標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法およびその用途
【課題】遺伝子導入を行った細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかを簡便に判別できる方法を提供する。
【解決手段】プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列および２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置された第１ベクターを導入した細胞に、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列および２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置された第２ベクターを導入する。得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出し、第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する。
【解決手段】プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列および２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置された第１ベクターを導入した細胞に、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列および２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置された第２ベクターを導入する。得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出し、第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法およびそれに用いる判別用キットに関する。また、本発明は、標的組換え効率の評価方法およびそれに用いる評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療等の先端医療分野や、創薬研究、基盤研究等の分野において、遺伝子ターゲティングは、遺伝子機能を解明するための主要な技術とされている。遺伝子ターゲティングとは、ゲノム上の目的遺伝子を破壊したり改変する方法であって、一般的に、相同組換えが利用されている。具体的には、例えば、目的遺伝子（内在性遺伝子）に類似した配列を有する遺伝子ターゲティングベクターを使用し、前記目的遺伝子と前記ベクターとの間で相同組換えを起こすことによって、ゲノムの目的位置に突然変異を組み込んで、目的遺伝子の破壊や改変が行われる。
【０００３】
しかしながら、真核細胞、特に哺乳類の細胞において、このような相同組換えは稀にしか起こらず、その頻度はランダム挿入の約１／１０４〜１／１０５にすぎない。また、このように頻度が極めて低いため、多数のランダム挿入体が混在する中から、相同組換え体（標的組換え体）を判別することは非常に困難である。
【０００４】
そこで、近年、標的組換え（相同組換え）が高効率で生じる細胞の検索（非特許文献１）や、高効率での標的組換えを可能にする技術の確立（非特許文献２、非特許文献４）が求められ、盛んに研究が行われている。このような研究においては、検索対象の細胞や改良技術によって、標的組換えが高効率で起こっているか否かを相対的に判断することが必要である（非特許文献３）。そこで、通常、組換え処理を行った細胞を培養して、標的組換え体の数とランダム挿入体の数とを計数し、それから算出した標的組換え効率を比較することによって、相対的に評価を行っている。
【０００５】
具体例として、従来、標的組換え体とランダム挿入体との判別、ならびに、それぞれの計数は、以下のようにして行われていた。例えば、ターゲティングベクターの導入処理を行った細胞について、前記ターゲティングベクター上の薬剤耐性遺伝子によるスクリーニングを行い、各クローンからゲノムを調製して、サザンブロッティングによって相同組換え体を識別する方法がある。この方法は、識別結果の確実性に優れている。他方、簡便性に優れる方法としては、例えば、前記クローンから調製したゲノムを鋳型としてＰＣＲにより識別する方法がある。
【０００６】
しかしながら、従来のＰＣＲやブロッティングを利用する方法では、多数の細胞についてランダム挿入体であるか標的組換え体であるかを同定することは、非常に手間がかかり効率的ではなかった。特に、例えば、標的組換え効率の算出が目的である場合等は、目的の標的組換えが生じた細胞を得ること自体を目的とする場合と異なり、多数の細胞について標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断することが必要である。したがって、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを迅速且つ簡便に判別できることが望ましい。
【非特許文献１】“Increased Ratio of Targeted to Random Integration after Transfection of Chicken 6 Cell Lines.” Buerstedde JM and Takeda S, Cell 67, 179-188 (1991).
【非特許文献２】“Possible association of BLM in decreasing DNA double strand breaks during DNA replication.” Wang W et al., EMBO 19, 3428-3435 (2000).
【非特許文献３】“Lntrachromosomal homologous recombination in whole plants.” Swoboda P et al., EMBO 13, 484-489 (1994).
【非特許文献４】“Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.” Thomas K and Capecchi MR, Cell 51, 503-512 (1987).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、遺伝子導入を行った細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかを簡便に判別できる方法および標的組換え効率の評価方法、ならびに、これらに使用するキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の判別方法は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【０００９】
本発明の評価方法は、標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む。
（ａ） 本発明の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【００１０】
本発明の判別用キットは、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、第１ベクターおよび第２ベクターを含み、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターであり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターである。
【００１１】
本発明の評価用キットは、標的組換え効率を評価するためのキットであり、本発明の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、まず、第１蛍光タンパク質コード配列を有する第１ベクターを細胞に導入して、ゲノムＤＮＡへの組み込みを行い、さらに、第２蛍光タンパク質コード配列を有する第２ベクターを細胞に導入して、ゲノムＤＮＡへの組み込みを行う。このため、標的組換えが生じていれば、ゲノムＤＮＡには、第１ベクターの第１蛍光タンパク質コード配列に置き換わって第２ベクターの第２蛍光タンパク質コード配列が組み込まれることとなる。他方、ランダム挿入が生じていれば、ゲノムＤＮＡには、第１ベクターの第１蛍光タンパク質コード配列と第２ベクターの第２蛍光タンパク質コード配列の両方が組み込まれることとなる。したがって、最終的に得られる細胞について、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを検出することによって、標的組換え細胞（標的組換え体）であるかランダム挿入細胞（ランダム挿入体）であるかを判断できる。特に、本発明においては、前記第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを、それらが発する蛍光によって検出するため、視覚的な検出が可能であり、極めて簡便に標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかを判別できる。このように標的組換え細胞とランダム挿入細胞との判別を視覚的に行える方法は従来存在しなかった。この蛍光検出には、例えば、ＰＣＲやハイブリダイゼーション等のように、細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を抽出する必要はなく、細胞そのものへの励起光照射で足りることからも、極めて簡便な方法といえる。また、このように標的組換え細胞とランダム挿入細胞の判別を簡便に行えることから、それぞれの細胞数の計数も非常に容易となる。このため、本発明によれば、極めて簡便に標的組換え効率を評価することもできる。前述のように、近年、高効率で標的組換えが生じる細胞の検索や技術の確立が研究されていることからも、例えば、本発明によればこれらの研究を促進化できるため、非常に有用な技術といえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜標的組換え細胞とランダム挿入細胞との判別方法＞
本発明の判別方法は、前述のように、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【００１４】
まず、本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて説明する。なお、本発明において、「機能的に連結」、「機能的に配置」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で連結（結合）または配置されていることを意味する。
【００１５】
前記第１ベクターの蛍光タンパク質および第２ベクターの蛍光タンパク質の種類は、制限されない。本発明において、前記両蛍光タンパク質は、異なる種類であればよく、具体的には、例えば、従来公知の方法により、区別して検出できるものであればよい。蛍光タンパク質は、通常、特定波長光（励起光）の照射により励起され、その励起状態から基底状態に戻る際に蛍光を発する。このため、蛍光タンパク質の検出においては、一般に、目的の蛍光タンパク質に応じて、励起光を抽出するための光学素子（Ｅｘｃｉｔａｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ：Ｅｘ）、蛍光タンパク質が発する蛍光とその他の散乱光を分離する光学素子（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）、励起光と蛍光を分離するための光学素子（Ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）等が使用される。そして、これらの光学素子（光学フィルタ）を組み合わせることによって、複数の目的蛍光タンパク質を検出できることは、当該技術分野の技術常識である。
