核酸サンプルを調製するための方法およびキット
本発明は、核酸サンプルを調製する方法に関する。本発明に係る方法は、実質的に全転写産物に相当するサンプルを調製するのに特に適している。本方法は、マイクロアレイによる発現解析法とともに使用するのに特に適している。本発明の一態様において、ＲＮＡ転写産物に相当する核酸サンプルを調製する方法が提供される。本方法は、エキソンや選択的スプライシングなど、転写産物の特徴を検出するために使用されるサンプルを調製するのに特に適している。本方法は、そのような転写産物を定量的、半定量的、または定性的に検出するのに適している。本方法は、選択的スプライシングを受けた転写産物など、あらゆるタイプの変異配列を含む多数の転写産物を観察するために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
（優先権主張）
本出願は、２００３年８月１３日付で出願された米国特許仮出願第６０／４９５，２３２号、および２００４年２月９日付で出願された米国特許仮出願第６０／５４２，９３３号の利益を主張するものであり、それらの教示内容は、参照して本明細書に組み込まれる。引用された特許出願はすべて、本明細書において、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸サンプルを調製する方法は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術を利用する研究室での研究を大きく変貌させ、また、数例をあげれば、診断学、法医学、核酸解析法、および遺伝子発現観察法の分野に影響を与えてきた。技術的には、実質的に全転写産物を増幅する方法に対する需要がまだ存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写産物に相当する核酸サンプルを調製する方法が提供される。本方法は、エキソンや選択的スプライシングなど、転写産物の特徴を検出するために使用されるサンプルを調製するのに特に適している。本方法は、そのような転写産物を定量的、半定量的、または定性的に検出するのに適している。本方法は、選択的スプライシングを受けた転写産物など、あらゆるタイプの変異配列を含む多数の転写産物を観察するために使用することができる。本方法は、例えば、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった標的転写産物、または転写産物の特徴を、マイクロアレイによって平行して解析する方法に特に適している。本明細書において、「標的転写産物」または「標的核酸」という用語は、対象とする転写産物またはその他の核酸を意味するために使用される。
【０００４】
好適な実施形態において、核酸サンプルを調製する方法は、プライマー混合物を、複数のＲＮＡ転写産物、または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸にハイブリダイズさせ、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第一鎖ｃＤＮＡ、および該第一鎖ｃＤＮＡに相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダム配列プライマー領域を有するオリゴヌクレオチドを含む工程、および、プロモーター領域からＲＮＡ転写を開始させて核酸サンプルを生成する工程を含む。プライマー領域は、ランダムな六量体（ヘキサマー）であってもよい。プロモーターは、一般的には、バクテリオファージのプロモーター、好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のプロモーターのような原核生物プロモーターである。
【０００５】
本方法を用いて、真核生物のｍＲＮＡ、またはそれ以外のＲＮＡを解析することができる。全ＲＮＡサンプル、またはポリ（Ａ）＋で濃縮されたサンプルはすべて、本方法を用いるのに適している。
【０００６】
特に好適な方法において、得られたｃＲＮＡをテンプレートとして用いて、第二鎖ｃＤＮＡを合成することができる。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダム・ヘキサマーなどのランダムプライマーを使用して実施することが可能である。
【０００７】
本発明に係る方法は応用範囲が広く、特定の検出方法に限定されないが、特に、例えば１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった転写産物の特徴を検出するのに適している。例えば、第二鎖ｃＤＮＡは断片であって／標識した後、検出のためハイブリダイズさせることができる。標識工程は、例えばｃＤＮＡ合成の過程で行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブは、転写産物における特異的エキソンおよび／またはスプライス部位のような、転写産物の特異的な特徴を検出するのに特に適している。一般的には、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００または５００，０００種類のオリゴヌクレオチドプローブをまとめて検出のため使用することも可能である。核酸プローブは、ビーズのコレクション上、または単一の基質上に固定することが可能である。
【０００８】
本発明の別の態様において、核酸サンプルを調製するための試薬キットを提供する。試薬キットの具体例は、オリゴヌクレオチド混合物成分を含む容器、および、オリゴヌクレオチド混合物成分中のオリゴヌクレオチドがランダムプライマー領域およびプロモーター領域を含むものである、該オリゴヌクレオチド混合物の使用指示書を含む。オリゴヌクレオチド混合物の具体例の一つは以下の配列を有する：
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【０００９】
本試薬キットは、さらに、逆転写酵素を含む容器、およびＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含む。キットには、ランダムプライマー領域およびプロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド混合物以外にも、ランダムプライマー混合液（例えばランダムなヘキサマー混合液）を含ませることも可能である。付加的な成分には、標識用および断片化用の試薬やヌクレオチドなどがある。
【００１０】
好適な実施形態において、本キットは、標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するよう設計された、少なくとも１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、または５０，０００種類のさまざまな核酸プローブのコレクションを含む。これらの核酸プローブは、基質上に固定することも可能であり、一般的には、５０００以上のさまざまなエキソンおよび／または５００以上のスプライス部位に対して設計されている。
【００１１】
本発明に係る方法およびキットは、生物学的研究、診断学、毒物学、創薬などの領域において広範な応用範囲を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写を解析する方法および組成物が提供される。転写物サンプルに由来する核酸サンプルを調製する方法および組成物が提供される。好適な実施形態において、核酸サンプルは転写物サンプルにおける転写物の集団に相当する。したがって、これらの好適な方法は、エキソン構造および転写におけるスプライシングのような、転写の特徴／構造を調べるのに用いられる核酸サンプルを調製するのに特に適している。本発明に係る方法は、通常、３’または５’末端に限らず、標的全域の任意の場所で転写産物をより良好に産生することができる。好適な本方法は、転写産物をテンプレートとして用い、また、ランダムなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、（例えば、逆転写反応によって）核酸を合成することを一般に含む。次いで、合成された核酸をさらに処理して、核酸サンプルを得る。本方法は、マイクロアレイによる実験に特に有効である。しかし、本サンプル調製法は、他の検出法にも使用することができる。
【００１３】
本発明の別の態様において、１種類以上のプライマー（ランダム領域、およびＴ７プロモーターのように一定の配列内容をもつ領域を含むことができる）を含むアッセイ用キットは、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、標識試薬、および／または断片化試薬を選択的に含む。
【００１４】
（Ｉ．概略）
本発明は多くの好適な実施形態を有し、当業者に公知の詳細に関しては、多くの特許、出願、および参考文献に依存する。したがって、特許、出願、または他の参考文献が以下に引用または繰り返されている場合、該特許、出願または参考文献は、引用された事柄のみならず、あらゆる目的で、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本出願において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の記載がない限り、複数形への言及も含むものとする。例えば、「一個の因子」という用語は、複数因子の混合物など、複数の因子を含む。
【００１６】
個体はヒトに限定されず、哺乳動物、植物、細菌、または上記のいずれかに由来する細胞などの有機体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本開示を通して、本発明の種々の態様は、範囲表示形式（ａ ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で表示されることがあるが、範囲表示形式による記載は、単に便宜と簡潔さのためのものである理解されるべきであり、本発明の範囲を不動の制約として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲のすべて、およびその範囲内にある各数値を具体的に開示したと考慮されるべきである。例えば、１から６までの範囲が記載されている場合には、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などという部分範囲、および、この範囲内にある各数字、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００１８】
本発明の実施は、特段の記載がない限り、有機化学、高分子技術、分子生物学（組換技術など）、細胞生物学、生化学および免疫学などの従来技術および説明を使用することができ、これらは当技術分野の範囲に入る。このような従来技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、およびラベルを用いたハイブリダイゼーション検出を含む。適当な技術の具体例を、本明細書で後述する実施例を参照して得ることができる。しかし、もちろん、他の同等な常法を用いることも可能である。このような従来の技術および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｖｏｌｓ． Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （４ｔｈ Ｅｄ．） Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ （２０００）， Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，およびＢｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹなどの標準的な実験マニュアルの中に記載されており、これらは全て、あらゆる目的でその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明は、いくつかの好適な実施形態において、アレイなどの固形基質を使用することができる。ポリマー（タンパク質など）のアレイ合成に応用可能な方法および技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、国際公開公報第ＷＯ００／５８５１６号、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２４２，９７４号、第５，２５２，７４３号、第５，３２４，６３３号、第５，３８４，２６１号、第５，４０５，７８３号、第５，４２４，１８６号、第５，４５１，６８３号、第５，４８２，８６７号、第５，４９１，０７４号、第５，５２７，６８１号、第５，５５０，２１５号、第５，５７１，６３９号、第５，５７８，８３２号、第５，５９３，８３９号、第５，５９９，６９５号、第５，６２４，７１１号、第５，６３１，７３４号、第５，７９５，７１６号、第５，８３１，０７０号、第５，８３７，８３２号、第５，８５６，１０１号、第５，８５８，６５９号、第５，９３６，３２４号、第５，９６８，７４０号、第５，９７４，１６４号、第５，９８１，１８５号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１９３号、第６，０９０，５５５号、第６，１３６，２６９号、第６，２６９，８４６号、および第６，４２８，７５２号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０号（国際公開公報番号第ＷＯ９９／３６７６０号）および第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５号に記載されており、これらはすべて、あらゆる目的のためにその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２０】
具体的な実施形態において合成技術が記載されている特許は、米国特許第５，４１２，０８７号、第６，１４７，２０５号、第６，２６２，２１６号、第６，３１０，１８９号、第５，８８９，１６５号および第５，９５９，０９８号などである。核酸アレイは、上記特許の多くに記載されているが、同一の技術がポリペプチド配列にも適用される。
【００２１】
本発明において有用な核酸アレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からブランド名ＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)として市販されているものを含む。アレイの見本がａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍのウェブサイトに表示されている。
【００２２】
また、本発明は、固形基質に結合したポリマーの多くの用途も想定している。これらの用途には、遺伝子発現のモニタリング、プロファイリング、ライブラリーのスクリーニング、遺伝子型決定および診断が含まれる。遺伝子発現のモニタリングおよびプロファイリングの方法は、米国特許第５，８００，９９２号、第６，０１３，４４９号、第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１３８号、第６，１７７，２４８号、および第６，３０９，８２２号において示されている。遺伝子型決定法およびその用途は、米国特許出願第６０／３１９，２５３号、第１０／０１３，５９８号、ならびに米国特許第５，８５６，０９２号、第６，３００，０６３号、第５，８５８，６５９号、第６，２８４，４６０号、第６，３６１，９４７号、第６，３６８，７９９号、および第６，３３３，１７９号に示されている。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，９０２，７２３号、第６，０４５，９９６号、第５，５４１，０６１号、および第６，１９７，５０６号において具体化されている。
【００２３】
本発明はまた、特定の好適な実施形態におけるサンプル調製法も想定している。遺伝子型決定の前、またはそれと並行して、ゲノムサンプルをさまざまな手法により増幅することができ、それらの手法のいくつかではＰＣＲを用いることができる。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ． Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）、Ｍａｔｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １，１７（１９９１）；ＰＣＲ （Ｅｄｓ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、および米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号および第５，３３３，６７５号参照。また、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。サンプルはアレイで増幅される。米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号参照。また、これらは参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２４】
他の適当な増幅法は、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０））、転写増幅法（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自律的配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）および国際公開公報第ＷＯ９０／０６９９５号）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列開始型（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＣＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライマーポリメラーゼ連鎖反応法（ＡＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、第５，８６１，２４５号）、および核酸による配列増幅法（ＮＡＢＳＡ）を含む。（米国特許第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号、および第６，０６３，６０３号参照。これらはそれぞれ参照されて本明細書に組み込まれる）。この他に利用できる増幅法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号、および米国特許出願第０９／８５４，３１７号に記載されており、これらは、それぞれ参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２５】
サンプル調製のさらに別の方法、および核酸サンプルの複雑性を軽減させる技術は、Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、第６，３９１，５９２号、ならびに米国特許出願第０９／９１６，１３５号、第０９／９２０，４９１号、第０９／９１０，２９２号、および第１０／０１３，５９８号に記載されている。
【００２６】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの測定を行う方法は、当技術分野において十分に開発されてきた。ハイブリダイゼーションを測定する手順および条件は用途に応じて変化し、公知の一般的な結合方法、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）において参照されている方法などに応じて選択される。反復制御されたハイブリダイゼーション反応を実行する方法および装置は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，８７４，２１９号、第６，０４５，９９６号および第６，３８６，７４９号、第６，３９１，６２３号に記載されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明は、一定の好適な実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出も想定している。米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８３４，７５８号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、および第６，２２５，６２５号、ならびに米国特許出願第６０／３６４，７３１号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開公報第ＷＯ９９／４７９６４号として公開されている）参照。これらも、そのそれぞれが、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２８】
シグナル検出および強度データ処理の方法および装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５４７，８３９号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８００，９９２号、第５，８３４，７５８号、第５，８５６，０９２号、第５，９０２，７２３号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０９０，５５５号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、および第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開公報第ＷＯ９９／４７９６４号として公開されている）参照。これらもまた、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２９】
また、本発明の実施は、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよび装置を使用することもできる。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、一般的に、本発明の方法の論理工程を遂行するためのコンピュータで実行可能な命令を有する、コンピュータで読み取り可能な媒体を含む。適当なコンピュータ可読性媒体は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ‐ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ‐ＲＯＭ、ハードディスク装置、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ等を含む。コンピュータで実行可能命令は、適当なコンピュータ言語、またはいくつかの言語の組み合わせで記述することができる。基本的なコンピュータによる生物学的方法は、例えばＳｅｔｕｂａｌ ａｎｄ Ｍｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）、Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（ＥＤ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）、Ｒａｓｈｉｄｉ ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）、およびＯｕｅｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｂｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ｗｉｎｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記載されている。米国特許第６，４２０，１０８号参照。
【００３０】
