迅速なＤＮＡ配列決定、例えばゲノム配列決定を実施するための装置および方法を本明細書に記載する。該方法は以下の工程、即ち、ゲノム配列決定のためのサンプルＤＮＡを調製する工程、調製されたＤＮＡを代表的な様式において増幅する工程、および、唯一のプライマーハイブリダイゼーション工程を用いて増幅されたＤＮＡに対して多重配列決定反応を実施する工程を包む。本発明は、特に大型鋳型ＤＮＡまたは全（もしくは部分）ゲノムＤＮＡから誘導された複数のＤＮＡ配列のライブラリを調製する為の新規な方法を提供する。１本鎖ＤＮＡの配列は、大型鋳型ＤＮＡまたは全もしくは部分ＤＮＡゲノムのサンプルからフラグメント化、ポリッシング、アダプターライゲーション、ニック修復および１本鎖ＤＮＡの単離を経て調製される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ）参照核酸配列を参照数配列に変換する工程であって、ここで該参照数配列は理想的なフローグラムを含む、工程；
ｂ）１つ以上のヌクレオチドが、該標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合にシグナルを検出する工程であって、該シグナルは該フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列に対応し、該クエリ数配列はクエリフローグラムを含む、工程；
ｃ）該理想的なフローグラムと該クエリフローグラムとのおおよそのマッチが得られる該理想的なフローグラムの１つ以上の位置において、該理想的なフローグラムに該クエリフローグラムをアラインする工程；
ｄ）該クエリフローグラムの数配列を該理想的なフローグラムの数配列と比較して、クオリティスコアを発生させる工程であって、ここで該クオリティスコアは該クエリフローグラムと該理想的なフローグラムとの間のアライメントのクオリティを示す、工程；
ｅ）複数のフラグメントに関して工程ｂ）〜ｄ）を反復する工程；
ｆ）最高のクオリティアライメントに対応する該理想的なフローグラム上の位置において、複数のクエリフローグラムをアンカーする工程；
ｇ）１つ以上のクエリフローグラムにより網羅される該理想的なフローグラムの各位置において、１つ以上のクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；そして
ｈ）該コンセンサスフローグラムを核酸配列に変換する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記理想的なフローグラムを所定の長さの重複する理想的なサブフローグラムに分割し、該理想的なサブフローグラムを指標化する工程を更に包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各クエリフローグラムを、前記理想的なサブフローグラムの所定の長さに対応する長さを各々が有するクエリサブフローグラムに分割する工程を更に包含する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記指標化した理想的なサブフローグラムを検索して、前記クエリフローグラムを前記理想的なフローグラムにアラインするための位置を決定する工程を更に包含する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記理想的なサブフローグラムがバイナリコードされる、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記クエリサブフローグラムがバイナリコードされる、請求項３記載の方法。
【請求項７】
標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ）１つ以上のヌクレオチドが、該標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合にシグナルを検出する工程；
ｂ）該フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列に該シグナルを関連付ける工程であって、該クエリ数配列はクエリフローグラムを含む、工程；
ｃ）工程ａ）〜ｂ）を反復して、複数のクエリフローグラムを作製する工程；
ｄ）該複数のクエリフローグラムを相互に比較して、該複数のクエリフローグラム間の重複領域を同定する工程；
ｅ）該重複領域において、該複数のクエリフローグラムをアラインする工程；
ｆ）該アライメントに基づいてクオリティスコアを発生させる工程であって、該クオリティスコアは該アライメントのクオリティを示す、工程；
ｇ）所定の閾値に合致するクオリティスコアを有するアライメントを決定することにより、ペアワイズ重複クエリフローグラムを同定する工程；
ｈ）該ペアワイズ重複クエリフローグラムを１つ以上のユニティグにグループ分けする工程；
ｉ）各ユニティグ内の１つ以上のマッチする位置の各々において、該クエリフローグラムの配列数を平均して、ユニティグコンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；そして
ｊ）各ユニティグコンセンサスフローグラムをユニティグコンセンサス核酸配列に変換する工程；
を包含する、方法。
【請求項８】
工程ｈ）の前記１つ以上のユニティグが、前記クエリフローグラムの重複が最大の一致する鎖を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｋ）ユニティグコンセンサス核酸配列を相互に比較して、配列の重複を同定する工程；及び、
ｌ）共通の重複配列を有するユニティグコンセンサスを連結することにより、コンティグ核酸配列を含む１つ以上のコンティグを形成する工程；
を更に包含する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ｍ）各コンティグ内の境界を同定する工程であって、ここで境界はユニティグ配列が共通領域から発散している領域である、工程；及び、
ｎ）工程ｍ）において同定された境界において、コンティグを破断する工程；
を更に包含する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ｏ）同じフラグメント核酸配列により、それ自体の末端が重複した何れかの２つのコンティグを連結する工程であって、ここで場合により、このようにして連結されたコンティグは、境界が同定される場合に破断される、工程；
を更に包含する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ｐ）フラグメント核酸配列と前記コンティグ間の全てのアライメントを同定する工程であって；ここで場合により、該コンティグは、４未満のフラグメント核酸配列がアラインされている何れかの位置において破断される、工程；
ｑ）工程ｐ）におけるコンティグにアラインされたフラグメント核酸配列に関連するクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンティグコンセンサスフローグラムを計算する工程；そして、
ｒ）該コンティグコンセンサスフローグラムをコンティグコンセンサス核酸配列に変換する工程；
を更に包含する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
コンセンサス塩基コールが実質的に変化しなくなるまで、前記コンティグコンセンサス核酸配列を用いながら工程ｐ）〜ｒ）を反復することにより、最終コンティグコンセンサス配列を計算する工程を更に包含する、請求項１２記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図１Ｇ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図８Ｆ】

【図８Ｇ】

【図８Ｈ】

【図８Ｉ】

【図８Ｊ】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１０Ｅ】

【図１０Ｆ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１１Ｄ】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２８Ｃ】

【図２８Ｄ】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３５Ｃ】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３Ａ】

【図４３Ｂ】

【図４３Ｃ】

【図４４】

【図４５】

【図４６Ａ】

【図４６Ｂ】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【公表番号】特表２００９−５０２２０２（Ｐ２００９−５０２２０２Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２５１８０（Ｐ２００８−５２５１８０）
【出願日】平成１８年８月１日（２００６．８．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８６９３５
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０７３３１２３２）４５４　ライフ　サイエンシーズ　コーポレイション (11)
【Ｆターム（参考）】