核酸配列の分析方法
【課題】標的領域を有する核酸以外にも、類似する核酸が狭雑する検体において、類似する核酸に対して標的領域を有する核酸１分子が有する配列の特徴の程度を検出する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明では、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で同一の核酸増幅反応を行い、増幅産物の融解曲線分析を行ことで標的領域を有する核酸単独の１分子に由来する配列の特徴を検出できる。
【解決手段】本発明では、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で同一の核酸増幅反応を行い、増幅産物の融解曲線分析を行ことで標的領域を有する核酸単独の１分子に由来する配列の特徴を検出できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検体の中に多量に存在する標的領域を有する核酸分子の特徴を個別検出する方法に関する。より詳細には、標的領域を有する核酸一分子に由来するメチル化の程度をPCRと融解曲線分析によって検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは遺伝子病と呼ぶことができ、がん関連遺伝子の異常が蓄積することにより発症するとされている。この異常は、遺伝子の突然変異のようなジェネティックな異常だけでなく、シトシンのメチル化の異常といったエピジェネティックな異常によっても引き起こされることが明らかになっている。特に、がん抑制遺伝子のプロモーター領域に存在するCpGアイランドの高メチル化による遺伝子の不活性化は、がんの発生と進展に重要とされている。従って、がん関連遺伝子のプロモーターのメチル化を検出することが、がんの早期発見に有効であるという可能性があり、早期発見によって有効な治療がほどこせることが期待されている。例えば、特許文献１では、エストロゲン受容体、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、06−MGMTおよびhMLH1遺伝子のプロモーター領域が、正常組織と比べてがん組織で高メチル化状態にあることを検出している。メチル化を検出する手法としては、メチル化感受性の制限酵素とPCRを組み合わせて検出する方法などが知られているが、メチル化特異的PCR（MSP）が検出感度と簡便さにおいて優れている。MSPでは、先ずPCR反応前にテンプレートとなる核酸を重亜硫酸塩で処理し、すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その後、メチル化と非メチル化シトシンを区別するプライマーを用いてPCRを行うことで、プライマーを設定した領域のメチル化を検出する。しかしこのMSPは検出したいCpGの位置毎にプライマーを個別に設計する必要がある。従って多数の検体について広範囲のCpGのメチル化を調べることは、反応数が膨大となり作業上困難である。またCpGが密に集まっている場所では、プライマーを複数のCpGにまたがるようにしか設計できないため、少ないプライマーセットでCpGアイランドの全般のメチル化状態を把握することは困難である。CpGアイランドのメチル化状態を広範囲に調べる方法としては、重亜硫酸塩処理した後にCpGを含まない領域のプライマーセットでPCR増幅して、シーケンシングを行うバイサルファイトシーケンス法があるが、これは増幅だけでなく標識も必要であり、またシーケンシングには時間と労力がかかるという問題がある。
【０００３】
CpGアイランドのメチル化の分析で、遺伝子が不活化したかどうかを判断するには１ヵ所のCpGのメチル化の情報だけを用いて判定することは通常困難であり、広範囲にメチル化の程度を分析してCpGアイランドのメチル化が低度であるのか、高度であるのかを調べる必要がある。
【０００４】
一方、がんの早期発見においては、検査対象とする検体は非浸襲であるか、または浸襲性の低い検体を使用することが望まれている。具体的には非浸襲検体とは、血液、喀痰、尿、糞便などである。がん患者のこれらの検体中には、早期であってもがん細胞が遊離・循環しているとされており、非特許文献１では、これを用いてがんの早期診断を行う試みがなされている。またこれらの検体中には、がん細胞だけでなく、がん細胞に由来する核酸も遊離・循環しているとされている。さらに、がん患者においては、がん細胞に由来する血液中のＤＮＡ量が増加しているという報告が非特許文献２にある。そこで、非特許文献３では血清中に遊離するＤＮＡについて、遺伝子のメチル化のパターンを検出して肺がんの早期診断を行うことが紹介されている。しかし、血清中および血漿中から核酸を回収しようとする場合、正常な血球細胞由来の核酸を完全に除去することはできず、また正常な血液中にも正常細胞由来のDNAが遊離しているため、実際に評価する核酸はがん細胞に由来するもののみではない。従って、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べようとする際に、CpGの位置ごとに個別にMSPでメチル化の有無を特定する場合には、各CpGのメチル化の程度は正常細胞とがん細胞由来のものが混在したものの結果となる。また、この場合にはメチル化の程度が高いとする結果が得られても、ある一つの核酸分子に由来するCpGアイランドが高メチル化されているのか、それともまばらにメチル化されているものが複数存在しているのかということを切り分けることは困難である。
【０００５】
従って、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がんの早期診断を行うことは、正常細胞とがん細胞由来の核酸を区別できないという理由で困難であるという課題があった。
【０００６】
そこで複数の狭雑する核酸の中から特定の核酸１分子に由来する特徴を調べる手法として、非特許文献４に、デジタルPCRという技術が提案されている。これはPCRが１分子からでも増幅可能であるという特性を利用したもので、テンプレートとなる核酸を限界希釈してPCR反応液を調製して、１分子由来のPCRを行うという手法である。具体的には、希釈系列を作成し、それぞれの系列毎に96ウェルのPCRプレート等を用いて複数のPCRを行い、蛍光インターカレータ等で蛍光検出を行っている。これにより96ウェルすべてのウェルで増幅が確認されたウェルプレートから、一つも増幅が確認されなくなるプレートの間の希釈系列にある、数個から数十個のウェルで増幅が確認される希釈系列のプレートでのPCR増幅は１分子由来であると判断するものである。しかしこの手法は、PCRに用いたプライマーで増幅する領域の有無を判定しているにすぎない。仮にタックマン法等のプローブを使用する場合でも、増幅対象となる領域中の一つの変異を調べることができるが、１ウェルで１分子中の複数の変異等を調べることは困難である。通常、複数位置の変異等をPCRで調べる際は、検体が複数の同一分子を含むという仮定のもと、検体を分割して複数のウェルで異なるプローブを用いて検出を行う。しかし、デジタルPCRの場合には１ウェル中にある１分子を分割して分析する手法を行うことはできない。従って、１分子に由来するCpGアイランドのメチル化の程度を、複数ヶ所について広範囲に調べるといったことは、通常のデジタルPCRを行うだけでは不十分であった。
【特許文献１】特許第3612080号
【非特許文献１】Clinical Cancer Research Vol. 10, 8152-8162, December 15, 2004
【非特許文献２】Cancer Metastasis Rev. 1999;18(1):65-73.