また、本発明では、プローブ設計、データ管理、解析、および機器の操作などの多様な目的に、種々のコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを利用することもできる。米国特許第５，５９３，８３９号、第５，７９５，７１６号、第５，７３３，７２９号、第５，９７４，１６４号、第６，０６６，４５４号、第６，０９０，５５５号、第６，１８５，５６１号、第６，１８８，７８３号、第６，２２３，１２７号、第６，２２９，９１１号、および第６，３０８，１７０号参照。
【００３１】
また、本発明では、米国特許第５，５４５，５３１号および第５，８７４，２１９号に記載されているアレイおよび処理についてのいくつかの実施形態を利用することもできる。これらの特許は、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００３２】
さらに、本発明には、米国特許出願第１０／０６３，５５９号、第６０／３４９，５４６号、第６０／３７６，００３号、第６０／３９４，５７４号、第６０／４０３，３８１号などに示されているように、インターネットなどのネットワーク上で遺伝子情報を提供する方法を含む好適な実施形態がありうる。
【００３３】
（ＩＩ．定義）
「アレイ」は、意図的に生成した分子の集合体であって、化学合成または生合成により調製することができる集合体である。アレイ中の分子は、同一のものでも、または互いに異なるものでもよい。アレイは、種々のフォーマット、例えば、可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固形支持体に固定した化合物などを想定することができる。
【００３４】
「アレイプレートまたはプレート」とは、液体を通過させずに、ウェルと呼ばれる領域または空間を形成する物理的障壁によって、各アレイが他のアレイから分離されている複数のアレイを有する物体である。
【００３５】
「核酸のライブラリーまたはアレイ」は、意図的に生成された核酸の集合体であって、化学合成によるか生合成によって調製することができ、さまざまな異なったフォーマット（可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、またはその他の固形支持体に固定されたオリゴのライブラリー）における生物活性をスクリーニングすることができる集合体である。さらに、「アレイ」という用語は、本質的には任意の長さの核酸（例えば、長さ約１から約１０００ヌクレオチドのモノマー）を基質上にスポットすることによって生成することができる、このような核酸ライブラリーも含む意味であるが、これらに限定されるものではない。本明細書において「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形状のものであって、プリン基およびピリミジン基、またはその他の天然に、化学的に、または生化学的に修飾されているヌクレオチドの塩基、または、誘導体化されているヌクレオチドの塩基のいずれかを含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または、米国特許第６，１５６，５０１号に示されているようなペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドの骨格は、一般的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ、または置換された糖またはリン酸基に見られるように、糖およびリン酸基から構成されることがある。ポリヌクレオチドには、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドのアナログなど、修飾されたヌクレオチドが含まれうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的には、本明細書に記載されているようなアナログも含む。これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに共通するいくつかの構造的特徴を有するため、核酸配列またはオリゴヌクレオチド配列に取り込まれると、溶液中に存在する天然の核酸配列とハイブリダイズすることが可能になるという分子である。一般的には、これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドを、塩基、リボース、またはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することによって得られる。これらの変化は、ハイブリッド形成を安定させたり不安定にさせたり、または、相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を亢進させたりと、必要に応じてあつらえることができる。
【００３６】
「バイオポリマーまたは生体高分子」は、生物学的または化学的成分の反復単位を意味するものとする。代表的なバイオポリマーは、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リポ多糖、リン脂質、および前記のものの合成アナログなどがあるが、これらに限定されるものではない。また、合成アナログは、逆転ヌクレオチド、ペプチド核酸、メタＤＮＡ、および上記したものの組合せを含むが、これらに限定されない。「バイオポリマー合成」は、有機的および無機的合成によるバイオポリマーの生成を含むものとする。
【００３７】
バイオポリマーに関係するのは、バイオポリマーの単一ユニット、またはバイオポリマーの一部ではない単一ユニットを意味するための「バイオモノマー」である。従って、例えば、ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・バイオポリマー内のバイオモノマーであり、また、アミノ酸は、タンパク質またはペプチド・バイオポリマー内のバイオモノマーであり、また、例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体断片などもバイオポリマーである。
【００３８】
「開始バイオモノマー」：または「イニシエーター・バイオモノマー」は、反応性求核試薬を介してポリマーの表面に共有結合によって結合している先頭のバイオモノマー、または、反応性求核試薬を介してポリマーに結合しているリンカーまたはスペーサーアームに結合している先頭のバイオモノマーである。
【００３９】
「相補性」は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖の間、または、オリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定または増幅すべき一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間など、ヌクレオチドまたは核酸同士におけるハイブリダイゼーションまたは塩基対の形成を意味する。相補ヌクレオチドは、通常、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。２本の一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、好ましくは整列されて比較され、また、適当なヌクレオチドの挿入または欠失をもって、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％から９５％、より好ましくは約９８％から１００％と対合する場合に、実質的に相補的であると言われる。あるいは、選択的なハイブリダイゼーション条件下で１本のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖がその相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相補性が存在する。一般に、少なくとも１４から２５個のヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：２０３（１９８４）参照。
【００４０】
コンビナトリアル合成法：コンビナトリアル合成法は、反応基質（ｒｅａｃｔａｎｔ ｍａｔｒｉｘ）およびスイッチ基質（ｓｗｉｔｃｈ ｍａｔｒｉｘ）に相当する試薬を順次添加することによって多様なポリマー配列を並行合成するための順序付けられた方法であり、この合成法の産物が生成物基質（ｐｒｏｄｕｃｔ ｍａｔｒｉｘ）である。反応基質は、添加される合成断片の構成単位である１列×ｍ行の基質である。スイッチ基質は、縦に並べられたｉ行からｍ行までの間の、好ましくは規則正しく並べられた２進数の全てまたは部分集合である。「バイナリー法」とは、少なくとも連続した２つのステップにより、基質上の目的とする領域の一部、しばしば半分を照射するという方法である。バイナリー合成法においては、一組の順番に並んだ反応試薬から形成することができると考えられるすべての化合物を形成させる。最も好適な実施形態において、バイナリー合成法は、その前の添加ステップも含む合成法を意味する。例えば、マスキング法のためのスイッチ基質が、前に照射した領域を半分に分けて、以前照射した領域の約半分を照射し、残りの半分を保護する（また、一方で、以前保護された領域の約半分を保護し、以前保護された領域の残りの約半分を照射する）。２進法的過程の間に非２進法的過程が入り込むことが可能であるため、基質の一部に対してのみ、２進法スキームを行うことができると認められる。コンビトリアルな「マスキング」法は、光または他の空間選択的な脱保護剤または活性化剤を使用して物質から保護基を除去して、アミノ酸などの別の物質を付加する合成法である。
【００４１】
「有効量」とは、所望の結果を誘導するのに十分な量を意味する。
【００４２】
「励起エネルギー」は、例えば蛍光性標識を発光させることのように、検出のための検出用標識に活性を与えるために利用されるエネルギーを意味する。この用途のための装置は、レーザー、紫光外線、発光ダイオード、白熱光源、またはその他の光線などのコヒーレント光または非コヒーレント光、または、励起可能標識の励起帯に波長を有する電磁エネルギー源、または検出可能な透過光、反射光または拡散光を発することができる電磁エネルギー源などである。
【００４３】
「ゲノム」は、生物の染色体中の遺伝物質のすべてである。特定の生物の染色体中の遺伝物質から得られるＤＮＡがゲノムＤＮＡである。ゲノムライブラリーは、ある生物の全ゲノムに相当する一組のランダムに生成した重複ＤＮＡ断片から生成したクローンの集合体である。
【００４４】
「ハイブリダイゼーションの条件」は、一般的には、約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくはおよそ２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃まで低くすることができるが、一般的には２２℃よりも高く、より一般的には約３０℃よりも高く、好ましくは約３７℃を超える。断片が長くなるほど、特異的ハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となろう。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶剤の存在および塩基のミスマッチの程度など、他の要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響するため、パラメーターの組合せが、単独のパラメーターの絶対測定値より重要である。
【００４５】
ハイブリダイゼーション、例えば、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で実施される。例えば、塩濃度が約１モル濃度（Ｍ）を超えず、温度が２５℃以上であるという条件は、例えば、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（５Ｘ ＳＳＰＥ、および、約２５℃から約３０℃の温度という条件である。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション」は、通常、ストリンジェントな条件下、例えば１Ｍを超えない塩濃度および２５℃以上の温度で実施する。例えば、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ ７５０ｍＭ、リン酸ナトリウム ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ｐＨ７．４）、および温度が２５℃から３０℃という条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈｅ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。この文献は、あらゆる目的のために、その全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【００４７】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、２本の一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを意味するが、三本鎖のハイブリダイゼーションも理論的には可能である。その結果得られた（通常は）二本鎖ポリヌクレオチドが「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率を、本明細書においては「ハイブリダイゼーション度」と呼ぶ。
【００４８】
「ハイブリダイゼーション・プローブ」とは、塩基特異的な態様で、核酸の相補鎖に結合することができるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブには、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されているようなペプチド核酸、ならびにその他の核酸類似物質および核酸模倣物質が含まれる。米国特許第６，１５６，５０１号参照。
【００４９】
「特異的にハイブリダイズする」、とは、複合混合物である（例えば、細胞中の全）ＤＮＡまたはＲＮＡの中に特定の塩基配列が存在するとき、その塩基配列に、ストリンジェントな条件下で実質的に、またはそれに対してのみ、ある分子が結合、二本鎖形成またはハイブリダイズすることを意味する。
【００５０】
「単離された核酸」とは、存在する主要な分子種が、目的とする分子種である発明である（すなわち、分子レベルでは、組成物に存在する他のどの分子種よりも豊富に存在する）。好ましくは、単離された核酸は、存在する全高分子種の少なくとも（モル濃度で）約５０、８０または９０％を構成する。最も好ましくは、目的とする分子種を、本質的に均一になるまで精製する（通常の検出法では、混入した分子種を組成物中で検出することができない）。
【００５１】
「標識」、例えば「発光性標識」、光を散乱させる標識または放射性標識。蛍光標識は、中でも、Ｆｌｕｏｒｅｐｒｉｍｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＦＡＭ（ＡＢＩ）など、市販されているフルオレセイン・ホスホルアミダイトなどである。米国特許第６，２８７，７７８号参照。
【００５２】
「リガンド」：リガンドは、特定のレセプターに認識される分子である。レセプターに結合される、またはレセプターと反応する因子を「リガンド」と呼ぶが、この用語は、その結合相手となるレセプターとの関係でのみ定義としての意味をもつ。「リガンド」という用語は、問題となっている物質が、レセプターに結合するか、さもなければレセプターと反応することができるということ以外に、何ら特定の分子量、その他構造上または組成上の特徴を意味するものではない。また、リガンドは、レセプターが結合する天然のリガンドとして、または、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することのできる機能的アナログとして働くことができる。本発明によって調べることができるリガンドの例には、細胞膜レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、麻酔剤、ステロイド剤など）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、基質アナログ、遷移状態アナログ、補因子、薬剤、タンパク質、および抗体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
「連鎖不平衡または対立遺伝子関連」とは、ある対立遺伝子または遺伝子マーカーが、集団中の任意の対立遺伝子と偶然に関連すると期待される頻度よりも高い頻度で、近傍に位置する特定の対立遺伝子または遺伝子マーカーと選択的に関連することを意味する。例えば、遺伝子座Ｘに対立遺伝子ａおよびｂがあって、これらが同じ頻度で存在しており、これに連鎖する遺伝子座Ｙには対立遺伝子ｃおよびｄがあって、これらも同じ頻度で存在する場合、ａｃという組み合わせが０．２５という頻度で生じると予想することができる。これよりも高い頻度でａｃが生じれば、対立遺伝子ａとｃは連鎖不平衡にある。連鎖不平衡は、ある対立遺伝子の組み合わせが自然選択されることにより、または、対立遺伝子が、つい最近になって導入されたため、連鎖する対立遺伝子との平衡に達していないことが原因で生じている可能性がある。
【００５４】
「マイクロタイタープレート」は、多数のサンプルの物理的、化学的または生物学的な特徴を並行して試験するために使用される標準的な構成（９６、３８４、および１５３６ウェル）になっている分離されたウェルの配列である。
【００５５】
「混合集団」または「複合集団」とは、所望の核酸と所望でない核酸とを含むサンプルを意味する。非限定的な例として、核酸の複合集団は、全ゲノムＤＮＡ、全ゲノムＲＮＡ、またはそれらを組み合わせたものである。さらに、核酸の複合集団は、所定の集団について濃縮されているものでもよいが、その他の所望でない集団を含んでいてもよい。例えば、核酸の複合集団は、所望のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列が濃縮されているものでもよいが、所望でないリボゾームＲＮＡの配列（ｒＲＮＡ）をいくらか含んでいてもよい。
【００５６】
「モノマー」とは、一緒に結合してオリゴマーまたはポリマーを形成することができる分子セットの構成分子を意味する。本発明において有用なモノマーのセットには、例えば、（ポリ）ペプチドを合成するためのＬ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、または合成アミノ酸のセットなどがあるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、「モノマー」は、オリゴマーを合成するための基本セットの構成分子を意味する。例えば、Ｌ型アミノ酸のダイマーは、ポリペプチドを合成するための４００種類の「モノマー」の基本セットを構成する。ポリマーの合成の連続的な工程において、さまざまなモノマーの基本セットを用いることが可能である。また、「モノマー」という用語は、さまざまな化学物質サブユニットと組み合わせて、どちらの単独サブユニットよりも大きな化合物を形成することができる化学物質サブユニットも意味する。
【００５７】
「ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写産物」とは、本明細書において、前駆ｍＲＮＡ転写産物、転写産物のプロセッシングにおける中間体、翻訳することができる成熟したｍＲＮＡ、および遺伝子の転写産物、またはｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸を含むが、これらに限定されるものではない。転写産物のプロセッシングには、スプライシング、エディティング、および分解などがありうる。本明細書において、ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸とは、その合成に、ｍＲＮＡまたはその部分配列が最終的にテンプレートとして働く核酸を意味する。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどはすべて、ｍＲＮＡ転写産物に由来するものであり、このような派生産物を検出することで、サンプル中に存在する本来の転写産物の有無が示されるのである。このように、ｍＲＮＡに由来するサンプルには、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「核酸のライブラリーまたはアレイ」は、意図的に生成された核酸の集合体であって、化学合成によるか生合成によって調製することができ、さまざまな異なったフォーマット（可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、またはその他の固形支持体に固定されたオリゴのライブラリー）における生物活性をスクリーニングすることができる集合体である。さらに、「アレイ」という用語は、本質的には任意の長さの核酸（例えば、長さ約１から約１０００ヌクレオチドのモノマー）を基質上にスポットすることによって生成することができる、このような核酸ライブラリーも含む意味であるが、これらに限定されるものではない。本明細書において「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形状のものであって、プリン基およびピリミジン基、またはその他の天然に、化学的に、または生化学的に修飾されているヌクレオチドの塩基、または、誘導体化されているヌクレオチドの塩基のいずれかを含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドの骨格は、一般的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ、または置換された糖またはリン酸基に見られるように、糖およびリン酸基から構成されることがある。ポリヌクレオチドには、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドのアナログなど、修飾されたヌクレオチドが含まれうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的には、本明細書に記載されているようなアナログも含む。これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに共通するいくつかの構造的特徴を有するため、核酸配列またはオリゴヌクレオチド配列に取り込まれると、溶液中に存在する天然の核酸配列とハイブリダイズすることが可能になるという分子である。一般的には、これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドを、塩基、リボース、またはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することによって得られる。これらの変化は、ハイブリッド形成を安定させたり不安定にさせたり、または、相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を亢進させたりと、必要に応じてあつらえることができる。
【００５９】
本発明に係る「核酸」は、ピリミジン塩基およびプリン塩基、好ましくは、それぞれ、システイン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンのポリマーまたはオリゴマーを含む。Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ ７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）参照。実際、本発明は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、および、それらの化学的変異体、すなわち、これらの塩基をメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグリコシル化した形態などを想定している。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において異種でも同種でもよく、天然の由来源から単離されたものでも、人工的または合成によって生成されたものでもよい。また、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物でもよく、また、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、およびハイブリッドの状態など、永久的にまたは一時的に一本鎖または二本鎖の形で存在しているものでもよい。
