木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法、マツノザイセンチュウのＬＡＭＰプライマーセット、および木片からのマツノザイセンチュウの検出方法
【課題】マツ属などの木本由来の木片からマツノザイセンチュウを分離することなくマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出し、検出する方法を提供する。
【解決手段】採取されたマツノザイセンチュウが含まれる木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法、マツノザイセンチュウのＤＮＡの特定領域にアニーリングするプライマーからなるＬＡＭＰプライマーセット、および当該プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅を行い検出する木片からのマツノザイセンチュウの検出方法。
【解決手段】採取されたマツノザイセンチュウが含まれる木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法、マツノザイセンチュウのＤＮＡの特定領域にアニーリングするプライマーからなるＬＡＭＰプライマーセット、および当該プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅を行い検出する木片からのマツノザイセンチュウの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マツノザイセンチュウが含まれる木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法、マツノザイセンチュウのＤＮＡの特定領域にアニーリングするプライマーからなるＬＡＭＰプライマーセット、木片からのマツノザイセンチュウの検出方法、およびマツノザイセンチュウの遺伝子増幅を用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）は日本の森林に最も甚大な被害をもたらしているマツ材線虫病の病原体である。マツノザイセンチュウは北米からの侵入種で、日本のマツはマツノザイセンチュウに対して抵抗性を持っていなかったことから劇的な被害となり、現在では北海道と青森県を除く全ての都府県に蔓延している。
【０００３】
マツ材線虫病の診断には、枯死したマツの木片からマツノザイセンチュウを検出する必要がある。一般的に、従来は木片からマツノザイセンチュウを分離して形態観察することにより検出が行われており、当該マツノザイセンチュウの分離にはベールマン法が用いられている。ベールマン法（例えば非特許文献１参照）は、材片をティッシュペーパーで包み、それを水の張ったロートに浸す方法である。材内にセンチュウがいる場合は、当該センチュウが漏斗の底に沈殿する。その後沈殿したセンチュウの形態を顕微鏡で確認し、マツノザイセンチュウかどうかを判定していた。
【０００４】
しかし、ベールマン法は、木片からのセンチュウの分離に多大な時間を要するほか、センチュウの形態に関する専門的な知識や顕微鏡などの高額な機器が不可欠であった。したがって、これまでマツノザイセンチュウの検出はセンチュウを識別できる人材および機器がそろっている専門機関でのみ行われていた。言い換えれば、マツノザイセンチュウの検出を容易に行うことができる方法は従来存在しなかった。
【非特許文献１】真宮靖治・二井一禎・小坂肇・神崎菜摘（2004）材線虫.（線虫学実験法. 日本線虫学会編、日本線虫学会、 茨城）. 134-153.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品や医療分野などにおいては、ＤＮＡの増幅を用いた病原体の検出の方法が提案されている。しかしながら、後述するように、マツノザイセンチュウは木本中に存在しているため、他の分野で行われている従来の方法を適用しても実用できるものではないという特殊な事情がある。
【０００６】
本発明はこのような事情を鑑みてなされたものであり、マツノザイセンチュウが含まれる木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを容易に抽出する方法、マツノザイセンチュウのＬＡＭＰプライマーセット、および遺伝子の増幅を用いてマツノザイセンチュウを容易に検出することができるマツノザイセンチュウの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法であって、マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明はＬＡＭＰプライマーセットであって、マツノザイセンチュウのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）内の特定領域にアニーリング可能な配列表１から４に示されたそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰのプライマーからなることを特徴とする。ここで、本発明のＬＡＭＰプライマーセットは配列表５に示された塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｆのプライマーを含むようにしてもよい。これらのプライマーセットは、マツノザイセンチュウが含まれる木片にケラチンを分解する酵素を作用させて抽出されたマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅に用いることができる。
【０００９】
さらに、本発明はマツノザイセンチュウの検出方法であって、マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出する段階と、抽出したマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階とを備えることを特徴とする。ここで、マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階は、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出するようにすることができる。
【００１０】
さらにまた、本発明はマツノザイセンチュウの検出方法であって、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を、請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出する段階を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、マツノザイセンチュウが木片中に存在する状態で木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出するので、マツノザイセンチュウを当該木片から分離することなくマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することができる。これにより、マツノザイセンチュウのＤＮＡを用いた検出を実用可能とすることができる。
【００１２】
また、本発明によれば、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域をＬＡＭＰ法にて増幅し、検出することができる。このため、より高精度で容易、且つ安価にマツノザイセンチュウの遺伝子の増幅および検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態のマツノザイセンチュウの検出方法においては、例えばマツ属の木本に由来する木片を、ケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、当該木片中に存在するマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することにより、マツノザイセンチュウを木片から分離することなくＤＮＡを抽出する。次に、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡ内の特定領域に特異的にアニーリング可能なプライマーを含むＬＡＭＰ法用プライマーセットを用いて、遺伝子増幅方法の一つであるＬＡＭＰ法を適用してマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出することにより、採取した木片からマツノザイセンチュウの検出を行う。
【００１４】
上述のように、従来はベールマン法にてマツノザイセンチュウを木片から分離した後、顕微鏡を用いた形態観察によりマツノザイセンチュウを同定していた。これに対し、本発明者はまず、マツノザイセンチュウの検出をＤＮＡの検出を用いて行うことを発案した。
【００１５】
しかしながら、従来のＤＮＡ抽出方法をマツノザイセンチュウが存在する木片に適用させた場合、木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを効率よく抽出することが困難であり抽出に非常に多くの時間を要する。一方、マツノザイセンチュウの存在する木片を粉砕してＤＮＡを抽出、精製することも考えられるが、木片を粉砕するための粉砕機などの専門機器が必要となるため、このような専門機器を備えない場合にあっては当該方法の適用は困難である。言い換えれば、当該専門機器を備えない場合には、結果的にマツノザイセンチュウを木片から分離してＤＮＡを抽出することとなり、ベールマン法の場合と同程度の手間と時間を要することになる。さらに、当該方法が適用できた場合にあっても、抽出液中にはリグニンなどの木片由来の成分が多量に含まれている。そのため、ＤＮＡ増幅による検出に用いるためには、抽出されたＤＮＡの精製を十分に行う必要もある。
