早期新生児の処置
本発明は、未熟児に関連した病的状態及び死亡を低減若又は防止させるための、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）又は血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）による早期新生児の処置に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば未熟児に関連した病的状態及び死亡を低減又は防止するための、早期新生児の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
未熟児出産は、先進国では人口の５％〜１０％、また発展途上国では人口のおよそ２５％に影響を及ぼす（非特許文献１）。早期出産は、新生児の死亡の大部分を占め、また新生児集中治療室の作業負荷の大半を占める。このことは、コストの著しい負担を表し、１日の新生児集中治療は、およそ１０００ポンドの費用がかかり、イギリスにおける年間コストは、２００６年〜２００７年で４億２千万ポンドと推定される（非特許文献２）。
【０００３】
新生児集中治療における最も首尾よい介入の１つは、出産直後の早期乳児の肺へ合成界面活性剤を投与することである。このことにより、未熟児に関連した病的状態及び死亡が低減される（概説に関しては非特許文献３を参照）。界面活性剤は、動物研究で同定されており、新生児がその第一呼吸をした際に、肺での表面張力を低減させるのに重要な役割を有することがわかった。肺内での界面活性剤の発現は、妊娠の後半の３分の１で増大し、ヒトを含む多くの種において、これは、胎児中のコルチコステロイドにより誘導される。界面活性剤の使用は、出産準備の生物学の理解が、有用かつ有益な治療上の介入へどのように変換され得るかの一例である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Steer P. BJOG 2005; 112 Suppl 1:1-3.
【非特許文献２】National Audit Office (UK). Caring for Vulnerable Babies: The reorganisation of neonatal service in England. London: The Stationery Office; 2007.
【非特許文献３】Suresh GK, Soll RF. J Perinatol 2005; 25 Suppl 2:S40-S44.
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）及び血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）をコードする転写産物が、正常な哺乳動物の妊娠の最終段階において胎児中で上方調節され、出産時に母体環境からの分娩後に続いて起こる変化に、新生児を適応させるのに重要な役割を果たすという知見に関する。したがって、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）及び／又は血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）は、早期新生児において病的状態若しくは死亡を低減又は防止させる際の治療薬として有用であり得る。
【０００６】
本発明の一態様は、早期新生児を処置する方法であって、上記早期新生児においてパラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることを含む、早期新生児を処置する方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は、早期新生児を処置する方法であって、上記早期新生児において血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることを含む、早期新生児を処置する方法を提供する。
【０００８】
早期新生児は、正常な妊娠期間の終了前に生まれた乳児である。ヒトでは、３７週未満（予定日の最良の臨床上の概算から算出される場合、ここでこの予定日は、４０週０日に等しいと解釈される）の妊娠期間で分娩された乳児が、一般的に早期であるとみなされる。
【０００９】
幾つかの実施形態では、早期新生児は、極めて早期の新生児、例えば、３２週未満の妊娠期間で分娩されるヒト乳児であり得る。
【００１０】
本明細書中で記載されるような処置に適した早期新生児は、哺乳動物早期新生児、好ましくはヒト早期新生児であり得る。
【００１１】
本明細書中に記載されるような処置に適した早期新生児は、ＰＯＮ３を欠損している場合がある。換言すると、早期新生児中のＰＯＮ３のレベル又は活性は、満期新生児中のＰＯＮ３のレベル又は活性未満であり得る。幾つかの実施形態では、早期新生児は、分娩前若しくは分娩後にＰＯＮ３のレベルを測定することによって直接的に、又は酸化的ストレス関連の合併症のようなＰＯＮ３欠損に関連した１つ又は複数の症状を同定することによって間接的に、処置前にＰＯＮ３が欠損していると同定され得る。他の実施形態では、早期新生児は、ＰＯＮ３が欠損していると同定されることなく、記載されるように処置され得る。
【００１２】
本明細書中に記載されるような処置に適した早期新生児は、ＳＡＡ３を欠損している場合がある。換言すると、早期新生児中のＳＡＡ３のレベル又は活性は、満期新生児中のＳＡＡ３のレベル又は活性未満であり得る。幾つかの実施形態では、早期新生児は、分娩前若しくは分娩後にＳＡＡ３のレベルを測定することによって直接的に、又は酸化的ストレス関連の合併症のようなＳＡＡ３欠損に関連した１つ又は複数の症状を同定することによって間接的に、処置前にＳＡＡ３が欠損していると同定され得る。他の実施形態では、早期新生児は、ＳＡＡ３が欠損していると同定されることなく、記載されるように処置され得る。
【００１３】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法は、該新生児から入手されるサンプル中のＰＯＮ３及び／若しくはＳＡＡ３のレベル又は活性を決定することを含むことができ、対照に対するＰＯＮ３及び／若しくはＳＡＡ３のレベル又は活性の低減が、該早期新生児は該病的状態及び／又は死亡の危険性があることを示す。
【００１４】
ＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベルは、標準的な技法、例えば、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイにより、又は酵素活性のアッセイにより、早期新生児から得られるサンプル、例えば血液サンプル又は血清サンプル中で決定され得る。
【００１５】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児は、満期新生児に対して病的状態及び／又は死亡の増大された危険性を有し得る。病的状態及び／又は死亡の危険性があると同定された早期新生児は、本明細書に記載されるように処置され得る。
【００１６】
本明細書中で記載されるように早期新生児においてＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることによって、病的状態及び／又は死亡の程度、重篤性又は危険性を低減させ得る。例えば、本明細書中に記載されるような処置は、未熟児の医学的合併症、例えば酸化的ストレスに関連した合併症の重篤性若しくは危険性を防止又は低減し得る。
【００１７】
処置され得る未熟児の合併症としては、呼吸器合併症（例えば、呼吸窮迫症候群、肺高血圧症及び気管支肺異形成症）、神経系合併症（未熟児無呼吸発作、低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）、頭蓋内出血、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、発育障害及び脳性まひ）、心血管系合併症（例えば、動脈管開存症（ＰＤＡ））、胃腸及び代謝系合併症（例えば、低血糖症、摂食困難及び壊死性腸炎（ＮＥＣ））、並びに血液系合併症（例えば、未熟児貧血、血小板減少症、及び高ビリルビン血症（黄疸）及び核黄疸）が挙げられる。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるように処置され得る未熟児の合併症は、敗血症若しくは感染症、又は敗血症若しくは感染症に関連した状態を含まない。
【００１９】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドのレベル又は活性は、新生児において全身的に、又は早期新生児の特定の臓器若しくは組織において（例えば早期新生児の肺、血管系及び／又は他の組織において）局所的に増大され得る。
【００２０】
好ましくは、ＰＯＮ３ポリペプチドのレベルは、ＰＯＮ３ポリペプチドを早期新生児に投与することによって増大される。
【００２１】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３、ＧｅｎｅＩＤ：５４４６）は、血清中での高密度リポタンパク質に関連するホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．８．１）である。
【００２２】
ヒトＰＯＮ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿０００９３１．１ ＧＩ：２９７８８９９６を有し、配列番号２で示される。ヒトＰＯＮ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿０００９４０．２ ＧＩ：９４５３８３５５を有し、配列番号１で示される。本発明者らはまた、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＰＯＮ３のスプライス変異体を同定した。ヒトＰＯＮ３スプライス変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。
【００２３】
本明細書に記載されるような使用に適した他のＰＯＮ３ポリペプチドは、ウシ又はブタのような非ヒト哺乳動物由来のＰＯＮ３のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれらの断片、変異体若しくは対立遺伝子であってもよい。ウシＰＯＮ３（ＧｅｎｅＩＤ：５１０９５３）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿００１０６８９４７．１ ＧＩ：１１５４９６１６５を有する。ウシＰＯＮ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿００１０７５４７９．１ ＧＩ：１１５４９６１６４を有するブタＰＯＮ３（ＧｅｎｅＩＤ：７３３６７４）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿００１０３８０６９．１ ＧＩ：１１３２０５８６６を有する。
【００２４】
本明細書に記載されるような使用に適したＰＯＮ３ポリペプチドは、参照ＰＯＮ３配列のアミノ酸配列（例えば配列番号２又は配列番号４）、又は参照ＰＯＮ３配列のフラグメント、対立遺伝子若しくは変異体を含んでもよい。例えば、配列番号２又は配列番号４のような参照ＰＯＮ３配列の対立遺伝子又は変異体は、参照ＰＯＮ３配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２５】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により、例えば配列番号２又は配列番号４のような参照ＰＯＮ３配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２６】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号４のような完全長ＰＯＮ３アミノ酸配列のフラグメント、又は配列番号２若しくは配列番号４の変異体若しくは対立遺伝子であり得る。フラグメントは、パラオキソナーゼ３活性を保持する完全長配列よりも少ないアミノ酸で構成される切断型ポリペプチドである。適切なフラグメントは、完全長配列の少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個又は少なくとも３００個のアミノ酸を含み得る。適切なフラグメントは、ＰＯＮ３活性を保持する。
【００２７】
本明細書に記載されるような使用に適したＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは配列番号３の対立遺伝子若しくは変異体によりコードされ得る。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００２８】
ＰＯＮ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、１個のヌクレオチド、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のヌクレオチドの挿入、付加、置換又は欠失により、配列番号１又は配列番号３と異なり得る。
【００２９】
同様に、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドのレベル又は活性は、早期新生児において全身的に、又は新生児の特定の臓器若しくは組織において（例えば肺、血管系及び／又は他の組織において）局所的に増大され得る。
【００３０】
好ましくは、ＳＡＡ３ポリペプチドのレベルは、ＳＡＡ３ポリペプチドを早期新生児に投与することによって増大される。
【００３１】
ヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＡＡＯ４８４３７．１ ＧＩ：２８８６４６９８を有し、配列番号６で示される。ヒトＳＡＡ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＡＹ２０９１８８．１ ＧＩ：２８８６４６９７を有し、配列番号５で示される。
【００３２】
本明細書に記載されるような使用に適した他のＳＡＡ３ポリペプチドは、ウシ、ラット若しくはマウスのような非ヒト哺乳動物由来のＳＡＡ３のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれらのフラグメント、変異体若しくは対立遺伝子であってもよい。マウスＳＡＡ３（ＧｅｎｅＩＤ：２０２１０）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿０３５４４５．１ ＧＩ：６７５５３９６を有する。マウスＳＡＡ３をコードするヌクレオチド酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿０１１３１５．３ ＧＩ：１１８１３０１９７を有する。ラットＳＡＡ３をコードするヌクレオチド酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＢＦ２８２３１８ ＧＩ：１１２１３４８９を有し、Ｒａｔ２３０＿２アレイ上でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ１３９２６４７＿にハイブリダイズする。ウシＳＡＡ３（ＧｅｎｅＩＤ：２８１４７４）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿８５１３５９．２ ＧＩ：３８５６６６９６を有する。ウシＳＡＡ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿１８１０１６．３ ＧＩ：３８５６６６９５を有する。
【００３３】
本明細書に記載されるような使用に適したＳＡＡ３ポリペプチドは、参照ＳＡＡ３配列のアミノ酸配列（例えば配列番号６）、又は参照ＳＡＡ３配列のフラグメント、対立遺伝子若しくは変異体を含んでもよい。例えば、配列番号６のような参照ＳＡＡ３配列の対立遺伝子又は変異体は、参照ＳＡＡ３配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３４】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により、例えば配列番号６のような参照ＳＡＡ３配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３５】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号６のような完全長ＳＡＡ３アミノ酸配列のフラグメント、又は配列番号６の変異体又は対立遺伝子であり得る。フラグメントは、血清アミロイドＡ様タンパク質３活性を保持する完全長配列よりも少ないアミノ酸で構成される切断型ポリペプチドである。適切なフラグメントは、完全長配列の少なくとも３０個、少なくとも４０個、又は少なくとも５０個のアミノ酸を含み得る。適切なフラグメントは、血清アミロイドＡ様タンパク質３活性を保持する。
【００３６】
本明細書に記載されるような使用に適したＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５の対立遺伝子若しくは変異体によりコードされ得る。例えば、ＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００３７】
ＳＡＡ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、１個のヌクレオチド、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のヌクレオチドの挿入、付加、置換又は欠失により、配列番号５と異なり得る。
【００３８】
ヌクレオチド及びアミノ酸の配列同一性は概して、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ ウィスコンシンパッケージ（商標）、Accelrys、カリフォルニア州、サンディエゴ）を参照して規定される。ＧＡＰは、Needleman及びWunschのアルゴリズム３６を使用して、マッチの数を最大にするとともに、ギャップの数を最低限に抑える２つの完全配列を整列させる。一般的には、ギャップ開始ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４を用いてデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいとされるが、一般的にデフォルトパラメータを用いて他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（これは、Altschul他（１９９０年）、J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（これは、Pearson及びLipman（１９８８年）、PNAS USA85: 2444-2448の方法を使用する）又はスミス・ウォータマンアルゴリズム（Smith及びWaterman（１９８１年）、J. Mol Biol. 147: 195-197）を使用してもよい。
【００３９】
１つ又は複数の異種アミノ酸、例えば異種ペプチド又は異種ポリペプチド配列を、本明細書中に記載されるＰＯＮ３アミノ酸配列又はＳＡＡ３アミノ酸配列に結合又は融合させてもよい。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチドは、１つ又は複数の異種アミノ酸に連結又は融合された上述するようなＰＯＮ３アミノ酸配列を含んでもよい。１つ又は複数の異種アミノ酸は、ＰＯＮ３以外の供給源由来の配列を含んでもよい。同様に、ＳＡＡ３ポリペプチドは、１つ又は複数の異種アミノ酸に連結又は融合された上述するようなＳＡＡ３アミノ酸配列を含んでもよい。１つ又は複数の異種アミノ酸は、ＳＡＡ３以外の供給源由来の配列を含んでもよい。
【００４０】
ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドが、融合タンパク質内に含まれてもよい。
【００４１】
幾つかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書中に記載されるような早期新生児の処置における使用前に、成熟ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドを生産するようにプロセシングすることができる。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドの他に、融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼ認識配列のすべて又は一部を形成するＮ末端若しくはＣ末端での１つ又は複数の異種アミノ酸を含んでもよい。成熟ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドは、例えば、トロンビン又は第Ｘａ因子のような部位特異的プロテアーゼを使用して、部位特異的プロテアーゼ認識配列の切断により融合タンパク質から生産することができる。
