核酸の変異解析方法および遺伝子の発現解析方法
本発明は、ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と核酸試料とを反応させる工程；検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸とポリメラーゼとの存在下で前記反応で得られた反応産物を伸長する工程；前記伸長工程で使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程；当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程；検出された信号の有無と前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の塩基の種類から標的部位の塩基を決定する工程を具備する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、固相されたプローブ核酸を用いて核酸の変異を解析する方法に関する。また本発明は、固相された標識プローブ核酸を用いて遺伝子発現を解析する方法に関する。更に本発明は、核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に有用である、標識プローブ核酸の調製方法に関する。
【背景技術】
所謂ＤＮＡマイクロアレイは、多数の異なったプローブＤＮＡをガラスなどの固相基板上に高密度に固定した装置である。このような基板にプローブ核酸を固定した装置は、その製造方法から２種類に大別される。１つは、光リソグラフ方式によりＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡチップと称される装置である（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４）９１：５０２２−５０２６）。もう１つは、予め調製したＤＮＡをスライドガラス上に機械的に並べ、それによってＤＮＡを張り付けていくタイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡマイクロアレイと称される装置である（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２７０：４６７−４７０）。
上記２種類のＤＮＡマイクロアレイの基本的な測定原理は、固定されたプローブ核酸に対して標識された核酸試料をハイブリダイズさせ、核酸試料の標識を基に、核酸試料の中に、プローブ核酸にハイブリダイズする核酸が存在するか否かを検出するものである。このような原理によって、遺伝子の大量解析が可能になる。また、検出感度の向上、装置のマイクロ化によるサンプルの節約、データの取得の自動化およびデータ処理の簡便化なども達成されると期待されている。
ＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプのＤＮＡマイクロアレイは、半導体に使われる光リソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術を融合させることで作製する。まず光反応で取り除くことができる保護基を持った合成リンカーをガラス基板上に結合させ、マスクと呼ばれる遮蔽物質を通して光を照射することにより、特定の領域の保護基を脱離させる。次にこのガラス基板を水酸基が保護されたヌクレオチドと反応させる。これにより保護基が脱離している部分のみで、重合反応が起こる。更に、別のマスクを用いて基板上の異なる領域に光を照射し、ヌクレオチドの重合を繰り返し、アレイを作製する。
スライドガラスにＤＮＡを張り付けていくタイプのＤＮＡマイクロアレイは大がかりな半導体製造機を必要としない。ＤＮＡアレイ機と検出器があれば目的のＤＮＡマイクロアレイを製造することが可能である。また、この方法は、張り付けるＤＮＡを任意に選択できることが利点であるが、その一方で、ＤＮＡのコレクションを調製する必要があり、繁雑な作業が必要である。また、この方法では、ピン先で物理的にスポットしていく。従って、ＤＮＡの高密度化は光リソグラフ方式よりは劣る。しかしながら、例えば、直径１００μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットすると計算上１ｃｍ２に２５００スポットすることが可能である。通常のスライドガラス１枚（有効面積は約４ｃｍ２である）について、約１万のＤＮＡを載せることが可能である。
ＤＮＡアレイ機は、基本的に高性能サーボモータを組み合わせて、コンピュータ制御下でピン先、或いは、スライドホルダーをＸＹＺ軸方向に作動して、マイクロタイタープレートからスライドガラス表面上にＤＮＡサンプルを運ぶものである。ピン先の形状には、多くの工夫がなされており、この技術の命とも言える。最も一般的なピン先形状は、カラス口のように割れたペン先形状である。そこにＤＮＡプローブ溶液を溜め、複数のスライドにスポットする方式である。洗浄および乾燥のサイクルを挟んで次のＤＮＡサンプルを載せるという工程を繰り返す。理想的なアレイ機に求められる機能は、スポットのサイズや形状が均一で、しかも高速で再現性がよいということである。ペン先のロットの違いなどにより均一性やスピードに限界があるので、より高性能なものを求めてインクジェット方式やキャピラリー方式など、新しい技術の開発も進められている。
ＤＮＡ固定法に関しては、ガラスはメンブレンと比較して、有効固定面積が小さく電荷のチャージも少ないので、種々のコーティングが試みられている。実用的にはポリＬリジンや、シラン化などが用いられている。ＤＮＡ末端をアミノ化してシラン化ガラスにクロスリンクする方法もある。
ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光標識ＤＮＡの蛍光シグナルの検出は蛍光検出器で行う。通常、スキャナーは蛍光顕微鏡と可動ステージを組み合わせたものである。従来型のゲル用の蛍光イメージアナライザーでも、それ程高密度ではないＤＮＡマイクロアレイの読み取りなら可能である。最近、ＤＮＡマイクロアレイ専用の高解像度スキャナーが売り出された。読み取り方式の違いにより共焦点型と落射型がある。
ＤＮＡマイクロアレイから出てくるデータは膨大なものになるので、データ解析ソフトが重要となってくる。データの表示方法やデータの後処理、他のデータベースとのリンクなど実験者にとって使い勝ってのよいソフトウェアの開発が望まれている。マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリングのデータベース化の試みや、アレイデータベースのインターネットでの公開も始まっている。
このような技術のＤＮＡマイクロアレイを用いて、突然変異を検出することが試みられている。まず、サンプルの特定領域中の１塩基に対して、その塩基のみが異なる４種類のオリゴヌクレオチドプローブをデザインし、ＤＮＡプローブチップに載せる。一方、塩基配列を調べるサンプルはＰＣＲで増幅し、蛍光色素を用いて末端標識しておく。このサンプルを前記のＤＮＡチップとハイブリダイゼーションさせると、サンプル配列と相補的な塩基を持つプローブが最も強いハイブリダイゼーションシグナルを示す。同様に、１塩基置換の突然変異を持ったサンプルの場合は、変異塩基に相補的な塩基を持つプローブが最も強いハイブリダイゼーションシグナルを示す。この方法では、電気泳動に基づいたＤＮＡシーケンシングと異なる、未知の塩基配列を決定することはできないが、特定の遺伝子の決まった領域について、突然変異の存在を高密度で検出できる。
サンプル調製では、例えば、Ｈｕ ＳＮＰ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）は、ＳＮＰマーカーの増幅に１本の反応チューブで約１００種類のＰＣＲ産物を増幅させるマルチプルＰＣＲを採用している。２段階目にはラベリングＰＣＲを行い、各ＳＮＰマーカーを含むＰＣＲ産物を更に増幅させると共に、ビオチン標識を行うが、このときには、全てのＰＣＲ産物に共通なプライマーペアを用いることができる。このサンプル調整の効率化により、約１２０ｎｇのゲノムＤＮＡから出発し、１日半でＳＮＰ遺伝子型を決定することができるようになった。実験操作は、ＧｅｎｅＣｈｉｐシステムにより極限まで自動化されており、１台のスキャナを用いた場合には２４時間で１８０サンプルの解析が可能である。
このようなＤＮＡ変異解析は、４種類のオリゴヌクレオチドプローブをガラスなどの固相基板上に固定し、その上に、ＰＣＲで増幅した蛍光標識ＤＮＡをハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、そのデータをコンピュータで解析する。このような解析は、以下のような問題点がある。即ち、１）測定したい試料を各試料毎に蛍光標識ヌクレオチドや蛍光標識プライマーを用いて標識しなければならず、標識の効率が低く、且つ製造コストが高い、２）ハイブリダイゼーションまでの前処理が煩雑で自動化しずらい、３）１つの試料を測定するのに４種類のプローブを用意しなければならず費用がかかる、４）測定が乾燥状態で行われるために蛍光シグナルの検出効率が低い。
一方、上述のＤＮＡマイクロアレイを用いて、遺伝子発現を解析することも現在行われている。その主流は、二蛍光標識法を用いたディファレンシャルな遺伝子発現をみる系である。その原理は、２つの異なったｍＲＮＡサンプル中での遺伝子発現の差を検出するものである。そのために、各ｍＲＮＡサンプルから各標識ｃＤＮＡを調製する際に、それぞれを異なる蛍光物質で標識し、各標識ｃＤＮＡをアレイ上のプローブに競合的にハイブリダイズさせ、両方の蛍光を測定し比較するものである。
このような従来の方法は、以下のような問題点がある。即ち、１）従来の方法では、測定したい試料を標識するため、例えばＲＮＡなどの試料のデグラデーションが生じる。２）従来の方法では、ハイブリダイゼーションまでの前処理が煩雑で自動化しずらい。３）従来の方法は、ディファレンシャルな遺伝子発現を検出するものである。従って、相対的変化でしか発現量を見られない。４）従来の方法では、プローブの固相量や、点着スポットの状態を反応前に知ることができない。従って、プローブ固相の精度管理を行うことが不可能である。５）従来の方法では、測定は乾燥状態で行われているので、蛍光シグナルの検出効率が低い。
【発明の開示】
上記の状況に鑑み、本発明の目的は、効率がよく、且つ経済的な遺伝子変異解析方法を提供することである。
鋭意研究の結果、本発明者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）の工程で得られた反応産物を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程
を具備する方法である。
また、上記背景技術に記載された状況に鑑み、本発明の目的は、効率のよい遺伝子発現解析方法を提供することである。本発明の更なる目的は、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現解析方法を提供することである。また本発明の更なる目的は、検出精度のよい遺伝子発現解析方法を提供することである。
鋭意研究の結果、本発明者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であって、
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程と
を具備する方法；および、
対象における標的配列の発現頻度を判定する方法であって、
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、対象から得た被検核酸を含む試料を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後に、前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、対象における標的配列の発現頻度を判定する工程
を具備する方法である。
また、このような遺伝子発現解析方法を実施するにあたり、この方法が、流路等の支持体上のプローブをすべて標識しなければならないという点において、多大な費用と時間と労力を要するという問題を有していることを見出した。
従って本発明は、アレイ上のプローブをすべて一括して標識することが可能な、簡便なプローブ標識方法を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、標識プローブ核酸を固相化した支持体を簡便に作成する方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明は、以下の手段を提供する。即ち、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程とを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の１態様に従って使用される反応容器の例を示す図であり、（ａ）は、本発明の１態様に従って使用される反応容器の例を示す平面図であり、図１（ｂ）および（ｃ）は、図１（ａ）の１Ｂ−１Ｂ線の断面図である。
図２は、本発明の１態様に従う変異解析方法の例を模式的に示す図である。
図３は、本発明の１態様に従う変異解析方法の例を模式的に示す図である。
図４は、Ｓ１ヌクレアーゼによる核酸分解の例を模式的に示す図である。
図５は、ヌクレアーゼプロテクションアッセイの原理を模式的に示す図である。
図６は、本発明の１態様に従う変異解析方法の１例を模式的に示す図である。
図７は、本発明の１態様に従う変異解析方法の１例を模式的に示す図である。
図８は、本発明の１態様に従う遺伝子発現解析方法を模式的に示す図である。
図９は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１０は、本発明の１態様に従う標的配列の検出方法を模式的に示す図である。
図１１は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１２は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１３は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１４は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第一の実施の形態を説明する図である。
図１５は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第二の実施の形態を説明する図である。
図１６は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第三の実施の形態を説明する図である。
図１７は、第１６の実施例の結果を示す顕微鏡写真である。
図で用いられた符号は、以下のとおりである：
１…反応容器、 ２…反応部、 ３…プローブ核酸、 ４ａ、４ｂ…開口部、 ５…ポリイミド薄膜、 ６…ヒーター、 ７…温度センサー；
２１ａ、２１ｂ…ターゲット核酸、 ２２ａ、２２ｂ…プローブ核酸、 ２３ａ、２３ｂ…標識化基質核酸；
３１ａ、３１ｂ、３１ｃ…ターゲット核酸、 ３２ａ、３２ｂ、３２ｃ…プローブ核酸、 ３３…標識化基質核酸、 ３４…反応部の底面、 ３５…反応部、 ３６ａ、３６ｂ、３６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸；
８１ａ、８１ｂ、８１ｃ…ターゲット核酸、 ８２ａ、８２ｂ、８３ｃ…プローブ核酸、 ８３…標識化基質核酸、 ８４…反応部の底部、 ８５…反応部、 ８６ａ、８６ｂ、８６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸、 ８７ａ、８７ｂ…ターゲット核酸；
９１ａ…ターゲット核酸、 ９２…プローブ核酸、 ９３ａ…標識化基質核酸、 ９４…反応部の底部、 ９５…反応部、 ９６ａ…伸長され標識されたプローブ核酸、 ９１ｂ…ターゲット核酸、 ９３ｂ…標識化基質核酸、 ９６ｂ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１０１…プローブ核酸、 １０２…ターゲット核酸、 １０４…反応部の底面、 １０５…反応部；
１２１…鋳型核酸、 １２２…種プローブ核酸、 １２３…標識化基質核酸、 １２４…反応部の底面、 １２５…反応部、 １２６…伸長され標識されたプローブ核酸、 １２７、１２８…非標識化基質核酸；
１３１ａ、１３１ｂ、１３１ｃ…鋳型核酸、 １３２ａ、１３２ｂ、１３２ｃ…種プローブ核酸、 １３３…標識化基質核酸、 １３４…反応部の底面、 １３５…反応部、 １３６ａ、１３６ｂ、１３６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１４１ａ…鋳型核酸、 １４２…種プローブ核酸、 １４３ａ、１４３ｂ…標識化基質核酸、 １４４…反応部の底面、 １４５…反応部、 １４６ａ、１４６ｂ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１５１…種プローブ核酸、 １５２…反応部の底面、 １５３…鋳型核酸、 １５４…第１の標識化基質核酸、 １５５…第２の標識化基質核酸；
１６１ａ、１６１ｂ、１６１ｃ…鋳型核酸、 １６２ａ、１６２ｂ、１６２ｃ…種プローブ核酸、 １６３…標識化基質核酸、 １６４…反応部の底面、 １６５…反応部、 １６６ａ、１６６ｂ、１６６ｃ…プローブ核酸、 １６７ａ、１６７ｂ…ターゲット核酸；
２０１…支持体、 ２０２…鋳型核酸、 ２０３…未標識プローブ核酸前駆体、 ２０４…標識ヌクレオチド、 ２０５…非標識ヌクレオチド、 ２０６…標識プローブ核酸；
２０７…ジデオキシヌクレオチド；
２０３ａ…未標識プローブ核酸前駆体Ａ、 ２０３ｂ…未標識プローブ核酸前駆体Ｂ。
【発明を実施するための最良の形態】
１． 核酸の変異解析方法
１．１ 核酸の変異解析方法の概要
本発明の態様に従うと、ターゲット核酸の特定部位の塩基を決定するための方法が提供される。本方法において、ターゲット核酸を選択的に捕獲するための配列を含み、かつその５’末端で基体に固相化されているプローブ核酸を用いる。
ここで使用される「核酸」の語は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを示す。
ここで使用される「ターゲット核酸」とは、前記核酸の何れかの核酸であって、ハイブリダイゼーションに適切な塩基長を有する核酸をいう。ハイブリダイゼーションに適切な塩基長とは、１０塩基長から１０００塩基長であればよく、好ましくは１５塩基長から２００塩基長であり、より好ましくは１５塩基長から５０塩基長である。
例えば、本発明に従って好ましく対象とされるターゲット核酸は、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド等、何れの核酸断片であってもよい。また、当該ターゲット核酸は、人工的に合成された核酸断片であっても、対象から抽出された何れの核酸断片であっても、それを元に合成されたｃＤＮＡおよびＲＮＡ断片であっても、ＰＣＲなどにより増幅されて得られた核酸断片であってもよい。また、それ自身公知の何れかの細胞工学的技術によって操作して得られた核酸の断片であってもよい。
ここで使用される「対象」の語は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む任意の哺乳動物、爬虫類、魚類および昆虫などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
上記のような対象からターゲット核酸を含む核酸試料を対象から得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能である。例えば、核酸試料がゲノムＤＮＡである場合には、市販のキットを使用しても、他の公知の方法を使用してもよい。また例えば、核酸試料がＲＮＡである場合には、例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを使用してもよいが、これに限定されるのもではない。
本発明の方法で使用される「プローブ核酸」は、特定の配列を有する「ターゲット核酸」をハイブリダイゼーションを利用して選択的に捕獲するための核酸である。従って、解析の対象となるターゲット核酸の既に分かっている配列の連続する一部分に相補的な配列を選択用配列として有する。プローブ核酸の長さは、１０塩基から１００塩基、好ましくは１５塩基から２５塩基であればよい。また、選択用配列の長さは、１０塩基から５０塩基、好ましくは１５塩基から３０塩基であればよい。プローブ核酸は、５’末端を介して基体に固相化されている。
本発明の方法で使用される「ターゲット核酸」は、本発明の方法において解析の対象となる配列であり、その塩基を決定しようとする標的部位以外の配列は既に分かっている配列であることが好ましい。ターゲット核酸に含まれる標的部位の３’側に上記「選択用配列」に相補的な配列が存在する。また、標的部位の長さは１塩基であっても、２塩基以上であってもよいが、１塩基であることが好ましい。また、ターゲット核酸における標的部位の位置は、プローブ核酸が５’端を介して基体に固相化されている場合であれば、３’端側に選択用配列に相補的な配列が位置するので、選択用配列の相補配列に隣接し、且つその相補配列よりも５’端側でに位置すればよく、５’末端であっても、末端でなく末端までに幾つかの塩基を有していてもよい。
本発明の態様に従う方法は、例えば、次のように行うことが可能である。先ず最初に、選択用配列を有するプローブ核酸を反応容器に固相化する。次に、核酸試料をその反応容器に添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件、例えば、厳格な（ストリンジェンシーな）条件、で反応を行う。選択用配列に相補的な配列を有するターゲット核酸が前記核酸試料に存在すれば、プローブ核酸にはターゲット核酸がハイブリダイズする。これにより、特定の配列を有するターゲット核酸を核酸試料から捕獲される。続いて、そこに検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを反応容器に添加し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う。その後、伸長反応に使用されなかった標識化基質を除去し、標識物質に由来する信号を検出する。その結果、当該信号が観察されれば伸長が生じていれることが分かる。従って、標的部位の塩基が、使用した標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれるに塩基に相補的な塩基であることが分かる。１つの核酸試料について、このような工程を４種類の塩基全てについて行ってもよい。また、標的部位が遺伝子多型の存在する部位であれば、その多型の遺伝子型となり得る塩基の種類についてのみ上記の工程を行ってもよい。
本発明の態様においてプローブ核酸は、その５’末端を介して基体に固相化されている。プローブ核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所望のプローブ核酸を固定することによって行うことが可能である。
本発明の態様に従って使用され得る「基体」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の基体であってもよい。あるいは、「基体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。処理の容易さから、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ましい。
基体が球状である場合、当該球状の基体を用いて以下に記載のとおり、本発明を実施することができる。すなわち、基体として、検出すべきターゲットに対応する複数のプローブを固相化した微粒子を調製し、当該微粒子をキャピラリーまたはウェル等の反応容器に供給して、本発明に記載の反応を実行することができる。当該微粒子は、反応後に反応容器から回収して、フローサイトメーター（ＦＣＭ）やレーザースキャニングメーター（ＬＳＭ）による既知の測定に適用してもよい。基体として微粒子を用いた場合、好ましくは、反応容器であるキャピラリーと連続する流路の別の場所において、流動させながら、あるいは静止させた状態で測定を行うことができる。また、１本の流路内の異なる場所に微粒子を順次移動させて、それぞれの位置で固相化工程、反応工程および測定工程という一連の工程を同時または連続的に行うことも可能である。微粒子をキャピラリー内の液体と独立して移動または停止させるために、個々の微粒子が、既知の磁気的分離技術を使用可能なように磁性体を含んでいるのが好ましい。このように、キャピラリー内を流通させることによって、ターゲットの種類毎に順番に移動と停止を行うことができる。すなわち、ある種類のプローブを固相した微粒子をキャピラリ内に流通させ、その後別の種類のプローブを固相した微粒子を流通させることによって、流路内の上流と下流とで異なる反応を行うこともできるし、各種ターゲットを含む各試料を流路内に順次流通させることによって、流路内の上流と下流とで異なる反応を行うこともできる。
また、本発明において、伸長反応時に使用される基質を標識するための「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いてもよい。複数のプローブ核酸を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよい。
１．２ 実施例
以下、本発明に従う態様例を用いて本発明について更に説明する。
第１の実施例：反応容器
本発明の態様において使用され得る反応容器の例を図１に示す。図１（ａ）は、当該反応容器の平面図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）の線１Ｂ−１Ｂに沿った断面図である。本例における反応容器１は、そこにおいて反応を行うための反応部２を具備する（図１（ｂ））。ここで、反応部２は、図１（ｂ）に示す通りの容器内部の形状がキャピラリー形状である。
また、図１（ａ）および（ｂ）に示すように反応容器１は、反応部２に試薬などを挿入および／または反応部２から試薬などを排出するための開口部４ａおよび４ｂを有している。また、反応部２の底部には、特定の配列を含むターゲット配列を捕獲するための選択用配列を含むプローブ核酸３が所望の領域に固相化されている（図１（ｂ））。このような反応容器１の製造は次のように行った。
即ち、キャピラリーを形成可能な溝およびその溝の両端に孔を有する第１の基板（キャピラリーカバー）と、その表面にプローブ核酸が固相化された第２の基板とを接合して製造した。このとき、前記プローブ核酸は、第１の基板の溝と第２の基板の表面により形成される空間内に含まれる。より具体的には次の通りである。図１には、１キャピラリーを具備する反応容器を示したが、本発明の態様に置いて使用される反応容器は、２以上のキャピラリーを具備する反応容器であってもよい。
また、上記の例ではその内部形状がキャピラリー形状の例を示したが、キャピラリー形状に限定するものではなく、そこにおいて所望の反応を行うことが可能であればどのような形状であってもよい。
また、本発明に従って使用されるキャピラリーアレイは、例えば、以下の様に変更することも可能である。図１（ｃ）は、図１（ａ）の線１Ｂ−１Ｂに沿った断面である。図１（ｃ）にその断面を示すように、反応部２の下方にヒーター６および温度センサー７を配置してもよい。その場合、例えば、プローブ核酸３が固相化されるポリイミド薄膜５の下方にヒーター６を配置し、ヒーター６の下方に温度センサー７を配置すればよい。このような装置は、それ自身公知の何れかの手法により製造することが可能である。また、このような装置に含まれるヒーターおよびセンサーの配置の位置および配置パターンは所望に応じて変更してもよい。また、必ずしも、ヒーターおよびセンサーが当該基板と一体化されて提供される必要はない。
本実施例に記載のキャピラリーアレイについては、米国特許公開２００２００１３４５７（Ａｋｉｒａ Ｓｕｙａｍａ）を参照することができる。また、他のキャピラリーアレイについては、米国特許６，１４３，１５２（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照することができる。
キャピラリーアレイは、米国特許公開２００２００１３４５７（Ａｋｉｒａ Ｓｕｙａｍａ）に記載されるように全長に亘って一定の断面積を有するように構成される。これにより、液体の流路内における液量は何処も均等であるから反応条件が等しい。同じ理由により、キャピラリーアレイにおける液体の出入りは、特別な制御手段を用いることなく定量的に調節されており、且つ脈流のない円滑な液体ハンドリングを可能にする。
第２の実施例
（１）反応容器
以下に示すように、４つのキャピラリー、即ち、キャピラリー１、キャピラリー２、キャピラリー３およびキャピラリー４を具備すること以外は第１の実施例に記載の反応容器と同様な反応容器を用いてターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法の例を示す。
第１の基板であるガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を４本形成し、これらの夫々の溝の両端に貫通孔を形成した。第２の基板には、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）を用いた。このストレプトアビジンコートスライドに対して、５’末端をビオチン標識したＲＶプローブ（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）を点着装置を用いて固相化した。固相化は、第１および第２の基板を接合した時に、前記４本の溝に相当する夫々の位置に、ＲＶプローブが配置されるようにした。この固相化は、ビオチン−アビジン反応を利用した。このような第１の基板と第２の基板を接合し、前記４つの溝によって４本のキャピラリー、即ち、キャピラリー１、キャピラリー２、キャピラリー３およびキャピラリー４を形成した。これにより、得られた４本のキャピラリー内に前記ＲＶプローブ核酸が具備された。このようにして形成した反応容器を用いて次の実験を行った。
（２）遺伝子の変異解析
以下、遺伝子の変異を解析する方法の１例である。ここでは、第４番目の塩基「Ｎ」が不明である試料ｔｇｃＮｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃターゲット核酸について、その「Ｎ」がアデニンであるのか、グアニンであるのかを決定する。
前記のキャピラリー１とキャピラリー２には、第１のターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。また、同様に、前記のキャピラリー３とキャピラリー４には、第２のターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。これらについて、３７℃で１時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のターゲット核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液Ａ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰをキャピラリー１と３に加え（図２反応Ａ）、伸長反応溶液Ｃ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄＣＴＰをキャピラリー２と４に加え（図２反応Ｂ）、これらを３７℃で１、２時間反応した。
反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を取り除き蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。表１は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値で示している。
表１の結果に示されるように、キャピラリー１とキャピラリー４の蛍光強度が大きい。この結果から、キャピラリー１とキャピラリー４に伸長が生じ、これに対してキャピラリー２とキャピラリー３では伸長は生じていないことが分かる。従って、キャピラリー１に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、アデニンであり、キャピラリー４に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、グアニンであることが判定される。
このように、加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類と、伸長の有無から試料ターゲットの「Ｎ」の塩基が決定された。
上記の例では、本発明の態様に従う方法を説明するために、便宜上、その配列を予め分かっているターゲット核酸、即ち、ＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）とＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を用いた。同様に、標的部位の塩基の不明な配列についても、その塩基を決定することが可能である。このような態様により、遺伝子の変異を検出したら、多型の遺伝子型を決定することが可能である。
このような反応により生じる現象を、図２に模式的に示した。本反応では、（Ａ１）および（Ｂ１）に示すように、選択用配列に相補的な配列を含む核酸試料としてターゲット核酸２１ａおよびｂを、選択用配列を含むプローブ核酸としてプローブ核酸２２ａおよびｂを使用した。また、ターゲット核酸の標的部位「Ｎ」に該当する塩基はＡである。反応Ａは、キャピラリー１で生じる反応を示し、反応Ｂは、キャピラリー２で生じる反応を示す。反応Ａでは、標識化基質核酸として蛍光標識した塩基Ｕ２３ａ（即ち、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）を用いた（Ａ３）。反応Ｂでは、標識化基質核酸として蛍光標識した塩基Ｃ２３ｂ（即ち、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ）を用いた（Ｂ３）。本明細書において、各略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシンである。また、本明細書において例として挙げる塩基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないので、それらの塩基に限定するものではない。
まず、反応Ａにおいて生じる事象について説明する。
（Ａ１）プローブ核酸鎖２２ａを固相化したキャピラリーにターゲット核酸２１ａを含む試料を添加する。
（Ａ２）当該キャピラリー内の条件をハイブリダイゼーションが生じるのに適切な条件とする。これにより、ターゲット核酸２１ａとプローブ核酸２２ａがハイブリダイズする。
（Ａ３）次に、Ｃｙ３で標識したｄＵＴＰ２３ａを基質として添加し、キャピラリー内を伸長反応が生じるのに適切な条件とする。その結果、ｄＵＴＰ２３ａは、プローブ核酸２２ａに取り込まれ、プローブ核酸２２ａの伸長が起こる。
次に、反応Ｂにおける事象を説明する。
（Ｂ１）プローブ２２ｂを固相化したキャピラリーにターゲット核酸２１ｂを含む試料を添加する。
（Ｂ２）当該キャピラリー内の条件をハイブリダイゼーションが生じるのに適切な条件とする。これによりターゲット核酸２１ｂとプローブ核酸２２ｂがハイブリダイズする。
（Ｂ３）次に、Ｃｙ３で標識したｄＣＴＰ２３ｂを基質として添加し、キャピラリー内を伸長反応が生じるのに適切な条件とする。その結果、ｄＣＴＰ２３ｂは、ターゲット核酸２１ｂの「Ｎ」の位置の塩基に相補性がないために、ハイブリダイズは生じず、プローブ核酸２２ｂの伸長は起こらない。
ここでは、ターゲット核酸２１ａおよびｂは選択用配列に相補的な配列を含み、且つその相補的配列の５’側に選択用配列および相補鎖とは異なる配列を含む。一方、プローブ配列２２ａおよびｂは選択用配列を有する。続く、プローブ核酸２２ａおよびｂの３’端の伸長は、そこにハイブリダイズしているターゲット核酸の選択用配列に相補的な配列よりも５’側の配列を鋳型として達成される。
上記のようなキャピラリー形状の反応容器を使用すると、使用する試料および試薬も微量で済むという利点がある。しかしながら、本発明において使用される反応容器は、キャピラリー形状に限られるものではない。また、上記の例では１つの反応容器に１本のキャピラリーが具備される装置の例を示したが、これに限定されるものではなく、１つの反応容器に複数のキャピラリー形状などの内部形状を有する反応部を有する反応容器を用いてもよい。
上記の模式図では、便宜上、１つのプローブ核酸について示したがこれに限定するものではない。また、プローブ核酸の配列は上記の配列に限定するものではなく、所望に応じて任意に選択し得る。また、複数の異なる配列をそれぞれに有するプローブ核酸を１つの基体において用いてもよく、同じ種類のプローブ核酸を複数使用してもよい。
以上のような本発明の態様に従うと、ターゲット核酸に含まれる標的部位の塩基の決定に加えて、同時に、プローブ核酸へのラベル付与を容易に行うことも可能である。
第３の実施例
第２の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第３の実施例を実施した。
また、第２の実施例において使用した伸長反応液Ａとして［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄｄＵＴＰ］を用い、伸長反応液Ｃとして［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄｄＣＴＰ］を用いたこと以外の条件は第２の実施例の記載と同様にして反応を行った。
