標的タンパク質に対して活性である薬物候補が該タンパク質の変異体に対して活性であるか否かを決定するためのイン・ビトロ方法
本発明はウイルス学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定する方法を提供する(ここで、該試験化合物は、該タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られているものである)。本発明は、標的タンパク質に対して活性である薬物候補、例えば、抗ウイルス化合物(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス：ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３に対する化合物)が、該タンパク質の変異体(例えば、多型、遺伝子型、または突然変異体)に対して活性であるか否かを決定するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明はウイルス学の分野に関する。より正確には、本発明は、標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定する方法を提供する(ここで、該試験化合物は、該タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られているものである)。本発明は、標的タンパク質に対して活性である薬物候補(例えば、抗ウイルス薬)が、該タンパク質の変異体に対して活性であるか否かを決定するのに有用である。
【０００２】
背景技術
Ｃ型肝炎は、世界的な健康問題であり、世界中に１億７０００万人の保菌者を有し、毎年３００〜４００万人の新たなケースを有する。この輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の原因であるウイルスは、フラビウイルス科(Flaviviridae)に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであると１９８９年に同定された(Chooら、1989)。ＨＣＶの可能性ある自然な経過には、急性感染から長期感染への進行(患者の７５〜８５％)、長期疾患から肝硬変への進行(１７〜２０％)、および肝硬変から代償不全または肝細胞癌への進行(１〜５％)が含まれる(Mc Hutchison、2004、Walker、2002)。現在、標準的な介護は、インターフェロン、即ち、免疫調節および抗ウイルス活性を有するサイトカイン(Moussalliら、1998)と、リバビリン(Ribavirin)、即ち、合成グアノシンヌクレオシド類似体(Hugleら、2003)とを組合せることにある。ＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂ(米国、日本および欧州に多い型)に感染した患者について、持続性のウイルス応答(抗ウイルス治療の２４週間後に血清ＨＣＶ ＲＮＡの減少)は、よくても４２〜４６％である(Walkerら、2002、Gordonら、2005、Lake-Bakaarら、2003)。その相対的に効果がないことに加え、この組合せ治療は重大な副作用を生じる(Fried Michael、2002)。新たな治療処方が求められており、研究者は、ウイルスのライフサイクルにおける特定の工程を阻害する薬剤の同定に焦点を当てている。
【０００３】
ウイルスと細胞膜との相互作用および融合の際に、ＲＮＡゲノムが、新たに感染した細胞の細胞質中に放出され、ＲＮＡ複製のための鋳型として働く。ＨＣＶゲノムの翻訳は、内部リボソーム侵入部位に依存し、大型のポリタンパク質を生じ、これがタンパク質分解によって切断されて１０個のウイルスタンパク質を生じる。ポリタンパク質のアミノ末端の１／３は、構造タンパク質（コアタンパク質 糖タンパク質Ｅ１＋Ｅ２）をコードしている。この構造領域の後に、小さい内在性タンパク質Ｐ７がある(これは、イオン化学物質として機能するようである)。ゲノムの残りは、非構造タンパク質ＮＳ２、Ｎ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂをコードし、これらは、ウイルスライフサイクルの細胞内過程を調整する(Lindenbachら、2005)。必須のウイルス酵素をブロックする抗ウイルス薬の開発は、新規な抗ＨＣＶ薬剤の開発への直接的なアプローチである。理論的に全てのＨＣＶ酵素が治療介入に等しく適しているが、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼおよびＮＳ３-４Ａセリンプロテアーゼが、それぞれゲノム複製およびポリタンパク質プロセシングに重要であり、最も研究されていた。様々な生化学的イン・ビトロアッセイが開発され、スクリーニング操作に使用されている(Behrensら、1996、Luoら、2000、Ohら、1999、Lohmannら、1997、Yamashitaら、1998、Mc Kercherら、2004)。有用ではあるが、これらのアッセイは、生理学的な細胞内場面における酵素の活性と、阻害物質との相互作用を予測することができなかった。さらに、これらは、分子の生物学的利用能および毒性に関する情報を与えない。
【０００４】
１９９９年まで、ＨＣＶ薬物を見出すために、あらゆる細胞に基づくスクリーニング作業は、代用ウイルス系、例えばウシウイルス下痢症ウイルスによって行われていた。１９９９年に、R. Bartenschlagerの研究室がＨＣＶレプリコン系を開発した場合に、ＨＣＶ ＲＮＡ複製の研究において大きな進展が生じた(Lohmannら、1999)。ジシストロン性の選択可能なサブゲノムＨＣＶレプリコンであるイン・ビトロＨＣＶ ＲＮＡ複製系において、伝統的な標的(例えば、ＮＳ３プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびＮＳ５Ｂポリメラーゼ)の阻害物質の効果を試験することが可能になった(Bartenschlagerら、2002)。選択可能およびレポーター選択可能なレプリコンの第１世代は、それぞれスクリーニングに使用する作業集約的な定量ＲＴ-ＰＣＲ法および低いシグナル／ノイズ比のゆえに、高処理量スクリーニングを行うことに貢献しなかった。さらに、この系は、細胞培養物適応突然変異を必要とし、なおシグナル窓の改善を必要とする(Blightら、2000、Kriegerら、2001)。最近の刊行物は、スクリーニングプラットホーム(Bourneら、2005、Zuckら、2004、O'Boyleら、2005)としてレプリコンアッセイ制限の相当な改善(Haoら、2006)を報告しており、レプリコンにおけるスクリーニングから顕になったいくつかの化合物が開発の臨床相にある。しかし、レプリコンアッセイは、単一標的アッセイではないままである。
【０００５】
ＨＣＶはインビボで高い突然変異率を示すので、臨床評価されている分子の一部が、既に酵素特異的な突然変異を誘発し、これが、使用した阻害物質に対する感受性の低下を導くことは驚くべきことではなかった(Sarrazinら、2007)。即ち、抗ＨＣＶ薬物の耐性プロファイル研究が、その最適化および長期的な臨床成功のために必須のようである。いくつかの異なるウイルス単離体から組換えＮＳ５Ｂポリメラーゼを得るための努力が為されているが、生理学的関連性の問題に直面している。臨床的に関連するウイルス単離体からの新規レプリコが研究されているが、遺伝子型１および２に、およびある種の細胞クローンになお限定されている。耐性表現型において観察された突然変異の関与は、さらなる研究を必要とすることが多い(Trozziら、2003、Nguyenら、2003)。これらの技術的制限を知ると、抗ＨＣＶ活性評価および耐性プロファイリングのための細胞スクリーニングプラットホームが緊急に必要とされている。これが本発明の目的である。
【０００６】
ここに、本発明者らは、M. Mehtali(国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット)によって開発された細胞に基づくアッセイが、阻害物質に結合した場合の標的ＨＣＶポリメラーゼおよびプロテアーゼにおける立体配座変化を検出しうることを示した。この細胞に基づくアッセイ(３Ｄスクリーンプラットホームと命名した)は、２-ハイブリッド系を用いてリガンド化されていない標的を特異的に結合し、標的と３Ｄセンサーペプチドとの間の相互作用を解離させる分子のスクリーニングを可能にする短いペプチドを同定することに基づくものである。また、本発明者らは、このＨＴＳ適合性アッセイは、ＨＣＶ特異的な抗ＮＳ５Ｂ分子の迅速同定を可能にするが、それに加えて、耐性突然変異体プロファイリングを行うのに十分感受性であることを示す。
【０００７】
最近の研究は、ＮＳ５Ｂの阻害物質として働く不自然なペプチド(Aminら、2003)を報告しているが、薬物を見出すためのツールとして使用されていなかった。いくつかの研究は、ファージ親和性選択を用いて、エストロゲン受容体の立体配座に感受性であるペプチドを同定した(Paigeら、1999)。別の特許(国際公開第０２／００４９５６号パンフレット)は、エストラジオール受容体のリガンド化された形態へのいくつかのペプチドの結合(Fowlkesら、2002)を利用して、物質の生物学的活性を、そのペプチド「指紋」を既知の参照リガンドのものと比較することによって予測した。ごく最近の刊行物には、標的受容体を認識しうるペプチドリガンドをスクリーニングするためのＦＲＥＴ-ハイブリッド相互作用法が報告された(Youら、2006)。しかし、本発明者らの知る限りでは、「感知される」ＨＣＶポリメラーゼおよびプロテアーゼ標的タンパク質ならびにこれらの変異体に対する薬物をスクリーニングするための３Ｄセンサーとしてペプチドを使用した報告は存在しなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法を提供する：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する少なくとも一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在が、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【０００９】
記述の残りについては、以下の図面の説明が参照されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮＳ５ＢΔ２１と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定(ａ)酵母２-ハイブリッド系においてＮＳ５ＢΔ２１と相互作用するペプチドの単離 バイト(bait)(ＮＳ５ＢΔ２１-ＬｅｘＡ)を保持する酵母細胞を、ランダムペプチドのライブラリー(ウイルスＶＰ１６活性化ドメインを有する枠内)で示されるプレイ(prey)で形質転換した。選択培地において増殖し、青色に染まるコロニーが、ポリメラーゼと特異的に相互作用する個々のペプチドの単離を可能にした。(ｂ)立体配座感受性ペプチドの単離 次いで、相互作用しているペプチドを、バイトＮＳ５Ｂにおいて立体配座変化を誘発することが知られているリガンドの存在下において試験した。即ち、「３Ｄセンサー」を、標的ポリメラーゼへのその結合が既知の抗ＮＳ５Ｂによって妨げられているものとして同定した。対応するコロニーは、選択遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を全く示さなかった。(ｃ)スポット試験におけるＮＳ５ＢΔ２１「３Ｄセンサー」の特性化 ここで、二つの選択した酵母コロニーが示された。一方は、以前に単離されたＥＲおよびその特異的ペプチド(Ｎｏ.３０-２と称する)を保持し、これを対照として使用し、他方は、ＮＳ５ＢΔ２１およびその特異的ペプチド(Ｎ２１Ｃ２７２と称する)を保持した。両クローンを、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠く選択培地にスポッティングし、ポリメラーゼリガンドを追加または追加せず、Ｘ-Ｇａｌ染色を重ねた。ＮＳ５ＢΔ２１＋Ｎ２１Ｃ２７２クローンを、ＮＳ５Ｂリガンドの非存在下において選択培地において増殖させ、ＬａｃＺに対して陽性に染色した。同じ培養物に由来するコロニーは、変化量の特異的ＮＳ５Ｂインヒビター(ベンゾチアジアジン ＣＶＶＳ０２３４７７)を含む選択培地において増殖を示さなかった。非特異的ウイルスポリメラーゼインヒビター[フォスカーネット(Foscarnet)、ＰＡＡ]または非関連リガンド(エストラジオール)は、増殖またはＬａｃＺ染色に対して効果を示さなかった。本発明における対照クローン(ＥＲ陽性の特異的３ＤセンサーＮｏ.３０.２)は、その対応する特異的リガンド(エストラジオール)に対しては感受性であったが、ＮＳ５Ｂまたは他のウイルスポリメラーゼインヒビターに対しては感受性ではなかった。
【図２Ａ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ａ：ベンゾサイアジアザイド薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝４)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示されている。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの６つに対して、２０より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図２Ｂ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｂ：参照ベンゾサイアジアザイド薬物に対して最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ベンゾサイアジアザイドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝４)が、最良のルシフェラーゼ活性化(２０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える６つの３Ｄセンサーに対して示されている。３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２を、特異的な抗ＮＳ５Ｂによる解離に対する比較的良好な応答性(１ｕＭ最終濃度で５１％ルシフェラーゼ阻害および１０ｕＭ最終濃度で９０％)および最小のデータ変動のために選択した。
【図２Ｃ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｃ：インドール薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝３)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６を用いて酵母において分離される２２の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの８つに対して、２０より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図２Ｄ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｄ：インドールおよびベンゾサイアジアザイド参照薬物に対して最も強力な３Ｄセンサーの反応性 インドールアセトアミドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７６またはベンゾサイアジアザイドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝３)が、最良のルシフェラーゼ活性化(２０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える８つの３Ｄセンサーに対して示される。
【図３Ａ】標的に対する選択した３Ｄセンサーの選択性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３Ｄセンサー、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。リガンドの非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示される。図３Ａ：天然ＮＳ５Ｂまたは構造不安定化突然変異体の存在下においての３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定は、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２との間の相互作用が、Labonte P.(2002)により記載されるＬ３０ＳおよびＬ３０Ｒ立体配座不安定化突然変異体を用いて起こらなかったことを示した。
【図３Ｂ】標的に対する選択した３Ｄセンサーの選択性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３Ｄセンサー、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。リガンドの非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示される。図３Ｂ：様々な耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 ３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２は、試験した１２種の薬物耐性突然変異体のうち１０種に結合した：ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されているＭ４１４Ｔ、Ｓ２８６ＡおよびＣ３１６Ｙ突然変異体、インドール耐性突然変異体Ｐ４９５Ｌ、チオフェンズ(Tiophens)耐性突然変異体Ｓ４１９ＭおよびＭ４２３Ｔ、２'-ヌクレオシド類似体耐性突然変異体Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、およびＮ１４２Ｔ、ならびに、ジヒドロキシピリミジンに耐性であるＧ１５２Ｅ突然変異体。
【図４】３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物の作用特異性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および融合タンパク質ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４により一時的にトランスフェクトし、次いで特異的または非特異的リガンドのいずれかを用いて２４時間インキュベートした。得られたルシフェラーゼ発現の阻害率(％)を、等量の溶媒(ＤＭＳＯ)に対して算出した。ＮＳ５Ｂ特異的インヒビターｃＶＶＳ-０２３４７７[ベンゾチアジアジン(Pratt JK、2005)]は、１０μＭ最終濃度においてルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を誘発し(８３.２％±７.５、ｎ＝１５)、一方、別の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６[インドール-Ｎ-アセトアミド(Harper S、2005)]は、１μＭ最終濃度から始まって顕著な効果を示した(６７％±８.３、ｎ＝６)。フォスカーネットまたはホスホノ酢酸などの非特異的リガンドは、１０μＭ濃度において有意のシグナル阻害を生じなかった(それぞれ、１１.７％±４および−２.２％±３３.８、Ｎ＝３)。別の重要な陰性対照はリバビリンであり、その推定される作用機序は直接的なＮＳ５Ｂ阻害に関連しないようであるが(Lohmann V、2000、Maag D、2001)、それは７５μＭ最終濃度において本発明の系に顕著な効果を示さなかった(阻害８.７％±１６.３、ｎ＝６)。
【図５】ＮＳ５Ｂリガンドに対する濃度-応答の関係。ルシフェラーゼ阻害の割合(％)が、増加濃度のｃＶＶＳ０２３４７７またはｃＶＶＳ０２３４７６のいずれか(０〜１００μＭの最終濃度)の存在下において２４時間インキュベートした後の、レポータールシフェラーゼ、ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４融合タンパク質および３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２-ＶＰ１６をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞に対して示されている。得られた曲線は、Michaelis-Mentenモデルに一致する双曲線関係を示した。
【図６Ａ】参照薬物に対する突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体(Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、特異的ＮＳ５Ｂインヒビターを増加濃度で用いて２４時間インキュベートした細胞に対して示される。図６Ａ：ベンゾサイアジアザイド化合物に対する異なる突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性 天然ＮＳ５Ｂあるいはベンゾサイアジアザイド感受性突然変異体Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４２３Ｍ、またはＳ２８２Ｔのいずれかを発現する細胞に対して、ベンゾサイアジアザイド化合物は、ＩＣ50が２〜５μＭで同様のルシフェラーゼ阻害を生じた(ｎ＝２)。他方、同じ化合物は、ベンゾサイアジアザイド耐性突然変異体Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、またはＧ３１６Ｙでトランスフェクトした細胞に対して、顕著なレポーター阻害を示さなかった。
【図６Ｂ】参照薬物に対する突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体(Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、特異的ＮＳ５Ｂインヒビターを増加濃度で用いて２４時間インキュベートした細胞に対して示される。図６Ｂ：インドール化合物に対する異なる突然変異体３Ｄスクリーンの反応性 天然ＮＳ５Ｂあるいはインドール感受性突然変異体のいずれかを発現する細胞に対して、インドール-Ｎ-アセトアミド化合物は、ＩＣ50が０.２〜２μＭで生成したシグナルを阻害したが、インドールに対して耐性であると記載されたＰ４９５Ｌに対しては阻害しなかった(そのＩＣ50は少なくとも１０倍高い)(ｎ＝２)。当業者なら、図６Ａに示されるベンゾチアジアジンに耐性である３種類の突然変異体が、他のインドール感受性突然変異体のようにインドール作用に反応することに気付くであろう。
【図７】アッセイのシグナル窓。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターで一時的にトランスフェクトした。特異的リガンドの存在下または非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示されている。天然ＮＳ５ＢΔ２１および３Ｄセンサー-ＶＰ１６を含まない骨格ベクターでトランスフェクトされた細胞によって放出されるバックグラウンドシグナルは、７１８２ＲＬＵ±６６４３(ｎ＝１７)であり、一方、等価なバックグラウンドシグナルが、３Ｄセンサーの存在下において変性ＮＳ５Ｂ(Labonteら、2002により記載されたＬ３０ＳおよびＬ３０Ａ立体配座不安定化突然変異体)を用いて得られた(それぞれ、７６３６ＲＬＵ±５９３２、ｎ＝５および３１００ＲＬＵ±１６１０、ｎ＝３)。別のバックグラウンドシグナルは、高濃度(毒性濃度ではない)(１００μＭ)の抗ＮＳ５Ｂ ｃＶＶＳ-０２３４７７による最大阻害後に得られる残留ルシフェラーゼ発現とみなすことができる。これは、７８９４７ＲＬＵ±３０７１、ｎ＝７であり、未阻害シグナル(１１５,２７１ＲＬＵ±６０,８００、ｎ＝２２)よりもはるかに低い。異なるバックグラウンドシグナルはむしろ等価であり、算出したシグナル／バックグラウンドは、必要な最少３に対して１６に達した。
【図８Ａ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ａ：シグナル(０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞)のバックグラウンド(１００μＭ最終濃度で参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を添加した後の残留シグナル)に対する比を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で示す。
【図８Ｂ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ｂ：０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞に対して測定した阻害シグナルの変動の係数を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で示す。
【図８Ｃ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ｃ：Ｚ因子を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で算出した。最大シグナルは、０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞に対して測定され、最少シグナルは、５０μＭ最終濃度で参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を添加した後に測定された。
【図９Ａ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図９Ａ：ペプチド模倣薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝３)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの四つに対して、２３より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図９Ｂ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図９Ｂ：参照ペプチド模倣薬物に対する最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ペプチド模倣ＮＳ３特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝３)が、最良のルシフェラーゼ活性化(１０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える四つの３Ｄセンサーに対して示される。３ＤセンサーＶ７-６２を、比較的高いルシフェラーゼ活性化、特異的な抗ＮＳ３による解離に対する比較的良好な応答性および最小のデータ変動のために選択した。
【図１０Ａ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図１０Ａ：ペプチド模倣薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝２)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの８つに対して、１６より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図１０Ｂ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図１０Ｂ：参照ペプチド模倣薬物に対する最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ペプチド模倣ＮＳ３特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝２)が、最良のルシフェラーゼ活性化(１０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える四つの３Ｄセンサーに対して示される。３ＤセンサーＨ５-３４を、比較的高いルシフェラーゼ活性化、特異的な抗ＮＳ３による解離に対する比較的良好な応答性および最小のデータ変動のために選択した。
【図１１】３Ｄスクリーンプラットホームを用いる薬物の選択性決定。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーターおよびＮＳ５ＢまたはＮＳ３標的のそれぞれ(その特異的３Ｄセンサーと一緒に)で一時的にトランスフェクトした。増加濃度の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミド)の添加は、ＮＳ５Ｂプラットホームにおいてのみ、強力な阻害を誘発した。また、特異的ＮＳ３インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８は、有意に標的効果をなくすことなく、ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長プラットホームを阻害した。
【図１２Ａ】ＮＳ３に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化。図１２Ａ：ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化(ｎ＝２)３ＤセンサーＶ７-６２と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼのいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(それは、突然変異形態に対して比較的低いものであるとしても、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の３３倍であり、それに対し、天然のものに対しては８０倍である)。
【図１２Ｂ】ＮＳ３に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化。図１２Ｂ：ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化(ｎ＝２)３ＤセンサーＨ５-３４と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(天然タンパク質に対しては、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の４２倍であり、それに対し、突然変異したものに対しては５６倍である)。
【図１３】ペプチド模倣参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８に対する突然変異３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、選択した３Ｄセンサーおよび天然ＮＳ３または耐性突然変異体(Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、増加濃度の特異的ＮＳ３インヒビターとともに２４時間インキュベートした細胞に対して示される。ペプチド模倣化合物は、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長に対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物は、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかった。
【図１４】ＶＦ-９Ａ１１ペプチドと、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質との異なる変異体の間の相互作用時のルシフェラーゼ活性化。３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と、天然または突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質とのいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた。シグナルは、Ｒ１５５Ｋ突然変異タンパク質を除く全ての試験した変異体に対して、バックグラウンドを超える(３を大きく超える)。
【図１５】３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質突然変異体プロファイリングプラットホームに類似したｃＶＶＳ-０２３５１８ペプチドの耐性プロファイリング。天然３Ｄスクリーンプラットホームは、化合物の阻害に感受性であり、文献にそのように記載されているＤ１６８ＶおよびＲ１０９Ｋも同様である。ｃＶＶＳ-０２３５１８に高耐性であると記載されている突然変異体Ａ１５６ＶおよびＡ１５６Ｔは、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて予測されるプロファイルを示す。また、ペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８に中耐性であることが知られているＡ１５６Ｓ、Ｔ５４Ａ、およびＶ３６Ｍも、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、野生型ＮＳ３と比較してＥＣ50値の中程度の倍数増加を示す。
【図１６】他のアッセイと比較した３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質プラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８の耐性プロファイリング(突然変異体-対-野生型のタンパク質において得られるＥＣ50値の倍数増加として表す)。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームは、Telaprevirに対して酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と同じ範囲の結果を示す。
【図１７】３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質突然変異体プロファイリングプラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３９５１の耐性プロファイリング。この化合物は、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、文献に報告されているものと同じ範囲において活性であり、感受性であると記載されているＡ１５６ＳおよびＶ３６Ｍ変異体においても同様である。高耐性の突然変異体Ａ１５６ＶおよびＤ１６８Ｖは、予測される化合物阻害活性に高耐性を示した。
【図１８】他のアッセイと比較した３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質プラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３９５１の耐性プロファイリング(突然変異体-対-野生型のタンパク質において得られるＥＣ50値の倍数増加として表す)。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームは、Ciluprevirに対して酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と同じ範囲の結果を示す。
【図１９】二つの異なる遺伝子型に由来するＮＳ５Ｂ標的に対するインドール参照薬物への最も強力な３Ｄセンサーの反応性(ｎ＝３)。インドールアセトアミドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７６の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)が、ＮＳ５Ｂ(遺伝子型１ａおよび１ｂ由来)を標的とするＮ２１Ｉ４ペプチドに対して示される。
【発明の具体的説明】
【００１１】
好ましくは、試験化合物は、薬学的に許容しうる小さい有機分子、例えば、２０００ダルトン未満、好ましくは１０００ダルトン未満、より好ましくは８００ダルトン未満、より好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有する分子である。試験化合物は、好ましくは、組合せライブラリーとして合成するのになじみやすい化学群のものである。本発明の方法によって選択される試験化合物には、標的タンパク質を特異的に結合する能力を有するものとして既に同定されている物質に類似しているか、または「リガンド様」である物質、例えば、問題にしているタンパク質の潜在的な薬理学的アゴニスト、アンタゴニスト、コアクチベーター、およびコインヒビターが含まれる。このような「リガンド様」試験化合物は、既知のタンパク質リガンドに対して類似した作用機序および類似した生物学的活性を有することができ、既知のタンパク質リガンドの潜在的な副作用を有する(アゴニストまたはアンタゴニスト)。さらに重要なことには、本発明の方法によって選択される試験化合物には、標的タンパク質を特異的に結合する能力を有するものとして既に同定されている物質に類似していない物質が含まれる。これは、本発明の方法が、天然の立体配座にある結合ペプチドを、先行技術の方法に反して同定したためである。このリガンド様分子ではない後者化合物は、既知のタンパク質リガンドと比較して、異なる生物学的および薬理学的特性を有することが予測される。また、試験化合物は、本発明の方法によって同定された結合ペプチドまたはその変異体、あるいは該結合ペプチドに似た化学分子であってもよい。本発明の試験化合物は、当業者によって知られる異なるイン・ビトロアッセイ、例えば、特許文献国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット(２００６年５月４日公開)の特に実施例４および５に記載されている細胞に基づくアッセイなどによって、化学分子のライブラリーにおいて以前に同定されていてもよい。また、本発明は、本発明の方法によって選択された試験化合物にも関する。
【００１２】
本発明の標的タンパク質は、ウイルス、微生物(細菌、菌類、藻類、および原生動物を含む)、無脊椎動物(昆虫および蠕虫を含む)、動物、特に脊椎動物(特に、哺乳動物、鳥類または魚類、哺乳動物の中では、特に、ヒト、類人猿、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ラマ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ネコ、およびイヌ)の正常または病的細胞、あるいは、植物の正常または病的細胞を含むあらゆる天然供給源からの天然物質またはそのサブユニットもしくはドメインであってよい。また、標的タンパク質は、イン・ビトロで創製または修飾された非天然タンパク質、例えば、突然変異タンパク質、キメラタンパク質、または人工タンパク質であってもよい。標的タンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、または金属タンパク質であってよい。それは、核、細胞質、膜、または分泌タンパク質であってよい。また、本発明の対象は、標的タンパク質が、タンパク質である代わりに、巨大分子の核酸、脂質、または炭水化物であってよいことである。それが核酸である場合、それはリボ核酸またはデオキシリボ核酸であってよく、また、一本鎖または二本鎖であってよい。標的タンパク質は、単一の巨大分子である必要はない。標的タンパク質は、巨大分子のホモまたはヘテロマルチマー(ダイマー、トリマー、テトラマー、・・・)であってよい。さらに、標的タンパク質は、結合パートナー、例えば、タンパク質、オリゴまたはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、あるいは小さい有機または無機分子またはイオンを必要とすることもある。その例には、補因子、リボソーム、ポリソーム、およびクロマチンが含まれる。
【００１３】
標的タンパク質の生物学的活性は、特定の活性、例えば、受容体または酵素活性に限定されない。標的タンパク質の非限定的な例には、核受容体、オーファン核受容体、チロシンキナーゼ受容体、Ｇタンパク質結合受容体、エンドテリン、エリトロポエチン受容体、ＦＡＳリガンド受容体、タンパク質キナーゼ(タンパク質キナーゼＣ、チロシンキナーゼ、セリンキナーゼ、トレオニンキナーゼ、ヌクレオチドキナーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ)、タンパク質ホスファターゼ(セリン／トレオニンホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ピロホスファターゼ)、細胞周期調節剤(サイクリンｃｄｋ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５、Ｐ５３、ＲＢ)、ＧＴＰアーゼ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ｒａｓ、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、イオンチャンネル、シャペロニン(即ち、熱ショックタンパク質)、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ(即ち、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ)、テロメラーゼ、プリマーゼ、ヘリカーゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ(ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リボシルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、・・・)、ヒドロラーゼ、カルボキシラーゼ、イソメラーゼ、グリコシダーゼ、デアミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、セルラーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、リガーゼなどが含まれる。
【００１４】