【００４２】
融合タンパク質は、精製後に部位特異的プロテアーゼにより除去される精製タグを含んでもよい。適切な精製タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（日本住吸血虫(Schistosoma Japonica)由来）が挙げられる。
【００４３】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、任意の利便性の高い技法により生産することができ、広範な適切なアプローチが利用可能である。
【００４４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、ブタ又はウシのような非ヒト哺乳動物から単離及び／又は精製することができる。
【００４５】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、全体的に又は部分的に化学合成により生成することができる。例えば、ポリペプチドは、液相又は固相合成方法を使用して、溶液中で、又は固相、液相及び溶液化学の任意の組合せにより、例えばまず、各々のペプチド部分を完成させ、続いて、望ましくかつ適切である場合、存在している任意の保護基の除去後に、各々のカルボン酸若しくはスルホン酸又はそれらの反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入により合成することができる。
【００４６】
ポリペプチドの化学合成は、当該技術分野で既知である（J.M. Stewart及びJ. D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Company、イリノイ州、ロックフォード（１９８４年）；M. Bodanzsky及びA. Bodanzsky、The Practice of Peptide Synthesis、Springer Verlag、ニューヨーク（１９８４年）；J.H. Jones、The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press、オックスフォード（１９９１年）；Applied Biosystems 430A Users Manualにて、ABI Inc.、カリフォルニア州、フォスター市；G.A. Grant（著）、Synthetic Peptides, A User's Guide. W.H. Freeman & Co.、ニューヨーク、１９９２年；E. Atherton及びR.C. Sheppard、Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press、１９８９年、並びにG.B. Field（著）、Solid-Phase Peptide Synthesis(Methods in Enzymology Vol. 289)にて、Academic Press、ニューヨーク及びロンドン（１９９７年）。
【００４７】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、全体的に又は部分的に組換え技法により生成することができる。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中で発現し、発現されたポリペプチドを細胞培養液から単離及び／又は精製することができる。
【００４８】
組換えＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドの生産に関して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドをコードする核酸配列（すなわち、ＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸）は、発現ベクター内に含まれ得る。適切な調節配列（プロモータ−配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサ配列、マーカー遺伝子及び適切な場合には他の配列を含む）を含有する適切なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞中でＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸の発現を駆動させるのに適した調節配列を含有する。広範な発現系において異種核酸コード配列の発現を駆動させるのに適した調節配列は、当該技術分野で既知であり、構成プロモータ−（例えばＣＭＶ又はＳＶ４０のようなウイルスプロモータ−）、及び誘導プロモータ−（例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ制御プロモータ−）が挙げられる。ベクターはまた、大腸菌(E. Coli)のような細菌宿主において、及び／又は酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞のような真核細胞において、その選択及び複製及び発現を可能にする配列（例えば、複製起点及び選択マーカー）を含み得る。
【００４９】
ＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸を発現させる際の使用に適したベクターとしては、プラスミド及びウイルスベクター、例えば「ファージ」又はファージミドが挙げられ、ベクターの正確な選択は、用いられる特定の発現系に依存する。ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドは、任意の利便性の高い発現系で発現することができ、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞発現系を含む多数の適切な系が当該技術分野で利用可能である。更なる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual：第３版、Russell他、２００１年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。細胞培養液中での組換えポリペプチドの発現、並びにそれらの続く単離及び精製に関する技法及びプロトコルは当該技術分野で既知である（例えば、Protocols in Molecular Biology、第２版、Ausubel他（著）、John Wiley & Sons、１９９２年；Recombinant Gene Expression Protocols、RS Tuan（著）（１９９７年３月）、Humana Press Incを参照）。
【００５０】
上述するように、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドは、ＰＯＮ３ポリペプチド配列又はＳＡＡ３ポリペプチド配列と精製タグとを含む融合タンパク質として発現系中で発現され得る。好ましくは、プロテアーゼ認識部位は、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドと精製タグとの間に位置する。発現に続いて、融合タンパク質は、精製タグに結合する固定化剤を使用したアフィニティクロマトグラフィにより単離され得る。単離後、融合タンパク質を、例えばトロンビン又は第Ｘａ因子を使用してタンパク質分解的に切断して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡポリペプチドを生産し得る。
【００５１】
精製タグは、特異的結合対の一成員を形成する異種アミノ酸配列である。精製タグを含有するポリペプチドは、ポリペプチドに対する特異的結合対の他の成員の結合によって検出、単離及び／又は精製され得る。例えば、精製タグは、抗体分子よって結合されるエピトープを形成し得る。
【００５２】
様々な適切な精製タグが当該技術分野で既知であり、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ(Ｒ５〜６)、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ２〜１０）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ４）、ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ１１）、ポリ−Ａｓｐ(Ｄ５〜１６)、ストレプト−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Murray, P.J.他、（１９９５年）、Anal Biochem 229、170-9）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Stammers, D.K.他、（１９９１年、FEBS Lett 283、298-302）、Ｔａｇ．１００（Qiagen；哺乳動物ＭＡＰキナーゼ２に由来する１２個アミノ酸タグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）及びＣｒｕｚタグ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が挙げられる。既知のタグ配列は、Terpe（２００３年）、Appl. Microbiol. Biotechnol.60, 523-533で概説される。
【００５３】
幾つかの好ましい実施形態では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ精製タグが用いられ得る。発現に続いて、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質は、固定化グルタチオンを使用したアフィニティクロマトグラフィにより単離され得る。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の精製は、当該技術分野で既知である。単離後、続いて融合タンパク質をタンパク質分解的に切断して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドを生産し得る。
【００５４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、上述するように早期新生児に投与され得る。ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドを単独で投与することが可能であるが、１つ又は複数の薬学的に許容されるキャリア、補助剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝液、安定剤、防腐剤、潤滑剤又は当業者に既知の他の材料、及び任意に他の治療剤又は予防剤と一緒に、上記で規定されるようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物（例えば、配合物）としてそれを提供することが好ましい。
【００５５】
本明細書中で記載されるように、１つ又は複数の薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、緩衝液、補助剤、安定剤又は他の材料と一緒に混合又は配合されるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物は、上述する方法で使用され得る。
【００５６】
本発明の別の態様は、薬学的組成物を調製する方法であって、
上述するようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを準備することと、
上記ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又は上記ＳＡＡ３ポリペプチドを、薬学的に許容される賦形剤と混合することと
を含む、薬学的組成物を調製する方法を提供する。
【００５７】
「薬学的に許容される」という用語は本明細書中で使用する場合、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当な医学的判断の範囲内で、被験体（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）の組織との接触における使用に適しており、合理的な有益性／危険性の比に相応する化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関する。各キャリア、賦形剤等はまた、配合物の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能で」なくてはならない。
【００５８】
適切なキャリア、賦形剤等は、標準的な医薬品テキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company、ペンシルバニア州、イースト、１９９０年に見出すことができる。
【００５９】
配合物は、単位剤形で利便性良く提供することができ、薬学の分野で既知の任意の方法により調製され得る。かかる方法は、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを、１つ又は複数の補助成分を構成し得るキャリアと結合させる工程を含む。概して、配合物は、活性化合物を、液体キャリア若しくは微細固体キャリア又はその両方と一様かつ緊密に結合させること、続いて必要であれば、生成物を成形することによって調製される。好ましい配合物は、液体若しくは溶液、又は徐放性インプラント若しくはカプセル（例えば、経口投与用）の形態で存在し得る。
【００６０】
ＰＯＮ３ポリペプチド、ＳＡＡ３ポリペプチド、又はＰＯＮ３ポリペプチド及び／若しくはＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物は、任意の利便性の高い投与経路によって被験体へ投与され得る。幾つかの実施形態では、投与は、静脈内経路、皮下経路、髄腔内経路又は気管内経路のような非経口経路によるものである。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、注射、特に静脈内注射により投与され得る。他の実施形態では、投与は、腸内経路による、例えば鼻空腸チューブ又は気道内チューブを介したものである。
【００６１】
非経口投与（例えば、静脈内注射を含む注射による）に適した配合物としては、酸化防止剤、緩衝液、防腐剤、安定化剤、静菌薬及び対象とされるレシピエントの血液と配合物を等張にする溶質を含有し得る水溶性及び非水溶性の等張性の発熱性物質を含まない滅菌注射溶液、並びに沈殿防止剤及び増粘剤を包含し得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。かかる配合物における使用に適した等張性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル溶液又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。通常、溶液中の活性化合物の濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００６２】
腸内投与（例えば、摂取による）に適した配合物は、カプセル、サシェ又は錠剤のような別個のユニットとして提供されてもよく、各々が粉末若しくは顆粒として、水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして、ボーラスとして、舐剤として、又はペーストとして、既定量のＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含有する。錠剤又はカプセルは任意に、胃以外の消化管の一部での放出を与えるように、腸内コーティングが提供されてもよい。
【００６３】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む配合物は、単位用量又は複数回用量の密封容器、例えばアンプル及びバイアル中に提供されてもよく、使用の直前に滅菌液体キャリア（例えば注射用の水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管してもよい。
【００６４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びにＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物の適切な投与量は、状況に応じて患者ごとに様々であり得る。最適な投与量を決定することは一般的に、投与の任意の危険性又は有害な副作用に対して治療上の有益性のレベルのバランスを取ることを包含する。選択される投与量レベルは、投与経路、投与期間、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの排出速度、併用される他の薬物、化合物及び／又は材料、並びに早期乳児の成熟度、性別、体重、条件及び全体的な健康状態を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存する。ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの量、並びに投与経路は最終的には、医師の自由裁量であるが、一般的には投与量は、かなりの害を及ぼす副作用又は有害な副作用を引き起こすことなく、有益な効果をもたらすのに十分であるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの血清濃度を達成するものとする。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、１回の用量で、連続して又は断続的に（例えば、適切な間隔での分割用量で）実施させることができる。投与の最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に既知であり、配合物及び処置される被験体により様々である。単回投与又は複数回投与は、医師により選択される用量レベル及びパターンを用いて実行させてもよい。
【００６６】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは好ましくは、早期新生児の分娩の直後に、又は分娩後間もなくして、投与する。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、分娩後１時間未満で、３時間未満で、６時間未満で、１２時間未満で、２４時間未満で、又は４８時間未満で投与され得る。
【００６７】
他の実施形態では、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／ＳＡＡ３ポリペプチドは、出産後４８時間を超えて投与されてもよい。
【００６８】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、分娩後に予防的に、又は早期新生児が、酸化的ストレス関連合併症のようなＰＯＮ３欠損に関連した１つ若しくは複数の症状を示す場合に投与され得る。
【００６９】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、分娩後に予防的に、又は早期新生児が、ＳＡＡ３欠損に関連した１つ若しくは複数の症状を示す場合に投与され得る。
【００７０】
幾つかの実施形態では、ＳＡＡ３ポリペプチドは、人工呼吸器及び／又は肺損傷若しくは炎症に曝されていない早期新生児に投与され得る。
【００７１】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びにＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む組成物は、上述するように、界面活性剤及びステロイドのような他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
【００７２】
本発明の他の態様は、早期新生児の処置における使用のための上述するようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びに早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの使用を提供する。ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを使用した早期新生児の処置は、上述するように、病的状態及び／又は死亡の程度、重篤性又は危険性を低減し得る。
【００７３】