【００１６】
前記蛍光タンパク質は、前述のように制限されないが、例えば、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質があげられる。第１蛍光タンパク質が、例えば、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである場合、前記第２蛍光タンパク質は、例えば、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであることが好ましい。組合せとしては、制限されないが、例えば、赤色蛍光タンパク質と緑色タンパク質との組合せがあげられる。
【００１７】
また、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とが、同じ色彩の蛍光タンパク質グループに属する場合（例えば、両者ともに緑色蛍光タンパク質）であっても、例えば、両者の励起光が異なる場合等は、区別して検出することが可能である。
【００１８】
前記青色蛍光タンパク質としては、例えば、ＥＣＦＰ、ＢＦＰ、ｓｇＢＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｄ２ＥＣＦＰ等があげられる。前記緑色蛍光タンパク質としては、例えば、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ（ＧＦＰｃｙｃｌｅ３）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）、ｓｇＧＦＰ、ＣｒＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ｈＭＧＦＰ、ｈｒＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ｄ２／１／４ＥＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ（ＯｎＯｆｆ可能）等があげられる。前記青緑色蛍光タンパク質としては、例えば、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ等があげられる。前記黄色蛍光タンパク質としては、例えば、ＥＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｄ２ＥＹＦＰ等があげられる。前記赤色蛍光タンパク質としては、例えば、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ（ＲＦＰ）、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−ＤＲ、ＨｃＲｅｄ−ＤＲ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ等があげられる。オレンジ色蛍光タンパク質としては、例えば、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅがあげられる。また、ＤｓＲｅｄ−Ｅ５（ｐＴｉｍｅｒ）、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ等の変色化蛍光タンパク質等も使用できる。これらの蛍光タンパク質のコード遺伝子は、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、和光純薬、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、フナコシ、Ｔａｋａｒａ、Ｉｎｖｉｔｒｔｏｇｅｎ、Ａｍａｓｈａｍ Ｂｕｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＴＯＹＯＢＯ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＭＢＬ等から入手できる。また、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよい。
【００１９】
さらに、本発明における蛍光タンパク質としては、上述のタンパク質のように、タンパク質そのものが蛍光を発するものの他に、例えば、触媒機能を有するタンパク質があげられる。具体的には、触媒機能によって基質を発色させるタンパク質があげられる。このようなタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼがあげられる。β−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば、Ｘ-ｇａｌ、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。前者は、前記酵素の触媒反応によって青色に発色し、後者は、前記酵素の触媒反応によってピンク色に発色する。前記β−ガラクトシダーゼのコード遺伝子（β-ｇａｌ）は、例えば、市販のベクターから入手できる。本発明において、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質は、両方が、前述のように、タンパク質そのものが蛍光を発する蛍光タンパク質でもよいし、両方が、触媒反応によって基質を発色させるタンパク質であってもよい。また、いずれか一方が、タンパク質そのものが蛍光を発する蛍光タンパク質であり、他方が、触媒反応によって基質を発色させるタンパク質であってもよい。
【００２０】
本発明において、前記プロモーターの種類は制限されず、細胞内において、蛍光タンパク質コード配列の転写を開始できるプロモーター配列であればよい。また、プロモーターの種類は、例えば、細胞の種類によって適宜決定してもよい。前記プロモーターとしては、例えば、構成的プロモーターがあげられ、具体例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター（以下、「ＣＭＶプロモーター」という）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等のウイルス由来プロモーター；チミヂンキナーゼプロモーター、エロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、筋βアクチンプロモーター等のハウスキーピング遺伝子由来プロモーター；ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβグロビンエクソンからなる合成プロモーター）、ＳＲα（ＳＶ４０初期プロモーターとＨＴＬＶ１のＬＴＲからなる合成プロモーター）等の合成プロモーター等があげられる。
【００２１】
前記プロモーターは、第１ベクターにおいて第１蛍光タンパク質コード配列に、第２ベクターにおいて第２蛍光タンパク質コード配列に、それぞれ機能的に結合（配置）されていることが好ましい。つまり、各ベクターにおいて、プロモーターは、前記蛍光タンパク質コード配列の転写を制御する位置に配置されていることが好ましい。通常、前記プロモーターは、転写目的のコード配列の上流側（すなわち５’側）に配置されているが、プロモーターと前記転写目的のコード配列との距離は、制限されない。一般的に、プロモーターは、転写開始点、その約２５〜３７塩基対上流にＴＡＴＡボックス、さらに、その上流（−４０〜−６０）にＧＣボックス、さらに、その上流（−６０〜−１００）にＣＡＡＴボックス、前記転写開始点の下流にイントロン（転写産物ｍＲＮＡが効率的に核外に輸送される）等が含まれた構成となっている。したがって、蛍光タンパク質を発現させるにあたって、例えば、そのコード遺伝子の転写を妨げる配列が入らないように、プロモーターと前記転写目的のコード配列との距離は、なるべく近い方が好ましい。また、ｍＲＮＡの効率よい翻訳が望まれることから、例えば、目的遺伝子（本発明における蛍光タンパク質のコード遺伝子）の開始コドン近傍は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）に統一することが望ましい。
【００２２】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、２つのアームを有し、２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記蛍光タンパク質コード配列が配置されている。一般に、標的組換えの効率に関して、アームの設計が重要であることが知られている。しかしながら、本発明は、より高い効率で相同組換えを実現するベクターを構築すること自体が目的ではない。本発明の第一の目的は、第１ベクターおよび第２ベクターを導入した細胞が、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判別したり、判別結果から、その細胞種の組換え効率またはその組換え手法の組換え効率を評価することである。したがって、本発明において、例えば、前記アームの配列や長さは制限されない。
【００２３】
第１ベクターのライトアームと第２ベクターのライトアーム、および、第１ベクターのレフトアームと第２ベクターのライトアームとは、互いに相同性が高い配列であることが好ましい。具体的には、例えば、９９％以上が好ましく、より好ましくは、９９．９％以上、特に好ましくは１００％である。
【００２４】
各ベクターの２つのアームは、例えば、ベクターが線状化した状態において、前記プロモーターの上流側（５’末端側）をレフトアーム、蛍光タンパク質コード配列の下流側（３’末端側）をライトアームと呼ぶ。
【００２５】
前記アームの長さは、制限されず、適宜設定できる。一般的には、相同領域が、例えば、２〜５ｋｂであり、好ましくは、１０ｋｂ以上である。通常、レフトアームおよびライトアームの少なくとも一方の長さ(相同領域の長さ)が、例えば、５ｋｂ以上であることが好ましく、より好ましくは１０ｋｂ以上である。また、他方の相同領域の長さは、例えば、短くてもよいが、０．５ｋｂ以上であることが好ましく、より好ましくは、前述のアームと同様に１０ｋｂ以上である。
【００２６】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて、構成の一例を図１に示す。同図において、上が第１ベクターであり、下が第２ベクターである。同図において、Ｃｏｌｏｒ１は、第１蛍光タンパク質コード配列であり、Ｃｏｌｏｒ２は、第２蛍光タンパク質コード配列である。同図に示す第１ベクターは、上流側から、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ１およびライトアームがこの順序で配置された構造であり、第２ベクターは、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ２およびライトアームがこの順序で配置された構造である。これらのベクターにおいて、各領域は、機能的に配置されていればよく、その限りにおいて、例えば、各領域の間に他の配列を含んでもよい。
【００２７】
本発明におけるベクターは、例えば、図１に示すような線状化ベクターでもよいし、環状化ベクターであってもよい。前記環状化ベクターの場合、通常、細胞への導入前に、レフトアームとライトアームとの間を切断して、線状化したものを使用する。なお、第１ベクターのプロモーターと第２ベクターのプロモーターとが同じ配列の場合、前記プロモーターは、例えば、レフトアームに含まれ、前記蛍光タンパク質コード配列の上流側がレフトアームに含まれ得る。
