅目からの昆虫に対して殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲの前記第１ラウンドが定量リアルタイムＰＣＲを行うステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣＲの前記第１ラウンドが蛍光実体の存在下で行われ、前記蛍光実体がＰＣＲ産物の存在を示し、かつＰＣＲ産物の量に関するシグナルを提供可能な、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光実体が染料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記染料がＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ドットブロット分析で用いられる前記標的グループからのすべての公知の殺虫性遺伝子に特異的である標識プローブが、ＰＣＲの前記第２ラウンドの間に生成される前記核酸フラグメントに存在する領域に特異的であるように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ドットブロット分析で用いられる前記標識プローブが約７０℃乃至約８５℃の熱融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔｍが約８０℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ遺伝子のドメイン１に存在するヌクレオチド配列に特異的であるように設計される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） Ｃｒｙ遺伝子のドメイン２に存在するヌクレオチド配列に特異的であるように設計される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＲの前記第１ラウンドおよび前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍが約５０℃乃至約６５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを分析するステップがヌクレオチド配列の分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列の分析が推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントを含む核酸を配列決定するステップと、前記推定上の新規殺虫性遺伝子フラグメントの前記ヌクレオチド配列をすべての公知の殺虫性遺伝子と比較するステップと、それによって前記フラグメントが新規であるかどうかを決定するステップとを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フラグメントが新規であると決定された場合、前記推定上の新規殺虫性遺伝子の全長を配列決定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記新規殺虫性遺伝子をクローニングベクターにクローン化するステップと、前記新規殺虫性遺伝子によってコードされるポリペプチドの殺虫活性を評価するステップとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記殺虫活性を評価するステップがバイオアッセイを行うステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる殺虫性遺伝子の標的グループに特異的な少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的グループのすべてのメンバーと共有される相同領域に特異的であるプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲの前記第１ラウンドからの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲの前記第２ラウンド用の順方向オリゴヌクレオチドプライマーを生成するために用いられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲの前記第１ランウンドで用いられる前記順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、殺虫性遺伝子の前記標的グループ内の約５０塩基対（ｂｐ）乃至約１５０ｂｐ離れているヌクレオチド配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる前記オリゴヌクレオチドプライマーが約６００ｂｐ乃至約７５０ｂｐの長さのフラグメントを生成するように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる前記オリゴヌクレオチドプライマーが約６５０ｂｐ乃至約７００ｂｐの長さのフラグメントを生成するように設計される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、
ａ）前記標的グループからのすべてのヌクレオチド配列のアライメントを調製するステップと、
ｂ）前記標的グループのすべてのメンバー間で相同領域を含む特徴的配列を、殺虫性遺伝子の前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で同定するステップと、
ｃ）約１５ｂｐ乃至３０ｂｐである最初のプライマー長を選択するステップと、
ｄ）オリゴヌクレオチドプライマー配列のスクリーニングの第1ラウンドを行い、前記スクリーニングが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内の特徴的配列の近接するヌクレオチドの最初の領域を観察することを含み、前記最初の領域が前記特徴的配列の前記ヌクレチド配列の５’末端で開始されるステップと、
ｅ）前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）乃至（ｖｉ）の配列の特徴、すなわち、
ｉ）４つ以上の近接する同一のヌクレオチド残基を持たない、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列の３’末端の最後の５残基内に２つ以上のグアニン残基またはシトシン残基を持たない、
ｉｉｉ）約５０℃乃至６５℃のＴｍを有する、
ｉｖ）ヘアピン構造または二量体構造が形成されない、
ｖ）殺虫性遺伝子の前記標的グループからの少なくとも1つの前記ヌクレオチド配列に存在する（すなわち上述のアライメント）、および
ｖｉ）殺虫性遺伝子の非標的グループからのヌクレオチド配列の間で保存されてない、
を有しているかどうかを決定し、
再観察される前記ヌクレオチド配列内の１つのヌクレオチド残基がｎであることが許され、ここでｎがアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからなる群から選択される任意のヌクレオチドであるステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）の配列の特徴のすべてが存在する場合、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いる前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列を選択するステップと、
ｇ）前記最初の領域内の前記ヌクレオチド配列がステップ（ｅ）の配列の特徴のすべてを有しない場合、前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内の前記特徴的配列の３’末端に向かって前記最初の領域を１塩基対ずつ移動させることによって接近するヌクレオチドの隣接する領域を選択し、前記隣接する領域が前記最初のプライマーの長さと等しい長さであるステップと、
ｈ）前記配列の特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されるまで、または前記標的グループの全特徴的配列がスクリーニングされるまで、前記隣接する領域でステップ（ｅ）乃至（ｇ）を繰り返すステップと、