【非特許文献３】CANCER RESEARCH 59, 67-70, January 1, 1999
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9236-9241, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、従来、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がんの早期診断を行うことは、正常細胞とがん細胞由来の核酸を区別できないという理由で困難であるという課題があった。
【０００８】
従って本発明は、増幅の対象となる標的領域の中のバリエーションが異なる核酸が多数狭雑する核酸検体においても、類似する核酸と区別して、標的領域を有する核酸１分子の配列の特徴の程度を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は鋭意検討した結果、上記問題点を解決する方法として、以下の方法を見いだすに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第一の核酸配列の分析方法は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【００１１】
本発明の第二の核酸配列の分析方法は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、少なくとも一つ以上の反応場で増幅が行われない核酸検体の濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【００１２】
さらに本発明の第三の核酸の分析方法は、核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の前記核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により前記複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の前記核酸検体について、前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、増幅の対象となる標的領域の中のバリエーションが異なる核酸が多数狭雑する核酸検体においても、類似する核酸と区別して、標的領域を有する核酸の１分子が有する配列の特徴の程度を検出する方法を提供することができる。特には、核酸検体中に存在する標的領域を有する核酸の１分子が有するCpGアイランドのメチル化の程度を検出することが可能となり、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がん細胞に由来すると考えられるCpGアイランドが高メチル化した核酸の有無を検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、より具体的な構成例について記載するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。本発明は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。核酸検体とは、分析の対象となる核酸であり、標的領域中の配列について分析がなされる。核酸配列の分析には、核酸の塩基配列自体の分析だけでなく、核酸配列のメチル化等の修飾の有無の分析も含まれる。また核酸配列の変化には、塩基配列自体の変化だけでなく、検体に含まれる時点での標的領域配列上の化学修飾の有無も含まれる。本発明の分析方法は、核酸検体に標的領域を有する核酸分子が複数含まれている場合であっても、標的領域の個別の分析を可能とする。また、例えば、核酸配列のメチル化の頻度を分析する場合、メチル化部位ごとに検出せずに複数のメチル化部位が存在する領域を広範囲に分析することができるため、メチル化の程度が高い標的領域を好適に検出することができる。メチル化の検出においても、標的領域と同一配列であってメチル化されていない核酸を複数含む検体であっても、標的領域のメチル化を個別に検出することができる。メチル化を検出する場合、標的領域として、ＣｐＧ領域を含んでいるものを好適に用いることができる。
【００１５】
（核酸増幅反応）
核酸増幅反応とは、ＰＣＲ法に代表される酵素反応を用いた分子生物学的手法であり、サーマルサイクルを与えるＰＣＲ法やＬＣＲ法の他にも、一定温度下で行うＳＤＡ法や、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられ、いずれも好ましく使用することができる。この核酸増幅反応は、初めに増幅を開始するところから、増幅終了後に、融解曲線分析を終えるまでを、一つの反応場で行う。この反応場とは、ある容量をもつ反応液中に存在する分子が拡散せずに制限された容積中に留まっている空間を指す。従って、複数の反応場とは、９６穴ウェルプレートや３８４穴ウェルプレートに代表されるような、物理的に区切られた、複数の空間であってもよい。また、物理的には区切られていないが、分子の拡散が大きく制限されているために、反応液毎での拡散が起きない連続した一つの空間内に複数の反応場を設定してもよい。具体的にこの連続した一つの空間としては、キャピラリーや、平板で挟まれた薄層のチャンバー、またはマイクロ流体デバイス上に加工された流路を好ましく用いることができる。ここでのマイクロ流体デバイスとは、ガラスやシリコン、プラスチック等の基材に１０〜５００μｍ程度の微細な流路を形成し、そのなかで様々な化学・生化学プロセスを行うための混合・分離・検出等を行うことのできる要素を備えているデバイスを意味する。この連続した一つの空間内に複数の反応場を設定するには、各反応場は、緩衝液等の溶液で隙間のないように満たされていてもよく、また空気や窒素またはアルゴン等の気体で満たされていてもよい。またはシリコンオイルやミネラルオイルといった非水溶性の溶剤で満たすこともできる。さらにこの反応場は、物理的に区切られておらず、また分子の拡散が大きく制限されていない、分子拡散が起こり得るチャンバーを用いることもできる。ただし、この場合は、NATURE METHODS VOL.3 NO.7 JULY 2006 545-550に示されているような、非水溶性の溶媒中で、界面活性剤の存在下においてＰＣＲ反応液で構成されるエマルジョンを複数作成することで、それぞれのエマルジョンを反応場とすることができる。
【００１６】
これらの複数の反応場で、例えば核酸増幅反応としてＰＣＲを行う際には、各反応場では、同一のプライマーを用いて、同一の領域を増幅することが好ましい。また、特にCpGアイランドのメチル化の程度を調べる用途においては、プライマーはCpGを含まないように設計されたものを用いることが好ましい。これは例えば、がんの診断を想定する場合、がん細胞に由来するCpGアイランドが高メチル化したテンプレート核酸と、正常細胞に由来する低メチル化のテンプレート核酸におけるメチル化の程度が常に一定ではなく、また中間のものも存在するためである。つまり、１つの反応場において１つのプライマーで増幅を行う際には、プライマー自身に特異性がある場合は、増幅の有無を確認するだけではCpGアイランドに含まれる複数のCpGのメチル化の程度を調べることはできない。従って、本発明では、調べるべき配列変化が起こる領域を挟んで、調べるべき配列変化が起こらないと想定される領域にプライマーを設計することが好ましい。
【００１７】
このように、調べるべき配列変化の程度によらずに核酸増幅反応を行った後に、この増幅産物の融解曲線分析を行うことで、配列変化の程度を調べることができる。
【００１８】
（融解曲線分析）
本発明では、核酸増幅反応により得られる増幅産物について融解曲線分析を行う。融解曲線分析としては、一般的によく用いられる蛍光インターカレータを用いた熱融解曲線分析を行うことができる。蛍光インターカレータとしては、通常融解曲線分析を行う際に用いることができるエチジウムブロマイドやSYBRR Green I（Molecular Probes Inc.社製）、LC Green（Idaho Technology社製）などを好ましく使用することができる。融解曲線分析によって、各反応場で増幅した増幅産物の融解温度と増幅産物に特徴的な融解曲線を得ることができる。増幅が行われない反応場では、通常、融解曲線は得られない。また仮に複数のピークが生じるような、非特異な産物が含まれている場合であっても、融解温度の分析から標的とする増幅産物であるかどうかを確認することは可能である。特にCpGアイランドのメチル化の程度を調べる用途において、重亜硫酸塩処理を行って、メチル化シトシンを変換せず、非メチル化シトシンをウラシルに変換する反応を用いる場合に融解曲線分析は有効性が高い。これは、例えば５００塩基の長さを増幅すると仮定した場合に、CpGが５０ヶ所存在するとしたとき、すべてのCpGがメチル化されているテンプレート核酸からの増幅産物と、すべてのCpGがメチル化されていないテンプレート核酸からの増幅産物では、ＧＣ％が１０％異なることを意味する。GC％の差は融解温度と融解曲線の変化となって検出することが可能である。つまりCpGアイランドが高メチル化していた場合は高い融解温度を示し、低メチル化である場合は低い融解温度を段階的に示すということである。また重亜硫酸塩での処理は、US5786146等に記載の方法にて行うことができる。