【００２８】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含んでもよい。前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、前記第１蛍光タンパク質コード配列または第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に配置される。「バイシストロニック性制御配列」とは、通常、バイシストロニック性を実現する制御配列を意味し、「バイシストロニック性」とは、１つのｍＲＮＡから、２つの機能し得るタンパク質が発現することを意味する。
【００２９】
本発明において、第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、プロモーターの下流において、前記蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間にバイシストロニック性制御配列が配置されていることが好ましい。前記蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との位置関係は特に制限されない。例えば、バイシストロニック性制御配列を介して、上流側に前記蛍光タンパク質コード配列、下流側に薬剤耐性遺伝子が機能的に配置されてもよいし、上流側に薬剤耐性遺伝子、下流側に前記蛍光タンパク質コード配列が機能的に配置されてもよい。中でも、上流側から、前記蛍光タンパク質コード配列、バイシストロニック性制御配列および薬剤耐性遺伝子がこの順序で配置されていることが好ましい。
【００３０】
前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、リボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列があげられる。前記ＩＲＥＳ配列としては、特に制限されないが、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ：Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）由来のＩＲＥＳ配列が好ましい。ＩＲＥＳ配列は、例えば、米国特許第４，９３７，１９０号、特表２００２−５１４０８６（ＪＰ２００２−５１４０８６Ａ）号公報、特表２００１−５０００２１（ＪＰ２００１−５０００２１Ａ）号公報等に記載されている。ＩＲＥＳ配列は、例えば、ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列に基づいてＰＣＲやクローニング等により合成してもよいし、ＩＲＥＳ配列を有する市販のベクターから調製することもできる。
【００３１】
また、前述のように、ＩＲＥＳ配列の下流側に薬剤耐性遺伝子が配置されている場合、例えば、前記薬剤耐性遺伝子の下流側（３’末端側）に、さらに、ポリＡ付加シグナルが結合していることが好ましい。
【００３２】
前記薬剤耐性遺伝子としては、制限されず、公知の薬剤耐性マーカーが使用できる。また、第１ベクターおよび第２ベクターが、前述のように、バイシストロニック性制御配列と共に薬剤耐性遺伝子を有する場合、第１ベクターと第２ベクターは、異なる薬剤耐性遺伝子を有することが好ましい。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子等があげられる。
【００３３】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて、その他の構成例を、図２に示す。同図において、上が第１ベクターであり、下が第２ベクターである。同図において、Ｃｏｌｏｒ１は、第１蛍光タンパク質コード配列、Ｃｏｌｏｒ２は、第２蛍光タンパク質コード配列、ｄｒｕｇ１ｒは、第１ベクターの第１の薬剤耐性遺伝子、ｄｒｕｇ２ｒは、第２ベクターの第２の薬剤耐性遺伝子を示す。同図に示す第１ベクターは、上流側から、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ１、ＩＲＥＳ、第１薬剤耐性遺伝子およびライトアームがこの順序で配置された構造であり、第２ベクターは、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ２、ＩＲＥＳ、第２薬剤耐性遺伝子およびライトアームがこの順序で配置された構造である。これらのベクターにおいて、各領域は、機能的に配置されていればよく、その限りにおいて、例えば、各領域の間に他の配列を含んでもよい。これらのベクターは、前述のように、例えば、図２に示すような線状化ベクターでもよいし、環状化ベクターであってもよい。なお、前述と同様に、第１ベクターのプロモーターと第２ベクターのプロモーターとが同じ配列の場合、例えば、前記プロモーターは、レフトアームに含まれる。
【００３４】
このような第１ベクターおよび第２ベクターは、例えば、前述のような領域を機能的に結合させて構築することもできるが、例えば、市販のベクターを骨格として作製することもできる。前記骨格となるベクターとしては、制限されないが、例えば、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３、ｐＩＲＥＳｂｌｅｏ３、ｐＩＲＥＳ、ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１等があげられる。前記第１ベクターおよび第２ベクターの構築において、例えば、前述のプロモーター、蛍光タンパク質コード配列、バイシストロニック性制御配列、薬剤耐性遺伝子等は、前記骨格となるベクターに連結してもよいし、前記骨格となるベクターが本来有している領域をそのまま利用してもよい。また、第１ベクターおよび第２ベクターにおいて、前記骨格となるベクター（またはその一部）を、アームとしてもよいし、さらに、別途準備したＤＮＡ断片を前記骨格となるベクターに補充してアームを形成してもよい。
【００３５】
つぎに、本発明の判別方法の一例を、図３および図４を用いて説明する。なお、本発明は、以下の例に限定されるものではない。
【００３６】
（Ａ）第１ベクターの導入
まず、細胞に第１ベクターを導入する（図３（Ａ））。前記第１ベクターは、前述のように、通常、線状化ベクターとして導入に使用する。細胞へのベクターの導入方法は、制限されず、例えば、細胞やベクターの種類に応じて適宜決定でき、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクョン法、リポソームにより導入する方法等があげられる。また、ウイルスをもとに作製したベクターの場合、例えば、ウイルスを介して細胞に導入させてもよい。このようなベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等をもとに作製したベクターがあげられる。また、ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで導入してもよい。
【００３７】
前記細胞は、制限されない。本発明は、例えば、前述のように、標的組換えが起こりにくい細胞に対して、標的組換え効率に優れる系を新たに構築する際、得られた細胞が標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断するのに有用である。このような目的で本発明を実施する場合、前記細胞として、例えば、標的組換えが起こり難い細胞があげられる。具体的には、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＩＭＲ９０、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ２１、Ｖｅｒｏ、ＰＣ１２、ＭＤＣＫ、Ｓ２、Ｓｆ９細胞等があげられる。また、遺伝子解析が求められている重要性の高い細胞について、さらに標的組換え効率を向上させる技術の開発も望まれることから、例えば、Ｎａｌｍ−６細胞、ＨＣＴ１１６、ＤＴ４０、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ＥＳ ｃｅｌｌ）等の細胞も好ましい。なお、本発明は、これには制限されず、例えば、真核細胞があげられ、詳細には、ヒトをはじめとする哺乳類由来の様々な細胞があげられる。より詳細には、造血幹細胞；Ｎａｌｍ−６、ＢＡＬＬ１、ＮＡＬＭ１、Ｒａｊｉ等のｐｒｅ−Ｂ細胞ならびにＢ細胞、Ｔ細胞、白血球、単球・マクロファ−ジ、赤血球、血小板等の血球系細胞、血液細胞；筋原細胞、肝細胞、リンパ球、ニューロン細胞、皮膚上皮、気道上皮、受精卵母細胞、各種腫瘍細胞（例えば、Ｈｅｌａ、ＣＨＯ、ＭＣＦ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２）、神経系細胞等があげられる。また、細胞の培養条件は、使用する細胞に応じて適宜決定できる。
【００３８】
（Ｂ）第１ベクター導入細胞の選択
続いて、前記工程により前記第１ベクターが導入された細胞（以下、「第１ベクター導入細胞」という）を選択する。すなわち、図３（Ｂ）に示すように、前記第１ベクターが前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた細胞を選択する。第１ベクターが組み込まれた細胞は、例えば、図４（Ｂ）に示すように第１蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）を有し、第１蛍光タンパク質を発現する。
【００３９】
この第１ベクターの選択方法は、制限されないが、本発明においては、例えば、第１蛍光タンパク質の蛍光検出により選択できる。蛍光検出の方法は、制限されず、従来公知の方法が使用できる。具体例としては、例えば、蛍光顕微鏡、セルソーティング、ＦＡＣＳｃａｎ等が使用できる。また、検出の際には、例えば、励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックミラー等、前述の各種光学素子を組み合わせて使用することが好ましい。
【００４０】
また、前記第１ベクターが、薬剤耐性遺伝子を有する場合には、前記薬剤耐性を示す細胞を、第１ベクター導入細胞として選択することもできる。このように薬剤耐性によって細胞を選択する場合、前述のように、薬剤耐性遺伝子をバイシストロニック性制御配列の上流または下流に機能的に配置した第１ベクターを使用することが好ましい。このベクターによれば、バイシストロニック性制御遺伝子の性質上、例えば、薬剤耐性を示す細胞は、第１蛍光タンパク質コード遺伝子が導入された細胞と判断できる。
【００４１】
（Ｃ）第２ベクターの導入
つぎに、前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する（図３（Ｃ））。前記第２ベクターは、前述と同様に、線状化ベクターであることが好ましい。また、細胞へのベクターの導入方法は、前述と同様である。
【００４２】
（Ｄ）蛍光タンパク質の検出、および、（Ｅ）組換えの判定
