核酸分子の増大したダイナミックレンジ検出のための組成物および方法
本発明は、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、一つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチド(例えば、分析物特異的プローブオリゴヌクレオチド)の使用を通じて、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるための方法およびキットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a)増幅産物を生成するために2つの異なるレベルの増幅で標的核酸を増幅する段階；
b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブとハイブリダイズする段階であって、ここで、該第一プローブは、該第二プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階。
【請求項２】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
少なくとも2つのプローブが同一配列へ結合する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
以下の段階を含む、幅広いダイナミックレンジにわたって複数の試料中で標的核酸を検出するための方法であって：
標的核酸の10^3未満のコピーを有する第一試料および標的核酸の10^5より多いコピーを有する第二試料を、該第一試料および該第二試料中の該標的核酸が検出されるような条件下で試薬のセットへ曝露する段階を含み、
該第一試料および第二試料の各々を、第一プローブおよび第二プローブへ曝露する段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該標的核酸とハイブリダイズする段階を含む、方法。
【請求項５】
第一および第二試料中の標的核酸が定量化される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が検出前に2つまたはそれ以上の異なる増幅条件下で処理される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
標的核酸のどんな増幅もなしで実施される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、直線的増幅によって、指数関数的増幅によって、または直線的および指数関数的増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸が2つの異なるレベルの増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：a)増幅産物を生成させるために標的核酸を増幅する段階；b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブと接触させる段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階；c)該第一プローブおよび第二プローブを切断する段階；ならびにd)該第一プローブおよび第二プローブの切断を検出する段階。
【請求項１２】
以下を含むキット：ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および標的核酸の分析物特異的領域とハイブリダイズするよう形成されている2つのプローブであって、第二プローブは、第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該分析物特異的領域とハイブリダイズし、かつ、第一プローブおよび第二プローブは、該標的核酸の存在下で検出可能シグナルを直接的にまたは間接的にの両方で生成させるよう形成されている、プローブ。
【請求項１３】
第一および第二プローブが同じタイプの検出可能シグナルを生成する、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
第一および第二プローブが標識を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１５】
第一および第二プローブが各々、FRETカセットと相補的なフラップ配列を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１６】
第一プローブのフラップが第二プローブのフラップと同一である、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズするか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズする、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項１８】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または該第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、第二プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列上で該第一プローブハイブリダイゼーション部位を異なる頻度で占有するか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列上の該第二プローブハイブリダイゼーション部位を、異なる頻度で占有する、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項２３】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階をさらに含む、請求項22記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；ならびに該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２８】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；ならびに該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２９】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；および該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項29記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；および該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３１】
第三プローブオリゴヌクレオチドが第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
増幅の第一レベルが直線的増幅によって達成され、および第二レベルが対数的増幅で達成される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
増幅の第一レベルが非対数的であり、および増幅の第二レベルが対数的である、請求項22記載の方法。
【請求項３４】
測定が、試料中の標的核酸の量を検出する、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約108分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約1010分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３７】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に103個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に105個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３８】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に101個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に107個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３９】
インキュベートする段階および測定する段階が単一容器中で実施される、請求項22記載の方法。
【請求項４０】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４２】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階が、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項４３】
ハイブリダイゼーションアッセイがリアルタイム増幅である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ハイブリダイゼーションアッセイが、TAQMANである、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションアッセイが、NASBA、TMAおよびマイクロアレイより選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
ハイブリダイゼーションアッセイが侵入型切断アッセイである、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
侵入型切断アッセイがINVADERアッセイである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
標的核酸がミクロRNAである、請求項22記載の方法。
【請求項４９】
第一および第二オリゴヌクレオチドプローブが、同じ標識を有する、請求項22記載の方法。
【請求項５０】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸における多型座の遺伝子型を同定するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、該多型座を含有する該標的核酸の領域が増幅されて、複数の増幅配列を生成するように、該標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって、該増幅は飽和するまで実施される、段階；