【００１９】
熱融解曲線は、ウェルプレートのような物理的に区切られた空間を反応場とする場合は、一般的に利用されている蛍光励起装置と蛍光検出装置を備えている定量ＰＣＲ装置等を使用して分析することができる。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間内に複数の反応場を設ける場合は、熱融解を行う位置に蛍光励起装置と蛍光検出装置を備えることで熱融解分析を行うことができる。この場合、熱融解を行う位置は、一点ではなく、ある程度の範囲にまたがるため、蛍光励起装置および蛍光検出装置はその範囲にまたがり複数を備えることが好ましい。蛍光励起装置においては、複数を備える代わりに、その範囲を一括して蛍光励起できる装置を用いてもよい。また、蛍光検出装置としてＣＣＤやＣＭＯＳといったエリアセンサーを用いて、その範囲を一括して検出してもよい。蛍光励起装置および蛍光検出装置は、使用する蛍光インターカレータの特性に応じて、光学フィルターを用いて波長を調製されることがより好ましい。
【００２０】
核酸増幅反応および融解曲線分析の際に温度制御やサーマルサイクルが必要となる場合において、ウェルプレートのような物理的に区切られた空間を反応場とする場合では、一般的に利用されているペルチェヒーター等を備えている定量ＰＣＲ装置等を使用して実施することができる。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間を反応場とする場合は、デバイスに接触するようにヒーターおよびペルチェヒーターを設けることで、温度調整またはサーマルサイクルを与えることができる。核酸増幅反応は、１分子からの増幅を行うことを想定しているため、例えば核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合は、２０〜７０サイクル、より好ましくは３０〜６０サイクルを実施することが好ましい。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間内に複数の反応場を設ける場合は、Science 280, 1046 (1998)で示されているようにＰＣＲ反応液が流れる流路の形状によって、ペルチェヒーターを用いなくともサーマルサイクルを与えることができる。
【００２１】
このように融解曲線分析を行った後、検体核酸の標的領域の核酸配列を分析するために、融解曲線分析の結果を反応場間で比較する工程を有してもよい。あるいは、核酸検体とともに、あらかじめ核酸配列の変化を判断する指標となる基準試料についての融解曲線分析の分析結果と比較する工程を有してもよい。基準試料としては、例えば、標的領域中のメチル化の程度が既知の核酸を用いることができる。具体的には０％〜１００％まで数段階でメチル化の程度が異なる核酸を別途に調製し、事前に融解曲線を測定し、新たに分析した核酸の融解曲線と比較することでメチル化の程度が分かるということである。
【００２２】
（核酸検体の調製）
核酸増幅反応とそれに続く融解曲線分析を行う際には、１つの反応場に含まれる検体中の核酸濃度は、１つの標的領域が主として含まれるように調製されていることが好ましい。つまり、１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させることであり、言い換えると、核酸検体に由来する１つの標的領域を含む１つの核酸を存在させることである。１つの反応場に２つ以上の標的領域が含まれる場合に得られるデータは１分子由来のものではなくなる。一方、ほとんどの反応場で増幅が確認されないような状況では、多くの反応場が標的領域を含んでいないということでありより多数の検体を処理する場合に、作業が煩雑になってしまう。そこで、検体の種類が既知で、核酸検体の濃度がわかっている場合は、あらかじめ検体の濃度調製を行うことが好ましい。例えば血清検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べる場合、核酸抽出法を同一の手法で行う場合はAnnals of the New York Academy of Sciences Volume 1075 Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum IV Page 185 - September 2006に示されているように核酸濃度はある範囲に収束するとされている。ここで、核酸検体とは、血清などの検体から抽出した核酸の集団を指し、核酸増幅の鋳型として用いることができる核酸の集団である。また、核酸検体の標的領域とは、１組２対のプライマー等で挟まれて規定される、PCR増幅対象となるターゲット領域のことを指す。また、核酸検体は、標的領域と類似の配列の特徴を有する核酸を含んでいてもよい。類似の核酸の特徴とは、塩基配列自体が類似している場合だけでなく、配列が同一でありながら標的領域上のメチル化等の化学修飾の有無での区別を含む。よって、がん細胞と正常細胞とが混在する検体から調製される核酸検体などを用いることができる。
【００２３】
従って、この場合は検体中の標的領域の濃度を想定することが可能であるため、少なくとも１つのウェルに１つ以下の標的領域が含まれるような濃度、また１つのウェルに複数個の標的領域が入る確立をさらに下げるためには１００ウェル当たりに１０〜５０程度になるように検体濃度を調製して用いることが好ましい。一方、濃度が未知である場合には、初めは最も標的領域の濃度が高くなるように設定しておき、順に段階希釈していく方法をとることができる。この際、マイクロ流体デバイスを反応場として用いる場合は、ウェル当たりの増幅率のモニターを行い、デバイスに解析結果をフィードバックして、リアルタイムで検体濃度を調製することができる。
【００２４】
よって、本発明は、標的領域を含む核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、核酸増幅反応により複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の核酸検体について、核酸増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、を有する核酸配列の分析方法を包含する。
【実施例】
【００２５】
以下、検体中に存在する標的領域を有する核酸の１分子が有するCpGアイランドのメチル化の程度を検出する実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
［１．ＰＣＲプライマーの準備］
CpGアイランドのメチル化の程度を検出する対象遺伝子として、hMLH1を選択した。GenBank Accession# U83845の配列を参考として、メチル化非特異的な位置にCpGを複数含む領域を増幅産物中に含むようにプライマー設計を行った。表１にプライマーの配列を示す。すなわち、プライマーは、メチル化されている標的領域と、メチル化されていない狭雑している核酸のいずれについても結合できる領域に設計されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】
上記表１中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Ｆ０１プライマーとＲ０１プライマーをそれぞれ混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解してプライマーミックス１を調製した。またＦ０２プライマーとＲ０２プライマーをそれぞれ混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解してプライマーミックス２を調製した。
【００２９】
［２．検体の準備］
検体中に存在する標的領域を含む核酸のバリエーションとして、すべてのCpG部位がメチル化されている核酸と、すべてのメチル化部位がメチル化されていない核酸の調製を行った。初めに、K-562細胞由来のヒトゲノム（CCL-243D：ATCCより取得）をテンプレートとして、上記のプライマー溶液を用いて市販のサーマルサイクラーでPCRを行った。反応液組成および反応条件を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
これを、反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去してhMLH1の１７５塩基の増幅産物を得て、これをCpG部位がすべてメチル化されていない核酸とした。ＰＣＲ増幅された産物は、すべてメチル化されていないものとすることができる。
【００３２】
次に、この核酸を分割し、この領域に含まれるCpGが全てメチル化されている核酸の調製を行った。上記で調製した１７５塩基の増幅産物の一部を分割して、これを標的としてＤＮＡメチラーゼ（CpG Methylase, M. Sss I ：第一化学薬品工業株式会社製）を用いて常法に従い核酸のメチル化を行った。
【００３３】