【００６０】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは８ヌクレオチド以上、また、より好ましくは２０ヌクレオチド以上の長さの核酸、または、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物である。本発明に係るポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であって、天然由来源から単離されうるもの、組換えによって作出されるか、人工的に合成されうるもの、およびそれらの模倣化合物を含む。本発明に係るポリヌクレオチドのさらなる例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。また、本発明は、一定のｔＲＮＡ分子で同定されていて、３重らせんで存在すると考えられているフーグステン型塩基対合のような従来とは異なる塩基対合があるという状況も含む。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本出願において互換的に使用される。
【００６１】
「プローブ」：プローブは、特定の標的によって認識されうる表面固定された分子である。本発明によって調べることができるプローブの例には、胞膜レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイド・ペプチド、ステロイド剤など）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
「プライマー」は、４種類のヌクレオシド三リン酸、および、例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合させるための薬剤が存在する中、例えば緩衝液や温度などが適切な条件下において、テンプレート特異的ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーの長さは、いずれの場合であっても、例えば、プライマーの使用目的に応じて決まるが、通常は、１５から２０、２５、３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子では、通常、テンプレートと十分に安定したハイブリッド複合体を形成するのに、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの配列を正確に反映する必要はないが、そのテンプレートにハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。プライマー部位とは、プライマーがハイブリダイズするテンプレートの領域である。プライマー対とは、増幅する配列の５’末端にハイブリダイズする５’側上流プライマーと、増幅する配列の３’末端の相補鎖にハイブリダイズする３’側下流プライマーとを含む、１組のプライマーである。
【００６３】
「多型」とは、ある集団において、遺伝的に決定されている選択的配列または対立遺伝子が２種類以上存在することを意味する。多型のマーカーまたは部位とは、分岐が生じている遺伝子座である。好適なマーカーは、２個以上の対立遺伝子であって、その各々が、選択された集団の１％以上の頻度、また、より好ましくは、１０％または２０％より高い頻度で存在する対立遺伝子を有する。多型性は、１個以上の塩基の変化、挿入、反復、または欠失を含みうる。多型的遺伝子座は、１塩基対だけという短さでもよい。多型性マーカーには、制限酵素断片長多型、可変数縦列反復配列（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、単純な配列反復、および、Ａｌｕなどの挿入因子などがある。最初に同定された対立遺伝子の型を勝手に参照型と名付け、その他の対立遺伝子型を選択的対立遺伝子または変異型対立遺伝子と名付ける。選択された集団において最も頻度が高い対立遺伝子型が野生型と呼ばれることもある。２倍体の生物は、対立遺伝子型についてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかであろう。２対立遺伝子多型には２種類の型がある。３対立遺伝子多型には３種類の型がある。１塩基多型（ＳＮＰ）は多型性に含まれる。
【００６４】
読み取り装置またはプレート読み取り装置は、アレイ上の核酸プローブと蛍光標識された標的とのハイブリダイゼーションのように、アレイ上でハイブリダイゼーションが起きたことを確認するために使用される装置である。読み取り装置は、当技術分野において公知であり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ、およびその他の会社を通して市販されている。通常、それらは、プローブにハイブリダイズした蛍光標識された標的核酸を照射するために励起エネルギー（レーザーなど）を利用することを含む。そして、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光ダイオード、または、集めた光を記録するための同様の装置（励起エネルギーとは異なった波長で）を用いて、再放出された光を検出する。米国特許第６，２２５，６２５号参照。
【００６５】
「レセプター」：所定のリガンドに対して親和性を有する分子。レセプターは、天然または人工の分子である。また、それらを元の状態のままで使用したり、他の分子種との集合体として使用することもできる。レセプターは、共有的または非共有的に、直接または特異的な結合物質を介して結合部に結合することができる。本発明によって利用されうるレセプターの例は、抗体、細胞膜レセプター、特異的な抗原決定基（ウイルス、細胞、または、他の物質など）と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラなどであるが、これらに限定されるものではない。当技術分野において、レセプターは、抗リガンドと呼ばれることもある。レセプターという用語が本明細書において複数形で使用されるとき、意味に違いを生じさせるものではない。「リガンド・レセプター対」は、２種類の高分子が分子認識によって結合して複合体を形成するときに形成される。本発明によって調べることができるレセプターのその他の例は、米国特許第５，１４３，８５４号に示されている分子などであるが、それらに限定されるものではない。本文献は、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６６】
「固形支持体」、「支持体」および「基質」は互換的に使用され、剛体または半剛体の表面をもつ物質または物質のグループを意味する。多くの実施形態において、固形支持体の少なくとも一方の表面は実質的に平面であるが、実施形態によっては、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、刻み込まれた溝などによって、異なった化合物を合成するための領域を物理的に隔てることが望ましいこともある。別の実施形態では、固形支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、またはその他の幾何学図形という形をとる。基質の例として、米国特許第５，７４４，３０５号参照。
【００６７】
標的：所定にプローブに親和性を有する分子。標的は、天然または人工の分子である。また、それらを元の状態のままで使用したり、他の分子種との集合体として使用することもできる。標的は、共有的または非共有的に、直接または特異的な結合物質を介して結合部に結合することができる。本発明によって利用されうる標的の例は、抗体、細胞膜レセプター、特異的な抗原決定基（ウイルス、細胞、または、他の物質など）と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラなどであるが、これらに限定されるものではない。当技術分野において、レセプターは、抗プローブと呼ばれることもある。標的という用語が本明細書において複数形で使用されるとき、意味に違いを生じさせるものではない。「プローブ・標的対」は、２種類の高分子が分子認識によって結合して複合体を形成するときに形成される。
【００６８】
ＷＧＳＡ（全ゲノムサンプリングアッセイ法）遺伝子型決定技術：遺伝子座特異的プライマーを使用せずに、複合ＤＮＡにおいて何千ものＳＮＰを同時に遺伝子型決定できる技術。この技術では、例えば、目的とする制限酵素でゲノムＤＮＡを切断して、切断された断片にアダプターを連結させる。アダプター配列に対応する１種類のプライマーを用いて、所望の長さ、例えば５００〜２０００ｂｐの断片を増幅する。そして、処理された標的を、ＳＮＰ含有断片／プローブを含む核酸アレイにハイブリダイズさせる。ＷＧＳＡは、例えば、米国仮出願番号第６０／３１９，６８５号、第６０／４５３，９３０号、第６０／４５４，０９０号および第６０／４５６，２０６号、第６０／４７０，４７５号、米国特許出願第０９／７６６，２１２号、第１０／３１６，５１７号、第１０／３１６，６２９号、第１０／４６３，９９１号、第１０／３２１，７４１号、第１０／４４２，０２１号、および第１０／２６４，９４５号に開示されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６９】
ここで、本発明の例示的実施形態を詳細に説明する。例示的な実施形態とともに本発明を説明するが、当然ながら、それらは、本発明をこれらの実施形態に制限することを意図したものではない。逆に、本発明は、代替、変更および同等のものをカバーするものであり、それらは、本発明の精神と範囲に含まれうる。
【００７０】
（３．全転写産物アッセイ法のためのサンプル調製法）
本発明の一態様において、転写産物のエキソンの少なくとも７０％、８０％、９０％、または全転写産物に相当する核酸サンプルの調製に適した方法を提供する。好適な実施形態では、エキソン、選択的にはエキソン間の結合部を標的するプローブを含むことができる高密度オリゴヌクレオチドアレイなどの核酸プローブアレイとハイブリダイズさせるために、これらの方法を用いて、転写産物中の少なくとも７０％、８０％、９０％またはすべてのエキソンから核酸サンプルを調製する。本発明に係る方法も、米国特許出願第１０／８１５，３３３号に記載されているようなタイリングアレイで使用するのに適している。この文献は本明細書に組み込まれる。好適な実施形態において、アレイは、少なくとも５００、１０００、１０，０００の転写産物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはすべてのエキソンを標的するプローブを有することが可能である。
【００７１】
好適な実施形態において、ＲＮＡ転写産物サンプル（図１に例示）は、ｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用のテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡを合成する方法は、当技術分野で周知されている。しかし、この好適な実施形態において、ランダムな領域および固定した配列内容領域をもつオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが可能である。プライマーの一例は、ランダム・ヘキサマーと、後のインビトロ転写反応において有益なＴ７プロモーターである：
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【００７２】
ランダム領域は、転写産物を用いてプライマーによる無作為なプライミングを行うために有用であり、得られたｃＤＮＡが、転写産物のさまざまな領域をより代表できるようになる。好適な実施形態において、プライマーのランダム領域は、長さ５、６、７、８、９塩基である。固定した配列内容領域は、その後の反応における所望の機能を提供するために一般的に用いられる。例えば、Ｔ７プロモーターは、インビトロでの転写反応に有益である。当業者の技術において、Ｔ３やＳＰ６などのＴ７以外のプロモーターもまた、インビトロでの転写に一般に利用されており、固定した内容領域への利用に好ましい。さまざまなインビトロ転写用プロモーターに対するポリメラーゼが、例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）から市販されている。
【００７３】
図１に示すように、得られたｃＤＮＡ（一般的には二本鎖）をインビトロ転写反応用のテンプレートとして用いてｃＲＮＡを合成することができる。ｃＲＮＡ標的は、ハイブリダイゼーションおよび検出のために標識／断片化することができる（図２参照）。しかし、特に好適な実施形態において、ｃＲＮＡが、例えばランダムプライマーを用いた別のｃＤＮＡ合成反応のテンプレートとして使用される。その結果得られたｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションおよび検出のために標識し断片化することができる。この方法は、一般的には、検出感度を増加させる。
【００７４】
図２は、２つの方法を比較したものである。当業者は、本発明が、特定の標識法または断片化法に限定されるものでないことを理解されよう。多くの適当な標識法および断片化法を利用することができる。ハイブリダイゼーションを促進するという用途に適した別のＤＮＡ断片化法が、例えば、米国特許仮出願第６０／５８９，６４８号、第６０／５４５，４１７号、第６０／５１２，５６９号，第６０／５０６，６９７号に記載されており、これらすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７５】
以下は、好適な実施形態を具体的に説明する非限定的な例としての詳細なプロトコールである。このプロトコール例は、エキソン、選択的スプライシングなど、転写の特徴を検出するために、いくつかの大規模実験で用いられ、非常に良好な結果をもたらした（データは図示せず）。表１に試薬および材料の例を列挙した。
【００７６】
（表１．試薬および材料）
【００７７】
【表１−１】
【００７８】
【表１−２】
。
【００７９】
（ｃＲＮＡ増幅）
（工程１．第１鎖ｃＤＮＡ合成）
１．全ＲＮＡサンプルとＲＰ−Ｔ７プライマーを、０．２μＬのＰＣＲチューブの中で十分に混合する：
全ＲＮＡ（１０ｎｇ−１００ｎｇ） １μＬ
ＲＰ−Ｔ７プライマー、２ｐｍｏｌ／ｎｇ １μＬ
Ｈ２Ｏ ３μＬ
総容量 ５μＬ
２．サーマルサイクラーの中、６５℃で５分間インキュベートしてから、４℃で２分間保温した後スピンダウンしてサンプルを回収する。
３．以下のようにＲＴ＿プレミックス＿１を調製する：
ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ ０．５μＬ
５×第１鎖緩衝液 ２μＬ
ＤＴＴ、０．１Ｍ １μＬ
ｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭ ０．５μＬ
Ｓｕｐｅｒａｓｅ Ｉｎ、２０Ｕ／μＬ ０．５μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、２００Ｕ／μＬ ０．５μＬ
総容量 ５μＬ
４．５μＬのＲＴ＿プレミックス＿１を、変性したＲＮＡとプライマー混合物に加えて、最終容量を１０μＬとする。
５．十分に混合し、スピンダウンし、２５℃で１０分間、３７℃で１時間インキュベートしてから、１０分以内４℃に保つ。
【００８０】
（工程２．第２鎖ｃＤＮＡ合成）
１．以下のようにＳＳ＿プレミックス＿１を調製する：
ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ ４．５７５μＬ
ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ２．８μＬ
Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（エキソ−）、５Ｕ／μＬ ２．５μＬ
ＲＮａｓｅ Ｈ、２Ｕ／μＬ ０．１２５μＬ
総容量 １０μＬ
２．１０μＬのＳＳ＿プレミックス＿１を各第１鎖反応液に加えて、最終容量を２０μＬとする。
３．十分に混合し、スピンダウンしてから、３７℃で５０分間インキュベートする。
４．Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（エキソ−）を７０℃で１０分間不活性化し、１０分以内４℃に保って、次の工程に進む。
【００８１】
（工程３．Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７キットを用いたｃＲＮＡ増幅のためのＩＶＴ）
１．第２鎖合成反応液に、室温で以下の試薬を以下の順序に従って加える：
ＡＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＣＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＧＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＵＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
１０×反応緩衝液 ５μＬ
１０×酵素混合液 ５μＬ
総容量 ５０μＬ
２．各試薬を加えた後十分に混合して、短時間スピンする。３７℃で１６時間インキュベートする。
【００８２】
（工程４．ＲＮｅａｓｙカラムによるｃＲＮＡのクリーンアップ）
１．５０μＬのＲＮａｓｅを含まない水を上記ｃＲＮＡ産物に加える。
２．ｃＲＮＡ精製用のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットに添付されているＱｉａｇｅｎ社のＲＮＡクリーンアップのためのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉプロトコールに従う。
３．ｃＲＮＡ精製の最終工程で、５０μのＲＮａｓｅを含まない水で生成物を溶出する。
４．２μＬのｃＲＮＡを取り出して７８μＬの水に加えて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｃＲＮＡの収量を判定する。
５．次の工程に進む前に高速真空装置を用いて、容量を７μＬに減少させる。
【００８３】
（ｃＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換および標識）
（工程５．ｃＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡへの変換）
１．０．２μＬのＰＣＲチューブの中でｃＲＮＡとランダムプライマーを十分に混和する：
ｃＲＮＡ、可変 ７μＬ
ランダムプライマー、３μｇ／μＬ １μＬ
総容量 ８μＬ
２．短時間スピンして、７０℃で５分間、２５℃で５分間インキュベートする。
３．以下のようにＲＴ＿プレミックス＿２を調製する：
５×第１鎖緩衝液 ４μＬ
ＤＴＴ、０．１Ｍ ２μＬ
ｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭ １μＬ
Ｓｕｐｅｒａｓｅ Ｉｎ、２０Ｕ／μＬ １μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、２００Ｕ／μＬ ４μＬ
総容量 １２μＬ
４．１２μＬのＲＴ＿プレミックス＿２を、変性したＲＮＡとプライマー混合物に加えて、最終容量を２０μＬとする。
５．十分に混合し、短時間スピンする。２５℃で１０分間、次に３７℃で１時間インキュベートしてから、１０分以内４℃に保つ。
【００８４】
（工程６．第２鎖ｃＤＮＡ合成）
１．以下のようにＳＳ＿プレミックス＿２を調製する：
ＤＥＰＣ処理した水 ９．９μＬ
ＭＧＣｌ２、２５ｍＭ ５．６μＬ
ラージフラグメント、８．４Ｕ／μＬＴ ４μＬ
ＲＮａｓｅ Ｈ、２Ｕ／μＬ ０．５μＬ
総容量 ２０μＬ
２．２０μＬのＳＳ＿プレミックス＿２を、各第１鎖反応液に加えて、最終容量を４０μＬとする。
５．十分に混合し、スピンダウンしてから、３７℃で４０分間インキュベートし、１０分以内４℃に保って、次の工程に進むか、−２０℃で凍結させる。
【００８５】
（工程７．二本鎖ｃＤＮＡのクリーンアップ）
１．ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットのプロトコールにしたがって二本鎖ｃＤＮＡをクリーンアップする。
２．二本鎖ｃＤＮＡ精製の最終工程で、３７μＬのＥＢ緩衝液で生成物を溶出する。
３．２μＬのｃＤＮＡ溶出液を取り出して７８μＬの水に加えて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｃＤＮＡの収量を判定する。
【００８６】
（工程８．二本鎖ｃＤＮＡの断片化）
１．１Ｕ／μＬのＤＮＡｓｅ Ｉを、１×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液プラスを用いて０．２Ｕ／μＬに希釈する。
２．以下の混合液を調製する：
１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液プラス ３．６μＬ
ｄｓ ｃＤＮＡ ３０μＬ
ＤＮＡｓｅ Ｉ（０．２Ｕ／μＬ） ３μＬ
総容量 ３６．６μＬ
３．短時間スピンし、３７℃で１０分間インキュベートして、９５℃で１０分間ＤＮａｓｅ Ｉを不活性化してから、４℃に保つ。
４．断片化されたｃＤＮＡを１μＬ取り出し、キットの取扱指示書にしたがって、ＲＮＡナノキットを用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー上でサイズをチェックする。所望の断片サイズは、５０から２００ｂｐの範囲になるはずである。必要ならば、さらなるＤＮａｓｅ Ｉを加えて、所望のサイズを得ることができる。
【００８７】
（工程９．断片されたｃＤＮＡの標識：）
１．標識混合液を以下のよう調製する：
５×ＴｄＴ反応緩衝液 １４μＬ
ＣｏＣｌ２、２５ｍＭ １４μＬ
ＤＬＲ−１ａ、５ｍＭ １μＬ
末端転移酵素、ｒｅｃ（４００Ｕ／μＬ） ４．４μＬ
総容量 ３３．４μＬ
２．３３．４μＬの標識混合液を、３５．６μＬの断片化ｃＤＮＡに加えて、最終容量を６９μＬとする。
３．混合して短時間スピンする。３７℃で６０分間インキュベートしてから、４℃に保つ。
【００８８】
（工程１０．ハイブリダイゼーション）
１．ハイブリダイゼーション混合液を以下のよう調製する：
２×ＭＥＳハイブリダイゼーション用緩衝液 １００μＬ
コントロールオリゴＢ２、３ｍＭ ３μＬ
２０×ＲＮＡコントロール １０μＬ
ＢＳＡ、アセチル化されたもの、５０ｍｇ／μＬ ２μＬ
ニシン精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／μＬ ２μＬ
ＤＭＳＯ，１００％ １４μＬ
総容量 １３１μＬ
２．１３１μＬのハイブリダイゼーション混合液を、６９μＬの標識反応液に加えて、最終容量を２００μＬとし、十分に混合した後、９９℃で１０分間変性してから、サーマルサイクラー中、５０℃で５分間放置する。
３．２００μＬの標識されたｃＤＮＡを、予め湿らせておいたＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)プローブアレイ（ｃＤＮＡ試験用アレイ）と５０℃で１６時間インキュベートする。
４．ＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析記述マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、ＵＳＡ）に記載されている洗浄およびスキャン手順に従う。この文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８９】
図２は、転写産物全体を解析するためのもう一つのプロトコールを示す。このＷＴＡプロトコールは、ランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成に基づいている。詳細なプロトコールが、本明細書において、非限定的な実施例として提供されている。