本発明の標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質、動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択される構造および非構造タンパク質であってよい。好ましい態様において、標的タンパク質はウイルスタンパク質である。該ウイルスタンパク質は、好ましくはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、より好ましくは、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である。好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質はＮＳ５ＢおよびＮＳ３である。従って、本発明は、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から、より好ましくはダイマーＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質、またはＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼタンパク質、またはＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法に関する：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーが多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在が、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在が、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【００１５】
該ウイルスタンパク質は、好ましくはインフルエンザウイルスタンパク質であり、好ましくはノイラミニダーゼ、Ｍ２タンパク質、およびヘマグルチニンの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはレンチウイルスタンパク質、例えばヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)タンパク質であり、逆転写酵素、インテグラーゼ、プロテアーゼ、ＴＡＴ、ＮＥＦ、ＲＥＶ、ＶＩＦ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはヒト呼吸器多核体ウイルスタンパク質であり、好ましくはタンパク質Ｎ、Ｆ、およびＧの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはＢ型肝炎ウイルスタンパク質であり、好ましくはポリメラーゼである。
【００１６】
第２の好ましい態様において、該タンパク質は受容体である。用語「受容体」には、表面および細胞内受容体の両方が含まれる。核受容体が特に重要である(特にヒト核受容体)。核受容体(ＮＲ)はこれまでに記載されている。(ＮＲ)は、リガンド活性化される転写アクチベーターのファミリーである。これらの受容体は、リガンド結合、二量化、トランス活性化、およびＤＮＡ結合のための別個のドメインに組織化されている。ステロイド受容体ファミリーは、グルココルチコイド、電解質コルチコイド、アンドロゲン、プロゲスチン、およびエストロゲンのための受容体から構成される大きいファミリーである。受容体の活性化はリガンド結合時に起こり、この結合が立体配座変化を誘発し、受容体二量化および共活性化タンパク質の結合を可能にする。次いで、これらのコアクチベーター(共活性化物質)は、受容体のＤＮＡへの結合およびその後の標的遺伝子の転写活性化を容易にする。共活性化タンパク質の補充に加えて、リガンドの結合は、受容体を、受容体機能の共抑制物質として働くタンパク質の結合を移しかえるまたは妨げる立体配座に置くものとも考えられる。リガンドが薬理学的アゴニストである場合、新たな立体配座は、生物学的シグナル変換経路の他の成分(例えば、転写因子)と相互作用して、標的組織における生物学的応答を誘導する配座である。リガンドが薬理学的アンタゴニストである場合、新たな立体配座は、受容体が一つまたはそれ以上のアゴニスト(これは、他では該受容体を活性化することができる)によって活性化されることができない配座である。ＮＲの完全ではないリストが国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット(第１４および１５頁、および図１を参照)に記載されている。ＮＲは、好ましくは、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、レチノイン酸受容体アルファ(ＲＡＲα)、レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(ＰＰＡＲ)、肝臓Ｘ受容体アルファ(ＬＸＲα)の中から選択される。
【００１７】
好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質および標的タンパク質の変異体は、天然の立体配座にある。好ましくは、本発明の方法の工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)を、天然の立体配座にある標的タンパク質および標的タンパク質の変異体を用いて行う。天然の立体配座とは、タンパク質が、その天然リガンドにリガンド化されていないことを意味する。リガンドは、標的タンパク質に結合し、従ってアゴニストおよびアンタゴニストの両方を包含する物質である。しかし、標的タンパク質を結合するが、受容体をアゴナイズもアンタゴナイズもしないリガンドが存在する。天然のリガンドは、天然において、ヒト介入なしに、天然の標的タンパク質のアゴナイズまたはアンタゴナイズまたは結合の原因であるリガンドである。リガンド化されていない状態にある標的タンパク質は、特定の立体配座、即ち、特定の３Ｄ構造を有する。タンパク質がリガンドに複合化した場合に、該タンパク質の立体配座が変化する。
【００１８】
本明細書中で使用する用語「変異体」は、用語「修飾した」、「突然変異した」、「多型」「遺伝子型」、準種または「突然変異体」を包含し、これらの用語は置換可能である。用語「変異体」は、参照の遺伝子または遺伝子産物(即ち、標的タンパク質)と比較した場合に、配列および／または機能特性における修飾(即ち、変化した特徴)を表す遺伝子または遺伝子産物(即ち、標的タンパク質)を指す(通常、参照の遺伝子または遺伝子産物は、野生型の遺伝子または遺伝子産物である)。用語「野生型」は、天然供給源から単離した場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子は、集団の中で最も多く観察される遺伝子であり、従って、任意に「正常」または「野生型」形態の遺伝子と称される。天然の変異体を単離することができ、これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、変化した特徴を有することによって同定されることが特記される。
【００１９】
本発明によれば、標的タンパク質の変異体には、該標的タンパク質の突然変異体が含まれる。突然変異の非限定的な例は、点突然変異、欠失、挿入、転座、ミスセンス突然変異などである。通常、突然変異は、標的タンパク質をコードしている遺伝子のコード配列を変化させ、該標的タンパク質の機能特性を変化させる。
【００２０】
別の態様によれば、標的タンパク質の変異体は、該標的タンパク質の天然多型である。通常、多型は、該タンパク質の機能特性に有意に影響しない、該タンパク質をコードしている遺伝子の配列における一つまたはいくつかの修飾である(即ち、突然変異のような多型は、遺伝性であるが、必ずしも標的タンパク質の機能特性に有害ではない)。遺伝子および遺伝子産物における多型は、全ヒト集団において起こりうる。従って、本発明は、標的タンパク質(即ち、ヒト核受容体、・・・)に対して活性な薬物候補が、該標的タンパク質の多型に対して活性であるか否かを決定することを可能にする。
【００２１】
同様に、本発明の方法は、あるウイルス株の標的タンパク質(例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１のノイラミニダーゼまたはＨＣＶ遺伝子型１のＮＳ５Ｂポリメラーゼ)に対して活性な薬物候補が、別のウイルス株の相同タンパク質(即ち、インフルエンザウイルス株Ｈ３Ｎ２のノイラミニダーゼまたはＨＣＶ遺伝子型２のＮＳ５Ｂポリメラーゼ)に対して活性であるか否かを決定することを可能にする。本発明は、あるＨＣＶ遺伝子型から同定されたＨＣＶ ＮＳ５ＢポリメラーゼまたはＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼに対する薬物候補が、それぞれ、他のＨＣＶ遺伝子型からのＨＣＶ ＮＳ５ＢポリメラーゼまたはＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼに対しても活性であるか否かを決定するのに特に有用であろう。
【００２２】
別の態様によれば、標的タンパク質の変異体は、該標的タンパク質との配列相同性または構造相同性を有するタンパク質である。ここに非限定的な例を挙げると、標的タンパク質がＨＣＶからのプロテアーゼである場合、該標的タンパク質の変異体は、該ＨＣＶプロテアーゼとの配列相同性または構造相同性を有するヒト細胞プロテアーゼであってよい。したがって、本発明は、ウイルスプロテアーゼに対する薬物候補が、ヒト細胞プロテアーゼに対しても活性であるか否かを決定するのに特に有用であろう。これは、薬物候補の潜在的な毒性および副作用を評価するのに特に重要であろう。したがって、本発明の方法は、薬物候補の毒性を予測するのに有用である。
【００２３】
好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質は、配列番号１でコードされるかまたは配列番号５１に供されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質(遺伝子型１ｂ)の野生型配列である。該標的タンパク質(即ち、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質)の変異体の非限定的な例は、Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、Ｃ３１６Ｙ、Ｙ４４８Ｈ、Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４１９Ｍ、Ｍ４２３Ｔ、Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、Ｎ１４２Ｔ、Ｇ１５２Ｅ、Ｐ１５６Ｌである(配列番号５１の第２アミノ酸が、これらの参照突然変異の第１位と考えられる)。第２の好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質は、配列番号２でコードされるかまたは配列番号５２に供されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質の野生型配列である。Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質の変異体の非限定的な例は、Ａ１５６Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｄ１６８Ａ／Ｖ、Ｖ１０７Ａ、Ｒ１５５Ｋ、Ｔ５４Ａ、Ｖ３６Ｍ、Ｖ３６Ｍ／Ａ１５６Ｔ、Ｖ３６Ａ／Ａ１５６、Ｖ３６Ｍ／Ｒ１５５Ｋ、Ｖ３６Ｔ／Ｔ５４、Ｖ３６Ｍ／Ｔ５４Ａ、Ａ１５６Ｖ／Ｒ１５５Ｋである(配列番号５２の第３アミノ酸が、これらの参照突然変異の第１位と考えられる)。呼吸器多核体ウイルスＮタンパク質(配列番号５３および５４を参照)の変異体の非限定的な例は、Ｎ１０５Ｄ、Ｉ１２９Ｌ、Ｌ１３９Ｉ、およびＩ１２９Ｌ＋Ｌ１３９Ｉである。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの変異体の非限定的な例は、Ｒ２９２Ｋ、Ｄ１５１Ｅ、Ｒ１５２Ｋ、Ｒ３７１Ｋ、Ｒ２２４Ｋ、Ｅ１１９Ｇ、およびＤ１９８Ｎである(配列番号５５および５６を参照)。ＨＩＶプロテアーゼの変異体の非限定的な例は、Ｌ１０Ｖ、Ｉ１３Ｖ、Ｅ３５Ｇ、Ｍ３６ＩおよびＨ６９Ｋである(配列番号５７および５８を参照)。ＨＩＶ逆転写酵素の変異体の非限定的な例は、Ｖ１７９Ｅ、Ｔ６９Ｓ、およびＭ１８４Ｖである(参照配列として、GenBankアクセッション番号AAO84275、GL37934320、アクセッションAY237815.1を参照)。
【００２４】
上記した薬物耐性突然変異の命名法は、元の推定アミノ酸(コンセンサス配列中に挙げたもの)、次いでその位置に関するコドン番号、次いで突然変異によって導かれたアミノ酸(これは、抗ウイルス剤に対する感受性の減少を与える)を挙げるものである。この元の推定アミノ酸は、コンセンサス配列中に挙げたものとは異なることもある(配列を患者の血清から導いた場合、抗ウイルス薬に対する標的の活性および感受性に有意に影響することはない)。
【００２５】
タンパク質中に突然変異を導入する手法は、当業者には周知であり、生物学的、物理的、または化学的手段のいずれかによって行うことができる。
【００２６】
既知のタンパク質リガンドは、標的タンパク質のためのリガンドであることが知られている物質である。本発明の既知タンパク質リガンドは、タンパク質に結合した場合に、該タンパク質の立体配座を変えることができる。通常、この既知タンパク質リガンドは、標的タンパク質が由来する器官の一つまたはそれ以上の標的組織における該標的タンパク質の薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストである。しかし、既知のタンパク質リガンドは、標的タンパク質のアゴニストでもアンタゴニストでもないこともある。例えば、それは標的タンパク質の基質であってよい(標的タンパク質が酵素である場合)。既知のタンパク質リガンドは、タンパク質の天然リガンドであってよいが、それである必要はない。本発明の既知タンパク質リガンドは、既知の標的タンパク質アゴニストおよび既知の標的タンパク質アンタゴニストの中から選択される。既知のリガンドは、工程Ｂの細胞に、内生的にまたは好ましくは外生的に添加する。
【００２７】
好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である：
(ａ)ＮＳ３-４Ａセリンプロテアーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、ピロリジン-５,５-トランスラクタム、２,４,６-トリヒドロキシ-３-ニトロ-ベンズアミドの誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ＢＩＬＮ２０６１[Ciluprevir(または本発明においてはｃＶＶＳ０２３９５１)とも称される]、ＩＴＭＮ１９１、ＴＭＣ４３５３５０、ＳＣＨ５０３０３４、およびＶＸ９５０(Telaprevirまたは本発明においてはｃＶＶＳ２３５１８とも称される)の中から選択され、
(ｂ)ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、２,３,５-トリ置換-１,２,４-チアジアゾール-２-イウム塩、ヘテロ環式カルボキサミド、およびベンゾトリアゾールの中から選択され、
(ｃ)ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン、１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド、ＨＣＶ７９６、ＧＳ９１９０、ＭＫ３２８１、およびＶＣＨ７５９の中から選択され、
(ｄ)他のＣ型肝炎ウイルスタンパク質、この場合、既知のタンパク質リガンドは、リバビリン、レボビリン、ビラミジン、メリムポジブ、サイモシンアルファ１、アマンタジンの中から選択される。
【００２８】
上で参照したＨＣＶタンパク質リガンドに関して、その構造は当業者に周知である。例えば：
−ＢＩＬＮ２０６１インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：(１Ｓ、４Ｒ、６Ｓ、７Ｚ、１４Ｓ、１８Ｒ)-１４-シクロペンチルオキシカルボニルアミノ-１８-[２-(２-イソプロピルアミノ-チアゾール-４-イル)-７-メトキシキノリン-４-イルオキシ]-２,１５-ジオキソ-３,１６-ジアザトリシクロ[１４.３.０.０４.６]ノナデカ-７-エン-４-カルボン酸(Lamarreら、2003)、
−ＳＣＨ５０３０３４インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：(１Ｒ,５Ｓ)-Ｎ-[３-アミノ-１-(シクロブチルメチル)-２,３-ジオキソプロピル]-３-[２(Ｓ)-[[[(１,１-ジメチルエチル)アミノ]カルボニル]アミノ]-３,３-ジメチル-１-オキソブチル]-６,６-ジメチル-３-アザビシクロ[３.１.０]ヘキサン-２(Ｓ)-カルボキサミド(Srikanth Venkatramanら、2006)、
−ＶＣＨ-７５９インヒビターは、文献(Beaulieu P.L.ら、2007、第621頁、図9)に示されている構造を有する化合物に対応する、
−以下の構造：
【化１】
を有するＭＫ０６０８インヒビター(７-デアザ-２'-Ｃ-メチル-アデノシン)も引用することができる(Beaulieuら、2007、第616頁、図4を参照)、
−ＴＭＣ４３５３５０インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：Ｎ-[１７-[２-(４-イソプロピルチアゾール-２-イル)-７-メトキシ-８-メチルキノリン-４-イルオキシ]-１３-メチル-２,１４-ジオキソ-３,１３-ジアザトリシクロ[１３.３.０.０４,６]オクタデカ-７-エン-４-カルボニル](シクロプロピル)スルホンアミド、これは、文献(Simmen K.ら、2007、図1)、「Ｃ型肝炎に関する第１４回国際シンポジウム(14th international symposium on hepatitis C)、Glasgow、2007年9月」において開示されたＰ-２４８ポスター(図１)にも示されている、
−ＩＴＭＮ１９１インヒビターは、以下の構造：
【化２】
を有する化合物に対応する、これは、文献(Mannsら、2007)にも示され (表１、第996頁、参照85)、および
−ＧＳ９１９０インヒビター(Gileadから)(Sheldon J.ら、2007、Expert Opinion on Investigational Drugs、第16巻、第8号、第1171-1181頁を参照)、
−ＨＣＶ７９６インヒビター：
【化３】
【００２９】
別の好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるインフルエンザウイルスのウイルスタンパク質である：
(ａ)ノイラミニダーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、ザナミビルおよびオセルタミビルの中から選択され、および
(ｂ)Ｍ２タンパク質、この場合、既知のタンパク質リガンドは、アマンタジンおよびリマンタジンの中から選択される。
【００３０】
別の好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるＨＩＶウイルスタンパク質である：
(ａ)ウイルスプロテアーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、アムプレナビル、インジナビル、サキナビル、ロピナビル、フォサムプレナビル、リトナビル、アタザナビル、ネルフィナビルの中から選択され、および
(ｂ)逆転写酵素、この場合、既知のタンパク質は、ラミブジン、ザルシタビン、デラビルジン、ジドブリン、エファビレンツ、ジダノシン、ネビラピン、フマル酸テノホビルジソプロキシル、アバカビル、スタブジンの中から選択される。
【００３１】
好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択される核受容体である：
(ａ)エストロゲン受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ゲニステイン、タモキシフェン、ＩＣＩ１８２７８０(Faslodex)、ラロキシフェンの中から選択することができ、および
(ｂ)アンドロゲン受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、テストステロン、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸シプロテロン、ミフェプリストン、デヒドロエピアンドロステロン、フルタミドの中から選択することができる、および
(ｃ)グルココルチコイド受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、デキサメタゾン、酢酸メドロキシプロゲステロン、コルチバゾール、デオキシコルチコステロン、ミフェプリストン、プロピオン酸フルチカゾン、デキサメタゾンの中から選択することができる、および
(ｄ)ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(ＰＰＡＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、グリタゾン類、例えばトログリタゾンの中から選択することができる、および
(ｅ)肝臓Ｘ受容体アルファ(ＬＸＲα)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、Ｔ１３１７(Tularik)であってよい、および
(ｆ)レチノイン酸受容体(ＲＡＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、全-trans-レチノイン酸、９-cis-レチノイン酸の中から選択することができる、および
(ｇ)レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、全-trans-レチノイン酸、９-cis-レチノイン酸の中から選択することができる。
【００３２】
本発明の結合ペプチドを選択する方法における主な制限は、立体配座感受性の結合ペプチドを同定するための既知のリガンド(即ち、薬物)の利用可能性である。例えば、ウイルスの分野において、ウイルス標的タンパク質に結合する抗ウイルス薬物が知られていない場合も多い(即ち、呼吸器多核体ウイルス)。しかし、ウイルスは、その複製のために細胞装置を使用している細胞内寄生体であるので、ウイルスタンパク質は、宿主細胞のタンパク質または分子(ＡＴＰ、ｔＲＮＡ、リボソーム、細胞酵素、・・・)と相互作用している。非常に多くのウイルスタンパク質と、宿主細胞のそれらとの相互作用が、科学文献に報告されている(Tellinghuisen & Rice Curr Opin Microbiol.、2002、5：419-427、ＨＩＶ-１、ヒトタンパク質相互作用データベース、National Institute of Allergy & Infectious Diseases、Loら、J Virol.、1996年8月、70(8)：5177-82)。本発明の別の態様によれば、標的タンパク質に結合するリガンド(即ち、薬理学的アゴニストまたはアンタゴニスト)が知られていない場合には、標的タンパク質と相互作用する細胞またはウイルスタンパク質のいずれかを、立体配座感受性の結合ペプチドを同定する代わりに使用することもできる。標的タンパク質と相互作用するペプチドが同定された場合には、該標的タンパク質と相互作用する該タンパク質をコードする発現ベクターを、標的タンパク質をコードする発現ベクターおよびペプチドライブラリーをコードする発現ベクターを用いて既に修飾した酵母中に導入する。タンパク質／タンパク質相互作用によってブロックされるペプチド(標的の立体配座修飾によるか、または立体障害による標的タンパク質上の認識部位の接近不可能性による)が同定されるであろう。
【００３３】
従って、本発明は、天然の立体配座にある標的タンパク質を結合する結合ペプチドを選択する方法(本発明の工程ＡおよびＢ)であって、以下の工程を含んでなる方法にも関する：
(ａ)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(ｂ)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
(ｃ)(ｂ)で選択したペプチドを、該標的タンパク質と相互作用することが知られている一つのタンパク質の存在下に、該タンパク質に結合する能力についてスクリーニングする工程、および
(ｄ)標的タンパク質と相互作用することが知られている該タンパク質の存在下において該標的タンパク質に結合する能力の減少または非存在を有し、かつ、標的タンパク質と相互作用することが知られている該タンパク質の存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力の保存を有する、(ｃ)でスクリーニングしたペプチドを選択する工程。
【００３４】
標的タンパク質と相互作用するタンパク質が知られていない場合、当業者は、標的タンパク質と相互作用することができるタンパク質を同定する方法を知っている。酵母２-ハイブリッドが、タンパク質-タンパク質相互作用を同定するための有効な手法である。例えば、標的タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを、関心あるヒト細胞からのｃＤＮＡライブラリーの酵母２-ハイブリッドスクリーニングによって単離することができる。ヒトｃＤＮＡライブラリーは、市販品から入手するか、または構築しなければならないであろう。
【００３５】
本明細書において、用語「結合する」または「結合」は、ペプチドと標的タンパク質とが、意図するアッセイを行いうるよう十分に、互いに相互作用、結合、連結、または会合することを意味する。本明細書において、用語「特異的な」または「特異的に」は、ペプチドと標的タンパク質とが互いに選択的に結合し、対象成分への結合が意図されていない他の成分には通常は結合しないことを意味する。特異的な相互作用を達成するのに必要なパラメーターは、定型的に、例えば当分野における常法を用いて決定することができる。
【００３６】
一般に、用語「ライブラリー」は、起源、構造、および／または機能において関連し、かつ、関心ある特性について同時にスクリーニングすることができる化学的または生物学的実体の集団を表す。用語「組合せライブラリー」は、個々の構成要素が、限定された一組の基本要素の体系的またはランダムな組合せのいずれかであるライブラリーを表す(各構成要素の特性は、それに導入される要素の選択および位置に依存する)。通常、ライブラリーの構成要素は、少なくとも同時にスクリーニングすることができる。ランダム化は、完全または部分的であってよい。即ち、一部の位置がランダム化され、他の位置が予め決められていてよく、ランダム位置においては、その選択が予め決めた様式で限定されていてよい。組合せライブラリーの構成要素は、ある種のオリゴマーまたはポリマーであってよく、この際、その変動は、オリゴマーまたはポリマーの一つまたはそれ以上の位置におけるモノマー構成要素の選択によって生じ、また恐らくは、その連結結合あるいはオリゴマーまたはポリマーの長さの点でも生じる。あるいは、該構成要素は、標準コア構造を有する非オリゴマー分子であってよく、この際、その変動は、該コア構造上の特定の変動部位における置換基の選択によって導入される。あるいは、該構成要素は、ジグソーパズルのように組立てた非オリゴマー分子であってよいが、この際、各ピースは、一つまたはそれ以上の可変部分(ライブラリー多様性に寄与する)および一つまたはそれ以上の一定部分(当該ピースが他のピースに結合するための機能性を供する)の両方を有する。
【００３７】
「単純な組合せライブラリー」においては、全ての構成要素が、同じクラスの化合物(例えば、ペプチド)に属しており、同時に合成することができる。「複合組合せライブラリー」は、二つまたはそれ以上の単純なライブラリーの混合物、例えば、ＤＮＡとペプチドまたは化学的化合物である。好ましくは、組合せライブラリーは、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１,０００、なおより好ましくは少なくとも１０,０００、さらにより好ましくは少なくとも１００,０００、最も好ましくは少なくとも１,０００,０００個の異なる分子の多様性を有するであろう。本発明のペプチドライブラリーは組合せライブラリーである。このライブラリーの構成要素は、ペプチド結合によって連結した少なくとも３個のアミノ酸を有するペプチドである。好ましくは、これらは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸の長さである。好ましくは、これらは、５０未満、好ましくは２５未満、より好ましくは１５個未満のアミノ酸から構成される。ペプチドは、直鎖、分岐鎖または環式であってよく、非ペプチジル部分を含んでいてもよい。アミノ酸は、天然のアミノ酸に限定されない。
【００３８】
本発明の細胞は、天然または非天然に、機能的に、適する標的タンパク質を発現する細胞である。好ましくは、細胞は真核細胞である。細胞は、単細胞生物、多細胞生物または中間形態(粘菌)に由来するものであってよい。多細胞生物に由来する場合、それは、無脊椎動物、下等脊椎動物(爬虫類、魚類、両生類)、高等脊椎動物(鳥類、哺乳動物)、または植物であってよい。好ましい態様によれば、本発明の方法の工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)の細胞は、完全な多細胞生物または生物の組織もしくは器官に組込まれていない細胞、好ましくは単離した細胞である。
【００３９】
好ましい態様によれば、結合ペプチドの選択に使用する細胞(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)は、非哺乳動物の真核細胞、好ましくは酵母細胞である。好ましくは、酵母細胞は、以下の属のいずれかのものである：サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、ピチア(Pichia)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、クリプロコッカス(Cryptococcus)、ヤロウイア(Yarrowia)、およびザイゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)。より好ましくは、これらは、Saccharomyces cerevisiae種のものである。興味ある他の非哺乳動物細胞には、植物細胞(例えば、シロイヌナズナ)、節足動物細胞、環形動物、または線虫細胞(例えば、線虫（Caenorhabditis elegans）、プラナリア、ヒル、ミミズ、環形動物多毛類)、甲殻類(例えば、ミジンコ)、原生動物細胞(例えば、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）)、および下等脊椎動物(爬虫類、両生類、魚類)細胞が含まれる。
【００４０】
好ましい態様によれば、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、動物またはヒト起源の哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の非限定的な例は、ヒト一次細胞、ヒト胚細胞、ヒト細胞系統である。好ましい態様において、ヒト細胞は継続ヒト細胞系統であり、ヒト細胞系統の非限定的な例には、Ｈｅｌａ、Ｈｕｈ７、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、ＨＥＫ-２９３、ＭＣＦ７が含まれる。また、該ヒト細胞は、胚細胞、好ましくは、全能性細胞(即ち、胚幹細胞、ＥＳ細胞)、多能性、複能性、および単能性細胞の中から選択される胚細胞である。特定の態様において、細胞はヒトＥＳ細胞であり、標的タンパク質は、ＥＳ細胞からヒト分化細胞への分化経路の制御に関与している重要タンパク質である。第２の態様において、該細胞は、動物細胞、例えば、動物一次細胞、動物胚細胞、および動物細胞系統の中から選択される。動物細胞系統の非限定的な例には、ＶＥＲＯ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、および３Ｔ３が含まれる。標的タンパク質がＣ型またはＢ型肝炎ウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトの肝細胞または肝細胞系統である。肝細胞系統の非限定的な例は、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐａＲＧである。標的タンパク質がＨＩＶウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトのリンパ球またはリンパ芽球様細胞系統、例えばＨＬ６０、Ｕ９３７、ＴＦ-１、Ｋ５６２、およびＩＭ-９である。標的タンパク質がインフルエンザまたはＲＳＶウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトの上皮細胞系統である。肺細胞系統の非限定的な例は、Ａ５４９およびＨＥｐ-２である。
【００４１】
結合ペプチドの選択に使用する各細胞(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)は、
−該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分および
−該ペプチドの組合せライブラリーの一つの構成要素、
を同時発現し、
各細胞は、該ライブラリーの該構成要素が、該細胞中または該細胞上で該標的タンパク質または部分を結合したか否かの指標であるシグナルを生成するように、該標的タンパク質もしくは標的タンパク質の変異体または部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供する。
【００４２】
好ましくは、レポーター遺伝子発現によって生成する該シグナルは、測定可能な定量性シグナルである。
【００４３】
好ましくは、測定される該シグナルの合計量は、標的タンパク質またはその変異体に特異的に結合したペプチドの数に比例し、結合の増加、保存、減少、または非存在の尺度を与える(対照または参照試料と比較して)。
【００４４】
該ペプチドが該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合した場合にシグナルが生成する。該シグナルは、該ペプチドが、該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体に結合する能力が減少するまたはそれに結合することができず、該標的タンパク質に対する既知のリガンドにリガンド化される場合に、減少するかまたは非存在である。
【００４５】
試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、
(ａ)該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分、および
(ｂ)工程(Ｂ)で選択され、既知のリガンドの非存在下において該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合することができる該ペプチド、
を同時発現し、
該細胞が、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供し、それにより、
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、それにより、該ペプチドが工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞中または細胞上で該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体または部分を結合すること、ならびに、該試験化合物が該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾しないことの指標であるシグナルを生成する、あるいは
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合の減少または非存在が、機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を可能にせず、それにより、該試験化合物が該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾することの指標であるシグナルを生成しない。
【００４６】
本発明の方法のシグナル生成系は、細胞にとって内生的なシグナル生成系および細胞にとって外生的なシグナル生成系の中から選択される。好ましくは、該シグナル生成系は、細胞にとって内生的である。シグナル生成系は、キメラタンパク質を供給するための標的タンパク質または部分に融合させたタンパク質結合した成分ならびにキメラペプチドを供給するためのペプチドに融合させたペプチド結合した成分を含んでなり、これにより、ペプチド結合およびタンパク質結合した成分が、ペプチドの標的タンパク質への結合の結果として物理的に接近することになった場合に、シグナルを生成する。該成分はＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)であり、別の該成分は相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)であり、シグナル生成系は、該ＤＮＡ結合ドメインによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子をさらに含み、ペプチドの標的タンパク質への結合は、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与える。
【００４７】
本発明のシグナル生成系は、
(i)キメラペプチドを供給するためのペプチドに融合させた相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)、該ＡＤは、好ましくは、大腸菌Ｂ４２、Ｇａｌ４活性化ドメインII、およびＨＳＶ ＶＰ１６からなる群から選択され、
(ii)キメラタンパク質を供給するための標的タンパク質に融合させたＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、該ＤＢＤは、好ましくは、Ｇａｌ４およびＬｅｘＡからなる群から選択され、ならびに
(iii)該ＤＢＤによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子を含むシグナル生成系
を含んでなり、これにより、該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、これにより、該ペプチドの、該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体またはそのリガンド結合タンパク質部分への結合の指標であるシグナルが、工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、または(Ｄ)において使用する細胞中または細胞上に生成する。
【００４８】
検出を行うために当業者が適応させて普通に使用する手段(即ち、ヒトの眼、分光光度計など)によってシグナルが検出可能である場合に、シグナルは「生成する」。結合が非存在であったことを示すのは、当業者がレポーター遺伝子発現の検出に普通に使用する手段によってシグナルが検出されなかった場合である。結合が減少したことを示すのは、レポーター遺伝子発現によって生成するシグナルの減少が、特異的な結合が起こった場合に生成するシグナルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である場合である。
【００４９】
シグナルが、問題にしている細胞の死または生存である場合には、このアッセイは選択であると言われる。シグナルが、単に検出可能な表現型(これにより、シグナル発信細胞が同じ細胞から非シグナル発信状態に分化することができる)になる場合には、このアッセイはスクリーニングである。しかし、本発明における用語「スクリーニング」は、選択を含む広い意味で使用することができる。本発明によれば、「レポーター遺伝子」は、一つの細胞における遺伝子の発現が、大きい細胞集団における該細胞の検出を可能にする遺伝子を意味する(即ち、該レポーター遺伝子を発現しているかまたは発現していない細胞の区別を可能にする)。本発明のレポーター遺伝子には、検出可能な表現型レポーター遺伝子および耐性選択遺伝子が含まれる。耐性選択遺伝子の非限定的な例には、以下の酵母遺伝子が含まれる：３-イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(ＬＥＵ２)、ホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ(ＴＲＰ１)、イミダゾール-グリセロール-ホスフェートデヒドラターゼ(ＨＩＳ３)、オロチジン-５'-ホスフェート(ＯＭＰ)デカルボキシラーゼ(ＵＲＡ３)、および抗生物質耐性遺伝子。抗生物質の中では、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ゲネチシン、プロマイシン、ブラスチシジンを挙げることができる。抗生物質耐性遺伝子は、当業者にとって周知である。例えば、ネオマイシン遺伝子は、細胞培養培地に添加したＧ４１８抗生物質に対する耐性を有する細胞を与える。また、検出可能な表現型レポーター遺伝子の非限定的な例には、以下の遺伝子が含まれる：ＤＨＦＲ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アデニル酸シクラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ-ガラクトシダーゼ、および自己-蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ならびにその全ての変異体および誘導化蛍光タンパク質)。シグナル生成系は、レポーター遺伝子の他に、シグナルの生成において協力する追加の遺伝子または生化学要素を含むことができる。このような要素は、例えば、酵素であるレポーター遺伝子の基質であることができる。
【００５０】
一つを超えるシグナル生成系が存在することができ、該系は一つを超えるレポーター遺伝子を含むことができる。
【００５１】