これを、反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去してCpGがすべてメチル化されたhMLH1の１７５塩基の増幅産物を得て、これをCpG部位がすべてメチル化された核酸とした。これらの核酸は、いずれも吸光度測定を行い濃度を５０ng/μLとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行った。
【００３４】
このCpG部位がすべてメチル化された核酸１０μＬに対して、CpG部位がすべてメチル化されていない核酸９０μＬを混合して、多数の非メチル化標的領域を含む核酸中に、僅かなメチル化核酸が含まれているモデルとなる核酸検体の調製を行った。
【００３５】
［３．重亜硫酸塩処理］
次に上記核酸に対して、非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩処理を行った。重亜硫酸塩処理は、MethylampＴＭ One-Step DNA Modification Kit（EPIGENTEK社製）を使用して、常法に従って実施した。最終的に溶出した溶液について吸光度測定を行い、これらの核酸が重亜硫酸塩処理されたものが合計として1000000コピー/μＬになるようにＴＥ緩衝液で希釈を行い処理核酸を調製した。
【００３６】
［４．核酸増幅および、融解曲線分析］
重亜硫酸塩処理を行い、濃度調製を行った上記処理核酸をさらに、０．１コピー/μＬとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行いTemplate Genome DNA1を作成した。表３に示すとおり、反応液中には、メチル化核酸と非メチル化核酸が１：９の比で含まれる０．１コピー/μＬのTemplate Genome DNA1が１μｌ含まれるので、この反応液を用いると、複数の反応場には平均して１つ以下の標的領域が含まれることになる。これについて、重亜流酸処理後のメチル化非特異的プライマーである、プライマーセット２とSYBRR Green Iを含むSYBRR Premix Ex TaqＴＭ (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製）を用いて核酸増幅につづいて融解曲線分析を行った。ここでは、９６穴のウェルプレートを、独立した反応場として用いて、市販の定量ＰＣＲ装置（ABI 7500 Real-Time PCR System：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて核酸増幅および融解曲線分析を行った。反応液組成および反応条件を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表４に、９６ウェルの融解温度の結果を示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
これより、融解温度が９３〜９４℃にあるものは、ＧＣ％が高くＣｐＧがすべてメチル化されていた核酸に由来した増幅産物であると考えることできる。また、融解温度が８３〜８４℃にあるものは、ＧＣ％が低くＣｐＧすべてがメチル化されていない核酸に由来した増幅産物であると考えることができる。従って検体中に僅かに含まれるメチル化核酸を非メチル化核酸と分離して、CpGアイランドのメチル化の程度を融解温度として検出できた。またその存在比はおよそ２：９であることが分かった。
【００４１】
（実施例２）
［１．ＰＣＲプライマーの準備］から［３．重亜硫酸塩処理］までは（実施例１）と同様にして処理核酸を調製し、さらに１コピー/ｎＬとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行いTemplate Genome DNA2を作成した。
【００４２】
［４．核酸増幅および、融解曲線分析］
次に、図１に核酸増幅および融解曲線分析を行う、マイクロ流体デバイスの一例を示す。これは石英基板（１）に直径１００μｍの流路（２）がパターニングされているものに流路がパターニングされていない石英基板で蓋をして構成される。オイル注入口（３）、希釈液注入口（５）、ＰＣＲ溶液注入口（６）および排出口（４）の上部には貫通穴があけられており、シリンジポンプ等の微量吐出ポンプによって溶液を、注入および排出できる。オイル注入口（３）からミネラルオイルを流路内に、パルスで注入することで、流路内の流れるＰＣＲ反応液はミネラルオイルに挟まれて１ｎＬ毎の反応場に区切られる。ここでは、変性ヒーター（８）を９５℃、伸長ヒーター（９）を５０℃に固定して、石英基盤（１）の裏面に接触して配置することで、流路（２）内を流れるＰＣＲ反応液は、蛇行する流路（２）の形状に依存して、流路（２）を流れきるまでには、実質的に４０サイクルの２ステップのサーマルサイクルがかけられることになる。ＰＣＲ反応液はＰＣＲ溶液注入口（６）から常時流される。このＰＣＲ反応液組成を表５に示す。
【００４３】
【表５】
【００４４】
流路（２）を流れ終わった反応場は、次にヒーターアレイ（１０）を備えている分析エリア（７）を流れる。ヒーターアレイ（１０）はここでは９５℃から６５℃のまで３℃ごとに計１０個のヒーターアレイ（１０）が基板（２）の下面に接触して備えられている。また、この分析エリアには、１０個のヒーターアレイ（１０）の直上に、蛍光励起装置としてトランスイルミネーターとファイバー式の蛍光検出装置（USB 2000：Ocean Optics, Inc社製）がそなえられており、トランスイルミネーターで一括して蛍光励起を行って、各ヒーターアレイ直上の蛍光が測定される。
ここでは、１０箇所の蛍光検出を経時的に行うことで、流れてくる反応場ごとに１０個のヒーターアレイのどの位置で蛍光が確認および消失されるかを検出し、融解温度として出力される。この際ROX Reference Dye IIに由来する蛍光波長とSYBRR Green Iの波長を分離して検出することで、反応場毎に融解温度が測定される。
【００４５】
ここでは、連続した１００反応場を測定した後に、希釈液注入口（５）から表６に示される組成の希釈液が初めのＰＣＲ反応液の送液量に対して１０倍の量の送液量で送液されるように同期している。さらに次の１００反応場を測定した後には、希釈液がＰＣＲ反応液の送液量に対して、再度、直前の希釈液の送液量の１０倍の量の送液量で送液されるように繰返し同期している。
【００４６】
ここでは１００反応場において５０個以上で融解温度が測定されない状態になるときの、融解温度データを用いて、検出結果とした。表７に、５０個以上で融解温度が測定されなかった２ラウンド目の検出結果を示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
【表７】
【００４９】
これより、融解温度が９３〜９４℃にあるものは、ＧＣ％が高くＣｐＧがすべてメチル化されていた核酸に由来した増幅産物であると考えることできる。また、融解温度が８３〜８４℃にあるものは、ＧＣ％が低くＣｐＧすべてがメチル化されていない核酸に由来した増幅産物であると考えることができる。従って検体中に僅かに含まれるメチル化核酸を類似する非メチル化核酸と分離して、CpGアイランドのメチル化の程度を融解温度として検出できた。またその存在比はおよそ3：28であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】連続した一つの空間内に複数の反応場を設けて核酸増幅と融解曲線分析を行う実施形態の例であるマイクロ流体デバイスの概要を示す図である。
【符号の説明】
【００５１】
１：石英基板
２：流路
３：オイル注入口
４：排出口
５：希釈液注入口
６：ＰＣＲ溶液注入口
７：分析エリア
８：変性ヒーター
９：伸長ヒーター
１０：ヒーターアレイ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検体の中に多量に存在する標的領域を有する核酸分子の特徴を個別検出する方法に関する。より詳細には、標的領域を有する核酸一分子に由来するメチル化の程度をPCRと融解曲線分析によって検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは遺伝子病と呼ぶことができ、がん関連遺伝子の異常が蓄積することにより発症するとされている。この異常は、遺伝子の突然変異のようなジェネティックな異常だけでなく、シトシンのメチル化の異常といったエピジェネティックな異常によっても引き起こされることが明らかになっている。特に、がん抑制遺伝子のプロモーター領域に存在するCpGアイランドの高メチル化による遺伝子の不活性化は、がんの発生と進展に重要とされている。従って、がん関連遺伝子のプロモーターのメチル化を検出することが、がんの早期発見に有効であるという可能性があり、早期発見によって有効な治療がほどこせることが期待されている。例えば、特許文献１では、エストロゲン受容体、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、06−MGMTおよびhMLH1遺伝子のプロモーター領域が、正常組織と比べてがん組織で高メチル化状態にあることを検出している。メチル化を検出する手法としては、メチル化感受性の制限酵素とPCRを組み合わせて検出する方法などが知られているが、メチル化特異的PCR（MSP）が検出感度と簡便さにおいて優れている。MSPでは、先ずPCR反応前にテンプレートとなる核酸を重亜硫酸塩で処理し、すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その後、メチル化と非メチル化シトシンを区別するプライマーを用いてPCRを行うことで、プライマーを設定した領域のメチル化を検出する。しかしこのMSPは検出したいCpGの位置毎にプライマーを個別に設計する必要がある。従って多数の検体について広範囲のCpGのメチル化を調べることは、反応数が膨大となり作業上困難である。またCpGが密に集まっている場所では、プライマーを複数のCpGにまたがるようにしか設計できないため、少ないプライマーセットでCpGアイランドの全般のメチル化状態を把握することは困難である。CpGアイランドのメチル化状態を広範囲に調べる方法としては、重亜硫酸塩処理した後にCpGを含まない領域のプライマーセットでPCR増幅して、シーケンシングを行うバイサルファイトシーケンス法があるが、これは増幅だけでなく標識も必要であり、またシーケンシングには時間と労力がかかるという問題がある。