【００１６】
そこで本発明者は、マツノザイセンチュウの体表の主要成分の一つがケラチンであることに着目した。そして鋭意研究の結果、マツノザイセンチュウを含む木片にケラチンを分解する酵素を作用させ、マツノザイセンチュウの体表を溶解してその中のＤＮＡを抽出することを見出し、本発明を成すに至った。すなわち、本発明によれば、採取した木片を粉砕等の処理を省略または簡素化しても、マツノザイセンチュウのＤＮＡを短時間で抽出することができる。また、ＤＮＡ抽出バッファー中に滲出する木片由来の成分も少ないため、ＤＮＡ精製過程を省略または簡素化することができる。
【００１７】
また、新しい遺伝子増幅法の一つとして、栄研化学社（栃木）によって開発されたＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）が公知となっている。ＬＡＭＰ法は特異性、増幅効率が高いこと、および反応系に蛍光色素を添加することで目視による増幅の判定が可能であることから、短時間で遺伝子の増幅および検出を行うことができる。さらに、ＬＡＭＰ法は等温核酸増幅法であることから、特別な温度制御機器が不要であり、また、ＬＡＭＰ法に用いられる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法のように耐熱性を備える必要がない。そのため、ＰＣＲ法などと比較してより安価に反応を行うことができる。したがって、マツノザイセンチュウの遺伝子による検出を行うにあたりＬＡＭＰ法を用いることができれば、より容易且つ安価にマツノザイセンチュウの遺伝子の増幅および検出を行うことができる。本発明者は鋭意研究の結果、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域に特異的にアニーリング可能な、配列表１から４に示すＬＡＭＰ法用プライマー（ＬＡＭＰプライマー）セットを見出し、ＬＡＭＰ法を用いたマツノザイセンチュウの遺伝子による検出を可能とするに至った。さらに、配列表５に示したＬｏｏｐ−Ｆプライマーを用いることにより、より短時間で増幅および検出を行うことが可能である。
【００１８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳しく説明する。
【００１９】
まず、マツノザイセンチュウが存在するマツの木片（マツ材片）からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することにより得られる、マツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液の調製について詳述する。本実施形態においては、採取したマツ材片をケラチンを分解する酵素（以下、ケラチン分解酵素という）を含む溶液（緩衝液、ＤＮＡ抽出バッファー）中に入れ、インキュベートしてマツ材片中に存在するマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ抽出液とする。緩衝液は、ケラチン分解酵素が活性を有する限り、ＤＮＡ抽出に用いることができる緩衝液を使用することができるが、例えばＮaＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡを含む緩衝液を例示することができ、この場合、ＮａＣｌ：100-150ｍＭ、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ：10-50ｍＭ、ＥＤＴＡ：0.1-1ｍＭとすることができる。
【００２０】
ここで、本実施形態に係るケラチン分解酵素は特に限定されるものではないが、例えばプロテイナーゼＫ（E.C. 3.4.21.64）を用いることができる。ケラチン分解酵素はマツ材片中のマツノザイセンチュウの体表の主要成分の一つであるケラチンを分解することにより、細胞を溶解して核内のＤＮＡをＤＮＡ抽出バッファー中に溶出させる。このため、マツノザイセンチュウを木片中から分離することなく、マツ材片から直接的にマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することができる。ケラチン分解酵素のＤＮＡ抽出バッファー中における含有量は特に限定されないが、例えば、抽出バッファー中に7.5Ｕ/μｌ程度含まれるようにすることができる。なお、ＤＮＡ抽出液の調製にあたっては、ケラチン分解酵素を含むＤＮＡ抽出キットをＤＮＡ抽出バッファーに添加することにより利用することができる。当該ＤＮＡ抽出キットは、例えばＩＳＯＨＡＩＲ（（株）ニッポンジーン）とすることができる。
【００２１】
上述のマツノザイセンチュウのＤＮＡの抽出に供される木片の大きさ、採取方法は本発明を限定するものではなく、任意に設定可能である。また、木片を採取する木本の種類についても特に限定されないが、例えばマツ属の木本であるクロマツ、アカマツ、リュウキュウマツ、チョウセンゴヨウ、ヒメコマツ、ヨーロッパアカマツ、ヨーロッパクロマツ、フランスカイガンショウ、ムゴマツ、ラジアータマツ、ポンデローサマツ、モンチコラマツ、タイワンクロマツ、マンシュウクロマツ、ヒマラヤゴヨウ、スラッシュマツ、リギダマツ、コントルタマツ、ストローブマツ、テーダマツ、ダイオウマツ、バンクスマツ、プンゲンスマツ、ハクショウ、タイワンアカマツ、などを例示することができる。なお、上述のＤＮＡ抽出液に、公知のＤＮＡ精製処理を行って後述するＬＡＭＰ法による増幅に供するようにしてもよい。また、ケラチン分解酵素を用いたＤＮＡ抽出法は、木片中に存在するマツノザイセンチュウだけに限定されるものではなく、マツノザイセンチュウそのものに酵素を作用させＤＮＡを抽出することももちろん可能である。
【００２２】
次に、本発明のＬＡＭＰプライマーの設計について詳述する。本実施形態においては、マツノザイセンチュウの塩基ｒＤＮＡのＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer）領域の塩基配列を決定し、当該塩基配列に基づいてプライマー設計支援ソフトを用い、マツノザイセンチュウに特異的なＬＡＭＰ法用プライマーの設計を行った。具体的にはまず、マツノザイセンチュウとニセマツノザイセンチュウ（マツノザイセンチュウに最も近縁な種）のｒＤＮＡのＩＴＳ領域をＰＣＲ法により増幅させ、その領域の塩基配列をＡＢＩ３１００ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って決定した。両種の塩基配列情報を、栄研化学（株）がＷＥＢ上で提供しているＬＡＭＰプライマー設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４）で解析し、マツノザイセンチュウのＤＮＡだけが増幅されるようにＬＡＭＰプライマーを設計した。
【００２３】
ここで、本実施形態に係るＬＡＭＰプライマーの設計にあたっては、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域内の標的遺伝子に対して、３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、また標的遺伝子の５'末端側に向かってＢ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰの４種のプライマーを設計する。なお、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域をそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１と、また、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域をそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃとする。
【００２４】
具体的には、配列表１に示されるＦ３プライマーは、Ｆ３ｃ領域と相補的な配列であるＦ３領域を持つように設計される。
【００２５】
また、配列表２に示されるＢ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列であるＢ３領域を持つように設計される。
【００２６】
さらに、配列表３に示されるＦＩＰプライマーは、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域に規定したＦ２ｃ領域と相補的な配列であるＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される。
【００２７】
さらにまた、配列表４に示されるＢＩＰプライマーは、Ｂ２ｃ領域と相補的な配列であるＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される。
【００２８】
加えて、本実施形態は配列表５に示されるＬｏｏｐ−Ｆプライマーを含む。これにより、増幅操作のときにＤＮＡ合成の起点を増やして増幅反応を加速させることができるため、より短時間でマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅および検出を行うことが可能である。配列表５に示されるＬｏｏｐ‐Ｆプライマーは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の領域と相補的な配列を持つように設計される。