前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の検出を行う。前記（Ｃ）工程により第２ベクターが導入された細胞は、例えば、標的組換え体またはランダム挿入体となる。具体的に説明すると、図３（Ｃ）に示すように、すでにゲノムＤＮＡに組み込まれた第１ベクターと導入された第２ベクターとの間で標的組換え（相同組換え）が生じると、図３（Ｄ１）に示す標的組換え体となる。この細胞では、標的組換えが生じたため、第１ベクター由来の蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）が、第２ベクター由来の蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ２）と置き換わっている。このため、この細胞では、例えば、図４（Ｄ１）に示すように、第２蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）を有し、第２蛍光タンパク質のみを発現する。他方、ランダム挿入が生じると、図３（Ｄ２）に示すように、ゲノムＤＮＡにおいて、第１ベクターとは異なる部位に、第２ベクターが組み込まれる。このため、ランダム挿入体では、例えば、図４（Ｄ２）に示すように、第１蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）と第２蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ２）との両方を有し、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質を発現する。したがって、得られた細胞について、第１蛍光タンパク質の検出および第２蛍光タンパク質の検出を行えば、標的組換え体であるか、ランダム挿入体であるかを判別できる。すなわち、第２蛍光タンパク質のみが検出された場合は、例えば、図３（Ｄ１）と判断できることから、標的組換え体であると判定できる。他方、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とが検出された場合は、例えば、図３（Ｄ２）と判断できることから、ランダム挿入体であると判定できる。
【００４３】
また、第１タンパク質のみが検出された場合は、第２ベクターが細胞内に導入されていないと判定できる。このように第２ベクターが導入されていない細胞を除外するためには、例えば、薬剤耐性遺伝子を有する第２ベクターを使用することが好ましい。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、第１ベクターが同様に薬剤耐性遺伝子（第１薬剤耐性遺伝子）を有する場合、前述のように、前記第１薬剤耐性遺伝子とは異なる遺伝子（第２薬剤耐性遺伝子）であることが好ましい。このように第２ベクターの薬剤耐性遺伝子によって細胞を選択すれば、第２ベクターが細胞に導入されていない細胞を除外できる。また、このように薬剤耐性によって細胞を選択する場合は、前記第１ベクターと同様に、薬剤耐性遺伝子をバイシストロニック性制御配列の上流または下流に機能的に配置した第２ベクターを使用することが好ましい。このベクターによれば、バイシストロニック性制御遺伝子の性質上、例えば、薬剤耐性を示す細胞は、標的組換え体かランダム挿入体であるかは別として、少なくとも第２蛍光タンパク質コード遺伝子が導入された細胞と判断できる。
【００４４】
また、本発明の判別方法は、例えば、後述するような標的組換え効率の評価だけでなく、細胞に目的配列を標的組換えにより組み込む際にも利用できる。例えば、第２ベクターにおいて、プロモーターの制御下、ＩＲＥＳの上流および下流に、第２蛍光タンパク質コード配列と目的配列を配置して、前述と同様に組換えを行う。そして、得られた細胞において、第２タンパク質の蛍光のみが検出された細胞を、標的組換えによって目的配列が組み込まれた細胞として判別できる。第２蛍光タンパク質が検出されれば、ＩＲＥＳの性質上、目的配列も標的組換えにより組み込まれていると判断できるからである。
【００４５】
＜標的組換え効率の評価方法＞
本発明は、細胞の標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む。
（ａ） 本発明の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【００４６】
細胞に遺伝子を導入した場合、前述のように、多数のランダム挿入体が混在しており、いずれの細胞が標的組換え体であるか同定することが極めて困難であった。しかしながら、本発明の判別方法によれば、前述のように、簡便に、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判別できる。このため、ベクターの導入により得られる多数の細胞について、標的組換え体の細胞数とランダム挿入体数を計数でき、これによって標的組換え効率を算出（定量化）できる。前記標的組換え効率の表し方は、制限されないが、例えば、標的組換え体の細胞数とランダム挿入体の細胞数との比で表すことが好ましい。具体例としては、例えば、標的組換え体数（Ａ）とランダム挿入体数（Ｂ）との比（Ａ：Ｂ）、全細胞数（Ａ＋Ｂ）における標的細胞数（Ａ）の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））およびその百分率（１００×Ａ／（Ａ＋Ｂ））等があげられる。
【００４７】
＜判別用キット＞
本発明は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、前記第１ベクターおよび第２ベクターを含む。本発明の判別用キットを用いれば、前述の本発明の判別方法を実施できる。なお、第１ベクターおよび第２ベクターは、前述の通りである。
【００４８】
＜標的組換え効率評価定用キット＞
本発明は、標的組換え効率を評価するためのキットであり、前記本発明の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む。本発明の評価用キットを用いれば、前述の本発明の標的組換え効率の評価方法を実施できる。
【００４９】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００５０】
＜第１ベクターおよび第２ベクターの構築＞
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の薬剤耐性遺伝子「ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子」を、別の薬剤耐性遺伝子「ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子」のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片で置き換えた。このベクターをｐＩＲＥＳｎｅｏｍｙｃｉｎと呼び、第１ベクター構築用のベクターとした。また、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、第２ベクター構築用のベクターとした。
【００５１】
λファージのゲノムＤＮＡから、ＤＮＡ断片を調製した。具体的には、下記プライマーセット１を用いて、２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、下記プライマーセット２を用いて５．１ｋｂのＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲ増幅により調製した。λファージのゲノムＤＮＡ（４８５０２ｂｐ）において、２．５ｋｂの断片は、１７０１０〜１３１９８番目の領域であり、５．１ｋｂのＤＮＡ断片は、５５２５〜１０６１７番目の領域である。前記２．５ｋｂのＤＮＡ断片をＮｒｕＩおよびＮｏｔＩで切断し、前記ｐＩＲＥＳｎｅｏｍｙｃｉｎおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３のＮｒｕＩ−ＮｏｔＩサイトに、それぞれ挿入した。得られたベクターをＮｏｔＩおよびＮｓｉＩで切断し、これに、前記５．１ｋｂのＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＮｓｉＩで処理して得られた４．８ｋｂの前記ＤＮＡ断片を、同様に連結した。得られたプラスミドを、ｐＩＲＥＳｎｅｏλおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏλと呼ぶ。
（プライマーセット１）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGGTCGCGAGCTGCACAGAAAGCGGGGATTTC−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−ATAAGAAGCGGCCGCCGCTCGCTGAGAATAGCCATCAC−３’
（プライマーセット２）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−ATAAGAAGCGGCCGCCACTAGTGCTCACGGACGCGAAGAACAG−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGCTCGAGTTGGCGCGCCCTCTGGCCATCTGCTCGTCAAATC−３’
【００５２】
他方、生体由来蛍光タンパク質ＡｃＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２の完全コード配列を、それぞれ制限酵素認識部位（５’側にＭｕｎＩサイト、３’側にＥｃｏＲＩサイト）を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ＭｕｎＩ／ＥｃｏＲＩ処理したＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。使用したプライマーセットを以下に示す。なお、各蛍光タンパク質のコード遺伝子の開始コドン近傍は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）とした。そして、このベクターから、ＣＡＧプロモーターおよび前記蛍光タンパク質のコード配列を含むＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切り出し、これを平滑化して、前述のｐＩＲＥＳｎｅｏλおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏλのＮｓｉＩ部位（平滑末端）に挿入した。前記断片をｐＩＲＥＳｎｅｏλに挿入して得られたベクターを、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）、前記断片をｐＩＲＥＳｐｕｒｏλに挿入して得られたベクターを第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）という。図５に、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３に２．５ｋｂのＤＮＡ断片、４．８ｋｂのＤＮＡ断片、ＣＡＧプロモーターおよびＤｓＲｅｄ２コード配列が挿入された、環状の第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）を示す。同図において、ｐｒｏＣＡＧは、ＣＡＧプロモーター、Ｃｏｌｏｒ２は、ＤｓＲｅｄ２コード配列、ｐｕｒｏｒは、ピューロマイシン耐性遺伝子を、それぞれ示す。また、矢印は、後述する線状化の際の切断部位を示す。なお、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）は、図５において、ｐｕｒｏｒがｎｅｏｒ（ネオマイシン耐性遺伝子）であり、Ｃｏｌｏｒ２（ＤｓＲｅｄ２コード配列）がＣｏｌｏｒ１（ＡｃＧＦＰコード配列）となった構造である。