【０００３】
CpGアイランドのメチル化の分析で、遺伝子が不活化したかどうかを判断するには１ヵ所のCpGのメチル化の情報だけを用いて判定することは通常困難であり、広範囲にメチル化の程度を分析してCpGアイランドのメチル化が低度であるのか、高度であるのかを調べる必要がある。
【０００４】
一方、がんの早期発見においては、検査対象とする検体は非浸襲であるか、または浸襲性の低い検体を使用することが望まれている。具体的には非浸襲検体とは、血液、喀痰、尿、糞便などである。がん患者のこれらの検体中には、早期であってもがん細胞が遊離・循環しているとされており、非特許文献１では、これを用いてがんの早期診断を行う試みがなされている。またこれらの検体中には、がん細胞だけでなく、がん細胞に由来する核酸も遊離・循環しているとされている。さらに、がん患者においては、がん細胞に由来する血液中のＤＮＡ量が増加しているという報告が非特許文献２にある。そこで、非特許文献３では血清中に遊離するＤＮＡについて、遺伝子のメチル化のパターンを検出して肺がんの早期診断を行うことが紹介されている。しかし、血清中および血漿中から核酸を回収しようとする場合、正常な血球細胞由来の核酸を完全に除去することはできず、また正常な血液中にも正常細胞由来のDNAが遊離しているため、実際に評価する核酸はがん細胞に由来するもののみではない。従って、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べようとする際に、CpGの位置ごとに個別にMSPでメチル化の有無を特定する場合には、各CpGのメチル化の程度は正常細胞とがん細胞由来のものが混在したものの結果となる。また、この場合にはメチル化の程度が高いとする結果が得られても、ある一つの核酸分子に由来するCpGアイランドが高メチル化されているのか、それともまばらにメチル化されているものが複数存在しているのかということを切り分けることは困難である。
【０００５】
従って、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がんの早期診断を行うことは、正常細胞とがん細胞由来の核酸を区別できないという理由で困難であるという課題があった。
【０００６】
そこで複数の狭雑する核酸の中から特定の核酸１分子に由来する特徴を調べる手法として、非特許文献４に、デジタルPCRという技術が提案されている。これはPCRが１分子からでも増幅可能であるという特性を利用したもので、テンプレートとなる核酸を限界希釈してPCR反応液を調製して、１分子由来のPCRを行うという手法である。具体的には、希釈系列を作成し、それぞれの系列毎に96ウェルのPCRプレート等を用いて複数のPCRを行い、蛍光インターカレータ等で蛍光検出を行っている。これにより96ウェルすべてのウェルで増幅が確認されたウェルプレートから、一つも増幅が確認されなくなるプレートの間の希釈系列にある、数個から数十個のウェルで増幅が確認される希釈系列のプレートでのPCR増幅は１分子由来であると判断するものである。しかしこの手法は、PCRに用いたプライマーで増幅する領域の有無を判定しているにすぎない。仮にタックマン法等のプローブを使用する場合でも、増幅対象となる領域中の一つの変異を調べることができるが、１ウェルで１分子中の複数の変異等を調べることは困難である。通常、複数位置の変異等をPCRで調べる際は、検体が複数の同一分子を含むという仮定のもと、検体を分割して複数のウェルで異なるプローブを用いて検出を行う。しかし、デジタルPCRの場合には１ウェル中にある１分子を分割して分析する手法を行うことはできない。従って、１分子に由来するCpGアイランドのメチル化の程度を、複数ヶ所について広範囲に調べるといったことは、通常のデジタルPCRを行うだけでは不十分であった。
【特許文献１】特許第3612080号
【非特許文献１】Clinical Cancer Research Vol. 10, 8152-8162, December 15, 2004
【非特許文献２】Cancer Metastasis Rev. 1999;18(1):65-73.
【非特許文献３】CANCER RESEARCH 59, 67-70, January 1, 1999
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9236-9241, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、従来、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がんの早期診断を行うことは、正常細胞とがん細胞由来の核酸を区別できないという理由で困難であるという課題があった。
【０００８】
従って本発明は、増幅の対象となる標的領域の中のバリエーションが異なる核酸が多数狭雑する核酸検体においても、類似する核酸と区別して、標的領域を有する核酸１分子の配列の特徴の程度を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は鋭意検討した結果、上記問題点を解決する方法として、以下の方法を見いだすに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第一の核酸配列の分析方法は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【００１１】
本発明の第二の核酸配列の分析方法は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、少なくとも一つ以上の反応場で増幅が行われない核酸検体の濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【００１２】
さらに本発明の第三の核酸の分析方法は、核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の前記核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により前記複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の前記核酸検体について、前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、増幅の対象となる標的領域の中のバリエーションが異なる核酸が多数狭雑する核酸検体においても、類似する核酸と区別して、標的領域を有する核酸の１分子が有する配列の特徴の程度を検出する方法を提供することができる。特には、核酸検体中に存在する標的領域を有する核酸の１分子が有するCpGアイランドのメチル化の程度を検出することが可能となり、非浸襲または低浸襲性の検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べるといった手法で、がん細胞に由来すると考えられるCpGアイランドが高メチル化した核酸の有無を検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、より具体的な構成例について記載するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。本発明は、核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法である。核酸検体とは、分析の対象となる核酸であり、標的領域中の配列について分析がなされる。核酸配列の分析には、核酸の塩基配列自体の分析だけでなく、核酸配列のメチル化等の修飾の有無の分析も含まれる。また核酸配列の変化には、塩基配列自体の変化だけでなく、検体に含まれる時点での標的領域配列上の化学修飾の有無も含まれる。本発明の分析方法は、核酸検体に標的領域を有する核酸分子が複数含まれている場合であっても、標的領域の個別の分析を可能とする。また、例えば、核酸配列のメチル化の頻度を分析する場合、メチル化部位ごとに検出せずに複数のメチル化部位が存在する領域を広範囲に分析することができるため、メチル化の程度が高い標的領域を好適に検出することができる。メチル化の検出においても、標的領域と同一配列であってメチル化されていない核酸を複数含む検体であっても、標的領域のメチル化を個別に検出することができる。メチル化を検出する場合、標的領域として、ＣｐＧ領域を含んでいるものを好適に用いることができる。