好ましい態様によれば、結合ペプチドを選択する方法(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)を、酵母細胞において行い、シグナル生成系は、少なくとも二つのレポーター遺伝子を直列して含み、一つの耐性選択遺伝子を、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３の中から選択し、一つのレポーター遺伝子を、ルシフェラーゼ、自己-蛍光タンパク質、およびベータ-ガラクトシダーゼの中から選択する。別の好ましい態様において、本発明の試験化合物を選択する方法(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)を、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において行い、シグナル生成系は、ルシフェラーゼ、自己-蛍光タンパク質およびベータ-ガラクトシダーゼの中から選択される少なくとも一つのレポーター遺伝子を含んでいる。試験化合物は、内生的に、または好ましくは、工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞に外生的に添加する。
【００５２】
本発明は、候補薬物が標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に対して活性であるか否かを予測するために、ならびに、最も広い作用範囲を有する薬物候補を選択するために有用である。
【００５３】
また、本発明は、本発明の方法によって選択した試験化合物にも関する。本発明の選択した試験化合物を、アッセイのヒットとして、薬物開発のための新たな候補分子を構成するヒットの同定のために使用することができる。また、本発明は、標的タンパク質の野生型、標的タンパク質の多型、標的タンパク質の耐性突然変異体に対して広い作用スペクトルを有する薬物として、特に、疾患、例えば、限定することなく例としてヒトおよび動物のウイルス疾患ならびにヒトおよび動物の癌の予防および治療処置のために、本発明の選択した試験化合物を使用することにも関する。
【００５４】
また、本発明は、
・ＤＧＣＡＲＣＶＡＳＶＱＬＹＧＤ （配列番号５９）、
・ＷＲＰＹＹＴＶＬＣＡＬＡＳＷＨ （配列番号６０）、
・ＰＳＮＨＲＱＳＴＲＳＴＰＷＬＷ （配列番号６１）、
・ＹＣＣＰＷＮＫＬＲＬＶＦＱＳ （配列番号６２）、
・ＴＨＬＶＬＣＤＡＲＴＣＬＮＹＶ （配列番号６３）、
・ＧＴＱＫＥＡＶＩＹＰＣＹＶＰＷ （配列番号６４）、
・ＶＮＡＷＡＷＧＷ （配列番号６５）、
・ＴＬＰＩＧＴＫＡＤＦＬＷＬＰＦ （配列番号６６）、
・ＬＬＧＰＹＰＮＬＴＴＬＣＰＰＷ （配列番号６７）、および
・ＬＬＨＬＬＡＨＨＬＲＨＩＡＲＡ （配列番号６８）、
からなる群から選択される単離したペプチドあるいは該ペプチドを含んでなる組換えベクターまたは宿主細胞にも関する。
【００５５】
また、本発明は、本発明に従ってＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するための方法であって、ペプチド：
−ＤＧＣＡＲＣＶＡＳＶＱＬＹＧＤ（配列番号５９）またはＹＣＣＰＷＮＫＬＲＬＶＦＱＳ（配列番号６２）：これは標的タンパク質がＨＣＶ ＮＳ５Ｂである場合、
−ＷＲＰＹＹＴＶＬＣＡＬＡＳＷＨ（配列番号６０）またはＴＨＬＶＬＣＤＡＲＴＣＬＮＹＶ（配列番号６３）：これは標的タンパク質がＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼである場合、および
−ＰＳＮＨＲＱＳＴＲＳＴＰＷＬＷ（配列番号６１）、ＧＴＱＫＥＡＶＩＹＰＣＹＶＰＷ（配列番号６４）、ＶＮＡＷＡＷＧＷ（配列番号６５）、ＴＬＰＩＧＴＫＡＤＦＬＷＬＰＦ（配列番号６６）、ＬＬＧＰＹＰＮＬＴＴＬＣＰＰＷ（配列番号６７）またはＬＬＨＬＬＡＨＨＬＲＨＩＡＲＡ（配列番号６８）：これは標的タンパク質がＨＣＶ完全長ＮＳ３である場合、
の結合を減少させる能力について、該試験化合物を試験する工程を含んでなることを特徴とする方法にも関する。
【実施例】
【００５６】
実施例１：原材料
１.１．化学物質：
エストラジオール、リバビリン、ホスホノ酢酸、およびフォスカーネットは、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３４７７(Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン)は、Pratt JK (2005)に記載されているように合成した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３４７６(１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド)は、Harper S (2005)に記載されているように合成した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３５１８(２-(２-{２-シクロヘキシル-２-[(ピラジン-２-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-３,３-ジメチル-ブチリル)-オクタヒドロ-シクロペンタ[ｃ]ピロール-１-カルボン酸(１-シクロプロピルアミノオキサリル-ブチル)-アミド)[これは、TelaprevirＲまたはＶＸ-９５０(Vertex Pharmaceuticals Inc.)とも称される]は、国際公開第０２／１８３Ａ２号(Babine R、2002)に記載されているように合成した。
Ｘ-Ｇａｌ(５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド)は、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した。
【００５７】
以下の実施例において表示および使用した立体配座感受性ペプチド(３Ｄセンサー)のアミノ酸配列：
【表１】
【００５８】
１.２．緩衝液：
溶解緩衝液：トリス-リン酸ｐＨ７.８(２５ｍＭ)＋ＥＤＴＡ(２ｍＭ)＋ＤＴＴ(１ｍＭ)＋グリセロール(１０％)＋トリトン(１％)。
ルシフェリン緩衝液：トリス-リン酸ｐＨ７.８(２０ｍＭ)＋ＤＴＴ(５００ｍＭ)＋ＭｇＣｌ2(１.０７ｍＭ)＋ＭｇＳＯ4(２.７ｍＭ)＋ＥＤＴＡ(０.１ｍＭ)＋ＡＴＰ(０.５３ｍＭ)＋アセチル補酵素Ａ(０.２７ｍＭ)＋ルシフェリン(０.４７ｍＭ)。
全ての成分をSigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した、ただし、ルシフェリンはPromega(Charbonnieres、仏国)から購入した。
Ｘ-Ｇａｌ溶液：１０ｍｌの０.５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4＋ＮａＨ2ＰＯ4＋５０μｌの２０％ＳＤＳ＋１００μｌの２％Ｘ-Ｇａｌ(ＤＭＦ中)。
【００５９】
１.３．ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、Invitrogen(Cergy Pontoise、仏国)から入手した。
【００６０】
１.４．酵素：
制限および連結酵素は、Promega(Charbonnieres、仏国)から購入し、製造元の推奨に従って使用した。ＰＣＲは、製造元の指示に従ってUptithermポリメラーゼを用いて行った(Interchim、Montlucon、仏国)。
【００６１】
１.５．酵母株および培養条件：
Saccharomyces cerevisiae酵母株Ｌ４０(MATa、his3-Δ200、Ieu2-3,112、trp1-901、[plexAop]4::HIS3、[plexAop]8::lacZ))(ATCC、Molsheim、仏国)は、液体(激しい震盪を伴う)または固体ＹＰＤもしくはＳＤ培地(アミノ酸を補足する)のいずれかにおいて３０℃で培養した。ＹＰＤ培地は、以下のように構成されていた：バクト-酵母抽出物１％、バクト-ペプトン２％、グルコース２％(バクト-寒天２％を含むかまたは含まない)(Difcoから購入)。ＳＤ培地は、以下のように構成されていた：酵母窒素ベース(アミノ酸を含まない)０.６７％、グルコース２％(バクト-寒天２％を含むかまたは含まない)(Difco、パリ、仏国から購入)。アミノ酸は、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入し、以下のように添加した：硫酸アデニン(２０ｍｇ/ｌ ＳＤ)、Ｌ-トリプトファン(５０ｍｇ／ｌ ＳＤ)、Ｌ-ヒスチジン(５０ｍｇ／ｌ ＳＤ、Ｌ-ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン(それぞれ６０ｍｇ／ｌ ＳＤ)。
【００６２】
実施例２：組換えプラスミド
２.１．酵母発現プラスミド
ｐＶＶＳ４６８は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢΔ２１の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel & Fields、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢＤ２１の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ５Ｂ完全長を保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：
順方向プライマー：
5' TATCTCGAGTCAATGTCCTACACATGGACAGGTG 3' (配列番号３)、
逆方向プライマー：
5' AGATCTGCAGTTAACGGGGTCGGGCACGAG 3' (配列番号４)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(thermocycler)(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６３】
ｐＶＶＳ６０１は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel & Fields、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。実のところ、ＮＳ３プロテアーゼは、最適の立体配座および活性のために、ＮＳ４Ａに複合化する(二つのタンパク質の間のシス切断後)ことが示されている(Linら、1995)。一本鎖組換えＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼドメインは、完全なタンパク質分解活性を示す(Taremiら、1998)。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカーおよびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜１８１)を得るために使用した：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTAGT
ATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号５)、
逆方向プライマー：
5' ACCTCGAGCAGCGCCTATCACGGCCTATTCCC 3' (配列番号６)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６４】
ｐＶＶＳ７７５は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３完全長の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＢｇｌII制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ３完全長を保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。ＮＳ３プロテアーゼは、最適の立体配座および活性のために、ＮＳ４Ａに複合化することが示されているので(Linら、1995)、一本鎖組換えＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質は、完全なタンパク質分解およびヘリカーゼ活性を示す(Howeら、1999)。さらに、このような組換え一本鎖タンパク質の結晶構造は、天然の複合ＮＳ３-ＮＳ４Ａに重ねられることが示されている(Yaoら、1999)。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカー、およびＮＳ３完全長(残基３〜６３１)を得るために使用した：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTAGT
ATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号７)、
逆方向プライマー：
5' ATAGATCTTTTAAGTGACGACCTCCAGG 3' (配列番号８)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６５】
ｐＶＶＳ６２５は、ｐＶＰ１６(Hollenbergら、1995)から、ＳｆｉＩによる消化およびＰＣＲによって創製したランダム１５アミノ酸ペプチドライブラリーの挿入によって誘導した。
【００６６】
２.２．哺乳動物発現プラスミド
ｐＶＶＳ５７８は、プラスミドｐＵＡＳＬｕｃ(Thielら、2000)から誘導した。これは、５つのＧａｌ４-結合部位およびヒト-βグロビン遺伝子の最小プロモーター、それに続くホタルルシフェラーゼコード配列から構成されるレポーター構築物を含んでいる。
【００６７】
ｐＶＶＳ４７８は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢΔ２１配列を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。ＮＳ５ＢΔ２１挿入体は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TTC CTC GAG GAT CAA TGT CCT ACA CAT GG 3' (配列番号９)、
逆方向プライマー：
5' GCT CGG ATC CCA GCT CTC AAC GGG GTC GGG 3' (配列番号１０)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間)を行った。
【００６８】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene、アムステルダム、オランダ国)に従って使用して、ＮＳ５ＢΔ２１配列中に単一突然変異を導入した。
【００６９】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ４７４を創製した：
Ｌ３０Ｓ突然変異のための順方向プライマー：
5' AATCCGTTGAGCAACTCTTCGCTGCGTCACCACAGTATG 3' (配列番号１１)、
Ｌ３０Ｓ突然変異のための逆方向プライマー：
5' ATACTGTGGTGACGCAGCGAAGAGTTGCTCAACGGATT 3' (配列番号１２)。
【００７０】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ４７５を創製した：
Ｌ３０Ｒ突然変異のための順方向プライマー：
5' AATCCGTTGAGCAACTCTCGGCTGCGTCACCACAGTATG 3' (配列番号１３)、
Ｌ３０Ｒ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CATACTGTGGTGACGCAGCCGAGAGTTGCTCAACGGATT 3' (配列番号１４)。
【００７１】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ５１７を創製した：
Ｈ９５Ｒ突然変異のための順方向プライマー：
5' CTGACGCCCCCACGCTCGGCCAAATCC 3' (配列番号１５)、
Ｈ９５Ｒ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CTGACGCCCCCACGCTCGGCCAAATCC 3' (配列番号１６)。
【００７２】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ５１６を創製した：
Ｍ４１４Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１７)、
Ｍ４１４Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１８)。
【００７３】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８９を創製した：
Ｇ１５２Ｅ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１９)、
Ｇ１５２Ｅ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号２０)。
【００７４】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９５を創製した：
Ｍ４２３Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' CTATGGGCGAGGACGATTCTGATGACT 3' (配列番号２１)、
Ｍ４２３Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' AGTCATCAGAATCGTCCTCGCCCATAG 3' (配列番号２２)。
【００７５】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＷＳ７８８を創製した：
Ｎ１４２Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' ATCATGGCAAAAACTGAGGTTTTCTG 3' (配列番号２３)、
Ｎ１４２Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CAGAAAACCTCAGTTTTTGCCATGAT 3' (配列番号２４)。
【００７６】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９０を創製した：
Ｐ１５６Ｌ突然変異のための順方向プライマー：
5' GAGGCCGCAAGCTAGCTCGCCTTATCG 3' (配列番号２５)、
Ｐ１５６Ｌ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CGATAAGGCGAGCTAGCTTGCGGCCTC 3' (配列番号２６)。
【００７７】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９７を創製した：
Ｐ４９５Ｌ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGAAACTTGGGGTACTACCCTTGCGAG 3' (配列番号２７)、
Ｐ４９５Ｌ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CTCGCAAGGGTAGTACCCCAAGTTTCC 3' (配列番号２８)。
【００７８】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９１を創製した：
Ｓ２８２Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGTGCCGCGCGACCGGCGTGCTGA 3' (配列番号２９)、
Ｓ２８２Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' TCAGCACGCCGGTCGCGCGGCACC 3' (配列番号３０)。
【００７９】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９９を創製した：
Ｓ３６８Ａ突然変異のための順方向プライマー：
5' GTCATGCTCCGCCAATGTGTCG 3' (配列番号３１)、
Ｓ３６８Ａ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CGACACATTGGCGGAGCATGAC 3' (配列番号３２)。
【００８０】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９４を創製した：
Ｓ４１９Ｍ突然変異のための順方向プライマー：
5' ATGCGCCCACCATGTGGGCGAGGATG 3' (配列番号３３)、
Ｓ４１９Ｍ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CATCCTCGCCCACATGGTGGGCGCAT 3' (配列番号３４)。
【００８１】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８７を創製した：
Ｓ９６Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' ACGCCCCCACATACGGCCAAATCCAAA 3' (配列番号３５)、
Ｓ９６Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' TTTGGATTTGGCCGTATGTGGGGGCGT 3' (配列番号３６)。
【００８２】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９６を創製した：
Ｙ４４８Ｍ突然変異のための順方向プライマー：
5' GTAGCAGGCCCCCATGATCTGACA 3' (配列番号３７)、
Ｙ４４８Ｍ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GTAGCAGGCCCCCATGATCTGACA 3' (配列番号３８)。
【００８３】
ｐＶＶＳ６０２は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏＩおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。一本鎖構築ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカー、およびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜１８１)(Taremiら、1998)は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGCAGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTA
GTATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号３９)、
逆方向プライマー：
5' ACCTCGAGCAGCGCCTATCACGGCCTATTCCC 3' (配列番号４０)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００８４】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene)に従って使用して、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ配列中に単一突然変異を導入した。
【００８５】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８１を創製した：
Ａ１５６Ｖ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCATCTTCCGGGTTGCTGTGTG 3' (配列番号４１)、
Ａ１５６Ｖ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CACACAGCAACCCGGAAGATGCC 3' (配列番号４２)。
【００８６】
ｐＶＶＳ７７２は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３完全長配列(GenBank D89872)を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカーおよびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜６３１)(Howeら、1999)は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGCAGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTA
GTATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号４３)、
逆方向プライマー：
5' ATAGATCTTTTAAGTGACGACCTCCAGG 3' (配列番号４４)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００８７】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene、アムステルダム、オランダ国)に従って使用して、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長配列中に単一突然変異を導入した。
【００８８】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８３を創製した：
Ａ１５６Ｖ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCATCTTCCGGGTTGCTGTGTG 3' (配列番号４５)、
Ａ１５６Ｖ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CACACAGCAACCCGGAAGATGCC 3' (配列番号４６)。
【００８９】
ｐＶＶＳ５２７は、ウイルスＶＰ１６活性化ドメイン(GenBank AF294982)のカルボキシ末端を含む枠と枠内で、選択したペプチドの受容体であるように、ｐＣＩＮｅｏ(Promega)から誘導した。
【００９０】
ｐＶＶＳ５５０は、ｐＶＶＳ５２７から、ＳｆｉＩ消化および選択したペプチドＮ２１Ｃ２７２コード配列の挿入によって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【００９１】
挿入体を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TCCTTAAGGGAGATGTGAGCAT 3' (配列番号４７)、
逆方向プライマー：
5' CAAGGCGATTAAGTTGGTAAC 3' (配列番号４８)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１分間)を行った。
【００９２】
実施例３：バイトと相互作用するペプチドの同定
ナイーブな酵母を、酢酸リチウム形質転換プロトコール(Schiestlら、1989)に従って、ｐＶＶＳ４６８(ＬｅｘＡに融合したＮＳ５ＢΔ２１)で形質転換した。形質転換体を、選択圧(トリプトファンを含まないＳＤ培地)下に液体培養で増殖させ、次いでｐＶＶＳ６２５(ウイルスＶＰ１６活性化ドメインと枠内にあるランダムペプチドのライブラリー)で形質転換した。得られた二重形質転換体を、トリプトファンおよびロイシンを欠くＳＤ寒天培地に広げ、３０℃で４８時間インキュベートした。次いで、コロニーを剥ぎ取り、混合した。得られた１／５００の懸濁液を、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを欠くＳＤ寒天培地にプレーティングしてＨＩＳ３レポーターの活性化を同定した。増殖の３〜５日後に、Ｘ-Ｇａｌを重ねてＬａｃＺ活性化を同定した。Ｘ-Ｇａｌ溶液を、５０℃に冷却した等容量の１％アガロースと混合し、次いで寒天プレート表面の酵母コロニー上にゆっくり注いだ。青色に染まった個々のクローンを拾い上げ、深いウエルにおいて一晩増殖させ、さらに分析した。
【００９３】
３.１．３Ｄセンサーの同定
バイトと相互作用するペプチドを含む酵母コロニーを、９６ウエルの深いウエル中のｔｒｐ-ｌｅｕ-液体培地において一晩増殖させた。次いで、これらを、プラガー(充填器)を用いて、異なる濃度の特異的または非特異的薬物あるいは等量の溶媒(ＤＭＳＯ)を補足したｔｒｐ-ｌｅｕ-ｈｉｓ-固体培地またはｔｒｐ-ｌｅｕ-固体培地のいずれかの上にスポッティングした。レポーター遺伝子の発現を解き放つ酵母コロニーを選択した。結果を、少なくとも３回確認した。
【００９４】
使用した別の方法は、半定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイであった。酵母コロニーを、異なる濃度の参照薬物を含むかまたは含まない液体選択培地において、上記のように増殖させた。細胞ペレットを、Ｙ-ＰＥＲタンパク質抽出試薬(Pierce、Brebieres、仏国)(１００ｕｌ)に再懸濁させた。３００ｒｐｍで３０分間の震盪の後、上清を透明化し、全タンパク質濃度を、Micro BCAタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce、製造元の指示に従う)を用いて測定した。０.６６ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ(Ｏ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド)溶液(Sigma-Aldrich、Lyon、仏国)(１８０ｕｌ)を添加することにより、タンパク質抽出物(５ｕｌ)を用いてＬａｃＺ活性を測定した。黄色の発色が現れたとき直ちにＮａ2ＣＯ3の１モル溶液(７５ｕｌ)を加えることによって反応を停止させた。分光光度計において４２０ｎｍでＯＤを測定し、以下の式を用いて比活性を算出した：
比活性(ｎｍｏｌ/ｍｇ/分)＝ＯＤ420×Ｖt/(0.0045×Protein×Ｖe×Time)
[式中、Ｖｔは全反応量(１６０ｕｌ)であり、Proteinは酵母抽出物のタンパク質濃度(ｍｇ／ｍｌ)であり、Ｖｅはアッセイされた抽出物容量(ｍｌ)であり、Timeは反応時間(分)である]。
【００９５】
３.２．プラスミドレスキュー
プラスミド抽出のために、レポーター発現が特異的薬物によって阻害された酵母クローンを、ｔｒｐ-ｌｅｕ-液体培地において増殖させた。一晩飽和培養物(２ｍｌ)を、微量遠心機で５分間沈降させ、ペレットを、２５００単位／ｍｌのLyticase(Sigma-Aldrich、Lyon、仏国)(２０μｌ)を補足した溶解緩衝液(８０ｕｌ)に再懸濁させた。懸濁液を、２２０ｒｐｍで震盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。２０％ＳＤＳ(２０μｌ)を添加し、混合物を１分間渦撹拌した。次いで、混合物を、Nucleospin Plasmid Quickpureを製造元の指示(Macherey Nagel、Hoerdt、仏国)に従って用いて精製した。精製した溶出物に対して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った：
順方向プライマー：5' TCCTTAAGGGAGATGTGAGCAT 3' (配列番号４９)、
逆方向プライマー：5' CAAGGCGATTAAGTTGGTAAC 3' (配列番号５０)。
ＰＣＲ生成物を配列決定し、ｐＶＶＳ５２７ベクターにおいてクローンした(上記のように)。プラスミドを、酵素制限およびＤＮＡ配列決定によって精製および確認した。
【００９６】
３.３．細胞系統および培養条件
Ｈｅｌａ細胞(ATCC、Molsheim、仏国)を、１０％ＦＢＳ(JRH)、２ｍＭグルタミン(Biowhittaker/Cambrex)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker/Cambrex)、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＥＭＥＭ(Eagleの最小必須培地、Earleのバランス塩溶液を含みＬ-グルタミンを含まない、Biowhittaker/Cambrex、East Rutherford、New Jersey、米国)において維持した。細胞を、湿度調節した５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で維持し、８０〜９０％全面に達したときにトリプシン-ＥＤＴＡ(IX)を用いて分離した。
【００９７】
Ｈｕｈ７肝癌由来細胞(Nakabayashi Hら、1982)を、１０％ＦＢＳ(SAFC、米国)、１ｍＭグルタミン(Lonza、Basel、スイス国)、０.５ｍＭピルビン酸ナトリウム(Lonza、Basel、スイス国)、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した、半分容量のＤＭＥＭ(Dulbeccoの最小必須培地、Ｌ-グルタミンを含まないEagle培地、Lonza、Basel、スイス国)および半分容量のHamのＦ１２培地(Lonza、Basel、スイス国)において維持した。細胞を、湿度調節した５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で維持し、８０〜９０％全面に達した場合にトリプシン-ＥＤＴＡ(IX)を用いて分離した。
【００９８】
３.４．ＨｅｌａおよびＨｕｈ７細胞のトランスフェクション実験
Ｎ／Ｐ比が８でjetPEI(PolyPLusトランスフェクション、Illkirch、仏国)に複合させた５〜２０ｕｇの合計ＤＮＡを用いて、２００万〜４００万細胞において、１００ｍｍ皿中で２時間、トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼレポーター、標的および選択した３Ｄセンサーをコードするプラスミドの間の最適比は、３ｕｇ／１ｕｇ／０.５ｕｇであった。細胞を分離し、ウエルあたり２５０００細胞を、９６ウエル培養処理プレート(BD Biosciences、Erembodegem、ベルギー国)に蒔いた。
【００９９】
３.５．小分子ライブラリーのスクリーニング
化合物ライブラリーのプレートを室温で解凍した。薬物をGenesisワークステーション(Tecan、Lyon、仏国)によって取り扱い、細胞に５ｕＭ(０.５％ＤＭＳＯ中)最終濃度で添加した。２０プレートの実施によってスクリーニングを行った。ルシフェラーゼ活性の測定によってヒットを同定した。
【０１００】
３.６．ルシフェラーゼアッセイ
細胞培養上清を捨て、溶解緩衝液(１００ｕｌ)を各ウエルに加えた。１０分間の激しい震盪の後、溶解液を白色不透明な９６ウエルプレートに移し、ルシフェリン緩衝液(１００ｕｌ)を加えた。直ちに、Microlumat LB96照度計(Berthold、Thoiry、仏国)を用い、１秒または１０秒の積分時間で化学発光測定を行った。
【０１０１】
３.７．細胞毒性アッセイ
上記のようにトランスフェクトされ、９６ウエルプレートに蒔かれ、薬物とともに２４時間インキュベートされた細胞において、生存性測定を行った。０.１５ｍｇ／ｍｌのＸＴＴ溶液(Roche Diagnostics、Meylan、仏国)を各ウエルに添加し、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。各ウエルの細胞培養上清の光学密度を、分光光度計を用いて分析した(４５０ｎｍにおいて、６９０ｎｍにおけるバックグラウンドシグナルを差し引く)。
【０１０２】
３.８．ＩＣ50測定実験
選択したヒットを、０.０１ｕＭ〜１００ｕＭ最終濃度に変化する濃度で合成および試験して、そのＩＣ50を三つの独立した実験において測定した。
【０１０３】
実施例４：３Ｄスクリーン-ＮＳ５Ｂプラットホーム
４.１．酵母においてＮＳ５ＢΔ２１と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ／Ｃ末端２１アミノ酸を欠く先端切除ＨＣＶポリメラーゼ]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０株(ATCC、Molsheim、仏国)において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。このＣ末端２１アミノ酸ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、２-ハイブリッドアプローチの実現可能性を低下させる(Yamashitaら、1998、Dimitrivaら、2003)。この２１アミノ酸ドメインの除去は、ＮＳ５Ｂ活性を低下させず、全体のタンパク質立体配座に小さな変化を導入する(Yamashitaら、1998、Tomeiら、2000)。合計して５７６のコロニーを、選択条件下で増殖するその能力に対して選択した(図１ａ)。次いで、ｃＶＶＳ-０２３４７７またはｃＶＶＳ-０２３４７６の選択した個々の酵母コロニーに、標的ポリメラーゼにおいて立体配座変化を誘発することが知られている二つの抗ＮＳ５Ｂ薬物を添加することによって、立体配座感受性ペプチドまたは「３Ｄセンサー」を同定した(図１ｂ)。１６コロニーの増殖およびＬａｃＺ発現を、ｃＶＶＳ-０２３４７７、ベンゾチアジアジンのファミリーに属する化合物(Prattら、2005)の添加によって停止させた。また、別の２２コロニーを、半定量的アプローチを用いて、ｃＶＶＳ-０２３４７６、インドール-Ｎ-アセトアミド化合物(Harperら、2005)により同定した(データは示さず)。
【０１０４】
選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。図１ｃは、ヒスチジンの非存在下およびｃＶＶＳ-０２３４７７(ベンゾサイアジアザイド抗ＮＳ５Ｂ)または非特異的ウイルスポリメラーゼリガンドのいずれかの存在下においての、増殖およびＮ２１Ｃ２７２(最も感受性の高いペプチド)のｌａｃＺ発現を示す。フォスカーネット、抗ＣＭＶ／ＨＩＶポリメラーゼ(Crumpackerら、1992、Lietmanら、1992)およびその類似体、ホスホノ酢酸(ＰＡＡ)(Crumpackerら、1992)は、この選択したクローンに効果を有していなかった。また、エストラジオールを陰性対照として使用したが、これは、本発明者らのグループによって以前に報告された３ＤセンサーＮｏ.３０.２-ＥＲ相互作用(国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレットを参照)に活性であった(即ち、上記した抗ＮＳ５Ｂによって影響を受けない)。
【０１０５】
ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１０６】
４.２．ヒト細胞における３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、ヒト細胞においてさらに調べた。Ｈｅｌａ細胞を選択した理由には、その広い用途、操作の容易性、およびサブゲノムＨＣＶレプリコンを複製する能力が挙げられる(Zhuら、2003、Katoら、2005)。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。選択した３Ｄセンサーのうち６つが、リガンドの非存在下においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図２Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ５ＢΔ２１との相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ベンゾチアジアジジンｃＶＶＳ-０２３４７７の添加時に大きく低下した(図２Ｂ)。(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのシグナルの阻害(１ｕＭで５１％ルシフェラーゼ阻害および１０ｕＭ最終濃度で９０％阻害)に基づいて、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。図２Ｃおよび２Ｄは、ｃＶＶＳ-０２３４７６を用いて同定した３Ｄセンサーの特異的および非特異的ポリメラーゼインヒビターによるルシフェラーゼ発現および阻害を示すものである。
【０１０７】
４.３．ＮＳ５Ｂ-３Ｄスクリーンプラットホームの開発
４.３.１．ＮＳ５ＢΔ２１ ３Ｄセンサーペプチドの選択性
３Ｄスクリーンプラットホームをさらに特性化するために、ペプチドＮ２１Ｃ２７２の結合の選択性を調べた。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターで一時的にトランスフェクトした(図３Ａ)。天然ＮＳ５ＢΔ２１と、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２との間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導き、それは、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の１７倍を示した。しかし、この３Ｄセンサーは、Labonte P (2002)により記載されるＬ３０ＳおよびＬ３０Ａ立体配座不安定化突然変異体を結合しなかった。
【０１０８】
他方において、図３Ｂに示すように、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２は、試験した１２種の薬物耐性突然変異体のうち１０種に結合した：ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されている突然変異体(Ｍ４１４Ｔ、Ｓ２６６Ａ、およびＣ３１６Ｙ)(Tomeiら、2005、Luら、2007)、インドール耐性突然変異体Ｐ４９５Ｌ(Tomeiら、2005)、チオフェンズ耐性突然変異体(Ｓ４１９ＭおよびＭ４２３Ｔ)(Tomeiら、2005)、２'-ヌクレオシド類似体耐性突然変異体Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、およびＮ１４２Ｔ(Tomeiら、2005、Le Pogamら、2006)、ならびに、ジヒドロキシピリミジンに耐性であるＧ１５２Ｅ突然変異体(Tomeiら、2005)。
【０１０９】