この反応の結果を表２に示す。表２は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値で示している。
表２の結果に示されるように、キャピラリー１とキャピラリー４の蛍光強度が大きい。この結果から、キャピラリー１とキャピラリー４に伸長が生じ、これに対してキャピラリー２とキャピラリー３では伸長は生じていないことが分かる。従って、キャピラリー１に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、アデニンであり、キャピラリー４に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、グアニンであることが判定される。
このように、加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類と、伸長の有無から試料ターゲットの「Ｎ」の塩基が決定された。
上記の例では、本発明の態様に従う方法を説明するために、便宜上、その配列を予め分かっているターゲット核酸、即ち、ＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）とＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を用いた。同様に、標的部位の塩基の不明な配列についても、その塩基を決定することが可能である。このような態様により、遺伝子の変異を検出したら、多型の遺伝子型を決定することが可能である。
第４の実施例
遺伝子の変異を解析する方法のもう１つの例を示す。ここでは、第４番目の塩基「Ｎ」が不明である試料ｔｇｃＮｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃターゲット核酸について、その「Ｎ」がアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであるのかを決定する。
第１の実施例に記載した形態の反応容器を用いて、第４の実施例を実施した。使用した反応容器は以下のように製造した。
即ち、第１の基板には、ガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を１本形成し、この溝の両端に貫通孔を形成した。第２の基板には、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）を用いた。このストレプトアビジンコートスライドに対して、５’末端をビオチン標識したＲＶプローブ（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）を点着装置を用いて固相化した。固相化は、第１および第２の基板を接合した時に、前記４本の溝に相当する夫々の位置に、ＲＶプローブが配置されるようにした。
このような第１の基板と第２の基板を接合し、前記溝によって１本のキャピラリーを形成した。
前記のキャピラリーに、ターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。これらについて、３７℃で１時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のターゲット核酸をキャピラリー内から取り除いた。
次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液Ａ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、並びに１０μＭの６−ＦＡＭ−ｄＵＴＰ、１０μＭのＨＥＸ−ｄＡＴＰ、１０μＭのＴＡＭＲＡ−ｄＣＴＰおよび１０μＭのＲＯＸ−ｄＧＴＰを前記キャピラリーに加え、これらを３７℃で１、２時間反応した。
反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を取り除き蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、励起光として４８８ｎｍと５１４ｎｍに強いレーザー光を発するアルゴンレーザを使用し、標識物質として用いた夫々の蛍光物質に応じた波長で蛍光強度を測定した。使用した蛍光物質の波長は、６−ＦＡＭは５１３ｎｍ、ＨＥＸは５６０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは５８０ｎｍおよびＲＯＸは６１０ｎｍである。
このように４種類の蛍光物質を標識物質として使用することによって、１キャピラリー内で効率的に標的部位の塩基を決定することが可能である。
第５の実施例
第４の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第５の実施例を実施した。第４の実施例に記載した方法と同様に、ターゲット核酸をハイブリダイズした。次に、第４の実施例において使用した伸長反応液に変えて、次の伸長反応液［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を用い、他の条件は第４の実施例の記載と同様にして伸長反応を行った。
この反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＣｙ３−Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸長されない。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＧまで伸長された。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されない。
このようにして、変異の有無を検出することができる。
第６の実施例
第６の実施例を模式図である図３を用いて説明する。本例では、それぞれに異なる選択用配列を有する第１、第２および第３のプローブ核酸３ａ、３ｂおよび３ｃを固相化した以外は第５の実施例と同様に作成した反応容器３０を使用する。３Ａに示す通り、それぞれのターゲット核酸３１ａ〜３１ｃに含まれる標的部位の塩基を便宜上「Ａ」として示した。
第５の実施例において記載した方法に従って、先ず、３Ｂに示すようにターゲット核酸３１ａ〜３１ｃをプローブ核酸３２ａ〜３２ｃに対してハイブリダイズし、次に、３Ｃに示すように伸長反応を行う。続いて、３Ｃにおいて、反応部３５を例えば、約９５℃に温度を上昇させ、伸長したプローブ核酸３６からターゲット核酸３１を解離させ、反応部３５を具備するキャピラリー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排出することにより内容液をフローする。それにより、解離したターゲット核酸を除去して、３Ｄに示すように、伸長され標識されたプローブ核酸３６ａ、３６ｂおよび３６ｃをそれぞれ１本鎖として得ることが可能である。
上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段として熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するものではない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホルムアミド等を用いてもよい。
また、ターゲット核酸がＲＮＡであり、プローブ核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅＨなどを用いて行ってもよい。
上記では３種類のプローブ核酸とターゲット核酸の例を示したが、これ以上または以下の種類のプローブ核酸および／またはターゲット核酸を用いてもよく、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。
また、本例では２本鎖核酸を１本鎖核酸としてから蛍光強度を測定したが、二本鎖のままで蛍光強度を測定してもよい。同様に本明細書に開示した他の例についても１本鎖核酸としてから蛍光強度を測定してもよい。
本発明の態様に従うと、上述した第１の実施例から第６の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一部を変更して実施してもよい。
本発明の更なる側面に従うと、上述のような第６の実施例に示すような本発明の態様により得られた１本鎖標識化プローブ核酸も本発明の更なる態様として提供される。
例えば、本発明の態様に従って得た伸長され標識されたプローブ核酸を、１本鎖にした後に、更なる標識化プローブ核酸として、後述する第７の実施例として記載するようなヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用することも可能である。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされている。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされている。しかしながら、本発明の態様に従うと、ヌクレオチドの伸長反応を制御できるので、最終的に得られる更なるプローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。従って、ヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用するためのプローブ核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。
第７の実施例
ヌクレアーゼプロテクションアッセイへの利用
核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＳ１ヌクレアーゼは、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、ＤＮＡおよびＲＮＡともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに分解する。また２本鎖中の１本鎖部分にも作用し、これを分解する酵素である。また、この酵素はＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼＩも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌクレオチドにする。これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられている（図４）。
ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、固相化したプローブ核酸をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーション後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法である。例えば、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテクションされるので標識が保護されるのに対し、未反応のプローブ核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解されるので標識が遊離してしまう。従って、そのプロテクションされたプローブ核酸の標識量を、プローブ核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方法である（図５）。
このようなヌクレアーゼプロテクションアッセイを本発明の一部として変異解析のために利用することも可能である。例えば、第６の実施例に記載する方法により得た１本鎖標識化プロープ核酸を用いてヌクレアーゼプロテクションアッセイにより核酸を解析してもよい。また、第２から第５の実施例に記載する方法により得た２本鎖標識化プローブを第６の実施例に記載するような手段により１本鎖して得られた１本鎖標識化プローブ核酸を用いてもよい。また、そのようにして得られた１本鎖標識化プローブ核酸は、本発明の態様に従って得られたままで、即ち、基体に固相化されたままでヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用してもよく、或いは基体から遊離させ回収して利用してもよい。更に、回収した後に生成した後に使用してもよい。
本発明の更なる態様を、図６の模式図を用いて説明する。まず、第６の実施の態様に記載した方法と同様に、蛍光強度の検出以前の段階まで、即ち、図６の６Ａから６Ｄまでを行う。これにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸が得られる（６Ｄ）。
次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応する。６Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合それらはハイブリダイズする。即ち、前記標的核酸を含むターゲット核酸８７ａおよび８７ｂと標識化プローブ核酸８６ａおよび８６ｂがそれぞれハイブリダイズする。その後、６Ｆに示すように、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する。その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった標識化ターゲット核酸８６Ｃは分解される（６Ｇ）。続いて、反応部８５内の容器をフローさせ、分解された核酸を除去し（６Ｇ）、蛍光強度を検出する（６Ｈ）。
本態様により使用されるヌクレオチドプロテクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、適宜決定されればよい。
ここに示した態様では、プローブ核酸の伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションアッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るものではなく、上述したプローブ核酸の伸長および標識化により得られた更なる伸長され標識されたプローブ核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸として予め作成し、所望に応じてヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用してもよい。
キャピラリー形状の反応容器を用いる場合の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定までの処理を自動化できる可能性が大きいことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場合、そこに含まれる溶液を容易に置換することが可能であることも更なる利点である。
上述したような本発明の態様によって得られた標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイは次のような利点を得ることが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるのでハイブリダイゼーション前のプローブ核酸の固相量を予め知ることが可能である。即ち、プローブ核酸の固相の量や点着スポットの状態を反応前に知ることが可能である。従って、プローブ核酸の固相の精度管理が可能である。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを避ることが出来る。
第８の実施例
本発明の更なる側面に従うと、１プローブ核酸に対して、複数回、ターゲット核酸を含む被検試料を繰り返し処理することも可能である。
第１の実施例に記載した反応容器と同じ構成を有する反応容器１を使用し、本発明の態様に従い２回繰り返して処理する場合の例について、各工程における各分子の状態を模式的に示した図７を用いて説明する。
まず、プローブ核酸９２を反応部９５の底面９４に固相化する。次に、反応部９５に対して、第１のターゲット核酸９１ａと第１の蛍光標識化基質核酸９３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（７Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の標的部位（図７では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（７Ｃ）。
或いは、上記のハイブリダイゼーションの際に、蛍光標識化基質核酸９３ａおよび非標識化基質核酸は添加せずに、最初に、プローブ核酸９２と第１のターゲット核酸９１ａとをハイブリダイズし、その後、両基質核酸とポリメラーゼを添加して伸長反応を行ってもよい。
ここで、所望の箇所、即ち、第１の標的部位の次の塩基で伸長反応を停止するためには、例えば、第１の標的部位の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰを添加しないという手段を用いればよい。
続いて、７Ｃに示すように、反応部９５に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５℃に温度を上昇させ、伸長されたプローブ核酸９６ａからターゲット核酸９１ａを解離させる。反応部９５を具備するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液などを注入し排出することによって内容液をフローして解離核酸を除去する。その結果、７Ｄに示すように、伸長され標識されたターゲット核酸９６ａが１本鎖として得られる。
続いて、７Ｅに示すような第２のターゲット核酸９１ｂと第２の蛍光標識化基質核酸９３ｂ（ここでは例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で、伸長され標識されたターゲット核酸９６ａに対して加えハイブリダイゼーションを行う（７Ｇ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の標的部位（図７では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（７Ｈ）。続いて、更に伸長され標識された第２のプローブ核酸９６ｂについて、第１の蛍光物質および第２の蛍光物質の蛍光強度を測定する（７Ｈ）。
或いは、上記のハイブリダイゼーションの際に、蛍光標識化基質核酸９３ｂおよび非標識化基質核酸は添加せずに、最初に、プローブ核酸９６ａとターゲット核酸９１ｂとをハイブリダイズし、その後、両基質核酸とポリメラーゼを添加して伸長反応を行ってもよい。
この態様においては、第２の標的部位の次の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸長しても、第２の標的部位まで伸長することも可能である。
また、上記の例では、プローブ核酸の伸長において、第１の標的部位と第２の標的部位の間に１の塩基が配置される例を示したが、これに限定するものではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以上の塩基が配置されてもよい。
７Ｈに示すように、得られた伸長され標識されたプローブ核酸９６ｂに含まれる第１の蛍光物質（図７では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図７ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望ましく、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが望ましい。また、検出される蛍光強度の違いによって、判定する場合や、使用する検出手段の選択によっては、必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
また更に、得られた伸長され標識されたプローブ核酸９６ｂを１本鎖に変性し、上述した方法の更なる繰り返しを行ってもよい。
本発明の態様に従うと、効率のよい遺伝子変異解析方法が提供される。
本発明の態様に従うと、反応容器内で、検出するべき標的部位を含むターゲット核酸とハイブリダイゼーションしたプローブ核酸についてのみ選択的に標識化することが可能である。従って、効率のよい遺伝子変異解析が可能であると共に、プローブ核酸の標識化を効率的に行うことも可能であり、且つ反応容器の製造コストも安価なものとなる。
本発明の態様に従うと、遺伝子の変異の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能である。
本発明の態様に従うと、標識化から発現頻度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行うことが可能である。
２． 遺伝子の発現解析方法
２．１ 遺伝子の発現解析方法の概要
本発明に従うと、被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法が提供される。そのような被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法の１態様を図８を用いて説明する。
まず、検出したい標的配列を有するターゲット核酸１０２を設定する。一方、前記標的配列に相補的な配列を有し、且つその配列の一部の塩基に標識物質を付与されたプローブ核酸１０１を準備する（８Ａ）。次に、プローブ核酸１０１を反応部１０５の底面１０４に固相化する。プローブ核酸１０１を固相化された反応部１０５に被検核酸を添加し（８Ｂ）、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、それらを反応させる（８Ｃ）。ここで、被検核酸中に標的配列を有するターゲット核酸が存在すれば、ハイブリダイゼーションが生じ、２本鎖核酸が生じる。
続いて、１本鎖特異的ヌクレアーゼを添加し、適切な酵素反応が得られる条件下で反応を行う（８Ｄ）。その結果、１本鎖のままのプローブ核酸およびターゲット核酸などの当該反応系に存在する１本鎖核酸は当該酵素によって分解される。この酵素反応の後、反応系を洗浄し、そこに残った２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出し、それによって被検核酸中に標的配列を有するターゲット核酸が存在することを検出する。
また、このとき、被検核酸を対象から採取した核酸を含む試料とし、上述の通りに検出を行うことによって、対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法としても提供される。
本発明で利用されるヌクレオチドプロテクションアッセイにおいては、ヌクレアーゼによる分解反応中にヌクレアーゼを含む液体を流動させる工程を加えてもよい。この流動によって、ヌクレアーゼは固相化された多種類のターゲットに対応する標識化プローブ核酸に対して均質な分解作用をする。さらに、キャピラリーアレイのような流路の一方向にヌクレアーゼを含む溶液を連続的ないし断続的に流動させるようにすれば、分解反応と除去とを継続して実行することができるし、静止状態に起こるような酵素活性の低下も起こることなく活性状態を維持することができる。一方、本発明で利用されるヌクレオチドプロテクションアッセイにおいては、試料との反応前および反応後の両方の標識量を測定し、両方の標識量を比較することによって真の固相量に基づく反応量を正確に産出する工程を付加することもできる。
このような反応において使用される１本鎖特異的ヌクレアーゼは、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であり、１本鎖の核酸を選択的に分解する酵素である。その１つであるＳ１ヌクレアーゼは、ＤＮＡおよびＲＮＡともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに分解する酵素である（図４）。また、２本鎖中の１本鎖部分にも作用しこれを分解する。この酵素はＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼＩも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌクレオチドにする。従来、これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられている。
従来のヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、固相したプローブ核酸をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーション後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法である。例えば、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテクションされるので標識が保護されるのに対し、未反応のプローブ核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解されるので標識が遊離してしまう（図５）。従って、そのプロテクションされたプローブ核酸の標識量を、プローブ核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方法である。このような従来のプロテクションアッセイの例は、例えば、特表２０００−５１２４９９（米国特許５，７７０，３７０の日本での公表公報）に記載されている。
前記文献に記載されるような従来の方法に比較して、本発明は以下のような効果を有する。本発明の態様に従うと、上述したような本方法は、好ましくは後述するような温度制御の可能なキャピラリー形状の反応部を具備する反応容器中で行われる。キャピラリー形状の反応部を具備する反応容器を使用することにより、反応前の操作（例えば、固相化や標識化）を同一のキャピラリーで実行することによって、効率的に全ての操作および反応を行うことが可能である。また、従来では必要であった煩雑な操作も不要になり、必要な試料の容量も微量ですむ。また、全ての反応について、小型の容器で一括して行うことが可能であるので自動化が可能である。また、本発明の態様に従うと、反応前のプローブの固相化の状態をモニターすることが可能である。更に、従来のＤＮＡアレイで行われるような競合反応により解析を行うのと異なり、本発明の態様では、他検体同士での比較や、キャピラリー間での比較、また、プレート間での比較が可能である。また、逆転写酵素でｃＤＮＡを作成したり、ラベルする作用で生じる効率の低下などを回避することが可能である。
上述したように、本発明に従う発現解析方法は、図１に示すようなキャピラリー形状の反応部２を具備する反応容器１内において実施されることが好ましい。
本発明において使用される「対象」の語は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む任意の哺乳動物、爬虫類、魚類および昆虫などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
本発明において使用される「被検核酸」の語は、標的配列の存在の検出対象となる核酸である。被検核酸は、自然界に存在する如何なる核酸であっても、人工的に作られた核酸であってもよい。例えば、遺伝子の発現頻度を解析する場合には、一般的には対象において発現されるｍＲＮＡが被検核酸であってよい。
対象から被検核酸を得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能であり、例えば、被検核酸がｍＲＮＡである場合には、例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを使用してもよい。しかしながら、これらの手段に限定されるのもではない。また、被検核酸は、対象から抽出された後に、それ自身公知の方法によって増幅されて本発明の態様に従う方法に供されてもよい。
また、標識されたプローブ核酸を得る場合に使用する「鋳型核酸」および「種プローブ核酸」もどのような核酸であってもよい。ここにおける「核酸」は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などであってもよく、その塩基配列および修飾の有無などは任意に選択すればよい。
本発明において使用される「標的配列」の語は、検出されるべき塩基配列を示す。ここで使用される「ターゲット核酸」の語は、検出されるべき塩基配列、標的配列を含む核酸を示す。
本発明において使用される「プローブ核酸」の語は、標的配列を検出するための核酸を示し、標的配列に相補的な塩基配列をその一部に含む核酸である。また、ここで使用される「標識化プローブ核酸」の語は、その配列の一部分の塩基に標識物質が付与されている核酸を示す。本発明の態様に従うプローブ核酸は、その５’末端を介して基体に固相化されている。プローブ核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所望のプローブ核酸を固定することによって行うことが可能である。
本発明の態様に従って使用され得る「基体」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の基体であってもよい。あるいは、「基体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。処理の容易さから、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ましい。
キャピラリー形状の反応部を有した反応容器の場合、例えば、シリコン基板またはガラス基板などの基体に、幅および厚さ約１０〜約５０μｍで形成された溝によりキャピラリー形状の反応部が形成されてもよい。また、１反応容器に具備されるキャピラリー形状の反応部は、例えば、キャピラリー間隔約５０μｍで１反応容器に約５０〜約１００本／ｃｍの本数で具備されてもよい。また、各々のキャピラリーは反応温度に素早く到達できるような構成であることが好ましい。
本発明において使用される「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いてもよい。また、異なる部位に存在する複数の核酸を標的配列として検出する場合や、複数のプローブ核酸を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよい。
本発明の方法において使用される１本鎖特異的ヌクレアーゼは、１本鎖核酸を分解することが可能な酵素であればよい。そのような酵素は、それ自身公知の何れの酵素を使用してよく、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼＩなどを使用することが可能である。
２．２ 標識化プローブ核酸の調製方法
本発明では、プローブ核酸の所望の部位に対して標識物質を付与する際に使用されるそれ自身公知の何れの手段も、本発明において使用される「標識化プローブ核酸」を調製する際に使用してよい。また、以下において説明する標識化プローブ核酸の調製方法を、上述の遺伝子発現解析方法で使用される「標識化プローブ核酸」を調製する際に使用してもよい。以下、図９を用いて「標識化プローブ核酸」を調製する方法を説明する。
先ず最初に、鋳型捕獲用配列を有する種プローブ核酸１２２を、その５’末端を介して反応部１２５の底面１２４に固相化する。次に、鋳型核酸１２１を反応部１２５に添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件、例えば、厳格な（ストリンジェンシーな）条件、で反応を行う。ここで、鋳型核酸１２１は、その３’端側に鋳型捕獲用配列に相補的な配列ａを、配列ａの５’側の隣りに被標識配列ｂを、更に被標識配列ｂの５’側の隣りに伸長配列ｃを含む（９Ａ）。このような構成によって、鋳型核酸１２１は、種プローブ核酸１２２に対してハイブリダイズする。図９には、被標識配列ｂが「Ａ」即ちアデニンである場合を示す。
ハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイゼーションに使われなかった鋳型核酸１２１を除去する。
続いて、反応部１２５に対して、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸１２３と、伸長配列ｃに相補的な塩基を含む非標識化デオキシヌクレオシド三リン酸１２７および１２８と、ポリメラーゼとを反応部に添加し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う（９Ｄ）。伸長反応終了後、伸長反応に使用されなかった基質を除去する。その後、得られた２本鎖を変性し、鋳型核酸１２１を除去する。それにより標識されたプローブ核酸１２６が得られる。得られた標識されたプローブ核酸１２６は、反応部１２５に固相化されたままの状態で使用しても、回収してから使用していよい。
また、上述の例では、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応の後に、反応に供されなかった物質を除去している。しかしながらこれらの除去は必ずしも行う必要はない。
ここで、鋳型核酸の長さは、目的とする標識されたプローブ核酸の長さに応じて変更すればよい。例えば、鋳型核酸の長さは１０塩基から１０００塩基でよく、好ましくは１５塩基から２００塩基であればよい。
種プローブ核酸の長さは、１０塩基から５０塩基でよく、好ましくは１５塩基から３０塩基であればよい。また、上記の例では被標識配列がアデニンの例を示したが、これに限定するものではなく、シトシン、ウラシル、チミン、グアニン何れであってもよい。
伸長配列は、種プローブ核酸に標識化基質が取り込まれた後に、続いて取り込まれる非標識化基質の種類および長さを決定する配列である。従って、実施者が任意に選択することが可能である。しかしながら必ずしも伸長配列が存在する必要はなく、伸長配列が存在しない場合には、標識化基質が種プローブ核酸の末端に存在する。伸長配列の長さは、１塩基から５０塩基であればよく、好ましくは１塩基から１０塩基である。
本発明に従うと、以下の［１］〜［６］に記載の態様も本発明として好ましく提供される。
［１］ 以下の工程により得られる標識化プローブ核酸：
（１）種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼの存在する条件下で、前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程で得られた２本鎖を解離することにより、１本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
［２］ 以下の工程により得られる標識化プローブ核酸：
（１）第１の種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記第１の種プローブ核酸に相補的な第１の相補配列と、この第１の相補的配列の５’側に存在する第１の被標識配列と、第１の被標識配列の５’側に存在する第１の伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記第１の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された第１の標識化基質核酸と、前記第１の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非標識基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（１）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記第１の種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することにより、第２の種プローブ核酸を得る工程と、
（４）前記（３）で得られた第２の種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記第２の種プローブ核酸の３’側の一部の配列に相補的な第２の相補的配列と、この第２の相補的配列の５’側に存在する第２の被標識配列と、第２の被標識配列の５’側に存在する第２の伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（５）前記第２の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含んでおり標識物質を付与された第２の標識化基質核酸と、前記第２の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非標識基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（４）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記第２の種プローブ核酸を伸長する工程と、
（６）前記（５）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することによって１本鎖として標識化プローブ核酸を得る工程。
［３］ 前記（６）の工程で得られた標識化プローブ核酸を種プローブ核酸として用いて、前記（４）の工程から（６）の工程を任意の回数だけ繰り返すことにより得られることを特徴とする上記［２］に記載の標識化プローブ核酸。
［４］ 前記種プローブ核酸がその５’末端を介して基体に固相化されていることを特徴とする上記［１］から［３］の何れか１に記載の標識化プローブ核酸。