本発明の様々な更なる態様及び実施形態は、本開示を鑑みて当業者に明らかである。本明細書中で言及される文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００７４】
出願日に上述したデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号を有する配列もまた、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００７５】
「及び／又は」は本明細書中で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成成分それぞれの、他のものを伴うか又は伴わない特定の開示として解釈されるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書中で個々に記述されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢそれぞれの特定の開示として解釈されるものとする。
【００７６】
文脈が他の場合を指示しない限りは、上述した特徴の説明及び規定は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される態様及び実施形態すべてに同様に適用する。
【００７７】
本発明の或る特定の態様及び実施形態はここで、一例として、また以下で記載される図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】妊娠後期において胎児中で上方調節又は下方調節される転写産物を同定するための実験スキームを示す図である。
【図２】妊娠期間１６日及び２０日で分娩されたラットを比較して（ともに、ｎ＝１０、それぞれ、別個の同腹子由来の動物）、初期アレイで使用されるラットの同胞種における肺組織（Ａ）、腸（Ｂ）及び肝臓（Ｃ）における１８Ｓ ＲＮＡに対するＰｏｎ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。Ｐ値は、所定の組織における２つの妊娠期間で対応のないスチューデントｔ検定を使用して、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３転写産物レベル（１８Ｓ ＲＮＡに対して）を比較する。
【図３】妊娠の後半の３分の１における種々の妊娠期間でのヒツジ肺（Ａ）及び腸（Ｂ）（各群中、ｎ＝５）における４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対するＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値；バー＝ＳＥＭ。Ｐ値は、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３転写産物レベル（４つのハウスキーピング遺伝子に対して）対妊娠期間の線形回帰に由来。スピアマンのローは、Ａでは０．９４及びＢでは０．７９（ともに、Ｐ＜０．００１）。パネルＣ及びパネルＤは、ｌｏｇ変換したコルチゾール値に対してプロットしたｌｏｇ変換したＰｏｎ３レベルである。Ｐ値は、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３レベル対ｌｏｇ変換したコルチゾールの線形回帰に由来。スピアマンのローは、Ｃでは０．９４及びＤでは０．８０（ともに、Ｐ＜０．００１）。
【図４】妊娠１３０日目にデキサメタゾン処置したヒツジ及び対照ヒツジ（各群中、ｎ＝５）の肺及び腸におけるＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値、バー＝ＳＥＭ。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルは、４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して示される。
【図５】早期（１１５ｄＧＡ〜１８８ｄＧＡ）副腎摘出術を受けたヒツジ及び対照ヒツジ（両群ともに、妊娠１４５日目に分娩）（各群中、ｎ＝５）の肺及び腸におけるＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値、バー＝ＳＥＭ。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルは、４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して示される。
【図６】種々の市販の抗体を使用して比較し、成人血液（Ａｄ）並びに４人の早期乳児及び４人の満期乳児由来の臍帯血におけるＰＯＮ３のウェスタンブロット解析を示す図である（上部パネル）。また、満期乳児及び早期乳児を比較するシグナル上でのデンシトメトリの結果も示す（下部パネル）。
【図７】妊娠期間１６日目及び２０日目でのラットの肺（Ａ及びＣ）腸（Ｂ及びＤ）のウェスタンブロット解析を示す図である。パネルＡ及びパネルＢは、ＰＯＮ３に特異的な抗体を用いた。パネルＣ及びパネルＤは、それぞれＡ及びＢと同じブロットを用いて、ストリッピングして、ＧＡＰＤＨに特異的な抗体で再プローブした。パネルＡ及びパネルＣ：レーン１及び２は、１６ｄＧＡ由来の肺であり、レーン３及びレーン４は、２０ｄＧＡ由来の肺である。パネルＢ及びパネルＤ：レーン１及びレーン２＝１６ｄＧＡ由来の小腸及び大腸の組み合わせ；レーン３及びレーン４＝２０ｄＧＡ由来の小腸；レーン５及びレーン６＝２０ｄＧＡ由来の大腸。
【図８】図８Ａは、８人の早期乳児及び１０人の満期乳児由来の臍帯血清中のＰＯＮ３のウェスタンブロット解析を示す図である。図８Ｂは、満期乳児及び早期乳児を比較するシグナル上でのデンシトメトリの結果を示す図である。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を使用して満期乳児及び早期乳児を比較するｌｏｇ変換したデンシトメトリ値である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
表１は、ヒツジにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマー及びプローブを示す。
【００８０】
表２は、選択した転写産物に関する妊娠期間（ｄＧＡ）１６日と２０日との間での遺伝子アレイ由来の倍数変化を示す。
【実施例】
【００８１】
実験
方法
動物サンプル
実験手順はすべて、適切な内務省ライセンスの下でＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６に従って、また地域倫理審査プロセス(the local ehical review process)からの承認を受けて実行した。
【００８２】
２０回交配した妊娠中のウィスターラットを、妊娠期間（ｄＧＡ）１６日目（ｎ＝１０）及び２０日目（ｎ＝１０）でＣＯ２過剰摂取により安楽死させ、ここでは０日目を、プラグの日と定義して、満期は２１日である。子は、帝王切開により分娩され、頸椎脱臼により安楽死させて、それらの臓器を解剖顕微鏡下で取り出した。複数の同胞種由来の組織を液体窒素中で瞬間凍結させた(snap flozen)後、続く分析用に−８０℃で保管した。ヒツジでの実験は、過去に詳述されるように行った７。簡潔に述べると、既知の妊娠期間の妊娠中のウェールズ・マウンテン雌ヒツジを、個々の檻中に保持して、乾草、水及び岩塩ブロックへ自由に近づける状態で２００ｇ／ｄの濃縮製剤で維持した。遺伝子発現に対する妊娠期間の影響を研究するため、正常な胎児を、妊娠の１００日目（ｎ＝５）、１１４日目〜１１６日目（ｎ＝５）、１２９日目〜１３１日目（ｎ＝５）及び１４４日目〜１４５日目（ｎ＝５）（ここで、満期は１４５±２日目である）で全身麻酔（２０ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウム（静脈内））下で帝王切開により組織採取のために分娩させた。満期で起きる内因性コルチコステロイドの正常な上昇を防止する影響を研究するために、胎児（ｎ＝５）を１１６ｄＧＡ〜１２０ｄＧＡの日数の間で全身麻酔（１：１のＯ２：Ｎ２Ｏ中の１．５％ハロタン）下で副腎摘出して、続いて満期で分娩させた。この影響は、正常な満期レベルの１５％にまでコルチゾールレベルを低減させることであることが過去に示されている。母体のグルココルチコイド処置の影響を研究するために、雌ヒツジを、１２５ｄＧＡに始まって２４時間間隔で、２回用量の１２ｍｇのデキサメタゾン又は生理食塩水のいずれかで処置して（それぞれｎ＝５）、２回目の注射の１０時間後に帝王切開により、胎児を分娩させた。すべての場合において、新生子ヒツジは、分娩直後に、ペンタバルビトンナトリウム（２００ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させた。分娩後に、臍帯血を入手した。コルチゾール濃度は、ヒツジ血漿を用いた使用に関して確認されたラジオイムノアッセイにより測定した２０。コルチゾールの検出限界量は１．５ｎｇ／ｍｌであり、アッセイ間変動係数は１１％であった。部検中、胎児の肺及び空腸（幽門括約筋と回盲部との間）のサンプルを液体窒素中で凍結させて、分析するまで−８０℃で保管した。
ヒト臍帯血サンプル
ヒト臍帯血を入手するためのプロトコルは、ケンブリッジ地域研究倫理委員会２(Cambridge Local Research Ethics Committee 2)によって承認された。女性はすべて、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。早期乳児は、妊娠期間の２４週〜２８の完了週に出産後に元気であったかどうかを研究するのに適格であった。満期は、３７週以上であると定義された。
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
総ＲＮＡは、製造業者の取扱説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（商標）（Invitrogen、英国、ペーズリー)を使用して、凍結組織から単離して、ＤＮａｓｅＩ（Promega、英国、サウサンプトン）で３７℃にて３０分間処理した。反応は、停止溶液の添加及び６５℃で１０分間の加熱により停止させた。ＲＮＡ完全性は、分光光度系及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザを使用して確認された。ＯＤ ２６０／２８０＞１．８を有するＲＮＡだけを、定量的ＰＣＲに使用し、７よりも大きいＲＮＡ完全性数を有するＲＮＡをアレイハイブリダイゼーションに使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲに関して、総ＲＮＡを、ランダム六量体プライマー（Bioline、英国、ロンドン）及びスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Invitrogen、英国、ペーズリー）を使用してｃＤＮＡへ逆転写させた。
マイクロアレイ解析
Affymetrixのラットゲノム２３０．２Ｇｅｎｅｃｈｉｐを用いた。総ＲＮＡは、標準的なAffymetrixの２サイクル標的標識及びハイブリダイゼーションプロトコルを使用してプロセシングした。データは、ロバストなマルチアレイ平均化を使用して予め正規化し、正規化は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（マイクロアレイデータの線形モデル、http://bioinf/wehi.edu.au/limma/）を使用して達成された。正規化された転写産物の大量データは、２つの独立した方法：Ｃｙｂｅｒ−Ｔアルゴリズム及び順位プロダクト解析(Rank Product Analysis)を使用して１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間で比較した２１，２２。Ｃｙｂｅｒ−Ｔアルゴリズムは、データ組において他の転写産物の分散に基づいてベイズ事前確率（Bayesian prior）の包含により修飾された対応のないｔ検定である。Ｃｙｂｅｒ−Ｔ（ベイズＰ値＜０．００１、差次的発現の事後確率＞０．９９）及び順位プロダクト解析（Ｐ＜０．０００１）の両方を使用して統計学的に有意である転写産物を、差次的に発現されると定義した。マイクロアレイデータは、ＮｅｔＡｆｆｘ（商標）解析センタ（Affymetrix）を使用してアノテートした。
ラットｃＤＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはすべて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴシステム（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）上で行い、鋳型として１００ｎｇのｃＤＮＡ、１×ＡＢＩ ＰＣＲミックス ＮＯ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）並びにパラオキソナーゼ３（Ｐｏｎ３）及びApplied Biosystemsから購入した１８Ｓに関する予め設計されかつ予め最適化された遺伝子発現アッセイ（それぞれ、Ｒｎ０１５００９２６＿ｍｌ及びＲｎ００８２４５４８＿ｍｌ）を含有する１０μｌの容量中で実施した。これらの専用のプライマー−プローブ組の配列は入手可能ではない。ＰＣＲサイクルは、９５℃で２０秒間の初期変性、続く９５℃で１秒及び６０℃で２０秒の４０サイクルを含んでいた。サンプルはすべて、三重反復で解析した。発現レベルは、ｄｄＣｔ法を使用して１８Ｓに対して定量化した。
ヒツジｃＤＮＡクローニング及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ヒツジＰｏｎ３遺伝子の配列はいまだ公開されていないため、本発明者らは、ウシＰｏｎ３ ｍＲＮＡ（ｎｍ＿００１０７５４７９）を使用してＮＣＢＩ発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索した。これにより、ウシ遺伝子に対して９５％を超える同一性を示す幾つかのヒツジＥＳＴを同定した。本発明者らは、推定ヒツジＰｏｎ３ ｃＤＮＡのフラグメントをクローニングするために、最高の相同性を示す２つのＥＳＴ（ＥＥ８５９９２０及びＥＥ７９２１９５）を使用して、ＰＣＲ戦略を設計した。プライマーは下記の通りであった：フォワード（５’−ＣＣＣＴＡＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴ−３’）及びリバース（５’−ＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡ−３’）。使用した鋳型は、胎児ヒツジ腸から生成したｃＤＮＡであった。ＰＣＲは、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、８００ｎＭの各プライマー及び０．１ユニット／μｌのＢｉｏＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Bioline、英国、ロンドン）の最終濃度を含有する５０μｌ中で実施した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分間の初期変性、続く９５℃で４０秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で６０秒間の４０サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長工程で構成されていた。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で解析し、予想サイズを有するバンドを切除して、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Qiagen、英国、クローリー）を使用して精製して、続いてｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（商標）プラスミド（Promega）へクローニングさせた。３つのクローンを配列検証した。
【００８３】
６−ＦＡＭ標識主溝結合剤（ＭＧＢ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイは、ヒツジＰＯＮ３に関するクローニングされた部分的ｃＤＮＡ及びヒツジハウスキーピング遺伝子に関する公的に利用可能な配列データ（NCBI）を使用して、Applied Biosystemsのファイルビルダー３．１を用いて設計した。Ｐｏｎ３の相対的定量化は、本発明者らがヒツジにおいてより大きな動物間変動性を観察した場合に４つのハウスキーピング遺伝子（１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ、シクロフィリンＡ及びβ−アクチン）の幾何平均に対して実施され、この方法は、任意の単一参照遺伝子を使用することよりも優れていると報告されている２３。ＰＣＲは、鋳型としての１００ｎｇのｃＤＮＡ、１×ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス ＮＯ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）及び注文設計されたプライマー−プローブ組を含有する１０μｌ中で実施された。ＰＣＲサイクルは、９５℃で２０秒間の初期変性、続く９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間の４０サイクルを包含した。参照サンプルの段階希釈を使用して、各アッセイに関して相対標準曲線を作成して、相対標準曲線法を使用して結果を解析した。
ウェスタンブロッティング
ラット腸におけるＰｏｎ３タンパク質発現を解析するために、１０ｍｌ当たり１つの完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Roche）を含有する１×ＲＩＰＡ緩衝液（Millipore）中でガラスホモジナイザを使用して、凍結組織を均質化した。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイを使用して決定した。２０μｇのタンパク質を含有するサンプルは、Ｎｕｐａｇｅサンプル還元剤（Invitrogen）を添加することによって還元して、熱変性させて、１０％Ｎｏｖｅｘビス−トリスゲル（Invitrogen）上に負荷した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Invitrogen）へ転写して、ＴＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）中の５％脱脂粉乳で１時間ブロックして、続いて０．２μｇ／ｍｌでのヤギポリクローナル抗ヒトＰｏｎ３抗体（Lifespan Biosciences）を用いて振とう機上で４℃にて一晩プローブした。抗体結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ二次抗体（DAKO）により検出した。続いて、ＥＣＬ基質（Amersham Biosciences）を使用して、結合を可視化させた。膜をＲｅｓｔｏｒｅ（商標）ウェスタンブロッティングストリッピング緩衝液（Pierce）を用いて室温で１５分間ストリッピングして、０．２μｇ／ｍｌでのヒトＧＡＰＤＨに対するウサギポリクローナル抗体（Abcam）で再プローブさせて、タンパク質の等しい負荷を確認した。
【００８４】
ヒト胎児におけるＰｏｎ３発現を解析するために、臍帯血サンプルをリチウム−へパリンチューブ中に回収して、３０００ｒｐｍで４℃にて１０分間の遠心分離により分離させた。血清サンプルをＰＢＳで１０倍に希釈して、Ｎｕｐａｇｅサンプル還元剤（Invitrogen）を添加することによって還元して、熱変性させた。３μｌの１０倍希釈したサンプルを、１０％Ｎｏｖｅｘビス−トリスゲル（Invitrogen）上に負荷した。電気泳動後、上述するように、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Invitrogen）へ転写して、ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）中の５％脱脂粉乳で１時間ブロックして、続いてヒトＰｏｎ３に対する抗体（Lifespan Biosciences、レバノン）でプローブした。等しい負荷を確認するためのウェスタンブロッティングの再プローブは、すべてのレーンに同一容量の血清が負荷された場合には不要であった。したがって、タンパク質の抽出効率又はタンパク質濃度の測定の変動性に関するノイズは存在しない。総タンパク質は、ポンソーＳでブロットを染色することによって評価した。
統計学