【００９０】
（ｃＤＮＡ標的の調製）
（試薬および材料）
・ランダムプライマー、３μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ ４８１９０−０１１
・ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ １８０６４−０７１
・ＳＵＰＥＲａｓｅ・ＩｎＴＭ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｐ／Ｎ ２６９６
・ＮａＯＨ、１Ｎ溶液、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐ／Ｎ ＭＫ４６９３６０
・ＨＣｌ、１Ｎ溶液、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐ／Ｎ ＭＫ６３８８６０
・ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、ＱＩＡＧＥＮ、Ｐ／Ｎ ２８１０４
・１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ／Ｎ ２７−０９０１−０２
・デオキシリボヌクレアーゼ Ｉ（ＤＮａｓｅ Ｉ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ／Ｎ ２７−０５１４−０１
・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ １５５７５−０２０
・末端転移酵素（緩衝液およびＣｏＣｌ２を含む）、４００ Ｕ／μＬ、組換え体、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐ／Ｎ ３ ３３３ ５７４
・ＤＬＲ−１ａ、５ｍＭ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ ９００４３０
（ｃＤＮＡ合成）
以下のプロトコールの出発物質は、５μｇの全ＲＮＡである。インキュベーションは、サーマルサイクラー中で行われる。
【００９１】
（工程１：ｃＤＮＡ合成）
１．プライマーをアニーリングするために以下の混合液を調製する。
ランダムプライマーを３μｇ／μＬから７５０ｎｇ／μＬに希釈する（１：４希釈）。
【００９２】
（ＲＮＡ／プライマーアニーリング用混合液）
【００９３】
【表２】
２．ＲＮＡ／プライマー混合液を以下の温度でインキュベートする。
・７０℃で１０分間
・２５℃で１０分間
・４℃に冷却する。
３．ｃＤＮＡ合成のために反応混合液を調製する。反応液を短時間遠心分離して、サンプルを底に集めて、ＲＮＡ／プライマーアニーリング用混合液に、以下の表からｃＤＮＡ合成用混合液を加える。
【００９４】
（ｃＤＮＡ合成成分）
【００９５】
【表３】
４．反応液を以下の温度でインキュベートする。
・２５℃で１０分間
・３７℃で６０分間
・４２℃で６０分間
・７０℃で１０分間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩを不活性化する。
・４℃に冷却する。
【００９６】
（工程２：ＲＮＡの除去）
１．２０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えて、６５℃で３０分間インキュベートする。
２．２０μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えて中和する。
【００９７】
（工程３：ｃＤＮＡ合成生成物の精製および定量）
１．ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを用いて、ｃＤＮＡ合成生成物をクリーンアップする（詳細なプロトコールについては、供給業者から提供されるＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 精製キットプロトコールを参照）。生成物を、４０μＬのＥＢ緩衝液（ＱＩＡｑｕｉｃｋキットとともに供給される）によって溶出する。
２．上記溶出液から２μＬを取り出して、精製されたｃＤＮＡ生成物を２６０ｎｍにおける吸光度によって定量する（１．０Ａ２６０ユニット＝３３μｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ）
（ｃＤＮＡの断片化）
１．以下の反応混合液を調製する。
【００９８】
（断片化反応混合液）
【００９９】
【表４】
２．この反応液を３７℃で１０分間インキュベートする。
３．ＤＮａｓｅ Ｉを９８℃で１０分間不活性化させる。
４．断片化されたｃＤＮＡを直接末端標識反応に適用する。あるいは、後で使用するため、材料を−２０℃で保存することもできる。
【０１００】
（末端標識）
ＤＬＲ−１ａ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）との組換え体であるＲｏｃｈｅ末端転移酵素を用いて、断片生成物の３’末端を標識する。
１．以下の反応混合液を調製する。
【０１０１】
（末端標識反応液）
【０１０２】
【表５】
２．この反応液を３７℃で６０分間インキュベートする。
３．２μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させる。
４．標的を、プローブアレイ上でハイブリダイズさせることができる。あるいは、後で使用するため、材料を−２０℃で保存することもできる。
【０１０３】
（標的のハイブリダイゼーション）
（試薬および材料）
・２×ＭＥＳハイブリダイゼーション用緩衝液（調製のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアル参照）
・アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、５０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ １５５６１−０２０
・ニシン精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐ／Ｎ Ｄ１８１１
・ＧｅｎｅＣｈｉｐ真核生物用ハイブリダイゼーションコントロールキット、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ９００２９９
・コントロールオリゴＢ２、３ｎＭ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ９００３０１（別々に順序正しく並べることができる。）
・１００％ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ／Ｎ Ｄ−４８１８
（標的のハイブリダイゼーション）
１．以下のものを標的毎に混合し、多数のプローブアレイに対してハイブリダイゼーションを行うためには、ハイブリダイゼーションの容量をスケールアップする。
【０１０４】
（１つのミディプローブアレイに対するハイブリダイゼーション用混合液）
【０１０５】
【表６】
２．使用直前に、プローブアレイを室温に平衡させる。
３．ハイブリダイゼーション用混合液を９９℃で５分間加熱してから、５０℃に保つ。
４．一方で、アレイを１×ハイブリダイゼーション用緩衝液で満たして湿らせる。プローブを５０℃で１０分間、回転させながらインキュベートする。
５．ハイブリダイゼーション用混合液を最高速度でスピンさせて、あらゆる不溶性物質を取り除く。
６．プローブアレイから緩衝液溶液を取り除き、ハイブリダイゼーションカクテルで充填する
７．５０℃オーブン内のローティッセリーボックスにプローブアレイを置いて、６０ｒｐｍで回転させて１６時間ハイブリダイズさせる。
【０１０６】
（プローブアレイの洗浄および染色）
（試薬および材料）
・２×ＭＥＳステイン緩衝液（調製のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアル参照）
・アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、５０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ １５５６１−０２０
・Ｒ−フィコエリトリン・ストレプトアビジン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｐ／Ｎ Ｓ−８８６
・ヤギＩｇＧ、試薬等級、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ Ｉ ５２５６
・抗ストレプトアビジン抗体（ヤギ）、ビオチン化抗体、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐ／Ｎ ＢＡ−０５００
（染色試薬の調製）
（第１回目および第３回目の染色のためのＳＡＰＥ溶液混合物）
【０１０７】
【表７】
（第２回目の染色のための抗体溶液混合物）
【０１０８】
【表８】
（プローブアレイを洗浄および染色する）
真核生物標的に対する洗浄および染色の工程に関するＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアルに記載されている指示にしたがう。
【０１０９】
図４は、ランダム・ヘキサマーｃＤＮＡプロトコール（ＷＴＡ）とｓＷＴＡ（ランダム／Ｔ７プライマー、ｃＤＮＡサンプル）の間のプローブ強度の比較結果を示している。ｓＷＴＡプロトコールは、ＷＴＡプロトコールと良好な相関関係を示す（Ｒ＝０．９６１±０．００４）。２つのプロトコールを用いて転写の検出を行う実験において、検出コールが一致するのはおよそ９０％であった。
【０１１０】
図５は、転写産物を全長にわたって検索するように設計されたプローブによって、例示的な転写産物を検出するためのＷＴＡプロトコールとｓＷＴＡプロトコールの比較結果を示している。これら２つのプロトコールが、転写産物の全長に相当する核酸サンプルを産生できることが分かる。
【０１１１】
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写産物に相当する核酸サンプルを調製する方法が提供される。これらの方法は、エキソンや選択的スプライシングなど、転写産物の特徴を検出するために使用されるサンプルを調製するのに特に適している。これらの方法は、転写産物の特徴を定量的、半定量的、または定性的に検出するのに適している。これらの方法を用いて、選択的にスプライシングされた転写産物など、すべてのタイプの転写産物を含む、多数の転写産物を観察することができる。これらの方法は、例えば、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった標的転写産物、または転写産物の特徴を、マイクロアレイによって平行して解析する方法に特に適している。本明細書において、「標的転写産物」または「標的核酸」という用語は、対象とする転写産物または核酸を意味するために使用される。
【０１１２】
好適な実施形態において、核酸サンプルを調製する方法は、プライマー混合物を、複数のＲＮＡ転写産物、または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸にハイブリダイズさせ、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第一鎖ｃＤＮＡ、および該第一鎖ｃＤＮＡに相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダム配列プライマー領域を有するオリゴヌクレオチドを含む工程、および、プロモーター領域からＲＮＡ転写を開始させて核酸サンプルを生成する工程を含む。プライマー領域は、ランダムな六量体（ヘキサマー）であってもよい。プロモーターは、一般的には、バクテリオファージのプロモーター、好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のプロモーターのような原核生物プロモーターである。
【０１１３】
本方法を用いて、真核生物のｍＲＮＡ、またはそれ以外のＲＮＡを解析することができる。全ＲＮＡサンプル、またはポリ（Ａ）＋で濃縮されたサンプルはすべて、本方法を用いるのに適している。
【０１１４】
特に好適な方法において、得られたｃＲＮＡをテンプレートとして用いて、第二鎖ｃＤＮＡを合成することができる。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダム・ヘキサマーなどのランダムプライマーを使用して実施することが可能である。
【０１１５】
本発明に係る方法は応用範囲が広く、特定の検出方法に限定されないが、特に、例えば１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった転写産物の特徴を検出するのに適している。例えば、第二鎖ｃＤＮＡは断片であって／標識した後、検出のためハイブリダイズさせることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、転写産物における特異的エキソンおよび／またはスプライス部位のような、転写産物の特異的な特徴を検出するのに特に適している。一般的には、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００または５００，０００種類のオリゴヌクレオチドプローブをまとめて検出のため使用することも可能である。核酸プローブは、ビーズのコレクション上、または単一の基質上に固定することが可能である。
【０１１６】
別の態様において、核酸サンプルを調製するための試薬キットを提供する。試薬キットの具体例は、オリゴヌクレオチド混合物成分を含む容器、および、オリゴヌクレオチド混合物成分中のオリゴヌクレオチドがランダムプライマー領域およびプロモーター領域を含むものである、該オリゴヌクレオチド混合物の使用指示書を含む。オリゴヌクレオチド混合物の具体例の一つは以下の配列を有する。
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【０１１７】
本試薬キットは、さらに、逆転写酵素を含む容器、およびＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含む。キットには、ランダムプライマー領域およびプロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド混合物以外にも、ランダムプライマー混合液（例えばランダムなヘキサマー混合液）を含ませることも可能である。付加的な成分には、標識用および断片化用の試薬やヌクレオチドなどがある。
【０１１８】
好適な実施形態において、本キットは、標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するよう設計された、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、または５０，０００種類のさまざまな核酸プローブのコレクションを含む。これらの核酸プローブは、基質上に固定することも可能であり、一般的には、５０００以上のさまざまなエキソンおよび／または５００以上のスプライス部位に対して設計されている。
【０１１９】
本発明に係る方法およびキットは、生物学的研究、診断学、毒物学、創薬などの領域において広範な応用範囲を有する。例示的な実施形態において、薬剤候補物質で処理したサンプルにおける各エキソンおよびスプライス部位構造の転写を観察する。選択的スプライシングなど、薬剤処理に対する転写特性の反応を解析して、薬剤候補物質を評価することができる。本発明に係る方法およびキットは、得られる核酸が、転写産物の３’末端領域または５’末端領域に限定されず、全転写産物に相当するものが多いため、このような用途に特に適している。
【０１２０】
別の用途例において、本方法およびキットを用いて組織サンプルを処理し、核酸サンプルを得ることができる。このサンプルを、選択的にスプライシングされた転写産物について解析する。選択的スプライシングは、しばしば一定の病気の発病に関係していることが知られている。組織サンプルにおける選択的スプライシングの発生を解析することによって、診断に関する情報を得ることができる。
【０１２１】
当然ながら、上記の説明は、例示のためのものであって、限定のためのものではない。上記説明を検討すれば、当業者にとって、本発明を変化させたものが数多く明らかになろう。特許文献および非特許文献を含む、引用された文献のすべてが、あらゆる目的のために、それら全部が参照されて本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を例示するものであり、明細書とともに、本発明の原理を説明する助けとなる。
【図１】図１は、ランダムなヘキサマー（ＲＨ）領域およびＴ７プロモーター領域を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用する好適な実施形態（小さなサンプルＷＴＡないしはｓＷＴＡ）を示す概略図である。本方法には、２段階のｃＤＮＡ合成工程がある。ｃＤＮＡは、５’もしくは３’末端を標識するか、または内部標識することも可能である。
【図２】図２は、ｃＲＮＡサンプルを調製するためのｃＤＮＡ合成を１段階で行うプロトコールと、ｃＤＮＡサンプルを調製するために２段階でｃＤＮＡ合成を行うプロトコールという２つのプロトコールを比較する概略図である。ｃＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために断片化／標識することが可能である。
【図３】図３は、ｃＤＮＡサンプル（ＷＴＡ）を調製するためのランダム・ヘキサマーによるｃＤＮＡプロトコールを示す概略図である。選択的には、第二鎖ｃＤＮＡを合成することも可能である。
【図４】図４は、ｓＷＴＡとＷＴＡの効率を比較する。
【図５】図５は、ＲＰ−Ｔ７−ＣＤＮＡ増幅（ｓＷＴＡ）プロトコールが、典型的な全長転写産物全体を検出するのに有用であることを示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
（優先権主張）
本出願は、２００３年８月１３日付で出願された米国特許仮出願第６０／４９５，２３２号、および２００４年２月９日付で出願された米国特許仮出願第６０／５４２，９３３号の利益を主張するものであり、それらの教示内容は、参照して本明細書に組み込まれる。引用された特許出願はすべて、本明細書において、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸サンプルを調製する方法は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術を利用する研究室での研究を大きく変貌させ、また、数例をあげれば、診断学、法医学、核酸解析法、および遺伝子発現観察法の分野に影響を与えてきた。技術的には、実質的に全転写産物を増幅する方法に対する需要がまだ存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写産物に相当する核酸サンプルを調製する方法が提供される。本方法は、エキソンや選択的スプライシングなど、転写産物の特徴を検出するために使用されるサンプルを調製するのに特に適している。本方法は、そのような転写産物を定量的、半定量的、または定性的に検出するのに適している。本方法は、選択的スプライシングを受けた転写産物など、あらゆるタイプの変異配列を含む多数の転写産物を観察するために使用することができる。本方法は、例えば、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった標的転写産物、または転写産物の特徴を、マイクロアレイによって平行して解析する方法に特に適している。本明細書において、「標的転写産物」または「標的核酸」という用語は、対象とする転写産物またはその他の核酸を意味するために使用される。
【０００４】
好適な実施形態において、核酸サンプルを調製する方法は、プライマー混合物を、複数のＲＮＡ転写産物、または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸にハイブリダイズさせ、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第一鎖ｃＤＮＡ、および該第一鎖ｃＤＮＡに相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダム配列プライマー領域を有するオリゴヌクレオチドを含む工程、および、プロモーター領域からＲＮＡ転写を開始させて核酸サンプルを生成する工程を含む。プライマー領域は、ランダムな六量体（ヘキサマー）であってもよい。プロモーターは、一般的には、バクテリオファージのプロモーター、好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のプロモーターのような原核生物プロモーターである。
【０００５】
本方法を用いて、真核生物のｍＲＮＡ、またはそれ以外のＲＮＡを解析することができる。全ＲＮＡサンプル、またはポリ（Ａ）＋で濃縮されたサンプルはすべて、本方法を用いるのに適している。
【０００６】
特に好適な方法において、得られたｃＲＮＡをテンプレートとして用いて、第二鎖ｃＤＮＡを合成することができる。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダム・ヘキサマーなどのランダムプライマーを使用して実施することが可能である。
【０００７】
本発明に係る方法は応用範囲が広く、特定の検出方法に限定されないが、特に、例えば１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった転写産物の特徴を検出するのに適している。例えば、第二鎖ｃＤＮＡは断片であって／標識した後、検出のためハイブリダイズさせることができる。標識工程は、例えばｃＤＮＡ合成の過程で行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブは、転写産物における特異的エキソンおよび／またはスプライス部位のような、転写産物の特異的な特徴を検出するのに特に適している。一般的には、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００または５００，０００種類のオリゴヌクレオチドプローブをまとめて検出のため使用することも可能である。核酸プローブは、ビーズのコレクション上、または単一の基質上に固定することが可能である。
【０００８】
本発明の別の態様において、核酸サンプルを調製するための試薬キットを提供する。試薬キットの具体例は、オリゴヌクレオチド混合物成分を含む容器、および、オリゴヌクレオチド混合物成分中のオリゴヌクレオチドがランダムプライマー領域およびプロモーター領域を含むものである、該オリゴヌクレオチド混合物の使用指示書を含む。オリゴヌクレオチド混合物の具体例の一つは以下の配列を有する：
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【０００９】
本試薬キットは、さらに、逆転写酵素を含む容器、およびＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含む。キットには、ランダムプライマー領域およびプロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド混合物以外にも、ランダムプライマー混合液（例えばランダムなヘキサマー混合液）を含ませることも可能である。付加的な成分には、標識用および断片化用の試薬やヌクレオチドなどがある。
【００１０】
好適な実施形態において、本キットは、標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するよう設計された、少なくとも１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、または５０，０００種類のさまざまな核酸プローブのコレクションを含む。これらの核酸プローブは、基質上に固定することも可能であり、一般的には、５０００以上のさまざまなエキソンおよび／または５００以上のスプライス部位に対して設計されている。