［５］ 上記［１］から［４］の何れか１に記載の標識化プローブ核酸を用いることを特徴とし、以下の工程を含む、被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。
［６］ 上記［５］に記載の（１）の工程において使用される標識物質を付加された標識化プローブ核酸が、以下の工程により製造されることを特徴とする、上記［５］に記載の被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法：
（ｉ）種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、種プローブ核酸に対して反応させる工程と、
（ｉｉ）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼの存在する条件下で、前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた２本鎖を解離することにより、１本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
２．３ 実施例
本発明の遺伝子の発現解析方法は、上述の第１および第２の実施例で記載される反応容器に、検出したい標的配列に相補的な配列を含む標識化プローブ核酸を固相化して行うことができる。
第９の実施例：ヌクレアーゼプロテクションアッセイ１
本発明の態様に従う被検核酸中の標的配列の存在を検出方法の例を図１０を用いて説明する。
それ自身公知の何れかの手段により、所望する部分に対して標識物質を付与されたプローブ核酸を準備する。このような標識化プローブ核酸を第１の実施例に示す反応容器と同様の反応容器の底面に固相化する（１０Ｄ）。
例えば、これに限定されるものではないが、種プローブ核酸１６２ａから１６２ｃを反応容器の反応部１６５の底面１６４に固相化し（１０Ａ）、鋳型核酸１６１ａから１６１ｃと、蛍光標識化基質核酸１６３（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えてハイブリダイゼーションを行い（１０Ｂ）、ポリメラーゼを添加して所望の塩基まで伸長反応を行い、更に加熱しながらまたは加熱後にフローを行って一本鎖とし（１０Ｃ）、所望する標識化プローブ核酸１６６ａから１６６ｃを合成してもよい（１０Ｄ）。また、ここでは、ハイブリダイゼーション時に蛍光標識化および非標識化基質核酸を存在させたが、ハイブリダイズ終了後のポリメラーゼ添加と共に蛍光標識化および非標識化基質核酸を添加してもよい。
次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応する。１０Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合、ハイブリダイゼーションが生じる。ここで示す例は、前記標的配列を含むターゲット核酸１６７ａおよび１６７ｂとプローブ核酸１６６ａおよび１６６ｂが、それぞれにハイブリダイズしている（１０Ｅ）。
その後、１本鎖特異的ヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する（１０Ｆ）。その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった１本鎖のプローブ核酸１６６ｃは分解される（１０Ｇ）。次に、反応部１６５内の内容物をフローさせ、分解された核酸を除去する（１０Ｇ）。続いて、反応部１６５について蛍光強度を検出する（１０Ｈ）。
本態様により使用されるヌクレオチドプロテクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、適宜決定されてよい。
ここに示した態様では、種プローブ核酸の伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションアッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るものではない。予め、上述した種プローブ核酸の伸長および標識化により得られた、更なる伸長され標識されたプローブ核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸として作成しておき、所望の時期にヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用してもよい。また、他のそれ自身公知の方法によって所望の位置に標識を付与した１本鎖標識化プローブ核酸を使用してもよい。
上述したような本発明の態様に従う標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを次のような有利点をもって行うことが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるので、ハイブリダイゼーション前に、予めプローブ核酸の固相量を知ることが可能である。即ち、固相化されたプローブ核酸量や点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。それによって、プローブ核酸の固相について精度管理を行うことが可能になる。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを回避することが可能である。
キャピラリー形状の反応容器を用いる場合の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定までの処理を行えるため、装置を自動化できる可能性が大きいことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場合、そこに含まれる溶液の置換も容易である。
第１０の実施例：ヌクレアーゼプロテクションアッセイ２
まず、第１の実施例と同様の方法により反応容器を形成した。第１の基板に、ガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を形成し、この溝の両端にそれぞれ貫通孔を形成した。第２の基板は、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）である。
ストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン社製）に対して、５’端をビオチン標識し、且つ３’端から１０番目のＴをＣｙ３標識したＰＲＨ−ＨＰＲＴ１Ｍ．ＢＤ｛ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣ（Ｔ−Ｃｙ３）ＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号４）｝を１０ｎＭで点着装置を用いてスポッティングした。これによりビオチン−アビジン反応でプローブ核酸が固相化された。続いて、第１の基板と第２の基板を接合した。
上述のようにして作成した反応容器に前記溝によって形成されたキャピラリー内に、ターゲット核酸として１０ｎＭのＰＲＨ−ＨＲＲＴ１ＲＶ．０（ＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＡＧＣＣＣＣＣ（配列番号５））を添加した。このとき、溶媒としては１×ＳＳＣ溶液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）を使用した。これを４２℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液で十分に洗浄し、未反応のターゲット核酸を当該キャピラリーから除去した。次に、Ｓ１ヌクレアーゼ溶液（３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＺｎＳＯ４の緩衝液中）をキャピラリー内に添加し、３７℃で１時間反応した。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を除去して蛍光強度を測定した。表３にＰＲＨ−ＨＰＲＴ１ＲＶ．０ターゲット核酸を濃度１０ｎＭで存在させた場合と、当該ターゲット核酸を存在させなかった場合に得られる蛍光強度を相対的に示した。
表３中の蛍光強度は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値である。表から分かるように、本態様に従う方法によると、定量的にターゲット核酸の検出を行うことが可能である。
本発明の態様に従うと、反応容器内で、標的配列を有するターゲット核酸にハイブリダイズしたプローブ核酸についてのみ、その標識物質からの信号が選択的に検出される。従って、効率のよい遺伝子発現頻度解析が可能である。
本発明の態様に従うと、遺伝子の発現頻度の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能である。また、本発明の態様に従うと、標識化から発現頻度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行うことが可能である。
本発明に従う遺伝子の発現頻度の解析は、従来の解析方法のような競合反応ではないので、他検体などについて検出を行った反応容器との間で比較をすることができる。即ち、複数の反応容器間（例えば、キャピラリー間や、プレート間など）での比較が可能である。
また、プローブ核酸の固相状況を把握することが可能であるので、プローブ核酸の固相量や、点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。従って、プローブ固相の精度管理が可能である。
第１１の実施例：標識化プローブの製造１
上述のような第１の実施例に示すような反応容器を用いて、次の実験を行った。
前記キャピラリー内に、鋳型核酸として前記ＲＶ核酸の配列に相補的なＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加し、３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応の鋳型核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を前記キャピラリー内に添加し３７℃で１〜２時間反応させた。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄して未反応物を取り除き蛍光を測定した（表４）。
表４は、種プローブ核酸の基体への点着量を１０ｎＭまたは１ｎＭとした場合に、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしとした場合に得られる蛍光強度を示す表である。表中の蛍光強度は、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値である。
表４に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、種プローブ核酸への標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、種プローブ核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。
このような反応により生じる現象を、図９に模式的に示した。本反応では、９Ａに示すように、鋳型核酸１２１として５’末端をビオチン標識したＲＶ核酸（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）１２１を、プローブ核酸１２２としてＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を使用した。また、被標識配列ｂはそこに存在する塩基をＡとし、それに相補的な塩基を含む標識化基質核酸としては蛍光標識した塩基Ｕ２３を用いた（９Ａ）。本明細書において、各略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシンである。また、本明細書において例として挙げる塩基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないので、それらの塩基に限定するものではない。
また、鋳型核酸１２１は、捕獲用配列ａを含み、且つその捕獲用配列ａの５’側に被標識配列ｂを含む。この捕獲用配列ａによって、種プローブ核酸１２２とのハイブリダイゼーションが達成される。続く、種プローブ核酸１２２の３’端の伸長は、鋳型核酸１２１の捕獲用配列ａよりも５’側の配列を鋳型として達成される。更に、その鋳型核酸１２１の捕獲用配列ａよりも５’側に含まれる被標識配列ｂの塩基に対して、標識化基質１２３がハイブリダイズして取り込まれることによって、標識化が達成される。
ここでは１塩基の被標識配列を用いた例を示したが、被標識配列は１塩基のみを含むものに限らず、連続した複数の塩基を含んでいてもよく、または断続的な複数の塩基であってもよい。
このようなプローブ核酸の標識化は、上述のようにキャピラリー形状の反応容器を使用すると、必要とされる試料および試薬の量が微量でよいという効果が得られる。
以上のような本発明の態様に従うと、プローブ核酸の標識化を容易に行うことが可能である。本態様に従うと、所望する特定の配列を有するプローブ核酸の特定の塩基を選択的に標識することが可能であり、これによって、被検試料中に含まれる被検核酸に標的配列が存在するか否かを判定することが可能である。それにより、遺伝子の発現頻度を解析することが可能である。また、上述のような方法により標識化したプローブ核酸も本発明の範囲内である。
第１２の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法２
第１の実施例に記載した反応容器を用いて、伸長反応液を変更したこと以外は第１１の実施例に記載の方法と同様に標識化プローブ核酸を作成した。
第１１の実施例において使用した伸長反応液に変えて、次の伸長反応液｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む｝を用い、他の条件は第１１の実施例の記載と同様にして標識化プローブ核酸を作成した。
その反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用いた場合には、種プローブであるＲＶ核酸はその３’端からＣｙ３−Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸長されなかった。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶ核酸はその３’端からＧまで伸長された。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されなかった。
表５は、種プローブ核酸の基体への点着量を１０ｎＭと１ｎＭとし、且つＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしの場合について、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値を示す。
表５に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、種プローブ核酸への標識基質核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、種プローブ核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。
本発明は、鋳型核酸とハイブリダイズした種プローブ核酸のみを標識化することが可能である。また、鋳型捕獲用配列にハイブリダイズするべき標識化基質核酸以外の基質核酸を、それ以降伸長反応できないようなヌクレオチド（例えば、ｄｄＮＴＰなど）にすれば、或いは反応系に存在させないようにすれば、種プローブ核酸の標識量および伸長程度を制御することができる。
また、種プローブ核酸に取り込まれる標識物質の量は、鋳型核酸の量に依存する。従って鋳型核酸として試料中の被検核酸を使用すれば、特定の条件において発現された核酸の情報を反映した標識化プローブ核酸を作成することが可能である。また、そのような場合には、鋳型核酸の量は、その核酸の発現頻度に依存して変化するので、標識化プローブ核酸を作成すると同時に、鋳型核酸として用いられた標的核酸についての遺伝子発現頻度も同時に測定することも可能である。このような遺伝子発現頻度解析方法は、微量な試料で行うことが可能である。即ち、全ての処理を小型の容器内で、一連の処理として行うことが可能であるので、核酸基質（例えば、ｄＮＴＰなど）の量および必要な試薬の量を低減することが可能であり、また、多検体について短時間に解析することも可能である。
第１３の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法３
第１３の実施例を模式図である図１１を用いて説明する。本例では、それぞれに配列の異なる第１の種プローブ核酸１３２ａ、第２の種プローブ核酸１３２ｂ、および第３の種プローブ核酸１３２ｃを反応部の底部１３４に固相化した以外は第１の実施例と同様に作成した反応容器を使用する。また、１１Ａでは、それぞれの鋳型核酸１３１ａ〜１３１ｃに含まれる被標識配列は便宜上「Ａ」として示した。
本発明に従う標識化プローブ核酸の作成は、以下のように行うことも可能である。先ず、１１Ｂに示すように鋳型核酸１３１ａ〜１３１ｃを種プロープ核酸１３２ａ〜１３２ｃに対してハイブリダイズし、次に、１１Ｃに示すように標識化基質核酸１３３を基質として用いて伸長反応する（１１Ｂ〜１１Ｃ）。続いて、反応部１３５について、例えば、約９５℃に温度を上昇させ（１１Ｃ）、伸長したプローブ核酸１３６から鋳型核酸１３１を解離させ、反応部１３５を具備するキャピラリー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排出することによって内容液をフローさせる。それにより、解離したターゲット核酸を除去し、伸長され標識されたプローブ核酸１３６ａから１３６ｃを１本鎖として得る（１１Ｄ）。
上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段として熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するものではない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホルムアミド等を用いてもよい。
また、鋳型核酸がＲＮＡであり、プローブ核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅＨなどを用いて行ってもよい。
上記では３種類の種プローブ核酸と鋳型核酸の例を示したが、これ以上またはこれ以下の種類の種プローブ核酸および／または鋳型核酸を用いてもよく、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。
本発明の態様に従うと、上述した第９の実施例から第１３の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一部を変更して実施してもよい。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされている。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされている。それに対して、本発明の態様に従うと、ヌクレオチドの伸長反応を制御できる。従って、最終的に得られる更なる標識されたプローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。それにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用するためのプローブ核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。
第１４の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法４
本発明の更なる側面に従うと、１種プローブ核酸に対して、複数回繰り返して異なる種類の鋳型核酸をハイブリさせて伸長処理することも可能である。
第１の実施例に記載する反応容器と同様な反応容器を使用し、本発明の態様に従い標識を２回繰り返して行う場合の例を図１２を用いて説明する。
まず、第１の鋳型核酸１４１と種プローブ核酸１４２と蛍光標識基質核酸１４３ａを用意する（１２Ａ）。次に、種プローブ核酸１４２を反応部１４５の底面１４４に固相化する（１２Ｂ）。次に、反応部１４５に対して、第１の鋳型核酸１４１ａと第１の蛍光標識化基質核酸１４３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えてハイブリダイゼーションを行う（１２Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の被標識配列（図１２では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（１２Ｃ）。
ここで、所望の箇所、即ち、第１の被標識配列の次の塩基で伸長反応を停止するためには、第１の被標識配列の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰを添加しないでおけばよい。或いは第１の被標識配列の次の塩基に相補的な塩基からなる基質をｄｄＮＴＰにしてもよい。
また、上記では、蛍光標識基質核酸１４３ａと非標識化基質核酸の添加をハイブリダイゼーションに先駆けて添加しているが、蛍光標識基質核酸１４３ａと非標識化基質核酸の添加はハイブリダイゼーションの後に、ポリメラーゼの添加と同時またはその前後に行ってよい。
続いて、１２Ｃに示すように、反応部１４５に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５℃に温度を上昇させ、伸長されたプローブ核酸１４６ａから鋳型核酸１４１ａを解離させる。反応部１４５を具備するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液などを注入し排出することによって内容液をフローして解離核酸を除去する。その結果、１２Ｄに示すように、伸長され標識されたプローブ核酸１４６ａが１本鎖として得られる（図１２）。
続いて、１２Ｅに示すような第２の鋳型核酸１４２ｂと第２の蛍光標識化基質核酸１４３ｂ（ここでは例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（１２Ｇ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の被標識配列（図１２では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（１２Ｈ）。更に、鋳型核酸１４２ｂを解離させ、１本鎖を得る。
また、上記では、ハイブリダイズに先駆けて第２の蛍光標識基質核酸１４３ｂと非標識化基質核酸を添加しているが、ハイブリダイズの後で、ポリメラーゼの添加と同時、またはその前後に添加してもよい。
この態様においては、第２の被標識配列の次の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸長しても、第２の標的配列までで伸長を止めてもよい。
また、上記の例では、種プローブ核酸の伸長において、第１の被標識配列と第２の被標識配列の間に１の塩基が配置される例を示したが、これに限定するものではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以上の塩基が配置されてもよい。
１２Ｈに示すように、得られた第２の伸長され標識されたプローブ核酸１４６ｂに含まれる第１の蛍光物質（図１２では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図１２ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望ましく、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが望ましい。しかしながら、検出される蛍光強度の違いによって判定する場合や、使用する検出手段の選択の仕方によっては、必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
また更に、得られた第２の伸長され標識されたプローブ核酸１４６ｂを更に１本鎖に変性し、上述した方法を更に繰り返してもよい。
以下に、具体的な１例を挙げて更に説明する。
まず、第１の実施例に記載の反応容器と同様な反応容器を用いて、ハイブリダイゼーション可能な条件下で第１の種プローブ核酸と第１の鋳型核酸とのハイブリダイゼーションを行う。続いて伸長反応溶液を｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む｝を用いることを除き、第１１の実施例に記載の方法と同様の方法により伸長反応を行う。
このハイブリダイゼーションと伸長反応によって、第１の鋳型核酸の存在およびその配列情報が第１のプローブ核酸の伸長および標識化に反映される。即ち、第１の種プローブ核酸にハイブリダイズした第１の鋳型核酸を鋳型として、第１の種プローブ核酸が伸長され、Ｃｙ３−Ｕが取り込まれ、Ｇの手前まで伸長される。その結果、第１の鋳型核酸にハイブリダイズした第１の伸長され標識されたプローブ核酸が得られる。
次に、温度を約９５℃に上昇させることにより、第１の伸長され標識されたプローブ核酸から第１の鋳型核酸を解離する。更に、反応部に含まれる溶液をフローすることにより、遊離した第１の鋳型核酸を除去する。
続いて、第２の鋳型核酸をハイブリダイゼーション可能な条件下においてハイブリダイズさせ、伸長反応溶液を｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ５−ｄＡＴＰ、０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのｄＴＴＰを含む｝を用いることを除いて第１１の実施例に記載の方法と同様の方法により伸長反応を行う。
上記の反応により、第２の鋳型核酸の存在が反映され、第２の鋳型核酸と第１の伸長され標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが生じ、続いて、更なる伸長および標識化が生じ、第２の伸長され標識されたプローブ核酸が得られる。第２の伸長され標識されたプローブ核酸は、Ｃｙ５−Ａで標識化され、Ｃの手前まで伸長される。
次に、得られた２本鎖を変性して１本鎖にすることにより、標識されたプローブ核酸を得ることが可能である。この標識されたプローブ核酸は、所望によっては基板から回収して使用してもよい。
ここで、Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光強度をそれぞれにまたは相対的に測定することによって、使用した第１の鋳型核酸と第２の鋳型核酸の量または相対量を測定することも可能である。
以上のような本発明の態様に従うと、複数のハイブリダイゼーションおよび標識化に関する全ての処理が、小型の容器内で、一括して、即ち、一連の操作によって行うことが可能である。従って、少ない試料で、所望する遺伝子発現頻度解析を短時間に、簡便に行うことが可能である。また、プローブ核酸の伸長の程度を制御でき、また、所望のプローブ核酸を伸長していく途中の所望の部位に容易に標識を行うことが可能である。
第１５の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法５
本発明の態様に従い使用され得る種プローブ核酸と鋳型核酸とがハイブリダイズした場合の状態の例を、図１３の１３Ａから１３Ｄまでに模式的に示す。
上述した通り、種プローブ核酸１５１は、反応部の底部１５２にその５’末端を介して固相化されている。
１３Ａに示すように、鋳型核酸１５３の全長は、種プローブ核酸１５１の全長よりも長いことが好ましい。それにより、鋳型核酸１５３と鋳型核酸１５１がハイブリダイズした際に、その長さの違いから生じる鋳型核酸１５３の１本鎖の部分を鋳型として、種プローブ核酸１５１の３’末端が伸長される。また、このとき被標識配列は鋳型核酸１５３の１本鎖の部分の最も３’よりに存在することが好ましい。
また、１３Ａおよび１３Ｃに示すように、種プローブ核酸１５１の全長に相補的な配列を、鋳型核酸１５３が含み、その上で、更に余分な配列が鋳型核酸の５’側に含まれるようにしてもよい。
或いは、１３Ｂおよび１３Ｄに示すように、種プローブ核酸５１の一部に相補的な配列を鋳型核酸１５３の３’側が含み、更に余分な配列を鋳型核酸１５３の５’側に含むように設計してもよい。
また、１３Ａおよび１３Ｂに示すように、被標識配列として１ヌクレオチドが１箇所に設定されてもよく、１３Ｃおよび１３Ｄに示すように、被標識配列として１ヌクレオチドが２箇所以上で設定されてもよい。
上述のまた、上述の第１１の実施例から第１５の実施例までの何れかにより得られる標識化プローブ核酸を、上述の第９の実施例および第１０の実施例において用いて、同様にアッセイしてもよい。第１１の実施例から第１５の実施例により得られた１本鎖標識化プローブ核酸は、基体に固相化されたままでヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用されてもよく、或いは基体から遊離させ回収した後に利用してもよい。また、回収して、更に精製した後で使用してもよい。
上述したような本発明の態様によって得られた標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを次のような有利点をもって行うことが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるので、ハイブリダイゼーション前に、予めプローブ核酸の固相量を知ることが可能である。即ち、固相化されたプローブ核酸量や点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。それによって、プローブ核酸の固相について精度管理を行うことが可能になる。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを回避することが可能である。
上述のような本発明によって、効率のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供された。また、上述のような本発明によって、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法が提供された。更に、上述のような本発明によって、検出精度のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供された。
３． 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法
３．１ 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の概要
上記２．２の欄で説明した「標識化プローブ核酸の調製方法」は、別の側面に従えば、標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法ということもできる。以下、標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法について詳説する。当該方法により作成される標識プローブ核酸を固相化した支持体は、核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に有用である。とりわけ、上記２．１の欄で説明した「ヌクレアーゼプロテクションアッセイを利用した遺伝子の発現解析方法」に有用である。
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法について、第一から第三の実施の形態を例に説明する。
第一の実施の形態
本発明の第一の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の３’端の１以上のヌクレオチドが欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む。
第一の実施の形態では、支持体上に作成される各標識プローブ核酸は、その３’側に標識ヌクレオチドが導入される。
以下、各工程について、図１４を参照しながら順に説明する。
［工程（１）］
工程（１）の反応により、図１４（ａ）に模式的に示す状態が作成される。
まず、目的とする解析に応じて、支持体上に作成する標識プローブ核酸の塩基配列をデザインする。一般に標識プローブ核酸の長さは、１５〜５０塩基とすることができる。
デザインされた標識プローブ核酸の塩基配列に基いて、「鋳型核酸２０２」および「未標識プローブ核酸前駆体２０３」を調製する。
ここで、「鋳型核酸２０２」および「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、それぞれ、ＤＮＡを構成するデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、その他ｄＵＴＰ等のヌクレオチドから構成され得る。
「鋳型核酸２０２」は、作成したい標識プローブ核酸に相補的な配列を有するように調製される。一方、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、「鋳型核酸」の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の３’端の１以上のヌクレオチドが欠損するように調製される。この欠損部分に、後の工程で標識ヌクレオチドが少なくとも一つ導入される。ここで、欠損させるヌクレオチドの数は、好ましくは２〜１０個とすることができる。欠損させるヌクレオチドの数を好ましくは２以上とした理由は、標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドに標識が取込まれることを、標識の安定性の観点から避けるためである。また、欠損させるヌクレオチドの数を好ましくは１０以下とした理由は、取込まれる標識ヌクレオチドの数を制限するためである。
欠損させるヌクレオチドの数は、作成したい標識プローブ核酸の３’端側の塩基配列と、欠損部分に後の工程で導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類とを考慮して決定する。例えば、作成したい標識プローブ核酸が、その３’端からＡＡＣＵＡＣＡＵＵＡ・・・という配列を有し、欠損部分に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、「未標識プローブ核酸前駆体」は、作成したい標識プローブ核酸の３’端から４〜７のヌクレオチドを欠損させることができる。この場合、標識ヌクレオチドＣｙ５−ｄＵＴＰは、欠損部分に一つだけ導入されることになる。このように、「未標識プローブ核酸前駆体」に一つの標識ヌクレオチドのみが導入されるように、欠損させるヌクレオチドの数を制御すれば、ＤＮＡアレイ上のすべての標識プローブを同じ標識物質の量で均一に標識することが可能である。
「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、その５’端で支持体２０１に固相化されている（図１４（ａ））。本発明の方法において「支持体２０１」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の支持体であってもよい。あるいは、「支持体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。キャピラリー形状の反応部を有した反応容器（以下、キャピラリーアレイともいう）は、反応部内の溶液を置換することが容易であるため好ましく使用される。キャピラリーアレイの具体的な説明については、上述の第１および第２の実施例の記載を参照することができる。ここで用いた「支持体」の用語は、上記「基体」と同じ意味を有する。
「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の支持体への固相化は、従来公知の方法により行うことができる。例えば、核酸の固相化は、後述の実施例のようにアビジンコートされた支持体と、ビオチン標識された５’端を有する核酸とを用いてビオチンアビジン反応により行ってもよいし、あるいは、反応基を導入した支持体と、該反応基と反応性を有する反応基を５’端に有する核酸とを用いて化学結合により行ってもよい。
工程（１）において、「鋳型核酸２０２」と、支持体２０１上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体２０３」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１４（ａ）参照）。ここでのハイブリダイゼーションは、「鋳型核酸」と、支持体上に固相されていない「未標識プローブ核酸前駆体」とをハイブリダイズさせた後に、支持体上に固相してもよいし、「鋳型核酸」と、支持体上に予め固相した「未標識プローブ核酸前駆体」とをハイブリダイズさせてもよい。
「ハイブリダイズ可能な条件下で反応させる」とは、例えば適切なハイブリダイゼーション溶液（１×ＳＳＣ）中で、２５〜７０℃で（または９５℃で５分間ののち徐冷して２５〜７０℃で）５〜６０分間静置させることをいう。
［工程（２）］
工程（２）において、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の欠損部分（すなわち３’側）が、「鋳型核酸２０２」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１４（ｂ）参照）。