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとインキュベートする段階であって、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該多型座で第一対立遺伝子を検出するよう形成されている第一分析特異的領域、およびii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、かつ、該第二プローブオリゴヌクレオチドは、i)該多型座で第二対立遺伝子を検出するよう形成されている第二分析物特異的領域、ii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該増幅配列上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており、かつここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドからの検出可能シグナルのタイプが同一である、段階；
c)生成された該検出可能シグナルの強度を測定し、それにより該標的核酸中の該第一対立遺伝子、該第二対立遺伝子、または該第一および第二対立遺伝子の両方の存在を決定する段階。
【請求項５１】
多型座が単一ヌクレオチド多型性である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
多型座が反復配列である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、第二非分析物特異的領域を含み、第二非分析物特異的領域は第一非分析物特異的領域と同一ではなく、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成させるよう、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項５４】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが同じである、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが異なる、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
上流オリゴヌクレオチドが5'部分および3'部分を含み、該5'部分が標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位と連続する領域とハイブリダイズするよう形成され、かつ該3'部分が該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
試料を第一および第二標識化配列とともにインキュベートする段階であって、第一非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第一標識化配列が第一検出可能シグナルを生成するよう形成され、第二非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第二標識化配列が第二検出可能シグナルを生成するよう形成されている、段階をさらに含む請求項53記載の方法。
【請求項５９】
第一および第二検出可能シグナルが同じである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
第一および第二標識化配列がFRETカセットを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
複数の上流オリゴヌクレオチドが試料中で生成される、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の第一上流オリゴヌクレオチド、複数の第二上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第一プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第二プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二非分析物特異的領域であって、該第二プローブハイブリダイゼーション部位は該第一プローブハイブリダイゼーション部位と同一ではない領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている該第一非分析物特異的領域と同一ではない第二非分析物特異的領域を含み、、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在し；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成するために、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項６３】
以下を含む、試料中の標的核酸の定量化のためのキット：
a)各々が第一分析物特異的領域を含む、複数の第一プローブオリゴヌクレオチド；
b)各々が第二分析物特異的領域を含み、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、複数の第二プローブオリゴヌクレオチド；および
c)該複数の該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを使用して、侵入型切断アッセイを実施するための試薬。
【請求項６４】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項63記載のキット。
【請求項６５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６７】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第一標識化配列は、第一検出可能シグナルを生成するように形成され、かつ、該第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第二標識化配列は、第二検出可能シグナルを生成するように形成されている、第一および第二標識化配列。
【請求項６８】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項６９】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有さない、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７２】
標的、および切断剤によって切断可能な上流オリゴヌクレオチドとともに侵入型切断構造を形成しない、第三5'領域および第三3'領域を含む第三プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７３】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一であり、かつここで、該第一3'領域は該第二3'領域と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一または第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、検出可能シグナルを生成するよう形成されている第一標識化配列。
【請求項７４】
以下を含む、キット：
a)複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドを含む第一容器であって、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは分析物特異的領域を含み、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、第一容器；
b)ポリメラーゼおよびFEN酵素を含む第二容器；ならびに
c)緩衝剤を含む第三容器。
【請求項７５】
第一および第二オリゴヌクレオチドが非標識である、請求項74記載のキット。
【請求項７６】
プローブハイブリダイゼーション部位を含むコントロール標的配列をさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７７】
第一容器が増幅のためのプライマーをさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７８】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドと同じ親和性を有する標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するように形成されており、かつここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、段階；ならびに
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項７９】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の非標識第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の非標識第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項８０】
以下の段階を含む、標的核酸の最初の量を増幅せずに試料中の標的核酸の最初の量を検出するための方法：
a)最初に300コピーまたはそれ未満の標的核酸を含有する試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、300コピーまたはそれ未満の該標的核酸は、測定段階前に増幅されていない、段階。
【請求項８１】
300コピーまたはそれ未満が、200〜100コピーである、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸の量を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、プローブハイブリダイゼーション部位を含有する該標的核酸の領域が複数の増幅配列を生成するように増幅されるように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階、
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該増幅配列上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
c)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、該標的核酸が最初に該試料中に約1分子〜約107分子の量で存在する場合、該測定する段階が可能である、段階。
【請求項１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a)増幅産物を生成するために2つの異なるレベルの増幅で標的核酸を増幅する段階；
b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブとハイブリダイズする段階であって、ここで、該第一プローブは、該第二プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階。