【００１１】
本発明に係る方法およびキットは、生物学的研究、診断学、毒物学、創薬などの領域において広範な応用範囲を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写を解析する方法および組成物が提供される。転写物サンプルに由来する核酸サンプルを調製する方法および組成物が提供される。好適な実施形態において、核酸サンプルは転写物サンプルにおける転写物の集団に相当する。したがって、これらの好適な方法は、エキソン構造および転写におけるスプライシングのような、転写の特徴／構造を調べるのに用いられる核酸サンプルを調製するのに特に適している。本発明に係る方法は、通常、３’または５’末端に限らず、標的全域の任意の場所で転写産物をより良好に産生することができる。好適な本方法は、転写産物をテンプレートとして用い、また、ランダムなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、（例えば、逆転写反応によって）核酸を合成することを一般に含む。次いで、合成された核酸をさらに処理して、核酸サンプルを得る。本方法は、マイクロアレイによる実験に特に有効である。しかし、本サンプル調製法は、他の検出法にも使用することができる。
【００１３】
本発明の別の態様において、１種類以上のプライマー（ランダム領域、およびＴ７プロモーターのように一定の配列内容をもつ領域を含むことができる）を含むアッセイ用キットは、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、標識試薬、および／または断片化試薬を選択的に含む。
【００１４】
（Ｉ．概略）
本発明は多くの好適な実施形態を有し、当業者に公知の詳細に関しては、多くの特許、出願、および参考文献に依存する。したがって、特許、出願、または他の参考文献が以下に引用または繰り返されている場合、該特許、出願または参考文献は、引用された事柄のみならず、あらゆる目的で、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本出願において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の記載がない限り、複数形への言及も含むものとする。例えば、「一個の因子」という用語は、複数因子の混合物など、複数の因子を含む。
【００１６】
個体はヒトに限定されず、哺乳動物、植物、細菌、または上記のいずれかに由来する細胞などの有機体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本開示を通して、本発明の種々の態様は、範囲表示形式（ａ ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で表示されることがあるが、範囲表示形式による記載は、単に便宜と簡潔さのためのものである理解されるべきであり、本発明の範囲を不動の制約として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲のすべて、およびその範囲内にある各数値を具体的に開示したと考慮されるべきである。例えば、１から６までの範囲が記載されている場合には、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などという部分範囲、および、この範囲内にある各数字、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００１８】
本発明の実施は、特段の記載がない限り、有機化学、高分子技術、分子生物学（組換技術など）、細胞生物学、生化学および免疫学などの従来技術および説明を使用することができ、これらは当技術分野の範囲に入る。このような従来技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、およびラベルを用いたハイブリダイゼーション検出を含む。適当な技術の具体例を、本明細書で後述する実施例を参照して得ることができる。しかし、もちろん、他の同等な常法を用いることも可能である。このような従来の技術および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｖｏｌｓ． Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （４ｔｈ Ｅｄ．） Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ （２０００）， Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，およびＢｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹなどの標準的な実験マニュアルの中に記載されており、これらは全て、あらゆる目的でその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明は、いくつかの好適な実施形態において、アレイなどの固形基質を使用することができる。ポリマー（タンパク質など）のアレイ合成に応用可能な方法および技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、国際公開公報第ＷＯ００／５８５１６号、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２４２，９７４号、第５，２５２，７４３号、第５，３２４，６３３号、第５，３８４，２６１号、第５，４０５，７８３号、第５，４２４，１８６号、第５，４５１，６８３号、第５，４８２，８６７号、第５，４９１，０７４号、第５，５２７，６８１号、第５，５５０，２１５号、第５，５７１，６３９号、第５，５７８，８３２号、第５，５９３，８３９号、第５，５９９，６９５号、第５，６２４，７１１号、第５，６３１，７３４号、第５，７９５，７１６号、第５，８３１，０７０号、第５，８３７，８３２号、第５，８５６，１０１号、第５，８５８，６５９号、第５，９３６，３２４号、第５，９６８，７４０号、第５，９７４，１６４号、第５，９８１，１８５号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１９３号、第６，０９０，５５５号、第６，１３６，２６９号、第６，２６９，８４６号、および第６，４２８，７５２号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０号（国際公開公報番号第ＷＯ９９／３６７６０号）および第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５号に記載されており、これらはすべて、あらゆる目的のためにその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２０】
具体的な実施形態において合成技術が記載されている特許は、米国特許第５，４１２，０８７号、第６，１４７，２０５号、第６，２６２，２１６号、第６，３１０，１８９号、第５，８８９，１６５号および第５，９５９，０９８号などである。核酸アレイは、上記特許の多くに記載されているが、同一の技術がポリペプチド配列にも適用される。
【００２１】
本発明において有用な核酸アレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からブランド名ＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)として市販されているものを含む。アレイの見本がａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍのウェブサイトに表示されている。
【００２２】
また、本発明は、固形基質に結合したポリマーの多くの用途も想定している。これらの用途には、遺伝子発現のモニタリング、プロファイリング、ライブラリーのスクリーニング、遺伝子型決定および診断が含まれる。遺伝子発現のモニタリングおよびプロファイリングの方法は、米国特許第５，８００，９９２号、第６，０１３，４４９号、第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１３８号、第６，１７７，２４８号、および第６，３０９，８２２号において示されている。遺伝子型決定法およびその用途は、米国特許出願第６０／３１９，２５３号、第１０／０１３，５９８号、ならびに米国特許第５，８５６，０９２号、第６，３００，０６３号、第５，８５８，６５９号、第６，２８４，４６０号、第６，３６１，９４７号、第６，３６８，７９９号、および第６，３３３，１７９号に示されている。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，９０２，７２３号、第６，０４５，９９６号、第５，５４１，０６１号、および第６，１９７，５０６号において具体化されている。
【００２３】
本発明はまた、特定の好適な実施形態におけるサンプル調製法も想定している。遺伝子型決定の前、またはそれと並行して、ゲノムサンプルをさまざまな手法により増幅することができ、それらの手法のいくつかではＰＣＲを用いることができる。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ． Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）、Ｍａｔｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １，１７（１９９１）；ＰＣＲ （Ｅｄｓ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、および米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号および第５，３３３，６７５号参照。また、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照されて本明細書に組み込まれる。サンプルはアレイで増幅される。米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号参照。また、これらは参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２４】
他の適当な増幅法は、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０））、転写増幅法（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自律的配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）および国際公開公報第ＷＯ９０／０６９９５号）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列開始型（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＣＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライマーポリメラーゼ連鎖反応法（ＡＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、第５，８６１，２４５号）、および核酸による配列増幅法（ＮＡＢＳＡ）を含む。（米国特許第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号、および第６，０６３，６０３号参照。これらはそれぞれ参照されて本明細書に組み込まれる）。この他に利用できる増幅法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号、および米国特許出願第０９／８５４，３１７号に記載されており、これらは、それぞれ参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２５】
サンプル調製のさらに別の方法、および核酸サンプルの複雑性を軽減させる技術は、Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、第６，３９１，５９２号、ならびに米国特許出願第０９／９１６，１３５号、第０９／９２０，４９１号、第０９／９１０，２９２号、および第１０／０１３，５９８号に記載されている。
【００２６】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの測定を行う方法は、当技術分野において十分に開発されてきた。ハイブリダイゼーションを測定する手順および条件は用途に応じて変化し、公知の一般的な結合方法、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）において参照されている方法などに応じて選択される。反復制御されたハイブリダイゼーション反応を実行する方法および装置は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，８７４，２１９号、第６，０４５，９９６号および第６，３８６，７４９号、第６，３９１，６２３号に記載されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明は、一定の好適な実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出も想定している。米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８３４，７５８号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、および第６，２２５，６２５号、ならびに米国特許出願第６０／３６４，７３１号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開公報第ＷＯ９９／４７９６４号として公開されている）参照。これらも、そのそれぞれが、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２８】
シグナル検出および強度データ処理の方法および装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５４７，８３９号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８００，９９２号、第５，８３４，７５８号、第５，８５６，０９２号、第５，９０２，７２３号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０９０，５５５号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、および第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開公報第ＷＯ９９／４７９６４号として公開されている）参照。これらもまた、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２９】
また、本発明の実施は、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよび装置を使用することもできる。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、一般的に、本発明の方法の論理工程を遂行するためのコンピュータで実行可能な命令を有する、コンピュータで読み取り可能な媒体を含む。適当なコンピュータ可読性媒体は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ‐ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ‐ＲＯＭ、ハードディスク装置、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ等を含む。コンピュータで実行可能命令は、適当なコンピュータ言語、またはいくつかの言語の組み合わせで記述することができる。基本的なコンピュータによる生物学的方法は、例えばＳｅｔｕｂａｌ ａｎｄ Ｍｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）、Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（ＥＤ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）、Ｒａｓｈｉｄｉ ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）、およびＯｕｅｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｂｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ｗｉｎｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記載されている。米国特許第６，４２０，１０８号参照。
【００３０】
また、本発明では、プローブ設計、データ管理、解析、および機器の操作などの多様な目的に、種々のコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを利用することもできる。米国特許第５，５９３，８３９号、第５，７９５，７１６号、第５，７３３，７２９号、第５，９７４，１６４号、第６，０６６，４５４号、第６，０９０，５５５号、第６，１８５，５６１号、第６，１８８，７８３号、第６，２２３，１２７号、第６，２２９，９１１号、および第６，３０８，１７０号参照。
【００３１】
また、本発明では、米国特許第５，５４５，５３１号および第５，８７４，２１９号に記載されているアレイおよび処理についてのいくつかの実施形態を利用することもできる。これらの特許は、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００３２】
さらに、本発明には、米国特許出願第１０／０６３，５５９号、第６０／３４９，５４６号、第６０／３７６，００３号、第６０／３９４，５７４号、第６０／４０３，３８１号などに示されているように、インターネットなどのネットワーク上で遺伝子情報を提供する方法を含む好適な実施形態がありうる。
【００３３】
（ＩＩ．定義）
「アレイ」は、意図的に生成した分子の集合体であって、化学合成または生合成により調製することができる集合体である。アレイ中の分子は、同一のものでも、または互いに異なるものでもよい。アレイは、種々のフォーマット、例えば、可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固形支持体に固定した化合物などを想定することができる。
【００３４】
「アレイプレートまたはプレート」とは、液体を通過させずに、ウェルと呼ばれる領域または空間を形成する物理的障壁によって、各アレイが他のアレイから分離されている複数のアレイを有する物体である。
【００３５】
「核酸のライブラリーまたはアレイ」は、意図的に生成された核酸の集合体であって、化学合成によるか生合成によって調製することができ、さまざまな異なったフォーマット（可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、またはその他の固形支持体に固定されたオリゴのライブラリー）における生物活性をスクリーニングすることができる集合体である。さらに、「アレイ」という用語は、本質的には任意の長さの核酸（例えば、長さ約１から約１０００ヌクレオチドのモノマー）を基質上にスポットすることによって生成することができる、このような核酸ライブラリーも含む意味であるが、これらに限定されるものではない。本明細書において「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形状のものであって、プリン基およびピリミジン基、またはその他の天然に、化学的に、または生化学的に修飾されているヌクレオチドの塩基、または、誘導体化されているヌクレオチドの塩基のいずれかを含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または、米国特許第６，１５６，５０１号に示されているようなペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドの骨格は、一般的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ、または置換された糖またはリン酸基に見られるように、糖およびリン酸基から構成されることがある。ポリヌクレオチドには、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドのアナログなど、修飾されたヌクレオチドが含まれうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的には、本明細書に記載されているようなアナログも含む。これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに共通するいくつかの構造的特徴を有するため、核酸配列またはオリゴヌクレオチド配列に取り込まれると、溶液中に存在する天然の核酸配列とハイブリダイズすることが可能になるという分子である。一般的には、これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドを、塩基、リボース、またはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することによって得られる。これらの変化は、ハイブリッド形成を安定させたり不安定にさせたり、または、相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を亢進させたりと、必要に応じてあつらえることができる。
【００３６】
「バイオポリマーまたは生体高分子」は、生物学的または化学的成分の反復単位を意味するものとする。代表的なバイオポリマーは、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リポ多糖、リン脂質、および前記のものの合成アナログなどがあるが、これらに限定されるものではない。また、合成アナログは、逆転ヌクレオチド、ペプチド核酸、メタＤＮＡ、および上記したものの組合せを含むが、これらに限定されない。「バイオポリマー合成」は、有機的および無機的合成によるバイオポリマーの生成を含むものとする。
【００３７】
バイオポリマーに関係するのは、バイオポリマーの単一ユニット、またはバイオポリマーの一部ではない単一ユニットを意味するための「バイオモノマー」である。従って、例えば、ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・バイオポリマー内のバイオモノマーであり、また、アミノ酸は、タンパク質またはペプチド・バイオポリマー内のバイオモノマーであり、また、例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体断片などもバイオポリマーである。
【００３８】
「開始バイオモノマー」：または「イニシエーター・バイオモノマー」は、反応性求核試薬を介してポリマーの表面に共有結合によって結合している先頭のバイオモノマー、または、反応性求核試薬を介してポリマーに結合しているリンカーまたはスペーサーアームに結合している先頭のバイオモノマーである。
【００３９】