【００２９】
続いて、抽出したＤＮＡについて上述のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法による増幅操作について説明する。
【００３０】
ＬＡＭＰ法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。まず、反応試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用バッファー（reaction mix）、プライマーセット、蒸留水）を混合し、増幅反応液を調製する。なお、後述する蛍光・目視検出試薬を合わせて混合してもよい。
【００３１】
プライマーセットを除く反応試薬は、例えば栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ（登録商標、以下同じ） ＤＮＡ増幅試薬キットとすることができる。ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キットは以下の含有成分により構成されている;2倍濃度反応用バッファー（２×Reaction mix）：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2% Tween20、1.6M Betaine、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP； Bst DNA Polymerase 8units/μl。また、後述する蛍光・目視検出試薬についても、例えば栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬とすることができる。
【００３２】
次いで、当該増幅反応液に上述したマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液を加え、例えば、６３℃にてインキュベートする。
【００３３】
ここで、ＬＡＭＰ法の反応は次のような工程により行われる。（１）鋳型ＤＮＡに配列表３のＦＩＰプライマーがアニーリングする。（２）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰプライマーのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。（３）ＦＩＰプライマーの外側に配列表１のＦ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、先に合成されているＦＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。（４）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが２本鎖となる。（５）一方、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされたＦＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖は１本鎖ＤＮＡとなる。当該ＤＮＡ鎖は５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１を持ち、自己アニールを起こしてループを形成する。（６）上述の（５）においてループが形成されたＤＮＡ鎖に対して配列表４のＢＩＰプライマーがアニールする。当該ＢＩＰプライマーの３’末端を起点として相補的なＤＮＡの合成が行われ、（５）で形成されたループは剥がされて伸びる。さらにＢＩＰプライマーの外側に配列表２のＢ３プライマーがアニールする。Ｂ３プライマーの３’末端を起点として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、先に合成されているＢＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。（７）上述の（６）の過程により２本鎖ＤＮＡが形成される。（８）一方、（６）の過程で剥がされたＢＩＰプライマーから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールしてループを形成してダンベル様の構造となる。（９）上述の（８）で形成されたダンベル様構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰプライマーおよびそれに続くＢＩＰプライマーのアニーニングを介したＤＮＡ増幅サイクルが進行する。
【００３４】
増幅操作のためのインキュベート時間は、例えば６０分とすることができる。ＬＡＭＰ法におけるアニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により、当該インキュベートの間にＤＮＡを１０９〜１０１０倍に増幅させることが可能である。
【００３５】
本実施形態においては、続いて、増幅操作が行われた反応液についてマツノザイセンチュウのＤＮＡが含まれるか否かの確認を行う。すなわち、検出に供したマツ材片中にマツノザイセンチュウが存在している場合、増幅操作によりマツノザイセンチュウのＤＮＡが増幅され、検出される。一方、検出に供したマツ材片中にマツノザイセンチュウが含まれていなければ、増幅操作によってもマツノザイセンチュウのＤＮＡは増幅されず、したがって検出されない。
【００３６】
反応液中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば蛍光目視検出で確認することができる。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、目視にて反応液の色を確認する。具体的には反応液が蛍光を発していれば陽性、すなわちマツノザイセンチュウのＤＮＡが増幅されており、蛍光を発していなければ陰性、すなわちマツノザイセンチュウのＤＮＡは増幅されていないと判断することができる。当該反応液の蛍光は、紫外線照射装置により、より明確に陽性と陰性の違いを判断することができる。
【００３７】
以上のとおり本実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の実施形態とすることが可能である。例えば、ＬＡＭＰ法におけるＤＮＡ増幅の検出方法は蛍光目視検出に限定されるものではなく、任意に変更可能である。具体的には、増幅の副産物として生じるピロリン酸マグネシウムの影響により増幅反応液は白濁するが、このときの増幅反応液の濁度を測定することによってマツノザイセンチュウのＤＮＡ増幅を検出するようにしてもよい。さらに、遺伝子の増幅についても公知となっている種々の核酸増幅方法、例えばＰＣＲ (Polymerase Chain Reaction)法を用いて行うこともできる。
【００３８】
加えて、本発明のＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法によりＤＮＡを増幅し、検出する方法は、木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡが直接的に抽出された場合に限定されず、マツノザイセンチュウをベールマン法などにより木片から分離してＤＮＡを抽出した場合にも適用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。しかしながら、本実施例は本発明を何ら限定するものではない。
（実施例１）
【００４０】
本実施例に用いたマツ材片は森林総合研究所本所構内の１０本の枯死したクロマツから採集した。そのうち５本はマツノザイセンチュウが感染しているクロマツ（人為的にマツノザイセンチュウを接種し枯死させたクロマツ）であり、残りの５本はマツノザイセンチュウが感染していないクロマツ（健全な状態で伐倒後、マツノザイセンチュウの感染を防ぐため網室に隔離したクロマツ）である。
【００４１】
採取したマツ材片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出し、マツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液を調製した。具体的には、まず、１．５ｍｌマイクロチューブにＤＮＡ抽出 ｂｕｆｆｅｒ（100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH.8.0), 1mM EDTA）を1ml入れた。次に、マイクロチューブ中の当該ＤＮＡ抽出バッファーにケラチン分解酵素であるプロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＨＡＩＲ、（株）ニッポンジーン）のLysis buffer 40μlとEnzyme solution 50μlを添加し、よく攪拌した。続いて、採取したマツ材片約０．０６ｇをマイクロチューブ内の溶液中に入れ、５５℃で２０分間、次いで９４℃で１０分間インキュベートした。
【００４２】