４.３.２．３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物の作用特異性
次に、本発明者らは、ポリメラーゼからの３Ｄセンサーの解離が、関連薬物の結合に起因することを確認した。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２／ＶＰ１６、および融合タンパク質ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４により一時的にトランスフェクトした。特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７７およびｃＶＶＳ-０２３４７６の添加は、図４に示すように、１０ｕＭ最終濃度でルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を誘発した(それぞれ、８３.２％±７.５、ｎ＝１５および８２.６％±８.３、ｎ＝６)。ｃＶＶＳ-０２３４７６は、比較的低い濃度においても、ルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を示した(１ｕＭ最終濃度において６７％±８.３、ｎ＝６)。対照的に、レポーターの発現は、抗ＣＭＶ／ＨＩＶポリメラーゼインヒビター、例えばフォスカーネットまたはホスホノ酢酸(Crumpackerら、1992、Lietmanら、1992)の１０ｕＭ濃度での添加によって阻害されなかった(それぞれ、１１.７％±４および−２.２％±３３.８、Ｎ＝３)。標準のＨＣＶ治療(インターフェロンと組合せて)であるリバビリンの作用機序は、ポリメラーゼの直接的な阻害に関係しているようには見えない(Lohmannら、2000、Maagら、2001)。従って、７５ｕＭ最終濃度(そのＥＣ50)で使用して、リバビリンは、ルシフェラーゼシグナルに対して顕著な効果を示さなかった(阻害８.７％±１６.３、ｎ＝６)。即ち、本発明者らは、酵母においてと同様にヒト細胞において、３Ｄセンサーペプチドは、選択的な様式でポリメラーゼと相互作用することができるが、特異的アロステリック抗ＮＳ５Ｂリガンドと複合化したポリメラーゼとは相互作用することができないことを確認した。
【０１１０】
４.３.３．濃度-応答の関係
本発明者らの系における薬物の作用がストキオメトリック(stokiometric)であったか否かを確認するために、Ｈｅｌａ細胞を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ、標的タンパク質および立体配座感受性ペプチドＮ２１Ｃ２７２をコードする三つの発現プラスミドにより一時的にトランスフェクトした。増加量の参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６またはｃＶＶＳ-０２３４７７とともにインキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図５は、Michaelis-Mentenモデルに従う濃度-効果の関係が得られたことを示す。ｃＶＶＳ-０２３４７６およびｃＶＶＳ-０２３４７７のＩＣ50値は、それぞれ０.３および３.２ｕＭであった。
【０１１１】
４.３.４．突然変異体プロファイリング
３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物作用の特異性は、耐性突然変異体において活性である分子のスクリーニングに有用でありうるので、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および天然ＮＳ５ＢΔ２１または文献に記載される異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。増加濃度のｃＶＶＳ０２３４７７(ベンゾチアジアジンのファミリーに属する化合物)またはｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミドのファミリーに属する化合物)とともに２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図６Ａは、ベンゾサイアジアザイド化合物が、天然ＮＳ５ＢΔ２１あるいはＰ４９５Ｌ、Ｓ４２３ＭまたはＳ２８２Ｔ突然変異体(ベンゾチアジアジンに感受性である)のいずれかに対しては、ＩＣ50が２〜５ｕＭで、相当なレポーター阻害を生じた(ｎ＝２)ことを示す。他方において、同じ化合物は、ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されている突然変異体でトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかった。実際には、Ｍ４１４ＴおよびＣ３１６Ｙ突然変異体については、５０％シグナル阻害には到達せず、Ｓ３６８Ａについては、ＩＣ50は天然ＮＳ５Ｂにおいて観察される値の１０倍である。インドール-Ｎ-アセトアミド化合物を試験した場合に、本発明者らは、これが、天然ＮＳ５ＢΔ２１および全ての試験した突然変異体を選択的に阻害することに気付いた(ＩＣ50が０.２〜２ｕＭ)[ただし、インドールに耐性であると記載されているＰ４９５Ｌ(少なくとも１０倍のＩＣ50の増加を有する)除く](図６Ｂ、ｎ＝２)。
【０１１２】
これらの結果は、不安定化突然変異によって乱されない限り、標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明の耐性突然変異体プラットホームは、標的の耐性プロファイルに従って、活性薬物と不活性薬物とを識別することを可能にする。
【０１１３】
同じ手法で同定されたいくつかの他のペプチド[その一つをＮ２１ Ｉ４と命名した(配列番号６２に対応する)]は、化合物ｃＶＶＳ-０２３４７６およびｃＶＶＳ-０２３４７７７に対して、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２と同じように感受性であった。この３Ｄセンサーを用いて、ＨｅｌａおよびＨｕｈ７肝癌由来細胞において、３Ｄスクリーン-ＮＳ５Ｂ突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１１４】
４.３.５．ＮＳ５ＢΔ２１／Ｎ２１Ｃ２７２-３Ｄスクリーンプラットホームの高処理量スクリーニングとの適合性
シグナル窓から始めて高処理量の要求を満たすために、アッセイをさらに最適化した。図７は、最大ルシフェラーゼ阻害後の残留シグナルが、プラットホームのバックグラウンドと同じように低かったことを示す(ｃＶＶＳ０２３４７７に対して８９４７ＲＬＵ±３０７１、ｎ＝７、これに対し、３Ｄセンサーを含まない基本ルシフェラーゼ活性に対して７１８２ＲＬＵ±６６４３、ｎ＝１７)。また、レポーター、３ＤセンサーおよびＬ３０ＳまたはＬ３０Ｒ ＮＳ５Ｂ変性突然変異体のいずれかでトランスフェクトした細胞によって放出されるシグナルも、プラットホームのバックグラウンドに等価であった(Ｌ３０Ｓ突然変異体に対して７６３６ＲＬＵ±５９３２、ｎ＝５、および、Ｌ３０Ｒ突然変異体に対して３１００ＲＬＵ±１６１０、Ｎ＝３)。
【０１１５】
アッセイの変動性を評価するために、ルシフェラーゼレポーター、ＮＳ５ＢΔ２１および３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を含む２０の９６ウエルプレートを、三つの独立した実験において、０.５％ＤＭＳＯの存在下において２４時間プレーティングした。算出したＳ／Ｂは、１４±０.９に達し(図８Ａ)、ＣＶは９.３％±１に達した(図８Ｂ)。平均Ｚ値０.６７±０.０３が得られ(図８Ｃ)、大きい動的範囲にわたる低い変動性を示した。
【０１１６】
４.４．試験化合物ライブラリーの高処理量スクリーニング
４.４.１．一次スクリーニング
ＶＩＶＡＬＩＳ所有の組合せライブラリー(即ち、Vivatheque)に由来する２３５１０のオリジナル化合物を、ＨｅＬａ細胞においてスクリーニングした。三つの発現プラスミド[ルシフェラーゼレポーター、ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４および３Ｄセンサー/ＶＰ１６ＡＤ(Ｎ２１Ｃ２７２)]を、１０ｃｍ皿中、４００万のＨｅｌａ細胞において同時トランスフェクトした。２時間後に、細胞を分離し、２５,０００細胞／ウエルを９６ウエルプレートに蒔いた。細胞付着後に化学的化合物を添加した。ルシフェラーゼ活性を２４時間後に測定した。４０％のルシフェラーゼ阻害を生じた１４３７のヒットを、一次スクリーニング中に同定した(ヒット率６.１％)。
【０１１７】
４.４.２．二次スクリーニング
３４２のヒット(スクリーニングした全化合物の１.４５％)を、２回目および３回目のトランスフェクションにおいて確認した(これは２３.８％の確認率である)。これらの中で、２１５の化合物が４０％未満の細胞毒性を示した。
【０１１８】
４.４.３．ＩＣ50測定実験
１０２の選択した化合物を、純粋な粉末として購入し、その５０％阻害濃度を測定した。２９が、細胞毒性とは独立して、興味ある用量応答プロファイルを示した。１８分子について、ＩＣ50値は１０ｕＭ以下であり、該濃度で２０％未満の毒性を有していた。これらのうち８つのウイルス阻害潜在能力を、Ｈｕｈ７(５,２)におけるレポーターレプリコン系およびＨｕｈ７(９,１３)におけるＲＴ-ＰＣＲ定量的レプリコン系の両方を用いて確認した。本発明者らのプラットホームによって同定した分子のうち三つは、その抗ＨＣＶ特性のために以前に特許されている。第１のｃＶＶＳ０１３００５(アミノチアゾール)は国際公開第２００６／１２２０１１号パンフレットに報告されており、第２のｃＶＶＳ０１９５３４(チオセミカルバゾン)は国際公開第２００４／０６０３０８号パンフレットに記載されており、第３のチエノピリジンは国際公開第２００６／０１９８３２号パンフレットに記載されている。
【０１１９】
実施例５：３Ｄスクリーン-ＮＳ３プラットホーム
５.１．立体配座感受性ペプチドの同定
５.１.１．酵母においてＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼと相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ／ＨＣＶ ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼドメイン(アミノ酸１〜１８１)]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０／ｙＤＧ１株において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。本発明者らは、参照薬物ｃＶＶＳ０２３５１８[臨床試験の第２相にあるペプチド模倣インヒビター(５０ｕＭ濃度)](Perniら、2006)の存在下または非存在下において、８６４の相互作用ペプチドをスクリーニングした。これらのうち２３を、定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを用いて参照薬物の存在下において、そのシグナル消光について選択した。
【０１２０】
選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。ｃＶＶＳ０２３５１８を用いて同定した３Ｄセンサーペプチドのアミノ酸配列を決定した。ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１２１】
５.１.２．酵母においてＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ/ＨＣＶ ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長(アミノ酸１〜６３２)]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０株において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。本発明者らは、参照薬物ｃＶＶＳ０２３５１８[臨床試験の第２相にあるペプチド模倣インヒビター(５０ｕＭ濃度)](Perniら、2006)の存在下または非存在下において、７６８の相互作用ペプチドをスクリーニングした。これらのうち１５を、定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを用いて、参照薬物に対するその反応性について選択した。選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。
【０１２２】
ｃＶＶＳ０２３５１８を用いて同定した３Ｄセンサーペプチドのアミノ酸配列を決定した。ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１２３】
５.２．ヒト細胞における３Ｄセンサーの検証
５.２.１．ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼと相互作用する３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、Ｈｅｌａ細胞においてさらに調べた。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合した標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子、を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。
【０１２４】
２３の試験した３Ｄセンサーのうち４つが、リガンドの非存在下において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図９Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼとの相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８の添加時に大きく低下した(図９Ｂ)。
【０１２５】
(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのシグナルの阻害(２ｕＭ最終濃度で９０％ルシフェラーゼ阻害)に基づいて、３ＤセンサーＶ７-６２を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。
【０１２６】
５.２.２．ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質と相互作用する３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、Ｈｅｌａ細胞においてさらに調べた。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合した標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子、を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。
【０１２７】
１６の同定した３Ｄセンサーのうち８つが、リガンドの非存在下において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図１０Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質との相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８の添加時に大きく低下した(図１０Ｂ)。
【０１２８】
(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのシグナルの阻害(２ｕＭ最終濃度で６０％ルシフェラーゼ阻害)に基づいて、３ＤセンサーＨ５-３４を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。
【０１２９】
５.３．３Ｄスクリーンプラットホームを用いる薬物の選択性決定
本発明者らは、ＮＳ３標的からの３Ｄセンサーの解離が、関連薬物の結合に起因し、特異的な事象によらないことを確認した。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーターならびにＮＳ５ＢおよびＮＳ３標的のそれぞれ(その特異的３Ｄセンサーと一緒に)で一時的にトランスフェクトした。増加濃度の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミド)の添加は、ＮＳ５Ｂプラットホームのみの強力な阻害を誘発した。また、特異的ＮＳ３インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８は、標的効果を有意になくすことなく、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長プラットホームを阻害した(図１１)。これらの結果は、本発明のスクリーニングプラットホームを使用して、細胞関連の異なる標的における薬物の選択性を試験しうることを示すものである。
【０１３０】
５.４．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ３Ｄスクリーンプラットホーム
３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物作用の特異性は、耐性突然変異体において活性である分子のスクリーニングに有用でありうるので、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＶ７-６２、および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼまたは文献(Linら、2005)に記載されるＶＸ９５０に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。３ＤセンサーＶ７-６２と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼのいずれかの間の相互作用は、突然変異形態については比較的低いとしても、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の３３倍、これに対し、天然のものについては８０倍)(図１２Ａ)。増加濃度のｃＶＶＳ-０２３５１８とともに２４時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１３は、ペプチド模倣化合物が、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物が、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかったことを示す。
【０１３１】
同じ手法で同定されたいくつかの他のペプチド[その一つをＴ１Ｅ７と命名した(配列番号６３に対応する)]は、TelaprevirおよびCiluprevirに対して、３ＤセンサーＶ７-６２と同じように感受性であった。この３Ｄセンサーを用いて、３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１３２】
５.５．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質３Ｄスクリーンプラットホーム-Ｈｅｌａ細胞：
本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＨ５-３４、および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質または文献(Linら、2005)に記載されるペプチド模倣体に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。３ＤセンサーＨ５-３４と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(天然タンパク質に対しては、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の４２倍、これに対し、突然変異したものに対しては５６倍)(図１２Ｂ)。増加濃度のｃＶＶＳ-０２３５１８とともに２４時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１３は、ペプチド模倣化合物が、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質に対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物が、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかったことを示す。
【０１３３】
これらの結果は、不安定化突然変異によって乱されない限り、標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明の耐性突然変異体プラットホームは、標的の耐性プロファイルに応じて、活性薬物と不活性薬物を区別することができた。
【０１３４】
５.６．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質３Ｄスクリーンプラットホーム-Ｈｕｈ７細胞：
本発明者らは、Ｈｕｈ７肝癌細胞を、ルシフェラーゼレポーター、酵母において分離される３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１(配列番号６４)および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質または文献(Linら、2005)に記載されるペプチド模倣体に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターによりトランスフェクトした。３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と天然または突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、図１４に示すように、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(Ｒ１５５Ｋ突然変異タンパク質を除いてシグナル／バックグラウンドは３を大きく超える)。
【０１３５】
ＶＦ-９Ａ１１ペプチドと標的変異体との相互作用は、ペプチド模倣化合物ｃＶＶＳ-０２３５１８が試験された多くの３Ｄスクリーンプラットホームとして創製することを可能にする。図１５に示すように、天然３Ｄスクリーンプラットホームは、化合物の阻害ならびに文献(Linら、2004)においてそのように記載されたＤ１６８ＶおよびＲ１０９Ｋに感受性である。高耐性であると記載された突然変異体Ａ１５６ＶおよびＡ１５６Ｔは、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて予測されるプロファイルを示す(Linら、2005、Sarrazinら、2007)。
【０１３６】
また、ペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８に中耐性であることが知られているＡ１５６Ｓ、Ｔ５４ＡおよびＶ３６Ｍも、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、野生型ＮＳ３と比較して、ＥＣ50値の中程度の倍数増加を示す。図１６に示すように、３Ｄスクリーンを用いて測定した耐性を反映するＥＣ50値の倍数増加は、酵素またはレプリコンアッセイによって測定したものと同じ範囲内にある(Linら、2004 & 2005、Sarrazinら、2007、Welshら、2008)。
【０１３７】
これらの結果は、３Ｄスクリーン手法を利用してプロファイリングプラットホームを開発し、臨床的に記載された耐性突然変異体に対する所与の薬物の活性スペクトルを予測することができるという考えを支持する。このようなプロファイリングプラットホームは、単離したヒットをその抗ウイルス活性の範囲に従ってランク付けすることを可能にし、早期段階において最も有望な分子を選択する機会を高める。
【０１３８】
３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームの関連性を、ナノモル範囲でプロテアーゼに対して活性であると記載され、臨床試験の第１相において実証されている第２のペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-２３５９１(Lamarreら、2003)を用いてさらに検討した。図１７に示すように、この化合物は、文献に報告されているものと同じ範囲で３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、ならびに、感受性であると記載されているＡ１５６ＳおよびＶ３６Ｍ変異体(Linら、2004)において活性である。
【０１３９】
高耐性の突然変異体Ａ１５６ＶおよびＤ１６８Ｖ(Linら、2004 & 2005)は、図１８に示すように、酵素またはレプリコンアッセイにおいて以前に報告されているものと同じ範囲で耐性を示した。
【０１４０】
同じ手法で同定され、ＶＦＩＩ-Ｎ４、ＶＦＩＩ-Ｎ１３、Ｔ４Ｃ１１、およびＴ３Ｇ５(それぞれ、配列番号６５、６６、６７および６８に対応する)と命名したいくつかの他のペプチドは、TelaprevirおよびCiluprevirに対して、３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と同じように感受性であった。これら全ての３Ｄセンサーを用いて、３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１４１】
即ち、これらの結果は、臨床的に記載された耐性突然変異体に対する所与の薬物の活性スペクトルを予測するための、確固とした信頼できるプロファイリングプラットホームの創製を示すものである。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームを、二つの異なるインヒビターを用いてＮＳ５Ｂポリメラーゼに対して開発および実証した。また、それをＮＳ３タンパク質に対しても開発し、二つの参照プロテアーゼインヒビターを用いて実証した。その耐性表現は、正確であり、予言的であり、酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と関連していた。さらに、細胞に基づく３Ｄスクリーンプラットホームは、実施の迅速性および単純性ならびに高処理量の利点を有する。
【０１４２】
実施例６：３Ｄスクリーンプラットホームを用いる遺伝子型プロファイリング
ＨＣＶ変異体は、６つの遺伝子型(１〜６)に分類され、サブタイプを示すための小文字を伴う(Le Guillou-Guillemetteら、2007)。薬物に対する感受性は、一つのＨＣＶ遺伝子型と他の遺伝子型では変化することができるため(Mannsら、2007)、本発明者らは、３Ｄスクリーンプラットホームが、薬物候補の予備臨床プロファイリングに非常に重要であるそのような相違を識別することができるか否かを試験した。即ち、本発明者らは、３ＤセンサーＮ２１Ｉ４が、遺伝子型１ａおよび１ｂ由来のポリメラーゼＮＳ５Ｂと、ＨｅｌａおよびＨｕｈ７細胞において、等価な様式で相互作用することを確認した。
【０１４３】
Ｈｕｈ７細胞を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ、遺伝子型１ａまたは１ｂ由来の標的ＮＳ５Ｂおよび立体配座感受性ペプチドＮ２１Ｉ４をコードする三つの発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした。増加量のｃＶＶＳ-０２３４７６とともにインキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１９は、二つの異なる遺伝子型に由来するＮＳ５Ｂが、３ＤセンサーペプチドＮ２１Ｉ４の存在下において、参照インドール薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６に対してわずかに異なる感受性を有することを示す。
【０１４４】
これらの結果は、異なる遺伝子型に由来する場合であっても標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明のスクリーニングプラットホームを用いて、標的の遺伝子型バックグラウンドに応じて活性薬物と低活性薬物とを識別することができた。同じ原理を、標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質に適用した。
【参考文献】
【０１４５】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明はウイルス学の分野に関する。より正確には、本発明は、標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定する方法を提供する(ここで、該試験化合物は、該タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られているものである)。本発明は、標的タンパク質に対して活性である薬物候補(例えば、抗ウイルス薬)が、該タンパク質の変異体に対して活性であるか否かを決定するのに有用である。
【０００２】
背景技術
Ｃ型肝炎は、世界的な健康問題であり、世界中に１億７０００万人の保菌者を有し、毎年３００〜４００万人の新たなケースを有する。この輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の原因であるウイルスは、フラビウイルス科(Flaviviridae)に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであると１９８９年に同定された(Chooら、1989)。ＨＣＶの可能性ある自然な経過には、急性感染から長期感染への進行(患者の７５〜８５％)、長期疾患から肝硬変への進行(１７〜２０％)、および肝硬変から代償不全または肝細胞癌への進行(１〜５％)が含まれる(Mc Hutchison、2004、Walker、2002)。現在、標準的な介護は、インターフェロン、即ち、免疫調節および抗ウイルス活性を有するサイトカイン(Moussalliら、1998)と、リバビリン(Ribavirin)、即ち、合成グアノシンヌクレオシド類似体(Hugleら、2003)とを組合せることにある。ＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂ(米国、日本および欧州に多い型)に感染した患者について、持続性のウイルス応答(抗ウイルス治療の２４週間後に血清ＨＣＶ ＲＮＡの減少)は、よくても４２〜４６％である(Walkerら、2002、Gordonら、2005、Lake-Bakaarら、2003)。その相対的に効果がないことに加え、この組合せ治療は重大な副作用を生じる(Fried Michael、2002)。新たな治療処方が求められており、研究者は、ウイルスのライフサイクルにおける特定の工程を阻害する薬剤の同定に焦点を当てている。
【０００３】
ウイルスと細胞膜との相互作用および融合の際に、ＲＮＡゲノムが、新たに感染した細胞の細胞質中に放出され、ＲＮＡ複製のための鋳型として働く。ＨＣＶゲノムの翻訳は、内部リボソーム侵入部位に依存し、大型のポリタンパク質を生じ、これがタンパク質分解によって切断されて１０個のウイルスタンパク質を生じる。ポリタンパク質のアミノ末端の１／３は、構造タンパク質（コアタンパク質 糖タンパク質Ｅ１＋Ｅ２）をコードしている。この構造領域の後に、小さい内在性タンパク質Ｐ７がある(これは、イオン化学物質として機能するようである)。ゲノムの残りは、非構造タンパク質ＮＳ２、Ｎ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂをコードし、これらは、ウイルスライフサイクルの細胞内過程を調整する(Lindenbachら、2005)。必須のウイルス酵素をブロックする抗ウイルス薬の開発は、新規な抗ＨＣＶ薬剤の開発への直接的なアプローチである。理論的に全てのＨＣＶ酵素が治療介入に等しく適しているが、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼおよびＮＳ３-４Ａセリンプロテアーゼが、それぞれゲノム複製およびポリタンパク質プロセシングに重要であり、最も研究されていた。様々な生化学的イン・ビトロアッセイが開発され、スクリーニング操作に使用されている(Behrensら、1996、Luoら、2000、Ohら、1999、Lohmannら、1997、Yamashitaら、1998、Mc Kercherら、2004)。有用ではあるが、これらのアッセイは、生理学的な細胞内場面における酵素の活性と、阻害物質との相互作用を予測することができなかった。さらに、これらは、分子の生物学的利用能および毒性に関する情報を与えない。
【０００４】
１９９９年まで、ＨＣＶ薬物を見出すために、あらゆる細胞に基づくスクリーニング作業は、代用ウイルス系、例えばウシウイルス下痢症ウイルスによって行われていた。１９９９年に、R. Bartenschlagerの研究室がＨＣＶレプリコン系を開発した場合に、ＨＣＶ ＲＮＡ複製の研究において大きな進展が生じた(Lohmannら、1999)。ジシストロン性の選択可能なサブゲノムＨＣＶレプリコンであるイン・ビトロＨＣＶ ＲＮＡ複製系において、伝統的な標的(例えば、ＮＳ３プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびＮＳ５Ｂポリメラーゼ)の阻害物質の効果を試験することが可能になった(Bartenschlagerら、2002)。選択可能およびレポーター選択可能なレプリコンの第１世代は、それぞれスクリーニングに使用する作業集約的な定量ＲＴ-ＰＣＲ法および低いシグナル／ノイズ比のゆえに、高処理量スクリーニングを行うことに貢献しなかった。さらに、この系は、細胞培養物適応突然変異を必要とし、なおシグナル窓の改善を必要とする(Blightら、2000、Kriegerら、2001)。最近の刊行物は、スクリーニングプラットホーム(Bourneら、2005、Zuckら、2004、O'Boyleら、2005)としてレプリコンアッセイ制限の相当な改善(Haoら、2006)を報告しており、レプリコンにおけるスクリーニングから顕になったいくつかの化合物が開発の臨床相にある。しかし、レプリコンアッセイは、単一標的アッセイではないままである。
【０００５】
ＨＣＶはインビボで高い突然変異率を示すので、臨床評価されている分子の一部が、既に酵素特異的な突然変異を誘発し、これが、使用した阻害物質に対する感受性の低下を導くことは驚くべきことではなかった(Sarrazinら、2007)。即ち、抗ＨＣＶ薬物の耐性プロファイル研究が、その最適化および長期的な臨床成功のために必須のようである。いくつかの異なるウイルス単離体から組換えＮＳ５Ｂポリメラーゼを得るための努力が為されているが、生理学的関連性の問題に直面している。臨床的に関連するウイルス単離体からの新規レプリコが研究されているが、遺伝子型１および２に、およびある種の細胞クローンになお限定されている。耐性表現型において観察された突然変異の関与は、さらなる研究を必要とすることが多い(Trozziら、2003、Nguyenら、2003)。これらの技術的制限を知ると、抗ＨＣＶ活性評価および耐性プロファイリングのための細胞スクリーニングプラットホームが緊急に必要とされている。これが本発明の目的である。
【０００６】
ここに、本発明者らは、M. Mehtali(国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット)によって開発された細胞に基づくアッセイが、阻害物質に結合した場合の標的ＨＣＶポリメラーゼおよびプロテアーゼにおける立体配座変化を検出しうることを示した。この細胞に基づくアッセイ(３Ｄスクリーンプラットホームと命名した)は、２-ハイブリッド系を用いてリガンド化されていない標的を特異的に結合し、標的と３Ｄセンサーペプチドとの間の相互作用を解離させる分子のスクリーニングを可能にする短いペプチドを同定することに基づくものである。また、本発明者らは、このＨＴＳ適合性アッセイは、ＨＣＶ特異的な抗ＮＳ５Ｂ分子の迅速同定を可能にするが、それに加えて、耐性突然変異体プロファイリングを行うのに十分感受性であることを示す。
【０００７】
最近の研究は、ＮＳ５Ｂの阻害物質として働く不自然なペプチド(Aminら、2003)を報告しているが、薬物を見出すためのツールとして使用されていなかった。いくつかの研究は、ファージ親和性選択を用いて、エストロゲン受容体の立体配座に感受性であるペプチドを同定した(Paigeら、1999)。別の特許(国際公開第０２／００４９５６号パンフレット)は、エストラジオール受容体のリガンド化された形態へのいくつかのペプチドの結合(Fowlkesら、2002)を利用して、物質の生物学的活性を、そのペプチド「指紋」を既知の参照リガンドのものと比較することによって予測した。ごく最近の刊行物には、標的受容体を認識しうるペプチドリガンドをスクリーニングするためのＦＲＥＴ-ハイブリッド相互作用法が報告された(Youら、2006)。しかし、本発明者らの知る限りでは、「感知される」ＨＣＶポリメラーゼおよびプロテアーゼ標的タンパク質ならびにこれらの変異体に対する薬物をスクリーニングするための３Ｄセンサーとしてペプチドを使用した報告は存在しなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法を提供する：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する少なくとも一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在が、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【０００９】
記述の残りについては、以下の図面の説明が参照されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮＳ５ＢΔ２１と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定(ａ)酵母２-ハイブリッド系においてＮＳ５ＢΔ２１と相互作用するペプチドの単離 バイト(bait)(ＮＳ５ＢΔ２１-ＬｅｘＡ)を保持する酵母細胞を、ランダムペプチドのライブラリー(ウイルスＶＰ１６活性化ドメインを有する枠内)で示されるプレイ(prey)で形質転換した。選択培地において増殖し、青色に染まるコロニーが、ポリメラーゼと特異的に相互作用する個々のペプチドの単離を可能にした。(ｂ)立体配座感受性ペプチドの単離 次いで、相互作用しているペプチドを、バイトＮＳ５Ｂにおいて立体配座変化を誘発することが知られているリガンドの存在下において試験した。即ち、「３Ｄセンサー」を、標的ポリメラーゼへのその結合が既知の抗ＮＳ５Ｂによって妨げられているものとして同定した。対応するコロニーは、選択遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を全く示さなかった。(ｃ)スポット試験におけるＮＳ５ＢΔ２１「３Ｄセンサー」の特性化 ここで、二つの選択した酵母コロニーが示された。一方は、以前に単離されたＥＲおよびその特異的ペプチド(Ｎｏ.３０-２と称する)を保持し、これを対照として使用し、他方は、ＮＳ５ＢΔ２１およびその特異的ペプチド(Ｎ２１Ｃ２７２と称する)を保持した。両クローンを、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠く選択培地にスポッティングし、ポリメラーゼリガンドを追加または追加せず、Ｘ-Ｇａｌ染色を重ねた。ＮＳ５ＢΔ２１＋Ｎ２１Ｃ２７２クローンを、ＮＳ５Ｂリガンドの非存在下において選択培地において増殖させ、ＬａｃＺに対して陽性に染色した。同じ培養物に由来するコロニーは、変化量の特異的ＮＳ５Ｂインヒビター(ベンゾチアジアジン ＣＶＶＳ０２３４７７)を含む選択培地において増殖を示さなかった。非特異的ウイルスポリメラーゼインヒビター[フォスカーネット(Foscarnet)、ＰＡＡ]または非関連リガンド(エストラジオール)は、増殖またはＬａｃＺ染色に対して効果を示さなかった。本発明における対照クローン(ＥＲ陽性の特異的３ＤセンサーＮｏ.３０.２)は、その対応する特異的リガンド(エストラジオール)に対しては感受性であったが、ＮＳ５Ｂまたは他のウイルスポリメラーゼインヒビターに対しては感受性ではなかった。
【図２Ａ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ａ：ベンゾサイアジアザイド薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝４)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示されている。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの６つに対して、２０より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図２Ｂ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｂ：参照ベンゾサイアジアザイド薬物に対して最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ベンゾサイアジアザイドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝４)が、最良のルシフェラーゼ活性化(２０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える６つの３Ｄセンサーに対して示されている。３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２を、特異的な抗ＮＳ５Ｂによる解離に対する比較的良好な応答性(１ｕＭ最終濃度で５１％ルシフェラーゼ阻害および１０ｕＭ最終濃度で９０％)および最小のデータ変動のために選択した。