転写産物及びコルチゾールのレベルをｌｏｇ変換し、続いて、対応のないスチューデントｔ検定を使用して、平均値を比較した。２つの連続した変数間の関連性は、スピアマン順位相関及び線形回帰の両方を使用して評価した。統計学的有意性はＰ＜０．０５で仮定されて、Ｐ値はすべて、両側であった。
結果の概要
本発明者らは、系統発生的に単に遠縁であるラット及びヒツジにおける肺並びに腸を研究した。両方の哺乳動物における両方の組織中の上方調節は、この遺伝子が、一般的に哺乳動物（ヒトを含む）における出産のための全身的な準備において、例えば酸化的ストレスに対する防御において重要であることを示す。
【００８５】
本発明者らは、広範の妊娠期間について研究し、またヒツジにおけるコルチコステロイドの影響を研究したが、これはコルチコステロイドが出産のための準備段階中である胎児において重要なプロセスの多くを上方調節することに関与するためである。
【００８６】
実験スキームを図１に示す。
【００８７】
アレイ実験により、肺（２４倍）及び腸（３１倍）の両方でのパラオキソナーゼ３をコードするｍＲＮＡの１６日目と２０日目との間での上方調節が実証された。定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを使用したサンプルバリデーションから、別個の一連の動物由来の肺及び腸において（図２Ａ及び図２Ｂ）、また肝臓において（図２Ｃ）、同程度の変化が確認された。
【００８８】
次に、本発明者らは、ヒツジにおいてＰＯＮ３ ｃＤＮＡのフラグメントをクローニングして、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブを設計して、定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを使用して、それぞれが妊娠の後半の３分の１で分娩された５匹の動物を有する４つの群において、ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルを解析した。小腸のサンプルは、幽門括約筋と回盲部との間の中間点から入手した。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡは、妊娠期間が進むにつれ直線的に増大し、両方の組織における変化は、非常に統計学的に有意であった。およそ５倍の上方調節が、肺及び腸の両方で観察された（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００８９】
本発明者らは、外因性合成コルチコステロイド（デキサメタゾン）及び媒体に暴露させた早期ヒツジ胎児におけるＰＯＮ３の発現を研究した。これにより、コルチコステロイドは、肺及び腸の両方でＰＯＮ３ ｍＲＮＡを増大させるが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、差異は、腸においては統計学的に有意でないことが実施された（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【００９０】
続いて、本発明者らは、満期（１４５日）で分娩した動物間でのＰＯＮ３ ｍＲＮＡレベルに対する内因性コルチコステロイドの影響を検査した。対照動物を、内因性コルチコステロイドの妊娠後期での増加が妊娠期間およそ１１５日目〜１１８日目に実施された副腎摘出術により防止された動物と比較した。副腎摘出術は、満期での両方の組織においてより低いＰＯＮ３ ｍＲＮＡと関連するが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、この差異も同様に、統計学的に有意ではなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【００９１】
これらの結果により、ＰＯＮ３ ｍＲＮＡは、ラット及びヒツジの両方において肺並びに腸の両方で出産に先立って上方調節されることが示される。
【００９２】
次に、本発明者らは、４人の早期乳児及び満期に生まれた４人の乳児において出産時に入手した臍帯血を得ることによって、早期ヒト胎児及び満期ヒト胎児に循環しているＰＯＮ３のレベルを比較した。満期乳幼児におけるＰＯＮ３タンパク質レベルは、成人と同程度であるが、ＰＯＮ３発現のレベルは、早期に生まれた乳児の臍帯血中ではより低かった（図６）。
妊娠後期における胎児ラットにおけるＰｏｎ３発現
マイクロアレイ解析により、肺及び腸の両方において１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間でアレイ上で２０倍を超えて上方調節される４つの遺伝子が実証された（表２）：血清アミロイドＡ様タンパク質３、パラオキソネーゼ３（Ｐｏｎ３）、溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）及び塩化物細胞内チャネル５。これに対して、Ｐｏｎ遺伝子ファミリーの他の２つの成員（Ｐｏｎ１及びＰｏｎ２）の発現は、有意に変化しなかった。
【００９３】
本発明者らは、アレイで使用される動物の同胞種においてリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｎ３の発現について解析して、ラットの肺、腸及び肝臓において、１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間でＰｏｎ３ ｍＲＮＡの上方調節を確認した（図２）。１６ｄＧＡ及び２０ｄＧＡのラット肺及び腸のウェスタンブロット解析により、Ｐｏｎ３タンパク質は１６ｄＧＡで検出不可能であるが、２０ｄＧＡでは適切な分子量の明らかなバンドが存在することが実証された（図７）。
胎児ヒツジにおけるＰｏｎ３発現
ヒツジＰＯＮ３遺伝子に関して公開された配列が存在しないため、本発明者らは、オルソロガスなヒツジ遺伝子の部分的ｃＤＮＡをクローニングした。本発明者らは、ヌクレオチドレベルでウシＰｏｎ３と９６％の相同性、及びヒトＰｏｎ３と８７％の相同性を共有する５０５ｂｐの配列を入手した。これに対して、その配列は、ウシＰｏｎ１（６２％）及びＰＯＮ２（７０％）とあまり相同性を示さなかった。定量的ＲＴ−ＰＣＲ戦略は、クローニングした配列を使用して設計された（表２）。次に、本発明者らは、それぞれが妊娠の後半の３分の１で分娩された５匹の動物を有する４つの群において、ＰＯＮ３の発現について解析した。ＰＯＮ３発現は、肺及び腸の両方における進行中の妊娠期間の進行（図３Ａ及び図３Ｂ）、及びコルチゾールレベル（図３Ｃ及び図３Ｄ）とともに直線的に増大し、変化はすべて、非常に統計学的に有意であった。
【００９４】
続いて、本発明者らは、外因性合成グルココルチコイド（デキサメタゾン）又は媒体に暴露した早期ヒツジ胎児を比較した。これにより、デキサメタゾンが肺及び腸の両方においてＰＯＮ３の発現を増大させたが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、差異は、腸では統計学的に有意ではなかったことが実証された（図４Ａ及び図４Ｂ）。次に、本発明者らは、対照満期動物を、１１５ｄＧＡ〜１１８ｄＧＡで胎児副腎摘出術を実施した満期動物と比較することによって、満期（１４５日目）で分娩された動物間でのＰＯＮ３の発現に対する、内因性グルココルチコイドの正常な妊娠後期での上昇を阻止することの影響について検査した。副腎摘出術は、満期では両方の組織でのＰＯＮ３のより低い発現に関連したが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、この差異も、腸では統計学的に有意ではなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。
ヒト臍帯血におけるＰｏｎ３タンパク質
ＰＯＮ３に関して適切なサイズのバンドは、臍帯血清のウェスタンブロットを使用して検出可能であった。ＰＯＮ３の臍帯血清レベルを、８人の早期乳児及び１０人の満期乳児で比較した。早期乳児の平均妊娠期間は２７週３日であり、平均出生体重は、９８６ｇであった。４人は正常分娩であり、４人は、帝王切開により分娩された。乳児の１人には、出産前にベタメタゾンの単回投与を施し、他はすべて、出生前ステロイドのコースを完了している。８人の乳児のうち６人は、５ｍｇ／Ｌ未満の初期ＣＲＰを有し、２人が、初期ＣＲＰが上昇していた（１４ｍｇ／Ｌ及び６８ｍｇ／Ｌ）。いずれも、出産後に実施される第１のサンプル中で血液又はＣＳＦの陽性培養を有さなかった。ＰＯＮ３レベルは、満期では６．３倍高かった（図８）。ＰＯＮ３が総タンパク質に対して発現されて、ポンソーＳ染色により評価される場合、満期レベルは４．９倍高く、ｌｏｇ変換した平均値の比較は、依然として非常に統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。
【００９５】
パラオキソナーゼ−３は、ラットの肺及び腸の両方において、妊娠後期に２０倍を超えて上方調節されるアレイ上の２８５３２個の遺伝子のうちのたった４つの中の１つであった。この上方調節は、同胞種において確認された。また、これまでの研究により、ヒトでは、ＰＯＮ３は主に肝臓で発現されることが実証されており２４、本発明者らもまた、ラットにおいて妊娠後期にこの臓器中でＰｏｎ３の上方調節を観察した。ウェスタンブロットにより、タンパク質レベルでの上方調節が確認された。本発明者らは、系統発生学的に異なる哺乳動物種である胎児ヒツジにおいて、妊娠の後半の３分の１でのＰＯＮ３ ｍＲＮＡの顕著な全身性の上方調節を確認した。さらに、内因性コルチゾールレベルとの強力な相関、デキサメタゾンが母体に付与された場合の早期動物における発現の増加、及び１１５ｄＧＡ〜１１８ｄＧＡで副腎摘出術が実施された胎児間での満期での発現の低減により明らかであるように、胎児ヒツジＰＯＮ３ ｍＲＮＡの発現は、界面活性剤のように１９、グルココルチコイドにより制御された。ＰＯＮ３は、低密度リポタンパク質と関連した血液中で循環する２５。したがって、本発明者らは、このタンパク質が、臍帯血清濃度を測定することによって妊娠後期におけるヒト乳児でも上方調節されるかどうかを研究することが可能であった。本発明者らは、出産前ベタメタゾンの完全なコースに暴露させたにもかかわらず、８人の早期乳児のうち７人が、ＰＯＮ３レベルが、満期で生まれたヒト乳児間で６倍を超えて高いことを見出した。本発明者らは、ＰＯＮ３の上方調節は、ラット、ヒツジ及びヒトの胎児において観察され、かつグルココルチコイドにより制御される、出産のための全身的な準備プロセスであり得ると結論付ける。
【００９６】
パラオキソナーゼファミリーは、１〜３の番号が付された３つのタンパク質で構成される。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ヒト染色体７ｑ２１〜７ｑ２２上のクラスター中に位置し、およそ６５％の相同性を共有する。３つはすべて、加水分解酵素であり、具体的には、一連のラクトン及びヒドロキシ酸を加水分解する。２つの研究により、ＰＯＮ３が酸化防止剤として作用することが実証された。ＰＯＮ３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで銅誘導性酸化に対して低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を保護するが、ＰＯＮ２は保護しないことを見出した２５。最近の研究により、マウスの骨格筋におけるヒトＰｏｎ３のトランスジェニック発現が四塩化炭素（ＣＣｌ４）の肝毒性効果の低減に関連することが実証された２６。ＣＣｌ４の投与は、フリーラジカルの肝臓誘導により肝臓損傷を引き起こす。トランスジェニックヒトＰＯＮ３は、脂質過酸化のレベルを低減させ、ＣＣｌ４により引き起こされる肝臓損傷の生化学的徴候及び組織学的徴候を低減させた。さらに、トランスジェニックヒトＰｏｎ３は、内因性酸化防止剤であるグルタチオン及びスーパーオキシドジスムターゼの正常な肝臓レベルの維持をもたらし、これらはともに、対照動物では欠失されていた。マウスにおけるヒトＰｏｎ３のトランスジェニック発現はまた、アテローム硬化性病変形成及び脂肪症を阻害することも知られている２７。
【００９７】
胎児ラットにおける妊娠後期でのＰＯＮ３の上方調節の全身的な性質により、ＰＯＮ３が種々の臓器において種々の細胞型により必要とされる幾つかの役割を有することが示唆される。さらに、Ｐｏｎ３が、ラット及びヒツジの両方において妊娠後期に全身的に上方調節されるという観察により、上方調節が、出産前後に多様な哺乳動物種に一般的なプロセスに関連することが示唆される。出産後、すべての哺乳動物種において動脈の酸素分圧の急速な上昇がみられる。ヒツジでは、胎児動脈血中の酸素分圧はおよそ１８ｍｍＨｇ〜２８ｍｍＨｇであり、これは、出産後数分以内に、およそ１００ｍｍＨｇへ上昇する２８。出産後の酸素圧の上昇は、動脈管の閉鎖を促進すること１６ａ及び肺血流を増大させること３０のような心血管系の出産後の適応にとって重要な誘因である。しかしながら、酸素圧の急速な増加は、「生理学的環境で上昇する酸素（スーパーオキシドから水に至るまで、ただし、水は除く）のすべての酸化状態及び励起状態」について記載するように定義され得る反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成をもたらし得る３１。出産後の酸素分圧の急激な増加を考慮すると、新生児は、出産後にＲＯＳの生成の増加に暴露される可能性が高い。Ｐｏｎ３の酸化防止効果を考慮すると、妊娠後期での酵素の全身的な上方調節は、出産直後に酸化的ストレスを制限するための一般的な要件に起因して、多様な種間で保存され得る。
【００９８】
早期出産は、病的状態及び死亡の増加に関連する。このことは、乳幼児が、妊娠後期に胎児に起こる新生児期にとって正常な準備の変化に先立って生まれるという事実に関する。界面活性剤療法は、通常妊娠後期に上方調節されたであろう物質を、早期乳児に補うことに基づく首尾よい臨床介入の一例である。したがって、これらの結果により、早期ヒト新生児へのＰＯＮ３の投与は、早期出産という結末を改善させる可能性が高く、上述するように未熟児の合併症に対する保護を提供することが示唆される。
【００９９】
ＰＯＮ３の重要な特性は、血清中に見出されることである。最初に、このことにより、本発明者らは、臍帯血サンプルから得られる血清中のレベルを測定することによって、ヒト乳児における上方調節を確認した。次に、新生児におけるＰＯＮ３の役割が、タンパク質の循環レベルを増大させることによって一部介在される場合、このことは、早期新生児に対する外因性Ｐｏｎ３の静脈内投与が有益であり得ることを示唆する。この解釈は、上述するマウスにおけるトランスジェニックヒトＰＯＮ３の研究により支持される。骨格筋におけるＰｏｎ３のトランスジェニック発現は、血中のＰｏｎ３ラクトナーゼ活性の上昇をもたらし、このことは、肝臓におけるＣＣｌ４誘導性のフリーラジカル生成の影響の低減に関連していた。したがって、これらの観察結果は、循環しているＰｏｎ３の全身効果を支持している。種々のパラオキソナーゼの生化学的研究により、３つの亜型は幾つかの共通基質を有するが、それらはまた、それぞれが特異的な基質を加水分解することも可能であることが実証された３２。
【０１００】
３つの他の遺伝子は、ラットの肺及び腸の両方で妊娠後期に２０倍を超えて上方調節した。これらのうちの２つが、イオンチャネル（溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）及び塩化物細胞内チャネル５）であった。したがって、どちらも潜在的な候補置換療法ではないが、妊娠後期におけるそれらの全身性かつ強い上方調節は、それらが出産前後の適応に重要である可能性が高いという示唆を提供する。
【０１０１】
残りの上方調節された転写産物である血清アミロイドＡ様タンパク質３は、急性期タンパク質である。過去の研究は、胎児ヒツジにおけるこのタンパク質の発現に対する人工呼吸器、エンドトキシン及びグルココルチコイドの影響について取り組んできた３３〜３５。しかしながら、妊娠後期にラット胎児において転写産物レベルでの生理学的上方調節は、本明細書中で初めて示される。したがって、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）もまた、早期新生児における候補となる新規治療薬を示す。
【０１０２】
参考文献
【表１】
【０１０３】
配列
【化１】
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
【化３】
【０１０６】
ヒツジ配列中のシーケンシング誤差又は単一ヌクレオチド多型を示すことができる多義塩基は下記の通りに表す：Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ。＊は、所定のヌクレオチドに関する３種すべての間の相同性を表す。アクセッション番号：ヒト＝ＮＭ＿０００９４０．２；ウシ＝ＮＭ＿００１０７５４７９；及びヒツジ＝ＧＵ３２７７８０。
【０１０７】
表
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
略記：Ｓａａ３＝血清アミロイドＡ様タンパク質３；Ｐｏｎ＝パラオキソナーゼ；ｓｌｃ３４ａ２＝溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）；Ｃｌｉｃ５＝塩化物細胞内チャネル５。１６ｄＧＡ及び２０ｄＧＡではともにｎ＝１０（所定の同腹子由来の単一動物から採取された所定の妊娠期間での所定の組織中のすべてのサンプルを用いる）。＊ Ｃｙｂｅｒ−Ｔ（ベイズＰ値＜０．００１、差次的発現の事後確率＞０．９９）及び順位プロダクト解析（Ｐ＜０．０００１））の両方を用いて、１６ｄＧＡ〜２０ｄＧＡの間の統計的に有意な倍数変化。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号７：合成順序：精製タグ
配列番号８：合成順序：精製タグ
配列番号９：合成順序：精製タグ
配列番号１０：合成順序：精製タグ
配列番号１１：合成順序：精製タグ
配列番号１２：合成順序：精製タグ
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配列番号１４：合成順序：フォワードプライマー
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配列番号１６：合成順序：プローブ
配列番号１７：合成順序：フォワードプライマー
配列番号１８：合成順序：リバースプライマー
配列番号１９：合成順序：プローブ
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配列番号２２：合成順序：プローブ
配列番号２３：合成順序：フォワードプライマー
配列番号２４：合成順序：リバースプライマー
配列番号２５：合成順序：プローブ
配列番号２６：合成順序：フォワードプライマー
配列番号２７：合成順序：リバースプライマー
配列番号２８：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば未熟児に関連した病的状態及び死亡を低減又は防止するための、早期新生児の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
未熟児出産は、先進国では人口の５％〜１０％、また発展途上国では人口のおよそ２５％に影響を及ぼす（非特許文献１）。早期出産は、新生児の死亡の大部分を占め、また新生児集中治療室の作業負荷の大半を占める。このことは、コストの著しい負担を表し、１日の新生児集中治療は、およそ１０００ポンドの費用がかかり、イギリスにおける年間コストは、２００６年〜２００７年で４億２千万ポンドと推定される（非特許文献２）。
【０００３】
新生児集中治療における最も首尾よい介入の１つは、出産直後の早期乳児の肺へ合成界面活性剤を投与することである。このことにより、未熟児に関連した病的状態及び死亡が低減される（概説に関しては非特許文献３を参照）。界面活性剤は、動物研究で同定されており、新生児がその第一呼吸をした際に、肺での表面張力を低減させるのに重要な役割を有することがわかった。肺内での界面活性剤の発現は、妊娠の後半の３分の１で増大し、ヒトを含む多くの種において、これは、胎児中のコルチコステロイドにより誘導される。界面活性剤の使用は、出産準備の生物学の理解が、有用かつ有益な治療上の介入へどのように変換され得るかの一例である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Steer P. BJOG 2005; 112 Suppl 1:1-3.
【非特許文献２】National Audit Office (UK). Caring for Vulnerable Babies: The reorganisation of neonatal service in England. London: The Stationery Office; 2007.
【非特許文献３】Suresh GK, Soll RF. J Perinatol 2005; 25 Suppl 2:S40-S44.