【００１５】
（核酸増幅反応）
核酸増幅反応とは、ＰＣＲ法に代表される酵素反応を用いた分子生物学的手法であり、サーマルサイクルを与えるＰＣＲ法やＬＣＲ法の他にも、一定温度下で行うＳＤＡ法や、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられ、いずれも好ましく使用することができる。この核酸増幅反応は、初めに増幅を開始するところから、増幅終了後に、融解曲線分析を終えるまでを、一つの反応場で行う。この反応場とは、ある容量をもつ反応液中に存在する分子が拡散せずに制限された容積中に留まっている空間を指す。従って、複数の反応場とは、９６穴ウェルプレートや３８４穴ウェルプレートに代表されるような、物理的に区切られた、複数の空間であってもよい。また、物理的には区切られていないが、分子の拡散が大きく制限されているために、反応液毎での拡散が起きない連続した一つの空間内に複数の反応場を設定してもよい。具体的にこの連続した一つの空間としては、キャピラリーや、平板で挟まれた薄層のチャンバー、またはマイクロ流体デバイス上に加工された流路を好ましく用いることができる。ここでのマイクロ流体デバイスとは、ガラスやシリコン、プラスチック等の基材に１０〜５００μｍ程度の微細な流路を形成し、そのなかで様々な化学・生化学プロセスを行うための混合・分離・検出等を行うことのできる要素を備えているデバイスを意味する。この連続した一つの空間内に複数の反応場を設定するには、各反応場は、緩衝液等の溶液で隙間のないように満たされていてもよく、また空気や窒素またはアルゴン等の気体で満たされていてもよい。またはシリコンオイルやミネラルオイルといった非水溶性の溶剤で満たすこともできる。さらにこの反応場は、物理的に区切られておらず、また分子の拡散が大きく制限されていない、分子拡散が起こり得るチャンバーを用いることもできる。ただし、この場合は、NATURE METHODS VOL.3 NO.7 JULY 2006 545-550に示されているような、非水溶性の溶媒中で、界面活性剤の存在下においてＰＣＲ反応液で構成されるエマルジョンを複数作成することで、それぞれのエマルジョンを反応場とすることができる。
【００１６】
これらの複数の反応場で、例えば核酸増幅反応としてＰＣＲを行う際には、各反応場では、同一のプライマーを用いて、同一の領域を増幅することが好ましい。また、特にCpGアイランドのメチル化の程度を調べる用途においては、プライマーはCpGを含まないように設計されたものを用いることが好ましい。これは例えば、がんの診断を想定する場合、がん細胞に由来するCpGアイランドが高メチル化したテンプレート核酸と、正常細胞に由来する低メチル化のテンプレート核酸におけるメチル化の程度が常に一定ではなく、また中間のものも存在するためである。つまり、１つの反応場において１つのプライマーで増幅を行う際には、プライマー自身に特異性がある場合は、増幅の有無を確認するだけではCpGアイランドに含まれる複数のCpGのメチル化の程度を調べることはできない。従って、本発明では、調べるべき配列変化が起こる領域を挟んで、調べるべき配列変化が起こらないと想定される領域にプライマーを設計することが好ましい。
【００１７】
このように、調べるべき配列変化の程度によらずに核酸増幅反応を行った後に、この増幅産物の融解曲線分析を行うことで、配列変化の程度を調べることができる。
【００１８】
（融解曲線分析）
本発明では、核酸増幅反応により得られる増幅産物について融解曲線分析を行う。融解曲線分析としては、一般的によく用いられる蛍光インターカレータを用いた熱融解曲線分析を行うことができる。蛍光インターカレータとしては、通常融解曲線分析を行う際に用いることができるエチジウムブロマイドやSYBRR Green I（Molecular Probes Inc.社製）、LC Green（Idaho Technology社製）などを好ましく使用することができる。融解曲線分析によって、各反応場で増幅した増幅産物の融解温度と増幅産物に特徴的な融解曲線を得ることができる。増幅が行われない反応場では、通常、融解曲線は得られない。また仮に複数のピークが生じるような、非特異な産物が含まれている場合であっても、融解温度の分析から標的とする増幅産物であるかどうかを確認することは可能である。特にCpGアイランドのメチル化の程度を調べる用途において、重亜硫酸塩処理を行って、メチル化シトシンを変換せず、非メチル化シトシンをウラシルに変換する反応を用いる場合に融解曲線分析は有効性が高い。これは、例えば５００塩基の長さを増幅すると仮定した場合に、CpGが５０ヶ所存在するとしたとき、すべてのCpGがメチル化されているテンプレート核酸からの増幅産物と、すべてのCpGがメチル化されていないテンプレート核酸からの増幅産物では、ＧＣ％が１０％異なることを意味する。GC％の差は融解温度と融解曲線の変化となって検出することが可能である。つまりCpGアイランドが高メチル化していた場合は高い融解温度を示し、低メチル化である場合は低い融解温度を段階的に示すということである。また重亜硫酸塩での処理は、US5786146等に記載の方法にて行うことができる。
【００１９】
熱融解曲線は、ウェルプレートのような物理的に区切られた空間を反応場とする場合は、一般的に利用されている蛍光励起装置と蛍光検出装置を備えている定量ＰＣＲ装置等を使用して分析することができる。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間内に複数の反応場を設ける場合は、熱融解を行う位置に蛍光励起装置と蛍光検出装置を備えることで熱融解分析を行うことができる。この場合、熱融解を行う位置は、一点ではなく、ある程度の範囲にまたがるため、蛍光励起装置および蛍光検出装置はその範囲にまたがり複数を備えることが好ましい。蛍光励起装置においては、複数を備える代わりに、その範囲を一括して蛍光励起できる装置を用いてもよい。また、蛍光検出装置としてＣＣＤやＣＭＯＳといったエリアセンサーを用いて、その範囲を一括して検出してもよい。蛍光励起装置および蛍光検出装置は、使用する蛍光インターカレータの特性に応じて、光学フィルターを用いて波長を調製されることがより好ましい。
【００２０】
核酸増幅反応および融解曲線分析の際に温度制御やサーマルサイクルが必要となる場合において、ウェルプレートのような物理的に区切られた空間を反応場とする場合では、一般的に利用されているペルチェヒーター等を備えている定量ＰＣＲ装置等を使用して実施することができる。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間を反応場とする場合は、デバイスに接触するようにヒーターおよびペルチェヒーターを設けることで、温度調整またはサーマルサイクルを与えることができる。核酸増幅反応は、１分子からの増幅を行うことを想定しているため、例えば核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合は、２０〜７０サイクル、より好ましくは３０〜６０サイクルを実施することが好ましい。また、マイクロ流体デバイスのように連続した一つの空間内に複数の反応場を設ける場合は、Science 280, 1046 (1998)で示されているようにＰＣＲ反応液が流れる流路の形状によって、ペルチェヒーターを用いなくともサーマルサイクルを与えることができる。
【００２１】
このように融解曲線分析を行った後、検体核酸の標的領域の核酸配列を分析するために、融解曲線分析の結果を反応場間で比較する工程を有してもよい。あるいは、核酸検体とともに、あらかじめ核酸配列の変化を判断する指標となる基準試料についての融解曲線分析の分析結果と比較する工程を有してもよい。基準試料としては、例えば、標的領域中のメチル化の程度が既知の核酸を用いることができる。具体的には０％〜１００％まで数段階でメチル化の程度が異なる核酸を別途に調製し、事前に融解曲線を測定し、新たに分析した核酸の融解曲線と比較することでメチル化の程度が分かるということである。
【００２２】
（核酸検体の調製）