【図２Ｃ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｃ：インドール薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝３)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６を用いて酵母において分離される２２の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの８つに対して、２０より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図２Ｄ】哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。図２Ｄ：インドールおよびベンゾサイアジアザイド参照薬物に対して最も強力な３Ｄセンサーの反応性 インドールアセトアミドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７６またはベンゾサイアジアザイドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝３)が、最良のルシフェラーゼ活性化(２０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える８つの３Ｄセンサーに対して示される。
【図３Ａ】標的に対する選択した３Ｄセンサーの選択性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３Ｄセンサー、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。リガンドの非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示される。図３Ａ：天然ＮＳ５Ｂまたは構造不安定化突然変異体の存在下においての３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定は、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２との間の相互作用が、Labonte P.(2002)により記載されるＬ３０ＳおよびＬ３０Ｒ立体配座不安定化突然変異体を用いて起こらなかったことを示した。
【図３Ｂ】標的に対する選択した３Ｄセンサーの選択性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３Ｄセンサー、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。リガンドの非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示される。図３Ｂ：様々な耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 ３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２は、試験した１２種の薬物耐性突然変異体のうち１０種に結合した：ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されているＭ４１４Ｔ、Ｓ２８６ＡおよびＣ３１６Ｙ突然変異体、インドール耐性突然変異体Ｐ４９５Ｌ、チオフェンズ(Tiophens)耐性突然変異体Ｓ４１９ＭおよびＭ４２３Ｔ、２'-ヌクレオシド類似体耐性突然変異体Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、およびＮ１４２Ｔ、ならびに、ジヒドロキシピリミジンに耐性であるＧ１５２Ｅ突然変異体。
【図４】３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物の作用特異性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および融合タンパク質ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４により一時的にトランスフェクトし、次いで特異的または非特異的リガンドのいずれかを用いて２４時間インキュベートした。得られたルシフェラーゼ発現の阻害率(％)を、等量の溶媒(ＤＭＳＯ)に対して算出した。ＮＳ５Ｂ特異的インヒビターｃＶＶＳ-０２３４７７[ベンゾチアジアジン(Pratt JK、2005)]は、１０μＭ最終濃度においてルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を誘発し(８３.２％±７.５、ｎ＝１５)、一方、別の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６[インドール-Ｎ-アセトアミド(Harper S、2005)]は、１μＭ最終濃度から始まって顕著な効果を示した(６７％±８.３、ｎ＝６)。フォスカーネットまたはホスホノ酢酸などの非特異的リガンドは、１０μＭ濃度において有意のシグナル阻害を生じなかった(それぞれ、１１.７％±４および−２.２％±３３.８、Ｎ＝３)。別の重要な陰性対照はリバビリンであり、その推定される作用機序は直接的なＮＳ５Ｂ阻害に関連しないようであるが(Lohmann V、2000、Maag D、2001)、それは７５μＭ最終濃度において本発明の系に顕著な効果を示さなかった(阻害８.７％±１６.３、ｎ＝６)。
【図５】ＮＳ５Ｂリガンドに対する濃度-応答の関係。ルシフェラーゼ阻害の割合(％)が、増加濃度のｃＶＶＳ０２３４７７またはｃＶＶＳ０２３４７６のいずれか(０〜１００μＭの最終濃度)の存在下において２４時間インキュベートした後の、レポータールシフェラーゼ、ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４融合タンパク質および３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２-ＶＰ１６をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞に対して示されている。得られた曲線は、Michaelis-Mentenモデルに一致する双曲線関係を示した。
【図６Ａ】参照薬物に対する突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体(Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、特異的ＮＳ５Ｂインヒビターを増加濃度で用いて２４時間インキュベートした細胞に対して示される。図６Ａ：ベンゾサイアジアザイド化合物に対する異なる突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性 天然ＮＳ５Ｂあるいはベンゾサイアジアザイド感受性突然変異体Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４２３Ｍ、またはＳ２８２Ｔのいずれかを発現する細胞に対して、ベンゾサイアジアザイド化合物は、ＩＣ50が２〜５μＭで同様のルシフェラーゼ阻害を生じた(ｎ＝２)。他方、同じ化合物は、ベンゾサイアジアザイド耐性突然変異体Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、またはＧ３１６Ｙでトランスフェクトした細胞に対して、顕著なレポーター阻害を示さなかった。
【図６Ｂ】参照薬物に対する突然変異体３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体(Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、特異的ＮＳ５Ｂインヒビターを増加濃度で用いて２４時間インキュベートした細胞に対して示される。図６Ｂ：インドール化合物に対する異なる突然変異体３Ｄスクリーンの反応性 天然ＮＳ５Ｂあるいはインドール感受性突然変異体のいずれかを発現する細胞に対して、インドール-Ｎ-アセトアミド化合物は、ＩＣ50が０.２〜２μＭで生成したシグナルを阻害したが、インドールに対して耐性であると記載されたＰ４９５Ｌに対しては阻害しなかった(そのＩＣ50は少なくとも１０倍高い)(ｎ＝２)。当業者なら、図６Ａに示されるベンゾチアジアジンに耐性である３種類の突然変異体が、他のインドール感受性突然変異体のようにインドール作用に反応することに気付くであろう。
【図７】アッセイのシグナル窓。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターで一時的にトランスフェクトした。特異的リガンドの存在下または非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定が示されている。天然ＮＳ５ＢΔ２１および３Ｄセンサー-ＶＰ１６を含まない骨格ベクターでトランスフェクトされた細胞によって放出されるバックグラウンドシグナルは、７１８２ＲＬＵ±６６４３(ｎ＝１７)であり、一方、等価なバックグラウンドシグナルが、３Ｄセンサーの存在下において変性ＮＳ５Ｂ(Labonteら、2002により記載されたＬ３０ＳおよびＬ３０Ａ立体配座不安定化突然変異体)を用いて得られた(それぞれ、７６３６ＲＬＵ±５９３２、ｎ＝５および３１００ＲＬＵ±１６１０、ｎ＝３)。別のバックグラウンドシグナルは、高濃度(毒性濃度ではない)(１００μＭ)の抗ＮＳ５Ｂ ｃＶＶＳ-０２３４７７による最大阻害後に得られる残留ルシフェラーゼ発現とみなすことができる。これは、７８９４７ＲＬＵ±３０７１、ｎ＝７であり、未阻害シグナル(１１５,２７１ＲＬＵ±６０,８００、ｎ＝２２)よりもはるかに低い。異なるバックグラウンドシグナルはむしろ等価であり、算出したシグナル／バックグラウンドは、必要な最少３に対して１６に達した。
【図８Ａ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ａ：シグナル(０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞)のバックグラウンド(１００μＭ最終濃度で参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を添加した後の残留シグナル)に対する比を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で示す。
【図８Ｂ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ｂ：０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞に対して測定した阻害シグナルの変動の係数を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で示す。
【図８Ｃ】偽ＨＴＳ実施の統計学的分析。Ｈｅｌａ細胞を、３種類の３Ｄスクリーンベクターでトランスフェクトし、次いで、２０の９６ウエルプレートにプレーティングしてＨＴＳ実施を模倣した。細胞を、参照薬物を含むかまたは含まずに２４時間インキュベートした。図８Ｃ：Ｚ因子を、各９６ウエルプレートに対して、三つの独立した実験で算出した。最大シグナルは、０.５％ＤＭＳＯとともにインキュベートした細胞に対して測定され、最少シグナルは、５０μＭ最終濃度で参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７７を添加した後に測定された。
【図９Ａ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図９Ａ：ペプチド模倣薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝３)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの四つに対して、２３より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図９Ｂ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図９Ｂ：参照ペプチド模倣薬物に対する最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ペプチド模倣ＮＳ３特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝３)が、最良のルシフェラーゼ活性化(１０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える四つの３Ｄセンサーに対して示される。３ＤセンサーＶ７-６２を、比較的高いルシフェラーゼ活性化、特異的な抗ＮＳ３による解離に対する比較的良好な応答性および最小のデータ変動のために選択した。
【図１０Ａ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図１０Ａ：ペプチド模倣薬物を用いて酵母において分離される３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化 薬物の非存在下においてのルシフェラーゼ発現の測定(ｎ＝２)が、参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８を用いて酵母において分離される１６の３Ｄセンサーに対して示される。三つのプラスミドを保持する細胞は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を、試験したペプチドの８つに対して、１６より大きいシグナル／バックグラウンド比で示した。
【図１０Ｂ】標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する哺乳動物細胞における３Ｄセンサーの検証。Ｈｅｌａ細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合され酵母において分離される３Ｄセンサー、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＢＤに融合したＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長)、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。図１０Ｂ：参照ペプチド模倣薬物に対する最も強力な３Ｄセンサーの反応性 ペプチド模倣ＮＳ３特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)(ｎ＝２)が、最良のルシフェラーゼ活性化(１０より大きいシグナル／バックグラウンド比)を与える四つの３Ｄセンサーに対して示される。３ＤセンサーＨ５-３４を、比較的高いルシフェラーゼ活性化、特異的な抗ＮＳ３による解離に対する比較的良好な応答性および最小のデータ変動のために選択した。
【図１１】３Ｄスクリーンプラットホームを用いる薬物の選択性決定。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーターおよびＮＳ５ＢまたはＮＳ３標的のそれぞれ(その特異的３Ｄセンサーと一緒に)で一時的にトランスフェクトした。増加濃度の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミド)の添加は、ＮＳ５Ｂプラットホームにおいてのみ、強力な阻害を誘発した。また、特異的ＮＳ３インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８は、有意に標的効果をなくすことなく、ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長プラットホームを阻害した。
【図１２Ａ】ＮＳ３に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化。図１２Ａ：ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化(ｎ＝２)３ＤセンサーＶ７-６２と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼのいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(それは、突然変異形態に対して比較的低いものであるとしても、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の３３倍であり、それに対し、天然のものに対しては８０倍である)。
【図１２Ｂ】ＮＳ３に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化。図１２Ｂ：ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長に対する耐性突然変異体の存在下においての選択した３Ｄセンサーによるルシフェラーゼ活性化(ｎ＝２)３ＤセンサーＨ５-３４と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(天然タンパク質に対しては、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の４２倍であり、それに対し、突然変異したものに対しては５６倍である)。
【図１３】ペプチド模倣参照薬物ｃＶＶＳ-０２３５１８に対する突然変異３Ｄスクリーンプラットホームの反応性。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、選択した３Ｄセンサーおよび天然ＮＳ３または耐性突然変異体(Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと枠内で融合させた)のいずれかを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトした。レポーター阻害の割合(％)が、増加濃度の特異的ＮＳ３インヒビターとともに２４時間インキュベートした細胞に対して示される。ペプチド模倣化合物は、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長に対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物は、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかった。
【図１４】ＶＦ-９Ａ１１ペプチドと、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質との異なる変異体の間の相互作用時のルシフェラーゼ活性化。３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と、天然または突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質とのいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた。シグナルは、Ｒ１５５Ｋ突然変異タンパク質を除く全ての試験した変異体に対して、バックグラウンドを超える(３を大きく超える)。
【図１５】３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質突然変異体プロファイリングプラットホームに類似したｃＶＶＳ-０２３５１８ペプチドの耐性プロファイリング。天然３Ｄスクリーンプラットホームは、化合物の阻害に感受性であり、文献にそのように記載されているＤ１６８ＶおよびＲ１０９Ｋも同様である。ｃＶＶＳ-０２３５１８に高耐性であると記載されている突然変異体Ａ１５６ＶおよびＡ１５６Ｔは、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて予測されるプロファイルを示す。また、ペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８に中耐性であることが知られているＡ１５６Ｓ、Ｔ５４Ａ、およびＶ３６Ｍも、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、野生型ＮＳ３と比較してＥＣ50値の中程度の倍数増加を示す。
【図１６】他のアッセイと比較した３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質プラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８の耐性プロファイリング(突然変異体-対-野生型のタンパク質において得られるＥＣ50値の倍数増加として表す)。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームは、Telaprevirに対して酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と同じ範囲の結果を示す。
【図１７】３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質突然変異体プロファイリングプラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３９５１の耐性プロファイリング。この化合物は、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、文献に報告されているものと同じ範囲において活性であり、感受性であると記載されているＡ１５６ＳおよびＶ３６Ｍ変異体においても同様である。高耐性の突然変異体Ａ１５６ＶおよびＤ１６８Ｖは、予測される化合物阻害活性に高耐性を示した。
【図１８】他のアッセイと比較した３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質プラットホームを用いるペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３９５１の耐性プロファイリング(突然変異体-対-野生型のタンパク質において得られるＥＣ50値の倍数増加として表す)。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームは、Ciluprevirに対して酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と同じ範囲の結果を示す。
【図１９】二つの異なる遺伝子型に由来するＮＳ５Ｂ標的に対するインドール参照薬物への最も強力な３Ｄセンサーの反応性(ｎ＝３)。インドールアセトアミドＮＳ５Ｂ特異的リガンドｃＶＶＳ-０２３４７６の存在下においてのルシフェラーゼ阻害の割合(％)が、ＮＳ５Ｂ(遺伝子型１ａおよび１ｂ由来)を標的とするＮ２１Ｉ４ペプチドに対して示される。
【発明の具体的説明】
【００１１】
好ましくは、試験化合物は、薬学的に許容しうる小さい有機分子、例えば、２０００ダルトン未満、好ましくは１０００ダルトン未満、より好ましくは８００ダルトン未満、より好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有する分子である。試験化合物は、好ましくは、組合せライブラリーとして合成するのになじみやすい化学群のものである。本発明の方法によって選択される試験化合物には、標的タンパク質を特異的に結合する能力を有するものとして既に同定されている物質に類似しているか、または「リガンド様」である物質、例えば、問題にしているタンパク質の潜在的な薬理学的アゴニスト、アンタゴニスト、コアクチベーター、およびコインヒビターが含まれる。このような「リガンド様」試験化合物は、既知のタンパク質リガンドに対して類似した作用機序および類似した生物学的活性を有することができ、既知のタンパク質リガンドの潜在的な副作用を有する(アゴニストまたはアンタゴニスト)。さらに重要なことには、本発明の方法によって選択される試験化合物には、標的タンパク質を特異的に結合する能力を有するものとして既に同定されている物質に類似していない物質が含まれる。これは、本発明の方法が、天然の立体配座にある結合ペプチドを、先行技術の方法に反して同定したためである。このリガンド様分子ではない後者化合物は、既知のタンパク質リガンドと比較して、異なる生物学的および薬理学的特性を有することが予測される。また、試験化合物は、本発明の方法によって同定された結合ペプチドまたはその変異体、あるいは該結合ペプチドに似た化学分子であってもよい。本発明の試験化合物は、当業者によって知られる異なるイン・ビトロアッセイ、例えば、特許文献国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット(２００６年５月４日公開)の特に実施例４および５に記載されている細胞に基づくアッセイなどによって、化学分子のライブラリーにおいて以前に同定されていてもよい。また、本発明は、本発明の方法によって選択された試験化合物にも関する。
【００１２】
本発明の標的タンパク質は、ウイルス、微生物(細菌、菌類、藻類、および原生動物を含む)、無脊椎動物(昆虫および蠕虫を含む)、動物、特に脊椎動物(特に、哺乳動物、鳥類または魚類、哺乳動物の中では、特に、ヒト、類人猿、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ラマ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ネコ、およびイヌ)の正常または病的細胞、あるいは、植物の正常または病的細胞を含むあらゆる天然供給源からの天然物質またはそのサブユニットもしくはドメインであってよい。また、標的タンパク質は、イン・ビトロで創製または修飾された非天然タンパク質、例えば、突然変異タンパク質、キメラタンパク質、または人工タンパク質であってもよい。標的タンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、または金属タンパク質であってよい。それは、核、細胞質、膜、または分泌タンパク質であってよい。また、本発明の対象は、標的タンパク質が、タンパク質である代わりに、巨大分子の核酸、脂質、または炭水化物であってよいことである。それが核酸である場合、それはリボ核酸またはデオキシリボ核酸であってよく、また、一本鎖または二本鎖であってよい。標的タンパク質は、単一の巨大分子である必要はない。標的タンパク質は、巨大分子のホモまたはヘテロマルチマー(ダイマー、トリマー、テトラマー、・・・)であってよい。さらに、標的タンパク質は、結合パートナー、例えば、タンパク質、オリゴまたはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、あるいは小さい有機または無機分子またはイオンを必要とすることもある。その例には、補因子、リボソーム、ポリソーム、およびクロマチンが含まれる。
【００１３】
標的タンパク質の生物学的活性は、特定の活性、例えば、受容体または酵素活性に限定されない。標的タンパク質の非限定的な例には、核受容体、オーファン核受容体、チロシンキナーゼ受容体、Ｇタンパク質結合受容体、エンドテリン、エリトロポエチン受容体、ＦＡＳリガンド受容体、タンパク質キナーゼ(タンパク質キナーゼＣ、チロシンキナーゼ、セリンキナーゼ、トレオニンキナーゼ、ヌクレオチドキナーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ)、タンパク質ホスファターゼ(セリン／トレオニンホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ピロホスファターゼ)、細胞周期調節剤(サイクリンｃｄｋ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５、Ｐ５３、ＲＢ)、ＧＴＰアーゼ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ｒａｓ、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、イオンチャンネル、シャペロニン(即ち、熱ショックタンパク質)、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ(即ち、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ)、テロメラーゼ、プリマーゼ、ヘリカーゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ(ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リボシルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、・・・)、ヒドロラーゼ、カルボキシラーゼ、イソメラーゼ、グリコシダーゼ、デアミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、セルラーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、リガーゼなどが含まれる。
【００１４】
本発明の標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質、動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択される構造および非構造タンパク質であってよい。好ましい態様において、標的タンパク質はウイルスタンパク質である。該ウイルスタンパク質は、好ましくはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、より好ましくは、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である。好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質はＮＳ５ＢおよびＮＳ３である。従って、本発明は、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から、より好ましくはダイマーＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質、またはＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼタンパク質、またはＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法に関する：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーが多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在が、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在が、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【００１５】
該ウイルスタンパク質は、好ましくはインフルエンザウイルスタンパク質であり、好ましくはノイラミニダーゼ、Ｍ２タンパク質、およびヘマグルチニンの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはレンチウイルスタンパク質、例えばヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)タンパク質であり、逆転写酵素、インテグラーゼ、プロテアーゼ、ＴＡＴ、ＮＥＦ、ＲＥＶ、ＶＩＦ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはヒト呼吸器多核体ウイルスタンパク質であり、好ましくはタンパク質Ｎ、Ｆ、およびＧの中から選択される。該ウイルスタンパク質は、好ましくはＢ型肝炎ウイルスタンパク質であり、好ましくはポリメラーゼである。
【００１６】
第２の好ましい態様において、該タンパク質は受容体である。用語「受容体」には、表面および細胞内受容体の両方が含まれる。核受容体が特に重要である(特にヒト核受容体)。核受容体(ＮＲ)はこれまでに記載されている。(ＮＲ)は、リガンド活性化される転写アクチベーターのファミリーである。これらの受容体は、リガンド結合、二量化、トランス活性化、およびＤＮＡ結合のための別個のドメインに組織化されている。ステロイド受容体ファミリーは、グルココルチコイド、電解質コルチコイド、アンドロゲン、プロゲスチン、およびエストロゲンのための受容体から構成される大きいファミリーである。受容体の活性化はリガンド結合時に起こり、この結合が立体配座変化を誘発し、受容体二量化および共活性化タンパク質の結合を可能にする。次いで、これらのコアクチベーター(共活性化物質)は、受容体のＤＮＡへの結合およびその後の標的遺伝子の転写活性化を容易にする。共活性化タンパク質の補充に加えて、リガンドの結合は、受容体を、受容体機能の共抑制物質として働くタンパク質の結合を移しかえるまたは妨げる立体配座に置くものとも考えられる。リガンドが薬理学的アゴニストである場合、新たな立体配座は、生物学的シグナル変換経路の他の成分(例えば、転写因子)と相互作用して、標的組織における生物学的応答を誘導する配座である。リガンドが薬理学的アンタゴニストである場合、新たな立体配座は、受容体が一つまたはそれ以上のアゴニスト(これは、他では該受容体を活性化することができる)によって活性化されることができない配座である。ＮＲの完全ではないリストが国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレット(第１４および１５頁、および図１を参照)に記載されている。ＮＲは、好ましくは、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、レチノイン酸受容体アルファ(ＲＡＲα)、レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(ＰＰＡＲ)、肝臓Ｘ受容体アルファ(ＬＸＲα)の中から選択される。
【００１７】
好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質および標的タンパク質の変異体は、天然の立体配座にある。好ましくは、本発明の方法の工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)を、天然の立体配座にある標的タンパク質および標的タンパク質の変異体を用いて行う。天然の立体配座とは、タンパク質が、その天然リガンドにリガンド化されていないことを意味する。リガンドは、標的タンパク質に結合し、従ってアゴニストおよびアンタゴニストの両方を包含する物質である。しかし、標的タンパク質を結合するが、受容体をアゴナイズもアンタゴナイズもしないリガンドが存在する。天然のリガンドは、天然において、ヒト介入なしに、天然の標的タンパク質のアゴナイズまたはアンタゴナイズまたは結合の原因であるリガンドである。リガンド化されていない状態にある標的タンパク質は、特定の立体配座、即ち、特定の３Ｄ構造を有する。タンパク質がリガンドに複合化した場合に、該タンパク質の立体配座が変化する。
【００１８】
本明細書中で使用する用語「変異体」は、用語「修飾した」、「突然変異した」、「多型」「遺伝子型」、準種または「突然変異体」を包含し、これらの用語は置換可能である。用語「変異体」は、参照の遺伝子または遺伝子産物(即ち、標的タンパク質)と比較した場合に、配列および／または機能特性における修飾(即ち、変化した特徴)を表す遺伝子または遺伝子産物(即ち、標的タンパク質)を指す(通常、参照の遺伝子または遺伝子産物は、野生型の遺伝子または遺伝子産物である)。用語「野生型」は、天然供給源から単離した場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子は、集団の中で最も多く観察される遺伝子であり、従って、任意に「正常」または「野生型」形態の遺伝子と称される。天然の変異体を単離することができ、これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、変化した特徴を有することによって同定されることが特記される。
【００１９】
本発明によれば、標的タンパク質の変異体には、該標的タンパク質の突然変異体が含まれる。突然変異の非限定的な例は、点突然変異、欠失、挿入、転座、ミスセンス突然変異などである。通常、突然変異は、標的タンパク質をコードしている遺伝子のコード配列を変化させ、該標的タンパク質の機能特性を変化させる。
【００２０】
別の態様によれば、標的タンパク質の変異体は、該標的タンパク質の天然多型である。通常、多型は、該タンパク質の機能特性に有意に影響しない、該タンパク質をコードしている遺伝子の配列における一つまたはいくつかの修飾である(即ち、突然変異のような多型は、遺伝性であるが、必ずしも標的タンパク質の機能特性に有害ではない)。遺伝子および遺伝子産物における多型は、全ヒト集団において起こりうる。従って、本発明は、標的タンパク質(即ち、ヒト核受容体、・・・)に対して活性な薬物候補が、該標的タンパク質の多型に対して活性であるか否かを決定することを可能にする。
【００２１】
同様に、本発明の方法は、あるウイルス株の標的タンパク質(例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１のノイラミニダーゼまたはＨＣＶ遺伝子型１のＮＳ５Ｂポリメラーゼ)に対して活性な薬物候補が、別のウイルス株の相同タンパク質(即ち、インフルエンザウイルス株Ｈ３Ｎ２のノイラミニダーゼまたはＨＣＶ遺伝子型２のＮＳ５Ｂポリメラーゼ)に対して活性であるか否かを決定することを可能にする。本発明は、あるＨＣＶ遺伝子型から同定されたＨＣＶ ＮＳ５ＢポリメラーゼまたはＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼに対する薬物候補が、それぞれ、他のＨＣＶ遺伝子型からのＨＣＶ ＮＳ５ＢポリメラーゼまたはＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼに対しても活性であるか否かを決定するのに特に有用であろう。
【００２２】
別の態様によれば、標的タンパク質の変異体は、該標的タンパク質との配列相同性または構造相同性を有するタンパク質である。ここに非限定的な例を挙げると、標的タンパク質がＨＣＶからのプロテアーゼである場合、該標的タンパク質の変異体は、該ＨＣＶプロテアーゼとの配列相同性または構造相同性を有するヒト細胞プロテアーゼであってよい。したがって、本発明は、ウイルスプロテアーゼに対する薬物候補が、ヒト細胞プロテアーゼに対しても活性であるか否かを決定するのに特に有用であろう。これは、薬物候補の潜在的な毒性および副作用を評価するのに特に重要であろう。したがって、本発明の方法は、薬物候補の毒性を予測するのに有用である。
【００２３】
好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質は、配列番号１でコードされるかまたは配列番号５１に供されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質(遺伝子型１ｂ)の野生型配列である。該標的タンパク質(即ち、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質)の変異体の非限定的な例は、Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、Ｃ３１６Ｙ、Ｙ４４８Ｈ、Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４１９Ｍ、Ｍ４２３Ｔ、Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、Ｎ１４２Ｔ、Ｇ１５２Ｅ、Ｐ１５６Ｌである(配列番号５１の第２アミノ酸が、これらの参照突然変異の第１位と考えられる)。第２の好ましい態様によれば、本発明の標的タンパク質は、配列番号２でコードされるかまたは配列番号５２に供されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質の野生型配列である。Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質の変異体の非限定的な例は、Ａ１５６Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｄ１６８Ａ／Ｖ、Ｖ１０７Ａ、Ｒ１５５Ｋ、Ｔ５４Ａ、Ｖ３６Ｍ、Ｖ３６Ｍ／Ａ１５６Ｔ、Ｖ３６Ａ／Ａ１５６、Ｖ３６Ｍ／Ｒ１５５Ｋ、Ｖ３６Ｔ／Ｔ５４、Ｖ３６Ｍ／Ｔ５４Ａ、Ａ１５６Ｖ／Ｒ１５５Ｋである(配列番号５２の第３アミノ酸が、これらの参照突然変異の第１位と考えられる)。呼吸器多核体ウイルスＮタンパク質(配列番号５３および５４を参照)の変異体の非限定的な例は、Ｎ１０５Ｄ、Ｉ１２９Ｌ、Ｌ１３９Ｉ、およびＩ１２９Ｌ＋Ｌ１３９Ｉである。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの変異体の非限定的な例は、Ｒ２９２Ｋ、Ｄ１５１Ｅ、Ｒ１５２Ｋ、Ｒ３７１Ｋ、Ｒ２２４Ｋ、Ｅ１１９Ｇ、およびＤ１９８Ｎである(配列番号５５および５６を参照)。ＨＩＶプロテアーゼの変異体の非限定的な例は、Ｌ１０Ｖ、Ｉ１３Ｖ、Ｅ３５Ｇ、Ｍ３６ＩおよびＨ６９Ｋである(配列番号５７および５８を参照)。ＨＩＶ逆転写酵素の変異体の非限定的な例は、Ｖ１７９Ｅ、Ｔ６９Ｓ、およびＭ１８４Ｖである(参照配列として、GenBankアクセッション番号AAO84275、GL37934320、アクセッションAY237815.1を参照)。
【００２４】
上記した薬物耐性突然変異の命名法は、元の推定アミノ酸(コンセンサス配列中に挙げたもの)、次いでその位置に関するコドン番号、次いで突然変異によって導かれたアミノ酸(これは、抗ウイルス剤に対する感受性の減少を与える)を挙げるものである。この元の推定アミノ酸は、コンセンサス配列中に挙げたものとは異なることもある(配列を患者の血清から導いた場合、抗ウイルス薬に対する標的の活性および感受性に有意に影響することはない)。
【００２５】
タンパク質中に突然変異を導入する手法は、当業者には周知であり、生物学的、物理的、または化学的手段のいずれかによって行うことができる。
【００２６】
既知のタンパク質リガンドは、標的タンパク質のためのリガンドであることが知られている物質である。本発明の既知タンパク質リガンドは、タンパク質に結合した場合に、該タンパク質の立体配座を変えることができる。通常、この既知タンパク質リガンドは、標的タンパク質が由来する器官の一つまたはそれ以上の標的組織における該標的タンパク質の薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストである。しかし、既知のタンパク質リガンドは、標的タンパク質のアゴニストでもアンタゴニストでもないこともある。例えば、それは標的タンパク質の基質であってよい(標的タンパク質が酵素である場合)。既知のタンパク質リガンドは、タンパク質の天然リガンドであってよいが、それである必要はない。本発明の既知タンパク質リガンドは、既知の標的タンパク質アゴニストおよび既知の標的タンパク質アンタゴニストの中から選択される。既知のリガンドは、工程Ｂの細胞に、内生的にまたは好ましくは外生的に添加する。