ｉ）第１の特徴的配列をスクリーニングすることによって前記特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されない場合、殺虫性遺伝子の前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で第２の特徴的配列を選択し、前記第２の特徴的配列を用いて、ステップ（ｃ）乃至（ｈ）を繰り返すことを含むスクリーニングの付加的ラウンドを行うステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、請求項２８に記載の方法に従って縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物を、それぞれの対のオリゴヌクレオチドプライマーが前記標的グループ内でできるだけ多くの殺虫性遺伝子に特異的になるように設計することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に従って設計される前記複数対のオリゴヌクレオチドプライマーの前記混合物がＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的なＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、
ａ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで順方向オリゴヌクレオチドプライマーを生成するために、ＰＣＲの前記第１ラウンドからの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いるステップと、
ｂ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、殺虫性遺伝子の前記標的グループからのすべてのヌクレオチド配列のアライメントを調製するステップと、
ｃ）前記標的グループの前記ヌクレオチド配列内で、前記標的グループのすべてのメンバー間で相同領域を含む特徴的配列を同定し、ＰＣＲの前記第２ラウンド用の前記逆方向プライマーを設計するために用いられる前記特徴的配列が、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられる前記逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる前記特徴的配列に対して３’に位置付けられる、ステップと、
ｄ）前記配列の特徴のすべてを有するヌクレオチド配列が同定されるまで、請求項２８に記載のステップ（ｃ）乃至（ｉ）を行い、ＰＣＲの前記第２ラウンドで逆方向プライマーとして用いる前記ヌクレオチド配列を選択するステップと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔｍが約５２℃乃至約５６℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
殺虫性遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するステップが、請求項３２に記載の方法に従って縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物を、それぞれの対のオリゴヌクレオチドプライマーが前記標的グループ内でできるだけ多くの殺虫性遺伝子に特異的になるように設計することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に従って設計される前記複数対のオリゴヌクレオチドプライマーの混合物が、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３０に従って設計される縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物がＰＣＲの前記第１ラウンドで用いられ、かつ請求項３４に従って設計される縮重オリゴヌクレオチドプライマー対の混合物がＰＣＲの前記第２ラウンドで用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
公知の遺伝子の標的グループとの相同性を共有する新規遺伝子を同定する方法であって、
ａ）遺伝子の標的グループに特異的であるＰＣＲの第１ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループのヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｂ）目的の生物由来の核酸物質の第１の試料を取得するステップと、
ｃ）核酸物質の前記第１の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第１ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合するステップと、
ｄ）ＰＣＲの第１ラウンドを行い、ＰＣＲ増幅産物を検出し、それによってＰＣＲ産物がＰＣＲの前記第１ラウンドで生成されたかどうかを決定するステップと、
ｅ）ＰＣＲの前記第１ラウンドでＰＣＲ産物が検出される場合、前記生物由来の核酸物質の第２の試料を取得するステップと、
ｆ）遺伝子の前記標的グループに特異的であるＰＣＲの第２ラウンドで用いる少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、それぞれのプライマーが前記標的グループの前記ヌクレオチド配列に存在する特徴的配列を標的にする順方向プライマーと逆方向プライマーとを含むプライマーの対を設計するステップと、
ｇ）核酸物質の前記第２の試料を、ＰＣＲによる増幅に適した条件下で、ＰＣＲの前記第２ラウンドで用いる少なくとも一対の前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと混合し、ＰＣＲの第２ラウンドを行うステップと、
ｈ）ＰＣＲの前記第２ラウンドで生成される任意のＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、前記標的グループの前記遺伝子との相同性を共有する推定上の新規遺伝子フラグメントを含み得る核酸フラグメントをさらなる分析のために単離するステップと、
ｉ）それぞれの核酸フラグメントをクローニングベクターにクローン化するステップと、
ｊ）ステップ（ｈ）で単離される前記核酸フラグメントを含むクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換させるステップと、
ｋ）クローニングベクターを含む個々の宿主コロニーから核酸試料を調製するステップと、
ｌ）前記個々の宿主コロニーからの前記核酸試料を、前記標的グループからのすべての公知の遺伝子に特異的である標識プローブを用いるドットブロット分析に掛け、ステップ（ｈ）で単離され、前記ドットブロット分析ステップの間に検出されない核酸フラグメントが、前記標的グループの前記遺伝子との相同性を共有する推定上の新規遺伝子フラグメントを含むステップと、
ｍ）前記推定上の新規遺伝子フラグメントを分析するステップと
を含む、方法。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５４４２８８（Ｐ２００９−５４４２８８Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２１０１８（Ｐ２００９−５２１０１８）
【出願日】平成１９年７月２０日（２００７．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１５６５
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０７１０１３１４）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (4)
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２０日（２００７．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１５６５
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０７１０１３１４）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (4)
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【Ｆターム（参考）】
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