ここでの伸長反応には、その基質として、「検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチド４」と、「当該特定の塩基以外の他の各塩基の非標識ヌクレオチド５」とが使用される。ここで「標識物質」とは、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば蛍光物質、放射性物質、化学発光物質等であり得る。「特定塩基の標識ヌクレオチド」として、１種類の塩基の標識ヌクレオチドを使用し、「当該特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチド」として、他の３種類の塩基の各ヌクレオチドを使用することができる。ただし、これに限定されず、複数種類の塩基のヌクレオチドを標識ヌクレオチドとして使用してもよい。あるいは、後述の第二の実施の形態に記載されるとおり、ある種類の塩基のヌクレオチドを基質として使用しなくてもよい。例えば「標識ヌクレオチド」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用い、「非標識ヌクレオチド」として、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを使用することができる。
伸長反応溶液は、上述の基質となるヌクレオチド、伸長反応酵素（Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｍｇ２＋を含む公知の溶液を使用することができる。伸長反応は、例えば２５〜７０℃で５〜１２０分間行う。
「標識ヌクレオチド」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用いる場合、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分に、当該伸長反応により少なくとも１つのＣｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計することが必要である。すなわち、伸長反応の際に鋳型となる「鋳型核酸」の部分に、ｄＡＴＰが少なくとも１つ存在していなければ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰは導入されないため、Ｃｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計する必要がある。
好ましくは、「標識ヌクレオチド」としてＣｙ５−ｄＵＴＰを用いる場合、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分に、当該伸長反応により「１つの」Ｃｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計する。支持体上のすべての「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を、当該伸長反応により１つのＣｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように設計しておくと、すべてのプローブ核酸１分子に対して、均一に１つのＣｙ５−ｄＵＴＰを導入することができる。これにより、支持体上のすべてのプローブ核酸を、１回の伸長反応により、均一な標識量で標識することが可能になる。
ただし、第一の実施の形態において、作成された標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドに標識が取込まれるようにすることは、標識の安定性の面から望ましくない。
［工程（３）］
工程（３）において、工程（２）の伸長反応により作成された「標識プローブ核酸」と、「鋳型核酸」との間の相補的結合をすべて解離させる（図１４（ｃ）参照）。
ここでの解離は、後述の実施例のように支持体上の伸長反応溶液を、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液に置換し、当該溶液中で５〜１０分間室温で反応させることにより行ってもよいし、９０〜９８℃で５〜１０分間維持し、熱処理を施すことにより行ってもよい。
［工程（４）］
工程（４）において、工程（３）で解離された「鋳型核酸」等を支持体上から除去し、標識プローブ核酸が固相化された支持体を作成する。ここでの除去は、緩衝液、オートクレーブ水等を用いた洗浄により行うことができる。
以上第一の実施の形態で説明したとおり、支持体上のプローブ核酸前駆体の３’端のヌクレオチドを幾つか欠損させておくことにより、プローブ核酸の３’側に標識を付与することが可能である。これを支持体上に複数の標識プローブ核酸を作成する際に適用して、支持体上のすべてのプローブ核酸前駆体の３’端のヌクレオチドを幾つか欠損させておけば、支持体上のすべてのプローブ核酸を一回の伸長反応で標識することが可能である。
また、本発明の方法は、支持体上のすべてのプローブ核酸前駆体の欠損部分を、導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類に応じて、１つの標識ヌクレオチドのみが導入されるように設計しておくことにより、支持体上のすべてのプローブ核酸に対して、それぞれ均一な標識量の標識を導入することができる。
これにより、支持体上のすべてのプローブ核酸を、１回の伸長反応により、均一に標識することが可能になる。このように、１回の伸長反応で、支持体上のすべてのプローブ核酸を標識できるという点において本発明は簡便であり、加えて、欠損部分のヌクレオチド数を制御することにより、核酸プローブに導入する標識物質の量を制御できるという点において優れている。
第二の実施の形態
本発明の第二の実施の形態に係る方法は、第一の実施の形態に係る方法と基本的には同じであるが、以下の点を特徴とする。すなわち、第二の実施の形態に係る方法は、欠損部分の伸長反応に使用するための「特定塩基の標識ヌクレオチド」が、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、欠損部分の伸長反応に使用するための「前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチド」の少なくとも１種類が、ジデオキシヌクレオチドであるか、あるいは存在しないことを特徴とする。
このように第二の実施の形態に係る方法は、上記特徴以外、第一の実施の形態に係る方法と同様であるため、各工程の詳細については、上記第一の実施の形態の工程の各説明を参照されたい。第二の実施の形態の概要を、図１５に模式的に示す。
第二の実施の形態では、まず、「鋳型核酸２０２」と、支持体２０１上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体２０３」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１５（ａ）参照）。次いで、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の欠損部分（すなわち３’側）が、「鋳型核酸２０２」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１５（ｂ）参照）。
ここで、「非標識ヌクレオチド」として、ジデオキシヌクレオチド７を用いることにより、ジデオキシヌクレオチドが欠損部分に導入された後の伸長反応を停止させることができる。「標識ヌクレオチド２０４」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用いた場合、「ジデオキシヌクレオチド２０７」として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰの少なくとも１つを用いることができる。例えば、「未標識プローブ核酸前駆体」がその３’端からＵＵＡＡＣＵＡという配列を欠損しており、欠損部分に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、ｄｄＣＴＰを「非標識ヌクレオチド」として使用して、伸長反応を途中で停止させることができる。ここでは、ｄｄＣＴＰを用いることにより、伸長反応の際にＣｙ５−ｄＵＴＰが３分子取込まれないで１分子取込まれることになる。
あるいは、塩基がシトシンのヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄｄＣＴＰ）を伸長反応の際に存在させないことにより、伸長反応を途中で停止させることもできる。
伸長反応の後、伸長反応により作成された「標識プローブ核酸」と、「鋳型核酸」との間の相補的結合をすべて解離させる（図１５（ｃ）参照）。
第二の実施の形態では、ジデオキシヌクレオチドを用いたり、特定塩基のヌクレオチドを使用しないことにより、伸長反応を停止させる。このように特定塩基のジデオキシヌクレオチドの使用もしくは特定塩基のヌクレオチドの除去により、プローブ核酸への標識物質の導入量を制御することができる。
第三の実施の形態
本発明の第三の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドが一部欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む。
第三の実施の形態では、支持体上に作成される各標識プローブ核酸は、その中間部分（例えば中央部分）に標識ヌクレオチドが導入される。この点を除いて、第三の実施の形態は、第一の実施の形態と同様である。
従って、以下、各工程について図１６を参照しながら順に説明するが、各工程（１）〜（４）の詳細については、第一の実施の形態の工程（１）〜（４）の各説明も適宜参照されたい。
［工程（１）］
工程（１）の反応により、図１６（ａ）に模式的に示す状態が作成される。
第一の実施の形態と同様、目的とする解析に応じて、支持体上に作成する標識プローブ核酸の塩基配列をデザインする。「鋳型核酸２０２」は、作成したい標識プローブ核酸に相補的な配列を有するように調製される。一方、「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」は、その総塩基数において、「鋳型核酸」の塩基数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドが一部欠損するように調製される。
本実施の形態では、「未標識プローブ核酸前駆体」は、図１６（ａ）に示すとおり、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドを一部欠損しているため、欠損部分により分断された２つの「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」から構成される。２つの「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」を、図１６では、それぞれ「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」と称する。「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」は、それぞれ単独で、「鋳型核酸」にハイブリダイズすることができる長さであることが必要である。よって、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」および「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」は、それぞれ少なくとも６ヌクレオチド以上の長さを有し、好ましくは１０〜１５ヌクレオチドの長さを有する。このようにある程度の長さを有する２つの「未標識プローブ核酸前駆体」の間に欠損部分を作成するため、「中間部分」は、必然的に、作成したい標識核酸プローブの中央部分になる。
ここで、欠損させるヌクレオチドの数は、一般に１〜１５個、好ましくは５〜１０個とすることができる。欠損させるヌクレオチドの位置およびその数は、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列と、欠損させた領域に後の工程で導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類とを考慮して決定する。例えば、欠損させた領域に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、欠損させるヌクレオチドの位置は、ｄＵＴＰが導入されるべき位置を含んでいなければならない。また、欠損させるヌクレオチドの数は、作成したい標識プローブ核酸の中央部分においてその塩基配列がＵである部分の前後１〜５個とすることができる。ここで、欠損させた領域に標識ヌクレオチドＣｙ５−ｄＵＴＰが一つだけ導入されるように欠損部分を選定すれば、支持体上のすべてのプローブ核酸に均一な標識量で標識を導入することができる。
工程（１）では、第一の実施の形態と同様にして、「鋳型核酸」と、支持体上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１６（ａ）参照）。
［工程（２）］
工程（２）において、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分（すなわち中間部分）が、「鋳型核酸」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」と「未標識プローブ核酸Ｂ」の間に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１６（ｂ）参照）。ここでは第一の実施の形態と同様にして、伸長反応を５’から３’方向へと行う。ただし、第三の実施の形態では、伸長された最後のヌクレオチドの３’端と「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」（図１６の符号２０３ｂ）の５’端との間に切れ目（ニック）が存在し、伸長反応だけで標識核酸プローブは完全な１本鎖ではない。よって、伸長反応の後、好ましくはライゲーション反応を行う必要がある。ライゲーション反応は、ライゲース酵素を含む緩衝液中で１４〜３７℃で３０〜１２０分行うことができる。
工程（３）および（４）については、第一の実施の形態と同様にして行い、標識プローブ核酸が固相された支持体を作成する。
以上第三の実施の形態で説明したとおり、支持体上のプローブ核酸前駆体の中間部分のヌクレオチドを欠損させておくことにより、プローブ核酸の中間部分に標識を付与することが可能である。第三の実施の形態では、プローブ核酸の中間部分に標識を付与するため、中間部分の種々の任意の位置を欠損部分として選定することができる。この点において第三の実施の形態は、欠損部分がプローブ核酸の３’端に限定される第一の実施の形態に比べて、導入する標識ヌクレオチドの数を制御しやすいという点で優れている。また、プローブ核酸の中間部分に標識ヌクレオチドが入っていることは、標識が安定している点でも優れている。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部分を標識化する場合には、高度な技術が必要とされていた。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされていた。それに対して、本実施の形態に従うと、プローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。
３．２ 実施例
第１６の実施例
第１６の実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」の３’端を、標識ｄＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。
本実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」として、５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号６）を用い、「鋳型核酸」として、５’−ＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’（配列番号７）を用いた。
基板であるストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン）において、５’端にビオチンを結合した２０ｎＭ「未標識プローブ核酸前駆体」と、２０ｎＭ「鋳型核酸」とを、等量１０μＬずつ１×ＳＳＣ溶液（３０μＬ）中で混合し、３７℃で１時間反応させた。反応によりハイブリダイズした「未標識プローブ核酸前駆体」と「鋳型核酸」を、点着装置を用いて、ビオチンとアビジンとの反応により基板上に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄により除去した後、キャピラリーを形成可能な溝を有するキャピラリーカバーを基板上にかぶせ、核酸分子が固相化されたキャピラリーアレイを作成した。ここで、キャピラリーカバーは、両端に溶液を出し入れできる穴を有し、長さ３〜４ｃｍ。幅１ｍｍ、深さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリーを形成可能なものを使用した。
次いで、以下の成分からなる伸長反応溶液をキャピラリー内に入れ、３７℃で１〜２時間反応させた：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、１０μＭ ｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＡＴＰ→ｄＡＴＰと伸長し、「標識プローブ核酸」が作成される。
反応後、０．１×ＳＳＣでキャピラリー内の未反応物を十分洗浄することにより除去した。次いで、０．１Ｎ ＮａＯＨのアルカリ溶液をキャピラリー内に導入し、室温で５分間反応させ、「鋳型核酸」を「標識プローブ核酸」から解離した。解離された「鋳型核酸」を洗浄によりキャピラリー内から除去し、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。
表６は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
また、図１７は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」と「ネガティブコントロール」の蛍光顕微鏡写真を示す。図１７において、「（１）ネガティブコントロール」は、蛍光が観察されず、固相された「（２）標識プローブ核酸」は、蛍光が観察されている。
表６および図１７の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
第１７の実施例
第１７の実施例では、第１６の実施例と同様、「未標識プローブ核酸前駆体」の３’端を、標識ｄ−ＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。第１７の実施例では、標識ｄ−ＵＴＰを導入する伸長反応の際に、１０μＭ ｄＣＴＰの代わりに０μＭ ｄＣＴＰもしくは１０μＭ ｄｄＣＴＰを用いて伸長反応を途中で停止させた点において第１６の実施例と異なる。
第１６の実施例で使用した伸長反応溶液を、以下の成分に変えた以外、第１６の実施例と同様にして、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。すなわち、第１７の実施例では、以下の成分の伸長反応溶液を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、０μＭ ｄＣＴＰまたは１０μＭ ｄｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。
伸長反応のための基質ヌクレオチドとして、０μＭ ｄＣＴＰを用いた場合、伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰと伸長し、反応は停止する。一方、伸長反応のための基質ヌクレオチドとして、１０μＭ ｄｄＣＴＰを用いた場合、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰ→ｄｄＣＴＰと伸長し、反応は停止する。この結果、「標識プローブ核酸」が作成される。
表７は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
表７の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
第１８の実施例
第１８の実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」の中央付近に位置する欠損部分を、標識ｄＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。
本実施例では、図１６に示すとおり、「未標識プローブ核酸前駆体」として、２つのオリゴヌクレオチド、すなわち「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」：５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴ−３’（配列番号８）と「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」：５’−ＡＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡ−３’（配列番号９）を使用した。また、「鋳型核酸」として、５’−ＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１０）を使用した。
基板であるストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン）上において、２０ｎＭの「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」と、２０ｎＭの「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」と、２０ｎＭの「鋳型核酸」とを、等量１０μＬずつ１×ＳＳＣ溶液（３０μＬ）中で混合し、３７℃で１時間反応させた。反応によりハイブリダイズした「未標識プローブ核酸前駆体」と「鋳型核酸」を、点着装置を用いて、ビオチンとアビジンとの反応により基板上に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄により除去した後、キャピラリーを形成可能な溝を有するキャピラリーカバーを基板上にかぶせ、核酸分子が固相化されたキャピラリーアレイを作成した。ここで、キャピラリーカバーは、両端に溶液を出し入れできる穴を有し、長さ３〜４ｃｍ。幅１ｍｍ、深さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリーを形成可能なものを使用した。
次いで、以下の成分からなる伸長反応溶液をキャピラリー内に入れ、３７℃で１〜２時間反応させた：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、１０μＭ ｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰと伸長する。その後、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」の３’端のＣｙ５−ｄＵＴＰと、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」の５’端のｄＡＴＰとの間の切れ目（ニック）をリガーゼにより連結した。具体的には、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、１００ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ溶液で、１６℃、１時間反応させることにより連結した。これにより、「標識プローブ核酸」が作成される。
反応後、０．１×ＳＳＣでキャピラリー内の未反応物を十分洗浄することにより除去した。次いで、０．１Ｎ ＮａＯＨのアルカリ溶液をキャピラリー内に導入し、室温で５分間反応させ、「鋳型核酸」を「標識プローブ核酸」から解離した。解離された「鋳型核酸」を洗浄によりキャピラリー内から除去し、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。
表８は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
表８の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
以上説明したとおり、本発明の方法に従って作成された、標識プローブ核酸が固相された支持体は、当該標識プローブ核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に利用することが可能である。
支持体上のプローブ核酸を標識する本発明の方法は、以下に記載の点で優れており、試料を標識する場合にみられた問題点を解決し得るものである。
まず、本発明の方法は、試料を標識しないので試料が分解する心配がない。また、本発明の方法は、支持体上のすべてのプローブ核酸に対して、１回の伸長反応により一括して標識を付与することができる点で簡便である。
また、アレイ上のデザインされた既知の配列を有するプローブを標識するため、標識物質を導入する位置および標識効率を制御可能である。すなわち、本発明の方法は、プローブ核酸の中間部分の任意のヌクレオチドに標識物質を導入することができるため、その後の検出反応の際に標識が離脱することのない安定な標識プローブを作成することが可能である。加えて、本発明の方法は、プローブ核酸の特定のヌクレオチドに標識物質を導入することができるため、支持体上のすべてのプローブに対して均一な量の標識物質を導入することができる。このようにプローブを均一な標識量で標識することにより、試料への不均一な標識しかできなかった従来と比較して、標識量に左右されない信頼性のある測定結果を得ることが可能になる。
更に、本発明に従って標識プローブを固相したアレイを準備することにより、発現解析の自動化が可能である。その上、遺伝子の発現量を、他のサンプルとの競合的ハイブリダイゼーションで測定するのではなく、単一サンプルの遺伝子発現量の絶対値として測定することができる。加えて、アレイ上のプローブを標識することは、反応前のプローブが標識されているため、その固相化状態をモニターすることが可能であり、これは解析精度を管理する上で望ましい。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【技術分野】
本発明は、固相されたプローブ核酸を用いて核酸の変異を解析する方法に関する。また本発明は、固相された標識プローブ核酸を用いて遺伝子発現を解析する方法に関する。更に本発明は、核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に有用である、標識プローブ核酸の調製方法に関する。
【背景技術】
所謂ＤＮＡマイクロアレイは、多数の異なったプローブＤＮＡをガラスなどの固相基板上に高密度に固定した装置である。このような基板にプローブ核酸を固定した装置は、その製造方法から２種類に大別される。１つは、光リソグラフ方式によりＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡチップと称される装置である（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４）９１：５０２２−５０２６）。もう１つは、予め調製したＤＮＡをスライドガラス上に機械的に並べ、それによってＤＮＡを張り付けていくタイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡマイクロアレイと称される装置である（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２７０：４６７−４７０）。
上記２種類のＤＮＡマイクロアレイの基本的な測定原理は、固定されたプローブ核酸に対して標識された核酸試料をハイブリダイズさせ、核酸試料の標識を基に、核酸試料の中に、プローブ核酸にハイブリダイズする核酸が存在するか否かを検出するものである。このような原理によって、遺伝子の大量解析が可能になる。また、検出感度の向上、装置のマイクロ化によるサンプルの節約、データの取得の自動化およびデータ処理の簡便化なども達成されると期待されている。
ＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプのＤＮＡマイクロアレイは、半導体に使われる光リソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術を融合させることで作製する。まず光反応で取り除くことができる保護基を持った合成リンカーをガラス基板上に結合させ、マスクと呼ばれる遮蔽物質を通して光を照射することにより、特定の領域の保護基を脱離させる。次にこのガラス基板を水酸基が保護されたヌクレオチドと反応させる。これにより保護基が脱離している部分のみで、重合反応が起こる。更に、別のマスクを用いて基板上の異なる領域に光を照射し、ヌクレオチドの重合を繰り返し、アレイを作製する。
スライドガラスにＤＮＡを張り付けていくタイプのＤＮＡマイクロアレイは大がかりな半導体製造機を必要としない。ＤＮＡアレイ機と検出器があれば目的のＤＮＡマイクロアレイを製造することが可能である。また、この方法は、張り付けるＤＮＡを任意に選択できることが利点であるが、その一方で、ＤＮＡのコレクションを調製する必要があり、繁雑な作業が必要である。また、この方法では、ピン先で物理的にスポットしていく。従って、ＤＮＡの高密度化は光リソグラフ方式よりは劣る。しかしながら、例えば、直径１００μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットすると計算上１ｃｍ２に２５００スポットすることが可能である。通常のスライドガラス１枚（有効面積は約４ｃｍ２である）について、約１万のＤＮＡを載せることが可能である。
ＤＮＡアレイ機は、基本的に高性能サーボモータを組み合わせて、コンピュータ制御下でピン先、或いは、スライドホルダーをＸＹＺ軸方向に作動して、マイクロタイタープレートからスライドガラス表面上にＤＮＡサンプルを運ぶものである。ピン先の形状には、多くの工夫がなされており、この技術の命とも言える。最も一般的なピン先形状は、カラス口のように割れたペン先形状である。そこにＤＮＡプローブ溶液を溜め、複数のスライドにスポットする方式である。洗浄および乾燥のサイクルを挟んで次のＤＮＡサンプルを載せるという工程を繰り返す。理想的なアレイ機に求められる機能は、スポットのサイズや形状が均一で、しかも高速で再現性がよいということである。ペン先のロットの違いなどにより均一性やスピードに限界があるので、より高性能なものを求めてインクジェット方式やキャピラリー方式など、新しい技術の開発も進められている。
ＤＮＡ固定法に関しては、ガラスはメンブレンと比較して、有効固定面積が小さく電荷のチャージも少ないので、種々のコーティングが試みられている。実用的にはポリＬリジンや、シラン化などが用いられている。ＤＮＡ末端をアミノ化してシラン化ガラスにクロスリンクする方法もある。
ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光標識ＤＮＡの蛍光シグナルの検出は蛍光検出器で行う。通常、スキャナーは蛍光顕微鏡と可動ステージを組み合わせたものである。従来型のゲル用の蛍光イメージアナライザーでも、それ程高密度ではないＤＮＡマイクロアレイの読み取りなら可能である。最近、ＤＮＡマイクロアレイ専用の高解像度スキャナーが売り出された。読み取り方式の違いにより共焦点型と落射型がある。
ＤＮＡマイクロアレイから出てくるデータは膨大なものになるので、データ解析ソフトが重要となってくる。データの表示方法やデータの後処理、他のデータベースとのリンクなど実験者にとって使い勝ってのよいソフトウェアの開発が望まれている。マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリングのデータベース化の試みや、アレイデータベースのインターネットでの公開も始まっている。
このような技術のＤＮＡマイクロアレイを用いて、突然変異を検出することが試みられている。まず、サンプルの特定領域中の１塩基に対して、その塩基のみが異なる４種類のオリゴヌクレオチドプローブをデザインし、ＤＮＡプローブチップに載せる。一方、塩基配列を調べるサンプルはＰＣＲで増幅し、蛍光色素を用いて末端標識しておく。このサンプルを前記のＤＮＡチップとハイブリダイゼーションさせると、サンプル配列と相補的な塩基を持つプローブが最も強いハイブリダイゼーションシグナルを示す。同様に、１塩基置換の突然変異を持ったサンプルの場合は、変異塩基に相補的な塩基を持つプローブが最も強いハイブリダイゼーションシグナルを示す。この方法では、電気泳動に基づいたＤＮＡシーケンシングと異なる、未知の塩基配列を決定することはできないが、特定の遺伝子の決まった領域について、突然変異の存在を高密度で検出できる。
サンプル調製では、例えば、Ｈｕ ＳＮＰ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）は、ＳＮＰマーカーの増幅に１本の反応チューブで約１００種類のＰＣＲ産物を増幅させるマルチプルＰＣＲを採用している。２段階目にはラベリングＰＣＲを行い、各ＳＮＰマーカーを含むＰＣＲ産物を更に増幅させると共に、ビオチン標識を行うが、このときには、全てのＰＣＲ産物に共通なプライマーペアを用いることができる。このサンプル調整の効率化により、約１２０ｎｇのゲノムＤＮＡから出発し、１日半でＳＮＰ遺伝子型を決定することができるようになった。実験操作は、ＧｅｎｅＣｈｉｐシステムにより極限まで自動化されており、１台のスキャナを用いた場合には２４時間で１８０サンプルの解析が可能である。
このようなＤＮＡ変異解析は、４種類のオリゴヌクレオチドプローブをガラスなどの固相基板上に固定し、その上に、ＰＣＲで増幅した蛍光標識ＤＮＡをハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、そのデータをコンピュータで解析する。このような解析は、以下のような問題点がある。即ち、１）測定したい試料を各試料毎に蛍光標識ヌクレオチドや蛍光標識プライマーを用いて標識しなければならず、標識の効率が低く、且つ製造コストが高い、２）ハイブリダイゼーションまでの前処理が煩雑で自動化しずらい、３）１つの試料を測定するのに４種類のプローブを用意しなければならず費用がかかる、４）測定が乾燥状態で行われるために蛍光シグナルの検出効率が低い。
一方、上述のＤＮＡマイクロアレイを用いて、遺伝子発現を解析することも現在行われている。その主流は、二蛍光標識法を用いたディファレンシャルな遺伝子発現をみる系である。その原理は、２つの異なったｍＲＮＡサンプル中での遺伝子発現の差を検出するものである。そのために、各ｍＲＮＡサンプルから各標識ｃＤＮＡを調製する際に、それぞれを異なる蛍光物質で標識し、各標識ｃＤＮＡをアレイ上のプローブに競合的にハイブリダイズさせ、両方の蛍光を測定し比較するものである。
このような従来の方法は、以下のような問題点がある。即ち、１）従来の方法では、測定したい試料を標識するため、例えばＲＮＡなどの試料のデグラデーションが生じる。２）従来の方法では、ハイブリダイゼーションまでの前処理が煩雑で自動化しずらい。３）従来の方法は、ディファレンシャルな遺伝子発現を検出するものである。従って、相対的変化でしか発現量を見られない。４）従来の方法では、プローブの固相量や、点着スポットの状態を反応前に知ることができない。従って、プローブ固相の精度管理を行うことが不可能である。５）従来の方法では、測定は乾燥状態で行われているので、蛍光シグナルの検出効率が低い。
【発明の開示】
上記の状況に鑑み、本発明の目的は、効率がよく、且つ経済的な遺伝子変異解析方法を提供することである。
鋭意研究の結果、本発明者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）の工程で得られた反応産物を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程
を具備する方法である。
また、上記背景技術に記載された状況に鑑み、本発明の目的は、効率のよい遺伝子発現解析方法を提供することである。本発明の更なる目的は、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現解析方法を提供することである。また本発明の更なる目的は、検出精度のよい遺伝子発現解析方法を提供することである。
鋭意研究の結果、本発明者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であって、
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程と
を具備する方法；および、
対象における標的配列の発現頻度を判定する方法であって、
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、対象から得た被検核酸を含む試料を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後に、前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、対象における標的配列の発現頻度を判定する工程
を具備する方法である。