【００２７】
好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である：
(ａ)ＮＳ３-４Ａセリンプロテアーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、ピロリジン-５,５-トランスラクタム、２,４,６-トリヒドロキシ-３-ニトロ-ベンズアミドの誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ＢＩＬＮ２０６１[Ciluprevir(または本発明においてはｃＶＶＳ０２３９５１)とも称される]、ＩＴＭＮ１９１、ＴＭＣ４３５３５０、ＳＣＨ５０３０３４、およびＶＸ９５０(Telaprevirまたは本発明においてはｃＶＶＳ２３５１８とも称される)の中から選択され、
(ｂ)ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、２,３,５-トリ置換-１,２,４-チアジアゾール-２-イウム塩、ヘテロ環式カルボキサミド、およびベンゾトリアゾールの中から選択され、
(ｃ)ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン、１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド、ＨＣＶ７９６、ＧＳ９１９０、ＭＫ３２８１、およびＶＣＨ７５９の中から選択され、
(ｄ)他のＣ型肝炎ウイルスタンパク質、この場合、既知のタンパク質リガンドは、リバビリン、レボビリン、ビラミジン、メリムポジブ、サイモシンアルファ１、アマンタジンの中から選択される。
【００２８】
上で参照したＨＣＶタンパク質リガンドに関して、その構造は当業者に周知である。例えば：
−ＢＩＬＮ２０６１インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：(１Ｓ、４Ｒ、６Ｓ、７Ｚ、１４Ｓ、１８Ｒ)-１４-シクロペンチルオキシカルボニルアミノ-１８-[２-(２-イソプロピルアミノ-チアゾール-４-イル)-７-メトキシキノリン-４-イルオキシ]-２,１５-ジオキソ-３,１６-ジアザトリシクロ[１４.３.０.０４.６]ノナデカ-７-エン-４-カルボン酸(Lamarreら、2003)、
−ＳＣＨ５０３０３４インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：(１Ｒ,５Ｓ)-Ｎ-[３-アミノ-１-(シクロブチルメチル)-２,３-ジオキソプロピル]-３-[２(Ｓ)-[[[(１,１-ジメチルエチル)アミノ]カルボニル]アミノ]-３,３-ジメチル-１-オキソブチル]-６,６-ジメチル-３-アザビシクロ[３.１.０]ヘキサン-２(Ｓ)-カルボキサミド(Srikanth Venkatramanら、2006)、
−ＶＣＨ-７５９インヒビターは、文献(Beaulieu P.L.ら、2007、第621頁、図9)に示されている構造を有する化合物に対応する、
−以下の構造：
【化１】
を有するＭＫ０６０８インヒビター(７-デアザ-２'-Ｃ-メチル-アデノシン)も引用することができる(Beaulieuら、2007、第616頁、図4を参照)、
−ＴＭＣ４３５３５０インヒビターは、以下の構造を有する化合物に対応する：Ｎ-[１７-[２-(４-イソプロピルチアゾール-２-イル)-７-メトキシ-８-メチルキノリン-４-イルオキシ]-１３-メチル-２,１４-ジオキソ-３,１３-ジアザトリシクロ[１３.３.０.０４,６]オクタデカ-７-エン-４-カルボニル](シクロプロピル)スルホンアミド、これは、文献(Simmen K.ら、2007、図1)、「Ｃ型肝炎に関する第１４回国際シンポジウム(14th international symposium on hepatitis C)、Glasgow、2007年9月」において開示されたＰ-２４８ポスター(図１)にも示されている、
−ＩＴＭＮ１９１インヒビターは、以下の構造：
【化２】
を有する化合物に対応する、これは、文献(Mannsら、2007)にも示され (表１、第996頁、参照85)、および
−ＧＳ９１９０インヒビター(Gileadから)(Sheldon J.ら、2007、Expert Opinion on Investigational Drugs、第16巻、第8号、第1171-1181頁を参照)、
−ＨＣＶ７９６インヒビター：
【化３】
【００２９】
別の好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるインフルエンザウイルスのウイルスタンパク質である：
(ａ)ノイラミニダーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、ザナミビルおよびオセルタミビルの中から選択され、および
(ｂ)Ｍ２タンパク質、この場合、既知のタンパク質リガンドは、アマンタジンおよびリマンタジンの中から選択される。
【００３０】
別の好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択されるＨＩＶウイルスタンパク質である：
(ａ)ウイルスプロテアーゼ、この場合、既知のタンパク質リガンドは、アムプレナビル、インジナビル、サキナビル、ロピナビル、フォサムプレナビル、リトナビル、アタザナビル、ネルフィナビルの中から選択され、および
(ｂ)逆転写酵素、この場合、既知のタンパク質は、ラミブジン、ザルシタビン、デラビルジン、ジドブリン、エファビレンツ、ジダノシン、ネビラピン、フマル酸テノホビルジソプロキシル、アバカビル、スタブジンの中から選択される。
【００３１】
好ましい態様によれば、標的タンパク質は、以下の中から選択される核受容体である：
(ａ)エストロゲン受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ゲニステイン、タモキシフェン、ＩＣＩ１８２７８０(Faslodex)、ラロキシフェンの中から選択することができ、および
(ｂ)アンドロゲン受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、テストステロン、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸シプロテロン、ミフェプリストン、デヒドロエピアンドロステロン、フルタミドの中から選択することができる、および
(ｃ)グルココルチコイド受容体、この場合、既知のタンパク質リガンドは、デキサメタゾン、酢酸メドロキシプロゲステロン、コルチバゾール、デオキシコルチコステロン、ミフェプリストン、プロピオン酸フルチカゾン、デキサメタゾンの中から選択することができる、および
(ｄ)ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(ＰＰＡＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、グリタゾン類、例えばトログリタゾンの中から選択することができる、および
(ｅ)肝臓Ｘ受容体アルファ(ＬＸＲα)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、Ｔ１３１７(Tularik)であってよい、および
(ｆ)レチノイン酸受容体(ＲＡＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、全-trans-レチノイン酸、９-cis-レチノイン酸の中から選択することができる、および
(ｇ)レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、この場合、既知のタンパク質リガンドは、全-trans-レチノイン酸、９-cis-レチノイン酸の中から選択することができる。
【００３２】
本発明の結合ペプチドを選択する方法における主な制限は、立体配座感受性の結合ペプチドを同定するための既知のリガンド(即ち、薬物)の利用可能性である。例えば、ウイルスの分野において、ウイルス標的タンパク質に結合する抗ウイルス薬物が知られていない場合も多い(即ち、呼吸器多核体ウイルス)。しかし、ウイルスは、その複製のために細胞装置を使用している細胞内寄生体であるので、ウイルスタンパク質は、宿主細胞のタンパク質または分子(ＡＴＰ、ｔＲＮＡ、リボソーム、細胞酵素、・・・)と相互作用している。非常に多くのウイルスタンパク質と、宿主細胞のそれらとの相互作用が、科学文献に報告されている(Tellinghuisen & Rice Curr Opin Microbiol.、2002、5：419-427、ＨＩＶ-１、ヒトタンパク質相互作用データベース、National Institute of Allergy & Infectious Diseases、Loら、J Virol.、1996年8月、70(8)：5177-82)。本発明の別の態様によれば、標的タンパク質に結合するリガンド(即ち、薬理学的アゴニストまたはアンタゴニスト)が知られていない場合には、標的タンパク質と相互作用する細胞またはウイルスタンパク質のいずれかを、立体配座感受性の結合ペプチドを同定する代わりに使用することもできる。標的タンパク質と相互作用するペプチドが同定された場合には、該標的タンパク質と相互作用する該タンパク質をコードする発現ベクターを、標的タンパク質をコードする発現ベクターおよびペプチドライブラリーをコードする発現ベクターを用いて既に修飾した酵母中に導入する。タンパク質／タンパク質相互作用によってブロックされるペプチド(標的の立体配座修飾によるか、または立体障害による標的タンパク質上の認識部位の接近不可能性による)が同定されるであろう。
【００３３】
従って、本発明は、天然の立体配座にある標的タンパク質を結合する結合ペプチドを選択する方法(本発明の工程ＡおよびＢ)であって、以下の工程を含んでなる方法にも関する：
(ａ)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(ｂ)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
(ｃ)(ｂ)で選択したペプチドを、該標的タンパク質と相互作用することが知られている一つのタンパク質の存在下に、該タンパク質に結合する能力についてスクリーニングする工程、および
(ｄ)標的タンパク質と相互作用することが知られている該タンパク質の存在下において該標的タンパク質に結合する能力の減少または非存在を有し、かつ、標的タンパク質と相互作用することが知られている該タンパク質の存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力の保存を有する、(ｃ)でスクリーニングしたペプチドを選択する工程。
【００３４】
標的タンパク質と相互作用するタンパク質が知られていない場合、当業者は、標的タンパク質と相互作用することができるタンパク質を同定する方法を知っている。酵母２-ハイブリッドが、タンパク質-タンパク質相互作用を同定するための有効な手法である。例えば、標的タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを、関心あるヒト細胞からのｃＤＮＡライブラリーの酵母２-ハイブリッドスクリーニングによって単離することができる。ヒトｃＤＮＡライブラリーは、市販品から入手するか、または構築しなければならないであろう。
【００３５】
本明細書において、用語「結合する」または「結合」は、ペプチドと標的タンパク質とが、意図するアッセイを行いうるよう十分に、互いに相互作用、結合、連結、または会合することを意味する。本明細書において、用語「特異的な」または「特異的に」は、ペプチドと標的タンパク質とが互いに選択的に結合し、対象成分への結合が意図されていない他の成分には通常は結合しないことを意味する。特異的な相互作用を達成するのに必要なパラメーターは、定型的に、例えば当分野における常法を用いて決定することができる。
【００３６】
一般に、用語「ライブラリー」は、起源、構造、および／または機能において関連し、かつ、関心ある特性について同時にスクリーニングすることができる化学的または生物学的実体の集団を表す。用語「組合せライブラリー」は、個々の構成要素が、限定された一組の基本要素の体系的またはランダムな組合せのいずれかであるライブラリーを表す(各構成要素の特性は、それに導入される要素の選択および位置に依存する)。通常、ライブラリーの構成要素は、少なくとも同時にスクリーニングすることができる。ランダム化は、完全または部分的であってよい。即ち、一部の位置がランダム化され、他の位置が予め決められていてよく、ランダム位置においては、その選択が予め決めた様式で限定されていてよい。組合せライブラリーの構成要素は、ある種のオリゴマーまたはポリマーであってよく、この際、その変動は、オリゴマーまたはポリマーの一つまたはそれ以上の位置におけるモノマー構成要素の選択によって生じ、また恐らくは、その連結結合あるいはオリゴマーまたはポリマーの長さの点でも生じる。あるいは、該構成要素は、標準コア構造を有する非オリゴマー分子であってよく、この際、その変動は、該コア構造上の特定の変動部位における置換基の選択によって導入される。あるいは、該構成要素は、ジグソーパズルのように組立てた非オリゴマー分子であってよいが、この際、各ピースは、一つまたはそれ以上の可変部分(ライブラリー多様性に寄与する)および一つまたはそれ以上の一定部分(当該ピースが他のピースに結合するための機能性を供する)の両方を有する。
【００３７】
「単純な組合せライブラリー」においては、全ての構成要素が、同じクラスの化合物(例えば、ペプチド)に属しており、同時に合成することができる。「複合組合せライブラリー」は、二つまたはそれ以上の単純なライブラリーの混合物、例えば、ＤＮＡとペプチドまたは化学的化合物である。好ましくは、組合せライブラリーは、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１,０００、なおより好ましくは少なくとも１０,０００、さらにより好ましくは少なくとも１００,０００、最も好ましくは少なくとも１,０００,０００個の異なる分子の多様性を有するであろう。本発明のペプチドライブラリーは組合せライブラリーである。このライブラリーの構成要素は、ペプチド結合によって連結した少なくとも３個のアミノ酸を有するペプチドである。好ましくは、これらは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸の長さである。好ましくは、これらは、５０未満、好ましくは２５未満、より好ましくは１５個未満のアミノ酸から構成される。ペプチドは、直鎖、分岐鎖または環式であってよく、非ペプチジル部分を含んでいてもよい。アミノ酸は、天然のアミノ酸に限定されない。
【００３８】
本発明の細胞は、天然または非天然に、機能的に、適する標的タンパク質を発現する細胞である。好ましくは、細胞は真核細胞である。細胞は、単細胞生物、多細胞生物または中間形態(粘菌)に由来するものであってよい。多細胞生物に由来する場合、それは、無脊椎動物、下等脊椎動物(爬虫類、魚類、両生類)、高等脊椎動物(鳥類、哺乳動物)、または植物であってよい。好ましい態様によれば、本発明の方法の工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)の細胞は、完全な多細胞生物または生物の組織もしくは器官に組込まれていない細胞、好ましくは単離した細胞である。
【００３９】
好ましい態様によれば、結合ペプチドの選択に使用する細胞(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)は、非哺乳動物の真核細胞、好ましくは酵母細胞である。好ましくは、酵母細胞は、以下の属のいずれかのものである：サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、ピチア(Pichia)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、クリプロコッカス(Cryptococcus)、ヤロウイア(Yarrowia)、およびザイゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)。より好ましくは、これらは、Saccharomyces cerevisiae種のものである。興味ある他の非哺乳動物細胞には、植物細胞(例えば、シロイヌナズナ)、節足動物細胞、環形動物、または線虫細胞(例えば、線虫（Caenorhabditis elegans）、プラナリア、ヒル、ミミズ、環形動物多毛類)、甲殻類(例えば、ミジンコ)、原生動物細胞(例えば、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）)、および下等脊椎動物(爬虫類、両生類、魚類)細胞が含まれる。
【００４０】
好ましい態様によれば、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、動物またはヒト起源の哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の非限定的な例は、ヒト一次細胞、ヒト胚細胞、ヒト細胞系統である。好ましい態様において、ヒト細胞は継続ヒト細胞系統であり、ヒト細胞系統の非限定的な例には、Ｈｅｌａ、Ｈｕｈ７、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、ＨＥＫ-２９３、ＭＣＦ７が含まれる。また、該ヒト細胞は、胚細胞、好ましくは、全能性細胞(即ち、胚幹細胞、ＥＳ細胞)、多能性、複能性、および単能性細胞の中から選択される胚細胞である。特定の態様において、細胞はヒトＥＳ細胞であり、標的タンパク質は、ＥＳ細胞からヒト分化細胞への分化経路の制御に関与している重要タンパク質である。第２の態様において、該細胞は、動物細胞、例えば、動物一次細胞、動物胚細胞、および動物細胞系統の中から選択される。動物細胞系統の非限定的な例には、ＶＥＲＯ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、および３Ｔ３が含まれる。標的タンパク質がＣ型またはＢ型肝炎ウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトの肝細胞または肝細胞系統である。肝細胞系統の非限定的な例は、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐａＲＧである。標的タンパク質がＨＩＶウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトのリンパ球またはリンパ芽球様細胞系統、例えばＨＬ６０、Ｕ９３７、ＴＦ-１、Ｋ５６２、およびＩＭ-９である。標的タンパク質がインフルエンザまたはＲＳＶウイルスタンパク質である場合には、試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、好ましくは、動物またはヒトの上皮細胞系統である。肺細胞系統の非限定的な例は、Ａ５４９およびＨＥｐ-２である。
【００４１】
結合ペプチドの選択に使用する各細胞(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)は、
−該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分および
−該ペプチドの組合せライブラリーの一つの構成要素、
を同時発現し、
各細胞は、該ライブラリーの該構成要素が、該細胞中または該細胞上で該標的タンパク質または部分を結合したか否かの指標であるシグナルを生成するように、該標的タンパク質もしくは標的タンパク質の変異体または部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供する。
【００４２】
好ましくは、レポーター遺伝子発現によって生成する該シグナルは、測定可能な定量性シグナルである。
【００４３】
好ましくは、測定される該シグナルの合計量は、標的タンパク質またはその変異体に特異的に結合したペプチドの数に比例し、結合の増加、保存、減少、または非存在の尺度を与える(対照または参照試料と比較して)。
【００４４】
該ペプチドが該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合した場合にシグナルが生成する。該シグナルは、該ペプチドが、該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体に結合する能力が減少するまたはそれに結合することができず、該標的タンパク質に対する既知のリガンドにリガンド化される場合に、減少するかまたは非存在である。
【００４５】
試験化合物の選択および試験に使用する細胞(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)は、
(ａ)該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分、および
(ｂ)工程(Ｂ)で選択され、既知のリガンドの非存在下において該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合することができる該ペプチド、
を同時発現し、
該細胞が、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供し、それにより、
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、それにより、該ペプチドが工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞中または細胞上で該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体または部分を結合すること、ならびに、該試験化合物が該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾しないことの指標であるシグナルを生成する、あるいは
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合の減少または非存在が、機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を可能にせず、それにより、該試験化合物が該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾することの指標であるシグナルを生成しない。
【００４６】
本発明の方法のシグナル生成系は、細胞にとって内生的なシグナル生成系および細胞にとって外生的なシグナル生成系の中から選択される。好ましくは、該シグナル生成系は、細胞にとって内生的である。シグナル生成系は、キメラタンパク質を供給するための標的タンパク質または部分に融合させたタンパク質結合した成分ならびにキメラペプチドを供給するためのペプチドに融合させたペプチド結合した成分を含んでなり、これにより、ペプチド結合およびタンパク質結合した成分が、ペプチドの標的タンパク質への結合の結果として物理的に接近することになった場合に、シグナルを生成する。該成分はＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)であり、別の該成分は相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)であり、シグナル生成系は、該ＤＮＡ結合ドメインによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子をさらに含み、ペプチドの標的タンパク質への結合は、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与える。
【００４７】
本発明のシグナル生成系は、
(i)キメラペプチドを供給するためのペプチドに融合させた相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)、該ＡＤは、好ましくは、大腸菌Ｂ４２、Ｇａｌ４活性化ドメインII、およびＨＳＶ ＶＰ１６からなる群から選択され、
(ii)キメラタンパク質を供給するための標的タンパク質に融合させたＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、該ＤＢＤは、好ましくは、Ｇａｌ４およびＬｅｘＡからなる群から選択され、ならびに
(iii)該ＤＢＤによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子を含むシグナル生成系
を含んでなり、これにより、該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、これにより、該ペプチドの、該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体またはそのリガンド結合タンパク質部分への結合の指標であるシグナルが、工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、または(Ｄ)において使用する細胞中または細胞上に生成する。
【００４８】
検出を行うために当業者が適応させて普通に使用する手段(即ち、ヒトの眼、分光光度計など)によってシグナルが検出可能である場合に、シグナルは「生成する」。結合が非存在であったことを示すのは、当業者がレポーター遺伝子発現の検出に普通に使用する手段によってシグナルが検出されなかった場合である。結合が減少したことを示すのは、レポーター遺伝子発現によって生成するシグナルの減少が、特異的な結合が起こった場合に生成するシグナルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である場合である。
【００４９】
シグナルが、問題にしている細胞の死または生存である場合には、このアッセイは選択であると言われる。シグナルが、単に検出可能な表現型(これにより、シグナル発信細胞が同じ細胞から非シグナル発信状態に分化することができる)になる場合には、このアッセイはスクリーニングである。しかし、本発明における用語「スクリーニング」は、選択を含む広い意味で使用することができる。本発明によれば、「レポーター遺伝子」は、一つの細胞における遺伝子の発現が、大きい細胞集団における該細胞の検出を可能にする遺伝子を意味する(即ち、該レポーター遺伝子を発現しているかまたは発現していない細胞の区別を可能にする)。本発明のレポーター遺伝子には、検出可能な表現型レポーター遺伝子および耐性選択遺伝子が含まれる。耐性選択遺伝子の非限定的な例には、以下の酵母遺伝子が含まれる：３-イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(ＬＥＵ２)、ホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ(ＴＲＰ１)、イミダゾール-グリセロール-ホスフェートデヒドラターゼ(ＨＩＳ３)、オロチジン-５'-ホスフェート(ＯＭＰ)デカルボキシラーゼ(ＵＲＡ３)、および抗生物質耐性遺伝子。抗生物質の中では、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ゲネチシン、プロマイシン、ブラスチシジンを挙げることができる。抗生物質耐性遺伝子は、当業者にとって周知である。例えば、ネオマイシン遺伝子は、細胞培養培地に添加したＧ４１８抗生物質に対する耐性を有する細胞を与える。また、検出可能な表現型レポーター遺伝子の非限定的な例には、以下の遺伝子が含まれる：ＤＨＦＲ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アデニル酸シクラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ-ガラクトシダーゼ、および自己-蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ならびにその全ての変異体および誘導化蛍光タンパク質)。シグナル生成系は、レポーター遺伝子の他に、シグナルの生成において協力する追加の遺伝子または生化学要素を含むことができる。このような要素は、例えば、酵素であるレポーター遺伝子の基質であることができる。
【００５０】
一つを超えるシグナル生成系が存在することができ、該系は一つを超えるレポーター遺伝子を含むことができる。
【００５１】
好ましい態様によれば、結合ペプチドを選択する方法(本発明の方法の工程ＡおよびＢ)を、酵母細胞において行い、シグナル生成系は、少なくとも二つのレポーター遺伝子を直列して含み、一つの耐性選択遺伝子を、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３の中から選択し、一つのレポーター遺伝子を、ルシフェラーゼ、自己-蛍光タンパク質、およびベータ-ガラクトシダーゼの中から選択する。別の好ましい態様において、本発明の試験化合物を選択する方法(本発明の方法の工程ＣおよびＤ)を、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において行い、シグナル生成系は、ルシフェラーゼ、自己-蛍光タンパク質およびベータ-ガラクトシダーゼの中から選択される少なくとも一つのレポーター遺伝子を含んでいる。試験化合物は、内生的に、または好ましくは、工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞に外生的に添加する。
【００５２】
本発明は、候補薬物が標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に対して活性であるか否かを予測するために、ならびに、最も広い作用範囲を有する薬物候補を選択するために有用である。
【００５３】
また、本発明は、本発明の方法によって選択した試験化合物にも関する。本発明の選択した試験化合物を、アッセイのヒットとして、薬物開発のための新たな候補分子を構成するヒットの同定のために使用することができる。また、本発明は、標的タンパク質の野生型、標的タンパク質の多型、標的タンパク質の耐性突然変異体に対して広い作用スペクトルを有する薬物として、特に、疾患、例えば、限定することなく例としてヒトおよび動物のウイルス疾患ならびにヒトおよび動物の癌の予防および治療処置のために、本発明の選択した試験化合物を使用することにも関する。
【００５４】
また、本発明は、
・ＤＧＣＡＲＣＶＡＳＶＱＬＹＧＤ （配列番号５９）、
・ＷＲＰＹＹＴＶＬＣＡＬＡＳＷＨ （配列番号６０）、
・ＰＳＮＨＲＱＳＴＲＳＴＰＷＬＷ （配列番号６１）、
・ＹＣＣＰＷＮＫＬＲＬＶＦＱＳ （配列番号６２）、
・ＴＨＬＶＬＣＤＡＲＴＣＬＮＹＶ （配列番号６３）、
・ＧＴＱＫＥＡＶＩＹＰＣＹＶＰＷ （配列番号６４）、
・ＶＮＡＷＡＷＧＷ （配列番号６５）、
・ＴＬＰＩＧＴＫＡＤＦＬＷＬＰＦ （配列番号６６）、
・ＬＬＧＰＹＰＮＬＴＴＬＣＰＰＷ （配列番号６７）、および
・ＬＬＨＬＬＡＨＨＬＲＨＩＡＲＡ （配列番号６８）、
からなる群から選択される単離したペプチドあるいは該ペプチドを含んでなる組換えベクターまたは宿主細胞にも関する。
【００５５】
また、本発明は、本発明に従ってＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するための方法であって、ペプチド：
−ＤＧＣＡＲＣＶＡＳＶＱＬＹＧＤ（配列番号５９）またはＹＣＣＰＷＮＫＬＲＬＶＦＱＳ（配列番号６２）：これは標的タンパク質がＨＣＶ ＮＳ５Ｂである場合、
−ＷＲＰＹＹＴＶＬＣＡＬＡＳＷＨ（配列番号６０）またはＴＨＬＶＬＣＤＡＲＴＣＬＮＹＶ（配列番号６３）：これは標的タンパク質がＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼである場合、および
−ＰＳＮＨＲＱＳＴＲＳＴＰＷＬＷ（配列番号６１）、ＧＴＱＫＥＡＶＩＹＰＣＹＶＰＷ（配列番号６４）、ＶＮＡＷＡＷＧＷ（配列番号６５）、ＴＬＰＩＧＴＫＡＤＦＬＷＬＰＦ（配列番号６６）、ＬＬＧＰＹＰＮＬＴＴＬＣＰＰＷ（配列番号６７）またはＬＬＨＬＬＡＨＨＬＲＨＩＡＲＡ（配列番号６８）：これは標的タンパク質がＨＣＶ完全長ＮＳ３である場合、
の結合を減少させる能力について、該試験化合物を試験する工程を含んでなることを特徴とする方法にも関する。
【実施例】
【００５６】
実施例１：原材料
１.１．化学物質：
エストラジオール、リバビリン、ホスホノ酢酸、およびフォスカーネットは、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３４７７(Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン)は、Pratt JK (2005)に記載されているように合成した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３４７６(１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド)は、Harper S (2005)に記載されているように合成した。
化合物ｃＶＶＳ-０２３５１８(２-(２-{２-シクロヘキシル-２-[(ピラジン-２-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-３,３-ジメチル-ブチリル)-オクタヒドロ-シクロペンタ[ｃ]ピロール-１-カルボン酸(１-シクロプロピルアミノオキサリル-ブチル)-アミド)[これは、TelaprevirＲまたはＶＸ-９５０(Vertex Pharmaceuticals Inc.)とも称される]は、国際公開第０２／１８３Ａ２号(Babine R、2002)に記載されているように合成した。
Ｘ-Ｇａｌ(５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド)は、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した。
【００５７】
以下の実施例において表示および使用した立体配座感受性ペプチド(３Ｄセンサー)のアミノ酸配列：
【表１】
【００５８】
１.２．緩衝液：
溶解緩衝液：トリス-リン酸ｐＨ７.８(２５ｍＭ)＋ＥＤＴＡ(２ｍＭ)＋ＤＴＴ(１ｍＭ)＋グリセロール(１０％)＋トリトン(１％)。
ルシフェリン緩衝液：トリス-リン酸ｐＨ７.８(２０ｍＭ)＋ＤＴＴ(５００ｍＭ)＋ＭｇＣｌ2(１.０７ｍＭ)＋ＭｇＳＯ4(２.７ｍＭ)＋ＥＤＴＡ(０.１ｍＭ)＋ＡＴＰ(０.５３ｍＭ)＋アセチル補酵素Ａ(０.２７ｍＭ)＋ルシフェリン(０.４７ｍＭ)。
全ての成分をSigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入した、ただし、ルシフェリンはPromega(Charbonnieres、仏国)から購入した。
Ｘ-Ｇａｌ溶液：１０ｍｌの０.５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4＋ＮａＨ2ＰＯ4＋５０μｌの２０％ＳＤＳ＋１００μｌの２％Ｘ-Ｇａｌ(ＤＭＦ中)。
【００５９】
１.３．ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、Invitrogen(Cergy Pontoise、仏国)から入手した。
【００６０】
１.４．酵素：
制限および連結酵素は、Promega(Charbonnieres、仏国)から購入し、製造元の推奨に従って使用した。ＰＣＲは、製造元の指示に従ってUptithermポリメラーゼを用いて行った(Interchim、Montlucon、仏国)。
【００６１】
１.５．酵母株および培養条件：
Saccharomyces cerevisiae酵母株Ｌ４０(MATa、his3-Δ200、Ieu2-3,112、trp1-901、[plexAop]4::HIS3、[plexAop]8::lacZ))(ATCC、Molsheim、仏国)は、液体(激しい震盪を伴う)または固体ＹＰＤもしくはＳＤ培地(アミノ酸を補足する)のいずれかにおいて３０℃で培養した。ＹＰＤ培地は、以下のように構成されていた：バクト-酵母抽出物１％、バクト-ペプトン２％、グルコース２％(バクト-寒天２％を含むかまたは含まない)(Difcoから購入)。ＳＤ培地は、以下のように構成されていた：酵母窒素ベース(アミノ酸を含まない)０.６７％、グルコース２％(バクト-寒天２％を含むかまたは含まない)(Difco、パリ、仏国から購入)。アミノ酸は、Sigma-Aldrich(Lyon、仏国)から購入し、以下のように添加した：硫酸アデニン(２０ｍｇ/ｌ ＳＤ)、Ｌ-トリプトファン(５０ｍｇ／ｌ ＳＤ)、Ｌ-ヒスチジン(５０ｍｇ／ｌ ＳＤ、Ｌ-ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン(それぞれ６０ｍｇ／ｌ ＳＤ)。
【００６２】
実施例２：組換えプラスミド
２.１．酵母発現プラスミド
ｐＶＶＳ４６８は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢΔ２１の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel & Fields、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢＤ２１の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ５Ｂ完全長を保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：
順方向プライマー：
5' TATCTCGAGTCAATGTCCTACACATGGACAGGTG 3' (配列番号３)、
逆方向プライマー：
5' AGATCTGCAGTTAACGGGGTCGGGCACGAG 3' (配列番号４)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(thermocycler)(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６３】
ｐＶＶＳ６０１は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel & Fields、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。実のところ、ＮＳ３プロテアーゼは、最適の立体配座および活性のために、ＮＳ４Ａに複合化する(二つのタンパク質の間のシス切断後)ことが示されている(Linら、1995)。一本鎖組換えＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼドメインは、完全なタンパク質分解活性を示す(Taremiら、1998)。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカーおよびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜１８１)を得るために使用した：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTAGT
ATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号５)、
逆方向プライマー：
5' ACCTCGAGCAGCGCCTATCACGGCCTATTCCC 3' (配列番号６)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６４】
ｐＶＶＳ７７５は、遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３完全長の配列(GenBank D89872)を、ｐＢＴＭ１１６(Bartel、1995)のポリリンカーのＸｈｏＩおよびＢｇｌII制限部位の間に、ＬｅｘＡ(Genbank U89960)と枠内であるように挿入することによって得た。融合タンパク質の発現は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下にある。遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ ＮＳ３完全長を保持するｐＩＶ２９４プラスミド(Dr Catherine Schusterの寄贈品、Strasbourg、仏国)のＰＣＲ増幅によって得た。ＮＳ３プロテアーゼは、最適の立体配座および活性のために、ＮＳ４Ａに複合化することが示されているので(Linら、1995)、一本鎖組換えＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質は、完全なタンパク質分解およびヘリカーゼ活性を示す(Howeら、1999)。さらに、このような組換え一本鎖タンパク質の結晶構造は、天然の複合ＮＳ３-ＮＳ４Ａに重ねられることが示されている(Yaoら、1999)。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカー、およびＮＳ３完全長(残基３〜６３１)を得るために使用した：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTAGT
ATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号７)、
逆方向プライマー：
5' ATAGATCTTTTAAGTGACGACCTCCAGG 3' (配列番号８)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００６５】
ｐＶＶＳ６２５は、ｐＶＰ１６(Hollenbergら、1995)から、ＳｆｉＩによる消化およびＰＣＲによって創製したランダム１５アミノ酸ペプチドライブラリーの挿入によって誘導した。
【００６６】
２.２．哺乳動物発現プラスミド
ｐＶＶＳ５７８は、プラスミドｐＵＡＳＬｕｃ(Thielら、2000)から誘導した。これは、５つのＧａｌ４-結合部位およびヒト-βグロビン遺伝子の最小プロモーター、それに続くホタルルシフェラーゼコード配列から構成されるレポーター構築物を含んでいる。
【００６７】
ｐＶＶＳ４７８は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ５ＢΔ２１配列を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。ＮＳ５ＢΔ２１挿入体は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TTC CTC GAG GAT CAA TGT CCT ACA CAT GG 3' (配列番号９)、
逆方向プライマー：