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）及び血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）をコードする転写産物が、正常な哺乳動物の妊娠の最終段階において胎児中で上方調節され、出産時に母体環境からの分娩後に続いて起こる変化に、新生児を適応させるのに重要な役割を果たすという知見に関する。したがって、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）及び／又は血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）は、早期新生児において病的状態若しくは死亡を低減又は防止させる際の治療薬として有用であり得る。
【０００６】
本発明の一態様は、早期新生児を処置する方法であって、上記早期新生児においてパラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることを含む、早期新生児を処置する方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は、早期新生児を処置する方法であって、上記早期新生児において血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることを含む、早期新生児を処置する方法を提供する。
【０００８】
早期新生児は、正常な妊娠期間の終了前に生まれた乳児である。ヒトでは、３７週未満（予定日の最良の臨床上の概算から算出される場合、ここでこの予定日は、４０週０日に等しいと解釈される）の妊娠期間で分娩された乳児が、一般的に早期であるとみなされる。
【０００９】
幾つかの実施形態では、早期新生児は、極めて早期の新生児、例えば、３２週未満の妊娠期間で分娩されるヒト乳児であり得る。
【００１０】
本明細書中で記載されるような処置に適した早期新生児は、哺乳動物早期新生児、好ましくはヒト早期新生児であり得る。
【００１１】
本明細書中に記載されるような処置に適した早期新生児は、ＰＯＮ３を欠損している場合がある。換言すると、早期新生児中のＰＯＮ３のレベル又は活性は、満期新生児中のＰＯＮ３のレベル又は活性未満であり得る。幾つかの実施形態では、早期新生児は、分娩前若しくは分娩後にＰＯＮ３のレベルを測定することによって直接的に、又は酸化的ストレス関連の合併症のようなＰＯＮ３欠損に関連した１つ又は複数の症状を同定することによって間接的に、処置前にＰＯＮ３が欠損していると同定され得る。他の実施形態では、早期新生児は、ＰＯＮ３が欠損していると同定されることなく、記載されるように処置され得る。
【００１２】
本明細書中に記載されるような処置に適した早期新生児は、ＳＡＡ３を欠損している場合がある。換言すると、早期新生児中のＳＡＡ３のレベル又は活性は、満期新生児中のＳＡＡ３のレベル又は活性未満であり得る。幾つかの実施形態では、早期新生児は、分娩前若しくは分娩後にＳＡＡ３のレベルを測定することによって直接的に、又は酸化的ストレス関連の合併症のようなＳＡＡ３欠損に関連した１つ又は複数の症状を同定することによって間接的に、処置前にＳＡＡ３が欠損していると同定され得る。他の実施形態では、早期新生児は、ＳＡＡ３が欠損していると同定されることなく、記載されるように処置され得る。
【００１３】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法は、該新生児から入手されるサンプル中のＰＯＮ３及び／若しくはＳＡＡ３のレベル又は活性を決定することを含むことができ、対照に対するＰＯＮ３及び／若しくはＳＡＡ３のレベル又は活性の低減が、該早期新生児は該病的状態及び／又は死亡の危険性があることを示す。
【００１４】
ＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベルは、標準的な技法、例えば、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイにより、又は酵素活性のアッセイにより、早期新生児から得られるサンプル、例えば血液サンプル又は血清サンプル中で決定され得る。
【００１５】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児は、満期新生児に対して病的状態及び／又は死亡の増大された危険性を有し得る。病的状態及び／又は死亡の危険性があると同定された早期新生児は、本明細書に記載されるように処置され得る。
【００１６】
本明細書中で記載されるように早期新生児においてＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドのレベル又は活性を増大させることによって、病的状態及び／又は死亡の程度、重篤性又は危険性を低減させ得る。例えば、本明細書中に記載されるような処置は、未熟児の医学的合併症、例えば酸化的ストレスに関連した合併症の重篤性若しくは危険性を防止又は低減し得る。
【００１７】
処置され得る未熟児の合併症としては、呼吸器合併症（例えば、呼吸窮迫症候群、肺高血圧症及び気管支肺異形成症）、神経系合併症（未熟児無呼吸発作、低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）、頭蓋内出血、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、発育障害及び脳性まひ）、心血管系合併症（例えば、動脈管開存症（ＰＤＡ））、胃腸及び代謝系合併症（例えば、低血糖症、摂食困難及び壊死性腸炎（ＮＥＣ））、並びに血液系合併症（例えば、未熟児貧血、血小板減少症、及び高ビリルビン血症（黄疸）及び核黄疸）が挙げられる。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるように処置され得る未熟児の合併症は、敗血症若しくは感染症、又は敗血症若しくは感染症に関連した状態を含まない。
【００１９】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドのレベル又は活性は、新生児において全身的に、又は早期新生児の特定の臓器若しくは組織において（例えば早期新生児の肺、血管系及び／又は他の組織において）局所的に増大され得る。
【００２０】
好ましくは、ＰＯＮ３ポリペプチドのレベルは、ＰＯＮ３ポリペプチドを早期新生児に投与することによって増大される。
【００２１】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３、ＧｅｎｅＩＤ：５４４６）は、血清中での高密度リポタンパク質に関連するホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．８．１）である。
【００２２】
ヒトＰＯＮ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿０００９３１．１ ＧＩ：２９７８８９９６を有し、配列番号２で示される。ヒトＰＯＮ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿０００９４０．２ ＧＩ：９４５３８３５５を有し、配列番号１で示される。本発明者らはまた、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＰＯＮ３のスプライス変異体を同定した。ヒトＰＯＮ３スプライス変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。
【００２３】
本明細書に記載されるような使用に適した他のＰＯＮ３ポリペプチドは、ウシ又はブタのような非ヒト哺乳動物由来のＰＯＮ３のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれらの断片、変異体若しくは対立遺伝子であってもよい。ウシＰＯＮ３（ＧｅｎｅＩＤ：５１０９５３）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿００１０６８９４７．１ ＧＩ：１１５４９６１６５を有する。ウシＰＯＮ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿００１０７５４７９．１ ＧＩ：１１５４９６１６４を有するブタＰＯＮ３（ＧｅｎｅＩＤ：７３３６７４）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿００１０３８０６９．１ ＧＩ：１１３２０５８６６を有する。
【００２４】
本明細書に記載されるような使用に適したＰＯＮ３ポリペプチドは、参照ＰＯＮ３配列のアミノ酸配列（例えば配列番号２又は配列番号４）、又は参照ＰＯＮ３配列のフラグメント、対立遺伝子若しくは変異体を含んでもよい。例えば、配列番号２又は配列番号４のような参照ＰＯＮ３配列の対立遺伝子又は変異体は、参照ＰＯＮ３配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２５】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により、例えば配列番号２又は配列番号４のような参照ＰＯＮ３配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２６】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号４のような完全長ＰＯＮ３アミノ酸配列のフラグメント、又は配列番号２若しくは配列番号４の変異体若しくは対立遺伝子であり得る。フラグメントは、パラオキソナーゼ３活性を保持する完全長配列よりも少ないアミノ酸で構成される切断型ポリペプチドである。適切なフラグメントは、完全長配列の少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個又は少なくとも３００個のアミノ酸を含み得る。適切なフラグメントは、ＰＯＮ３活性を保持する。
【００２７】
本明細書に記載されるような使用に適したＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは配列番号３の対立遺伝子若しくは変異体によりコードされ得る。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００２８】
ＰＯＮ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、１個のヌクレオチド、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のヌクレオチドの挿入、付加、置換又は欠失により、配列番号１又は配列番号３と異なり得る。
【００２９】
同様に、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドのレベル又は活性は、早期新生児において全身的に、又は新生児の特定の臓器若しくは組織において（例えば肺、血管系及び／又は他の組織において）局所的に増大され得る。
【００３０】
好ましくは、ＳＡＡ３ポリペプチドのレベルは、ＳＡＡ３ポリペプチドを早期新生児に投与することによって増大される。
【００３１】
ヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＡＡＯ４８４３７．１ ＧＩ：２８８６４６９８を有し、配列番号６で示される。ヒトＳＡＡ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＡＹ２０９１８８．１ ＧＩ：２８８６４６９７を有し、配列番号５で示される。
【００３２】
本明細書に記載されるような使用に適した他のＳＡＡ３ポリペプチドは、ウシ、ラット若しくはマウスのような非ヒト哺乳動物由来のＳＡＡ３のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれらのフラグメント、変異体若しくは対立遺伝子であってもよい。マウスＳＡＡ３（ＧｅｎｅＩＤ：２０２１０）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿０３５４４５．１ ＧＩ：６７５５３９６を有する。マウスＳＡＡ３をコードするヌクレオチド酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿０１１３１５．３ ＧＩ：１１８１３０１９７を有する。ラットＳＡＡ３をコードするヌクレオチド酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＢＦ２８２３１８ ＧＩ：１１２１３４８９を有し、Ｒａｔ２３０＿２アレイ上でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ１３９２６４７＿にハイブリダイズする。ウシＳＡＡ３（ＧｅｎｅＩＤ：２８１４７４）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＰ＿８５１３５９．２ ＧＩ：３８５６６６９６を有する。ウシＳＡＡ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース識別番号ＮＭ＿１８１０１６．３ ＧＩ：３８５６６６９５を有する。
【００３３】
本明細書に記載されるような使用に適したＳＡＡ３ポリペプチドは、参照ＳＡＡ３配列のアミノ酸配列（例えば配列番号６）、又は参照ＳＡＡ３配列のフラグメント、対立遺伝子若しくは変異体を含んでもよい。例えば、配列番号６のような参照ＳＡＡ３配列の対立遺伝子又は変異体は、参照ＳＡＡ３配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３４】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により、例えば配列番号６のような参照ＳＡＡ３配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３５】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号６のような完全長ＳＡＡ３アミノ酸配列のフラグメント、又は配列番号６の変異体又は対立遺伝子であり得る。フラグメントは、血清アミロイドＡ様タンパク質３活性を保持する完全長配列よりも少ないアミノ酸で構成される切断型ポリペプチドである。適切なフラグメントは、完全長配列の少なくとも３０個、少なくとも４０個、又は少なくとも５０個のアミノ酸を含み得る。適切なフラグメントは、血清アミロイドＡ様タンパク質３活性を保持する。
【００３６】
本明細書に記載されるような使用に適したＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５の対立遺伝子若しくは変異体によりコードされ得る。例えば、ＳＡＡ３ポリペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００３７】
ＳＡＡ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、１個のヌクレオチド、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のヌクレオチドの挿入、付加、置換又は欠失により、配列番号５と異なり得る。
【００３８】
ヌクレオチド及びアミノ酸の配列同一性は概して、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ ウィスコンシンパッケージ（商標）、Accelrys、カリフォルニア州、サンディエゴ）を参照して規定される。ＧＡＰは、Needleman及びWunschのアルゴリズム３６を使用して、マッチの数を最大にするとともに、ギャップの数を最低限に抑える２つの完全配列を整列させる。一般的には、ギャップ開始ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４を用いてデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいとされるが、一般的にデフォルトパラメータを用いて他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（これは、Altschul他（１９９０年）、J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（これは、Pearson及びLipman（１９８８年）、PNAS USA85: 2444-2448の方法を使用する）又はスミス・ウォータマンアルゴリズム（Smith及びWaterman（１９８１年）、J. Mol Biol. 147: 195-197）を使用してもよい。
【００３９】
１つ又は複数の異種アミノ酸、例えば異種ペプチド又は異種ポリペプチド配列を、本明細書中に記載されるＰＯＮ３アミノ酸配列又はＳＡＡ３アミノ酸配列に結合又は融合させてもよい。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチドは、１つ又は複数の異種アミノ酸に連結又は融合された上述するようなＰＯＮ３アミノ酸配列を含んでもよい。１つ又は複数の異種アミノ酸は、ＰＯＮ３以外の供給源由来の配列を含んでもよい。同様に、ＳＡＡ３ポリペプチドは、１つ又は複数の異種アミノ酸に連結又は融合された上述するようなＳＡＡ３アミノ酸配列を含んでもよい。１つ又は複数の異種アミノ酸は、ＳＡＡ３以外の供給源由来の配列を含んでもよい。
【００４０】
ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドが、融合タンパク質内に含まれてもよい。
【００４１】
幾つかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書中に記載されるような早期新生児の処置における使用前に、成熟ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドを生産するようにプロセシングすることができる。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドの他に、融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼ認識配列のすべて又は一部を形成するＮ末端若しくはＣ末端での１つ又は複数の異種アミノ酸を含んでもよい。成熟ＰＯＮ３ポリペプチド又は成熟ＳＡＡ３ポリペプチドは、例えば、トロンビン又は第Ｘａ因子のような部位特異的プロテアーゼを使用して、部位特異的プロテアーゼ認識配列の切断により融合タンパク質から生産することができる。
【００４２】
融合タンパク質は、精製後に部位特異的プロテアーゼにより除去される精製タグを含んでもよい。適切な精製タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（日本住吸血虫(Schistosoma Japonica)由来）が挙げられる。
【００４３】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、任意の利便性の高い技法により生産することができ、広範な適切なアプローチが利用可能である。
【００４４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、ブタ又はウシのような非ヒト哺乳動物から単離及び／又は精製することができる。
【００４５】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、全体的に又は部分的に化学合成により生成することができる。例えば、ポリペプチドは、液相又は固相合成方法を使用して、溶液中で、又は固相、液相及び溶液化学の任意の組合せにより、例えばまず、各々のペプチド部分を完成させ、続いて、望ましくかつ適切である場合、存在している任意の保護基の除去後に、各々のカルボン酸若しくはスルホン酸又はそれらの反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入により合成することができる。
【００４６】
ポリペプチドの化学合成は、当該技術分野で既知である（J.M. Stewart及びJ. D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Company、イリノイ州、ロックフォード（１９８４年）；M. Bodanzsky及びA. Bodanzsky、The Practice of Peptide Synthesis、Springer Verlag、ニューヨーク（１９８４年）；J.H. Jones、The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press、オックスフォード（１９９１年）；Applied Biosystems 430A Users Manualにて、ABI Inc.、カリフォルニア州、フォスター市；G.A. Grant（著）、Synthetic Peptides, A User's Guide. W.H. Freeman & Co.、ニューヨーク、１９９２年；E. Atherton及びR.C. Sheppard、Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press、１９８９年、並びにG.B. Field（著）、Solid-Phase Peptide Synthesis(Methods in Enzymology Vol. 289)にて、Academic Press、ニューヨーク及びロンドン（１９９７年）。
【００４７】
ＰＯＮ３ポリペプチド及びＳＡＡ３ポリペプチドを、全体的に又は部分的に組換え技法により生成することができる。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中で発現し、発現されたポリペプチドを細胞培養液から単離及び／又は精製することができる。