また、このような遺伝子発現解析方法を実施するにあたり、この方法が、流路等の支持体上のプローブをすべて標識しなければならないという点において、多大な費用と時間と労力を要するという問題を有していることを見出した。
従って本発明は、アレイ上のプローブをすべて一括して標識することが可能な、簡便なプローブ標識方法を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、標識プローブ核酸を固相化した支持体を簡便に作成する方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明は、以下の手段を提供する。即ち、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程とを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の１態様に従って使用される反応容器の例を示す図であり、（ａ）は、本発明の１態様に従って使用される反応容器の例を示す平面図であり、図１（ｂ）および（ｃ）は、図１（ａ）の１Ｂ−１Ｂ線の断面図である。
図２は、本発明の１態様に従う変異解析方法の例を模式的に示す図である。
図３は、本発明の１態様に従う変異解析方法の例を模式的に示す図である。
図４は、Ｓ１ヌクレアーゼによる核酸分解の例を模式的に示す図である。
図５は、ヌクレアーゼプロテクションアッセイの原理を模式的に示す図である。
図６は、本発明の１態様に従う変異解析方法の１例を模式的に示す図である。
図７は、本発明の１態様に従う変異解析方法の１例を模式的に示す図である。
図８は、本発明の１態様に従う遺伝子発現解析方法を模式的に示す図である。
図９は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１０は、本発明の１態様に従う標的配列の検出方法を模式的に示す図である。
図１１は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１２は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１３は、本発明の１態様に従うプローブ核酸の標識方法の例を示す図である。
図１４は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第一の実施の形態を説明する図である。
図１５は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第二の実施の形態を説明する図である。
図１６は、本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の第三の実施の形態を説明する図である。
図１７は、第１６の実施例の結果を示す顕微鏡写真である。
図で用いられた符号は、以下のとおりである：
１…反応容器、 ２…反応部、 ３…プローブ核酸、 ４ａ、４ｂ…開口部、 ５…ポリイミド薄膜、 ６…ヒーター、 ７…温度センサー；
２１ａ、２１ｂ…ターゲット核酸、 ２２ａ、２２ｂ…プローブ核酸、 ２３ａ、２３ｂ…標識化基質核酸；
３１ａ、３１ｂ、３１ｃ…ターゲット核酸、 ３２ａ、３２ｂ、３２ｃ…プローブ核酸、 ３３…標識化基質核酸、 ３４…反応部の底面、 ３５…反応部、 ３６ａ、３６ｂ、３６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸；
８１ａ、８１ｂ、８１ｃ…ターゲット核酸、 ８２ａ、８２ｂ、８３ｃ…プローブ核酸、 ８３…標識化基質核酸、 ８４…反応部の底部、 ８５…反応部、 ８６ａ、８６ｂ、８６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸、 ８７ａ、８７ｂ…ターゲット核酸；
９１ａ…ターゲット核酸、 ９２…プローブ核酸、 ９３ａ…標識化基質核酸、 ９４…反応部の底部、 ９５…反応部、 ９６ａ…伸長され標識されたプローブ核酸、 ９１ｂ…ターゲット核酸、 ９３ｂ…標識化基質核酸、 ９６ｂ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１０１…プローブ核酸、 １０２…ターゲット核酸、 １０４…反応部の底面、 １０５…反応部；
１２１…鋳型核酸、 １２２…種プローブ核酸、 １２３…標識化基質核酸、 １２４…反応部の底面、 １２５…反応部、 １２６…伸長され標識されたプローブ核酸、 １２７、１２８…非標識化基質核酸；
１３１ａ、１３１ｂ、１３１ｃ…鋳型核酸、 １３２ａ、１３２ｂ、１３２ｃ…種プローブ核酸、 １３３…標識化基質核酸、 １３４…反応部の底面、 １３５…反応部、 １３６ａ、１３６ｂ、１３６ｃ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１４１ａ…鋳型核酸、 １４２…種プローブ核酸、 １４３ａ、１４３ｂ…標識化基質核酸、 １４４…反応部の底面、 １４５…反応部、 １４６ａ、１４６ｂ…伸長され標識されたプローブ核酸；
１５１…種プローブ核酸、 １５２…反応部の底面、 １５３…鋳型核酸、 １５４…第１の標識化基質核酸、 １５５…第２の標識化基質核酸；
１６１ａ、１６１ｂ、１６１ｃ…鋳型核酸、 １６２ａ、１６２ｂ、１６２ｃ…種プローブ核酸、 １６３…標識化基質核酸、 １６４…反応部の底面、 １６５…反応部、 １６６ａ、１６６ｂ、１６６ｃ…プローブ核酸、 １６７ａ、１６７ｂ…ターゲット核酸；
２０１…支持体、 ２０２…鋳型核酸、 ２０３…未標識プローブ核酸前駆体、 ２０４…標識ヌクレオチド、 ２０５…非標識ヌクレオチド、 ２０６…標識プローブ核酸；
２０７…ジデオキシヌクレオチド；
２０３ａ…未標識プローブ核酸前駆体Ａ、 ２０３ｂ…未標識プローブ核酸前駆体Ｂ。
【発明を実施するための最良の形態】
１． 核酸の変異解析方法
１．１ 核酸の変異解析方法の概要
本発明の態様に従うと、ターゲット核酸の特定部位の塩基を決定するための方法が提供される。本方法において、ターゲット核酸を選択的に捕獲するための配列を含み、かつその５’末端で基体に固相化されているプローブ核酸を用いる。
ここで使用される「核酸」の語は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを示す。
ここで使用される「ターゲット核酸」とは、前記核酸の何れかの核酸であって、ハイブリダイゼーションに適切な塩基長を有する核酸をいう。ハイブリダイゼーションに適切な塩基長とは、１０塩基長から１０００塩基長であればよく、好ましくは１５塩基長から２００塩基長であり、より好ましくは１５塩基長から５０塩基長である。
例えば、本発明に従って好ましく対象とされるターゲット核酸は、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド等、何れの核酸断片であってもよい。また、当該ターゲット核酸は、人工的に合成された核酸断片であっても、対象から抽出された何れの核酸断片であっても、それを元に合成されたｃＤＮＡおよびＲＮＡ断片であっても、ＰＣＲなどにより増幅されて得られた核酸断片であってもよい。また、それ自身公知の何れかの細胞工学的技術によって操作して得られた核酸の断片であってもよい。
ここで使用される「対象」の語は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む任意の哺乳動物、爬虫類、魚類および昆虫などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
上記のような対象からターゲット核酸を含む核酸試料を対象から得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能である。例えば、核酸試料がゲノムＤＮＡである場合には、市販のキットを使用しても、他の公知の方法を使用してもよい。また例えば、核酸試料がＲＮＡである場合には、例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを使用してもよいが、これに限定されるのもではない。
本発明の方法で使用される「プローブ核酸」は、特定の配列を有する「ターゲット核酸」をハイブリダイゼーションを利用して選択的に捕獲するための核酸である。従って、解析の対象となるターゲット核酸の既に分かっている配列の連続する一部分に相補的な配列を選択用配列として有する。プローブ核酸の長さは、１０塩基から１００塩基、好ましくは１５塩基から２５塩基であればよい。また、選択用配列の長さは、１０塩基から５０塩基、好ましくは１５塩基から３０塩基であればよい。プローブ核酸は、５’末端を介して基体に固相化されている。
本発明の方法で使用される「ターゲット核酸」は、本発明の方法において解析の対象となる配列であり、その塩基を決定しようとする標的部位以外の配列は既に分かっている配列であることが好ましい。ターゲット核酸に含まれる標的部位の３’側に上記「選択用配列」に相補的な配列が存在する。また、標的部位の長さは１塩基であっても、２塩基以上であってもよいが、１塩基であることが好ましい。また、ターゲット核酸における標的部位の位置は、プローブ核酸が５’端を介して基体に固相化されている場合であれば、３’端側に選択用配列に相補的な配列が位置するので、選択用配列の相補配列に隣接し、且つその相補配列よりも５’端側でに位置すればよく、５’末端であっても、末端でなく末端までに幾つかの塩基を有していてもよい。
本発明の態様に従う方法は、例えば、次のように行うことが可能である。先ず最初に、選択用配列を有するプローブ核酸を反応容器に固相化する。次に、核酸試料をその反応容器に添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件、例えば、厳格な（ストリンジェンシーな）条件、で反応を行う。選択用配列に相補的な配列を有するターゲット核酸が前記核酸試料に存在すれば、プローブ核酸にはターゲット核酸がハイブリダイズする。これにより、特定の配列を有するターゲット核酸を核酸試料から捕獲される。続いて、そこに検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを反応容器に添加し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う。その後、伸長反応に使用されなかった標識化基質を除去し、標識物質に由来する信号を検出する。その結果、当該信号が観察されれば伸長が生じていれることが分かる。従って、標的部位の塩基が、使用した標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれるに塩基に相補的な塩基であることが分かる。１つの核酸試料について、このような工程を４種類の塩基全てについて行ってもよい。また、標的部位が遺伝子多型の存在する部位であれば、その多型の遺伝子型となり得る塩基の種類についてのみ上記の工程を行ってもよい。
本発明の態様においてプローブ核酸は、その５’末端を介して基体に固相化されている。プローブ核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所望のプローブ核酸を固定することによって行うことが可能である。
本発明の態様に従って使用され得る「基体」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の基体であってもよい。あるいは、「基体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。処理の容易さから、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ましい。
基体が球状である場合、当該球状の基体を用いて以下に記載のとおり、本発明を実施することができる。すなわち、基体として、検出すべきターゲットに対応する複数のプローブを固相化した微粒子を調製し、当該微粒子をキャピラリーまたはウェル等の反応容器に供給して、本発明に記載の反応を実行することができる。当該微粒子は、反応後に反応容器から回収して、フローサイトメーター（ＦＣＭ）やレーザースキャニングメーター（ＬＳＭ）による既知の測定に適用してもよい。基体として微粒子を用いた場合、好ましくは、反応容器であるキャピラリーと連続する流路の別の場所において、流動させながら、あるいは静止させた状態で測定を行うことができる。また、１本の流路内の異なる場所に微粒子を順次移動させて、それぞれの位置で固相化工程、反応工程および測定工程という一連の工程を同時または連続的に行うことも可能である。微粒子をキャピラリー内の液体と独立して移動または停止させるために、個々の微粒子が、既知の磁気的分離技術を使用可能なように磁性体を含んでいるのが好ましい。このように、キャピラリー内を流通させることによって、ターゲットの種類毎に順番に移動と停止を行うことができる。すなわち、ある種類のプローブを固相した微粒子をキャピラリ内に流通させ、その後別の種類のプローブを固相した微粒子を流通させることによって、流路内の上流と下流とで異なる反応を行うこともできるし、各種ターゲットを含む各試料を流路内に順次流通させることによって、流路内の上流と下流とで異なる反応を行うこともできる。
また、本発明において、伸長反応時に使用される基質を標識するための「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いてもよい。複数のプローブ核酸を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよい。
１．２ 実施例
以下、本発明に従う態様例を用いて本発明について更に説明する。
第１の実施例：反応容器
本発明の態様において使用され得る反応容器の例を図１に示す。図１（ａ）は、当該反応容器の平面図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）の線１Ｂ−１Ｂに沿った断面図である。本例における反応容器１は、そこにおいて反応を行うための反応部２を具備する（図１（ｂ））。ここで、反応部２は、図１（ｂ）に示す通りの容器内部の形状がキャピラリー形状である。
また、図１（ａ）および（ｂ）に示すように反応容器１は、反応部２に試薬などを挿入および／または反応部２から試薬などを排出するための開口部４ａおよび４ｂを有している。また、反応部２の底部には、特定の配列を含むターゲット配列を捕獲するための選択用配列を含むプローブ核酸３が所望の領域に固相化されている（図１（ｂ））。このような反応容器１の製造は次のように行った。
即ち、キャピラリーを形成可能な溝およびその溝の両端に孔を有する第１の基板（キャピラリーカバー）と、その表面にプローブ核酸が固相化された第２の基板とを接合して製造した。このとき、前記プローブ核酸は、第１の基板の溝と第２の基板の表面により形成される空間内に含まれる。より具体的には次の通りである。図１には、１キャピラリーを具備する反応容器を示したが、本発明の態様に置いて使用される反応容器は、２以上のキャピラリーを具備する反応容器であってもよい。
また、上記の例ではその内部形状がキャピラリー形状の例を示したが、キャピラリー形状に限定するものではなく、そこにおいて所望の反応を行うことが可能であればどのような形状であってもよい。
また、本発明に従って使用されるキャピラリーアレイは、例えば、以下の様に変更することも可能である。図１（ｃ）は、図１（ａ）の線１Ｂ−１Ｂに沿った断面である。図１（ｃ）にその断面を示すように、反応部２の下方にヒーター６および温度センサー７を配置してもよい。その場合、例えば、プローブ核酸３が固相化されるポリイミド薄膜５の下方にヒーター６を配置し、ヒーター６の下方に温度センサー７を配置すればよい。このような装置は、それ自身公知の何れかの手法により製造することが可能である。また、このような装置に含まれるヒーターおよびセンサーの配置の位置および配置パターンは所望に応じて変更してもよい。また、必ずしも、ヒーターおよびセンサーが当該基板と一体化されて提供される必要はない。
本実施例に記載のキャピラリーアレイについては、米国特許公開２００２００１３４５７（Ａｋｉｒａ Ｓｕｙａｍａ）を参照することができる。また、他のキャピラリーアレイについては、米国特許６，１４３，１５２（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照することができる。
キャピラリーアレイは、米国特許公開２００２００１３４５７（Ａｋｉｒａ Ｓｕｙａｍａ）に記載されるように全長に亘って一定の断面積を有するように構成される。これにより、液体の流路内における液量は何処も均等であるから反応条件が等しい。同じ理由により、キャピラリーアレイにおける液体の出入りは、特別な制御手段を用いることなく定量的に調節されており、且つ脈流のない円滑な液体ハンドリングを可能にする。
第２の実施例
（１）反応容器
以下に示すように、４つのキャピラリー、即ち、キャピラリー１、キャピラリー２、キャピラリー３およびキャピラリー４を具備すること以外は第１の実施例に記載の反応容器と同様な反応容器を用いてターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法の例を示す。
第１の基板であるガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を４本形成し、これらの夫々の溝の両端に貫通孔を形成した。第２の基板には、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）を用いた。このストレプトアビジンコートスライドに対して、５’末端をビオチン標識したＲＶプローブ（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）を点着装置を用いて固相化した。固相化は、第１および第２の基板を接合した時に、前記４本の溝に相当する夫々の位置に、ＲＶプローブが配置されるようにした。この固相化は、ビオチン−アビジン反応を利用した。このような第１の基板と第２の基板を接合し、前記４つの溝によって４本のキャピラリー、即ち、キャピラリー１、キャピラリー２、キャピラリー３およびキャピラリー４を形成した。これにより、得られた４本のキャピラリー内に前記ＲＶプローブ核酸が具備された。このようにして形成した反応容器を用いて次の実験を行った。
（２）遺伝子の変異解析
以下、遺伝子の変異を解析する方法の１例である。ここでは、第４番目の塩基「Ｎ」が不明である試料ｔｇｃＮｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃターゲット核酸について、その「Ｎ」がアデニンであるのか、グアニンであるのかを決定する。
前記のキャピラリー１とキャピラリー２には、第１のターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。また、同様に、前記のキャピラリー３とキャピラリー４には、第２のターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。これらについて、３７℃で１時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のターゲット核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液Ａ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰをキャピラリー１と３に加え（図２反応Ａ）、伸長反応溶液Ｃ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄＣＴＰをキャピラリー２と４に加え（図２反応Ｂ）、これらを３７℃で１、２時間反応した。
反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を取り除き蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。表１は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値で示している。
表１の結果に示されるように、キャピラリー１とキャピラリー４の蛍光強度が大きい。この結果から、キャピラリー１とキャピラリー４に伸長が生じ、これに対してキャピラリー２とキャピラリー３では伸長は生じていないことが分かる。従って、キャピラリー１に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、アデニンであり、キャピラリー４に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、グアニンであることが判定される。
このように、加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類と、伸長の有無から試料ターゲットの「Ｎ」の塩基が決定された。
上記の例では、本発明の態様に従う方法を説明するために、便宜上、その配列を予め分かっているターゲット核酸、即ち、ＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）とＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を用いた。同様に、標的部位の塩基の不明な配列についても、その塩基を決定することが可能である。このような態様により、遺伝子の変異を検出したら、多型の遺伝子型を決定することが可能である。
このような反応により生じる現象を、図２に模式的に示した。本反応では、（Ａ１）および（Ｂ１）に示すように、選択用配列に相補的な配列を含む核酸試料としてターゲット核酸２１ａおよびｂを、選択用配列を含むプローブ核酸としてプローブ核酸２２ａおよびｂを使用した。また、ターゲット核酸の標的部位「Ｎ」に該当する塩基はＡである。反応Ａは、キャピラリー１で生じる反応を示し、反応Ｂは、キャピラリー２で生じる反応を示す。反応Ａでは、標識化基質核酸として蛍光標識した塩基Ｕ２３ａ（即ち、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）を用いた（Ａ３）。反応Ｂでは、標識化基質核酸として蛍光標識した塩基Ｃ２３ｂ（即ち、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ）を用いた（Ｂ３）。本明細書において、各略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシンである。また、本明細書において例として挙げる塩基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないので、それらの塩基に限定するものではない。
まず、反応Ａにおいて生じる事象について説明する。
（Ａ１）プローブ核酸鎖２２ａを固相化したキャピラリーにターゲット核酸２１ａを含む試料を添加する。
（Ａ２）当該キャピラリー内の条件をハイブリダイゼーションが生じるのに適切な条件とする。これにより、ターゲット核酸２１ａとプローブ核酸２２ａがハイブリダイズする。
（Ａ３）次に、Ｃｙ３で標識したｄＵＴＰ２３ａを基質として添加し、キャピラリー内を伸長反応が生じるのに適切な条件とする。その結果、ｄＵＴＰ２３ａは、プローブ核酸２２ａに取り込まれ、プローブ核酸２２ａの伸長が起こる。
次に、反応Ｂにおける事象を説明する。
（Ｂ１）プローブ２２ｂを固相化したキャピラリーにターゲット核酸２１ｂを含む試料を添加する。
（Ｂ２）当該キャピラリー内の条件をハイブリダイゼーションが生じるのに適切な条件とする。これによりターゲット核酸２１ｂとプローブ核酸２２ｂがハイブリダイズする。
（Ｂ３）次に、Ｃｙ３で標識したｄＣＴＰ２３ｂを基質として添加し、キャピラリー内を伸長反応が生じるのに適切な条件とする。その結果、ｄＣＴＰ２３ｂは、ターゲット核酸２１ｂの「Ｎ」の位置の塩基に相補性がないために、ハイブリダイズは生じず、プローブ核酸２２ｂの伸長は起こらない。
ここでは、ターゲット核酸２１ａおよびｂは選択用配列に相補的な配列を含み、且つその相補的配列の５’側に選択用配列および相補鎖とは異なる配列を含む。一方、プローブ配列２２ａおよびｂは選択用配列を有する。続く、プローブ核酸２２ａおよびｂの３’端の伸長は、そこにハイブリダイズしているターゲット核酸の選択用配列に相補的な配列よりも５’側の配列を鋳型として達成される。
上記のようなキャピラリー形状の反応容器を使用すると、使用する試料および試薬も微量で済むという利点がある。しかしながら、本発明において使用される反応容器は、キャピラリー形状に限られるものではない。また、上記の例では１つの反応容器に１本のキャピラリーが具備される装置の例を示したが、これに限定されるものではなく、１つの反応容器に複数のキャピラリー形状などの内部形状を有する反応部を有する反応容器を用いてもよい。
上記の模式図では、便宜上、１つのプローブ核酸について示したがこれに限定するものではない。また、プローブ核酸の配列は上記の配列に限定するものではなく、所望に応じて任意に選択し得る。また、複数の異なる配列をそれぞれに有するプローブ核酸を１つの基体において用いてもよく、同じ種類のプローブ核酸を複数使用してもよい。
以上のような本発明の態様に従うと、ターゲット核酸に含まれる標的部位の塩基の決定に加えて、同時に、プローブ核酸へのラベル付与を容易に行うことも可能である。
第３の実施例
第２の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第３の実施例を実施した。
また、第２の実施例において使用した伸長反応液Ａとして［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄｄＵＴＰ］を用い、伸長反応液Ｃとして［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ３−ｄｄＣＴＰ］を用いたこと以外の条件は第２の実施例の記載と同様にして反応を行った。
この反応の結果を表２に示す。表２は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値で示している。
表２の結果に示されるように、キャピラリー１とキャピラリー４の蛍光強度が大きい。この結果から、キャピラリー１とキャピラリー４に伸長が生じ、これに対してキャピラリー２とキャピラリー３では伸長は生じていないことが分かる。従って、キャピラリー１に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、アデニンであり、キャピラリー４に添加したターゲット核酸の標的部位の塩基は、グアニンであることが判定される。
このように、加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類と、伸長の有無から試料ターゲットの「Ｎ」の塩基が決定された。
上記の例では、本発明の態様に従う方法を説明するために、便宜上、その配列を予め分かっているターゲット核酸、即ち、ＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号３）とＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を用いた。同様に、標的部位の塩基の不明な配列についても、その塩基を決定することが可能である。このような態様により、遺伝子の変異を検出したら、多型の遺伝子型を決定することが可能である。
第４の実施例
遺伝子の変異を解析する方法のもう１つの例を示す。ここでは、第４番目の塩基「Ｎ」が不明である試料ｔｇｃＮｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃターゲット核酸について、その「Ｎ」がアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであるのかを決定する。
第１の実施例に記載した形態の反応容器を用いて、第４の実施例を実施した。使用した反応容器は以下のように製造した。
即ち、第１の基板には、ガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を１本形成し、この溝の両端に貫通孔を形成した。第２の基板には、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）を用いた。このストレプトアビジンコートスライドに対して、５’末端をビオチン標識したＲＶプローブ（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）を点着装置を用いて固相化した。固相化は、第１および第２の基板を接合した時に、前記４本の溝に相当する夫々の位置に、ＲＶプローブが配置されるようにした。
このような第１の基板と第２の基板を接合し、前記溝によって１本のキャピラリーを形成した。
前記のキャピラリーに、ターゲット核酸としてのＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加した。これらについて、３７℃で１時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のターゲット核酸をキャピラリー内から取り除いた。
次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液Ａ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）］を０．４ユニット／μＬ、並びに１０μＭの６−ＦＡＭ−ｄＵＴＰ、１０μＭのＨＥＸ−ｄＡＴＰ、１０μＭのＴＡＭＲＡ−ｄＣＴＰおよび１０μＭのＲＯＸ−ｄＧＴＰを前記キャピラリーに加え、これらを３７℃で１、２時間反応した。
反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を取り除き蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、励起光として４８８ｎｍと５１４ｎｍに強いレーザー光を発するアルゴンレーザを使用し、標識物質として用いた夫々の蛍光物質に応じた波長で蛍光強度を測定した。使用した蛍光物質の波長は、６−ＦＡＭは５１３ｎｍ、ＨＥＸは５６０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは５８０ｎｍおよびＲＯＸは６１０ｎｍである。
このように４種類の蛍光物質を標識物質として使用することによって、１キャピラリー内で効率的に標的部位の塩基を決定することが可能である。
第５の実施例
第４の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第５の実施例を実施した。第４の実施例に記載した方法と同様に、ターゲット核酸をハイブリダイズした。次に、第４の実施例において使用した伸長反応液に変えて、次の伸長反応液［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を用い、他の条件は第４の実施例の記載と同様にして伸長反応を行った。
この反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＣｙ３−Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸長されない。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＧまで伸長された。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されない。
このようにして、変異の有無を検出することができる。
第６の実施例
第６の実施例を模式図である図３を用いて説明する。本例では、それぞれに異なる選択用配列を有する第１、第２および第３のプローブ核酸３ａ、３ｂおよび３ｃを固相化した以外は第５の実施例と同様に作成した反応容器３０を使用する。３Ａに示す通り、それぞれのターゲット核酸３１ａ〜３１ｃに含まれる標的部位の塩基を便宜上「Ａ」として示した。
第５の実施例において記載した方法に従って、先ず、３Ｂに示すようにターゲット核酸３１ａ〜３１ｃをプローブ核酸３２ａ〜３２ｃに対してハイブリダイズし、次に、３Ｃに示すように伸長反応を行う。続いて、３Ｃにおいて、反応部３５を例えば、約９５℃に温度を上昇させ、伸長したプローブ核酸３６からターゲット核酸３１を解離させ、反応部３５を具備するキャピラリー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排出することにより内容液をフローする。それにより、解離したターゲット核酸を除去して、３Ｄに示すように、伸長され標識されたプローブ核酸３６ａ、３６ｂおよび３６ｃをそれぞれ１本鎖として得ることが可能である。
上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段として熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するものではない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホルムアミド等を用いてもよい。
また、ターゲット核酸がＲＮＡであり、プローブ核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅＨなどを用いて行ってもよい。
上記では３種類のプローブ核酸とターゲット核酸の例を示したが、これ以上または以下の種類のプローブ核酸および／またはターゲット核酸を用いてもよく、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。
また、本例では２本鎖核酸を１本鎖核酸としてから蛍光強度を測定したが、二本鎖のままで蛍光強度を測定してもよい。同様に本明細書に開示した他の例についても１本鎖核酸としてから蛍光強度を測定してもよい。
本発明の態様に従うと、上述した第１の実施例から第６の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一部を変更して実施してもよい。
本発明の更なる側面に従うと、上述のような第６の実施例に示すような本発明の態様により得られた１本鎖標識化プローブ核酸も本発明の更なる態様として提供される。
例えば、本発明の態様に従って得た伸長され標識されたプローブ核酸を、１本鎖にした後に、更なる標識化プローブ核酸として、後述する第７の実施例として記載するようなヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用することも可能である。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされている。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされている。しかしながら、本発明の態様に従うと、ヌクレオチドの伸長反応を制御できるので、最終的に得られる更なるプローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。従って、ヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用するためのプローブ核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。
第７の実施例
ヌクレアーゼプロテクションアッセイへの利用
核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＳ１ヌクレアーゼは、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、ＤＮＡおよびＲＮＡともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに分解する。また２本鎖中の１本鎖部分にも作用し、これを分解する酵素である。また、この酵素はＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼＩも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌクレオチドにする。これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられている（図４）。
ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、固相化したプローブ核酸をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーション後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法である。例えば、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテクションされるので標識が保護されるのに対し、未反応のプローブ核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解されるので標識が遊離してしまう。従って、そのプロテクションされたプローブ核酸の標識量を、プローブ核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方法である（図５）。
このようなヌクレアーゼプロテクションアッセイを本発明の一部として変異解析のために利用することも可能である。例えば、第６の実施例に記載する方法により得た１本鎖標識化プロープ核酸を用いてヌクレアーゼプロテクションアッセイにより核酸を解析してもよい。また、第２から第５の実施例に記載する方法により得た２本鎖標識化プローブを第６の実施例に記載するような手段により１本鎖して得られた１本鎖標識化プローブ核酸を用いてもよい。また、そのようにして得られた１本鎖標識化プローブ核酸は、本発明の態様に従って得られたままで、即ち、基体に固相化されたままでヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用してもよく、或いは基体から遊離させ回収して利用してもよい。更に、回収した後に生成した後に使用してもよい。
