核酸複合体
【課題】生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度よりも高い温度では疎水性となる温度応答性ポリマーブロックを有した遺伝子導入剤と核酸との複合体を提供する。
【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなり、該ポリマーは、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である、温度感応性ポリマーブロックを有する遺伝子導入剤を用いて核酸複合体とする。ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるホモポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをブロック重合させたものである。
【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなり、該ポリマーは、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である、温度感応性ポリマーブロックを有する遺伝子導入剤を用いて核酸複合体とする。ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるホモポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをブロック重合させたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤を用いた核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
本出願人らは合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
これに対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００に代表されるカチオン性脂質ベクターはＤＮＡと形成させたリポソーム粒子表面の脂質が疎水性相互作用より細胞の細胞膜へ溶解又は融合するように膜を透過することで高い発現性を発揮している。
近年、合成高分子ベクターでもカチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性のセグメントを導入することで疎水性相互作用を付与する検討が盛んに行われている。しかしながら、カチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性物質を導入した合成高分子は水溶液中では親水性のカチオン性ポリマー鎖が外周側へ多く、疎水性物質が内殻へ多く存在するミセル類似構造またはミセル構造を形成すると考えられ、従って、ＤＮＡと形成させた複合体においてもカチオン性ブロックが優先的に水溶液側へ配向し、ポリイオン複合体の疎水性相互作用は非常に効率が悪くなるものと考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記従来の問題点を解消し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、より効率よく細胞膜を透過することができる核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の核酸複合体は、芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とするものである。なお、本発明でいうポリマーとは、モノマーの２量体などのオリゴマーも包含するものとする。
【０００５】
前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることが好ましく、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であっても良い。
【０００６】
このカチオン性ホモポリマーブロックの分子量は、2,000〜500,000が好ましく、非イオン性ポリマーブロックの分子量は2,000〜500,000が好ましい。
【０００７】
このブロック共重合体の分子量は、3,000〜600,000であることが好ましい。
【０００８】
前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることが好ましい。
【０００９】
前記カチオン性ホモポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１０】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１１】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸複合体に用いられている遺伝子導入剤は、温度感応性ポリマーブロックを有しており、上記所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、これを水に溶解させて核酸と複合させることができる。この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。
【００１３】
本発明で用いられる遺伝子導入剤は、ベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造の合成高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡを高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた本発明の核酸複合体の微粒子の表面にはＤＮＡ、カチオン性ポリマー鎖ブロック、温度官能性ポリマー鎖ブロックガランダムに配向している。この核酸複合体を使用して細胞への遺伝子導入する際は、培養条件下で核酸複合体微粒子の表面に露出している温度官能性ブロック鎖が疎水性ブロックへ相転移し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、効率よく細胞膜を透過することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で用いる遺伝子導入剤は、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有するポリマー材料よりなる。
【００１５】
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させ、さらに温度感応性ポリマーブロックを導入した分岐型重合体が好適である。
【００１６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００１７】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００１８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００１９】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種とりわけ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００２０】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２１】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ％以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００２２】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００２３】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００２４】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００２５】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００２６】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００２７】
この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。
【００２８】
この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００２９】
本発明では、まず分岐型重合体よりなるカチオン性ポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入し、目的とするポリマー材料とするのが好ましい。ただし、先に温度感応性ポリマーブロックを有した分岐型重合体を形成し、その後、カチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３０】
いずれの場合でも、このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより上記ポリマー材料が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３１】
カチオン性ポリマーブロックにＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体をメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミドを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３２】
本発明の別の一態様では、モノマーとして、カチオン性モノマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体と、非イオン性モノマーとを用いる。イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドブロック又はその誘導体、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。
【００３３】
非イオン性モノマーとしては、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。
【００３４】
このブロック共重合体（ポリマー材料）の分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３５】
このポリマー材料よりなる遺伝子導入剤中の温度感応性ポリマーブロックは、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。
【００３６】
従って、約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有することになる。