「相補性」は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖の間、または、オリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定または増幅すべき一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間など、ヌクレオチドまたは核酸同士におけるハイブリダイゼーションまたは塩基対の形成を意味する。相補ヌクレオチドは、通常、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。２本の一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、好ましくは整列されて比較され、また、適当なヌクレオチドの挿入または欠失をもって、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％から９５％、より好ましくは約９８％から１００％と対合する場合に、実質的に相補的であると言われる。あるいは、選択的なハイブリダイゼーション条件下で１本のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖がその相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相補性が存在する。一般に、少なくとも１４から２５個のヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：２０３（１９８４）参照。
【００４０】
コンビナトリアル合成法：コンビナトリアル合成法は、反応基質（ｒｅａｃｔａｎｔ ｍａｔｒｉｘ）およびスイッチ基質（ｓｗｉｔｃｈ ｍａｔｒｉｘ）に相当する試薬を順次添加することによって多様なポリマー配列を並行合成するための順序付けられた方法であり、この合成法の産物が生成物基質（ｐｒｏｄｕｃｔ ｍａｔｒｉｘ）である。反応基質は、添加される合成断片の構成単位である１列×ｍ行の基質である。スイッチ基質は、縦に並べられたｉ行からｍ行までの間の、好ましくは規則正しく並べられた２進数の全てまたは部分集合である。「バイナリー法」とは、少なくとも連続した２つのステップにより、基質上の目的とする領域の一部、しばしば半分を照射するという方法である。バイナリー合成法においては、一組の順番に並んだ反応試薬から形成することができると考えられるすべての化合物を形成させる。最も好適な実施形態において、バイナリー合成法は、その前の添加ステップも含む合成法を意味する。例えば、マスキング法のためのスイッチ基質が、前に照射した領域を半分に分けて、以前照射した領域の約半分を照射し、残りの半分を保護する（また、一方で、以前保護された領域の約半分を保護し、以前保護された領域の残りの約半分を照射する）。２進法的過程の間に非２進法的過程が入り込むことが可能であるため、基質の一部に対してのみ、２進法スキームを行うことができると認められる。コンビトリアルな「マスキング」法は、光または他の空間選択的な脱保護剤または活性化剤を使用して物質から保護基を除去して、アミノ酸などの別の物質を付加する合成法である。
【００４１】
「有効量」とは、所望の結果を誘導するのに十分な量を意味する。
【００４２】
「励起エネルギー」は、例えば蛍光性標識を発光させることのように、検出のための検出用標識に活性を与えるために利用されるエネルギーを意味する。この用途のための装置は、レーザー、紫光外線、発光ダイオード、白熱光源、またはその他の光線などのコヒーレント光または非コヒーレント光、または、励起可能標識の励起帯に波長を有する電磁エネルギー源、または検出可能な透過光、反射光または拡散光を発することができる電磁エネルギー源などである。
【００４３】
「ゲノム」は、生物の染色体中の遺伝物質のすべてである。特定の生物の染色体中の遺伝物質から得られるＤＮＡがゲノムＤＮＡである。ゲノムライブラリーは、ある生物の全ゲノムに相当する一組のランダムに生成した重複ＤＮＡ断片から生成したクローンの集合体である。
【００４４】
「ハイブリダイゼーションの条件」は、一般的には、約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくはおよそ２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃まで低くすることができるが、一般的には２２℃よりも高く、より一般的には約３０℃よりも高く、好ましくは約３７℃を超える。断片が長くなるほど、特異的ハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となろう。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶剤の存在および塩基のミスマッチの程度など、他の要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響するため、パラメーターの組合せが、単独のパラメーターの絶対測定値より重要である。
【００４５】
ハイブリダイゼーション、例えば、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で実施される。例えば、塩濃度が約１モル濃度（Ｍ）を超えず、温度が２５℃以上であるという条件は、例えば、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（５Ｘ ＳＳＰＥ、および、約２５℃から約３０℃の温度という条件である。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション」は、通常、ストリンジェントな条件下、例えば１Ｍを超えない塩濃度および２５℃以上の温度で実施する。例えば、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ ７５０ｍＭ、リン酸ナトリウム ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ｐＨ７．４）、および温度が２５℃から３０℃という条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈｅ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。この文献は、あらゆる目的のために、その全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【００４７】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、２本の一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを意味するが、三本鎖のハイブリダイゼーションも理論的には可能である。その結果得られた（通常は）二本鎖ポリヌクレオチドが「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率を、本明細書においては「ハイブリダイゼーション度」と呼ぶ。
【００４８】
「ハイブリダイゼーション・プローブ」とは、塩基特異的な態様で、核酸の相補鎖に結合することができるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブには、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されているようなペプチド核酸、ならびにその他の核酸類似物質および核酸模倣物質が含まれる。米国特許第６，１５６，５０１号参照。
【００４９】
「特異的にハイブリダイズする」、とは、複合混合物である（例えば、細胞中の全）ＤＮＡまたはＲＮＡの中に特定の塩基配列が存在するとき、その塩基配列に、ストリンジェントな条件下で実質的に、またはそれに対してのみ、ある分子が結合、二本鎖形成またはハイブリダイズすることを意味する。
【００５０】
「単離された核酸」とは、存在する主要な分子種が、目的とする分子種である発明である（すなわち、分子レベルでは、組成物に存在する他のどの分子種よりも豊富に存在する）。好ましくは、単離された核酸は、存在する全高分子種の少なくとも（モル濃度で）約５０、８０または９０％を構成する。最も好ましくは、目的とする分子種を、本質的に均一になるまで精製する（通常の検出法では、混入した分子種を組成物中で検出することができない）。
【００５１】
「標識」、例えば「発光性標識」、光を散乱させる標識または放射性標識。蛍光標識は、中でも、Ｆｌｕｏｒｅｐｒｉｍｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＦＡＭ（ＡＢＩ）など、市販されているフルオレセイン・ホスホルアミダイトなどである。米国特許第６，２８７，７７８号参照。
【００５２】
「リガンド」：リガンドは、特定のレセプターに認識される分子である。レセプターに結合される、またはレセプターと反応する因子を「リガンド」と呼ぶが、この用語は、その結合相手となるレセプターとの関係でのみ定義としての意味をもつ。「リガンド」という用語は、問題となっている物質が、レセプターに結合するか、さもなければレセプターと反応することができるということ以外に、何ら特定の分子量、その他構造上または組成上の特徴を意味するものではない。また、リガンドは、レセプターが結合する天然のリガンドとして、または、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することのできる機能的アナログとして働くことができる。本発明によって調べることができるリガンドの例には、細胞膜レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、麻酔剤、ステロイド剤など）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、基質アナログ、遷移状態アナログ、補因子、薬剤、タンパク質、および抗体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
「連鎖不平衡または対立遺伝子関連」とは、ある対立遺伝子または遺伝子マーカーが、集団中の任意の対立遺伝子と偶然に関連すると期待される頻度よりも高い頻度で、近傍に位置する特定の対立遺伝子または遺伝子マーカーと選択的に関連することを意味する。例えば、遺伝子座Ｘに対立遺伝子ａおよびｂがあって、これらが同じ頻度で存在しており、これに連鎖する遺伝子座Ｙには対立遺伝子ｃおよびｄがあって、これらも同じ頻度で存在する場合、ａｃという組み合わせが０．２５という頻度で生じると予想することができる。これよりも高い頻度でａｃが生じれば、対立遺伝子ａとｃは連鎖不平衡にある。連鎖不平衡は、ある対立遺伝子の組み合わせが自然選択されることにより、または、対立遺伝子が、つい最近になって導入されたため、連鎖する対立遺伝子との平衡に達していないことが原因で生じている可能性がある。
【００５４】
「マイクロタイタープレート」は、多数のサンプルの物理的、化学的または生物学的な特徴を並行して試験するために使用される標準的な構成（９６、３８４、および１５３６ウェル）になっている分離されたウェルの配列である。
【００５５】
「混合集団」または「複合集団」とは、所望の核酸と所望でない核酸とを含むサンプルを意味する。非限定的な例として、核酸の複合集団は、全ゲノムＤＮＡ、全ゲノムＲＮＡ、またはそれらを組み合わせたものである。さらに、核酸の複合集団は、所定の集団について濃縮されているものでもよいが、その他の所望でない集団を含んでいてもよい。例えば、核酸の複合集団は、所望のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列が濃縮されているものでもよいが、所望でないリボゾームＲＮＡの配列（ｒＲＮＡ）をいくらか含んでいてもよい。
【００５６】
「モノマー」とは、一緒に結合してオリゴマーまたはポリマーを形成することができる分子セットの構成分子を意味する。本発明において有用なモノマーのセットには、例えば、（ポリ）ペプチドを合成するためのＬ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、または合成アミノ酸のセットなどがあるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、「モノマー」は、オリゴマーを合成するための基本セットの構成分子を意味する。例えば、Ｌ型アミノ酸のダイマーは、ポリペプチドを合成するための４００種類の「モノマー」の基本セットを構成する。ポリマーの合成の連続的な工程において、さまざまなモノマーの基本セットを用いることが可能である。また、「モノマー」という用語は、さまざまな化学物質サブユニットと組み合わせて、どちらの単独サブユニットよりも大きな化合物を形成することができる化学物質サブユニットも意味する。
【００５７】
「ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写産物」とは、本明細書において、前駆ｍＲＮＡ転写産物、転写産物のプロセッシングにおける中間体、翻訳することができる成熟したｍＲＮＡ、および遺伝子の転写産物、またはｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸を含むが、これらに限定されるものではない。転写産物のプロセッシングには、スプライシング、エディティング、および分解などがありうる。本明細書において、ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸とは、その合成に、ｍＲＮＡまたはその部分配列が最終的にテンプレートとして働く核酸を意味する。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどはすべて、ｍＲＮＡ転写産物に由来するものであり、このような派生産物を検出することで、サンプル中に存在する本来の転写産物の有無が示されるのである。このように、ｍＲＮＡに由来するサンプルには、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「核酸のライブラリーまたはアレイ」は、意図的に生成された核酸の集合体であって、化学合成によるか生合成によって調製することができ、さまざまな異なったフォーマット（可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、またはその他の固形支持体に固定されたオリゴのライブラリー）における生物活性をスクリーニングすることができる集合体である。さらに、「アレイ」という用語は、本質的には任意の長さの核酸（例えば、長さ約１から約１０００ヌクレオチドのモノマー）を基質上にスポットすることによって生成することができる、このような核酸ライブラリーも含む意味であるが、これらに限定されるものではない。本明細書において「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形状のものであって、プリン基およびピリミジン基、またはその他の天然に、化学的に、または生化学的に修飾されているヌクレオチドの塩基、または、誘導体化されているヌクレオチドの塩基のいずれかを含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドの骨格は、一般的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ、または置換された糖またはリン酸基に見られるように、糖およびリン酸基から構成されることがある。ポリヌクレオチドには、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドのアナログなど、修飾されたヌクレオチドが含まれうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的には、本明細書に記載されているようなアナログも含む。これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに共通するいくつかの構造的特徴を有するため、核酸配列またはオリゴヌクレオチド配列に取り込まれると、溶液中に存在する天然の核酸配列とハイブリダイズすることが可能になるという分子である。一般的には、これらのアナログは、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドを、塩基、リボース、またはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することによって得られる。これらの変化は、ハイブリッド形成を安定させたり不安定にさせたり、または、相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を亢進させたりと、必要に応じてあつらえることができる。
【００５９】
本発明に係る「核酸」は、ピリミジン塩基およびプリン塩基、好ましくは、それぞれ、システイン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンのポリマーまたはオリゴマーを含む。Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ ７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）参照。実際、本発明は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、および、それらの化学的変異体、すなわち、これらの塩基をメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグリコシル化した形態などを想定している。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において異種でも同種でもよく、天然の由来源から単離されたものでも、人工的または合成によって生成されたものでもよい。また、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物でもよく、また、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、およびハイブリッドの状態など、永久的にまたは一時的に一本鎖または二本鎖の形で存在しているものでもよい。
【００６０】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは８ヌクレオチド以上、また、より好ましくは２０ヌクレオチド以上の長さの核酸、または、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物である。本発明に係るポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であって、天然由来源から単離されうるもの、組換えによって作出されるか、人工的に合成されうるもの、およびそれらの模倣化合物を含む。本発明に係るポリヌクレオチドのさらなる例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。また、本発明は、一定のｔＲＮＡ分子で同定されていて、３重らせんで存在すると考えられているフーグステン型塩基対合のような従来とは異なる塩基対合があるという状況も含む。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本出願において互換的に使用される。
【００６１】
「プローブ」：プローブは、特定の標的によって認識されうる表面固定された分子である。本発明によって調べることができるプローブの例には、胞膜レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイド・ペプチド、ステロイド剤など）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
「プライマー」は、４種類のヌクレオシド三リン酸、および、例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合させるための薬剤が存在する中、例えば緩衝液や温度などが適切な条件下において、テンプレート特異的ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーの長さは、いずれの場合であっても、例えば、プライマーの使用目的に応じて決まるが、通常は、１５から２０、２５、３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子では、通常、テンプレートと十分に安定したハイブリッド複合体を形成するのに、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの配列を正確に反映する必要はないが、そのテンプレートにハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。プライマー部位とは、プライマーがハイブリダイズするテンプレートの領域である。プライマー対とは、増幅する配列の５’末端にハイブリダイズする５’側上流プライマーと、増幅する配列の３’末端の相補鎖にハイブリダイズする３’側下流プライマーとを含む、１組のプライマーである。
【００６３】
「多型」とは、ある集団において、遺伝的に決定されている選択的配列または対立遺伝子が２種類以上存在することを意味する。多型のマーカーまたは部位とは、分岐が生じている遺伝子座である。好適なマーカーは、２個以上の対立遺伝子であって、その各々が、選択された集団の１％以上の頻度、また、より好ましくは、１０％または２０％より高い頻度で存在する対立遺伝子を有する。多型性は、１個以上の塩基の変化、挿入、反復、または欠失を含みうる。多型的遺伝子座は、１塩基対だけという短さでもよい。多型性マーカーには、制限酵素断片長多型、可変数縦列反復配列（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、単純な配列反復、および、Ａｌｕなどの挿入因子などがある。最初に同定された対立遺伝子の型を勝手に参照型と名付け、その他の対立遺伝子型を選択的対立遺伝子または変異型対立遺伝子と名付ける。選択された集団において最も頻度が高い対立遺伝子型が野生型と呼ばれることもある。２倍体の生物は、対立遺伝子型についてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかであろう。２対立遺伝子多型には２種類の型がある。３対立遺伝子多型には３種類の型がある。１塩基多型（ＳＮＰ）は多型性に含まれる。
【００６４】
読み取り装置またはプレート読み取り装置は、アレイ上の核酸プローブと蛍光標識された標的とのハイブリダイゼーションのように、アレイ上でハイブリダイゼーションが起きたことを確認するために使用される装置である。読み取り装置は、当技術分野において公知であり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ、およびその他の会社を通して市販されている。通常、それらは、プローブにハイブリダイズした蛍光標識された標的核酸を照射するために励起エネルギー（レーザーなど）を利用することを含む。そして、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光ダイオード、または、集めた光を記録するための同様の装置（励起エネルギーとは異なった波長で）を用いて、再放出された光を検出する。米国特許第６，２２５，６２５号参照。
【００６５】
「レセプター」：所定のリガンドに対して親和性を有する分子。レセプターは、天然または人工の分子である。また、それらを元の状態のままで使用したり、他の分子種との集合体として使用することもできる。レセプターは、共有的または非共有的に、直接または特異的な結合物質を介して結合部に結合することができる。本発明によって利用されうるレセプターの例は、抗体、細胞膜レセプター、特異的な抗原決定基（ウイルス、細胞、または、他の物質など）と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラなどであるが、これらに限定されるものではない。当技術分野において、レセプターは、抗リガンドと呼ばれることもある。レセプターという用語が本明細書において複数形で使用されるとき、意味に違いを生じさせるものではない。「リガンド・レセプター対」は、２種類の高分子が分子認識によって結合して複合体を形成するときに形成される。本発明によって調べることができるレセプターのその他の例は、米国特許第５，１４３，８５４号に示されている分子などであるが、それらに限定されるものではない。本文献は、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６６】