本発明の更なる態様を、図６の模式図を用いて説明する。まず、第６の実施の態様に記載した方法と同様に、蛍光強度の検出以前の段階まで、即ち、図６の６Ａから６Ｄまでを行う。これにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸が得られる（６Ｄ）。
次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応する。６Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合それらはハイブリダイズする。即ち、前記標的核酸を含むターゲット核酸８７ａおよび８７ｂと標識化プローブ核酸８６ａおよび８６ｂがそれぞれハイブリダイズする。その後、６Ｆに示すように、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する。その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった標識化ターゲット核酸８６Ｃは分解される（６Ｇ）。続いて、反応部８５内の容器をフローさせ、分解された核酸を除去し（６Ｇ）、蛍光強度を検出する（６Ｈ）。
本態様により使用されるヌクレオチドプロテクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、適宜決定されればよい。
ここに示した態様では、プローブ核酸の伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションアッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るものではなく、上述したプローブ核酸の伸長および標識化により得られた更なる伸長され標識されたプローブ核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸として予め作成し、所望に応じてヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用してもよい。
キャピラリー形状の反応容器を用いる場合の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定までの処理を自動化できる可能性が大きいことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場合、そこに含まれる溶液を容易に置換することが可能であることも更なる利点である。
上述したような本発明の態様によって得られた標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイは次のような利点を得ることが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるのでハイブリダイゼーション前のプローブ核酸の固相量を予め知ることが可能である。即ち、プローブ核酸の固相の量や点着スポットの状態を反応前に知ることが可能である。従って、プローブ核酸の固相の精度管理が可能である。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを避ることが出来る。
第８の実施例
本発明の更なる側面に従うと、１プローブ核酸に対して、複数回、ターゲット核酸を含む被検試料を繰り返し処理することも可能である。
第１の実施例に記載した反応容器と同じ構成を有する反応容器１を使用し、本発明の態様に従い２回繰り返して処理する場合の例について、各工程における各分子の状態を模式的に示した図７を用いて説明する。
まず、プローブ核酸９２を反応部９５の底面９４に固相化する。次に、反応部９５に対して、第１のターゲット核酸９１ａと第１の蛍光標識化基質核酸９３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（７Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の標的部位（図７では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（７Ｃ）。
或いは、上記のハイブリダイゼーションの際に、蛍光標識化基質核酸９３ａおよび非標識化基質核酸は添加せずに、最初に、プローブ核酸９２と第１のターゲット核酸９１ａとをハイブリダイズし、その後、両基質核酸とポリメラーゼを添加して伸長反応を行ってもよい。
ここで、所望の箇所、即ち、第１の標的部位の次の塩基で伸長反応を停止するためには、例えば、第１の標的部位の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰを添加しないという手段を用いればよい。
続いて、７Ｃに示すように、反応部９５に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５℃に温度を上昇させ、伸長されたプローブ核酸９６ａからターゲット核酸９１ａを解離させる。反応部９５を具備するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液などを注入し排出することによって内容液をフローして解離核酸を除去する。その結果、７Ｄに示すように、伸長され標識されたターゲット核酸９６ａが１本鎖として得られる。
続いて、７Ｅに示すような第２のターゲット核酸９１ｂと第２の蛍光標識化基質核酸９３ｂ（ここでは例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で、伸長され標識されたターゲット核酸９６ａに対して加えハイブリダイゼーションを行う（７Ｇ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の標的部位（図７では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（７Ｈ）。続いて、更に伸長され標識された第２のプローブ核酸９６ｂについて、第１の蛍光物質および第２の蛍光物質の蛍光強度を測定する（７Ｈ）。
或いは、上記のハイブリダイゼーションの際に、蛍光標識化基質核酸９３ｂおよび非標識化基質核酸は添加せずに、最初に、プローブ核酸９６ａとターゲット核酸９１ｂとをハイブリダイズし、その後、両基質核酸とポリメラーゼを添加して伸長反応を行ってもよい。
この態様においては、第２の標的部位の次の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸長しても、第２の標的部位まで伸長することも可能である。
また、上記の例では、プローブ核酸の伸長において、第１の標的部位と第２の標的部位の間に１の塩基が配置される例を示したが、これに限定するものではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以上の塩基が配置されてもよい。
７Ｈに示すように、得られた伸長され標識されたプローブ核酸９６ｂに含まれる第１の蛍光物質（図７では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図７ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望ましく、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが望ましい。また、検出される蛍光強度の違いによって、判定する場合や、使用する検出手段の選択によっては、必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
また更に、得られた伸長され標識されたプローブ核酸９６ｂを１本鎖に変性し、上述した方法の更なる繰り返しを行ってもよい。
本発明の態様に従うと、効率のよい遺伝子変異解析方法が提供される。
本発明の態様に従うと、反応容器内で、検出するべき標的部位を含むターゲット核酸とハイブリダイゼーションしたプローブ核酸についてのみ選択的に標識化することが可能である。従って、効率のよい遺伝子変異解析が可能であると共に、プローブ核酸の標識化を効率的に行うことも可能であり、且つ反応容器の製造コストも安価なものとなる。
本発明の態様に従うと、遺伝子の変異の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能である。
本発明の態様に従うと、標識化から発現頻度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行うことが可能である。
２． 遺伝子の発現解析方法
２．１ 遺伝子の発現解析方法の概要
本発明に従うと、被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法が提供される。そのような被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法の１態様を図８を用いて説明する。
まず、検出したい標的配列を有するターゲット核酸１０２を設定する。一方、前記標的配列に相補的な配列を有し、且つその配列の一部の塩基に標識物質を付与されたプローブ核酸１０１を準備する（８Ａ）。次に、プローブ核酸１０１を反応部１０５の底面１０４に固相化する。プローブ核酸１０１を固相化された反応部１０５に被検核酸を添加し（８Ｂ）、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で、それらを反応させる（８Ｃ）。ここで、被検核酸中に標的配列を有するターゲット核酸が存在すれば、ハイブリダイゼーションが生じ、２本鎖核酸が生じる。
続いて、１本鎖特異的ヌクレアーゼを添加し、適切な酵素反応が得られる条件下で反応を行う（８Ｄ）。その結果、１本鎖のままのプローブ核酸およびターゲット核酸などの当該反応系に存在する１本鎖核酸は当該酵素によって分解される。この酵素反応の後、反応系を洗浄し、そこに残った２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出し、それによって被検核酸中に標的配列を有するターゲット核酸が存在することを検出する。
また、このとき、被検核酸を対象から採取した核酸を含む試料とし、上述の通りに検出を行うことによって、対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法としても提供される。
本発明で利用されるヌクレオチドプロテクションアッセイにおいては、ヌクレアーゼによる分解反応中にヌクレアーゼを含む液体を流動させる工程を加えてもよい。この流動によって、ヌクレアーゼは固相化された多種類のターゲットに対応する標識化プローブ核酸に対して均質な分解作用をする。さらに、キャピラリーアレイのような流路の一方向にヌクレアーゼを含む溶液を連続的ないし断続的に流動させるようにすれば、分解反応と除去とを継続して実行することができるし、静止状態に起こるような酵素活性の低下も起こることなく活性状態を維持することができる。一方、本発明で利用されるヌクレオチドプロテクションアッセイにおいては、試料との反応前および反応後の両方の標識量を測定し、両方の標識量を比較することによって真の固相量に基づく反応量を正確に産出する工程を付加することもできる。
このような反応において使用される１本鎖特異的ヌクレアーゼは、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であり、１本鎖の核酸を選択的に分解する酵素である。その１つであるＳ１ヌクレアーゼは、ＤＮＡおよびＲＮＡともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに分解する酵素である（図４）。また、２本鎖中の１本鎖部分にも作用しこれを分解する。この酵素はＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼＩも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌクレオチドにする。従来、これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられている。
従来のヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、固相したプローブ核酸をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーション後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法である。例えば、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテクションされるので標識が保護されるのに対し、未反応のプローブ核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解されるので標識が遊離してしまう（図５）。従って、そのプロテクションされたプローブ核酸の標識量を、プローブ核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方法である。このような従来のプロテクションアッセイの例は、例えば、特表２０００−５１２４９９（米国特許５，７７０，３７０の日本での公表公報）に記載されている。
前記文献に記載されるような従来の方法に比較して、本発明は以下のような効果を有する。本発明の態様に従うと、上述したような本方法は、好ましくは後述するような温度制御の可能なキャピラリー形状の反応部を具備する反応容器中で行われる。キャピラリー形状の反応部を具備する反応容器を使用することにより、反応前の操作（例えば、固相化や標識化）を同一のキャピラリーで実行することによって、効率的に全ての操作および反応を行うことが可能である。また、従来では必要であった煩雑な操作も不要になり、必要な試料の容量も微量ですむ。また、全ての反応について、小型の容器で一括して行うことが可能であるので自動化が可能である。また、本発明の態様に従うと、反応前のプローブの固相化の状態をモニターすることが可能である。更に、従来のＤＮＡアレイで行われるような競合反応により解析を行うのと異なり、本発明の態様では、他検体同士での比較や、キャピラリー間での比較、また、プレート間での比較が可能である。また、逆転写酵素でｃＤＮＡを作成したり、ラベルする作用で生じる効率の低下などを回避することが可能である。
上述したように、本発明に従う発現解析方法は、図１に示すようなキャピラリー形状の反応部２を具備する反応容器１内において実施されることが好ましい。
本発明において使用される「対象」の語は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む任意の哺乳動物、爬虫類、魚類および昆虫などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
本発明において使用される「被検核酸」の語は、標的配列の存在の検出対象となる核酸である。被検核酸は、自然界に存在する如何なる核酸であっても、人工的に作られた核酸であってもよい。例えば、遺伝子の発現頻度を解析する場合には、一般的には対象において発現されるｍＲＮＡが被検核酸であってよい。
対象から被検核酸を得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能であり、例えば、被検核酸がｍＲＮＡである場合には、例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを使用してもよい。しかしながら、これらの手段に限定されるのもではない。また、被検核酸は、対象から抽出された後に、それ自身公知の方法によって増幅されて本発明の態様に従う方法に供されてもよい。
また、標識されたプローブ核酸を得る場合に使用する「鋳型核酸」および「種プローブ核酸」もどのような核酸であってもよい。ここにおける「核酸」は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などであってもよく、その塩基配列および修飾の有無などは任意に選択すればよい。
本発明において使用される「標的配列」の語は、検出されるべき塩基配列を示す。ここで使用される「ターゲット核酸」の語は、検出されるべき塩基配列、標的配列を含む核酸を示す。
本発明において使用される「プローブ核酸」の語は、標的配列を検出するための核酸を示し、標的配列に相補的な塩基配列をその一部に含む核酸である。また、ここで使用される「標識化プローブ核酸」の語は、その配列の一部分の塩基に標識物質が付与されている核酸を示す。本発明の態様に従うプローブ核酸は、その５’末端を介して基体に固相化されている。プローブ核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所望のプローブ核酸を固定することによって行うことが可能である。
本発明の態様に従って使用され得る「基体」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の基体であってもよい。あるいは、「基体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。処理の容易さから、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ましい。
キャピラリー形状の反応部を有した反応容器の場合、例えば、シリコン基板またはガラス基板などの基体に、幅および厚さ約１０〜約５０μｍで形成された溝によりキャピラリー形状の反応部が形成されてもよい。また、１反応容器に具備されるキャピラリー形状の反応部は、例えば、キャピラリー間隔約５０μｍで１反応容器に約５０〜約１００本／ｃｍの本数で具備されてもよい。また、各々のキャピラリーは反応温度に素早く到達できるような構成であることが好ましい。
本発明において使用される「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いてもよい。また、異なる部位に存在する複数の核酸を標的配列として検出する場合や、複数のプローブ核酸を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよい。
本発明の方法において使用される１本鎖特異的ヌクレアーゼは、１本鎖核酸を分解することが可能な酵素であればよい。そのような酵素は、それ自身公知の何れの酵素を使用してよく、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼＩなどを使用することが可能である。
２．２ 標識化プローブ核酸の調製方法
本発明では、プローブ核酸の所望の部位に対して標識物質を付与する際に使用されるそれ自身公知の何れの手段も、本発明において使用される「標識化プローブ核酸」を調製する際に使用してよい。また、以下において説明する標識化プローブ核酸の調製方法を、上述の遺伝子発現解析方法で使用される「標識化プローブ核酸」を調製する際に使用してもよい。以下、図９を用いて「標識化プローブ核酸」を調製する方法を説明する。
先ず最初に、鋳型捕獲用配列を有する種プローブ核酸１２２を、その５’末端を介して反応部１２５の底面１２４に固相化する。次に、鋳型核酸１２１を反応部１２５に添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件、例えば、厳格な（ストリンジェンシーな）条件、で反応を行う。ここで、鋳型核酸１２１は、その３’端側に鋳型捕獲用配列に相補的な配列ａを、配列ａの５’側の隣りに被標識配列ｂを、更に被標識配列ｂの５’側の隣りに伸長配列ｃを含む（９Ａ）。このような構成によって、鋳型核酸１２１は、種プローブ核酸１２２に対してハイブリダイズする。図９には、被標識配列ｂが「Ａ」即ちアデニンである場合を示す。
ハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイゼーションに使われなかった鋳型核酸１２１を除去する。
続いて、反応部１２５に対して、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸１２３と、伸長配列ｃに相補的な塩基を含む非標識化デオキシヌクレオシド三リン酸１２７および１２８と、ポリメラーゼとを反応部に添加し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う（９Ｄ）。伸長反応終了後、伸長反応に使用されなかった基質を除去する。その後、得られた２本鎖を変性し、鋳型核酸１２１を除去する。それにより標識されたプローブ核酸１２６が得られる。得られた標識されたプローブ核酸１２６は、反応部１２５に固相化されたままの状態で使用しても、回収してから使用していよい。
また、上述の例では、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応の後に、反応に供されなかった物質を除去している。しかしながらこれらの除去は必ずしも行う必要はない。
ここで、鋳型核酸の長さは、目的とする標識されたプローブ核酸の長さに応じて変更すればよい。例えば、鋳型核酸の長さは１０塩基から１０００塩基でよく、好ましくは１５塩基から２００塩基であればよい。
種プローブ核酸の長さは、１０塩基から５０塩基でよく、好ましくは１５塩基から３０塩基であればよい。また、上記の例では被標識配列がアデニンの例を示したが、これに限定するものではなく、シトシン、ウラシル、チミン、グアニン何れであってもよい。
伸長配列は、種プローブ核酸に標識化基質が取り込まれた後に、続いて取り込まれる非標識化基質の種類および長さを決定する配列である。従って、実施者が任意に選択することが可能である。しかしながら必ずしも伸長配列が存在する必要はなく、伸長配列が存在しない場合には、標識化基質が種プローブ核酸の末端に存在する。伸長配列の長さは、１塩基から５０塩基であればよく、好ましくは１塩基から１０塩基である。
本発明に従うと、以下の［１］〜［６］に記載の態様も本発明として好ましく提供される。
［１］ 以下の工程により得られる標識化プローブ核酸：
（１）種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼの存在する条件下で、前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程で得られた２本鎖を解離することにより、１本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
［２］ 以下の工程により得られる標識化プローブ核酸：
（１）第１の種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記第１の種プローブ核酸に相補的な第１の相補配列と、この第１の相補的配列の５’側に存在する第１の被標識配列と、第１の被標識配列の５’側に存在する第１の伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記第１の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された第１の標識化基質核酸と、前記第１の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非標識基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（１）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記第１の種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することにより、第２の種プローブ核酸を得る工程と、
（４）前記（３）で得られた第２の種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記第２の種プローブ核酸の３’側の一部の配列に相補的な第２の相補的配列と、この第２の相補的配列の５’側に存在する第２の被標識配列と、第２の被標識配列の５’側に存在する第２の伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（５）前記第２の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含んでおり標識物質を付与された第２の標識化基質核酸と、前記第２の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非標識基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（４）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記第２の種プローブ核酸を伸長する工程と、
（６）前記（５）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することによって１本鎖として標識化プローブ核酸を得る工程。
［３］ 前記（６）の工程で得られた標識化プローブ核酸を種プローブ核酸として用いて、前記（４）の工程から（６）の工程を任意の回数だけ繰り返すことにより得られることを特徴とする上記［２］に記載の標識化プローブ核酸。
［４］ 前記種プローブ核酸がその５’末端を介して基体に固相化されていることを特徴とする上記［１］から［３］の何れか１に記載の標識化プローブ核酸。
［５］ 上記［１］から［４］の何れか１に記載の標識化プローブ核酸を用いることを特徴とし、以下の工程を含む、被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。
［６］ 上記［５］に記載の（１）の工程において使用される標識物質を付加された標識化プローブ核酸が、以下の工程により製造されることを特徴とする、上記［５］に記載の被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法：
（ｉ）種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、種プローブ核酸に対して反応させる工程と、
（ｉｉ）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼの存在する条件下で、前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた２本鎖を解離することにより、１本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
２．３ 実施例
本発明の遺伝子の発現解析方法は、上述の第１および第２の実施例で記載される反応容器に、検出したい標的配列に相補的な配列を含む標識化プローブ核酸を固相化して行うことができる。
第９の実施例：ヌクレアーゼプロテクションアッセイ１
本発明の態様に従う被検核酸中の標的配列の存在を検出方法の例を図１０を用いて説明する。
それ自身公知の何れかの手段により、所望する部分に対して標識物質を付与されたプローブ核酸を準備する。このような標識化プローブ核酸を第１の実施例に示す反応容器と同様の反応容器の底面に固相化する（１０Ｄ）。
例えば、これに限定されるものではないが、種プローブ核酸１６２ａから１６２ｃを反応容器の反応部１６５の底面１６４に固相化し（１０Ａ）、鋳型核酸１６１ａから１６１ｃと、蛍光標識化基質核酸１６３（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えてハイブリダイゼーションを行い（１０Ｂ）、ポリメラーゼを添加して所望の塩基まで伸長反応を行い、更に加熱しながらまたは加熱後にフローを行って一本鎖とし（１０Ｃ）、所望する標識化プローブ核酸１６６ａから１６６ｃを合成してもよい（１０Ｄ）。また、ここでは、ハイブリダイゼーション時に蛍光標識化および非標識化基質核酸を存在させたが、ハイブリダイズ終了後のポリメラーゼ添加と共に蛍光標識化および非標識化基質核酸を添加してもよい。
次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応する。１０Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合、ハイブリダイゼーションが生じる。ここで示す例は、前記標的配列を含むターゲット核酸１６７ａおよび１６７ｂとプローブ核酸１６６ａおよび１６６ｂが、それぞれにハイブリダイズしている（１０Ｅ）。
その後、１本鎖特異的ヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する（１０Ｆ）。その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった１本鎖のプローブ核酸１６６ｃは分解される（１０Ｇ）。次に、反応部１６５内の内容物をフローさせ、分解された核酸を除去する（１０Ｇ）。続いて、反応部１６５について蛍光強度を検出する（１０Ｈ）。
本態様により使用されるヌクレオチドプロテクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、適宜決定されてよい。
ここに示した態様では、種プローブ核酸の伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションアッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るものではない。予め、上述した種プローブ核酸の伸長および標識化により得られた、更なる伸長され標識されたプローブ核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化プローブ核酸として作成しておき、所望の時期にヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用してもよい。また、他のそれ自身公知の方法によって所望の位置に標識を付与した１本鎖標識化プローブ核酸を使用してもよい。
上述したような本発明の態様に従う標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを次のような有利点をもって行うことが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるので、ハイブリダイゼーション前に、予めプローブ核酸の固相量を知ることが可能である。即ち、固相化されたプローブ核酸量や点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。それによって、プローブ核酸の固相について精度管理を行うことが可能になる。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを回避することが可能である。
キャピラリー形状の反応容器を用いる場合の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定までの処理を行えるため、装置を自動化できる可能性が大きいことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場合、そこに含まれる溶液の置換も容易である。
第１０の実施例：ヌクレアーゼプロテクションアッセイ２
まず、第１の実施例と同様の方法により反応容器を形成した。第１の基板に、ガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を形成し、この溝の両端にそれぞれ貫通孔を形成した。第２の基板は、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）である。
ストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン社製）に対して、５’端をビオチン標識し、且つ３’端から１０番目のＴをＣｙ３標識したＰＲＨ−ＨＰＲＴ１Ｍ．ＢＤ｛ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣ（Ｔ−Ｃｙ３）ＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号４）｝を１０ｎＭで点着装置を用いてスポッティングした。これによりビオチン−アビジン反応でプローブ核酸が固相化された。続いて、第１の基板と第２の基板を接合した。
上述のようにして作成した反応容器に前記溝によって形成されたキャピラリー内に、ターゲット核酸として１０ｎＭのＰＲＨ−ＨＲＲＴ１ＲＶ．０（ＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＡＧＣＣＣＣＣ（配列番号５））を添加した。このとき、溶媒としては１×ＳＳＣ溶液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）を使用した。これを４２℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液で十分に洗浄し、未反応のターゲット核酸を当該キャピラリーから除去した。次に、Ｓ１ヌクレアーゼ溶液（３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＺｎＳＯ４の緩衝液中）をキャピラリー内に添加し、３７℃で１時間反応した。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄し、未反応物質を除去して蛍光強度を測定した。表３にＰＲＨ−ＨＰＲＴ１ＲＶ．０ターゲット核酸を濃度１０ｎＭで存在させた場合と、当該ターゲット核酸を存在させなかった場合に得られる蛍光強度を相対的に示した。
表３中の蛍光強度は、一番強い蛍光強度を１とした場合の相対値である。表から分かるように、本態様に従う方法によると、定量的にターゲット核酸の検出を行うことが可能である。
本発明の態様に従うと、反応容器内で、標的配列を有するターゲット核酸にハイブリダイズしたプローブ核酸についてのみ、その標識物質からの信号が選択的に検出される。従って、効率のよい遺伝子発現頻度解析が可能である。
本発明の態様に従うと、遺伝子の発現頻度の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能である。また、本発明の態様に従うと、標識化から発現頻度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行うことが可能である。
本発明に従う遺伝子の発現頻度の解析は、従来の解析方法のような競合反応ではないので、他検体などについて検出を行った反応容器との間で比較をすることができる。即ち、複数の反応容器間（例えば、キャピラリー間や、プレート間など）での比較が可能である。
また、プローブ核酸の固相状況を把握することが可能であるので、プローブ核酸の固相量や、点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。従って、プローブ固相の精度管理が可能である。
第１１の実施例：標識化プローブの製造１
上述のような第１の実施例に示すような反応容器を用いて、次の実験を行った。
前記キャピラリー内に、鋳型核酸として前記ＲＶ核酸の配列に相補的なＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加し、３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応の鋳型核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を前記キャピラリー内に添加し３７℃で１〜２時間反応させた。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄して未反応物を取り除き蛍光を測定した（表４）。
表４は、種プローブ核酸の基体への点着量を１０ｎＭまたは１ｎＭとした場合に、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしとした場合に得られる蛍光強度を示す表である。表中の蛍光強度は、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値である。
表４に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、種プローブ核酸への標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、種プローブ核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。
このような反応により生じる現象を、図９に模式的に示した。本反応では、９Ａに示すように、鋳型核酸１２１として５’末端をビオチン標識したＲＶ核酸（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列番号１）１２１を、プローブ核酸１２２としてＲＶｃｏｍｐ ｔａｒｇｅｔ（ｔｇｃａｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ；配列番号２）を使用した。また、被標識配列ｂはそこに存在する塩基をＡとし、それに相補的な塩基を含む標識化基質核酸としては蛍光標識した塩基Ｕ２３を用いた（９Ａ）。本明細書において、各略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシンである。また、本明細書において例として挙げる塩基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないので、それらの塩基に限定するものではない。