次に、本発明に係るプライマーセットと上述のＤＮＡ抽出液を用いて、ＬＡＭＰ法による増幅、および検出操作を行った。具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに本発明のプライマーセット、Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学（株））の各試薬、およびＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学（株））を下記の分量で分注し、反応液を作成した。プライマーセットは、マツノザイセンチュウとニセマツノザイセンチュウのｒＤＮＡのＩＴＳ領域をＰＣＲ法により増幅させ、その領域の塩基配列をＡＢＩ３１００ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って決定した後、両種の塩基配列情報を、栄研化学（株）がＷＥＢ上で提供しているＬＡＭＰプライマー設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４）で解析し、マツノザイセンチュウのＤＮＡだけが増幅されるようにＬＡＭＰプライマーを設計することにより得た。
2×Reaction Mix : 12.5μl
Primer FIP （配列表１） : 1.0μl (40 pmol/μｌ)
Primer BIP （配列表２） : 1.0μl (40 pmol/μｌ)
Primer F3 （配列表３） : 1.0μl (5 pmol/μｌ)
Primer B3 (配列表４) : 1.0μl (5 pmol/μｌ)
Primer Loop-F （配列表５） : 1.0μl (20 pmol/μｌ)
Bst DNA Polymerase : 1.0μl
蛍光・目視検出試薬 : 1.0μl
蒸留水 : 3.5μl
計 : 23.0μl
【００４３】
続いて、当該増幅反応液に上述のＤＮＡ抽出液２μｌを加え、よく攪拌して６３℃の条件下に１時間放置した。
【００４４】
１時間後、増幅反応液が緑色の蛍光を発しているか否かについて目視にて確認した。その結果を表１に示す。緑色の蛍光を発し、陽性と判断される場合は○と、蛍光を発せず、陰性を判断される場合は×と示した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
また、それぞれ各例と同じ木から採取したマツ材片について、ベールマン法を用いた検出を行った。その結果、上記表１に示したのと同じ検出結果が得られた。これにより、本発明に係る本実施例の検出方法の有効性が示された。
（実施例２および実施例３）
【００４７】
続いて、本発明の実施例２および３として、ＬＡＭＰ法、およびＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を用いたマツノザイセンチュウの検出の有効性について検討した。
【００４８】
まず、森林総合研究所構内に発生したマツ枯死木1本から材片を採集した。採集した材片のうち8ｇについてベールマン法を適用し、マツノザイセンチュウを分離した。続いて、採集した材片の線虫密度（1ｇ当たりのマツノザイセンチュウ数）を算出した。
【００４９】
また、残りの材片から約0.06ｇのＤＮＡ抽出用サンプルを8つ調製し、ＤＮＡ抽出に用いた。具体的には、まず、１．５ｍｌマイクロチューブにＤＮＡ抽出 ｂｕｆｆｅｒ（100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH.8.0), 1mM EDTA）を1ml入れた。次に、マイクロチューブ中の当該ＤＮＡ抽出バッファーにケラチン分解酵素であるプロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＨＡＩＲ、（株）ニッポンジーン）のLysis buffer 40μlとEnzyme solution 50μlを添加し、よく攪拌した。続いて、ＤＮＡ抽出用サンプルそれぞれ約０．０６ｇをマイクロチューブ内の溶液中に入れ、５５℃で２０分間、次いで９４℃で１０分間インキュベートした。
【００５０】
この8つのＤＮＡ抽出液を用いてＬＡＭＰ法およびＰＣＲ法でマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅し、検出を行った。なお、ＬＡＭＰ法を用いた検出の方法および条件については上述した実施例１と同一であるため、説明を省略する。
【００５１】
実施例３のPCR法を用いた検出は次のような方法で行った。まず、0.2mlマイクロチューブにGoTaq green Master Mix（プロメガ（株））およびマツノザイセンチュウのrＤＮＡのITS領域をPCR法により増幅させるためのプライマーセットを下記の分量で分注し、反応液を作成した。なお、該プライマーセットを構成するプライマーの配列を配列表６および７に示す。
GoTaq green Master Mix ：10.0μｌ
Bx18S1)(配列表6) ：2.5μｌ（2pmol/μｌ）
Bx28S1)(配列表7） ：2.5μｌ（2pmol/μｌ）
蒸留水 ：3.0μｌ
計 ：18.0μｌ
1)Aikawa, T., Kikuchi, T. and Kosaka, H. (2003) Demonstration of interbreeding between virulent and avirulent populations of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) by PCR-RFLP method. Appl. Entomol. Zool. 38: 565-569.
【００５２】
この反応液に上記のＤＮＡ抽出液2μｌを加え、iCyclerサーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリー（株））を使ってＰＣＲ反応によりマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は次のように設定した。まず、94℃2分、次に94℃1分−53℃1分−72℃1分を35サイクル、そして最後に72℃を2分とした。
【００５３】
8つの増幅反応液はアガロースゲルに注入し、電気泳動後にエチジウムブロマイド液で染色した。そして、これらについて、UV照射によりDNA増幅の有無を確認することによって、ＤＮＡ検出できたか否かを判断した。
【００５４】
実施例２および３の適用結果を以下に示す。まず、ベールマン法による線虫分離の結果、本実施例の検出方法を適用した材片は、1ｇあたりマツノザイセンチュウが約17頭生息している材片であることが確認された。
【００５５】
ＬＡＭＰ法およびＰＣＲ法を用いた検出結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２に示すとおり、実施例２では用いた8サンプル全てでマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅し、検出することができた。当該実施例２および３の結果から、木片にケラチン分解酵素を作用させてＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを増幅して検出する本発明のマツノザイセンチュウの検出方法においては、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を、上記のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出することが好ましいことが示された。
【００５８】
また、当該実施例２および３の結果から、上記のＬＡＭＰプライマーセットは、マツノザイセンチュウが含まれる木片にケラチンを分解する酵素を作用させて抽出されたマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅に用いた場合に、ＰＣＲ法で用いられる他のプライマーと比較して、非常に高い増幅成功率を示すことが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マツノザイセンチュウが含まれる木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法、マツノザイセンチュウのＤＮＡの特定領域にアニーリングするプライマーからなるＬＡＭＰプライマーセット、木片からのマツノザイセンチュウの検出方法、およびマツノザイセンチュウの遺伝子増幅を用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）は日本の森林に最も甚大な被害をもたらしているマツ材線虫病の病原体である。マツノザイセンチュウは北米からの侵入種で、日本のマツはマツノザイセンチュウに対して抵抗性を持っていなかったことから劇的な被害となり、現在では北海道と青森県を除く全ての都府県に蔓延している。
【０００３】
マツ材線虫病の診断には、枯死したマツの木片からマツノザイセンチュウを検出する必要がある。一般的に、従来は木片からマツノザイセンチュウを分離して形態観察することにより検出が行われており、当該マツノザイセンチュウの分離にはベールマン法が用いられている。ベールマン法（例えば非特許文献１参照）は、材片をティッシュペーパーで包み、それを水の張ったロートに浸す方法である。材内にセンチュウがいる場合は、当該センチュウが漏斗の底に沈殿する。その後沈殿したセンチュウの形態を顕微鏡で確認し、マツノザイセンチュウかどうかを判定していた。
【０００４】