（ＡｃＧＦＰプライマーセット）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGCAATTGTCGCCACCATGGTGAGCAAG−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGGAATTCTACTTGTACAGCTCATCCATGCCGTG−３’
（ＤｓＲｅｄ２プライマーセット）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGCAATTGTCGCCACCATGGACAACACC−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGGAATTCTACTGGGAGCCGGAGTGGC−３’
【００５３】
＜ベクターの導入＞
Ｎａｌｍ−６細胞に、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）および第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）を、以下の方法により導入した。なお、第１ベクターおよび第２ベクターは、ＮｏｔＩでの切断により線状化したものを導入に使用した。図６に、ＮｏｔＩでの切断により線状化した第１ベクターおよび第２ベクターの構成の概略を示す。ＮｏｔＩ処理によって、例えば、図６に示すベクターにおいて、λＤＮＡ断片２．５ｋｂとλＤＮＡ断片４．８ｋｂとの間が切断される。そして、蛍光タンパク質コード領域の上流が、レフトアーム、薬剤耐性遺伝子の下流が、ライトアームとなる。前記各ベクターの導入は、遺伝子導入システム（商品名Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）、ａｍａｘａ社製）および前記システム専用の遺伝子導入試薬を用いて行った。図７に、本実施例における、第１ベクターおよび第２ベクターのヒトゲノムＤＮＡに対する組み込みを表す概略図を示す。
【００５４】
まず、指数増殖中のＮａｌｍ−６細胞（約２×１０６個）を用意し、遠心分離によって上澄みを除去した。回収した細胞を、１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＴ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｔ，ａｍａｘａ）に懸濁し、線状化した前記第１ベクター２μｇを混和し、前記キットに付随するキュベットに移した。そして、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃ−０５にて通電し、エレクトロポレーションにより前記ベクターの導入を行った。導入処理後、前記細胞を、３７℃に温めておいたＥＳ培地４ｍｌに添加し、２４時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。２４時間静置後の細胞を、細胞濃度が約５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＥＳ培地で希釈し、この細胞希釈液を９６ウェルプレートにまいた（２００μｌ細胞懸濁液／ウェル、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）。このプレートを、２週間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。２週間後、Ｇ４１８に耐性を示した細胞を選択した。ここで選択される細胞は、図７に示すように、Ｎａｌｍ−６細胞に第１ベクターが導入されることによって（図７（Ａ））、ヒトゲノムＤＮＡに線状化第１ベクターが組み込まれた細胞である（図７（Ｂ））。なお、ヒトゲノムＤＮＡに線状化第１ベクターが組み込まれた細胞を、以下、ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４（第１ベクター導入細胞株）ともいう。
【００５５】
続いて、得られたＧ４１８耐性細胞に、前記第１ベクターと同じ方法で、第２ベクターを導入した。導入後の細胞を、さらに、終濃度０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＥＳ培地において、３７℃で２週間培養した。そして、ピューロマイシンに耐性を示した細胞を選択した（合計６株）。これらのピューロマイシン耐性細胞を、それぞれ、Ｃｌｏｎｅ１〜６とする。ここで選択される細胞は、２種類の組換え体である。一つは、図７（Ｃ）に示すように、ヒトゲノムＤＮＡに組み込まれた前記第１ベクターと第２ベクターとの間で「標的組換え」が生じ、第１ベクターにおけるＣｏｌｏｒ１（ＡｃＧＦＰコード配列）がＣｏｌｏｒ２（ＤｓＲｅｄ２コード配列）に、ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒがＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒに置き換わった組換え体である（図７（Ｄ１））。他方は、図７（Ｄ２）に示すように、ランダム挿入によって、第１ベクターが組み込まれた領域とは別の領域に、第２ベクターが組み込まれた組換え体である。なお、後述するが、Ｃｌｏｎｅ６は、標的組換えが生じている細胞であるため、以下の図においては、便宜上「ＣｌｏｎｅＣ６」と記載する。
【００５６】
蛍光タンパク質の発現を利用した組換えの評価が可能であることを裏付けるため、得られたピューロマイシン耐性細胞について、以下の分析を行った。コントロールとして、ベクターを導入していない野生株Ｎａｌｍ−６細胞、蛍光タンパク質としてＡｃＧＦＰのみを発現する細胞（ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４）、および、蛍光タンパク質としてＤｓＲｅｄ２のみを発現する細胞（以下、「ＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５」という）についても同様に分析を行った。前記ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４は、前述のとおり、Ｎａｌｍ−６細胞に第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）のみを導入した細胞である。前記ＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５は、Ｎａｌｍ−６細胞にベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）のみを導入した細胞である。前記ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）は、前述と同様にしてＤｓＲｅｄ２の完全コード配列をサブクローニングしたｐＣＡＧＧＳから、ＣＡＧプロモーターおよびＤｓＲｅｄ２コード配列を含むＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、平滑化して、前記ｐＩＲＥＳｎｅｏλに挿入することにより作製した。
【００５７】
（ＰＣＲによる標的組換えの確認）
各細胞から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡｃＧＦＰコード配列およびＤｓＲｅｄ２コード配列に特異的なプライマーセットをそれぞれ用いて、ＰＣＲを行った。前記プライマーセットは、前記ベクター構築で使用したものと同じである。そして、各細胞のＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅断片の検出を行った。なお、増幅反応のコントロールとして、β−グロブリンの増幅を確認した。これらの結果を図８に示す。同図は、各細胞のゲノムにおけるＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【００５８】
Ｃｌｏｎｅ１〜５は、それぞれ、同図に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列およびＤｓＲｅｄ２コード配列の増幅物が両方検出された。これは、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、ランダム挿入が生じ、第１ベクターによりＡｃＧＦＰコード配列が組み込まれ、且つ、異なる部位に、第２ベクターによりＤｓＲｅｄ２コード配列が組み込まれたことを意味する。他方、ＣｌｏｎｅＣ６は、同図に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列の増幅物は検出されず、コントロールＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５と同様に、ＤｓＲｅｄ２コード配列のみが検出された。このことから、ＣｌｏｎｅＣ６は、初めに組み込まれた第１ベクターのＡｃＧＦＰコード配列が、第２ベクターのＤｓＲｅｄ２コード配列と置き換わっている、つまり標的組換えが生じていることがわかる。
【００５９】
（サザンブロットによる標的組換えの確認）
各細胞から単離したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動した。そして、ゲル内で分離されたＤＮＡ断片をナイロンメンブランに写し、ＡｃＧＦＰコード配列またはＤｓＲｅｄ２コード配列に対する下記プローブとのハイブリダイズを行った。これらのオートラジオグラフィーの結果を、図９に示す。同図は、各細胞のゲノムＤＮＡとプローブとのサザンハイブリダイゼーションの結果を示すオートラジオグラフィーであり、（Ａ）が、ＡｃＧＦＰコード配列を検出した結果であり、（Ｂ）が、ＤｓＲｅｄ２コード配列を検出した結果である。
【００６０】
ＡｃＧＦＰ用プローブは、ベクターｐＡｃＧＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理した、全長ＡｃＧＦＰの精製ＤＮＡ断片を使用した。また、ＤｓＲｅｄ２用プローブは、ベクターＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理した、全長ＤｓＲｅｄ２の精製ＤＮＡ断片を使用した。
【００６１】
Ｃｌｏｎｅ１〜５は、同図（Ａ）に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列が検出され、且つ、同図（Ｂ）に示すように、ＤｓＲｅｄ２コード配列が検出された。これは、Ｃｌｏｎｅ１〜５について、ランダム挿入が生じ、第１ベクターによりＡｃＧＦＰコード配列が組み込まれ、且つ、第２ベクターによりＤｓＲｅｄ２コード配列が組み込まれたことを意味する。また、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、同図（Ａ）におけるＡｃＧＦＰコード配列のバンドと、同図（Ｂ）におけるＤｓＲｅｄ２コード配列のバンドが、全く異なることからも、ＤｓＲｅｄ２コード配列は、ＡｃＧＦＰコード配列とは、全く別の部位に組み込まれていることがわかる。他方、ＣｌｏｎｅＣ６は、同図（Ａ）に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列は検出されず、同図（Ｂ）に示すように、ＤｓＲｅｄ２コード配列のみが検出された。さらに、同図（Ａ）のＣｌｏｎｅ１〜５におけるＡｃＧＦＰコード配列のバンドと、同図（Ｂ）のＣｌｏｎｅＣ６におけるＤｓＲｅｄ２コード配列のバンドが同じであった。このことから、ＣｌｏｎｅＣ６は、初めに組み込まれた第１ベクターのＡｃＧＦＰコード配列が、第２ベクターのＤｓＲｅｄ２コード配列と置き換わっている、つまり標的組換えが生じていることがわかる。
【００６２】
（ＦＡＣＳｃａｎによる標的組換えの確認）