【００３７】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００３８】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、３０℃よりも低温度下において、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の水溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００３９】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４０】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡなどの導入、遺伝子発現、リプレッシング以外にも細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４１】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えば、動的光散乱装置によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは生体内使用の際には、腎臓にて速やかに濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、微粒子同士が凝集して沈降したり、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４２】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４３】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４４】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４５】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００４６】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００４７】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００４８】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００４９】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５０】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５１】
実施例１
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００５２】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００５３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００５４】
【化１】
【００５５】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００５６】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）１９．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３５分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）よりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５０，０００と測定された。
【００５７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００５８】
【化２】
【００５９】
iii)カチオン性ホモポリマーへのＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合によるポリマー材料（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭと記すことがある。）の合成を行った。
【００６０】
即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを１リットルフラスコへ移し、約８００ｍＬのジエイチルエーテルを投入して再沈殿させ、デカンテーションによりジエチルエーテルを除去した。ここへ約５０ｍＬのトルエンを加えポリマー成分を溶解し、再度ジエイチルエーテルを投入してポリマー成分を再沈殿した。この操作を３回繰り返した。ポリマー成分を約２０ｍＬのメタノールへ溶解し、ここへＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）０．５ｇを混合して全量をメタノールで６０ｍＬに調整した。ii）と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍとポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＭ）とのブロックポリマーよりなるポリマー材料ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭを得た。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。
【００６１】
【化３】
【００６２】
以上により、目的とする分岐スター型遺伝子導入剤が得られた。
【００６３】
［遺伝子導入剤と核酸との複合体］
ＤＮＡとして、ホタルルシフェラーゼをコードするｐＧＬ３コントロールベクター（プロメガ社)を濃度０．０３３μｇ／μＬで調製した。
その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した。粒子径を測定すると８０〜１２０ｎｍ、平均１１０ｎｍのイオン複合体が形成され、２０〜２３℃の温度下では約４８時間後にも安定に分散していた。これを３７℃の環境に置くと、昇温後の数時間は粒子径は９０〜１４０ｎｍ、平均１３０ｎｍで大きな変化はなかったが、２４時間後には４００ｎｍ程度まで増大し、微粒子同士の凝集が起こっていることが確認された。実際の遺伝子導入操作が数時間内で行われることを考慮すれば、３７℃昇温後の数時間だけ核酸複合体の粒子径が維持できれば問題ないと考えられる。
次に、水溶液をすべて３７℃に温調する以外はすべて前記と同様の手法で粒子径を測定した。３６０〜４００ｎｍのイオン複合体が形成されており、経時性に粒子径を増大し、沈降することが確認された。これは疎水性ブロックを包囲するようにミセルライクな微粒子が形成されるために粒子径が大きくなったものと推測される。
なお、上記の粒子径の測定には動的光散乱装置（ＨＯＲＩＢＡ社、ＬＢ−５００）を用いた。
【００６４】
［遺伝子導入実験］
細胞として血管内皮細胞を使用した。
遺伝子導入剤の溶液の調製は２０〜２５℃の環境下で行った。ＤＮＡは濃度０．０３３μｇ／μＬのＴＥバッファー溶液とし、その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した後に１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合して室温で３０分間インキュベートして遺伝子導入剤溶液とした。２４穴培養フ゜レートへＣＯＳ−１細胞を６×１０４個播種し、培養２４時間後にトランスフェクションを行った。
トランスフェクションは培養細胞から培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に遺伝子導入剤溶液を２００μＬづつ加えて３時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後に完全培地を加えて４８時間培養して行った。
このトランスフェクション後の４８時間の培養後に遺伝子導入活性の評価をルシフェラーゼアッセイで行った結果を図１に示す。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
【００６５】
＜比較例１＞
上記実施例１の合成プロセスii）を踏襲し、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを合成し、２リットルフラスコ内でジエチルエーテル再沈殿を７回繰り返し、その沈殿物の全量を２０ｍＬのメタノールへ溶解した。ここへスチレン１．０ｇを加え、メタノールで全量を５０ｍＬへ調整した。光照射重合の手法は上記合成プロセスiii）と同様に行い、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを合成した。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。これより親水性のカチオン性ポリマー鎖へ疎水性のスチレンブロックが導入されたことが確認された。
この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂＳｔブロックポリマーとＤＮＡのイオン複合体の粒子径を実施例１と同様に測定した。温度環境は２０℃〜２５℃で行い、疎水性ブロックが導入されたことによる影響を確認した。３５０〜４５０ｎｍのイオン複合体が形成されており、数時間は安定に分散したが経時性に粒子径は増大し凝集現象が起こっていることが示唆された。
ベクターとして、この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。
【００６６】
＜比較例２＞
ベクターに実施例１の合成プロセスii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。
【００６７】
［考察］
以上より、カチオン性ホモポリマーへの疎水性ブロックの固定的導入は核酸複合体の粒子径サイズ及びその安定性に影響し、若干の遺伝子導入活性の向上が確認されるが効率的でないこと考えられる。本発明では核酸複合体形成時には親水性であったブロックを細胞作用時に始めて疎水性ブロックへ相転移させることで核酸複合体の粒子径を高密度に凝縮し、安定化し、細胞作用時には細胞膜との疎水性相互作用を効率良く利用できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤を用いた核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
本出願人らは合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
これに対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００に代表されるカチオン性脂質ベクターはＤＮＡと形成させたリポソーム粒子表面の脂質が疎水性相互作用より細胞の細胞膜へ溶解又は融合するように膜を透過することで高い発現性を発揮している。