核酸増幅反応とそれに続く融解曲線分析を行う際には、１つの反応場に含まれる検体中の核酸濃度は、１つの標的領域が主として含まれるように調製されていることが好ましい。つまり、１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させることであり、言い換えると、核酸検体に由来する１つの標的領域を含む１つの核酸を存在させることである。１つの反応場に２つ以上の標的領域が含まれる場合に得られるデータは１分子由来のものではなくなる。一方、ほとんどの反応場で増幅が確認されないような状況では、多くの反応場が標的領域を含んでいないということでありより多数の検体を処理する場合に、作業が煩雑になってしまう。そこで、検体の種類が既知で、核酸検体の濃度がわかっている場合は、あらかじめ検体の濃度調製を行うことが好ましい。例えば血清検体から、CpGアイランドのメチル化の程度を広範囲に調べる場合、核酸抽出法を同一の手法で行う場合はAnnals of the New York Academy of Sciences Volume 1075 Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum IV Page 185 - September 2006に示されているように核酸濃度はある範囲に収束するとされている。ここで、核酸検体とは、血清などの検体から抽出した核酸の集団を指し、核酸増幅の鋳型として用いることができる核酸の集団である。また、核酸検体の標的領域とは、１組２対のプライマー等で挟まれて規定される、PCR増幅対象となるターゲット領域のことを指す。また、核酸検体は、標的領域と類似の配列の特徴を有する核酸を含んでいてもよい。類似の核酸の特徴とは、塩基配列自体が類似している場合だけでなく、配列が同一でありながら標的領域上のメチル化等の化学修飾の有無での区別を含む。よって、がん細胞と正常細胞とが混在する検体から調製される核酸検体などを用いることができる。
【００２３】
従って、この場合は検体中の標的領域の濃度を想定することが可能であるため、少なくとも１つのウェルに１つ以下の標的領域が含まれるような濃度、また１つのウェルに複数個の標的領域が入る確立をさらに下げるためには１００ウェル当たりに１０〜５０程度になるように検体濃度を調製して用いることが好ましい。一方、濃度が未知である場合には、初めは最も標的領域の濃度が高くなるように設定しておき、順に段階希釈していく方法をとることができる。この際、マイクロ流体デバイスを反応場として用いる場合は、ウェル当たりの増幅率のモニターを行い、デバイスに解析結果をフィードバックして、リアルタイムで検体濃度を調製することができる。
【００２４】
よって、本発明は、標的領域を含む核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、核酸増幅反応により複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の核酸検体について、核酸増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、を有する核酸配列の分析方法を包含する。
【実施例】
【００２５】
以下、検体中に存在する標的領域を有する核酸の１分子が有するCpGアイランドのメチル化の程度を検出する実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
［１．ＰＣＲプライマーの準備］
CpGアイランドのメチル化の程度を検出する対象遺伝子として、hMLH1を選択した。GenBank Accession# U83845の配列を参考として、メチル化非特異的な位置にCpGを複数含む領域を増幅産物中に含むようにプライマー設計を行った。表１にプライマーの配列を示す。すなわち、プライマーは、メチル化されている標的領域と、メチル化されていない狭雑している核酸のいずれについても結合できる領域に設計されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】
上記表１中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Ｆ０１プライマーとＲ０１プライマーをそれぞれ混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解してプライマーミックス１を調製した。またＦ０２プライマーとＲ０２プライマーをそれぞれ混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解してプライマーミックス２を調製した。
【００２９】
［２．検体の準備］
検体中に存在する標的領域を含む核酸のバリエーションとして、すべてのCpG部位がメチル化されている核酸と、すべてのメチル化部位がメチル化されていない核酸の調製を行った。初めに、K-562細胞由来のヒトゲノム（CCL-243D：ATCCより取得）をテンプレートとして、上記のプライマー溶液を用いて市販のサーマルサイクラーでPCRを行った。反応液組成および反応条件を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
これを、反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去してhMLH1の１７５塩基の増幅産物を得て、これをCpG部位がすべてメチル化されていない核酸とした。ＰＣＲ増幅された産物は、すべてメチル化されていないものとすることができる。
【００３２】
次に、この核酸を分割し、この領域に含まれるCpGが全てメチル化されている核酸の調製を行った。上記で調製した１７５塩基の増幅産物の一部を分割して、これを標的としてＤＮＡメチラーゼ（CpG Methylase, M. Sss I ：第一化学薬品工業株式会社製）を用いて常法に従い核酸のメチル化を行った。
【００３３】
これを、反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去してCpGがすべてメチル化されたhMLH1の１７５塩基の増幅産物を得て、これをCpG部位がすべてメチル化された核酸とした。これらの核酸は、いずれも吸光度測定を行い濃度を５０ng/μLとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行った。
【００３４】
このCpG部位がすべてメチル化された核酸１０μＬに対して、CpG部位がすべてメチル化されていない核酸９０μＬを混合して、多数の非メチル化標的領域を含む核酸中に、僅かなメチル化核酸が含まれているモデルとなる核酸検体の調製を行った。
【００３５】
［３．重亜硫酸塩処理］
次に上記核酸に対して、非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩処理を行った。重亜硫酸塩処理は、MethylampＴＭ One-Step DNA Modification Kit（EPIGENTEK社製）を使用して、常法に従って実施した。最終的に溶出した溶液について吸光度測定を行い、これらの核酸が重亜硫酸塩処理されたものが合計として1000000コピー/μＬになるようにＴＥ緩衝液で希釈を行い処理核酸を調製した。
【００３６】
［４．核酸増幅および、融解曲線分析］
重亜硫酸塩処理を行い、濃度調製を行った上記処理核酸をさらに、０．１コピー/μＬとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行いTemplate Genome DNA1を作成した。表３に示すとおり、反応液中には、メチル化核酸と非メチル化核酸が１：９の比で含まれる０．１コピー/μＬのTemplate Genome DNA1が１μｌ含まれるので、この反応液を用いると、複数の反応場には平均して１つ以下の標的領域が含まれることになる。これについて、重亜流酸処理後のメチル化非特異的プライマーである、プライマーセット２とSYBRR Green Iを含むSYBRR Premix Ex TaqＴＭ (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製）を用いて核酸増幅につづいて融解曲線分析を行った。ここでは、９６穴のウェルプレートを、独立した反応場として用いて、市販の定量ＰＣＲ装置（ABI 7500 Real-Time PCR System：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて核酸増幅および融解曲線分析を行った。反応液組成および反応条件を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表４に、９６ウェルの融解温度の結果を示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
これより、融解温度が９３〜９４℃にあるものは、ＧＣ％が高くＣｐＧがすべてメチル化されていた核酸に由来した増幅産物であると考えることできる。また、融解温度が８３〜８４℃にあるものは、ＧＣ％が低くＣｐＧすべてがメチル化されていない核酸に由来した増幅産物であると考えることができる。従って検体中に僅かに含まれるメチル化核酸を非メチル化核酸と分離して、CpGアイランドのメチル化の程度を融解温度として検出できた。またその存在比はおよそ２：９であることが分かった。
【００４１】
（実施例２）
［１．ＰＣＲプライマーの準備］から［３．重亜硫酸塩処理］までは（実施例１）と同様にして処理核酸を調製し、さらに１コピー/ｎＬとなるようにＴＥ緩衝液で希釈を行いTemplate Genome DNA2を作成した。
【００４２】
［４．核酸増幅および、融解曲線分析］