【００４８】
組換えＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドの生産に関して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドをコードする核酸配列（すなわち、ＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸）は、発現ベクター内に含まれ得る。適切な調節配列（プロモータ−配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサ配列、マーカー遺伝子及び適切な場合には他の配列を含む）を含有する適切なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞中でＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸の発現を駆動させるのに適した調節配列を含有する。広範な発現系において異種核酸コード配列の発現を駆動させるのに適した調節配列は、当該技術分野で既知であり、構成プロモータ−（例えばＣＭＶ又はＳＶ４０のようなウイルスプロモータ−）、及び誘導プロモータ−（例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ制御プロモータ−）が挙げられる。ベクターはまた、大腸菌(E. Coli)のような細菌宿主において、及び／又は酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞のような真核細胞において、その選択及び複製及び発現を可能にする配列（例えば、複製起点及び選択マーカー）を含み得る。
【００４９】
ＰＯＮ３核酸又はＳＡＡ３核酸を発現させる際の使用に適したベクターとしては、プラスミド及びウイルスベクター、例えば「ファージ」又はファージミドが挙げられ、ベクターの正確な選択は、用いられる特定の発現系に依存する。ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドは、任意の利便性の高い発現系で発現することができ、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞発現系を含む多数の適切な系が当該技術分野で利用可能である。更なる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual：第３版、Russell他、２００１年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。細胞培養液中での組換えポリペプチドの発現、並びにそれらの続く単離及び精製に関する技法及びプロトコルは当該技術分野で既知である（例えば、Protocols in Molecular Biology、第２版、Ausubel他（著）、John Wiley & Sons、１９９２年；Recombinant Gene Expression Protocols、RS Tuan（著）（１９９７年３月）、Humana Press Incを参照）。
【００５０】
上述するように、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドは、ＰＯＮ３ポリペプチド配列又はＳＡＡ３ポリペプチド配列と精製タグとを含む融合タンパク質として発現系中で発現され得る。好ましくは、プロテアーゼ認識部位は、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドと精製タグとの間に位置する。発現に続いて、融合タンパク質は、精製タグに結合する固定化剤を使用したアフィニティクロマトグラフィにより単離され得る。単離後、融合タンパク質を、例えばトロンビン又は第Ｘａ因子を使用してタンパク質分解的に切断して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡポリペプチドを生産し得る。
【００５１】
精製タグは、特異的結合対の一成員を形成する異種アミノ酸配列である。精製タグを含有するポリペプチドは、ポリペプチドに対する特異的結合対の他の成員の結合によって検出、単離及び／又は精製され得る。例えば、精製タグは、抗体分子よって結合されるエピトープを形成し得る。
【００５２】
様々な適切な精製タグが当該技術分野で既知であり、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ(Ｒ５〜６)、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ２〜１０）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ４）、ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ１１）、ポリ−Ａｓｐ(Ｄ５〜１６)、ストレプト−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Murray, P.J.他、（１９９５年）、Anal Biochem 229、170-9）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Stammers, D.K.他、（１９９１年、FEBS Lett 283、298-302）、Ｔａｇ．１００（Qiagen；哺乳動物ＭＡＰキナーゼ２に由来する１２個アミノ酸タグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）及びＣｒｕｚタグ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が挙げられる。既知のタグ配列は、Terpe（２００３年）、Appl. Microbiol. Biotechnol.60, 523-533で概説される。
【００５３】
幾つかの好ましい実施形態では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ精製タグが用いられ得る。発現に続いて、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質は、固定化グルタチオンを使用したアフィニティクロマトグラフィにより単離され得る。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の精製は、当該技術分野で既知である。単離後、続いて融合タンパク質をタンパク質分解的に切断して、ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドを生産し得る。
【００５４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、上述するように早期新生児に投与され得る。ＰＯＮ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチドを単独で投与することが可能であるが、１つ又は複数の薬学的に許容されるキャリア、補助剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝液、安定剤、防腐剤、潤滑剤又は当業者に既知の他の材料、及び任意に他の治療剤又は予防剤と一緒に、上記で規定されるようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物（例えば、配合物）としてそれを提供することが好ましい。
【００５５】
本明細書中で記載されるように、１つ又は複数の薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、緩衝液、補助剤、安定剤又は他の材料と一緒に混合又は配合されるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物は、上述する方法で使用され得る。
【００５６】
本発明の別の態様は、薬学的組成物を調製する方法であって、
上述するようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを準備することと、
上記ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又は上記ＳＡＡ３ポリペプチドを、薬学的に許容される賦形剤と混合することと
を含む、薬学的組成物を調製する方法を提供する。
【００５７】
「薬学的に許容される」という用語は本明細書中で使用する場合、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当な医学的判断の範囲内で、被験体（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）の組織との接触における使用に適しており、合理的な有益性／危険性の比に相応する化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関する。各キャリア、賦形剤等はまた、配合物の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能で」なくてはならない。
【００５８】
適切なキャリア、賦形剤等は、標準的な医薬品テキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company、ペンシルバニア州、イースト、１９９０年に見出すことができる。
【００５９】
配合物は、単位剤形で利便性良く提供することができ、薬学の分野で既知の任意の方法により調製され得る。かかる方法は、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを、１つ又は複数の補助成分を構成し得るキャリアと結合させる工程を含む。概して、配合物は、活性化合物を、液体キャリア若しくは微細固体キャリア又はその両方と一様かつ緊密に結合させること、続いて必要であれば、生成物を成形することによって調製される。好ましい配合物は、液体若しくは溶液、又は徐放性インプラント若しくはカプセル（例えば、経口投与用）の形態で存在し得る。
【００６０】
ＰＯＮ３ポリペプチド、ＳＡＡ３ポリペプチド、又はＰＯＮ３ポリペプチド及び／若しくはＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物は、任意の利便性の高い投与経路によって被験体へ投与され得る。幾つかの実施形態では、投与は、静脈内経路、皮下経路、髄腔内経路又は気管内経路のような非経口経路によるものである。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、注射、特に静脈内注射により投与され得る。他の実施形態では、投与は、腸内経路による、例えば鼻空腸チューブ又は気道内チューブを介したものである。
【００６１】
非経口投与（例えば、静脈内注射を含む注射による）に適した配合物としては、酸化防止剤、緩衝液、防腐剤、安定化剤、静菌薬及び対象とされるレシピエントの血液と配合物を等張にする溶質を含有し得る水溶性及び非水溶性の等張性の発熱性物質を含まない滅菌注射溶液、並びに沈殿防止剤及び増粘剤を包含し得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。かかる配合物における使用に適した等張性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル溶液又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。通常、溶液中の活性化合物の濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００６２】
腸内投与（例えば、摂取による）に適した配合物は、カプセル、サシェ又は錠剤のような別個のユニットとして提供されてもよく、各々が粉末若しくは顆粒として、水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして、ボーラスとして、舐剤として、又はペーストとして、既定量のＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含有する。錠剤又はカプセルは任意に、胃以外の消化管の一部での放出を与えるように、腸内コーティングが提供されてもよい。
【００６３】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む配合物は、単位用量又は複数回用量の密封容器、例えばアンプル及びバイアル中に提供されてもよく、使用の直前に滅菌液体キャリア（例えば注射用の水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管してもよい。
【００６４】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びにＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む薬学的組成物の適切な投与量は、状況に応じて患者ごとに様々であり得る。最適な投与量を決定することは一般的に、投与の任意の危険性又は有害な副作用に対して治療上の有益性のレベルのバランスを取ることを包含する。選択される投与量レベルは、投与経路、投与期間、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの排出速度、併用される他の薬物、化合物及び／又は材料、並びに早期乳児の成熟度、性別、体重、条件及び全体的な健康状態を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存する。ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの量、並びに投与経路は最終的には、医師の自由裁量であるが、一般的には投与量は、かなりの害を及ぼす副作用又は有害な副作用を引き起こすことなく、有益な効果をもたらすのに十分であるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの血清濃度を達成するものとする。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、１回の用量で、連続して又は断続的に（例えば、適切な間隔での分割用量で）実施させることができる。投与の最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に既知であり、配合物及び処置される被験体により様々である。単回投与又は複数回投与は、医師により選択される用量レベル及びパターンを用いて実行させてもよい。
【００６６】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは好ましくは、早期新生児の分娩の直後に、又は分娩後間もなくして、投与する。例えば、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドは、分娩後１時間未満で、３時間未満で、６時間未満で、１２時間未満で、２４時間未満で、又は４８時間未満で投与され得る。
【００６７】
他の実施形態では、ＰＯＮ３ポリペプチド及び／ＳＡＡ３ポリペプチドは、出産後４８時間を超えて投与されてもよい。
【００６８】
ＰＯＮ３ポリペプチドは、分娩後に予防的に、又は早期新生児が、酸化的ストレス関連合併症のようなＰＯＮ３欠損に関連した１つ若しくは複数の症状を示す場合に投与され得る。
【００６９】
ＳＡＡ３ポリペプチドは、分娩後に予防的に、又は早期新生児が、ＳＡＡ３欠損に関連した１つ若しくは複数の症状を示す場合に投与され得る。
【００７０】
幾つかの実施形態では、ＳＡＡ３ポリペプチドは、人工呼吸器及び／又は肺損傷若しくは炎症に曝されていない早期新生児に投与され得る。
【００７１】
ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びにＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを含む組成物は、上述するように、界面活性剤及びステロイドのような他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
【００７２】
本発明の他の態様は、早期新生児の処置における使用のための上述するようなＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチド、並びに早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドの使用を提供する。ＰＯＮ３ポリペプチド及び／又はＳＡＡ３ポリペプチドを使用した早期新生児の処置は、上述するように、病的状態及び／又は死亡の程度、重篤性又は危険性を低減し得る。
【００７３】
本発明の様々な更なる態様及び実施形態は、本開示を鑑みて当業者に明らかである。本明細書中で言及される文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００７４】
出願日に上述したデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号を有する配列もまた、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００７５】
「及び／又は」は本明細書中で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成成分それぞれの、他のものを伴うか又は伴わない特定の開示として解釈されるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書中で個々に記述されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢそれぞれの特定の開示として解釈されるものとする。
【００７６】
文脈が他の場合を指示しない限りは、上述した特徴の説明及び規定は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される態様及び実施形態すべてに同様に適用する。
【００７７】
本発明の或る特定の態様及び実施形態はここで、一例として、また以下で記載される図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】妊娠後期において胎児中で上方調節又は下方調節される転写産物を同定するための実験スキームを示す図である。
【図２】妊娠期間１６日及び２０日で分娩されたラットを比較して（ともに、ｎ＝１０、それぞれ、別個の同腹子由来の動物）、初期アレイで使用されるラットの同胞種における肺組織（Ａ）、腸（Ｂ）及び肝臓（Ｃ）における１８Ｓ ＲＮＡに対するＰｏｎ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。Ｐ値は、所定の組織における２つの妊娠期間で対応のないスチューデントｔ検定を使用して、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３転写産物レベル（１８Ｓ ＲＮＡに対して）を比較する。
【図３】妊娠の後半の３分の１における種々の妊娠期間でのヒツジ肺（Ａ）及び腸（Ｂ）（各群中、ｎ＝５）における４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対するＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値；バー＝ＳＥＭ。Ｐ値は、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３転写産物レベル（４つのハウスキーピング遺伝子に対して）対妊娠期間の線形回帰に由来。スピアマンのローは、Ａでは０．９４及びＢでは０．７９（ともに、Ｐ＜０．００１）。パネルＣ及びパネルＤは、ｌｏｇ変換したコルチゾール値に対してプロットしたｌｏｇ変換したＰｏｎ３レベルである。Ｐ値は、ｌｏｇ変換したＰｏｎ３レベル対ｌｏｇ変換したコルチゾールの線形回帰に由来。スピアマンのローは、Ｃでは０．９４及びＤでは０．８０（ともに、Ｐ＜０．００１）。
【図４】妊娠１３０日目にデキサメタゾン処置したヒツジ及び対照ヒツジ（各群中、ｎ＝５）の肺及び腸におけるＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値、バー＝ＳＥＭ。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルは、４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して示される。
【図５】早期（１１５ｄＧＡ〜１８８ｄＧＡ）副腎摘出術を受けたヒツジ及び対照ヒツジ（両群ともに、妊娠１４５日目に分娩）（各群中、ｎ＝５）の肺及び腸におけるＰＯＮ３ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。カラム＝平均値、バー＝ＳＥＭ。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルは、４つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して示される。
【図６】種々の市販の抗体を使用して比較し、成人血液（Ａｄ）並びに４人の早期乳児及び４人の満期乳児由来の臍帯血におけるＰＯＮ３のウェスタンブロット解析を示す図である（上部パネル）。また、満期乳児及び早期乳児を比較するシグナル上でのデンシトメトリの結果も示す（下部パネル）。