5' GCT CGG ATC CCA GCT CTC AAC GGG GTC GGG 3' (配列番号１０)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間)を行った。
【００６８】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene、アムステルダム、オランダ国)に従って使用して、ＮＳ５ＢΔ２１配列中に単一突然変異を導入した。
【００６９】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ４７４を創製した：
Ｌ３０Ｓ突然変異のための順方向プライマー：
5' AATCCGTTGAGCAACTCTTCGCTGCGTCACCACAGTATG 3' (配列番号１１)、
Ｌ３０Ｓ突然変異のための逆方向プライマー：
5' ATACTGTGGTGACGCAGCGAAGAGTTGCTCAACGGATT 3' (配列番号１２)。
【００７０】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ４７５を創製した：
Ｌ３０Ｒ突然変異のための順方向プライマー：
5' AATCCGTTGAGCAACTCTCGGCTGCGTCACCACAGTATG 3' (配列番号１３)、
Ｌ３０Ｒ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CATACTGTGGTGACGCAGCCGAGAGTTGCTCAACGGATT 3' (配列番号１４)。
【００７１】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ５１７を創製した：
Ｈ９５Ｒ突然変異のための順方向プライマー：
5' CTGACGCCCCCACGCTCGGCCAAATCC 3' (配列番号１５)、
Ｈ９５Ｒ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CTGACGCCCCCACGCTCGGCCAAATCC 3' (配列番号１６)。
【００７２】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ５１６を創製した：
Ｍ４１４Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１７)、
Ｍ４１４Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１８)。
【００７３】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８９を創製した：
Ｇ１５２Ｅ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号１９)、
Ｇ１５２Ｅ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GGCAATATCATCACCTATGCGCCCACC 3' (配列番号２０)。
【００７４】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９５を創製した：
Ｍ４２３Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' CTATGGGCGAGGACGATTCTGATGACT 3' (配列番号２１)、
Ｍ４２３Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' AGTCATCAGAATCGTCCTCGCCCATAG 3' (配列番号２２)。
【００７５】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＷＳ７８８を創製した：
Ｎ１４２Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' ATCATGGCAAAAACTGAGGTTTTCTG 3' (配列番号２３)、
Ｎ１４２Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CAGAAAACCTCAGTTTTTGCCATGAT 3' (配列番号２４)。
【００７６】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９０を創製した：
Ｐ１５６Ｌ突然変異のための順方向プライマー：
5' GAGGCCGCAAGCTAGCTCGCCTTATCG 3' (配列番号２５)、
Ｐ１５６Ｌ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CGATAAGGCGAGCTAGCTTGCGGCCTC 3' (配列番号２６)。
【００７７】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９７を創製した：
Ｐ４９５Ｌ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGAAACTTGGGGTACTACCCTTGCGAG 3' (配列番号２７)、
Ｐ４９５Ｌ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CTCGCAAGGGTAGTACCCCAAGTTTCC 3' (配列番号２８)。
【００７８】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９１を創製した：
Ｓ２８２Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGTGCCGCGCGACCGGCGTGCTGA 3' (配列番号２９)、
Ｓ２８２Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' TCAGCACGCCGGTCGCGCGGCACC 3' (配列番号３０)。
【００７９】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９９を創製した：
Ｓ３６８Ａ突然変異のための順方向プライマー：
5' GTCATGCTCCGCCAATGTGTCG 3' (配列番号３１)、
Ｓ３６８Ａ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CGACACATTGGCGGAGCATGAC 3' (配列番号３２)。
【００８０】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９４を創製した：
Ｓ４１９Ｍ突然変異のための順方向プライマー：
5' ATGCGCCCACCATGTGGGCGAGGATG 3' (配列番号３３)、
Ｓ４１９Ｍ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CATCCTCGCCCACATGGTGGGCGCAT 3' (配列番号３４)。
【００８１】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８７を創製した：
Ｓ９６Ｔ突然変異のための順方向プライマー：
5' ACGCCCCCACATACGGCCAAATCCAAA 3' (配列番号３５)、
Ｓ９６Ｔ突然変異のための逆方向プライマー：
5' TTTGGATTTGGCCGTATGTGGGGGCGT 3' (配列番号３６)。
【００８２】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７９６を創製した：
Ｙ４４８Ｍ突然変異のための順方向プライマー：
5' GTAGCAGGCCCCCATGATCTGACA 3' (配列番号３７)、
Ｙ４４８Ｍ突然変異のための逆方向プライマー：
5' GTAGCAGGCCCCCATGATCTGACA 3' (配列番号３８)。
【００８３】
ｐＶＶＳ６０２は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏＩおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３の配列を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。一本鎖構築ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカー、およびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜１８１)(Taremiら、1998)は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGCAGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTA
GTATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号３９)、
逆方向プライマー：
5' ACCTCGAGCAGCGCCTATCACGGCCTATTCCC 3' (配列番号４０)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００８４】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene)に従って使用して、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ配列中に単一突然変異を導入した。
【００８５】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８１を創製した：
Ａ１５６Ｖ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCATCTTCCGGGTTGCTGTGTG 3' (配列番号４１)、
Ａ１５６Ｖ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CACACAGCAACCCGGAAGATGCC 3' (配列番号４２)。
【００８６】
ｐＶＶＳ７７２は、ｐＧ４ｍポリII(Webster N J G、1989)から、ポリリンカーをＸｈｏおよびＢａｍＨ１で消化し、酵母Ｇａｌ４ ＤＢＤ(GenBank AY647987)のカルボキシ末端と枠内であるように遺伝子型１ｂ ＨＣＶ ＮＳ３完全長配列(GenBank D89872)を挿入することによって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にある。一本鎖構築物ＮＳ４Ａ(残基２１〜３２)、ＧＳＧＳリンカーおよびＮＳ３プロテアーゼ(残基３〜６３１)(Howeら、1999)は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｐＩＶ２９４プラスミドのＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TACTCGAGCAGGTTCTGTTGTTATTGTTGGTAGAATTATTTTATCTGGTAGTGGTA
GTATCACGGCCTATTCCCAACAAACGCGGG 3' (配列番号４３)、
逆方向プライマー：
5' ATAGATCTTTTAAGTGACGACCTCCAGG 3' (配列番号４４)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間)を行った。
【００８７】
QuickChange II XL部位指向性突然変異誘発キットを製造元の指示(Stratagene、アムステルダム、オランダ国)に従って使用して、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長配列中に単一突然変異を導入した。
【００８８】
以下のプライマーを使用してプラスミドｐＶＶＳ７８３を創製した：
Ａ１５６Ｖ突然変異のための順方向プライマー：
5' GGCATCTTCCGGGTTGCTGTGTG 3' (配列番号４５)、
Ａ１５６Ｖ突然変異のための逆方向プライマー：
5' CACACAGCAACCCGGAAGATGCC 3' (配列番号４６)。
【００８９】
ｐＶＶＳ５２７は、ウイルスＶＰ１６活性化ドメイン(GenBank AF294982)のカルボキシ末端を含む枠と枠内で、選択したペプチドの受容体であるように、ｐＣＩＮｅｏ(Promega)から誘導した。
【００９０】
ｐＶＶＳ５５０は、ｐＶＶＳ５２７から、ＳｆｉＩ消化および選択したペプチドＮ２１Ｃ２７２コード配列の挿入によって誘導した。融合タンパク質の発現は、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【００９１】
挿入体を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって得た：
順方向プライマー：
5' TCCTTAAGGGAGATGTGAGCAT 3' (配列番号４７)、
逆方向プライマー：
5' CAAGGCGATTAAGTTGGTAAC 3' (配列番号４８)。
ＰＣＲ増幅は、Ｔ１サーモサイクラー(Biometra)を用いて、９６℃で３分間、続いて３５サイクル(９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１分間)を行った。
【００９２】
実施例３：バイトと相互作用するペプチドの同定
ナイーブな酵母を、酢酸リチウム形質転換プロトコール(Schiestlら、1989)に従って、ｐＶＶＳ４６８(ＬｅｘＡに融合したＮＳ５ＢΔ２１)で形質転換した。形質転換体を、選択圧(トリプトファンを含まないＳＤ培地)下に液体培養で増殖させ、次いでｐＶＶＳ６２５(ウイルスＶＰ１６活性化ドメインと枠内にあるランダムペプチドのライブラリー)で形質転換した。得られた二重形質転換体を、トリプトファンおよびロイシンを欠くＳＤ寒天培地に広げ、３０℃で４８時間インキュベートした。次いで、コロニーを剥ぎ取り、混合した。得られた１／５００の懸濁液を、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを欠くＳＤ寒天培地にプレーティングしてＨＩＳ３レポーターの活性化を同定した。増殖の３〜５日後に、Ｘ-Ｇａｌを重ねてＬａｃＺ活性化を同定した。Ｘ-Ｇａｌ溶液を、５０℃に冷却した等容量の１％アガロースと混合し、次いで寒天プレート表面の酵母コロニー上にゆっくり注いだ。青色に染まった個々のクローンを拾い上げ、深いウエルにおいて一晩増殖させ、さらに分析した。
【００９３】
３.１．３Ｄセンサーの同定
バイトと相互作用するペプチドを含む酵母コロニーを、９６ウエルの深いウエル中のｔｒｐ-ｌｅｕ-液体培地において一晩増殖させた。次いで、これらを、プラガー(充填器)を用いて、異なる濃度の特異的または非特異的薬物あるいは等量の溶媒(ＤＭＳＯ)を補足したｔｒｐ-ｌｅｕ-ｈｉｓ-固体培地またはｔｒｐ-ｌｅｕ-固体培地のいずれかの上にスポッティングした。レポーター遺伝子の発現を解き放つ酵母コロニーを選択した。結果を、少なくとも３回確認した。
【００９４】
使用した別の方法は、半定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイであった。酵母コロニーを、異なる濃度の参照薬物を含むかまたは含まない液体選択培地において、上記のように増殖させた。細胞ペレットを、Ｙ-ＰＥＲタンパク質抽出試薬(Pierce、Brebieres、仏国)(１００ｕｌ)に再懸濁させた。３００ｒｐｍで３０分間の震盪の後、上清を透明化し、全タンパク質濃度を、Micro BCAタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce、製造元の指示に従う)を用いて測定した。０.６６ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ(Ｏ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド)溶液(Sigma-Aldrich、Lyon、仏国)(１８０ｕｌ)を添加することにより、タンパク質抽出物(５ｕｌ)を用いてＬａｃＺ活性を測定した。黄色の発色が現れたとき直ちにＮａ2ＣＯ3の１モル溶液(７５ｕｌ)を加えることによって反応を停止させた。分光光度計において４２０ｎｍでＯＤを測定し、以下の式を用いて比活性を算出した：
比活性(ｎｍｏｌ/ｍｇ/分)＝ＯＤ420×Ｖt/(0.0045×Protein×Ｖe×Time)
[式中、Ｖｔは全反応量(１６０ｕｌ)であり、Proteinは酵母抽出物のタンパク質濃度(ｍｇ／ｍｌ)であり、Ｖｅはアッセイされた抽出物容量(ｍｌ)であり、Timeは反応時間(分)である]。
【００９５】
３.２．プラスミドレスキュー
プラスミド抽出のために、レポーター発現が特異的薬物によって阻害された酵母クローンを、ｔｒｐ-ｌｅｕ-液体培地において増殖させた。一晩飽和培養物(２ｍｌ)を、微量遠心機で５分間沈降させ、ペレットを、２５００単位／ｍｌのLyticase(Sigma-Aldrich、Lyon、仏国)(２０μｌ)を補足した溶解緩衝液(８０ｕｌ)に再懸濁させた。懸濁液を、２２０ｒｐｍで震盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。２０％ＳＤＳ(２０μｌ)を添加し、混合物を１分間渦撹拌した。次いで、混合物を、Nucleospin Plasmid Quickpureを製造元の指示(Macherey Nagel、Hoerdt、仏国)に従って用いて精製した。精製した溶出物に対して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った：
順方向プライマー：5' TCCTTAAGGGAGATGTGAGCAT 3' (配列番号４９)、
逆方向プライマー：5' CAAGGCGATTAAGTTGGTAAC 3' (配列番号５０)。
ＰＣＲ生成物を配列決定し、ｐＶＶＳ５２７ベクターにおいてクローンした(上記のように)。プラスミドを、酵素制限およびＤＮＡ配列決定によって精製および確認した。
【００９６】
３.３．細胞系統および培養条件
Ｈｅｌａ細胞(ATCC、Molsheim、仏国)を、１０％ＦＢＳ(JRH)、２ｍＭグルタミン(Biowhittaker/Cambrex)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker/Cambrex)、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＥＭＥＭ(Eagleの最小必須培地、Earleのバランス塩溶液を含みＬ-グルタミンを含まない、Biowhittaker/Cambrex、East Rutherford、New Jersey、米国)において維持した。細胞を、湿度調節した５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で維持し、８０〜９０％全面に達したときにトリプシン-ＥＤＴＡ(IX)を用いて分離した。
【００９７】
Ｈｕｈ７肝癌由来細胞(Nakabayashi Hら、1982)を、１０％ＦＢＳ(SAFC、米国)、１ｍＭグルタミン(Lonza、Basel、スイス国)、０.５ｍＭピルビン酸ナトリウム(Lonza、Basel、スイス国)、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した、半分容量のＤＭＥＭ(Dulbeccoの最小必須培地、Ｌ-グルタミンを含まないEagle培地、Lonza、Basel、スイス国)および半分容量のHamのＦ１２培地(Lonza、Basel、スイス国)において維持した。細胞を、湿度調節した５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で維持し、８０〜９０％全面に達した場合にトリプシン-ＥＤＴＡ(IX)を用いて分離した。
【００９８】
３.４．ＨｅｌａおよびＨｕｈ７細胞のトランスフェクション実験
Ｎ／Ｐ比が８でjetPEI(PolyPLusトランスフェクション、Illkirch、仏国)に複合させた５〜２０ｕｇの合計ＤＮＡを用いて、２００万〜４００万細胞において、１００ｍｍ皿中で２時間、トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼレポーター、標的および選択した３Ｄセンサーをコードするプラスミドの間の最適比は、３ｕｇ／１ｕｇ／０.５ｕｇであった。細胞を分離し、ウエルあたり２５０００細胞を、９６ウエル培養処理プレート(BD Biosciences、Erembodegem、ベルギー国)に蒔いた。
【００９９】
３.５．小分子ライブラリーのスクリーニング
化合物ライブラリーのプレートを室温で解凍した。薬物をGenesisワークステーション(Tecan、Lyon、仏国)によって取り扱い、細胞に５ｕＭ(０.５％ＤＭＳＯ中)最終濃度で添加した。２０プレートの実施によってスクリーニングを行った。ルシフェラーゼ活性の測定によってヒットを同定した。
【０１００】
３.６．ルシフェラーゼアッセイ
細胞培養上清を捨て、溶解緩衝液(１００ｕｌ)を各ウエルに加えた。１０分間の激しい震盪の後、溶解液を白色不透明な９６ウエルプレートに移し、ルシフェリン緩衝液(１００ｕｌ)を加えた。直ちに、Microlumat LB96照度計(Berthold、Thoiry、仏国)を用い、１秒または１０秒の積分時間で化学発光測定を行った。
【０１０１】
３.７．細胞毒性アッセイ
上記のようにトランスフェクトされ、９６ウエルプレートに蒔かれ、薬物とともに２４時間インキュベートされた細胞において、生存性測定を行った。０.１５ｍｇ／ｍｌのＸＴＴ溶液(Roche Diagnostics、Meylan、仏国)を各ウエルに添加し、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。各ウエルの細胞培養上清の光学密度を、分光光度計を用いて分析した(４５０ｎｍにおいて、６９０ｎｍにおけるバックグラウンドシグナルを差し引く)。
【０１０２】
３.８．ＩＣ50測定実験
選択したヒットを、０.０１ｕＭ〜１００ｕＭ最終濃度に変化する濃度で合成および試験して、そのＩＣ50を三つの独立した実験において測定した。
【０１０３】
実施例４：３Ｄスクリーン-ＮＳ５Ｂプラットホーム
４.１．酵母においてＮＳ５ＢΔ２１と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ／Ｃ末端２１アミノ酸を欠く先端切除ＨＣＶポリメラーゼ]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０株(ATCC、Molsheim、仏国)において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。このＣ末端２１アミノ酸ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、２-ハイブリッドアプローチの実現可能性を低下させる(Yamashitaら、1998、Dimitrivaら、2003)。この２１アミノ酸ドメインの除去は、ＮＳ５Ｂ活性を低下させず、全体のタンパク質立体配座に小さな変化を導入する(Yamashitaら、1998、Tomeiら、2000)。合計して５７６のコロニーを、選択条件下で増殖するその能力に対して選択した(図１ａ)。次いで、ｃＶＶＳ-０２３４７７またはｃＶＶＳ-０２３４７６の選択した個々の酵母コロニーに、標的ポリメラーゼにおいて立体配座変化を誘発することが知られている二つの抗ＮＳ５Ｂ薬物を添加することによって、立体配座感受性ペプチドまたは「３Ｄセンサー」を同定した(図１ｂ)。１６コロニーの増殖およびＬａｃＺ発現を、ｃＶＶＳ-０２３４７７、ベンゾチアジアジンのファミリーに属する化合物(Prattら、2005)の添加によって停止させた。また、別の２２コロニーを、半定量的アプローチを用いて、ｃＶＶＳ-０２３４７６、インドール-Ｎ-アセトアミド化合物(Harperら、2005)により同定した(データは示さず)。
【０１０４】
選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。図１ｃは、ヒスチジンの非存在下およびｃＶＶＳ-０２３４７７(ベンゾサイアジアザイド抗ＮＳ５Ｂ)または非特異的ウイルスポリメラーゼリガンドのいずれかの存在下においての、増殖およびＮ２１Ｃ２７２(最も感受性の高いペプチド)のｌａｃＺ発現を示す。フォスカーネット、抗ＣＭＶ／ＨＩＶポリメラーゼ(Crumpackerら、1992、Lietmanら、1992)およびその類似体、ホスホノ酢酸(ＰＡＡ)(Crumpackerら、1992)は、この選択したクローンに効果を有していなかった。また、エストラジオールを陰性対照として使用したが、これは、本発明者らのグループによって以前に報告された３ＤセンサーＮｏ.３０.２-ＥＲ相互作用(国際公開第２００６／０４６１３４号パンフレットを参照)に活性であった(即ち、上記した抗ＮＳ５Ｂによって影響を受けない)。
【０１０５】
ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１０６】
４.２．ヒト細胞における３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、ヒト細胞においてさらに調べた。Ｈｅｌａ細胞を選択した理由には、その広い用途、操作の容易性、およびサブゲノムＨＣＶレプリコンを複製する能力が挙げられる(Zhuら、2003、Katoら、2005)。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)標的ポリメラーゼ(酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合したＮＳ５ＢΔ２１)、および(iii)複合体[ＮＳ５ＢΔ２１／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。選択した３Ｄセンサーのうち６つが、リガンドの非存在下においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図２Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ５ＢΔ２１との相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ベンゾチアジアジジンｃＶＶＳ-０２３４７７の添加時に大きく低下した(図２Ｂ)。(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３４７７の存在下においてのシグナルの阻害(１ｕＭで５１％ルシフェラーゼ阻害および１０ｕＭ最終濃度で９０％阻害)に基づいて、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。図２Ｃおよび２Ｄは、ｃＶＶＳ-０２３４７６を用いて同定した３Ｄセンサーの特異的および非特異的ポリメラーゼインヒビターによるルシフェラーゼ発現および阻害を示すものである。
【０１０７】
４.３．ＮＳ５Ｂ-３Ｄスクリーンプラットホームの開発
４.３.１．ＮＳ５ＢΔ２１ ３Ｄセンサーペプチドの選択性
３Ｄスクリーンプラットホームをさらに特性化するために、ペプチドＮ２１Ｃ２７２の結合の選択性を調べた。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２、および天然ＮＳ５ＢΔ２１または異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターで一時的にトランスフェクトした(図３Ａ)。天然ＮＳ５ＢΔ２１と、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２との間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導き、それは、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の１７倍を示した。しかし、この３Ｄセンサーは、Labonte P (2002)により記載されるＬ３０ＳおよびＬ３０Ａ立体配座不安定化突然変異体を結合しなかった。
【０１０８】
他方において、図３Ｂに示すように、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２は、試験した１２種の薬物耐性突然変異体のうち１０種に結合した：ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されている突然変異体(Ｍ４１４Ｔ、Ｓ２６６Ａ、およびＣ３１６Ｙ)(Tomeiら、2005、Luら、2007)、インドール耐性突然変異体Ｐ４９５Ｌ(Tomeiら、2005)、チオフェンズ耐性突然変異体(Ｓ４１９ＭおよびＭ４２３Ｔ)(Tomeiら、2005)、２'-ヌクレオシド類似体耐性突然変異体Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、およびＮ１４２Ｔ(Tomeiら、2005、Le Pogamら、2006)、ならびに、ジヒドロキシピリミジンに耐性であるＧ１５２Ｅ突然変異体(Tomeiら、2005)。
【０１０９】
４.３.２．３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物の作用特異性
次に、本発明者らは、ポリメラーゼからの３Ｄセンサーの解離が、関連薬物の結合に起因することを確認した。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２／ＶＰ１６、および融合タンパク質ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４により一時的にトランスフェクトした。特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７７およびｃＶＶＳ-０２３４７６の添加は、図４に示すように、１０ｕＭ最終濃度でルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を誘発した(それぞれ、８３.２％±７.５、ｎ＝１５および８２.６％±８.３、ｎ＝６)。ｃＶＶＳ-０２３４７６は、比較的低い濃度においても、ルシフェラーゼシグナルの強力な阻害を示した(１ｕＭ最終濃度において６７％±８.３、ｎ＝６)。対照的に、レポーターの発現は、抗ＣＭＶ／ＨＩＶポリメラーゼインヒビター、例えばフォスカーネットまたはホスホノ酢酸(Crumpackerら、1992、Lietmanら、1992)の１０ｕＭ濃度での添加によって阻害されなかった(それぞれ、１１.７％±４および−２.２％±３３.８、Ｎ＝３)。標準のＨＣＶ治療(インターフェロンと組合せて)であるリバビリンの作用機序は、ポリメラーゼの直接的な阻害に関係しているようには見えない(Lohmannら、2000、Maagら、2001)。従って、７５ｕＭ最終濃度(そのＥＣ50)で使用して、リバビリンは、ルシフェラーゼシグナルに対して顕著な効果を示さなかった(阻害８.７％±１６.３、ｎ＝６)。即ち、本発明者らは、酵母においてと同様にヒト細胞において、３Ｄセンサーペプチドは、選択的な様式でポリメラーゼと相互作用することができるが、特異的アロステリック抗ＮＳ５Ｂリガンドと複合化したポリメラーゼとは相互作用することができないことを確認した。
【０１１０】
４.３.３．濃度-応答の関係
本発明者らの系における薬物の作用がストキオメトリック(stokiometric)であったか否かを確認するために、Ｈｅｌａ細胞を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ、標的タンパク質および立体配座感受性ペプチドＮ２１Ｃ２７２をコードする三つの発現プラスミドにより一時的にトランスフェクトした。増加量の参照薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６またはｃＶＶＳ-０２３４７７とともにインキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図５は、Michaelis-Mentenモデルに従う濃度-効果の関係が得られたことを示す。ｃＶＶＳ-０２３４７６およびｃＶＶＳ-０２３４７７のＩＣ50値は、それぞれ０.３および３.２ｕＭであった。
【０１１１】
４.３.４．突然変異体プロファイリング
３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物作用の特異性は、耐性突然変異体において活性である分子のスクリーニングに有用でありうるので、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２および天然ＮＳ５ＢΔ２１または文献に記載される異なる突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。増加濃度のｃＶＶＳ０２３４７７(ベンゾチアジアジンのファミリーに属する化合物)またはｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミドのファミリーに属する化合物)とともに２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図６Ａは、ベンゾサイアジアザイド化合物が、天然ＮＳ５ＢΔ２１あるいはＰ４９５Ｌ、Ｓ４２３ＭまたはＳ２８２Ｔ突然変異体(ベンゾチアジアジンに感受性である)のいずれかに対しては、ＩＣ50が２〜５ｕＭで、相当なレポーター阻害を生じた(ｎ＝２)ことを示す。他方において、同じ化合物は、ベンゾチアジアジンに耐性であると記載されている突然変異体でトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかった。実際には、Ｍ４１４ＴおよびＣ３１６Ｙ突然変異体については、５０％シグナル阻害には到達せず、Ｓ３６８Ａについては、ＩＣ50は天然ＮＳ５Ｂにおいて観察される値の１０倍である。インドール-Ｎ-アセトアミド化合物を試験した場合に、本発明者らは、これが、天然ＮＳ５ＢΔ２１および全ての試験した突然変異体を選択的に阻害することに気付いた(ＩＣ50が０.２〜２ｕＭ)[ただし、インドールに耐性であると記載されているＰ４９５Ｌ(少なくとも１０倍のＩＣ50の増加を有する)除く](図６Ｂ、ｎ＝２)。
【０１１２】
これらの結果は、不安定化突然変異によって乱されない限り、標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明の耐性突然変異体プラットホームは、標的の耐性プロファイルに従って、活性薬物と不活性薬物とを識別することを可能にする。
【０１１３】
同じ手法で同定されたいくつかの他のペプチド[その一つをＮ２１ Ｉ４と命名した(配列番号６２に対応する)]は、化合物ｃＶＶＳ-０２３４７６およびｃＶＶＳ-０２３４７７７に対して、３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２と同じように感受性であった。この３Ｄセンサーを用いて、ＨｅｌａおよびＨｕｈ７肝癌由来細胞において、３Ｄスクリーン-ＮＳ５Ｂ突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１１４】
４.３.５．ＮＳ５ＢΔ２１／Ｎ２１Ｃ２７２-３Ｄスクリーンプラットホームの高処理量スクリーニングとの適合性
シグナル窓から始めて高処理量の要求を満たすために、アッセイをさらに最適化した。図７は、最大ルシフェラーゼ阻害後の残留シグナルが、プラットホームのバックグラウンドと同じように低かったことを示す(ｃＶＶＳ０２３４７７に対して８９４７ＲＬＵ±３０７１、ｎ＝７、これに対し、３Ｄセンサーを含まない基本ルシフェラーゼ活性に対して７１８２ＲＬＵ±６６４３、ｎ＝１７)。また、レポーター、３ＤセンサーおよびＬ３０ＳまたはＬ３０Ｒ ＮＳ５Ｂ変性突然変異体のいずれかでトランスフェクトした細胞によって放出されるシグナルも、プラットホームのバックグラウンドに等価であった(Ｌ３０Ｓ突然変異体に対して７６３６ＲＬＵ±５９３２、ｎ＝５、および、Ｌ３０Ｒ突然変異体に対して３１００ＲＬＵ±１６１０、Ｎ＝３)。
【０１１５】
アッセイの変動性を評価するために、ルシフェラーゼレポーター、ＮＳ５ＢΔ２１および３ＤセンサーＮ２１Ｃ２７２をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を含む２０の９６ウエルプレートを、三つの独立した実験において、０.５％ＤＭＳＯの存在下において２４時間プレーティングした。算出したＳ／Ｂは、１４±０.９に達し(図８Ａ)、ＣＶは９.３％±１に達した(図８Ｂ)。平均Ｚ値０.６７±０.０３が得られ(図８Ｃ)、大きい動的範囲にわたる低い変動性を示した。
【０１１６】
４.４．試験化合物ライブラリーの高処理量スクリーニング
４.４.１．一次スクリーニング
ＶＩＶＡＬＩＳ所有の組合せライブラリー(即ち、Vivatheque)に由来する２３５１０のオリジナル化合物を、ＨｅＬａ細胞においてスクリーニングした。三つの発現プラスミド[ルシフェラーゼレポーター、ＮＳ５ＢΔ２１-Ｇａｌ４および３Ｄセンサー/ＶＰ１６ＡＤ(Ｎ２１Ｃ２７２)]を、１０ｃｍ皿中、４００万のＨｅｌａ細胞において同時トランスフェクトした。２時間後に、細胞を分離し、２５,０００細胞／ウエルを９６ウエルプレートに蒔いた。細胞付着後に化学的化合物を添加した。ルシフェラーゼ活性を２４時間後に測定した。４０％のルシフェラーゼ阻害を生じた１４３７のヒットを、一次スクリーニング中に同定した(ヒット率６.１％)。
【０１１７】
４.４.２．二次スクリーニング
３４２のヒット(スクリーニングした全化合物の１.４５％)を、２回目および３回目のトランスフェクションにおいて確認した(これは２３.８％の確認率である)。これらの中で、２１５の化合物が４０％未満の細胞毒性を示した。
【０１１８】
４.４.３．ＩＣ50測定実験
１０２の選択した化合物を、純粋な粉末として購入し、その５０％阻害濃度を測定した。２９が、細胞毒性とは独立して、興味ある用量応答プロファイルを示した。１８分子について、ＩＣ50値は１０ｕＭ以下であり、該濃度で２０％未満の毒性を有していた。これらのうち８つのウイルス阻害潜在能力を、Ｈｕｈ７(５,２)におけるレポーターレプリコン系およびＨｕｈ７(９,１３)におけるＲＴ-ＰＣＲ定量的レプリコン系の両方を用いて確認した。本発明者らのプラットホームによって同定した分子のうち三つは、その抗ＨＣＶ特性のために以前に特許されている。第１のｃＶＶＳ０１３００５(アミノチアゾール)は国際公開第２００６／１２２０１１号パンフレットに報告されており、第２のｃＶＶＳ０１９５３４(チオセミカルバゾン)は国際公開第２００４／０６０３０８号パンフレットに記載されており、第３のチエノピリジンは国際公開第２００６／０１９８３２号パンフレットに記載されている。
【０１１９】
実施例５：３Ｄスクリーン-ＮＳ３プラットホーム
５.１．立体配座感受性ペプチドの同定
５.１.１．酵母においてＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼと相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ／ＨＣＶ ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼドメイン(アミノ酸１〜１８１)]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０／ｙＤＧ１株において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。本発明者らは、参照薬物ｃＶＶＳ０２３５１８[臨床試験の第２相にあるペプチド模倣インヒビター(５０ｕＭ濃度)](Perniら、2006)の存在下または非存在下において、８６４の相互作用ペプチドをスクリーニングした。これらのうち２３を、定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを用いて参照薬物の存在下において、そのシグナル消光について選択した。
【０１２０】
選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。ｃＶＶＳ０２３５１８を用いて同定した３Ｄセンサーペプチドのアミノ酸配列を決定した。ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１２１】
５.１.２．酵母においてＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質と相互作用する立体配座感受性ペプチドの同定
[ｌｅｘＡ/ＨＣＶ ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長(アミノ酸１〜６３２)]融合タンパク質をバイトとして、およびＶＶＳ００１ペプチドライブラリーをプレイとして用いて形質転換したＬ４０株において、酵母２-ハイブリッド実験を行った。本発明者らは、参照薬物ｃＶＶＳ０２３５１８[臨床試験の第２相にあるペプチド模倣インヒビター(５０ｕＭ濃度)](Perniら、2006)の存在下または非存在下において、７６８の相互作用ペプチドをスクリーニングした。これらのうち１５を、定量的β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを用いて、参照薬物に対するその反応性について選択した。選択したペプチドをコードするプラスミドを単離し、酵母において標的に結合する各３Ｄセンサーの能力を確認するため、ならびに相互作用の特異性を調べるために使用した。
【０１２２】
ｃＶＶＳ０２３５１８を用いて同定した３Ｄセンサーペプチドのアミノ酸配列を決定した。ペプチド配列のいずれも、既知のタンパク質(National Center for Biotechnology Information databaseのBLASTサーチ)との有意の相同性を示さなかった。全ての配列を、発現ベクターにＶＰ１６ＡＤと枠内で挿入して、哺乳動物細胞における小分子のスクリーニングを行った。
【０１２３】
５.２．ヒト細胞における３Ｄセンサーの検証
５.２.１．ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼと相互作用する３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、Ｈｅｌａ細胞においてさらに調べた。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合した標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子、を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。
【０１２４】