また、鋳型核酸１２１は、捕獲用配列ａを含み、且つその捕獲用配列ａの５’側に被標識配列ｂを含む。この捕獲用配列ａによって、種プローブ核酸１２２とのハイブリダイゼーションが達成される。続く、種プローブ核酸１２２の３’端の伸長は、鋳型核酸１２１の捕獲用配列ａよりも５’側の配列を鋳型として達成される。更に、その鋳型核酸１２１の捕獲用配列ａよりも５’側に含まれる被標識配列ｂの塩基に対して、標識化基質１２３がハイブリダイズして取り込まれることによって、標識化が達成される。
ここでは１塩基の被標識配列を用いた例を示したが、被標識配列は１塩基のみを含むものに限らず、連続した複数の塩基を含んでいてもよく、または断続的な複数の塩基であってもよい。
このようなプローブ核酸の標識化は、上述のようにキャピラリー形状の反応容器を使用すると、必要とされる試料および試薬の量が微量でよいという効果が得られる。
以上のような本発明の態様に従うと、プローブ核酸の標識化を容易に行うことが可能である。本態様に従うと、所望する特定の配列を有するプローブ核酸の特定の塩基を選択的に標識することが可能であり、これによって、被検試料中に含まれる被検核酸に標的配列が存在するか否かを判定することが可能である。それにより、遺伝子の発現頻度を解析することが可能である。また、上述のような方法により標識化したプローブ核酸も本発明の範囲内である。
第１２の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法２
第１の実施例に記載した反応容器を用いて、伸長反応液を変更したこと以外は第１１の実施例に記載の方法と同様に標識化プローブ核酸を作成した。
第１１の実施例において使用した伸長反応液に変えて、次の伸長反応液｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む｝を用い、他の条件は第１１の実施例の記載と同様にして標識化プローブ核酸を作成した。
その反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用いた場合には、種プローブであるＲＶ核酸はその３’端からＣｙ３−Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸長されなかった。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶ核酸はその３’端からＧまで伸長された。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されなかった。
表５は、種プローブ核酸の基体への点着量を１０ｎＭと１ｎＭとし、且つＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしの場合について、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値を示す。
表５に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、種プローブ核酸への標識基質核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、種プローブ核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。
本発明は、鋳型核酸とハイブリダイズした種プローブ核酸のみを標識化することが可能である。また、鋳型捕獲用配列にハイブリダイズするべき標識化基質核酸以外の基質核酸を、それ以降伸長反応できないようなヌクレオチド（例えば、ｄｄＮＴＰなど）にすれば、或いは反応系に存在させないようにすれば、種プローブ核酸の標識量および伸長程度を制御することができる。
また、種プローブ核酸に取り込まれる標識物質の量は、鋳型核酸の量に依存する。従って鋳型核酸として試料中の被検核酸を使用すれば、特定の条件において発現された核酸の情報を反映した標識化プローブ核酸を作成することが可能である。また、そのような場合には、鋳型核酸の量は、その核酸の発現頻度に依存して変化するので、標識化プローブ核酸を作成すると同時に、鋳型核酸として用いられた標的核酸についての遺伝子発現頻度も同時に測定することも可能である。このような遺伝子発現頻度解析方法は、微量な試料で行うことが可能である。即ち、全ての処理を小型の容器内で、一連の処理として行うことが可能であるので、核酸基質（例えば、ｄＮＴＰなど）の量および必要な試薬の量を低減することが可能であり、また、多検体について短時間に解析することも可能である。
第１３の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法３
第１３の実施例を模式図である図１１を用いて説明する。本例では、それぞれに配列の異なる第１の種プローブ核酸１３２ａ、第２の種プローブ核酸１３２ｂ、および第３の種プローブ核酸１３２ｃを反応部の底部１３４に固相化した以外は第１の実施例と同様に作成した反応容器を使用する。また、１１Ａでは、それぞれの鋳型核酸１３１ａ〜１３１ｃに含まれる被標識配列は便宜上「Ａ」として示した。
本発明に従う標識化プローブ核酸の作成は、以下のように行うことも可能である。先ず、１１Ｂに示すように鋳型核酸１３１ａ〜１３１ｃを種プロープ核酸１３２ａ〜１３２ｃに対してハイブリダイズし、次に、１１Ｃに示すように標識化基質核酸１３３を基質として用いて伸長反応する（１１Ｂ〜１１Ｃ）。続いて、反応部１３５について、例えば、約９５℃に温度を上昇させ（１１Ｃ）、伸長したプローブ核酸１３６から鋳型核酸１３１を解離させ、反応部１３５を具備するキャピラリー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排出することによって内容液をフローさせる。それにより、解離したターゲット核酸を除去し、伸長され標識されたプローブ核酸１３６ａから１３６ｃを１本鎖として得る（１１Ｄ）。
上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段として熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するものではない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホルムアミド等を用いてもよい。
また、鋳型核酸がＲＮＡであり、プローブ核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅＨなどを用いて行ってもよい。
上記では３種類の種プローブ核酸と鋳型核酸の例を示したが、これ以上またはこれ以下の種類の種プローブ核酸および／または鋳型核酸を用いてもよく、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。
本発明の態様に従うと、上述した第９の実施例から第１３の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一部を変更して実施してもよい。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされている。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされている。それに対して、本発明の態様に従うと、ヌクレオチドの伸長反応を制御できる。従って、最終的に得られる更なる標識されたプローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。それにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用するためのプローブ核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。
第１４の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法４
本発明の更なる側面に従うと、１種プローブ核酸に対して、複数回繰り返して異なる種類の鋳型核酸をハイブリさせて伸長処理することも可能である。
第１の実施例に記載する反応容器と同様な反応容器を使用し、本発明の態様に従い標識を２回繰り返して行う場合の例を図１２を用いて説明する。
まず、第１の鋳型核酸１４１と種プローブ核酸１４２と蛍光標識基質核酸１４３ａを用意する（１２Ａ）。次に、種プローブ核酸１４２を反応部１４５の底面１４４に固相化する（１２Ｂ）。次に、反応部１４５に対して、第１の鋳型核酸１４１ａと第１の蛍光標識化基質核酸１４３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えてハイブリダイゼーションを行う（１２Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の被標識配列（図１２では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（１２Ｃ）。
ここで、所望の箇所、即ち、第１の被標識配列の次の塩基で伸長反応を停止するためには、第１の被標識配列の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰを添加しないでおけばよい。或いは第１の被標識配列の次の塩基に相補的な塩基からなる基質をｄｄＮＴＰにしてもよい。
また、上記では、蛍光標識基質核酸１４３ａと非標識化基質核酸の添加をハイブリダイゼーションに先駆けて添加しているが、蛍光標識基質核酸１４３ａと非標識化基質核酸の添加はハイブリダイゼーションの後に、ポリメラーゼの添加と同時またはその前後に行ってよい。
続いて、１２Ｃに示すように、反応部１４５に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５℃に温度を上昇させ、伸長されたプローブ核酸１４６ａから鋳型核酸１４１ａを解離させる。反応部１４５を具備するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液などを注入し排出することによって内容液をフローして解離核酸を除去する。その結果、１２Ｄに示すように、伸長され標識されたプローブ核酸１４６ａが１本鎖として得られる（図１２）。
続いて、１２Ｅに示すような第２の鋳型核酸１４２ｂと第２の蛍光標識化基質核酸１４３ｂ（ここでは例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（１２Ｇ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の被標識配列（図１２では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（１２Ｈ）。更に、鋳型核酸１４２ｂを解離させ、１本鎖を得る。
また、上記では、ハイブリダイズに先駆けて第２の蛍光標識基質核酸１４３ｂと非標識化基質核酸を添加しているが、ハイブリダイズの後で、ポリメラーゼの添加と同時、またはその前後に添加してもよい。
この態様においては、第２の被標識配列の次の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸長しても、第２の標的配列までで伸長を止めてもよい。
また、上記の例では、種プローブ核酸の伸長において、第１の被標識配列と第２の被標識配列の間に１の塩基が配置される例を示したが、これに限定するものではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以上の塩基が配置されてもよい。
１２Ｈに示すように、得られた第２の伸長され標識されたプローブ核酸１４６ｂに含まれる第１の蛍光物質（図１２では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図１２ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望ましく、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが望ましい。しかしながら、検出される蛍光強度の違いによって判定する場合や、使用する検出手段の選択の仕方によっては、必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
また更に、得られた第２の伸長され標識されたプローブ核酸１４６ｂを更に１本鎖に変性し、上述した方法を更に繰り返してもよい。
以下に、具体的な１例を挙げて更に説明する。
まず、第１の実施例に記載の反応容器と同様な反応容器を用いて、ハイブリダイゼーション可能な条件下で第１の種プローブ核酸と第１の鋳型核酸とのハイブリダイゼーションを行う。続いて伸長反応溶液を｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む｝を用いることを除き、第１１の実施例に記載の方法と同様の方法により伸長反応を行う。
このハイブリダイゼーションと伸長反応によって、第１の鋳型核酸の存在およびその配列情報が第１のプローブ核酸の伸長および標識化に反映される。即ち、第１の種プローブ核酸にハイブリダイズした第１の鋳型核酸を鋳型として、第１の種プローブ核酸が伸長され、Ｃｙ３−Ｕが取り込まれ、Ｇの手前まで伸長される。その結果、第１の鋳型核酸にハイブリダイズした第１の伸長され標識されたプローブ核酸が得られる。
次に、温度を約９５℃に上昇させることにより、第１の伸長され標識されたプローブ核酸から第１の鋳型核酸を解離する。更に、反応部に含まれる溶液をフローすることにより、遊離した第１の鋳型核酸を除去する。
続いて、第２の鋳型核酸をハイブリダイゼーション可能な条件下においてハイブリダイズさせ、伸長反応溶液を｛１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ポリメラーゼＩ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ５−ｄＡＴＰ、０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのｄＴＴＰを含む｝を用いることを除いて第１１の実施例に記載の方法と同様の方法により伸長反応を行う。
上記の反応により、第２の鋳型核酸の存在が反映され、第２の鋳型核酸と第１の伸長され標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが生じ、続いて、更なる伸長および標識化が生じ、第２の伸長され標識されたプローブ核酸が得られる。第２の伸長され標識されたプローブ核酸は、Ｃｙ５−Ａで標識化され、Ｃの手前まで伸長される。
次に、得られた２本鎖を変性して１本鎖にすることにより、標識されたプローブ核酸を得ることが可能である。この標識されたプローブ核酸は、所望によっては基板から回収して使用してもよい。
ここで、Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光強度をそれぞれにまたは相対的に測定することによって、使用した第１の鋳型核酸と第２の鋳型核酸の量または相対量を測定することも可能である。
以上のような本発明の態様に従うと、複数のハイブリダイゼーションおよび標識化に関する全ての処理が、小型の容器内で、一括して、即ち、一連の操作によって行うことが可能である。従って、少ない試料で、所望する遺伝子発現頻度解析を短時間に、簡便に行うことが可能である。また、プローブ核酸の伸長の程度を制御でき、また、所望のプローブ核酸を伸長していく途中の所望の部位に容易に標識を行うことが可能である。
第１５の実施例：標識化プローブ核酸の製造方法５
本発明の態様に従い使用され得る種プローブ核酸と鋳型核酸とがハイブリダイズした場合の状態の例を、図１３の１３Ａから１３Ｄまでに模式的に示す。
上述した通り、種プローブ核酸１５１は、反応部の底部１５２にその５’末端を介して固相化されている。
１３Ａに示すように、鋳型核酸１５３の全長は、種プローブ核酸１５１の全長よりも長いことが好ましい。それにより、鋳型核酸１５３と鋳型核酸１５１がハイブリダイズした際に、その長さの違いから生じる鋳型核酸１５３の１本鎖の部分を鋳型として、種プローブ核酸１５１の３’末端が伸長される。また、このとき被標識配列は鋳型核酸１５３の１本鎖の部分の最も３’よりに存在することが好ましい。
また、１３Ａおよび１３Ｃに示すように、種プローブ核酸１５１の全長に相補的な配列を、鋳型核酸１５３が含み、その上で、更に余分な配列が鋳型核酸の５’側に含まれるようにしてもよい。
或いは、１３Ｂおよび１３Ｄに示すように、種プローブ核酸５１の一部に相補的な配列を鋳型核酸１５３の３’側が含み、更に余分な配列を鋳型核酸１５３の５’側に含むように設計してもよい。
また、１３Ａおよび１３Ｂに示すように、被標識配列として１ヌクレオチドが１箇所に設定されてもよく、１３Ｃおよび１３Ｄに示すように、被標識配列として１ヌクレオチドが２箇所以上で設定されてもよい。
上述のまた、上述の第１１の実施例から第１５の実施例までの何れかにより得られる標識化プローブ核酸を、上述の第９の実施例および第１０の実施例において用いて、同様にアッセイしてもよい。第１１の実施例から第１５の実施例により得られた１本鎖標識化プローブ核酸は、基体に固相化されたままでヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用されてもよく、或いは基体から遊離させ回収した後に利用してもよい。また、回収して、更に精製した後で使用してもよい。
上述したような本発明の態様によって得られた標識化プローブ核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを次のような有利点をもって行うことが可能である。即ち、プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるので、ハイブリダイゼーション前に、予めプローブ核酸の固相量を知ることが可能である。即ち、固相化されたプローブ核酸量や点着スポットの状態を反応前に把握することが可能である。それによって、プローブ核酸の固相について精度管理を行うことが可能になる。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを回避することが可能である。
上述のような本発明によって、効率のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供された。また、上述のような本発明によって、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法が提供された。更に、上述のような本発明によって、検出精度のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供された。
３． 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法
３．１ 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の概要
上記２．２の欄で説明した「標識化プローブ核酸の調製方法」は、別の側面に従えば、標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法ということもできる。以下、標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法について詳説する。当該方法により作成される標識プローブ核酸を固相化した支持体は、核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に有用である。とりわけ、上記２．１の欄で説明した「ヌクレアーゼプロテクションアッセイを利用した遺伝子の発現解析方法」に有用である。
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法について、第一から第三の実施の形態を例に説明する。
第一の実施の形態
本発明の第一の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の３’端の１以上のヌクレオチドが欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む。
第一の実施の形態では、支持体上に作成される各標識プローブ核酸は、その３’側に標識ヌクレオチドが導入される。
以下、各工程について、図１４を参照しながら順に説明する。
［工程（１）］
工程（１）の反応により、図１４（ａ）に模式的に示す状態が作成される。
まず、目的とする解析に応じて、支持体上に作成する標識プローブ核酸の塩基配列をデザインする。一般に標識プローブ核酸の長さは、１５〜５０塩基とすることができる。
デザインされた標識プローブ核酸の塩基配列に基いて、「鋳型核酸２０２」および「未標識プローブ核酸前駆体２０３」を調製する。
ここで、「鋳型核酸２０２」および「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、それぞれ、ＤＮＡを構成するデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、その他ｄＵＴＰ等のヌクレオチドから構成され得る。
「鋳型核酸２０２」は、作成したい標識プローブ核酸に相補的な配列を有するように調製される。一方、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、「鋳型核酸」の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の３’端の１以上のヌクレオチドが欠損するように調製される。この欠損部分に、後の工程で標識ヌクレオチドが少なくとも一つ導入される。ここで、欠損させるヌクレオチドの数は、好ましくは２〜１０個とすることができる。欠損させるヌクレオチドの数を好ましくは２以上とした理由は、標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドに標識が取込まれることを、標識の安定性の観点から避けるためである。また、欠損させるヌクレオチドの数を好ましくは１０以下とした理由は、取込まれる標識ヌクレオチドの数を制限するためである。
欠損させるヌクレオチドの数は、作成したい標識プローブ核酸の３’端側の塩基配列と、欠損部分に後の工程で導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類とを考慮して決定する。例えば、作成したい標識プローブ核酸が、その３’端からＡＡＣＵＡＣＡＵＵＡ・・・という配列を有し、欠損部分に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、「未標識プローブ核酸前駆体」は、作成したい標識プローブ核酸の３’端から４〜７のヌクレオチドを欠損させることができる。この場合、標識ヌクレオチドＣｙ５−ｄＵＴＰは、欠損部分に一つだけ導入されることになる。このように、「未標識プローブ核酸前駆体」に一つの標識ヌクレオチドのみが導入されるように、欠損させるヌクレオチドの数を制御すれば、ＤＮＡアレイ上のすべての標識プローブを同じ標識物質の量で均一に標識することが可能である。
「未標識プローブ核酸前駆体２０３」は、その５’端で支持体２０１に固相化されている（図１４（ａ））。本発明の方法において「支持体２０１」は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の支持体であってもよい。あるいは、「支持体」が、針、糸（ストランド）、繊維（ファイバ）、円錐（ディスク）、多孔質フィルタであってもよい。キャピラリー形状の反応部を有した反応容器（以下、キャピラリーアレイともいう）は、反応部内の溶液を置換することが容易であるため好ましく使用される。キャピラリーアレイの具体的な説明については、上述の第１および第２の実施例の記載を参照することができる。ここで用いた「支持体」の用語は、上記「基体」と同じ意味を有する。
「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の支持体への固相化は、従来公知の方法により行うことができる。例えば、核酸の固相化は、後述の実施例のようにアビジンコートされた支持体と、ビオチン標識された５’端を有する核酸とを用いてビオチンアビジン反応により行ってもよいし、あるいは、反応基を導入した支持体と、該反応基と反応性を有する反応基を５’端に有する核酸とを用いて化学結合により行ってもよい。
工程（１）において、「鋳型核酸２０２」と、支持体２０１上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体２０３」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１４（ａ）参照）。ここでのハイブリダイゼーションは、「鋳型核酸」と、支持体上に固相されていない「未標識プローブ核酸前駆体」とをハイブリダイズさせた後に、支持体上に固相してもよいし、「鋳型核酸」と、支持体上に予め固相した「未標識プローブ核酸前駆体」とをハイブリダイズさせてもよい。
「ハイブリダイズ可能な条件下で反応させる」とは、例えば適切なハイブリダイゼーション溶液（１×ＳＳＣ）中で、２５〜７０℃で（または９５℃で５分間ののち徐冷して２５〜７０℃で）５〜６０分間静置させることをいう。
［工程（２）］
工程（２）において、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の欠損部分（すなわち３’側）が、「鋳型核酸２０２」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１４（ｂ）参照）。
ここでの伸長反応には、その基質として、「検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチド４」と、「当該特定の塩基以外の他の各塩基の非標識ヌクレオチド５」とが使用される。ここで「標識物質」とは、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば蛍光物質、放射性物質、化学発光物質等であり得る。「特定塩基の標識ヌクレオチド」として、１種類の塩基の標識ヌクレオチドを使用し、「当該特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチド」として、他の３種類の塩基の各ヌクレオチドを使用することができる。ただし、これに限定されず、複数種類の塩基のヌクレオチドを標識ヌクレオチドとして使用してもよい。あるいは、後述の第二の実施の形態に記載されるとおり、ある種類の塩基のヌクレオチドを基質として使用しなくてもよい。例えば「標識ヌクレオチド」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用い、「非標識ヌクレオチド」として、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを使用することができる。
伸長反応溶液は、上述の基質となるヌクレオチド、伸長反応酵素（Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｍｇ２＋を含む公知の溶液を使用することができる。伸長反応は、例えば２５〜７０℃で５〜１２０分間行う。
「標識ヌクレオチド」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用いる場合、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分に、当該伸長反応により少なくとも１つのＣｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計することが必要である。すなわち、伸長反応の際に鋳型となる「鋳型核酸」の部分に、ｄＡＴＰが少なくとも１つ存在していなければ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰは導入されないため、Ｃｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計する必要がある。
好ましくは、「標識ヌクレオチド」としてＣｙ５−ｄＵＴＰを用いる場合、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分に、当該伸長反応により「１つの」Ｃｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を設計する。支持体上のすべての「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分のヌクレオチド数を、当該伸長反応により１つのＣｙ５−ｄＵＴＰが導入されるように設計しておくと、すべてのプローブ核酸１分子に対して、均一に１つのＣｙ５−ｄＵＴＰを導入することができる。これにより、支持体上のすべてのプローブ核酸を、１回の伸長反応により、均一な標識量で標識することが可能になる。
ただし、第一の実施の形態において、作成された標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドに標識が取込まれるようにすることは、標識の安定性の面から望ましくない。
［工程（３）］
工程（３）において、工程（２）の伸長反応により作成された「標識プローブ核酸」と、「鋳型核酸」との間の相補的結合をすべて解離させる（図１４（ｃ）参照）。
ここでの解離は、後述の実施例のように支持体上の伸長反応溶液を、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液に置換し、当該溶液中で５〜１０分間室温で反応させることにより行ってもよいし、９０〜９８℃で５〜１０分間維持し、熱処理を施すことにより行ってもよい。
［工程（４）］
工程（４）において、工程（３）で解離された「鋳型核酸」等を支持体上から除去し、標識プローブ核酸が固相化された支持体を作成する。ここでの除去は、緩衝液、オートクレーブ水等を用いた洗浄により行うことができる。
以上第一の実施の形態で説明したとおり、支持体上のプローブ核酸前駆体の３’端のヌクレオチドを幾つか欠損させておくことにより、プローブ核酸の３’側に標識を付与することが可能である。これを支持体上に複数の標識プローブ核酸を作成する際に適用して、支持体上のすべてのプローブ核酸前駆体の３’端のヌクレオチドを幾つか欠損させておけば、支持体上のすべてのプローブ核酸を一回の伸長反応で標識することが可能である。
また、本発明の方法は、支持体上のすべてのプローブ核酸前駆体の欠損部分を、導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類に応じて、１つの標識ヌクレオチドのみが導入されるように設計しておくことにより、支持体上のすべてのプローブ核酸に対して、それぞれ均一な標識量の標識を導入することができる。
これにより、支持体上のすべてのプローブ核酸を、１回の伸長反応により、均一に標識することが可能になる。このように、１回の伸長反応で、支持体上のすべてのプローブ核酸を標識できるという点において本発明は簡便であり、加えて、欠損部分のヌクレオチド数を制御することにより、核酸プローブに導入する標識物質の量を制御できるという点において優れている。
第二の実施の形態
本発明の第二の実施の形態に係る方法は、第一の実施の形態に係る方法と基本的には同じであるが、以下の点を特徴とする。すなわち、第二の実施の形態に係る方法は、欠損部分の伸長反応に使用するための「特定塩基の標識ヌクレオチド」が、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、欠損部分の伸長反応に使用するための「前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチド」の少なくとも１種類が、ジデオキシヌクレオチドであるか、あるいは存在しないことを特徴とする。
このように第二の実施の形態に係る方法は、上記特徴以外、第一の実施の形態に係る方法と同様であるため、各工程の詳細については、上記第一の実施の形態の工程の各説明を参照されたい。第二の実施の形態の概要を、図１５に模式的に示す。
第二の実施の形態では、まず、「鋳型核酸２０２」と、支持体２０１上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体２０３」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１５（ａ）参照）。次いで、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」の欠損部分（すなわち３’側）が、「鋳型核酸２０２」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体２０３」に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１５（ｂ）参照）。
ここで、「非標識ヌクレオチド」として、ジデオキシヌクレオチド７を用いることにより、ジデオキシヌクレオチドが欠損部分に導入された後の伸長反応を停止させることができる。「標識ヌクレオチド２０４」として、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを用いた場合、「ジデオキシヌクレオチド２０７」として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰの少なくとも１つを用いることができる。例えば、「未標識プローブ核酸前駆体」がその３’端からＵＵＡＡＣＵＡという配列を欠損しており、欠損部分に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、ｄｄＣＴＰを「非標識ヌクレオチド」として使用して、伸長反応を途中で停止させることができる。ここでは、ｄｄＣＴＰを用いることにより、伸長反応の際にＣｙ５−ｄＵＴＰが３分子取込まれないで１分子取込まれることになる。
あるいは、塩基がシトシンのヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄｄＣＴＰ）を伸長反応の際に存在させないことにより、伸長反応を途中で停止させることもできる。
伸長反応の後、伸長反応により作成された「標識プローブ核酸」と、「鋳型核酸」との間の相補的結合をすべて解離させる（図１５（ｃ）参照）。
第二の実施の形態では、ジデオキシヌクレオチドを用いたり、特定塩基のヌクレオチドを使用しないことにより、伸長反応を停止させる。このように特定塩基のジデオキシヌクレオチドの使用もしくは特定塩基のヌクレオチドの除去により、プローブ核酸への標識物質の導入量を制御することができる。
第三の実施の形態
本発明の第三の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
（１）作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドが一部欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
（２）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
（３）前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
（４）解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む。
第三の実施の形態では、支持体上に作成される各標識プローブ核酸は、その中間部分（例えば中央部分）に標識ヌクレオチドが導入される。この点を除いて、第三の実施の形態は、第一の実施の形態と同様である。
従って、以下、各工程について図１６を参照しながら順に説明するが、各工程（１）〜（４）の詳細については、第一の実施の形態の工程（１）〜（４）の各説明も適宜参照されたい。
［工程（１）］
工程（１）の反応により、図１６（ａ）に模式的に示す状態が作成される。
第一の実施の形態と同様、目的とする解析に応じて、支持体上に作成する標識プローブ核酸の塩基配列をデザインする。「鋳型核酸２０２」は、作成したい標識プローブ核酸に相補的な配列を有するように調製される。一方、「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」は、その総塩基数において、「鋳型核酸」の塩基数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドが一部欠損するように調製される。
本実施の形態では、「未標識プローブ核酸前駆体」は、図１６（ａ）に示すとおり、作成したい標識プローブ核酸の中間部分においてヌクレオチドを一部欠損しているため、欠損部分により分断された２つの「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」から構成される。２つの「未標識プローブ核酸前駆体２０３ａおよび２０３ｂ」を、図１６では、それぞれ「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」と称する。「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」は、それぞれ単独で、「鋳型核酸」にハイブリダイズすることができる長さであることが必要である。よって、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」および「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」は、それぞれ少なくとも６ヌクレオチド以上の長さを有し、好ましくは１０〜１５ヌクレオチドの長さを有する。このようにある程度の長さを有する２つの「未標識プローブ核酸前駆体」の間に欠損部分を作成するため、「中間部分」は、必然的に、作成したい標識核酸プローブの中央部分になる。