しかし、ベールマン法は、木片からのセンチュウの分離に多大な時間を要するほか、センチュウの形態に関する専門的な知識や顕微鏡などの高額な機器が不可欠であった。したがって、これまでマツノザイセンチュウの検出はセンチュウを識別できる人材および機器がそろっている専門機関でのみ行われていた。言い換えれば、マツノザイセンチュウの検出を容易に行うことができる方法は従来存在しなかった。
【非特許文献１】真宮靖治・二井一禎・小坂肇・神崎菜摘（2004）材線虫.（線虫学実験法. 日本線虫学会編、日本線虫学会、 茨城）. 134-153.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品や医療分野などにおいては、ＤＮＡの増幅を用いた病原体の検出の方法が提案されている。しかしながら、後述するように、マツノザイセンチュウは木本中に存在しているため、他の分野で行われている従来の方法を適用しても実用できるものではないという特殊な事情がある。
【０００６】
本発明はこのような事情を鑑みてなされたものであり、マツノザイセンチュウが含まれる木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを容易に抽出する方法、マツノザイセンチュウのＬＡＭＰプライマーセット、および遺伝子の増幅を用いてマツノザイセンチュウを容易に検出することができるマツノザイセンチュウの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法であって、マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明はＬＡＭＰプライマーセットであって、マツノザイセンチュウのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）内の特定領域にアニーリング可能な配列表１から４に示されたそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰのプライマーからなることを特徴とする。ここで、本発明のＬＡＭＰプライマーセットは配列表５に示された塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｆのプライマーを含むようにしてもよい。これらのプライマーセットは、マツノザイセンチュウが含まれる木片にケラチンを分解する酵素を作用させて抽出されたマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅に用いることができる。
【０００９】
さらに、本発明はマツノザイセンチュウの検出方法であって、マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出する段階と、抽出したマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階とを備えることを特徴とする。ここで、マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階は、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出するようにすることができる。
【００１０】
さらにまた、本発明はマツノザイセンチュウの検出方法であって、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を、請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出する段階を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、マツノザイセンチュウが木片中に存在する状態で木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出するので、マツノザイセンチュウを当該木片から分離することなくマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することができる。これにより、マツノザイセンチュウのＤＮＡを用いた検出を実用可能とすることができる。
【００１２】
また、本発明によれば、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域をＬＡＭＰ法にて増幅し、検出することができる。このため、より高精度で容易、且つ安価にマツノザイセンチュウの遺伝子の増幅および検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態のマツノザイセンチュウの検出方法においては、例えばマツ属の木本に由来する木片を、ケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、当該木片中に存在するマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することにより、マツノザイセンチュウを木片から分離することなくＤＮＡを抽出する。次に、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡ内の特定領域に特異的にアニーリング可能なプライマーを含むＬＡＭＰ法用プライマーセットを用いて、遺伝子増幅方法の一つであるＬＡＭＰ法を適用してマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出することにより、採取した木片からマツノザイセンチュウの検出を行う。
【００１４】
上述のように、従来はベールマン法にてマツノザイセンチュウを木片から分離した後、顕微鏡を用いた形態観察によりマツノザイセンチュウを同定していた。これに対し、本発明者はまず、マツノザイセンチュウの検出をＤＮＡの検出を用いて行うことを発案した。
【００１５】
しかしながら、従来のＤＮＡ抽出方法をマツノザイセンチュウが存在する木片に適用させた場合、木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを効率よく抽出することが困難であり抽出に非常に多くの時間を要する。一方、マツノザイセンチュウの存在する木片を粉砕してＤＮＡを抽出、精製することも考えられるが、木片を粉砕するための粉砕機などの専門機器が必要となるため、このような専門機器を備えない場合にあっては当該方法の適用は困難である。言い換えれば、当該専門機器を備えない場合には、結果的にマツノザイセンチュウを木片から分離してＤＮＡを抽出することとなり、ベールマン法の場合と同程度の手間と時間を要することになる。さらに、当該方法が適用できた場合にあっても、抽出液中にはリグニンなどの木片由来の成分が多量に含まれている。そのため、ＤＮＡ増幅による検出に用いるためには、抽出されたＤＮＡの精製を十分に行う必要もある。
【００１６】
そこで本発明者は、マツノザイセンチュウの体表の主要成分の一つがケラチンであることに着目した。そして鋭意研究の結果、マツノザイセンチュウを含む木片にケラチンを分解する酵素を作用させ、マツノザイセンチュウの体表を溶解してその中のＤＮＡを抽出することを見出し、本発明を成すに至った。すなわち、本発明によれば、採取した木片を粉砕等の処理を省略または簡素化しても、マツノザイセンチュウのＤＮＡを短時間で抽出することができる。また、ＤＮＡ抽出バッファー中に滲出する木片由来の成分も少ないため、ＤＮＡ精製過程を省略または簡素化することができる。
【００１７】
また、新しい遺伝子増幅法の一つとして、栄研化学社（栃木）によって開発されたＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）が公知となっている。ＬＡＭＰ法は特異性、増幅効率が高いこと、および反応系に蛍光色素を添加することで目視による増幅の判定が可能であることから、短時間で遺伝子の増幅および検出を行うことができる。さらに、ＬＡＭＰ法は等温核酸増幅法であることから、特別な温度制御機器が不要であり、また、ＬＡＭＰ法に用いられる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法のように耐熱性を備える必要がない。そのため、ＰＣＲ法などと比較してより安価に反応を行うことができる。したがって、マツノザイセンチュウの遺伝子による検出を行うにあたりＬＡＭＰ法を用いることができれば、より容易且つ安価にマツノザイセンチュウの遺伝子の増幅および検出を行うことができる。本発明者は鋭意研究の結果、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域に特異的にアニーリング可能な、配列表１から４に示すＬＡＭＰ法用プライマー（ＬＡＭＰプライマー）セットを見出し、ＬＡＭＰ法を用いたマツノザイセンチュウの遺伝子による検出を可能とするに至った。さらに、配列表５に示したＬｏｏｐ−Ｆプライマーを用いることにより、より短時間で増幅および検出を行うことが可能である。
【００１８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳しく説明する。
【００１９】