【請求項２】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
少なくとも2つのプローブが同一配列へ結合する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
以下の段階を含む、幅広いダイナミックレンジにわたって複数の試料中で標的核酸を検出するための方法であって：
標的核酸の10^3未満のコピーを有する第一試料および標的核酸の10^5より多いコピーを有する第二試料を、該第一試料および該第二試料中の該標的核酸が検出されるような条件下で試薬のセットへ曝露する段階を含み、
該第一試料および第二試料の各々を、第一プローブおよび第二プローブへ曝露する段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該標的核酸とハイブリダイズする段階を含む、方法。
【請求項５】
第一および第二試料中の標的核酸が定量化される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が検出前に2つまたはそれ以上の異なる増幅条件下で処理される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
標的核酸のどんな増幅もなしで実施される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、直線的増幅によって、指数関数的増幅によって、または直線的および指数関数的増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸が2つの異なるレベルの増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：a)増幅産物を生成させるために標的核酸を増幅する段階；b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブと接触させる段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階；c)該第一プローブおよび第二プローブを切断する段階；ならびにd)該第一プローブおよび第二プローブの切断を検出する段階。
【請求項１２】
以下を含むキット：ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および標的核酸の分析物特異的領域とハイブリダイズするよう形成されている2つのプローブであって、第二プローブは、第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該分析物特異的領域とハイブリダイズし、かつ、第一プローブおよび第二プローブは、該標的核酸の存在下で検出可能シグナルを直接的にまたは間接的にの両方で生成させるよう形成されている、プローブ。
【請求項１３】
第一および第二プローブが同じタイプの検出可能シグナルを生成する、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
第一および第二プローブが標識を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１５】
第一および第二プローブが各々、FRETカセットと相補的なフラップ配列を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１６】
第一プローブのフラップが第二プローブのフラップと同一である、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズするか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズする、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項１８】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または該第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、第二プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列上で該第一プローブハイブリダイゼーション部位を異なる頻度で占有するか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列上の該第二プローブハイブリダイゼーション部位を、異なる頻度で占有する、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項２３】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階をさらに含む、請求項22記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；ならびに該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２８】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；ならびに該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２９】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；および該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項29記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；および該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３１】
第三プローブオリゴヌクレオチドが第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
増幅の第一レベルが直線的増幅によって達成され、および第二レベルが対数的増幅で達成される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
増幅の第一レベルが非対数的であり、および増幅の第二レベルが対数的である、請求項22記載の方法。
【請求項３４】
測定が、試料中の標的核酸の量を検出する、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約108分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約1010分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３７】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に103個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に105個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３８】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に101個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に107個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３９】
インキュベートする段階および測定する段階が単一容器中で実施される、請求項22記載の方法。
【請求項４０】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４２】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階が、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項４３】
ハイブリダイゼーションアッセイがリアルタイム増幅である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ハイブリダイゼーションアッセイが、TAQMANである、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションアッセイが、NASBA、TMAおよびマイクロアレイより選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
ハイブリダイゼーションアッセイが侵入型切断アッセイである、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
侵入型切断アッセイがINVADERアッセイである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
標的核酸がミクロRNAである、請求項22記載の方法。
【請求項４９】
第一および第二オリゴヌクレオチドプローブが、同じ標識を有する、請求項22記載の方法。
【請求項５０】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸における多型座の遺伝子型を同定するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、該多型座を含有する該標的核酸の領域が増幅されて、複数の増幅配列を生成するように、該標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって、該増幅は飽和するまで実施される、段階；
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとインキュベートする段階であって、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該多型座で第一対立遺伝子を検出するよう形成されている第一分析特異的領域、およびii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、かつ、該第二プローブオリゴヌクレオチドは、i)該多型座で第二対立遺伝子を検出するよう形成されている第二分析物特異的領域、ii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該増幅配列上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており、かつここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドからの検出可能シグナルのタイプが同一である、段階；
c)生成された該検出可能シグナルの強度を測定し、それにより該標的核酸中の該第一対立遺伝子、該第二対立遺伝子、または該第一および第二対立遺伝子の両方の存在を決定する段階。
【請求項５１】