次に、図１に核酸増幅および融解曲線分析を行う、マイクロ流体デバイスの一例を示す。これは石英基板（１）に直径１００μｍの流路（２）がパターニングされているものに流路がパターニングされていない石英基板で蓋をして構成される。オイル注入口（３）、希釈液注入口（５）、ＰＣＲ溶液注入口（６）および排出口（４）の上部には貫通穴があけられており、シリンジポンプ等の微量吐出ポンプによって溶液を、注入および排出できる。オイル注入口（３）からミネラルオイルを流路内に、パルスで注入することで、流路内の流れるＰＣＲ反応液はミネラルオイルに挟まれて１ｎＬ毎の反応場に区切られる。ここでは、変性ヒーター（８）を９５℃、伸長ヒーター（９）を５０℃に固定して、石英基盤（１）の裏面に接触して配置することで、流路（２）内を流れるＰＣＲ反応液は、蛇行する流路（２）の形状に依存して、流路（２）を流れきるまでには、実質的に４０サイクルの２ステップのサーマルサイクルがかけられることになる。ＰＣＲ反応液はＰＣＲ溶液注入口（６）から常時流される。このＰＣＲ反応液組成を表５に示す。
【００４３】
【表５】
【００４４】
流路（２）を流れ終わった反応場は、次にヒーターアレイ（１０）を備えている分析エリア（７）を流れる。ヒーターアレイ（１０）はここでは９５℃から６５℃のまで３℃ごとに計１０個のヒーターアレイ（１０）が基板（２）の下面に接触して備えられている。また、この分析エリアには、１０個のヒーターアレイ（１０）の直上に、蛍光励起装置としてトランスイルミネーターとファイバー式の蛍光検出装置（USB 2000：Ocean Optics, Inc社製）がそなえられており、トランスイルミネーターで一括して蛍光励起を行って、各ヒーターアレイ直上の蛍光が測定される。
ここでは、１０箇所の蛍光検出を経時的に行うことで、流れてくる反応場ごとに１０個のヒーターアレイのどの位置で蛍光が確認および消失されるかを検出し、融解温度として出力される。この際ROX Reference Dye IIに由来する蛍光波長とSYBRR Green Iの波長を分離して検出することで、反応場毎に融解温度が測定される。
【００４５】
ここでは、連続した１００反応場を測定した後に、希釈液注入口（５）から表６に示される組成の希釈液が初めのＰＣＲ反応液の送液量に対して１０倍の量の送液量で送液されるように同期している。さらに次の１００反応場を測定した後には、希釈液がＰＣＲ反応液の送液量に対して、再度、直前の希釈液の送液量の１０倍の量の送液量で送液されるように繰返し同期している。
【００４６】
ここでは１００反応場において５０個以上で融解温度が測定されない状態になるときの、融解温度データを用いて、検出結果とした。表７に、５０個以上で融解温度が測定されなかった２ラウンド目の検出結果を示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
【表７】
【００４９】
これより、融解温度が９３〜９４℃にあるものは、ＧＣ％が高くＣｐＧがすべてメチル化されていた核酸に由来した増幅産物であると考えることできる。また、融解温度が８３〜８４℃にあるものは、ＧＣ％が低くＣｐＧすべてがメチル化されていない核酸に由来した増幅産物であると考えることができる。従って検体中に僅かに含まれるメチル化核酸を類似する非メチル化核酸と分離して、CpGアイランドのメチル化の程度を融解温度として検出できた。またその存在比はおよそ3：28であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】連続した一つの空間内に複数の反応場を設けて核酸増幅と融解曲線分析を行う実施形態の例であるマイクロ流体デバイスの概要を示す図である。
【符号の説明】
【００５１】
１：石英基板
２：流路
３：オイル注入口
４：排出口
５：希釈液注入口
６：ＰＣＲ溶液注入口
７：分析エリア
８：変性ヒーター
９：伸長ヒーター
１０：ヒーターアレイ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項２】
核酸増幅反応を行う複数の反応場において、少なくとも一つ以上の反応場で増幅が行われない核酸検体の濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項３】
核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の前記核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により前記複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の前記核酸検体について、前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項４】
前記各反応場における融解曲線分析の結果を基準試料の分析結果に対して比較する工程を更に有する請求項１乃至３の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項５】
前記融解曲線分析の結果を前記反応場間で比較する工程を更に有する請求項１乃至４の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項６】
前記反応場が物理的に区切られている請求項１乃至５の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項７】
前記核酸検体が、重亜硫酸塩で処理がなされている請求項１乃至6の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項８】
前記核酸増幅が、ＰＣＲ反応である請求項１乃至７の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項９】
前記核酸検体が、ＣｐＧ領域を含んでいる請求項１乃至8の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスで前記融解曲線分析を行う請求項１乃至9の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項１】
核酸増幅反応を行う複数の反応場において、各反応場に平均して１つ以下の核酸検体の標的領域を存在させる濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項２】
核酸増幅反応を行う複数の反応場において、少なくとも一つ以上の反応場で増幅が行われない核酸検体の濃度条件下で、前記各反応場の核酸検体に対して同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程とを有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項３】
核酸検体について希釈系列を調製し、夫々の希釈度の前記核酸検体ごとに複数の反応場において同一の核酸増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により前記複数の反応場の少なくとも一つ以上で増幅が行われない希釈度の前記核酸検体について、前記増幅反応により得られる各反応場の増幅産物の融解曲線分析を行う工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の分析方法。
【請求項４】
前記各反応場における融解曲線分析の結果を基準試料の分析結果に対して比較する工程を更に有する請求項１乃至３の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項５】
前記融解曲線分析の結果を前記反応場間で比較する工程を更に有する請求項１乃至４の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項６】
前記反応場が物理的に区切られている請求項１乃至５の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項７】
前記核酸検体が、重亜硫酸塩で処理がなされている請求項１乃至6の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項８】
前記核酸増幅が、ＰＣＲ反応である請求項１乃至７の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項９】
前記核酸検体が、ＣｐＧ領域を含んでいる請求項１乃至8の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスで前記融解曲線分析を行う請求項１乃至9の何れか記載の核酸配列の分析方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１８９２９５（Ｐ２００９−１８９２９５Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３００９（Ｐ２００８−３３００９）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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