【図７】妊娠期間１６日目及び２０日目でのラットの肺（Ａ及びＣ）腸（Ｂ及びＤ）のウェスタンブロット解析を示す図である。パネルＡ及びパネルＢは、ＰＯＮ３に特異的な抗体を用いた。パネルＣ及びパネルＤは、それぞれＡ及びＢと同じブロットを用いて、ストリッピングして、ＧＡＰＤＨに特異的な抗体で再プローブした。パネルＡ及びパネルＣ：レーン１及び２は、１６ｄＧＡ由来の肺であり、レーン３及びレーン４は、２０ｄＧＡ由来の肺である。パネルＢ及びパネルＤ：レーン１及びレーン２＝１６ｄＧＡ由来の小腸及び大腸の組み合わせ；レーン３及びレーン４＝２０ｄＧＡ由来の小腸；レーン５及びレーン６＝２０ｄＧＡ由来の大腸。
【図８】図８Ａは、８人の早期乳児及び１０人の満期乳児由来の臍帯血清中のＰＯＮ３のウェスタンブロット解析を示す図である。図８Ｂは、満期乳児及び早期乳児を比較するシグナル上でのデンシトメトリの結果を示す図である。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を使用して満期乳児及び早期乳児を比較するｌｏｇ変換したデンシトメトリ値である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
表１は、ヒツジにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマー及びプローブを示す。
【００８０】
表２は、選択した転写産物に関する妊娠期間（ｄＧＡ）１６日と２０日との間での遺伝子アレイ由来の倍数変化を示す。
【実施例】
【００８１】
実験
方法
動物サンプル
実験手順はすべて、適切な内務省ライセンスの下でＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６に従って、また地域倫理審査プロセス(the local ehical review process)からの承認を受けて実行した。
【００８２】
２０回交配した妊娠中のウィスターラットを、妊娠期間（ｄＧＡ）１６日目（ｎ＝１０）及び２０日目（ｎ＝１０）でＣＯ２過剰摂取により安楽死させ、ここでは０日目を、プラグの日と定義して、満期は２１日である。子は、帝王切開により分娩され、頸椎脱臼により安楽死させて、それらの臓器を解剖顕微鏡下で取り出した。複数の同胞種由来の組織を液体窒素中で瞬間凍結させた(snap flozen)後、続く分析用に−８０℃で保管した。ヒツジでの実験は、過去に詳述されるように行った７。簡潔に述べると、既知の妊娠期間の妊娠中のウェールズ・マウンテン雌ヒツジを、個々の檻中に保持して、乾草、水及び岩塩ブロックへ自由に近づける状態で２００ｇ／ｄの濃縮製剤で維持した。遺伝子発現に対する妊娠期間の影響を研究するため、正常な胎児を、妊娠の１００日目（ｎ＝５）、１１４日目〜１１６日目（ｎ＝５）、１２９日目〜１３１日目（ｎ＝５）及び１４４日目〜１４５日目（ｎ＝５）（ここで、満期は１４５±２日目である）で全身麻酔（２０ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウム（静脈内））下で帝王切開により組織採取のために分娩させた。満期で起きる内因性コルチコステロイドの正常な上昇を防止する影響を研究するために、胎児（ｎ＝５）を１１６ｄＧＡ〜１２０ｄＧＡの日数の間で全身麻酔（１：１のＯ２：Ｎ２Ｏ中の１．５％ハロタン）下で副腎摘出して、続いて満期で分娩させた。この影響は、正常な満期レベルの１５％にまでコルチゾールレベルを低減させることであることが過去に示されている。母体のグルココルチコイド処置の影響を研究するために、雌ヒツジを、１２５ｄＧＡに始まって２４時間間隔で、２回用量の１２ｍｇのデキサメタゾン又は生理食塩水のいずれかで処置して（それぞれｎ＝５）、２回目の注射の１０時間後に帝王切開により、胎児を分娩させた。すべての場合において、新生子ヒツジは、分娩直後に、ペンタバルビトンナトリウム（２００ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させた。分娩後に、臍帯血を入手した。コルチゾール濃度は、ヒツジ血漿を用いた使用に関して確認されたラジオイムノアッセイにより測定した２０。コルチゾールの検出限界量は１．５ｎｇ／ｍｌであり、アッセイ間変動係数は１１％であった。部検中、胎児の肺及び空腸（幽門括約筋と回盲部との間）のサンプルを液体窒素中で凍結させて、分析するまで−８０℃で保管した。
ヒト臍帯血サンプル
ヒト臍帯血を入手するためのプロトコルは、ケンブリッジ地域研究倫理委員会２(Cambridge Local Research Ethics Committee 2)によって承認された。女性はすべて、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。早期乳児は、妊娠期間の２４週〜２８の完了週に出産後に元気であったかどうかを研究するのに適格であった。満期は、３７週以上であると定義された。
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
総ＲＮＡは、製造業者の取扱説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（商標）（Invitrogen、英国、ペーズリー)を使用して、凍結組織から単離して、ＤＮａｓｅＩ（Promega、英国、サウサンプトン）で３７℃にて３０分間処理した。反応は、停止溶液の添加及び６５℃で１０分間の加熱により停止させた。ＲＮＡ完全性は、分光光度系及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザを使用して確認された。ＯＤ ２６０／２８０＞１．８を有するＲＮＡだけを、定量的ＰＣＲに使用し、７よりも大きいＲＮＡ完全性数を有するＲＮＡをアレイハイブリダイゼーションに使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲに関して、総ＲＮＡを、ランダム六量体プライマー（Bioline、英国、ロンドン）及びスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Invitrogen、英国、ペーズリー）を使用してｃＤＮＡへ逆転写させた。
マイクロアレイ解析
Affymetrixのラットゲノム２３０．２Ｇｅｎｅｃｈｉｐを用いた。総ＲＮＡは、標準的なAffymetrixの２サイクル標的標識及びハイブリダイゼーションプロトコルを使用してプロセシングした。データは、ロバストなマルチアレイ平均化を使用して予め正規化し、正規化は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（マイクロアレイデータの線形モデル、http://bioinf/wehi.edu.au/limma/）を使用して達成された。正規化された転写産物の大量データは、２つの独立した方法：Ｃｙｂｅｒ−Ｔアルゴリズム及び順位プロダクト解析(Rank Product Analysis)を使用して１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間で比較した２１，２２。Ｃｙｂｅｒ−Ｔアルゴリズムは、データ組において他の転写産物の分散に基づいてベイズ事前確率（Bayesian prior）の包含により修飾された対応のないｔ検定である。Ｃｙｂｅｒ−Ｔ（ベイズＰ値＜０．００１、差次的発現の事後確率＞０．９９）及び順位プロダクト解析（Ｐ＜０．０００１）の両方を使用して統計学的に有意である転写産物を、差次的に発現されると定義した。マイクロアレイデータは、ＮｅｔＡｆｆｘ（商標）解析センタ（Affymetrix）を使用してアノテートした。
ラットｃＤＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはすべて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴシステム（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）上で行い、鋳型として１００ｎｇのｃＤＮＡ、１×ＡＢＩ ＰＣＲミックス ＮＯ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）並びにパラオキソナーゼ３（Ｐｏｎ３）及びApplied Biosystemsから購入した１８Ｓに関する予め設計されかつ予め最適化された遺伝子発現アッセイ（それぞれ、Ｒｎ０１５００９２６＿ｍｌ及びＲｎ００８２４５４８＿ｍｌ）を含有する１０μｌの容量中で実施した。これらの専用のプライマー−プローブ組の配列は入手可能ではない。ＰＣＲサイクルは、９５℃で２０秒間の初期変性、続く９５℃で１秒及び６０℃で２０秒の４０サイクルを含んでいた。サンプルはすべて、三重反復で解析した。発現レベルは、ｄｄＣｔ法を使用して１８Ｓに対して定量化した。
ヒツジｃＤＮＡクローニング及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ヒツジＰｏｎ３遺伝子の配列はいまだ公開されていないため、本発明者らは、ウシＰｏｎ３ ｍＲＮＡ（ｎｍ＿００１０７５４７９）を使用してＮＣＢＩ発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索した。これにより、ウシ遺伝子に対して９５％を超える同一性を示す幾つかのヒツジＥＳＴを同定した。本発明者らは、推定ヒツジＰｏｎ３ ｃＤＮＡのフラグメントをクローニングするために、最高の相同性を示す２つのＥＳＴ（ＥＥ８５９９２０及びＥＥ７９２１９５）を使用して、ＰＣＲ戦略を設計した。プライマーは下記の通りであった：フォワード（５’−ＣＣＣＴＡＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴ−３’）及びリバース（５’−ＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡ−３’）。使用した鋳型は、胎児ヒツジ腸から生成したｃＤＮＡであった。ＰＣＲは、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、８００ｎＭの各プライマー及び０．１ユニット／μｌのＢｉｏＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Bioline、英国、ロンドン）の最終濃度を含有する５０μｌ中で実施した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分間の初期変性、続く９５℃で４０秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で６０秒間の４０サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長工程で構成されていた。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で解析し、予想サイズを有するバンドを切除して、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Qiagen、英国、クローリー）を使用して精製して、続いてｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（商標）プラスミド（Promega）へクローニングさせた。３つのクローンを配列検証した。
【００８３】
６−ＦＡＭ標識主溝結合剤（ＭＧＢ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイは、ヒツジＰＯＮ３に関するクローニングされた部分的ｃＤＮＡ及びヒツジハウスキーピング遺伝子に関する公的に利用可能な配列データ（NCBI）を使用して、Applied Biosystemsのファイルビルダー３．１を用いて設計した。Ｐｏｎ３の相対的定量化は、本発明者らがヒツジにおいてより大きな動物間変動性を観察した場合に４つのハウスキーピング遺伝子（１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ、シクロフィリンＡ及びβ−アクチン）の幾何平均に対して実施され、この方法は、任意の単一参照遺伝子を使用することよりも優れていると報告されている２３。ＰＣＲは、鋳型としての１００ｎｇのｃＤＮＡ、１×ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス ＮＯ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Applied Biosystems、英国、ウォリントン）及び注文設計されたプライマー−プローブ組を含有する１０μｌ中で実施された。ＰＣＲサイクルは、９５℃で２０秒間の初期変性、続く９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間の４０サイクルを包含した。参照サンプルの段階希釈を使用して、各アッセイに関して相対標準曲線を作成して、相対標準曲線法を使用して結果を解析した。
ウェスタンブロッティング
ラット腸におけるＰｏｎ３タンパク質発現を解析するために、１０ｍｌ当たり１つの完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Roche）を含有する１×ＲＩＰＡ緩衝液（Millipore）中でガラスホモジナイザを使用して、凍結組織を均質化した。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイを使用して決定した。２０μｇのタンパク質を含有するサンプルは、Ｎｕｐａｇｅサンプル還元剤（Invitrogen）を添加することによって還元して、熱変性させて、１０％Ｎｏｖｅｘビス−トリスゲル（Invitrogen）上に負荷した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Invitrogen）へ転写して、ＴＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）中の５％脱脂粉乳で１時間ブロックして、続いて０．２μｇ／ｍｌでのヤギポリクローナル抗ヒトＰｏｎ３抗体（Lifespan Biosciences）を用いて振とう機上で４℃にて一晩プローブした。抗体結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ二次抗体（DAKO）により検出した。続いて、ＥＣＬ基質（Amersham Biosciences）を使用して、結合を可視化させた。膜をＲｅｓｔｏｒｅ（商標）ウェスタンブロッティングストリッピング緩衝液（Pierce）を用いて室温で１５分間ストリッピングして、０．２μｇ／ｍｌでのヒトＧＡＰＤＨに対するウサギポリクローナル抗体（Abcam）で再プローブさせて、タンパク質の等しい負荷を確認した。
【００８４】
ヒト胎児におけるＰｏｎ３発現を解析するために、臍帯血サンプルをリチウム−へパリンチューブ中に回収して、３０００ｒｐｍで４℃にて１０分間の遠心分離により分離させた。血清サンプルをＰＢＳで１０倍に希釈して、Ｎｕｐａｇｅサンプル還元剤（Invitrogen）を添加することによって還元して、熱変性させた。３μｌの１０倍希釈したサンプルを、１０％Ｎｏｖｅｘビス−トリスゲル（Invitrogen）上に負荷した。電気泳動後、上述するように、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Invitrogen）へ転写して、ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）中の５％脱脂粉乳で１時間ブロックして、続いてヒトＰｏｎ３に対する抗体（Lifespan Biosciences、レバノン）でプローブした。等しい負荷を確認するためのウェスタンブロッティングの再プローブは、すべてのレーンに同一容量の血清が負荷された場合には不要であった。したがって、タンパク質の抽出効率又はタンパク質濃度の測定の変動性に関するノイズは存在しない。総タンパク質は、ポンソーＳでブロットを染色することによって評価した。
統計学
転写産物及びコルチゾールのレベルをｌｏｇ変換し、続いて、対応のないスチューデントｔ検定を使用して、平均値を比較した。２つの連続した変数間の関連性は、スピアマン順位相関及び線形回帰の両方を使用して評価した。統計学的有意性はＰ＜０．０５で仮定されて、Ｐ値はすべて、両側であった。
結果の概要
本発明者らは、系統発生的に単に遠縁であるラット及びヒツジにおける肺並びに腸を研究した。両方の哺乳動物における両方の組織中の上方調節は、この遺伝子が、一般的に哺乳動物（ヒトを含む）における出産のための全身的な準備において、例えば酸化的ストレスに対する防御において重要であることを示す。
【００８５】
本発明者らは、広範の妊娠期間について研究し、またヒツジにおけるコルチコステロイドの影響を研究したが、これはコルチコステロイドが出産のための準備段階中である胎児において重要なプロセスの多くを上方調節することに関与するためである。
【００８６】
実験スキームを図１に示す。
【００８７】
アレイ実験により、肺（２４倍）及び腸（３１倍）の両方でのパラオキソナーゼ３をコードするｍＲＮＡの１６日目と２０日目との間での上方調節が実証された。定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを使用したサンプルバリデーションから、別個の一連の動物由来の肺及び腸において（図２Ａ及び図２Ｂ）、また肝臓において（図２Ｃ）、同程度の変化が確認された。
【００８８】
次に、本発明者らは、ヒツジにおいてＰＯＮ３ ｃＤＮＡのフラグメントをクローニングして、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブを設計して、定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを使用して、それぞれが妊娠の後半の３分の１で分娩された５匹の動物を有する４つの群において、ＰＯＮ３ ｍＲＮＡのレベルを解析した。小腸のサンプルは、幽門括約筋と回盲部との間の中間点から入手した。ＰＯＮ３ ｍＲＮＡは、妊娠期間が進むにつれ直線的に増大し、両方の組織における変化は、非常に統計学的に有意であった。およそ５倍の上方調節が、肺及び腸の両方で観察された（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００８９】
本発明者らは、外因性合成コルチコステロイド（デキサメタゾン）及び媒体に暴露させた早期ヒツジ胎児におけるＰＯＮ３の発現を研究した。これにより、コルチコステロイドは、肺及び腸の両方でＰＯＮ３ ｍＲＮＡを増大させるが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、差異は、腸においては統計学的に有意でないことが実施された（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【００９０】
続いて、本発明者らは、満期（１４５日）で分娩した動物間でのＰＯＮ３ ｍＲＮＡレベルに対する内因性コルチコステロイドの影響を検査した。対照動物を、内因性コルチコステロイドの妊娠後期での増加が妊娠期間およそ１１５日目〜１１８日目に実施された副腎摘出術により防止された動物と比較した。副腎摘出術は、満期での両方の組織においてより低いＰＯＮ３ ｍＲＮＡと関連するが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、この差異も同様に、統計学的に有意ではなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【００９１】
これらの結果により、ＰＯＮ３ ｍＲＮＡは、ラット及びヒツジの両方において肺並びに腸の両方で出産に先立って上方調節されることが示される。
【００９２】
次に、本発明者らは、４人の早期乳児及び満期に生まれた４人の乳児において出産時に入手した臍帯血を得ることによって、早期ヒト胎児及び満期ヒト胎児に循環しているＰＯＮ３のレベルを比較した。満期乳幼児におけるＰＯＮ３タンパク質レベルは、成人と同程度であるが、ＰＯＮ３発現のレベルは、早期に生まれた乳児の臍帯血中ではより低かった（図６）。
妊娠後期における胎児ラットにおけるＰｏｎ３発現
マイクロアレイ解析により、肺及び腸の両方において１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間でアレイ上で２０倍を超えて上方調節される４つの遺伝子が実証された（表２）：血清アミロイドＡ様タンパク質３、パラオキソネーゼ３（Ｐｏｎ３）、溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）及び塩化物細胞内チャネル５。これに対して、Ｐｏｎ遺伝子ファミリーの他の２つの成員（Ｐｏｎ１及びＰｏｎ２）の発現は、有意に変化しなかった。
【００９３】
本発明者らは、アレイで使用される動物の同胞種においてリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｎ３の発現について解析して、ラットの肺、腸及び肝臓において、１６ｄＧＡと２０ｄＧＡとの間でＰｏｎ３ ｍＲＮＡの上方調節を確認した（図２）。１６ｄＧＡ及び２０ｄＧＡのラット肺及び腸のウェスタンブロット解析により、Ｐｏｎ３タンパク質は１６ｄＧＡで検出不可能であるが、２０ｄＧＡでは適切な分子量の明らかなバンドが存在することが実証された（図７）。
胎児ヒツジにおけるＰｏｎ３発現