「固形支持体」、「支持体」および「基質」は互換的に使用され、剛体または半剛体の表面をもつ物質または物質のグループを意味する。多くの実施形態において、固形支持体の少なくとも一方の表面は実質的に平面であるが、実施形態によっては、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、刻み込まれた溝などによって、異なった化合物を合成するための領域を物理的に隔てることが望ましいこともある。別の実施形態では、固形支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、またはその他の幾何学図形という形をとる。基質の例として、米国特許第５，７４４，３０５号参照。
【００６７】
標的：所定にプローブに親和性を有する分子。標的は、天然または人工の分子である。また、それらを元の状態のままで使用したり、他の分子種との集合体として使用することもできる。標的は、共有的または非共有的に、直接または特異的な結合物質を介して結合部に結合することができる。本発明によって利用されうる標的の例は、抗体、細胞膜レセプター、特異的な抗原決定基（ウイルス、細胞、または、他の物質など）と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラなどであるが、これらに限定されるものではない。当技術分野において、レセプターは、抗プローブと呼ばれることもある。標的という用語が本明細書において複数形で使用されるとき、意味に違いを生じさせるものではない。「プローブ・標的対」は、２種類の高分子が分子認識によって結合して複合体を形成するときに形成される。
【００６８】
ＷＧＳＡ（全ゲノムサンプリングアッセイ法）遺伝子型決定技術：遺伝子座特異的プライマーを使用せずに、複合ＤＮＡにおいて何千ものＳＮＰを同時に遺伝子型決定できる技術。この技術では、例えば、目的とする制限酵素でゲノムＤＮＡを切断して、切断された断片にアダプターを連結させる。アダプター配列に対応する１種類のプライマーを用いて、所望の長さ、例えば５００〜２０００ｂｐの断片を増幅する。そして、処理された標的を、ＳＮＰ含有断片／プローブを含む核酸アレイにハイブリダイズさせる。ＷＧＳＡは、例えば、米国仮出願番号第６０／３１９，６８５号、第６０／４５３，９３０号、第６０／４５４，０９０号および第６０／４５６，２０６号、第６０／４７０，４７５号、米国特許出願第０９／７６６，２１２号、第１０／３１６，５１７号、第１０／３１６，６２９号、第１０／４６３，９９１号、第１０／３２１，７４１号、第１０／４４２，０２１号、および第１０／２６４，９４５号に開示されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のために、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６９】
ここで、本発明の例示的実施形態を詳細に説明する。例示的な実施形態とともに本発明を説明するが、当然ながら、それらは、本発明をこれらの実施形態に制限することを意図したものではない。逆に、本発明は、代替、変更および同等のものをカバーするものであり、それらは、本発明の精神と範囲に含まれうる。
【００７０】
（３．全転写産物アッセイ法のためのサンプル調製法）
本発明の一態様において、転写産物のエキソンの少なくとも７０％、８０％、９０％、または全転写産物に相当する核酸サンプルの調製に適した方法を提供する。好適な実施形態では、エキソン、選択的にはエキソン間の結合部を標的するプローブを含むことができる高密度オリゴヌクレオチドアレイなどの核酸プローブアレイとハイブリダイズさせるために、これらの方法を用いて、転写産物中の少なくとも７０％、８０％、９０％またはすべてのエキソンから核酸サンプルを調製する。本発明に係る方法も、米国特許出願第１０／８１５，３３３号に記載されているようなタイリングアレイで使用するのに適している。この文献は本明細書に組み込まれる。好適な実施形態において、アレイは、少なくとも５００、１０００、１０，０００の転写産物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはすべてのエキソンを標的するプローブを有することが可能である。
【００７１】
好適な実施形態において、ＲＮＡ転写産物サンプル（図１に例示）は、ｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用のテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡを合成する方法は、当技術分野で周知されている。しかし、この好適な実施形態において、ランダムな領域および固定した配列内容領域をもつオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが可能である。プライマーの一例は、ランダム・ヘキサマーと、後のインビトロ転写反応において有益なＴ７プロモーターである：
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【００７２】
ランダム領域は、転写産物を用いてプライマーによる無作為なプライミングを行うために有用であり、得られたｃＤＮＡが、転写産物のさまざまな領域をより代表できるようになる。好適な実施形態において、プライマーのランダム領域は、長さ５、６、７、８、９塩基である。固定した配列内容領域は、その後の反応における所望の機能を提供するために一般的に用いられる。例えば、Ｔ７プロモーターは、インビトロでの転写反応に有益である。当業者の技術において、Ｔ３やＳＰ６などのＴ７以外のプロモーターもまた、インビトロでの転写に一般に利用されており、固定した内容領域への利用に好ましい。さまざまなインビトロ転写用プロモーターに対するポリメラーゼが、例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）から市販されている。
【００７３】
図１に示すように、得られたｃＤＮＡ（一般的には二本鎖）をインビトロ転写反応用のテンプレートとして用いてｃＲＮＡを合成することができる。ｃＲＮＡ標的は、ハイブリダイゼーションおよび検出のために標識／断片化することができる（図２参照）。しかし、特に好適な実施形態において、ｃＲＮＡが、例えばランダムプライマーを用いた別のｃＤＮＡ合成反応のテンプレートとして使用される。その結果得られたｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションおよび検出のために標識し断片化することができる。この方法は、一般的には、検出感度を増加させる。
【００７４】
図２は、２つの方法を比較したものである。当業者は、本発明が、特定の標識法または断片化法に限定されるものでないことを理解されよう。多くの適当な標識法および断片化法を利用することができる。ハイブリダイゼーションを促進するという用途に適した別のＤＮＡ断片化法が、例えば、米国特許仮出願第６０／５８９，６４８号、第６０／５４５，４１７号、第６０／５１２，５６９号，第６０／５０６，６９７号に記載されており、これらすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７５】
以下は、好適な実施形態を具体的に説明する非限定的な例としての詳細なプロトコールである。このプロトコール例は、エキソン、選択的スプライシングなど、転写の特徴を検出するために、いくつかの大規模実験で用いられ、非常に良好な結果をもたらした（データは図示せず）。表１に試薬および材料の例を列挙した。
【００７６】
（表１．試薬および材料）
【００７７】
【表１−１】
【００７８】
【表１−２】
。
【００７９】
（ｃＲＮＡ増幅）
（工程１．第１鎖ｃＤＮＡ合成）
１．全ＲＮＡサンプルとＲＰ−Ｔ７プライマーを、０．２μＬのＰＣＲチューブの中で十分に混合する：
全ＲＮＡ（１０ｎｇ−１００ｎｇ） １μＬ
ＲＰ−Ｔ７プライマー、２ｐｍｏｌ／ｎｇ １μＬ
Ｈ２Ｏ ３μＬ
総容量 ５μＬ
２．サーマルサイクラーの中、６５℃で５分間インキュベートしてから、４℃で２分間保温した後スピンダウンしてサンプルを回収する。
３．以下のようにＲＴ＿プレミックス＿１を調製する：
ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ ０．５μＬ
５×第１鎖緩衝液 ２μＬ
ＤＴＴ、０．１Ｍ １μＬ
ｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭ ０．５μＬ
Ｓｕｐｅｒａｓｅ Ｉｎ、２０Ｕ／μＬ ０．５μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、２００Ｕ／μＬ ０．５μＬ
総容量 ５μＬ
４．５μＬのＲＴ＿プレミックス＿１を、変性したＲＮＡとプライマー混合物に加えて、最終容量を１０μＬとする。
５．十分に混合し、スピンダウンし、２５℃で１０分間、３７℃で１時間インキュベートしてから、１０分以内４℃に保つ。
【００８０】
（工程２．第２鎖ｃＤＮＡ合成）
１．以下のようにＳＳ＿プレミックス＿１を調製する：
ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ ４．５７５μＬ
ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ２．８μＬ
Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（エキソ−）、５Ｕ／μＬ ２．５μＬ
ＲＮａｓｅ Ｈ、２Ｕ／μＬ ０．１２５μＬ
総容量 １０μＬ
２．１０μＬのＳＳ＿プレミックス＿１を各第１鎖反応液に加えて、最終容量を２０μＬとする。
３．十分に混合し、スピンダウンしてから、３７℃で５０分間インキュベートする。
４．Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（エキソ−）を７０℃で１０分間不活性化し、１０分以内４℃に保って、次の工程に進む。
【００８１】
（工程３．Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７キットを用いたｃＲＮＡ増幅のためのＩＶＴ）
１．第２鎖合成反応液に、室温で以下の試薬を以下の順序に従って加える：
ＡＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＣＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＧＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
ＵＴＰ、７５ｍＭ ５μＬ
１０×反応緩衝液 ５μＬ
１０×酵素混合液 ５μＬ
総容量 ５０μＬ
２．各試薬を加えた後十分に混合して、短時間スピンする。３７℃で１６時間インキュベートする。
【００８２】
（工程４．ＲＮｅａｓｙカラムによるｃＲＮＡのクリーンアップ）
１．５０μＬのＲＮａｓｅを含まない水を上記ｃＲＮＡ産物に加える。
２．ｃＲＮＡ精製用のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットに添付されているＱｉａｇｅｎ社のＲＮＡクリーンアップのためのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉプロトコールに従う。
３．ｃＲＮＡ精製の最終工程で、５０μのＲＮａｓｅを含まない水で生成物を溶出する。
４．２μＬのｃＲＮＡを取り出して７８μＬの水に加えて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｃＲＮＡの収量を判定する。
５．次の工程に進む前に高速真空装置を用いて、容量を７μＬに減少させる。
【００８３】
（ｃＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換および標識）
（工程５．ｃＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡへの変換）
１．０．２μＬのＰＣＲチューブの中でｃＲＮＡとランダムプライマーを十分に混和する：
ｃＲＮＡ、可変 ７μＬ
ランダムプライマー、３μｇ／μＬ １μＬ
総容量 ８μＬ
２．短時間スピンして、７０℃で５分間、２５℃で５分間インキュベートする。
３．以下のようにＲＴ＿プレミックス＿２を調製する：
５×第１鎖緩衝液 ４μＬ
ＤＴＴ、０．１Ｍ ２μＬ
ｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭ １μＬ
Ｓｕｐｅｒａｓｅ Ｉｎ、２０Ｕ／μＬ １μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、２００Ｕ／μＬ ４μＬ
総容量 １２μＬ
４．１２μＬのＲＴ＿プレミックス＿２を、変性したＲＮＡとプライマー混合物に加えて、最終容量を２０μＬとする。
５．十分に混合し、短時間スピンする。２５℃で１０分間、次に３７℃で１時間インキュベートしてから、１０分以内４℃に保つ。
【００８４】
（工程６．第２鎖ｃＤＮＡ合成）
１．以下のようにＳＳ＿プレミックス＿２を調製する：
ＤＥＰＣ処理した水 ９．９μＬ
ＭＧＣｌ２、２５ｍＭ ５．６μＬ
ラージフラグメント、８．４Ｕ／μＬＴ ４μＬ
ＲＮａｓｅ Ｈ、２Ｕ／μＬ ０．５μＬ
総容量 ２０μＬ
２．２０μＬのＳＳ＿プレミックス＿２を、各第１鎖反応液に加えて、最終容量を４０μＬとする。
５．十分に混合し、スピンダウンしてから、３７℃で４０分間インキュベートし、１０分以内４℃に保って、次の工程に進むか、−２０℃で凍結させる。
【００８５】
（工程７．二本鎖ｃＤＮＡのクリーンアップ）
１．ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットのプロトコールにしたがって二本鎖ｃＤＮＡをクリーンアップする。
２．二本鎖ｃＤＮＡ精製の最終工程で、３７μＬのＥＢ緩衝液で生成物を溶出する。
３．２μＬのｃＤＮＡ溶出液を取り出して７８μＬの水に加えて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｃＤＮＡの収量を判定する。
【００８６】
（工程８．二本鎖ｃＤＮＡの断片化）
１．１Ｕ／μＬのＤＮＡｓｅ Ｉを、１×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液プラスを用いて０．２Ｕ／μＬに希釈する。
２．以下の混合液を調製する：
１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液プラス ３．６μＬ
ｄｓ ｃＤＮＡ ３０μＬ
ＤＮＡｓｅ Ｉ（０．２Ｕ／μＬ） ３μＬ
総容量 ３６．６μＬ
３．短時間スピンし、３７℃で１０分間インキュベートして、９５℃で１０分間ＤＮａｓｅ Ｉを不活性化してから、４℃に保つ。
４．断片化されたｃＤＮＡを１μＬ取り出し、キットの取扱指示書にしたがって、ＲＮＡナノキットを用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー上でサイズをチェックする。所望の断片サイズは、５０から２００ｂｐの範囲になるはずである。必要ならば、さらなるＤＮａｓｅ Ｉを加えて、所望のサイズを得ることができる。
【００８７】
（工程９．断片されたｃＤＮＡの標識：）
１．標識混合液を以下のよう調製する：
５×ＴｄＴ反応緩衝液 １４μＬ
ＣｏＣｌ２、２５ｍＭ １４μＬ
ＤＬＲ−１ａ、５ｍＭ １μＬ
末端転移酵素、ｒｅｃ（４００Ｕ／μＬ） ４．４μＬ
総容量 ３３．４μＬ
２．３３．４μＬの標識混合液を、３５．６μＬの断片化ｃＤＮＡに加えて、最終容量を６９μＬとする。
３．混合して短時間スピンする。３７℃で６０分間インキュベートしてから、４℃に保つ。
【００８８】
（工程１０．ハイブリダイゼーション）
１．ハイブリダイゼーション混合液を以下のよう調製する：
２×ＭＥＳハイブリダイゼーション用緩衝液 １００μＬ
コントロールオリゴＢ２、３ｍＭ ３μＬ
２０×ＲＮＡコントロール １０μＬ
ＢＳＡ、アセチル化されたもの、５０ｍｇ／μＬ ２μＬ
ニシン精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／μＬ ２μＬ
ＤＭＳＯ，１００％ １４μＬ
総容量 １３１μＬ
２．１３１μＬのハイブリダイゼーション混合液を、６９μＬの標識反応液に加えて、最終容量を２００μＬとし、十分に混合した後、９９℃で１０分間変性してから、サーマルサイクラー中、５０℃で５分間放置する。
３．２００μＬの標識されたｃＤＮＡを、予め湿らせておいたＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)プローブアレイ（ｃＤＮＡ試験用アレイ）と５０℃で１６時間インキュベートする。
４．ＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析記述マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、ＵＳＡ）に記載されている洗浄およびスキャン手順に従う。この文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８９】
図２は、転写産物全体を解析するためのもう一つのプロトコールを示す。このＷＴＡプロトコールは、ランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成に基づいている。詳細なプロトコールが、本明細書において、非限定的な実施例として提供されている。
【００９０】
（ｃＤＮＡ標的の調製）
（試薬および材料）
・ランダムプライマー、３μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ ４８１９０−０１１
・ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ １８０６４−０７１
・ＳＵＰＥＲａｓｅ・ＩｎＴＭ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｐ／Ｎ ２６９６
・ＮａＯＨ、１Ｎ溶液、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐ／Ｎ ＭＫ４６９３６０
・ＨＣｌ、１Ｎ溶液、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐ／Ｎ ＭＫ６３８８６０
・ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、ＱＩＡＧＥＮ、Ｐ／Ｎ ２８１０４
・１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ／Ｎ ２７−０９０１−０２
・デオキシリボヌクレアーゼ Ｉ（ＤＮａｓｅ Ｉ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ／Ｎ ２７−０５１４−０１
・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ １５５７５−０２０
・末端転移酵素（緩衝液およびＣｏＣｌ２を含む）、４００ Ｕ／μＬ、組換え体、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐ／Ｎ ３ ３３３ ５７４
・ＤＬＲ−１ａ、５ｍＭ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ ９００４３０
（ｃＤＮＡ合成）
以下のプロトコールの出発物質は、５μｇの全ＲＮＡである。インキュベーションは、サーマルサイクラー中で行われる。
【００９１】
（工程１：ｃＤＮＡ合成）
１．プライマーをアニーリングするために以下の混合液を調製する。
ランダムプライマーを３μｇ／μＬから７５０ｎｇ／μＬに希釈する（１：４希釈）。
【００９２】
（ＲＮＡ／プライマーアニーリング用混合液）
【００９３】
【表２】
２．ＲＮＡ／プライマー混合液を以下の温度でインキュベートする。
・７０℃で１０分間
・２５℃で１０分間
・４℃に冷却する。
３．ｃＤＮＡ合成のために反応混合液を調製する。反応液を短時間遠心分離して、サンプルを底に集めて、ＲＮＡ／プライマーアニーリング用混合液に、以下の表からｃＤＮＡ合成用混合液を加える。
【００９４】
（ｃＤＮＡ合成成分）
【００９５】
【表３】
４．反応液を以下の温度でインキュベートする。
・２５℃で１０分間
・３７℃で６０分間
・４２℃で６０分間
・７０℃で１０分間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩを不活性化する。
・４℃に冷却する。
【００９６】
（工程２：ＲＮＡの除去）
１．２０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えて、６５℃で３０分間インキュベートする。
２．２０μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えて中和する。
【００９７】
（工程３：ｃＤＮＡ合成生成物の精製および定量）
１．ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを用いて、ｃＤＮＡ合成生成物をクリーンアップする（詳細なプロトコールについては、供給業者から提供されるＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 精製キットプロトコールを参照）。生成物を、４０μＬのＥＢ緩衝液（ＱＩＡｑｕｉｃｋキットとともに供給される）によって溶出する。
２．上記溶出液から２μＬを取り出して、精製されたｃＤＮＡ生成物を２６０ｎｍにおける吸光度によって定量する（１．０Ａ２６０ユニット＝３３μｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ）
（ｃＤＮＡの断片化）
１．以下の反応混合液を調製する。
【００９８】
（断片化反応混合液）
【００９９】
【表４】
２．この反応液を３７℃で１０分間インキュベートする。
３．ＤＮａｓｅ Ｉを９８℃で１０分間不活性化させる。
４．断片化されたｃＤＮＡを直接末端標識反応に適用する。あるいは、後で使用するため、材料を−２０℃で保存することもできる。
【０１００】
（末端標識）
ＤＬＲ−１ａ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）との組換え体であるＲｏｃｈｅ末端転移酵素を用いて、断片生成物の３’末端を標識する。
１．以下の反応混合液を調製する。
【０１０１】
（末端標識反応液）
【０１０２】
【表５】
２．この反応液を３７℃で６０分間インキュベートする。
３．２μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させる。
４．標的を、プローブアレイ上でハイブリダイズさせることができる。あるいは、後で使用するため、材料を−２０℃で保存することもできる。
【０１０３】
（標的のハイブリダイゼーション）
（試薬および材料）
・２×ＭＥＳハイブリダイゼーション用緩衝液（調製のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアル参照）
・アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、５０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ １５５６１−０２０
・ニシン精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐ／Ｎ Ｄ１８１１
・ＧｅｎｅＣｈｉｐ真核生物用ハイブリダイゼーションコントロールキット、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ９００２９９
・コントロールオリゴＢ２、３ｎＭ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｐ／Ｎ９００３０１（別々に順序正しく並べることができる。）
・１００％ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ／Ｎ Ｄ−４８１８