ここで、欠損させるヌクレオチドの数は、一般に１〜１５個、好ましくは５〜１０個とすることができる。欠損させるヌクレオチドの位置およびその数は、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列と、欠損させた領域に後の工程で導入する標識ヌクレオチドの塩基の種類とを考慮して決定する。例えば、欠損させた領域に導入する標識ヌクレオチドがＣｙ５−ｄＵＴＰである場合、欠損させるヌクレオチドの位置は、ｄＵＴＰが導入されるべき位置を含んでいなければならない。また、欠損させるヌクレオチドの数は、作成したい標識プローブ核酸の中央部分においてその塩基配列がＵである部分の前後１〜５個とすることができる。ここで、欠損させた領域に標識ヌクレオチドＣｙ５−ｄＵＴＰが一つだけ導入されるように欠損部分を選定すれば、支持体上のすべてのプローブ核酸に均一な標識量で標識を導入することができる。
工程（１）では、第一の実施の形態と同様にして、「鋳型核酸」と、支持体上に固相された「未標識プローブ核酸前駆体」とがハイブリダイズされた状態が作成される（図１６（ａ）参照）。
［工程（２）］
工程（２）において、「未標識プローブ核酸前駆体」の欠損部分（すなわち中間部分）が、「鋳型核酸」を鋳型とした伸長反応により修復されるとともに、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」と「未標識プローブ核酸Ｂ」の間に標識ヌクレオチド２０４が導入される（図１６（ｂ）参照）。ここでは第一の実施の形態と同様にして、伸長反応を５’から３’方向へと行う。ただし、第三の実施の形態では、伸長された最後のヌクレオチドの３’端と「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」（図１６の符号２０３ｂ）の５’端との間に切れ目（ニック）が存在し、伸長反応だけで標識核酸プローブは完全な１本鎖ではない。よって、伸長反応の後、好ましくはライゲーション反応を行う必要がある。ライゲーション反応は、ライゲース酵素を含む緩衝液中で１４〜３７℃で３０〜１２０分行うことができる。
工程（３）および（４）については、第一の実施の形態と同様にして行い、標識プローブ核酸が固相された支持体を作成する。
以上第三の実施の形態で説明したとおり、支持体上のプローブ核酸前駆体の中間部分のヌクレオチドを欠損させておくことにより、プローブ核酸の中間部分に標識を付与することが可能である。第三の実施の形態では、プローブ核酸の中間部分に標識を付与するため、中間部分の種々の任意の位置を欠損部分として選定することができる。この点において第三の実施の形態は、欠損部分がプローブ核酸の３’端に限定される第一の実施の形態に比べて、導入する標識ヌクレオチドの数を制御しやすいという点で優れている。また、プローブ核酸の中間部分に標識ヌクレオチドが入っていることは、標識が安定している点でも優れている。
従来の方法では、プローブ核酸の中間部分を標識化する場合には、高度な技術が必要とされていた。また、中間部位が標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされていた。それに対して、本実施の形態に従うと、プローブ核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。
３．２ 実施例
第１６の実施例
第１６の実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」の３’端を、標識ｄＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。
本実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」として、５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号６）を用い、「鋳型核酸」として、５’−ＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’（配列番号７）を用いた。
基板であるストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン）において、５’端にビオチンを結合した２０ｎＭ「未標識プローブ核酸前駆体」と、２０ｎＭ「鋳型核酸」とを、等量１０μＬずつ１×ＳＳＣ溶液（３０μＬ）中で混合し、３７℃で１時間反応させた。反応によりハイブリダイズした「未標識プローブ核酸前駆体」と「鋳型核酸」を、点着装置を用いて、ビオチンとアビジンとの反応により基板上に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄により除去した後、キャピラリーを形成可能な溝を有するキャピラリーカバーを基板上にかぶせ、核酸分子が固相化されたキャピラリーアレイを作成した。ここで、キャピラリーカバーは、両端に溶液を出し入れできる穴を有し、長さ３〜４ｃｍ。幅１ｍｍ、深さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリーを形成可能なものを使用した。
次いで、以下の成分からなる伸長反応溶液をキャピラリー内に入れ、３７℃で１〜２時間反応させた：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、１０μＭ ｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＡＴＰ→ｄＡＴＰと伸長し、「標識プローブ核酸」が作成される。
反応後、０．１×ＳＳＣでキャピラリー内の未反応物を十分洗浄することにより除去した。次いで、０．１Ｎ ＮａＯＨのアルカリ溶液をキャピラリー内に導入し、室温で５分間反応させ、「鋳型核酸」を「標識プローブ核酸」から解離した。解離された「鋳型核酸」を洗浄によりキャピラリー内から除去し、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。
表６は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
また、図１７は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」と「ネガティブコントロール」の蛍光顕微鏡写真を示す。図１７において、「（１）ネガティブコントロール」は、蛍光が観察されず、固相された「（２）標識プローブ核酸」は、蛍光が観察されている。
表６および図１７の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
第１７の実施例
第１７の実施例では、第１６の実施例と同様、「未標識プローブ核酸前駆体」の３’端を、標識ｄ−ＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。第１７の実施例では、標識ｄ−ＵＴＰを導入する伸長反応の際に、１０μＭ ｄＣＴＰの代わりに０μＭ ｄＣＴＰもしくは１０μＭ ｄｄＣＴＰを用いて伸長反応を途中で停止させた点において第１６の実施例と異なる。
第１６の実施例で使用した伸長反応溶液を、以下の成分に変えた以外、第１６の実施例と同様にして、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。すなわち、第１７の実施例では、以下の成分の伸長反応溶液を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、０μＭ ｄＣＴＰまたは１０μＭ ｄｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。
伸長反応のための基質ヌクレオチドとして、０μＭ ｄＣＴＰを用いた場合、伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰと伸長し、反応は停止する。一方、伸長反応のための基質ヌクレオチドとして、１０μＭ ｄｄＣＴＰを用いた場合、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰ→ｄｄＣＴＰと伸長し、反応は停止する。この結果、「標識プローブ核酸」が作成される。
表７は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
表７の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
第１８の実施例
第１８の実施例では、「未標識プローブ核酸前駆体」の中央付近に位置する欠損部分を、標識ｄＵＴＰを用いて伸長し、「標識プローブ核酸」を作成した。
本実施例では、図１６に示すとおり、「未標識プローブ核酸前駆体」として、２つのオリゴヌクレオチド、すなわち「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」：５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴ−３’（配列番号８）と「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」：５’−ＡＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡ−３’（配列番号９）を使用した。また、「鋳型核酸」として、５’−ＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１０）を使用した。
基板であるストレプトアビジンコートスライド（（株）グライナー・ジャパン）上において、２０ｎＭの「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」と、２０ｎＭの「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」と、２０ｎＭの「鋳型核酸」とを、等量１０μＬずつ１×ＳＳＣ溶液（３０μＬ）中で混合し、３７℃で１時間反応させた。反応によりハイブリダイズした「未標識プローブ核酸前駆体」と「鋳型核酸」を、点着装置を用いて、ビオチンとアビジンとの反応により基板上に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄により除去した後、キャピラリーを形成可能な溝を有するキャピラリーカバーを基板上にかぶせ、核酸分子が固相化されたキャピラリーアレイを作成した。ここで、キャピラリーカバーは、両端に溶液を出し入れできる穴を有し、長さ３〜４ｃｍ。幅１ｍｍ、深さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリーを形成可能なものを使用した。
次いで、以下の成分からなる伸長反応溶液をキャピラリー内に入れ、３７℃で１〜２時間反応させた：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＴＯＹＯＢＯ）、１０μＭ ｄＡＴＰ、１０μＭ ｄＣＴＰ、１０μＭ ｄＧＴＰ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ。伸長反応により、基板上の「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」は、その３’端を、ｄＡＴＰ→Ｃｙ５−ｄＵＴＰと伸長する。その後、「未標識プローブ核酸前駆体Ａ」の３’端のＣｙ５−ｄＵＴＰと、「未標識プローブ核酸前駆体Ｂ」の５’端のｄＡＴＰとの間の切れ目（ニック）をリガーゼにより連結した。具体的には、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、１００ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ溶液で、１６℃、１時間反応させることにより連結した。これにより、「標識プローブ核酸」が作成される。
反応後、０．１×ＳＳＣでキャピラリー内の未反応物を十分洗浄することにより除去した。次いで、０．１Ｎ ＮａＯＨのアルカリ溶液をキャピラリー内に導入し、室温で５分間反応させ、「鋳型核酸」を「標識プローブ核酸」から解離した。解離された「鋳型核酸」を洗浄によりキャピラリー内から除去し、「標識プローブ核酸」が固相されたキャピラリーアレイを作成した。
表８は、以上の方法で固相された「標識プローブ核酸」の蛍光強度を１００とし、「鋳型核酸」なしで同様の工程を経た場合（ネガティブコントロール）の蛍光強度をその相対値により示す。
表８の結果は、本発明の方法により、標識されたプローブ核酸が基板上に作成可能であることを示す。
以上説明したとおり、本発明の方法に従って作成された、標識プローブ核酸が固相された支持体は、当該標識プローブ核酸を用いた種々の解析、例えば遺伝子の発現解析等に利用することが可能である。
支持体上のプローブ核酸を標識する本発明の方法は、以下に記載の点で優れており、試料を標識する場合にみられた問題点を解決し得るものである。
まず、本発明の方法は、試料を標識しないので試料が分解する心配がない。また、本発明の方法は、支持体上のすべてのプローブ核酸に対して、１回の伸長反応により一括して標識を付与することができる点で簡便である。
また、アレイ上のデザインされた既知の配列を有するプローブを標識するため、標識物質を導入する位置および標識効率を制御可能である。すなわち、本発明の方法は、プローブ核酸の中間部分の任意のヌクレオチドに標識物質を導入することができるため、その後の検出反応の際に標識が離脱することのない安定な標識プローブを作成することが可能である。加えて、本発明の方法は、プローブ核酸の特定のヌクレオチドに標識物質を導入することができるため、支持体上のすべてのプローブに対して均一な量の標識物質を導入することができる。このようにプローブを均一な標識量で標識することにより、試料への不均一な標識しかできなかった従来と比較して、標識量に左右されない信頼性のある測定結果を得ることが可能になる。
更に、本発明に従って標識プローブを固相したアレイを準備することにより、発現解析の自動化が可能である。その上、遺伝子の発現量を、他のサンプルとの競合的ハイブリダイゼーションで測定するのではなく、単一サンプルの遺伝子発現量の絶対値として測定することができる。加えて、アレイ上のプローブを標識することは、反応前のプローブが標識されているため、その固相化状態をモニターすることが可能であり、これは解析精度を管理する上で望ましい。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）の工程で得られた反応産物を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項２】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある第１の反応系と第２の反応系において夫々に反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程を行った第１の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（３）前記（１）の工程を行った第２の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第２の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（４）前記（２）および（３）の伸長反応を行う工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を各反応系から除去する工程と、
（５）前記（３）の工程の後で、第１の反応系と第２の反応系に存在する前記標識物質由来の信号を夫々検出する工程と、
（６）前記（５）の工程において検出された信号の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項３】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある第１の反応系、第２の反応系、第３の反応系および第４の反応系において夫々に反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程を行った第１の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（３）前記（１）の工程を行った第２の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第２の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（４）前記（１）の工程を行った第３の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第３の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（５）前記（１）の工程を行った第４の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第４の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（６）前記（２）および（３）の伸長反応を行う工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を各反応系から除去する工程と、
（５）前記（３）の工程の後で、第１の反応系、第２の反応系、第３の反応系および第４の反応系に存在する前記標識物質由来の信号を夫々に検出する工程と、
（６）前記（５）の工程において検出された信号の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項４】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲットの標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な第１の信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む第１の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第２の信号を生ずる標識物質を付された第２の塩基を含む第２の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第３の信号を生ずる標識物質を付された第３の塩基を含む第３の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第４の信号を生ずる標識物質を付された第４の塩基を含む第４の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）で得られた二本鎖核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、前記伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸をその反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、その反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項５】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応する工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付されたと第１の種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、前記第１の塩基とは異なる種類の第２の塩基を含む少なくとも１の非標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）で得られた二本鎖核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項６】
前記検出可能な信号が蛍光であり、前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項７】
前記選択用配列が、１０塩基長から１５塩基長までの長さであることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項８】
前記核酸試料が予め対象より採取され調製されることと、前記標的部位が変異の存在する可能性のある部位であることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項９】
前記核酸試料は予め対象より採取され調製された試料に含まれていることと、前記標的部位が一塩基多型の存在する部位であることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１０】
前記プローブ核酸が、そこにおいて核酸について反応を行うことが可能な反応容器の内壁に固相化されていることを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１１】
前記反応容器の容器内部の形状がキャピラリー形状であることを特徴とする請求項１０記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１２】
被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。
【請求項１３】
対象における標的配列の発現頻度を判定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、対象から得た被検核酸を含む試料を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後に、前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、対象における標的配列の発現頻度を判定する工程。
【請求項１４】
以下の工程により得られる標識化プローブ核酸を用いることを特徴とする請求項１２に記載の被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法；
（１）種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（１）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することによって、１本鎖として標識化プローブ核酸を得る工程。
【請求項１５】
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記未標識プローブ核酸前駆体が、作成したい標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドが１以上欠損したものであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記未標識プローブ核酸前駆体が、作成したい標識プローブ核酸の中間部分のヌクレオチドが１以上欠損したものであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７の何れか１項に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドが、３種類の塩基の各ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドの少なくとも１種類が、ジデオキシヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドの少なくとも１種類が、存在しないことを特徴とする方法。
【請求項１】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）の工程で得られた反応産物を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項２】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある第１の反応系と第２の反応系において夫々に反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程を行った第１の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（３）前記（１）の工程を行った第２の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第２の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（４）前記（２）および（３）の伸長反応を行う工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を各反応系から除去する工程と、
（５）前記（３）の工程の後で、第１の反応系と第２の反応系に存在する前記標識物質由来の信号を夫々検出する工程と、
（６）前記（５）の工程において検出された信号の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項３】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある第１の反応系、第２の反応系、第３の反応系および第４の反応系において夫々に反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程を行った第１の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（３）前記（１）の工程を行った第２の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第２の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（４）前記（１）の工程を行った第３の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第３の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（５）前記（１）の工程を行った第４の反応系に含まれる反応産物について、適切な伸長反応を得るための条件下で、検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質としての第４の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとを用いて、伸長反応を行う工程と、
（６）前記（２）および（３）の伸長反応を行う工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を各反応系から除去する工程と、
（５）前記（３）の工程の後で、第１の反応系、第２の反応系、第３の反応系および第４の反応系に存在する前記標識物質由来の信号を夫々に検出する工程と、
（６）前記（５）の工程において検出された信号の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項４】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲットの標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応させる工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な第１の信号を生ずる標識物質を付された第１の塩基を含む第１の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第２の信号を生ずる標識物質を付された第２の塩基を含む第２の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第３の信号を生ずる標識物質を付された第３の塩基を含む第３の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、検出可能な第４の信号を生ずる標識物質を付された第４の塩基を含む第４の標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）で得られた二本鎖核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、前記伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸をその反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、その反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項５】
ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）前記ターゲット核酸の標的部位に隣接する３’側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み、且つその５’末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と、核酸試料とを、適切なハイブリダイゼーションを得るための条件にある反応系において反応する工程と、
（２）適切な伸長反応を得るための条件において、検出可能な信号を生ずる標識物質を付されたと第１の種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、前記第１の塩基とは異なる種類の第２の塩基を含む少なくとも１の非標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下で、前記（１）で得られた二本鎖核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の伸長する工程において、当該伸長反応に使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後で、当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程における当該信号の検出の有無と、前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸に含まれる塩基の種類から、標的部位の塩基を決定する工程。
【請求項６】
前記検出可能な信号が蛍光であり、前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項７】
前記選択用配列が、１０塩基長から１５塩基長までの長さであることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項８】
前記核酸試料が予め対象より採取され調製されることと、前記標的部位が変異の存在する可能性のある部位であることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項９】
前記核酸試料は予め対象より採取され調製された試料に含まれていることと、前記標的部位が一塩基多型の存在する部位であることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１０】
前記プローブ核酸が、そこにおいて核酸について反応を行うことが可能な反応容器の内壁に固相化されていることを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１１】
前記反応容器の容器内部の形状がキャピラリー形状であることを特徴とする請求項１０記載のターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
【請求項１２】
被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で被検核酸を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。
【請求項１３】
対象における標的配列の発現頻度を判定する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）そこにおいて反応を行うことが可能な流路に固相化され、且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、対象から得た被検核酸を含む試料を反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼを前記流路に添加して、適切な酵素反応を得られる条件下で反応を行う工程と、
（３）前記（２）の工程の後に、前記流路から酵素反応の分解産物を除去する工程と、
（４）前記（３）の工程の後に、前記流路内の２本鎖核酸に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
（５）前記（４）の工程において検出された信号を基に、対象における標的配列の発現頻度を判定する工程。
【請求項１４】
以下の工程により得られる標識化プローブ核酸を用いることを特徴とする請求項１２に記載の被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法；
（１）種プローブ核酸に対して、適切なハイブリダイゼーション可能な条件下で、前記種プローブ核酸に相補的な相補配列と、この相補配列の５’側に存在する被標識配列と、この被標識配列の５’側に存在する伸長配列とを含む鋳型核酸を反応させる工程と、
（２）前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、且つ標識物質を付与された標識化基質核酸と、前記伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、ポリメラーゼとの存在する条件下で、前記（１）の工程で得られた２本鎖に含まれる前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
（３）前記（２）の工程における伸長の後に、当該２本鎖を解離することによって、１本鎖として標識化プローブ核酸を得る工程。
【請求項１５】
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鋳型核酸と、前記鋳型核酸の塩基の総数より少なく、作成したい標識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、その５’端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体とを、これらがハイブリダイズ可能な条件下で、反応させる工程と、
検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、特定塩基の標識ヌクレオチドと、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドとを基質として用いて、前記未標識プローブ核酸前駆体の欠損部分を、前記鋳型核酸を鋳型として、５’から３’方向に向かって伸長させ、標識プローブ核酸を合成する工程と、
前記工程により得られた標識プローブ核酸と、前記鋳型核酸との間の相補的結合をすべて解離させる工程と、
解離された前記鋳型核酸を支持体上から除去する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記未標識プローブ核酸前駆体が、作成したい標識プローブ核酸の３’端のヌクレオチドが１以上欠損したものであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記未標識プローブ核酸前駆体が、作成したい標識プローブ核酸の中間部分のヌクレオチドが１以上欠損したものであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７の何れか１項に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドが、３種類の塩基の各ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドの少なくとも１種類が、ジデオキシヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、前記特定塩基の標識ヌクレオチドが、１種類の塩基の標識ヌクレオチドであり、前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌクレオチドの少なくとも１種類が、存在しないことを特徴とする方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１００
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６７１０（Ｐ２００５−５０６７１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５８１９
【国際出願日】平成１５年１２月１０日（２００３．１２．１０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５８１９
【国際出願日】平成１５年１２月１０日（２００３．１２．１０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]