ヒツジＰＯＮ３遺伝子に関して公開された配列が存在しないため、本発明者らは、オルソロガスなヒツジ遺伝子の部分的ｃＤＮＡをクローニングした。本発明者らは、ヌクレオチドレベルでウシＰｏｎ３と９６％の相同性、及びヒトＰｏｎ３と８７％の相同性を共有する５０５ｂｐの配列を入手した。これに対して、その配列は、ウシＰｏｎ１（６２％）及びＰＯＮ２（７０％）とあまり相同性を示さなかった。定量的ＲＴ−ＰＣＲ戦略は、クローニングした配列を使用して設計された（表２）。次に、本発明者らは、それぞれが妊娠の後半の３分の１で分娩された５匹の動物を有する４つの群において、ＰＯＮ３の発現について解析した。ＰＯＮ３発現は、肺及び腸の両方における進行中の妊娠期間の進行（図３Ａ及び図３Ｂ）、及びコルチゾールレベル（図３Ｃ及び図３Ｄ）とともに直線的に増大し、変化はすべて、非常に統計学的に有意であった。
【００９４】
続いて、本発明者らは、外因性合成グルココルチコイド（デキサメタゾン）又は媒体に暴露した早期ヒツジ胎児を比較した。これにより、デキサメタゾンが肺及び腸の両方においてＰＯＮ３の発現を増大させたが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、差異は、腸では統計学的に有意ではなかったことが実証された（図４Ａ及び図４Ｂ）。次に、本発明者らは、対照満期動物を、１１５ｄＧＡ〜１１８ｄＧＡで胎児副腎摘出術を実施した満期動物と比較することによって、満期（１４５日目）で分娩された動物間でのＰＯＮ３の発現に対する、内因性グルココルチコイドの正常な妊娠後期での上昇を阻止することの影響について検査した。副腎摘出術は、満期では両方の組織でのＰＯＮ３のより低い発現に関連したが、サンプル間のより大きな変動性に起因して、この差異も、腸では統計学的に有意ではなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。
ヒト臍帯血におけるＰｏｎ３タンパク質
ＰＯＮ３に関して適切なサイズのバンドは、臍帯血清のウェスタンブロットを使用して検出可能であった。ＰＯＮ３の臍帯血清レベルを、８人の早期乳児及び１０人の満期乳児で比較した。早期乳児の平均妊娠期間は２７週３日であり、平均出生体重は、９８６ｇであった。４人は正常分娩であり、４人は、帝王切開により分娩された。乳児の１人には、出産前にベタメタゾンの単回投与を施し、他はすべて、出生前ステロイドのコースを完了している。８人の乳児のうち６人は、５ｍｇ／Ｌ未満の初期ＣＲＰを有し、２人が、初期ＣＲＰが上昇していた（１４ｍｇ／Ｌ及び６８ｍｇ／Ｌ）。いずれも、出産後に実施される第１のサンプル中で血液又はＣＳＦの陽性培養を有さなかった。ＰＯＮ３レベルは、満期では６．３倍高かった（図８）。ＰＯＮ３が総タンパク質に対して発現されて、ポンソーＳ染色により評価される場合、満期レベルは４．９倍高く、ｌｏｇ変換した平均値の比較は、依然として非常に統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。
【００９５】
パラオキソナーゼ−３は、ラットの肺及び腸の両方において、妊娠後期に２０倍を超えて上方調節されるアレイ上の２８５３２個の遺伝子のうちのたった４つの中の１つであった。この上方調節は、同胞種において確認された。また、これまでの研究により、ヒトでは、ＰＯＮ３は主に肝臓で発現されることが実証されており２４、本発明者らもまた、ラットにおいて妊娠後期にこの臓器中でＰｏｎ３の上方調節を観察した。ウェスタンブロットにより、タンパク質レベルでの上方調節が確認された。本発明者らは、系統発生学的に異なる哺乳動物種である胎児ヒツジにおいて、妊娠の後半の３分の１でのＰＯＮ３ ｍＲＮＡの顕著な全身性の上方調節を確認した。さらに、内因性コルチゾールレベルとの強力な相関、デキサメタゾンが母体に付与された場合の早期動物における発現の増加、及び１１５ｄＧＡ〜１１８ｄＧＡで副腎摘出術が実施された胎児間での満期での発現の低減により明らかであるように、胎児ヒツジＰＯＮ３ ｍＲＮＡの発現は、界面活性剤のように１９、グルココルチコイドにより制御された。ＰＯＮ３は、低密度リポタンパク質と関連した血液中で循環する２５。したがって、本発明者らは、このタンパク質が、臍帯血清濃度を測定することによって妊娠後期におけるヒト乳児でも上方調節されるかどうかを研究することが可能であった。本発明者らは、出産前ベタメタゾンの完全なコースに暴露させたにもかかわらず、８人の早期乳児のうち７人が、ＰＯＮ３レベルが、満期で生まれたヒト乳児間で６倍を超えて高いことを見出した。本発明者らは、ＰＯＮ３の上方調節は、ラット、ヒツジ及びヒトの胎児において観察され、かつグルココルチコイドにより制御される、出産のための全身的な準備プロセスであり得ると結論付ける。
【００９６】
パラオキソナーゼファミリーは、１〜３の番号が付された３つのタンパク質で構成される。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ヒト染色体７ｑ２１〜７ｑ２２上のクラスター中に位置し、およそ６５％の相同性を共有する。３つはすべて、加水分解酵素であり、具体的には、一連のラクトン及びヒドロキシ酸を加水分解する。２つの研究により、ＰＯＮ３が酸化防止剤として作用することが実証された。ＰＯＮ３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで銅誘導性酸化に対して低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を保護するが、ＰＯＮ２は保護しないことを見出した２５。最近の研究により、マウスの骨格筋におけるヒトＰｏｎ３のトランスジェニック発現が四塩化炭素（ＣＣｌ４）の肝毒性効果の低減に関連することが実証された２６。ＣＣｌ４の投与は、フリーラジカルの肝臓誘導により肝臓損傷を引き起こす。トランスジェニックヒトＰＯＮ３は、脂質過酸化のレベルを低減させ、ＣＣｌ４により引き起こされる肝臓損傷の生化学的徴候及び組織学的徴候を低減させた。さらに、トランスジェニックヒトＰｏｎ３は、内因性酸化防止剤であるグルタチオン及びスーパーオキシドジスムターゼの正常な肝臓レベルの維持をもたらし、これらはともに、対照動物では欠失されていた。マウスにおけるヒトＰｏｎ３のトランスジェニック発現はまた、アテローム硬化性病変形成及び脂肪症を阻害することも知られている２７。
【００９７】
胎児ラットにおける妊娠後期でのＰＯＮ３の上方調節の全身的な性質により、ＰＯＮ３が種々の臓器において種々の細胞型により必要とされる幾つかの役割を有することが示唆される。さらに、Ｐｏｎ３が、ラット及びヒツジの両方において妊娠後期に全身的に上方調節されるという観察により、上方調節が、出産前後に多様な哺乳動物種に一般的なプロセスに関連することが示唆される。出産後、すべての哺乳動物種において動脈の酸素分圧の急速な上昇がみられる。ヒツジでは、胎児動脈血中の酸素分圧はおよそ１８ｍｍＨｇ〜２８ｍｍＨｇであり、これは、出産後数分以内に、およそ１００ｍｍＨｇへ上昇する２８。出産後の酸素圧の上昇は、動脈管の閉鎖を促進すること１６ａ及び肺血流を増大させること３０のような心血管系の出産後の適応にとって重要な誘因である。しかしながら、酸素圧の急速な増加は、「生理学的環境で上昇する酸素（スーパーオキシドから水に至るまで、ただし、水は除く）のすべての酸化状態及び励起状態」について記載するように定義され得る反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成をもたらし得る３１。出産後の酸素分圧の急激な増加を考慮すると、新生児は、出産後にＲＯＳの生成の増加に暴露される可能性が高い。Ｐｏｎ３の酸化防止効果を考慮すると、妊娠後期での酵素の全身的な上方調節は、出産直後に酸化的ストレスを制限するための一般的な要件に起因して、多様な種間で保存され得る。
【００９８】
早期出産は、病的状態及び死亡の増加に関連する。このことは、乳幼児が、妊娠後期に胎児に起こる新生児期にとって正常な準備の変化に先立って生まれるという事実に関する。界面活性剤療法は、通常妊娠後期に上方調節されたであろう物質を、早期乳児に補うことに基づく首尾よい臨床介入の一例である。したがって、これらの結果により、早期ヒト新生児へのＰＯＮ３の投与は、早期出産という結末を改善させる可能性が高く、上述するように未熟児の合併症に対する保護を提供することが示唆される。
【００９９】
ＰＯＮ３の重要な特性は、血清中に見出されることである。最初に、このことにより、本発明者らは、臍帯血サンプルから得られる血清中のレベルを測定することによって、ヒト乳児における上方調節を確認した。次に、新生児におけるＰＯＮ３の役割が、タンパク質の循環レベルを増大させることによって一部介在される場合、このことは、早期新生児に対する外因性Ｐｏｎ３の静脈内投与が有益であり得ることを示唆する。この解釈は、上述するマウスにおけるトランスジェニックヒトＰＯＮ３の研究により支持される。骨格筋におけるＰｏｎ３のトランスジェニック発現は、血中のＰｏｎ３ラクトナーゼ活性の上昇をもたらし、このことは、肝臓におけるＣＣｌ４誘導性のフリーラジカル生成の影響の低減に関連していた。したがって、これらの観察結果は、循環しているＰｏｎ３の全身効果を支持している。種々のパラオキソナーゼの生化学的研究により、３つの亜型は幾つかの共通基質を有するが、それらはまた、それぞれが特異的な基質を加水分解することも可能であることが実証された３２。
【０１００】
３つの他の遺伝子は、ラットの肺及び腸の両方で妊娠後期に２０倍を超えて上方調節した。これらのうちの２つが、イオンチャネル（溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）及び塩化物細胞内チャネル５）であった。したがって、どちらも潜在的な候補置換療法ではないが、妊娠後期におけるそれらの全身性かつ強い上方調節は、それらが出産前後の適応に重要である可能性が高いという示唆を提供する。
【０１０１】
残りの上方調節された転写産物である血清アミロイドＡ様タンパク質３は、急性期タンパク質である。過去の研究は、胎児ヒツジにおけるこのタンパク質の発現に対する人工呼吸器、エンドトキシン及びグルココルチコイドの影響について取り組んできた３３〜３５。しかしながら、妊娠後期にラット胎児において転写産物レベルでの生理学的上方調節は、本明細書中で初めて示される。したがって、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）もまた、早期新生児における候補となる新規治療薬を示す。
【０１０２】
参考文献
【表１】
【０１０３】
配列
【化１】
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
【化３】
【０１０６】
ヒツジ配列中のシーケンシング誤差又は単一ヌクレオチド多型を示すことができる多義塩基は下記の通りに表す：Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ。＊は、所定のヌクレオチドに関する３種すべての間の相同性を表す。アクセッション番号：ヒト＝ＮＭ＿０００９４０．２；ウシ＝ＮＭ＿００１０７５４７９；及びヒツジ＝ＧＵ３２７７８０。
【０１０７】
表
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
略記：Ｓａａ３＝血清アミロイドＡ様タンパク質３；Ｐｏｎ＝パラオキソナーゼ；ｓｌｃ３４ａ２＝溶質キャリアファミリー３４（メンバー２）；Ｃｌｉｃ５＝塩化物細胞内チャネル５。１６ｄＧＡ及び２０ｄＧＡではともにｎ＝１０（所定の同腹子由来の単一動物から採取された所定の妊娠期間での所定の組織中のすべてのサンプルを用いる）。＊ Ｃｙｂｅｒ−Ｔ（ベイズＰ値＜０．００１、差次的発現の事後確率＞０．９９）及び順位プロダクト解析（Ｐ＜０．０００１））の両方を用いて、１６ｄＧＡ〜２０ｄＧＡの間の統計的に有意な倍数変化。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号７：合成順序：精製タグ
配列番号８：合成順序：精製タグ
配列番号９：合成順序：精製タグ
配列番号１０：合成順序：精製タグ
配列番号１１：合成順序：精製タグ
配列番号１２：合成順序：精製タグ
配列番号１３：合成順序：精製タグ
配列番号１４：合成順序：フォワードプライマー
配列番号１５：合成順序：リバースプライマー
配列番号１６：合成順序：プローブ
配列番号１７：合成順序：フォワードプライマー
配列番号１８：合成順序：リバースプライマー
配列番号１９：合成順序：プローブ
配列番号２０：合成順序：フォワードプライマー
配列番号２１：合成順序：リバースプライマー
配列番号２２：合成順序：プローブ
配列番号２３：合成順序：フォワードプライマー
配列番号２４：合成順序：リバースプライマー
配列番号２５：合成順序：プローブ
配列番号２６：合成順序：フォワードプライマー
配列番号２７：合成順序：リバースプライマー
配列番号２８：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
早期新生児を処置する方法であって、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドを該早期新生児に投与することを含む、早期新生児を処置する方法。
【請求項２】
前記処置が、前記新生児において死亡の危険性、及び／又は病的状態の程度、重篤性若しくは危険性を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを薬学的組成物中に配合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを非経口投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを静脈投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを腸内投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
早期新生児の処置における使用のためのＰＯＮ３ポリペプチド。
【請求項９】
早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＰＯＮ３ポリペプチドの使用。
【請求項１０】
早期新生児を処置する方法であって、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドを該早期新生児に投与することを含む、早期新生児を処置する方法。
【請求項１１】
前記処置が、前記新生児において死亡の危険性、及び／又は病的状態の程度、重篤性若しくは危険性を低減させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドが、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを薬学的組成物中に配合する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを非経口投与する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを静脈内投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを腸内投与する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドを前記早期新生児に投与することを更に含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
早期新生児の処置における使用のためのＳＡＡ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチド及びＰＯＮ３ポリペプチドの組合せ。
【請求項１９】
早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＳＡＡ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチド及びＰＯＮ３ポリペプチドの組合せの使用。
【請求項２０】
前記投与前に、ＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３を欠損していると前記早期新生児を同定することを含む、請求項１〜７又は請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法であって、該新生児から入手されるサンプル中のＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベル若しくは活性を決定することを含み、対照に対するＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベル若しくは活性の低減が、該早期新生児は病的状態及び／又は死亡の危険性があることを示す、病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法。
【請求項１】
早期新生児を処置する方法であって、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドを該早期新生児に投与することを含む、早期新生児を処置する方法。
【請求項２】
前記処置が、前記新生児において死亡の危険性、及び／又は病的状態の程度、重篤性若しくは危険性を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを薬学的組成物中に配合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを非経口投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを静脈投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＯＮ３ポリペプチドを腸内投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
早期新生児の処置における使用のためのＰＯＮ３ポリペプチド。
【請求項９】
早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＰＯＮ３ポリペプチドの使用。
【請求項１０】
早期新生児を処置する方法であって、血清アミロイドＡ様タンパク質３（ＳＡＡ３）ポリペプチドを該早期新生児に投与することを含む、早期新生児を処置する方法。
【請求項１１】
前記処置が、前記新生児において死亡の危険性、及び／又は病的状態の程度、重篤性若しくは危険性を低減させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドが、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを薬学的組成物中に配合する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを非経口投与する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを静脈内投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＡＡ３ポリペプチドを腸内投与する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）ポリペプチドを前記早期新生児に投与することを更に含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
早期新生児の処置における使用のためのＳＡＡ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチド及びＰＯＮ３ポリペプチドの組合せ。
【請求項１９】
早期新生児の処置における使用のための薬剤の製造におけるＳＡＡ３ポリペプチド又はＳＡＡ３ポリペプチド及びＰＯＮ３ポリペプチドの組合せの使用。
【請求項２０】
前記投与前に、ＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３を欠損していると前記早期新生児を同定することを含む、請求項１〜７又は請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法であって、該新生児から入手されるサンプル中のＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベル若しくは活性を決定することを含み、対照に対するＰＯＮ３及び／又はＳＡＡ３のレベル若しくは活性の低減が、該早期新生児は病的状態及び／又は死亡の危険性があることを示す、病的状態及び／又は死亡の危険性がある早期新生児を同定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５０８３４５（Ｐ２０１３−５０８３４５Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４７６５（Ｐ２０１２−５３４７６５）
【出願日】平成２２年１０月２２日（２０１０．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１９６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８３８７
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５００３４１５５１）ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２２日（２０１０．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１９６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８３８７
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５００３４１５５１）ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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