まず、マツノザイセンチュウが存在するマツの木片（マツ材片）からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することにより得られる、マツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液の調製について詳述する。本実施形態においては、採取したマツ材片をケラチンを分解する酵素（以下、ケラチン分解酵素という）を含む溶液（緩衝液、ＤＮＡ抽出バッファー）中に入れ、インキュベートしてマツ材片中に存在するマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ抽出液とする。緩衝液は、ケラチン分解酵素が活性を有する限り、ＤＮＡ抽出に用いることができる緩衝液を使用することができるが、例えばＮaＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡを含む緩衝液を例示することができ、この場合、ＮａＣｌ：100-150ｍＭ、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ：10-50ｍＭ、ＥＤＴＡ：0.1-1ｍＭとすることができる。
【００２０】
ここで、本実施形態に係るケラチン分解酵素は特に限定されるものではないが、例えばプロテイナーゼＫ（E.C. 3.4.21.64）を用いることができる。ケラチン分解酵素はマツ材片中のマツノザイセンチュウの体表の主要成分の一つであるケラチンを分解することにより、細胞を溶解して核内のＤＮＡをＤＮＡ抽出バッファー中に溶出させる。このため、マツノザイセンチュウを木片中から分離することなく、マツ材片から直接的にマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することができる。ケラチン分解酵素のＤＮＡ抽出バッファー中における含有量は特に限定されないが、例えば、抽出バッファー中に7.5Ｕ/μｌ程度含まれるようにすることができる。なお、ＤＮＡ抽出液の調製にあたっては、ケラチン分解酵素を含むＤＮＡ抽出キットをＤＮＡ抽出バッファーに添加することにより利用することができる。当該ＤＮＡ抽出キットは、例えばＩＳＯＨＡＩＲ（（株）ニッポンジーン）とすることができる。
【００２１】
上述のマツノザイセンチュウのＤＮＡの抽出に供される木片の大きさ、採取方法は本発明を限定するものではなく、任意に設定可能である。また、木片を採取する木本の種類についても特に限定されないが、例えばマツ属の木本であるクロマツ、アカマツ、リュウキュウマツ、チョウセンゴヨウ、ヒメコマツ、ヨーロッパアカマツ、ヨーロッパクロマツ、フランスカイガンショウ、ムゴマツ、ラジアータマツ、ポンデローサマツ、モンチコラマツ、タイワンクロマツ、マンシュウクロマツ、ヒマラヤゴヨウ、スラッシュマツ、リギダマツ、コントルタマツ、ストローブマツ、テーダマツ、ダイオウマツ、バンクスマツ、プンゲンスマツ、ハクショウ、タイワンアカマツ、などを例示することができる。なお、上述のＤＮＡ抽出液に、公知のＤＮＡ精製処理を行って後述するＬＡＭＰ法による増幅に供するようにしてもよい。また、ケラチン分解酵素を用いたＤＮＡ抽出法は、木片中に存在するマツノザイセンチュウだけに限定されるものではなく、マツノザイセンチュウそのものに酵素を作用させＤＮＡを抽出することももちろん可能である。
【００２２】
次に、本発明のＬＡＭＰプライマーの設計について詳述する。本実施形態においては、マツノザイセンチュウの塩基ｒＤＮＡのＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer）領域の塩基配列を決定し、当該塩基配列に基づいてプライマー設計支援ソフトを用い、マツノザイセンチュウに特異的なＬＡＭＰ法用プライマーの設計を行った。具体的にはまず、マツノザイセンチュウとニセマツノザイセンチュウ（マツノザイセンチュウに最も近縁な種）のｒＤＮＡのＩＴＳ領域をＰＣＲ法により増幅させ、その領域の塩基配列をＡＢＩ３１００ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って決定した。両種の塩基配列情報を、栄研化学（株）がＷＥＢ上で提供しているＬＡＭＰプライマー設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４）で解析し、マツノザイセンチュウのＤＮＡだけが増幅されるようにＬＡＭＰプライマーを設計した。
【００２３】
ここで、本実施形態に係るＬＡＭＰプライマーの設計にあたっては、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域内の標的遺伝子に対して、３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、また標的遺伝子の５'末端側に向かってＢ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰの４種のプライマーを設計する。なお、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域をそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１と、また、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域をそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃとする。
【００２４】
具体的には、配列表１に示されるＦ３プライマーは、Ｆ３ｃ領域と相補的な配列であるＦ３領域を持つように設計される。
【００２５】
また、配列表２に示されるＢ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列であるＢ３領域を持つように設計される。
【００２６】
さらに、配列表３に示されるＦＩＰプライマーは、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域に規定したＦ２ｃ領域と相補的な配列であるＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される。
【００２７】
さらにまた、配列表４に示されるＢＩＰプライマーは、Ｂ２ｃ領域と相補的な配列であるＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される。
【００２８】
加えて、本実施形態は配列表５に示されるＬｏｏｐ−Ｆプライマーを含む。これにより、増幅操作のときにＤＮＡ合成の起点を増やして増幅反応を加速させることができるため、より短時間でマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅および検出を行うことが可能である。配列表５に示されるＬｏｏｐ‐Ｆプライマーは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の領域と相補的な配列を持つように設計される。
【００２９】
続いて、抽出したＤＮＡについて上述のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法による増幅操作について説明する。
【００３０】
ＬＡＭＰ法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。まず、反応試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用バッファー（reaction mix）、プライマーセット、蒸留水）を混合し、増幅反応液を調製する。なお、後述する蛍光・目視検出試薬を合わせて混合してもよい。
【００３１】
プライマーセットを除く反応試薬は、例えば栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ（登録商標、以下同じ） ＤＮＡ増幅試薬キットとすることができる。ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キットは以下の含有成分により構成されている;2倍濃度反応用バッファー（２×Reaction mix）：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2% Tween20、1.6M Betaine、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP； Bst DNA Polymerase 8units/μl。また、後述する蛍光・目視検出試薬についても、例えば栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬とすることができる。
【００３２】
次いで、当該増幅反応液に上述したマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液を加え、例えば、６３℃にてインキュベートする。
【００３３】