各細胞について、ＡｃＧＦＰの蛍光強度とＤｓＲｅｄ２の蛍光強度に従って、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を行った。フローサイトメーターとしては、商品名ＦＡＣＳｃａｎ(ベクトン・ディッキンソン社製)を使用し、ＡｃＧＦＰは、励起光波長４８８ｎｍ、検出波長５３０ｎｍ近傍（ＦＬ１）とし、ＤｓＲｅｄ２は、励起光波長４８８ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ近傍（ＦＬ２）とした。この結果を図１０に示す。同図において、各グラフの横軸は、ＧＦＰの蛍光強度を示し、縦軸は、ＤｓＲｅｄ２の蛍光強度を示す。同図に示すように、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、全て、緑の蛍光と赤の蛍光を示す領域に分布しているのに対し、ＣｌｏｎｅＣ６は、赤の蛍光を示す領域に略１００％が分布していた。つまり、Ｃｌｏｎｅ６は、ＦＡＣＳｃａｎの結果からも、標的組換えによりＤｓＲｅｄ２のみを発現していることがわかる。また、この結果は、標的組換え効率の測定に、ＦＡＣＳｃａｎによる解析が効果的であることも示唆している。
【００６３】
（標的組換えの蛍光顕微鏡解析）
以上のように、ピューロマイシン耐性細胞６株のうち、ＣｌｏｎｅＣ６のみがＤｓＲｅｄ２を発現し、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、ＤｓＲｅｄ２とＡｃＧＦＰの両方を発現していることから、Ｃｌｏｎｅ６は標的組換えが生じ、Ｃｌｏｎｅ１〜５はランダム挿入が生じていることがわかった。つまり、蛍光タンパク質の検出によって、ランダム挿入体と標的組換え体を判断できることがわかった。そこで、実際に、得られたピューロマイシン耐性６株における組換えを視覚的に判断するため、蛍光顕微鏡観察を行った（商品名Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ社製）。蛍光顕微鏡観察の条件は、ＡｃＧＦＰについて、励起光波長４８５ｎｍ、検出波長５１５−５６５ｎｍ（蛍光フィルタＦｉｌｔｅｒ ｓｅｔ１７）とし、ＤｓＲｅｄ２について、励起光波長５５０ｎｍ、検出波長５７０−６４０ｎｍ（蛍光フィルタ４３−ＨＥ）とした。観察は、標的組換えが生じたＣｌｏｎｅＣ６、ランダム挿入が生じたＣｌｏｎｅ５、コントロールとして、野生株Ｎａｌｍ−６細胞およびＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４（第１ベクター導入細胞株）について行った。これらの結果を、図１１に示す。同図において、（Ａ）は、各細胞の顕微鏡写真の画像データであり、（Ｂ）は、ＡｃＧＦＰの検出波長での蛍光顕微鏡写真の画像データ、（Ｃ）は、ＤｓＲｅｄ２の検出波長での蛍光顕微鏡写真の画像データであり、（Ｄ）は、前記（Ｂ）および（Ｃ）を重ね合わせた画像データである。同図に示すように、標的組換えが生じたＣｌｏｎｅＣ６では、ＡｃＧＦＰは検出されず、赤色のＤｓＲｅｄ２のみが検出された。他方、ランダム挿入が生じたＣｌｏｎｅ５は、緑色のＡｃＧＦＰと赤色のＤｓＲｅｄ２がともに検出され、これらを重ね合わせた画像データでは、黄色〜黄緑を示した。このように、蛍光顕微鏡観察において、ＣｌｏｎｅＣ６は、標的組換えによりＤｓＲｅｄ２のみを発現し、他のＣｌｏｎｅは、ランダム挿入によりＤｓＲｅｄ２とＡｃＧＦＰとを発現していた。この結果は、前述のゲノム解析、サザンブロット解析等における蛍光タンパク質遺伝子の組換え結果と同様の結果である。したがって、本実施例の手法によれば、蛍光タンパク質の検出によって標的組換えとランダム挿入を視覚的に区別でき、且つ、それに基づいて組換え効率を評価することが可能であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、最終的に得られる細胞について、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質を検出することによって、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断できる。特に、本発明においては、前記第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを、それらが発する蛍光によって検出するため、視覚的な検出が可能であり、極めて簡便に標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断できる。この蛍光検出には、例えば、ＰＣＲやハイブリダイゼーション等のように細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を抽出する必要はなく、例えば、細胞そのものへの励起光照射で足りることからも、極めて簡便かつ迅速な方法であるといえる。また、このように標的組換え体とランダム挿入体の判別を簡便に行えることから、それぞれの細胞数の計数も非常に容易に行うことができる。このため、本発明によれば、極めて簡便に標的組換え効率を評価できる。前述のように、近年、高効率で標的組換えが生じる細胞の検索や技術の確立が行われていることからも、本発明は、これらの研究を、例えば、簡便化且つ促進化できるため、非常に有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明のその他の実施形態における第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施形態において、第１ベクターおよび第２ベクターのゲノムＤＮＡに対する組み込みを示す概略図であり、（Ａ）は、細胞内に第１ベクターが導入された状態を示す図、（Ｂ）は、ゲノムＤＮＡに第１ベクターが挿入された状態を示す図、（Ｃ）は、第１ベクターが組み込まれたゲノムＤＮＡと第２ベクターとの相同組換えを示す図、（Ｄ１）は、第２ベクターが標的組換えによりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図、（Ｄ２）は、第２ベクターがランダム挿入によりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図をそれぞれ示す。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施形態において、図３における細胞が有する蛍光タンパク質を示す概略図であって、（Ｂ）は、図３（Ｂ）の第１ベクター導入細胞、（Ｄ１）は、図３（Ｄ１）の標的組換え体、（Ｄ２）は、図３（Ｄ２）のランダム挿入体をそれぞれ示す。
【図５】図５は、本発明の一実施例における、環状の第２ベクターの構成を示す概略図である。
【図６】図６は、本発明の一実施例における、第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す概略図である。
【図７】図７は、本発明の一実施例において、第１ベクターおよび第２ベクターのヒトゲノムＤＮＡに対する組み込みを示す概略図であり、（Ａ）は、細胞内に第１ベクターが導入された状態を示す図、（Ｂ）は、ゲノムＤＮＡに第１ベクターが挿入された状態を示す図、（Ｃ）は、第１ベクターが組み込まれたゲノムＤＮＡと第２ベクターとの相同組換えを示す図、（Ｄ１）は、第２ベクターが標的組換えによりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図、（Ｄ２）は、第２ベクターがランダム挿入によりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図をそれぞれ示す。
【図８】本発明のその他の実施例における、ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図９】本発明のさらにその他の実施例における、サザンブロットのオートラジオグラフィー写真である。
【図１０】本発明のさらにその他の実施例における、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図１１】本発明のさらにその他の実施例における、蛍光顕微鏡解析の結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法およびそれに用いる判別用キットに関する。また、本発明は、標的組換え効率の評価方法およびそれに用いる評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療等の先端医療分野や、創薬研究、基盤研究等の分野において、遺伝子ターゲティングは、遺伝子機能を解明するための主要な技術とされている。遺伝子ターゲティングとは、ゲノム上の目的遺伝子を破壊したり改変する方法であって、一般的に、相同組換えが利用されている。具体的には、例えば、目的遺伝子（内在性遺伝子）に類似した配列を有する遺伝子ターゲティングベクターを使用し、前記目的遺伝子と前記ベクターとの間で相同組換えを起こすことによって、ゲノムの目的位置に突然変異を組み込んで、目的遺伝子の破壊や改変が行われる。
【０００３】
しかしながら、真核細胞、特に哺乳類の細胞において、このような相同組換えは稀にしか起こらず、その頻度はランダム挿入の約１／１０４〜１／１０５にすぎない。また、このように頻度が極めて低いため、多数のランダム挿入体が混在する中から、相同組換え体（標的組換え体）を判別することは非常に困難である。
【０００４】
そこで、近年、標的組換え（相同組換え）が高効率で生じる細胞の検索（非特許文献１）や、高効率での標的組換えを可能にする技術の確立（非特許文献２、非特許文献４）が求められ、盛んに研究が行われている。このような研究においては、検索対象の細胞や改良技術によって、標的組換えが高効率で起こっているか否かを相対的に判断することが必要である（非特許文献３）。そこで、通常、組換え処理を行った細胞を培養して、標的組換え体の数とランダム挿入体の数とを計数し、それから算出した標的組換え効率を比較することによって、相対的に評価を行っている。
【０００５】
具体例として、従来、標的組換え体とランダム挿入体との判別、ならびに、それぞれの計数は、以下のようにして行われていた。例えば、ターゲティングベクターの導入処理を行った細胞について、前記ターゲティングベクター上の薬剤耐性遺伝子によるスクリーニングを行い、各クローンからゲノムを調製して、サザンブロッティングによって相同組換え体を識別する方法がある。この方法は、識別結果の確実性に優れている。他方、簡便性に優れる方法としては、例えば、前記クローンから調製したゲノムを鋳型としてＰＣＲにより識別する方法がある。
【０００６】
しかしながら、従来のＰＣＲやブロッティングを利用する方法では、多数の細胞についてランダム挿入体であるか標的組換え体であるかを同定することは、非常に手間がかかり効率的ではなかった。特に、例えば、標的組換え効率の算出が目的である場合等は、目的の標的組換えが生じた細胞を得ること自体を目的とする場合と異なり、多数の細胞について標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断することが必要である。したがって、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを迅速且つ簡便に判別できることが望ましい。
【非特許文献１】“Increased Ratio of Targeted to Random Integration after Transfection of Chicken 6 Cell Lines.” Buerstedde JM and Takeda S, Cell 67, 179-188 (1991).