多型座が単一ヌクレオチド多型性である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
多型座が反復配列である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、第二非分析物特異的領域を含み、第二非分析物特異的領域は第一非分析物特異的領域と同一ではなく、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成させるよう、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項５４】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが同じである、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが異なる、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
上流オリゴヌクレオチドが5'部分および3'部分を含み、該5'部分が標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位と連続する領域とハイブリダイズするよう形成され、かつ該3'部分が該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
試料を第一および第二標識化配列とともにインキュベートする段階であって、第一非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第一標識化配列が第一検出可能シグナルを生成するよう形成され、第二非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第二標識化配列が第二検出可能シグナルを生成するよう形成されている、段階をさらに含む請求項53記載の方法。
【請求項５９】
第一および第二検出可能シグナルが同じである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
第一および第二標識化配列がFRETカセットを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
複数の上流オリゴヌクレオチドが試料中で生成される、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の第一上流オリゴヌクレオチド、複数の第二上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第一プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第二プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二非分析物特異的領域であって、該第二プローブハイブリダイゼーション部位は該第一プローブハイブリダイゼーション部位と同一ではない領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている該第一非分析物特異的領域と同一ではない第二非分析物特異的領域を含み、、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在し；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成するために、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項６３】
以下を含む、試料中の標的核酸の定量化のためのキット：
a)各々が第一分析物特異的領域を含む、複数の第一プローブオリゴヌクレオチド；
b)各々が第二分析物特異的領域を含み、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、複数の第二プローブオリゴヌクレオチド；および
c)該複数の該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを使用して、侵入型切断アッセイを実施するための試薬。
【請求項６４】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項63記載のキット。
【請求項６５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６７】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第一標識化配列は、第一検出可能シグナルを生成するように形成され、かつ、該第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第二標識化配列は、第二検出可能シグナルを生成するように形成されている、第一および第二標識化配列。
【請求項６８】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項６９】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有さない、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７２】
標的、および切断剤によって切断可能な上流オリゴヌクレオチドとともに侵入型切断構造を形成しない、第三5'領域および第三3'領域を含む第三プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７３】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一であり、かつここで、該第一3'領域は該第二3'領域と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一または第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、検出可能シグナルを生成するよう形成されている第一標識化配列。
【請求項７４】
以下を含む、キット：
a)複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドを含む第一容器であって、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは分析物特異的領域を含み、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、第一容器；
b)ポリメラーゼおよびFEN酵素を含む第二容器；ならびに
c)緩衝剤を含む第三容器。
【請求項７５】
第一および第二オリゴヌクレオチドが非標識である、請求項74記載のキット。
【請求項７６】
プローブハイブリダイゼーション部位を含むコントロール標的配列をさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７７】
第一容器が増幅のためのプライマーをさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７８】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドと同じ親和性を有する標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するように形成されており、かつここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、段階；ならびに
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項７９】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の非標識第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の非標識第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項８０】
以下の段階を含む、標的核酸の最初の量を増幅せずに試料中の標的核酸の最初の量を検出するための方法：
a)最初に300コピーまたはそれ未満の標的核酸を含有する試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、300コピーまたはそれ未満の該標的核酸は、測定段階前に増幅されていない、段階。
【請求項８１】
300コピーまたはそれ未満が、200〜100コピーである、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸の量を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、プローブハイブリダイゼーション部位を含有する該標的核酸の領域が複数の増幅配列を生成するように増幅されるように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階、
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該増幅配列上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
c)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、該標的核酸が最初に該試料中に約1分子〜約107分子の量で存在する場合、該測定する段階が可能である、段階。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００８−５３３９７４（Ｐ２００８−５３３９７４Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２３５８（Ｐ２００７−５５２３５８）
【出願日】平成１８年１月２３日（２００６．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７９０４９
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
３．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５００２２８７９１）サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２３日（２００６．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７９０４９
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
３．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５００２２８７９１）サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Ｆターム（参考）】
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