（標的のハイブリダイゼーション）
１．以下のものを標的毎に混合し、多数のプローブアレイに対してハイブリダイゼーションを行うためには、ハイブリダイゼーションの容量をスケールアップする。
【０１０４】
（１つのミディプローブアレイに対するハイブリダイゼーション用混合液）
【０１０５】
【表６】
２．使用直前に、プローブアレイを室温に平衡させる。
３．ハイブリダイゼーション用混合液を９９℃で５分間加熱してから、５０℃に保つ。
４．一方で、アレイを１×ハイブリダイゼーション用緩衝液で満たして湿らせる。プローブを５０℃で１０分間、回転させながらインキュベートする。
５．ハイブリダイゼーション用混合液を最高速度でスピンさせて、あらゆる不溶性物質を取り除く。
６．プローブアレイから緩衝液溶液を取り除き、ハイブリダイゼーションカクテルで充填する
７．５０℃オーブン内のローティッセリーボックスにプローブアレイを置いて、６０ｒｐｍで回転させて１６時間ハイブリダイズさせる。
【０１０６】
（プローブアレイの洗浄および染色）
（試薬および材料）
・２×ＭＥＳステイン緩衝液（調製のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアル参照）
・アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、５０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ １５５６１−０２０
・Ｒ−フィコエリトリン・ストレプトアビジン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｐ／Ｎ Ｓ−８８６
・ヤギＩｇＧ、試薬等級、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ Ｉ ５２５６
・抗ストレプトアビジン抗体（ヤギ）、ビオチン化抗体、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐ／Ｎ ＢＡ−０５００
（染色試薬の調製）
（第１回目および第３回目の染色のためのＳＡＰＥ溶液混合物）
【０１０７】
【表７】
（第２回目の染色のための抗体溶液混合物）
【０１０８】
【表８】
（プローブアレイを洗浄および染色する）
真核生物標的に対する洗浄および染色の工程に関するＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)発現解析技術マニュアルに記載されている指示にしたがう。
【０１０９】
図４は、ランダム・ヘキサマーｃＤＮＡプロトコール（ＷＴＡ）とｓＷＴＡ（ランダム／Ｔ７プライマー、ｃＤＮＡサンプル）の間のプローブ強度の比較結果を示している。ｓＷＴＡプロトコールは、ＷＴＡプロトコールと良好な相関関係を示す（Ｒ＝０．９６１±０．００４）。２つのプロトコールを用いて転写の検出を行う実験において、検出コールが一致するのはおよそ９０％であった。
【０１１０】
図５は、転写産物を全長にわたって検索するように設計されたプローブによって、例示的な転写産物を検出するためのＷＴＡプロトコールとｓＷＴＡプロトコールの比較結果を示している。これら２つのプロトコールが、転写産物の全長に相当する核酸サンプルを産生できることが分かる。
【０１１１】
本発明の一態様において、ＲＮＡ転写産物に相当する核酸サンプルを調製する方法が提供される。これらの方法は、エキソンや選択的スプライシングなど、転写産物の特徴を検出するために使用されるサンプルを調製するのに特に適している。これらの方法は、転写産物の特徴を定量的、半定量的、または定性的に検出するのに適している。これらの方法を用いて、選択的にスプライシングされた転写産物など、すべてのタイプの転写産物を含む、多数の転写産物を観察することができる。これらの方法は、例えば、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった標的転写産物、または転写産物の特徴を、マイクロアレイによって平行して解析する方法に特に適している。本明細書において、「標的転写産物」または「標的核酸」という用語は、対象とする転写産物または核酸を意味するために使用される。
【０１１２】
好適な実施形態において、核酸サンプルを調製する方法は、プライマー混合物を、複数のＲＮＡ転写産物、または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸にハイブリダイズさせ、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第一鎖ｃＤＮＡ、および該第一鎖ｃＤＮＡに相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダム配列プライマー領域を有するオリゴヌクレオチドを含む工程、および、プロモーター領域からＲＮＡ転写を開始させて核酸サンプルを生成する工程を含む。プライマー領域は、ランダムな六量体（ヘキサマー）であってもよい。プロモーターは、一般的には、バクテリオファージのプロモーター、好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のプロモーターのような原核生物プロモーターである。
【０１１３】
本方法を用いて、真核生物のｍＲＮＡ、またはそれ以外のＲＮＡを解析することができる。全ＲＮＡサンプル、またはポリ（Ａ）＋で濃縮されたサンプルはすべて、本方法を用いるのに適している。
【０１１４】
特に好適な方法において、得られたｃＲＮＡをテンプレートとして用いて、第二鎖ｃＤＮＡを合成することができる。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダム・ヘキサマーなどのランダムプライマーを使用して実施することが可能である。
【０１１５】
本発明に係る方法は応用範囲が広く、特定の検出方法に限定されないが、特に、例えば１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、５０，０００種類よりも多い、多数の異なった転写産物の特徴を検出するのに適している。例えば、第二鎖ｃＤＮＡは断片であって／標識した後、検出のためハイブリダイズさせることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、転写産物における特異的エキソンおよび／またはスプライス部位のような、転写産物の特異的な特徴を検出するのに特に適している。一般的には、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００または５００，０００種類のオリゴヌクレオチドプローブをまとめて検出のため使用することも可能である。核酸プローブは、ビーズのコレクション上、または単一の基質上に固定することが可能である。
【０１１６】
別の態様において、核酸サンプルを調製するための試薬キットを提供する。試薬キットの具体例は、オリゴヌクレオチド混合物成分を含む容器、および、オリゴヌクレオチド混合物成分中のオリゴヌクレオチドがランダムプライマー領域およびプロモーター領域を含むものである、該オリゴヌクレオチド混合物の使用指示書を含む。オリゴヌクレオチド混合物の具体例の一つは以下の配列を有する。
（配列番号：０１）５’ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮ３’
（ＮＮＮＮＮＮが、ランダム・ヘキサマー領域に相当する）。
【０１１７】
本試薬キットは、さらに、逆転写酵素を含む容器、およびＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含む。キットには、ランダムプライマー領域およびプロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド混合物以外にも、ランダムプライマー混合液（例えばランダムなヘキサマー混合液）を含ませることも可能である。付加的な成分には、標識用および断片化用の試薬やヌクレオチドなどがある。
【０１１８】
好適な実施形態において、本キットは、標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するよう設計された、１０００種類、５０００種類、１０，０００種類、または５０，０００種類のさまざまな核酸プローブのコレクションを含む。これらの核酸プローブは、基質上に固定することも可能であり、一般的には、５０００以上のさまざまなエキソンおよび／または５００以上のスプライス部位に対して設計されている。
【０１１９】
本発明に係る方法およびキットは、生物学的研究、診断学、毒物学、創薬などの領域において広範な応用範囲を有する。例示的な実施形態において、薬剤候補物質で処理したサンプルにおける各エキソンおよびスプライス部位構造の転写を観察する。選択的スプライシングなど、薬剤処理に対する転写特性の反応を解析して、薬剤候補物質を評価することができる。本発明に係る方法およびキットは、得られる核酸が、転写産物の３’末端領域または５’末端領域に限定されず、全転写産物に相当するものが多いため、このような用途に特に適している。
【０１２０】
別の用途例において、本方法およびキットを用いて組織サンプルを処理し、核酸サンプルを得ることができる。このサンプルを、選択的にスプライシングされた転写産物について解析する。選択的スプライシングは、しばしば一定の病気の発病に関係していることが知られている。組織サンプルにおける選択的スプライシングの発生を解析することによって、診断に関する情報を得ることができる。
【０１２１】
当然ながら、上記の説明は、例示のためのものであって、限定のためのものではない。上記説明を検討すれば、当業者にとって、本発明を変化させたものが数多く明らかになろう。特許文献および非特許文献を含む、引用された文献のすべてが、あらゆる目的のために、それら全部が参照されて本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を例示するものであり、明細書とともに、本発明の原理を説明する助けとなる。
【図１】図１は、ランダムなヘキサマー（ＲＨ）領域およびＴ７プロモーター領域を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用する好適な実施形態（小さなサンプルＷＴＡないしはｓＷＴＡ）を示す概略図である。本方法には、２段階のｃＤＮＡ合成工程がある。ｃＤＮＡは、５’もしくは３’末端を標識するか、または内部標識することも可能である。
【図２】図２は、ｃＲＮＡサンプルを調製するためのｃＤＮＡ合成を１段階で行うプロトコールと、ｃＤＮＡサンプルを調製するために２段階でｃＤＮＡ合成を行うプロトコールという２つのプロトコールを比較する概略図である。ｃＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために断片化／標識することが可能である。
【図３】図３は、ｃＤＮＡサンプル（ＷＴＡ）を調製するためのランダム・ヘキサマーによるｃＤＮＡプロトコールを示す概略図である。選択的には、第二鎖ｃＤＮＡを合成することも可能である。
【図４】図４は、ｓＷＴＡとＷＴＡの効率を比較する。
【図５】図５は、ＲＰ−Ｔ７−ＣＤＮＡ増幅（ｓＷＴＡ）プロトコールが、典型的な全長転写産物全体を検出するのに有用であることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルを調製する方法であって、
プライマー混合物を複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、ならびに、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写して核酸サンプルを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸サンプルを調製する方法であって、
プライマー混合物を複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成して第１のｃＤＮＡを生成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写してｃＲＮＡを生成する工程、
ランダムプライマーの混合物を該ｃＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、ならびに
該ランダムプライマーから第２のｃＤＮＡを合成する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ランダムプライマーが、ランダムなヘキサマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
複数の転写産物を解析する方法であって、
プライマー混合物を該複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成して第１のｃＤＮＡを生成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写してｃＲＮＡを生成する工程、
ランダムプライマーの混合物を該ｃＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
該ランダムプライマーから第２のｃＤＮＡを合成する工程、
該第２のｃＤＮＡを断片化して断片化されたｃＤＮＡを生成する工程、
断片化されたｃＤＮＡを複数の核酸プローブにハイブリダイズさせて、標的転写産物に相当する核酸を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項１８に記載の方法
【請求項２６】
前記ランダムプライマーが、前記ランダムなヘキサマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の核酸プローブが固定されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の核酸プローブが、少なくとも５０，０００プローブを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の核酸プローブが、ビーズの集合体上に固定されており、各ビーズが、特有のプローブまたはプローブ混合物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の核酸プローブが、基質上に固定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの前に前記第２のｃＤＮＡ断片を標識する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
断片化の前に前記第２のｃＤＮＡを標識する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的転写産物が、少なくとも５０００の異なるエキソンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
エキソン標的転写産物が、少なくとも５００の異なるスプライス部位を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
核酸サンプルを調製する試薬キットであって、オリゴヌクレオチド混合成分、および該オリゴヌクレオチド混合物を使用するための指示書を含む容器を備え、該オリゴヌクレオチド混合成分中のオリゴヌクレオチドが、ランダムプライマー領域とプロモーター領域とを含む、キット。
【請求項３７】
逆転写酵素を含む容器とＲＮＡポリメラーゼを含む容器とをさらに備える、請求項３６に記載の試薬キット。
【請求項３８】
ランダムプライマーの混合物をさらに含む、請求項３７に記載の試薬キット。
【請求項３９】
ランダムプライマーの混合物が、ランダムなヘキサマー混合物である、請求項３８に記載の試薬キット。
【請求項４０】
標識試薬をさらに含む、請求項３９に記載の試薬キット。
【請求項４１】
標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するために設計された核酸プローブの集合体をさらに含む、請求項４０に記載の試薬キット。
【請求項４２】
前記核酸プローブの集合体が、基質上に固定されている、請求項４２に記載の試薬キット。
【請求項４３】
前記核酸プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項４２に記載の試薬キット。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも５０００の異なるエキソンを標的する、請求項４３に記載の試薬キット。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも５００の異なるスプライス部位を標的する、請求項４３に記載の試薬キット。
【請求項１】
核酸サンプルを調製する方法であって、
プライマー混合物を複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、ならびに、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写して核酸サンプルを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸サンプルを調製する方法であって、
プライマー混合物を複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成して第１のｃＤＮＡを生成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写してｃＲＮＡを生成する工程、
ランダムプライマーの混合物を該ｃＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、ならびに
該ランダムプライマーから第２のｃＤＮＡを合成する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ランダムプライマーが、ランダムなヘキサマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
複数の転写産物を解析する方法であって、
プライマー混合物を該複数のＲＮＡ転写産物または該ＲＮＡ転写産物に由来する核酸とハイブリダイズさせて、該ＲＮＡ転写産物に相補的な第１鎖ｃＤＮＡ、および該第１鎖ｃＤＮＡに相補的な第２鎖ｃＤＮＡを合成して第１のｃＤＮＡを生成する工程であって、該プライマー混合物が、プロモーター領域およびランダムな配列プライマー領域をもつオリゴヌクレオチドを含む、工程、
該プロモーター領域から開始されるＲＮＡを転写してｃＲＮＡを生成する工程、
ランダムプライマーの混合物を該ｃＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
該ランダムプライマーから第２のｃＤＮＡを合成する工程、
該第２のｃＤＮＡを断片化して断片化されたｃＤＮＡを生成する工程、
断片化されたｃＤＮＡを複数の核酸プローブにハイブリダイズさせて、標的転写産物に相当する核酸を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ランダムな配列プライマー領域が、ランダムなヘキサマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーター領域が、原核生物のプロモーターを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーター領域が、バクテリオファージのプロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーター領域が、Ｔ３プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーター領域が、ＳＰ６プロモーターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ転写産物が、真核生物のｍＲＮＡである、請求項１８に記載の方法
【請求項２６】
前記ランダムプライマーが、前記ランダムなヘキサマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の核酸プローブが固定されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の核酸プローブが、少なくとも５０，０００プローブを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の核酸プローブが、ビーズの集合体上に固定されており、各ビーズが、特有のプローブまたはプローブ混合物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の核酸プローブが、基質上に固定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの前に前記第２のｃＤＮＡ断片を標識する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
断片化の前に前記第２のｃＤＮＡを標識する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的転写産物が、少なくとも５０００の異なるエキソンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
エキソン標的転写産物が、少なくとも５００の異なるスプライス部位を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
核酸サンプルを調製する試薬キットであって、オリゴヌクレオチド混合成分、および該オリゴヌクレオチド混合物を使用するための指示書を含む容器を備え、該オリゴヌクレオチド混合成分中のオリゴヌクレオチドが、ランダムプライマー領域とプロモーター領域とを含む、キット。
【請求項３７】
逆転写酵素を含む容器とＲＮＡポリメラーゼを含む容器とをさらに備える、請求項３６に記載の試薬キット。
【請求項３８】
ランダムプライマーの混合物をさらに含む、請求項３７に記載の試薬キット。
【請求項３９】
ランダムプライマーの混合物が、ランダムなヘキサマー混合物である、請求項３８に記載の試薬キット。
【請求項４０】
標識試薬をさらに含む、請求項３９に記載の試薬キット。
【請求項４１】
標的ＲＮＡ転写産物に相当する配列を検出するために設計された核酸プローブの集合体をさらに含む、請求項４０に記載の試薬キット。
【請求項４２】
前記核酸プローブの集合体が、基質上に固定されている、請求項４２に記載の試薬キット。
【請求項４３】
前記核酸プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項４２に記載の試薬キット。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも５０００の異なるエキソンを標的する、請求項４３に記載の試薬キット。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも５００の異なるスプライス部位を標的する、請求項４３に記載の試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５０２１１６（Ｐ２００７−５０２１１６Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３３９５（Ｐ２００６−５２３３９５）
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６２８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７２０６
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６２８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７２０６
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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