【非特許文献２】“Possible association of BLM in decreasing DNA double strand breaks during DNA replication.” Wang W et al., EMBO 19, 3428-3435 (2000).
【非特許文献３】“Lntrachromosomal homologous recombination in whole plants.” Swoboda P et al., EMBO 13, 484-489 (1994).
【非特許文献４】“Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.” Thomas K and Capecchi MR, Cell 51, 503-512 (1987).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、遺伝子導入を行った細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかを簡便に判別できる方法および標的組換え効率の評価方法、ならびに、これらに使用するキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の判別方法は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【０００９】
本発明の評価方法は、標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む。
（ａ） 本発明の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【００１０】
本発明の判別用キットは、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、第１ベクターおよび第２ベクターを含み、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターであり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターである。
【００１１】
本発明の評価用キットは、標的組換え効率を評価するためのキットであり、本発明の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、まず、第１蛍光タンパク質コード配列を有する第１ベクターを細胞に導入して、ゲノムＤＮＡへの組み込みを行い、さらに、第２蛍光タンパク質コード配列を有する第２ベクターを細胞に導入して、ゲノムＤＮＡへの組み込みを行う。このため、標的組換えが生じていれば、ゲノムＤＮＡには、第１ベクターの第１蛍光タンパク質コード配列に置き換わって第２ベクターの第２蛍光タンパク質コード配列が組み込まれることとなる。他方、ランダム挿入が生じていれば、ゲノムＤＮＡには、第１ベクターの第１蛍光タンパク質コード配列と第２ベクターの第２蛍光タンパク質コード配列の両方が組み込まれることとなる。したがって、最終的に得られる細胞について、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを検出することによって、標的組換え細胞（標的組換え体）であるかランダム挿入細胞（ランダム挿入体）であるかを判断できる。特に、本発明においては、前記第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを、それらが発する蛍光によって検出するため、視覚的な検出が可能であり、極めて簡便に標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかを判別できる。このように標的組換え細胞とランダム挿入細胞との判別を視覚的に行える方法は従来存在しなかった。この蛍光検出には、例えば、ＰＣＲやハイブリダイゼーション等のように、細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を抽出する必要はなく、細胞そのものへの励起光照射で足りることからも、極めて簡便な方法といえる。また、このように標的組換え細胞とランダム挿入細胞の判別を簡便に行えることから、それぞれの細胞数の計数も非常に容易となる。このため、本発明によれば、極めて簡便に標的組換え効率を評価することもできる。前述のように、近年、高効率で標的組換えが生じる細胞の検索や技術の確立が研究されていることからも、例えば、本発明によればこれらの研究を促進化できるため、非常に有用な技術といえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜標的組換え細胞とランダム挿入細胞との判別方法＞
本発明の判別方法は、前述のように、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【００１４】
まず、本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて説明する。なお、本発明において、「機能的に連結」、「機能的に配置」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で連結（結合）または配置されていることを意味する。
【００１５】
前記第１ベクターの蛍光タンパク質および第２ベクターの蛍光タンパク質の種類は、制限されない。本発明において、前記両蛍光タンパク質は、異なる種類であればよく、具体的には、例えば、従来公知の方法により、区別して検出できるものであればよい。蛍光タンパク質は、通常、特定波長光（励起光）の照射により励起され、その励起状態から基底状態に戻る際に蛍光を発する。このため、蛍光タンパク質の検出においては、一般に、目的の蛍光タンパク質に応じて、励起光を抽出するための光学素子（Ｅｘｃｉｔａｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ：Ｅｘ）、蛍光タンパク質が発する蛍光とその他の散乱光を分離する光学素子（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）、励起光と蛍光を分離するための光学素子（Ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）等が使用される。そして、これらの光学素子（光学フィルタ）を組み合わせることによって、複数の目的蛍光タンパク質を検出できることは、当該技術分野の技術常識である。
【００１６】
前記蛍光タンパク質は、前述のように制限されないが、例えば、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質があげられる。第１蛍光タンパク質が、例えば、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである場合、前記第２蛍光タンパク質は、例えば、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであることが好ましい。組合せとしては、制限されないが、例えば、赤色蛍光タンパク質と緑色タンパク質との組合せがあげられる。
【００１７】
また、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とが、同じ色彩の蛍光タンパク質グループに属する場合（例えば、両者ともに緑色蛍光タンパク質）であっても、例えば、両者の励起光が異なる場合等は、区別して検出することが可能である。
【００１８】
前記青色蛍光タンパク質としては、例えば、ＥＣＦＰ、ＢＦＰ、ｓｇＢＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｄ２ＥＣＦＰ等があげられる。前記緑色蛍光タンパク質としては、例えば、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ（ＧＦＰｃｙｃｌｅ３）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）、ｓｇＧＦＰ、ＣｒＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ｈＭＧＦＰ、ｈｒＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ｄ２／１／４ＥＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ（ＯｎＯｆｆ可能）等があげられる。前記青緑色蛍光タンパク質としては、例えば、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ等があげられる。前記黄色蛍光タンパク質としては、例えば、ＥＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｄ２ＥＹＦＰ等があげられる。前記赤色蛍光タンパク質としては、例えば、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ（ＲＦＰ）、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−ＤＲ、ＨｃＲｅｄ−ＤＲ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ等があげられる。オレンジ色蛍光タンパク質としては、例えば、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅがあげられる。また、ＤｓＲｅｄ−Ｅ５（ｐＴｉｍｅｒ）、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ等の変色化蛍光タンパク質等も使用できる。これらの蛍光タンパク質のコード遺伝子は、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、和光純薬、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、フナコシ、Ｔａｋａｒａ、Ｉｎｖｉｔｒｔｏｇｅｎ、Ａｍａｓｈａｍ Ｂｕｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＴＯＹＯＢＯ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＭＢＬ等から入手できる。また、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよい。
【００１９】
さらに、本発明における蛍光タンパク質としては、上述のタンパク質のように、タンパク質そのものが蛍光を発するものの他に、例えば、触媒機能を有するタンパク質があげられる。具体的には、触媒機能によって基質を発色させるタンパク質があげられる。このようなタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼがあげられる。β−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば、Ｘ-ｇａｌ、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。前者は、前記酵素の触媒反応によって青色に発色し、後者は、前記酵素の触媒反応によってピンク色に発色する。前記β−ガラクトシダーゼのコード遺伝子（β-ｇａｌ）は、例えば、市販のベクターから入手できる。本発明において、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質は、両方が、前述のように、タンパク質そのものが蛍光を発する蛍光タンパク質でもよいし、両方が、触媒反応によって基質を発色させるタンパク質であってもよい。また、いずれか一方が、タンパク質そのものが蛍光を発する蛍光タンパク質であり、他方が、触媒反応によって基質を発色させるタンパク質であってもよい。
【００２０】