近年、合成高分子ベクターでもカチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性のセグメントを導入することで疎水性相互作用を付与する検討が盛んに行われている。しかしながら、カチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性物質を導入した合成高分子は水溶液中では親水性のカチオン性ポリマー鎖が外周側へ多く、疎水性物質が内殻へ多く存在するミセル類似構造またはミセル構造を形成すると考えられ、従って、ＤＮＡと形成させた複合体においてもカチオン性ブロックが優先的に水溶液側へ配向し、ポリイオン複合体の疎水性相互作用は非常に効率が悪くなるものと考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記従来の問題点を解消し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、より効率よく細胞膜を透過することができる核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の核酸複合体は、芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とするものである。なお、本発明でいうポリマーとは、モノマーの２量体などのオリゴマーも包含するものとする。
【０００５】
前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることが好ましく、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であっても良い。
【０００６】
このカチオン性ホモポリマーブロックの分子量は、2,000〜500,000が好ましく、非イオン性ポリマーブロックの分子量は2,000〜500,000が好ましい。
【０００７】
このブロック共重合体の分子量は、3,000〜600,000であることが好ましい。
【０００８】
前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることが好ましい。
【０００９】
前記カチオン性ホモポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１０】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１１】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸複合体に用いられている遺伝子導入剤は、温度感応性ポリマーブロックを有しており、上記所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、これを水に溶解させて核酸と複合させることができる。この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。
【００１３】
本発明で用いられる遺伝子導入剤は、ベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造の合成高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡを高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた本発明の核酸複合体の微粒子の表面にはＤＮＡ、カチオン性ポリマー鎖ブロック、温度官能性ポリマー鎖ブロックガランダムに配向している。この核酸複合体を使用して細胞への遺伝子導入する際は、培養条件下で核酸複合体微粒子の表面に露出している温度官能性ブロック鎖が疎水性ブロックへ相転移し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、効率よく細胞膜を透過することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で用いる遺伝子導入剤は、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有するポリマー材料よりなる。
【００１５】
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させ、さらに温度感応性ポリマーブロックを導入した分岐型重合体が好適である。
【００１６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００１７】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００１８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００１９】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種とりわけ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００２０】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２１】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ％以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００２２】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００２３】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００２４】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００２５】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００２６】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００２７】
この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。
【００２８】
この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００２９】
本発明では、まず分岐型重合体よりなるカチオン性ポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入し、目的とするポリマー材料とするのが好ましい。ただし、先に温度感応性ポリマーブロックを有した分岐型重合体を形成し、その後、カチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３０】
いずれの場合でも、このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより上記ポリマー材料が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３１】
カチオン性ポリマーブロックにＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体をメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミドを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３２】
本発明の別の一態様では、モノマーとして、カチオン性モノマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体と、非イオン性モノマーとを用いる。イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドブロック又はその誘導体、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。
【００３３】
非イオン性モノマーとしては、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。
【００３４】
このブロック共重合体（ポリマー材料）の分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３５】
このポリマー材料よりなる遺伝子導入剤中の温度感応性ポリマーブロックは、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。
【００３６】
従って、約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有することになる。
【００３７】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００３８】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、３０℃よりも低温度下において、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の水溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００３９】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４０】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡなどの導入、遺伝子発現、リプレッシング以外にも細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４１】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えば、動的光散乱装置によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは生体内使用の際には、腎臓にて速やかに濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、微粒子同士が凝集して沈降したり、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４２】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４３】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４４】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４５】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００４６】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００４７】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００４８】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００４９】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５０】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５１】
実施例１