ここで、ＬＡＭＰ法の反応は次のような工程により行われる。（１）鋳型ＤＮＡに配列表３のＦＩＰプライマーがアニーリングする。（２）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰプライマーのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。（３）ＦＩＰプライマーの外側に配列表１のＦ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、先に合成されているＦＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。（４）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが２本鎖となる。（５）一方、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされたＦＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖は１本鎖ＤＮＡとなる。当該ＤＮＡ鎖は５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１を持ち、自己アニールを起こしてループを形成する。（６）上述の（５）においてループが形成されたＤＮＡ鎖に対して配列表４のＢＩＰプライマーがアニールする。当該ＢＩＰプライマーの３’末端を起点として相補的なＤＮＡの合成が行われ、（５）で形成されたループは剥がされて伸びる。さらにＢＩＰプライマーの外側に配列表２のＢ３プライマーがアニールする。Ｂ３プライマーの３’末端を起点として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、先に合成されているＢＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。（７）上述の（６）の過程により２本鎖ＤＮＡが形成される。（８）一方、（６）の過程で剥がされたＢＩＰプライマーから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールしてループを形成してダンベル様の構造となる。（９）上述の（８）で形成されたダンベル様構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰプライマーおよびそれに続くＢＩＰプライマーのアニーニングを介したＤＮＡ増幅サイクルが進行する。
【００３４】
増幅操作のためのインキュベート時間は、例えば６０分とすることができる。ＬＡＭＰ法におけるアニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により、当該インキュベートの間にＤＮＡを１０９〜１０１０倍に増幅させることが可能である。
【００３５】
本実施形態においては、続いて、増幅操作が行われた反応液についてマツノザイセンチュウのＤＮＡが含まれるか否かの確認を行う。すなわち、検出に供したマツ材片中にマツノザイセンチュウが存在している場合、増幅操作によりマツノザイセンチュウのＤＮＡが増幅され、検出される。一方、検出に供したマツ材片中にマツノザイセンチュウが含まれていなければ、増幅操作によってもマツノザイセンチュウのＤＮＡは増幅されず、したがって検出されない。
【００３６】
反応液中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば蛍光目視検出で確認することができる。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、目視にて反応液の色を確認する。具体的には反応液が蛍光を発していれば陽性、すなわちマツノザイセンチュウのＤＮＡが増幅されており、蛍光を発していなければ陰性、すなわちマツノザイセンチュウのＤＮＡは増幅されていないと判断することができる。当該反応液の蛍光は、紫外線照射装置により、より明確に陽性と陰性の違いを判断することができる。
【００３７】
以上のとおり本実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の実施形態とすることが可能である。例えば、ＬＡＭＰ法におけるＤＮＡ増幅の検出方法は蛍光目視検出に限定されるものではなく、任意に変更可能である。具体的には、増幅の副産物として生じるピロリン酸マグネシウムの影響により増幅反応液は白濁するが、このときの増幅反応液の濁度を測定することによってマツノザイセンチュウのＤＮＡ増幅を検出するようにしてもよい。さらに、遺伝子の増幅についても公知となっている種々の核酸増幅方法、例えばＰＣＲ (Polymerase Chain Reaction)法を用いて行うこともできる。
【００３８】
加えて、本発明のＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法によりＤＮＡを増幅し、検出する方法は、木片からマツノザイセンチュウのＤＮＡが直接的に抽出された場合に限定されず、マツノザイセンチュウをベールマン法などにより木片から分離してＤＮＡを抽出した場合にも適用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。しかしながら、本実施例は本発明を何ら限定するものではない。
（実施例１）
【００４０】
本実施例に用いたマツ材片は森林総合研究所本所構内の１０本の枯死したクロマツから採集した。そのうち５本はマツノザイセンチュウが感染しているクロマツ（人為的にマツノザイセンチュウを接種し枯死させたクロマツ）であり、残りの５本はマツノザイセンチュウが感染していないクロマツ（健全な状態で伐倒後、マツノザイセンチュウの感染を防ぐため網室に隔離したクロマツ）である。
【００４１】
採取したマツ材片からマツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出し、マツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出液を調製した。具体的には、まず、１．５ｍｌマイクロチューブにＤＮＡ抽出 ｂｕｆｆｅｒ（100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH.8.0), 1mM EDTA）を1ml入れた。次に、マイクロチューブ中の当該ＤＮＡ抽出バッファーにケラチン分解酵素であるプロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＨＡＩＲ、（株）ニッポンジーン）のLysis buffer 40μlとEnzyme solution 50μlを添加し、よく攪拌した。続いて、採取したマツ材片約０．０６ｇをマイクロチューブ内の溶液中に入れ、５５℃で２０分間、次いで９４℃で１０分間インキュベートした。
【００４２】
次に、本発明に係るプライマーセットと上述のＤＮＡ抽出液を用いて、ＬＡＭＰ法による増幅、および検出操作を行った。具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに本発明のプライマーセット、Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学（株））の各試薬、およびＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学（株））を下記の分量で分注し、反応液を作成した。プライマーセットは、マツノザイセンチュウとニセマツノザイセンチュウのｒＤＮＡのＩＴＳ領域をＰＣＲ法により増幅させ、その領域の塩基配列をＡＢＩ３１００ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って決定した後、両種の塩基配列情報を、栄研化学（株）がＷＥＢ上で提供しているＬＡＭＰプライマー設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４）で解析し、マツノザイセンチュウのＤＮＡだけが増幅されるようにＬＡＭＰプライマーを設計することにより得た。
2×Reaction Mix : 12.5μl
Primer FIP （配列表１） : 1.0μl (40 pmol/μｌ)
Primer BIP （配列表２） : 1.0μl (40 pmol/μｌ)
Primer F3 （配列表３） : 1.0μl (5 pmol/μｌ)
Primer B3 (配列表４) : 1.0μl (5 pmol/μｌ)
Primer Loop-F （配列表５） : 1.0μl (20 pmol/μｌ)
Bst DNA Polymerase : 1.0μl
蛍光・目視検出試薬 : 1.0μl
蒸留水 : 3.5μl
計 : 23.0μl
【００４３】
続いて、当該増幅反応液に上述のＤＮＡ抽出液２μｌを加え、よく攪拌して６３℃の条件下に１時間放置した。
【００４４】
１時間後、増幅反応液が緑色の蛍光を発しているか否かについて目視にて確認した。その結果を表１に示す。緑色の蛍光を発し、陽性と判断される場合は○と、蛍光を発せず、陰性を判断される場合は×と示した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
また、それぞれ各例と同じ木から採取したマツ材片について、ベールマン法を用いた検出を行った。その結果、上記表１に示したのと同じ検出結果が得られた。これにより、本発明に係る本実施例の検出方法の有効性が示された。
（実施例２および実施例３）
【００４７】
続いて、本発明の実施例２および３として、ＬＡＭＰ法、およびＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を用いたマツノザイセンチュウの検出の有効性について検討した。
【００４８】
まず、森林総合研究所構内に発生したマツ枯死木1本から材片を採集した。採集した材片のうち8ｇについてベールマン法を適用し、マツノザイセンチュウを分離した。続いて、採集した材片の線虫密度（1ｇ当たりのマツノザイセンチュウ数）を算出した。
【００４９】