２３の試験した３Ｄセンサーのうち４つが、リガンドの非存在下において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図９Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼとの相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８の添加時に大きく低下した(図９Ｂ)。
【０１２５】
(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのシグナルの阻害(２ｕＭ最終濃度で９０％ルシフェラーゼ阻害)に基づいて、３ＤセンサーＶ７-６２を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。
【０１２６】
５.２.２．ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質と相互作用する３Ｄセンサーの検証
酵母において確認された３Ｄセンサーを、Ｈｅｌａ細胞においてさらに調べた。細胞を、(i)トランス活性化ドメイン(ＶＰ１６-ＡＤ)に融合した３Ｄセンサーペプチド候補、(ii)酵母Ｇａｌ４-ＤＮＡ結合ドメインに融合した標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質、および(iii)複合体[ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質／３Ｄセンサー-ＶＰ１６]によって発現を誘発しうるルシフェラーゼレポーター遺伝子、を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。
【０１２７】
１６の同定した３Ｄセンサーのうち８つが、リガンドの非存在下において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を支持した(図１０Ａ)。この結果は、これらペプチドと哺乳動物関連のＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質との相互作用を確認するものである。予測されるように、ルシフェラーゼ活性は、ペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８の添加時に大きく低下した(図１０Ｂ)。
【０１２８】
(i)シグナル強度、(ii)ｃＶＶＳ-０２３５１８の存在下においてのシグナルの阻害(２ｕＭ最終濃度で６０％ルシフェラーゼ阻害)に基づいて、３ＤセンサーＨ５-３４を選択し、３Ｄスクリーンプラットホームを創製した。
【０１２９】
５.３．３Ｄスクリーンプラットホームを用いる薬物の選択性決定
本発明者らは、ＮＳ３標的からの３Ｄセンサーの解離が、関連薬物の結合に起因し、特異的な事象によらないことを確認した。Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーターならびにＮＳ５ＢおよびＮＳ３標的のそれぞれ(その特異的３Ｄセンサーと一緒に)で一時的にトランスフェクトした。増加濃度の特異的ＮＳ５ＢインヒビターｃＶＶＳ-０２３４７６(インドール-Ｎ-アセトアミド)の添加は、ＮＳ５Ｂプラットホームのみの強力な阻害を誘発した。また、特異的ＮＳ３インヒビターｃＶＶＳ-０２３５１８は、標的効果を有意になくすことなく、ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよび完全長プラットホームを阻害した(図１１)。これらの結果は、本発明のスクリーニングプラットホームを使用して、細胞関連の異なる標的における薬物の選択性を試験しうることを示すものである。
【０１３０】
５.４．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ３Ｄスクリーンプラットホーム
３Ｄスクリーンプラットホームにおける薬物作用の特異性は、耐性突然変異体において活性である分子のスクリーニングに有用でありうるので、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＶ７-６２、および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼまたは文献(Linら、2005)に記載されるＶＸ９５０に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。３ＤセンサーＶ７-６２と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼのいずれかの間の相互作用は、突然変異形態については比較的低いとしても、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の３３倍、これに対し、天然のものについては８０倍)(図１２Ａ)。増加濃度のｃＶＶＳ-０２３５１８とともに２４時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１３は、ペプチド模倣化合物が、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼに対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物が、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかったことを示す。
【０１３１】
同じ手法で同定されたいくつかの他のペプチド[その一つをＴ１Ｅ７と命名した(配列番号６３に対応する)]は、TelaprevirおよびCiluprevirに対して、３ＤセンサーＶ７-６２と同じように感受性であった。この３Ｄセンサーを用いて、３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼ突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１３２】
５.５．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質３Ｄスクリーンプラットホーム-Ｈｅｌａ細胞：
本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を、ルシフェラーゼレポーター、３ＤセンサーＨ５-３４、および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質または文献(Linら、2005)に記載されるペプチド模倣体に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトした。３ＤセンサーＨ５-３４と天然またはＡ１５６Ｖ突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(天然タンパク質に対しては、３Ｄセンサー-ＶＰ１６ＡＤを含まないバックグラウンドルシフェラーゼ活性の４２倍、これに対し、突然変異したものに対しては５６倍)(図１２Ｂ)。増加濃度のｃＶＶＳ-０２３５１８とともに２４時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１３は、ペプチド模倣化合物が、天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質に対して強力なレポーター阻害を生じたが、同じ化合物が、耐性突然変異体Ａ１５６Ｖでトランスフェクトした細胞に対しては、顕著なレポーター阻害を示さなかったことを示す。
【０１３３】
これらの結果は、不安定化突然変異によって乱されない限り、標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明の耐性突然変異体プラットホームは、標的の耐性プロファイルに応じて、活性薬物と不活性薬物を区別することができた。
【０１３４】
５.６．突然変異体プロファイリングＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質３Ｄスクリーンプラットホーム-Ｈｕｈ７細胞：
本発明者らは、Ｈｕｈ７肝癌細胞を、ルシフェラーゼレポーター、酵母において分離される３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１(配列番号６４)および天然ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質または文献(Linら、2005)に記載されるペプチド模倣体に耐性である最も頻繁に記載される突然変異体のいずれかを発現するベクターによりトランスフェクトした。３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と天然または突然変異ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質のいずれかの間の相互作用は、図１４に示すように、ルシフェラーゼレポーターの強力な活性化を導いた(Ｒ１５５Ｋ突然変異タンパク質を除いてシグナル／バックグラウンドは３を大きく超える)。
【０１３５】
ＶＦ-９Ａ１１ペプチドと標的変異体との相互作用は、ペプチド模倣化合物ｃＶＶＳ-０２３５１８が試験された多くの３Ｄスクリーンプラットホームとして創製することを可能にする。図１５に示すように、天然３Ｄスクリーンプラットホームは、化合物の阻害ならびに文献(Linら、2004)においてそのように記載されたＤ１６８ＶおよびＲ１０９Ｋに感受性である。高耐性であると記載された突然変異体Ａ１５６ＶおよびＡ１５６Ｔは、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて予測されるプロファイルを示す(Linら、2005、Sarrazinら、2007)。
【０１３６】
また、ペプチド模倣ｃＶＶＳ-０２３５１８に中耐性であることが知られているＡ１５６Ｓ、Ｔ５４ＡおよびＶ３６Ｍも、３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、野生型ＮＳ３と比較して、ＥＣ50値の中程度の倍数増加を示す。図１６に示すように、３Ｄスクリーンを用いて測定した耐性を反映するＥＣ50値の倍数増加は、酵素またはレプリコンアッセイによって測定したものと同じ範囲内にある(Linら、2004 & 2005、Sarrazinら、2007、Welshら、2008)。
【０１３７】
これらの結果は、３Ｄスクリーン手法を利用してプロファイリングプラットホームを開発し、臨床的に記載された耐性突然変異体に対する所与の薬物の活性スペクトルを予測することができるという考えを支持する。このようなプロファイリングプラットホームは、単離したヒットをその抗ウイルス活性の範囲に従ってランク付けすることを可能にし、早期段階において最も有望な分子を選択する機会を高める。
【０１３８】
３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームの関連性を、ナノモル範囲でプロテアーゼに対して活性であると記載され、臨床試験の第１相において実証されている第２のペプチド模倣インヒビターｃＶＶＳ-２３５９１(Lamarreら、2003)を用いてさらに検討した。図１７に示すように、この化合物は、文献に報告されているものと同じ範囲で３Ｄスクリーンプラットホームにおいて、ならびに、感受性であると記載されているＡ１５６ＳおよびＶ３６Ｍ変異体(Linら、2004)において活性である。
【０１３９】
高耐性の突然変異体Ａ１５６ＶおよびＤ１６８Ｖ(Linら、2004 & 2005)は、図１８に示すように、酵素またはレプリコンアッセイにおいて以前に報告されているものと同じ範囲で耐性を示した。
【０１４０】
同じ手法で同定され、ＶＦＩＩ-Ｎ４、ＶＦＩＩ-Ｎ１３、Ｔ４Ｃ１１、およびＴ３Ｇ５(それぞれ、配列番号６５、６６、６７および６８に対応する)と命名したいくつかの他のペプチドは、TelaprevirおよびCiluprevirに対して、３ＤセンサーＶＦ-９Ａ１１と同じように感受性であった。これら全ての３Ｄセンサーを用いて、３Ｄスクリーン-ＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長突然変異体プロファイリングプラットホームを創製した。
【０１４１】
即ち、これらの結果は、臨床的に記載された耐性突然変異体に対する所与の薬物の活性スペクトルを予測するための、確固とした信頼できるプロファイリングプラットホームの創製を示すものである。３Ｄスクリーン突然変異体プロファイリングプラットホームを、二つの異なるインヒビターを用いてＮＳ５Ｂポリメラーゼに対して開発および実証した。また、それをＮＳ３タンパク質に対しても開発し、二つの参照プロテアーゼインヒビターを用いて実証した。その耐性表現は、正確であり、予言的であり、酵素またはレプリコンに基づくアッセイを用いて文献に報告されている結果と関連していた。さらに、細胞に基づく３Ｄスクリーンプラットホームは、実施の迅速性および単純性ならびに高処理量の利点を有する。
【０１４２】
実施例６：３Ｄスクリーンプラットホームを用いる遺伝子型プロファイリング
ＨＣＶ変異体は、６つの遺伝子型(１〜６)に分類され、サブタイプを示すための小文字を伴う(Le Guillou-Guillemetteら、2007)。薬物に対する感受性は、一つのＨＣＶ遺伝子型と他の遺伝子型では変化することができるため(Mannsら、2007)、本発明者らは、３Ｄスクリーンプラットホームが、薬物候補の予備臨床プロファイリングに非常に重要であるそのような相違を識別することができるか否かを試験した。即ち、本発明者らは、３ＤセンサーＮ２１Ｉ４が、遺伝子型１ａおよび１ｂ由来のポリメラーゼＮＳ５Ｂと、ＨｅｌａおよびＨｕｈ７細胞において、等価な様式で相互作用することを確認した。
【０１４３】
Ｈｕｈ７細胞を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ、遺伝子型１ａまたは１ｂ由来の標的ＮＳ５Ｂおよび立体配座感受性ペプチドＮ２１Ｉ４をコードする三つの発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした。増加量のｃＶＶＳ-０２３４７６とともにインキュベートした後、ルシフェラーゼ発現を測定した。図１９は、二つの異なる遺伝子型に由来するＮＳ５Ｂが、３ＤセンサーペプチドＮ２１Ｉ４の存在下において、参照インドール薬物ｃＶＶＳ-０２３４７６に対してわずかに異なる感受性を有することを示す。
【０１４４】
これらの結果は、異なる遺伝子型に由来する場合であっても標的の立体配座に選択的である細胞プラットホームを創製しうることを示す。さらに、本発明のスクリーニングプラットホームを用いて、標的の遺伝子型バックグラウンドに応じて活性薬物と低活性薬物とを識別することができた。同じ原理を、標的ＮＳ４Ａ-ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ４Ａ-ＮＳ３完全長タンパク質に適用した。
【参考文献】
【０１４５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する少なくとも一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【請求項２】
工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)を、完全な多細胞生物または生物の組織もしくは器官に組込まれていない細胞において行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(Ａ)および(Ｂ)を酵母細胞において行い、工程(Ｃ)および(Ｄ)を、ヒト一次細胞、ヒト胚細胞、ヒト細胞系統の中から選択される哺乳動物細胞において行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程(Ａ)および(Ｂ)において、各細胞が、
−該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分、および
−該ペプチドの組合せライブラリーの一つの構成要素、
を同時発現し、
各細胞が、該ライブラリーの該構成要素が、該細胞中または該細胞上で該標的タンパク質または部分を結合したか否かの指標であるシグナルを生成するように、該標的タンパク質もしくは標的タンパク質の変異体または部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
既知のリガンドを、内生的に、または好ましくは外生的に工程Ｂの細胞に添加する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該ペプチドが該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する場合に該シグナルが生成し、該ペプチドが該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体に結合することができず、該標的タンパク質に対する既知のリガンドにリガンド化される場合に該シグナルが減少するかまたは非存在である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程(Ｃ)および(Ｄ)を細胞において行い、該細胞が、
(ａ)該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分および
(ｂ)工程(Ｂ)で選択され、既知のリガンドの非存在下において、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合することができる該ペプチド
を同時発現し、
該細胞が、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供し、それにより、
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、それにより、該ペプチドが工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞中または細胞上において、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体または部分を結合すること、ならびに、該試験化合物が該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾しないことの指標であるシグナルを生成する、あるいは
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合の減少または非存在が、機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を可能にせず、それにより、該試験化合物が該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾することの指標であるシグナルを生成しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該シグナル生成系が、
−キメラタンパク質を供給するための、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分に融合させた、タンパク質結合した成分および
−キメラペプチドを供給するための該ペプチドに融合させた、ペプチド結合した成分
を含んでなり、これにより、ペプチド結合およびタンパク質結合した成分が、ペプチドの標的タンパク質への結合の結果として物理的に接近することになった場合に、シグナルを生成する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
成分の一つがＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)であり、他の成分が相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)であり、シグナル生成系が、該ＤＮＡ結合ドメインによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子をさらに含み、ペプチドの標的タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与えるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該シグナル生成系が、
(i)キメラペプチドを供給するための該ペプチドに融合させた相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)、
(ii)キメラタンパク質を供給するための、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分に融合させたＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、および
(iii)該ＤＢＤによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子を含むシグナル生成系
を含んでなり、これにより、該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、これにより、該ペプチドの、該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体またはそのリガンド結合タンパク質部分への結合の指標であるシグナルが、工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、または(Ｄ)において使用する細胞中または細胞上に生成する、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＢＤが、Ｇａｌ４、およびＬｅｘＡからなる群から選択され、ＡＤが、大腸菌Ｂ４２、Ｇａｌ４活性化ドメインII、およびＨＳＶ ＶＰ１６からなる群から選択されるものである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、酵母遺伝子ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、および抗生物質耐性遺伝子からなる群から選択される耐性選択遺伝子である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(Ｃ)および(Ｄ)において試験化合物のスクリーニングおよび選択に使用するレポーター遺伝子が、ＤＨＦＲ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル-トランスフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アデニル酸シクラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ-ガラクトシダーゼ、および自己-蛍光タンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物を、内生的に、または好ましくは外生的に工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞に添加する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的タンパク質が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質、動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択されるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該標的タンパク質の変異体が、標的タンパク質を含む突然変異、該標的タンパク質の多型、該標的タンパク質との配列相同性を含むタンパク質の中から選択されるものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
該標的タンパク質が、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドは該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞は該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【請求項１９】
該標的タンパク質が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ５Ｂであり、該ＮＳ５Ｂの変異体が、好ましくは、Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、Ｃ３１６Ｙ、Ｙ４４８Ｈ、Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４１９Ｍ、Ｍ４２３Ｔ、Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、Ｎ１４２Ｔ、Ｇ１５２Ｅ、Ｐ１５６Ｌからなる群から選択されるＮＳ５Ｂ変異体の中から選択されるものである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ型肝炎標的タンパク質ＮＳ５Ｂの既知のリガンドが、ベンゾチアジアジン(Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン)、Ｎ-インドールアセトアミド(１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド)、ＨＣＶ７９６、ＧＳ９１９０、ＭＫ３２８１、およびＶＣＨ７５９からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該標的タンパク質が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ３であり、該ＮＳ３の変異体が、好ましくは、Ａ１５６Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｄ１６８Ａ／Ｖ、Ｖ１０７Ａ、Ｒ１５５Ｋ、Ｔ５４Ａ、Ｖ３６Ｍ、Ｖ３６Ｍ／Ａ１５６Ｔ、Ｖ３６Ａ／Ａ１５６、Ｖ３６Ｍ／Ｒ１５５Ｋ、Ｖ３６Ｔ／Ｔ５４、Ｖ３６Ｍ／Ｔ５４Ａ、Ａ１５６Ｖ／Ｒ１５５Ｋからなる群から選択されるＮＳ３変異体の中から選択されるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ型肝炎標的タンパク質ＮＳ３の既知のリガンドが、ペプチド模倣抗ＮＳ３プロテアーゼ(２-(２-{２-シクロヘキシル-２-[(ピラジン-２-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-３,３-ジメチル-ブチリル)-オクタヒドロ-シクロペンタ[ｃ]ピロール-１-カルボン酸(１-シクロプロピルアミノオキサリル-ブチル)-アミド)、ＢＩＬＮ２０６１、ＩＴＭＮ１９１、ＴＭＣ４３５３５０、およびＳＣＨ５０３０３４からなる群から選択されるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
標的タンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する少なくとも一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドが該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞が該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体が該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【請求項２】
工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、および(Ｄ)を、完全な多細胞生物または生物の組織もしくは器官に組込まれていない細胞において行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(Ａ)および(Ｂ)を酵母細胞において行い、工程(Ｃ)および(Ｄ)を、ヒト一次細胞、ヒト胚細胞、ヒト細胞系統の中から選択される哺乳動物細胞において行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程(Ａ)および(Ｂ)において、各細胞が、
−該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分、および
−該ペプチドの組合せライブラリーの一つの構成要素、
を同時発現し、
各細胞が、該ライブラリーの該構成要素が、該細胞中または該細胞上で該標的タンパク質または部分を結合したか否かの指標であるシグナルを生成するように、該標的タンパク質もしくは標的タンパク質の変異体または部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
既知のリガンドを、内生的に、または好ましくは外生的に工程Ｂの細胞に添加する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該ペプチドが該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する場合に該シグナルが生成し、該ペプチドが該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体に結合することができず、該標的タンパク質に対する既知のリガンドにリガンド化される場合に該シグナルが減少するかまたは非存在である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程(Ｃ)および(Ｄ)を細胞において行い、該細胞が、
(ａ)該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分および
(ｂ)工程(Ｂ)で選択され、既知のリガンドの非存在下において、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合することができる該ペプチド
を同時発現し、
該細胞が、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分と機能的に結合したシグナル生成系をさらに供し、それにより、
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、それにより、該ペプチドが工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞中または細胞上において、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体または部分を結合すること、ならびに、該試験化合物が該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾しないことの指標であるシグナルを生成する、あるいは
−試験化合物の存在下においての該ペプチドの該タンパク質への結合の減少または非存在が、機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を可能にせず、それにより、該試験化合物が該標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体の立体配座を修飾することの指標であるシグナルを生成しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該シグナル生成系が、
−キメラタンパク質を供給するための、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分に融合させた、タンパク質結合した成分および
−キメラペプチドを供給するための該ペプチドに融合させた、ペプチド結合した成分
を含んでなり、これにより、ペプチド結合およびタンパク質結合した成分が、ペプチドの標的タンパク質への結合の結果として物理的に接近することになった場合に、シグナルを生成する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
成分の一つがＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)であり、他の成分が相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)であり、シグナル生成系が、該ＤＮＡ結合ドメインによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子をさらに含み、ペプチドの標的タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与えるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該シグナル生成系が、
(i)キメラペプチドを供給するための該ペプチドに融合させた相補性トランス活性化ドメイン(ＡＤ)、
(ii)キメラタンパク質を供給するための、該標的タンパク質もしくは該標的タンパク質の変異体、またはそのリガンド結合タンパク質部分に融合させたＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、および
(iii)該ＤＢＤによって結合されたオペレーターに機能的に結合した少なくとも一つのレポーター遺伝子を含むシグナル生成系
を含んでなり、これにより、該ペプチドの該タンパク質への結合が、該レポーター遺伝子の発現を活性化する機能的なトランス活性化アクチベータータンパク質の構成を与え、これにより、該ペプチドの、該標的タンパク質または標的タンパク質の変異体またはそのリガンド結合タンパク質部分への結合の指標であるシグナルが、工程(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、または(Ｄ)において使用する細胞中または細胞上に生成する、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＢＤが、Ｇａｌ４、およびＬｅｘＡからなる群から選択され、ＡＤが、大腸菌Ｂ４２、Ｇａｌ４活性化ドメインII、およびＨＳＶ ＶＰ１６からなる群から選択されるものである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、酵母遺伝子ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、および抗生物質耐性遺伝子からなる群から選択される耐性選択遺伝子である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(Ｃ)および(Ｄ)において試験化合物のスクリーニングおよび選択に使用するレポーター遺伝子が、ＤＨＦＲ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル-トランスフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アデニル酸シクラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ-ガラクトシダーゼ、および自己-蛍光タンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物を、内生的に、または好ましくは外生的に工程(Ｃ)および(Ｄ)の細胞に添加する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的タンパク質が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質、動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択されるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該標的タンパク質の変異体が、標的タンパク質を含む突然変異、該標的タンパク質の多型、該標的タンパク質との配列相同性を含むタンパク質の中から選択されるものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
該標的タンパク質が、コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コアタンパク質、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの中から選択されるＣ型肝炎ウイルスタンパク質の変異体の生物学的活性を調節する試験化合物の能力を決定するイン・ビトロ方法であって、リガンドが該標的タンパク質の生物学的活性を調節することが予め知られており、以下の工程を含んでなる方法：
工程(Ａ)：該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する一つの結合ペプチドを選択し、以下の工程を含んでなる方法：
(Ａ１)ペプチドの組合せライブラリーを供し、該結合ペプチドは該ライブラリーの構成要素であり、該ライブラリーは多数の細胞において発現され、該細胞は該ライブラリーの全構成要素を共同で発現する工程、
(Ａ２)該ライブラリーを、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合する該ライブラリーの構成要素の能力についてスクリーニングし、該標的タンパク質および該標的タンパク質の変異体に結合するペプチドを選択する工程、
工程(Ｂ)：工程(Ａ２)で選択したペプチドの中から、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質に結合する能力が減少するまたは該能力を持たず、該既知のリガンドの存在下において該標的タンパク質の変異体に結合する能力が保存された少なくとも一つの結合ペプチドを選択する工程、
工程(Ｃ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの該標的タンパク質への結合を減少させる能力について試験化合物を試験および選択し、結合能力の減少または非存在は、試験化合物が標的タンパク質の立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示す工程、および
工程(Ｄ)：工程(Ｂ)で選択したペプチドの、該標的タンパク質の変異体への結合能力を調節する能力について(Ｃ)で選択した試験化合物を試験し、
−結合の減少または非存在は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発することを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節することを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性ではなく、
−保存された結合は、該試験化合物が、該標的タンパク質の変異体に立体配座変化を誘発しないことを示すものであり、該試験化合物が該標的タンパク質の生物学的活性を調節しないことを示し、該標的タンパク質の変異体は該試験化合物による該生物学的活性の調節に耐性である工程。
【請求項１９】
該標的タンパク質が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ５Ｂであり、該ＮＳ５Ｂの変異体が、好ましくは、Ｍ４１４Ｔ、Ｓ３６８Ａ、Ｃ３１６Ｙ、Ｙ４４８Ｈ、Ｐ４９５Ｌ、Ｓ４１９Ｍ、Ｍ４２３Ｔ、Ｓ２８２Ｔ、Ｓ９６Ｔ、Ｎ１４２Ｔ、Ｇ１５２Ｅ、Ｐ１５６Ｌからなる群から選択されるＮＳ５Ｂ変異体の中から選択されるものである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ型肝炎標的タンパク質ＮＳ５Ｂの既知のリガンドが、ベンゾチアジアジン(Ｎ-１-シクロブチル-４-ヒドロキシキノロン-３-イル-ベンゾチアジアジン)、Ｎ-インドールアセトアミド(１-{[６-カルボキシ-２-(４-クロロフェニル)-３-シクロヘキシル-１Ｈ-インドール-１-イル-]アセチル}-Ｎ,Ｎ-ジエチルピペリジン-４-アミニウムクロリド)、ＨＣＶ７９６、ＧＳ９１９０、ＭＫ３２８１、およびＶＣＨ７５９からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該標的タンパク質が、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ３であり、該ＮＳ３の変異体が、好ましくは、Ａ１５６Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｄ１６８Ａ／Ｖ、Ｖ１０７Ａ、Ｒ１５５Ｋ、Ｔ５４Ａ、Ｖ３６Ｍ、Ｖ３６Ｍ／Ａ１５６Ｔ、Ｖ３６Ａ／Ａ１５６、Ｖ３６Ｍ／Ｒ１５５Ｋ、Ｖ３６Ｔ／Ｔ５４、Ｖ３６Ｍ／Ｔ５４Ａ、Ａ１５６Ｖ／Ｒ１５５Ｋからなる群から選択されるＮＳ３変異体の中から選択されるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ型肝炎標的タンパク質ＮＳ３の既知のリガンドが、ペプチド模倣抗ＮＳ３プロテアーゼ(２-(２-{２-シクロヘキシル-２-[(ピラジン-２-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-３,３-ジメチル-ブチリル)-オクタヒドロ-シクロペンタ[ｃ]ピロール-１-カルボン酸(１-シクロプロピルアミノオキサリル-ブチル)-アミド)、ＢＩＬＮ２０６１、ＩＴＭＮ１９１、ＴＭＣ４３５３５０、およびＳＣＨ５０３０３４からなる群から選択されるものである、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５１７３９７（Ｐ２０１１−５１７３９７Ａ）
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５５０２２０（Ｐ２０１０−５５０２２０）
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１２５９２
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５０４３４１１２８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１２５９２
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５０４３４１１２８）
【Ｆターム（参考）】
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