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００５２】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００５３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００５４】
【化１】
【００５５】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００５６】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）１９．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３５分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）よりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５０，０００と測定された。
【００５７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００５８】
【化２】
【００５９】
iii)カチオン性ホモポリマーへのＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合によるポリマー材料（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭと記すことがある。）の合成を行った。
【００６０】
即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを１リットルフラスコへ移し、約８００ｍＬのジエイチルエーテルを投入して再沈殿させ、デカンテーションによりジエチルエーテルを除去した。ここへ約５０ｍＬのトルエンを加えポリマー成分を溶解し、再度ジエイチルエーテルを投入してポリマー成分を再沈殿した。この操作を３回繰り返した。ポリマー成分を約２０ｍＬのメタノールへ溶解し、ここへＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）０．５ｇを混合して全量をメタノールで６０ｍＬに調整した。ii）と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍとポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＭ）とのブロックポリマーよりなるポリマー材料ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭを得た。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。
【００６１】
【化３】
【００６２】
以上により、目的とする分岐スター型遺伝子導入剤が得られた。
【００６３】
［遺伝子導入剤と核酸との複合体］
ＤＮＡとして、ホタルルシフェラーゼをコードするｐＧＬ３コントロールベクター（プロメガ社)を濃度０．０３３μｇ／μＬで調製した。
その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した。粒子径を測定すると８０〜１２０ｎｍ、平均１１０ｎｍのイオン複合体が形成され、２０〜２３℃の温度下では約４８時間後にも安定に分散していた。これを３７℃の環境に置くと、昇温後の数時間は粒子径は９０〜１４０ｎｍ、平均１３０ｎｍで大きな変化はなかったが、２４時間後には４００ｎｍ程度まで増大し、微粒子同士の凝集が起こっていることが確認された。実際の遺伝子導入操作が数時間内で行われることを考慮すれば、３７℃昇温後の数時間だけ核酸複合体の粒子径が維持できれば問題ないと考えられる。
次に、水溶液をすべて３７℃に温調する以外はすべて前記と同様の手法で粒子径を測定した。３６０〜４００ｎｍのイオン複合体が形成されており、経時性に粒子径を増大し、沈降することが確認された。これは疎水性ブロックを包囲するようにミセルライクな微粒子が形成されるために粒子径が大きくなったものと推測される。
なお、上記の粒子径の測定には動的光散乱装置（ＨＯＲＩＢＡ社、ＬＢ−５００）を用いた。
【００６４】
［遺伝子導入実験］
細胞として血管内皮細胞を使用した。
遺伝子導入剤の溶液の調製は２０〜２５℃の環境下で行った。ＤＮＡは濃度０．０３３μｇ／μＬのＴＥバッファー溶液とし、その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した後に１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合して室温で３０分間インキュベートして遺伝子導入剤溶液とした。２４穴培養フ゜レートへＣＯＳ−１細胞を６×１０４個播種し、培養２４時間後にトランスフェクションを行った。
トランスフェクションは培養細胞から培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に遺伝子導入剤溶液を２００μＬづつ加えて３時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後に完全培地を加えて４８時間培養して行った。
このトランスフェクション後の４８時間の培養後に遺伝子導入活性の評価をルシフェラーゼアッセイで行った結果を図１に示す。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
【００６５】
＜比較例１＞
上記実施例１の合成プロセスii）を踏襲し、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを合成し、２リットルフラスコ内でジエチルエーテル再沈殿を７回繰り返し、その沈殿物の全量を２０ｍＬのメタノールへ溶解した。ここへスチレン１．０ｇを加え、メタノールで全量を５０ｍＬへ調整した。光照射重合の手法は上記合成プロセスiii）と同様に行い、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを合成した。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。これより親水性のカチオン性ポリマー鎖へ疎水性のスチレンブロックが導入されたことが確認された。
この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂＳｔブロックポリマーとＤＮＡのイオン複合体の粒子径を実施例１と同様に測定した。温度環境は２０℃〜２５℃で行い、疎水性ブロックが導入されたことによる影響を確認した。３５０〜４５０ｎｍのイオン複合体が形成されており、数時間は安定に分散したが経時性に粒子径は増大し凝集現象が起こっていることが示唆された。
ベクターとして、この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。
【００６６】
＜比較例２＞
ベクターに実施例１の合成プロセスii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。
【００６７】
［考察］
以上より、カチオン性ホモポリマーへの疎水性ブロックの固定的導入は核酸複合体の粒子径サイズ及びその安定性に影響し、若干の遺伝子導入活性の向上が確認されるが効率的でないこと考えられる。本発明では核酸複合体形成時には親水性であったブロックを細胞作用時に始めて疎水性ブロックへ相転移させることで核酸複合体の粒子径を高密度に凝縮し、安定化し、細胞作用時には細胞膜との疎水性相互作用を効率良く利用できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、
該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、
前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項３】
請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項４】
請求項３において、非イオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、カチオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項６】
請求項２ないし５のいずれか１項において、該ブロック共重合体の分子量が3,000〜600,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項８】
請求項２ないし７のいずれか1項において、前記ブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項９】
請求項８において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１０】
請求項８又は９において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１】
芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、
該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、
前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項３】
請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項４】
請求項３において、非イオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、カチオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項６】
請求項２ないし５のいずれか１項において、該ブロック共重合体の分子量が3,000〜600,000であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項８】
請求項２ないし７のいずれか1項において、前記ブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする核酸複合体。
【請求項９】
請求項８において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１０】
請求項８又は９において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする核酸複合体。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１９５６８７（Ｐ２００８−１９５６８７Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４８９８（Ｐ２００７−３４８９８）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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