また、残りの材片から約0.06ｇのＤＮＡ抽出用サンプルを8つ調製し、ＤＮＡ抽出に用いた。具体的には、まず、１．５ｍｌマイクロチューブにＤＮＡ抽出 ｂｕｆｆｅｒ（100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH.8.0), 1mM EDTA）を1ml入れた。次に、マイクロチューブ中の当該ＤＮＡ抽出バッファーにケラチン分解酵素であるプロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＨＡＩＲ、（株）ニッポンジーン）のLysis buffer 40μlとEnzyme solution 50μlを添加し、よく攪拌した。続いて、ＤＮＡ抽出用サンプルそれぞれ約０．０６ｇをマイクロチューブ内の溶液中に入れ、５５℃で２０分間、次いで９４℃で１０分間インキュベートした。
【００５０】
この8つのＤＮＡ抽出液を用いてＬＡＭＰ法およびＰＣＲ法でマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅し、検出を行った。なお、ＬＡＭＰ法を用いた検出の方法および条件については上述した実施例１と同一であるため、説明を省略する。
【００５１】
実施例３のPCR法を用いた検出は次のような方法で行った。まず、0.2mlマイクロチューブにGoTaq green Master Mix（プロメガ（株））およびマツノザイセンチュウのrＤＮＡのITS領域をPCR法により増幅させるためのプライマーセットを下記の分量で分注し、反応液を作成した。なお、該プライマーセットを構成するプライマーの配列を配列表６および７に示す。
GoTaq green Master Mix ：10.0μｌ
Bx18S1)(配列表6) ：2.5μｌ（2pmol/μｌ）
Bx28S1)(配列表7） ：2.5μｌ（2pmol/μｌ）
蒸留水 ：3.0μｌ
計 ：18.0μｌ
1)Aikawa, T., Kikuchi, T. and Kosaka, H. (2003) Demonstration of interbreeding between virulent and avirulent populations of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) by PCR-RFLP method. Appl. Entomol. Zool. 38: 565-569.
【００５２】
この反応液に上記のＤＮＡ抽出液2μｌを加え、iCyclerサーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリー（株））を使ってＰＣＲ反応によりマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は次のように設定した。まず、94℃2分、次に94℃1分−53℃1分−72℃1分を35サイクル、そして最後に72℃を2分とした。
【００５３】
8つの増幅反応液はアガロースゲルに注入し、電気泳動後にエチジウムブロマイド液で染色した。そして、これらについて、UV照射によりDNA増幅の有無を確認することによって、ＤＮＡ検出できたか否かを判断した。
【００５４】
実施例２および３の適用結果を以下に示す。まず、ベールマン法による線虫分離の結果、本実施例の検出方法を適用した材片は、1ｇあたりマツノザイセンチュウが約17頭生息している材片であることが確認された。
【００５５】
ＬＡＭＰ法およびＰＣＲ法を用いた検出結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２に示すとおり、実施例２では用いた8サンプル全てでマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅し、検出することができた。当該実施例２および３の結果から、木片にケラチン分解酵素を作用させてＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを増幅して検出する本発明のマツノザイセンチュウの検出方法においては、マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を、上記のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出することが好ましいことが示された。
【００５８】
また、当該実施例２および３の結果から、上記のＬＡＭＰプライマーセットは、マツノザイセンチュウが含まれる木片にケラチンを分解する酵素を作用させて抽出されたマツノザイセンチュウのＤＮＡの増幅に用いた場合に、ＰＣＲ法で用いられる他のプライマーと比較して、非常に高い増幅成功率を示すことが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することを特徴とする木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法。
【請求項２】
マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域にアニーリング可能な配列表１から４に示されたそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、およびＢＩＰのプライマーからなることを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３】
配列表５に示された塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｆのプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項４】
マツノザイセンチュウの検出方法であって、
前記マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出する段階を備えることを特徴とするマツノザイセンチュウの検出方法。
【請求項５】
マツノザイセンチュウの検出方法であって、
前記マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出する段階と、
抽出した前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階とを備えることを特徴とするマツノザイセンチュウの検出方法。
【請求項６】
前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階は、
前記マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出することを特徴とする請求項５に記載のマツノザイセンチュウの検出方法。
【請求項１】
マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出することを特徴とする木片からのマツノザイセンチュウのＤＮＡ抽出方法。
【請求項２】
マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域にアニーリング可能な配列表１から４に示されたそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、およびＢＩＰのプライマーからなることを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３】
配列表５に示された塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｆのプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項４】
マツノザイセンチュウの検出方法であって、
前記マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出する段階を備えることを特徴とするマツノザイセンチュウの検出方法。
【請求項５】
マツノザイセンチュウの検出方法であって、
前記マツノザイセンチュウが含まれる木片をケラチンを分解する酵素を含む溶液中に浸し、前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを抽出する段階と、
抽出した前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階とを備えることを特徴とするマツノザイセンチュウの検出方法。
【請求項６】
前記マツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅して検出する段階は、
前記マツノザイセンチュウのｒＤＮＡの特定領域を請求項２または３に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅して検出することを特徴とする請求項５に記載のマツノザイセンチュウの検出方法。
【公開番号】特開２００９−２６８４０４（Ｐ２００９−２６８４０４Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２１３１６（Ｐ２００８−１２１３１６）
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【出願人】（５０１１８６１７３）独立行政法人森林総合研究所 (91)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【出願人】（５０１１８６１７３）独立行政法人森林総合研究所 (91)
【Ｆターム（参考）】
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