本発明において、前記プロモーターの種類は制限されず、細胞内において、蛍光タンパク質コード配列の転写を開始できるプロモーター配列であればよい。また、プロモーターの種類は、例えば、細胞の種類によって適宜決定してもよい。前記プロモーターとしては、例えば、構成的プロモーターがあげられ、具体例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター（以下、「ＣＭＶプロモーター」という）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等のウイルス由来プロモーター；チミヂンキナーゼプロモーター、エロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、筋βアクチンプロモーター等のハウスキーピング遺伝子由来プロモーター；ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβグロビンエクソンからなる合成プロモーター）、ＳＲα（ＳＶ４０初期プロモーターとＨＴＬＶ１のＬＴＲからなる合成プロモーター）等の合成プロモーター等があげられる。
【００２１】
前記プロモーターは、第１ベクターにおいて第１蛍光タンパク質コード配列に、第２ベクターにおいて第２蛍光タンパク質コード配列に、それぞれ機能的に結合（配置）されていることが好ましい。つまり、各ベクターにおいて、プロモーターは、前記蛍光タンパク質コード配列の転写を制御する位置に配置されていることが好ましい。通常、前記プロモーターは、転写目的のコード配列の上流側（すなわち５’側）に配置されているが、プロモーターと前記転写目的のコード配列との距離は、制限されない。一般的に、プロモーターは、転写開始点、その約２５〜３７塩基対上流にＴＡＴＡボックス、さらに、その上流（−４０〜−６０）にＧＣボックス、さらに、その上流（−６０〜−１００）にＣＡＡＴボックス、前記転写開始点の下流にイントロン（転写産物ｍＲＮＡが効率的に核外に輸送される）等が含まれた構成となっている。したがって、蛍光タンパク質を発現させるにあたって、例えば、そのコード遺伝子の転写を妨げる配列が入らないように、プロモーターと前記転写目的のコード配列との距離は、なるべく近い方が好ましい。また、ｍＲＮＡの効率よい翻訳が望まれることから、例えば、目的遺伝子（本発明における蛍光タンパク質のコード遺伝子）の開始コドン近傍は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）に統一することが望ましい。
【００２２】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、２つのアームを有し、２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記蛍光タンパク質コード配列が配置されている。一般に、標的組換えの効率に関して、アームの設計が重要であることが知られている。しかしながら、本発明は、より高い効率で相同組換えを実現するベクターを構築すること自体が目的ではない。本発明の第一の目的は、第１ベクターおよび第２ベクターを導入した細胞が、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判別したり、判別結果から、その細胞種の組換え効率またはその組換え手法の組換え効率を評価することである。したがって、本発明において、例えば、前記アームの配列や長さは制限されない。
【００２３】
第１ベクターのライトアームと第２ベクターのライトアーム、および、第１ベクターのレフトアームと第２ベクターのライトアームとは、互いに相同性が高い配列であることが好ましい。具体的には、例えば、９９％以上が好ましく、より好ましくは、９９．９％以上、特に好ましくは１００％である。
【００２４】
各ベクターの２つのアームは、例えば、ベクターが線状化した状態において、前記プロモーターの上流側（５’末端側）をレフトアーム、蛍光タンパク質コード配列の下流側（３’末端側）をライトアームと呼ぶ。
【００２５】
前記アームの長さは、制限されず、適宜設定できる。一般的には、相同領域が、例えば、２〜５ｋｂであり、好ましくは、１０ｋｂ以上である。通常、レフトアームおよびライトアームの少なくとも一方の長さ(相同領域の長さ)が、例えば、５ｋｂ以上であることが好ましく、より好ましくは１０ｋｂ以上である。また、他方の相同領域の長さは、例えば、短くてもよいが、０．５ｋｂ以上であることが好ましく、より好ましくは、前述のアームと同様に１０ｋｂ以上である。
【００２６】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて、構成の一例を図１に示す。同図において、上が第１ベクターであり、下が第２ベクターである。同図において、Ｃｏｌｏｒ１は、第１蛍光タンパク質コード配列であり、Ｃｏｌｏｒ２は、第２蛍光タンパク質コード配列である。同図に示す第１ベクターは、上流側から、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ１およびライトアームがこの順序で配置された構造であり、第２ベクターは、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ２およびライトアームがこの順序で配置された構造である。これらのベクターにおいて、各領域は、機能的に配置されていればよく、その限りにおいて、例えば、各領域の間に他の配列を含んでもよい。
【００２７】
本発明におけるベクターは、例えば、図１に示すような線状化ベクターでもよいし、環状化ベクターであってもよい。前記環状化ベクターの場合、通常、細胞への導入前に、レフトアームとライトアームとの間を切断して、線状化したものを使用する。なお、第１ベクターのプロモーターと第２ベクターのプロモーターとが同じ配列の場合、前記プロモーターは、例えば、レフトアームに含まれ、前記蛍光タンパク質コード配列の上流側がレフトアームに含まれ得る。
【００２８】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含んでもよい。前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、前記第１蛍光タンパク質コード配列または第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に配置される。「バイシストロニック性制御配列」とは、通常、バイシストロニック性を実現する制御配列を意味し、「バイシストロニック性」とは、１つのｍＲＮＡから、２つの機能し得るタンパク質が発現することを意味する。
【００２９】
本発明において、第１ベクターおよび第２ベクターは、それぞれ、プロモーターの下流において、前記蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間にバイシストロニック性制御配列が配置されていることが好ましい。前記蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との位置関係は特に制限されない。例えば、バイシストロニック性制御配列を介して、上流側に前記蛍光タンパク質コード配列、下流側に薬剤耐性遺伝子が機能的に配置されてもよいし、上流側に薬剤耐性遺伝子、下流側に前記蛍光タンパク質コード配列が機能的に配置されてもよい。中でも、上流側から、前記蛍光タンパク質コード配列、バイシストロニック性制御配列および薬剤耐性遺伝子がこの順序で配置されていることが好ましい。
【００３０】
前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、リボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列があげられる。前記ＩＲＥＳ配列としては、特に制限されないが、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ：Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）由来のＩＲＥＳ配列が好ましい。ＩＲＥＳ配列は、例えば、米国特許第４，９３７，１９０号、特表２００２−５１４０８６（ＪＰ２００２−５１４０８６Ａ）号公報、特表２００１−５０００２１（ＪＰ２００１−５０００２１Ａ）号公報等に記載されている。ＩＲＥＳ配列は、例えば、ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列に基づいてＰＣＲやクローニング等により合成してもよいし、ＩＲＥＳ配列を有する市販のベクターから調製することもできる。
【００３１】
また、前述のように、ＩＲＥＳ配列の下流側に薬剤耐性遺伝子が配置されている場合、例えば、前記薬剤耐性遺伝子の下流側（３’末端側）に、さらに、ポリＡ付加シグナルが結合していることが好ましい。
【００３２】
前記薬剤耐性遺伝子としては、制限されず、公知の薬剤耐性マーカーが使用できる。また、第１ベクターおよび第２ベクターが、前述のように、バイシストロニック性制御配列と共に薬剤耐性遺伝子を有する場合、第１ベクターと第２ベクターは、異なる薬剤耐性遺伝子を有することが好ましい。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子等があげられる。
【００３３】
本発明における第１ベクターおよび第２ベクターについて、その他の構成例を、図２に示す。同図において、上が第１ベクターであり、下が第２ベクターである。同図において、Ｃｏｌｏｒ１は、第１蛍光タンパク質コード配列、Ｃｏｌｏｒ２は、第２蛍光タンパク質コード配列、ｄｒｕｇ１ｒは、第１ベクターの第１の薬剤耐性遺伝子、ｄｒｕｇ２ｒは、第２ベクターの第２の薬剤耐性遺伝子を示す。同図に示す第１ベクターは、上流側から、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ１、ＩＲＥＳ、第１薬剤耐性遺伝子およびライトアームがこの順序で配置された構造であり、第２ベクターは、レフトアーム、プロモーター、Ｃｏｌｏｒ２、ＩＲＥＳ、第２薬剤耐性遺伝子およびライトアームがこの順序で配置された構造である。これらのベクターにおいて、各領域は、機能的に配置されていればよく、その限りにおいて、例えば、各領域の間に他の配列を含んでもよい。これらのベクターは、前述のように、例えば、図２に示すような線状化ベクターでもよいし、環状化ベクターであってもよい。なお、前述と同様に、第１ベクターのプロモーターと第２ベクターのプロモーターとが同じ配列の場合、例えば、前記プロモーターは、レフトアームに含まれる。
【００３４】
このような第１ベクターおよび第２ベクターは、例えば、前述のような領域を機能的に結合させて構築することもできるが、例えば、市販のベクターを骨格として作製することもできる。前記骨格となるベクターとしては、制限されないが、例えば、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３、ｐＩＲＥＳｂｌｅｏ３、ｐＩＲＥＳ、ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１等があげられる。前記第１ベクターおよび第２ベクターの構築において、例えば、前述のプロモーター、蛍光タンパク質コード配列、バイシストロニック性制御配列、薬剤耐性遺伝子等は、前記骨格となるベクターに連結してもよいし、前記骨格となるベクターが本来有している領域をそのまま利用してもよい。また、第１ベクターおよび第２ベクターにおいて、前記骨格となるベクター（またはその一部）を、アームとしてもよいし、さらに、別途準備したＤＮＡ断片を前記骨格となるベクターに補充してアームを形成してもよい。
【００３５】
つぎに、本発明の判別方法の一例を、図３および図４を用いて説明する。なお、本発明は、以下の例に限定されるものではない。
【００３６】
（Ａ）第１ベクターの導入
まず、細胞に第１ベクターを導入する（図３（Ａ））。前記第１ベクターは、前述のように、通常、線状化ベクターとして導入に使用する。細胞へのベクターの導入方法は、制限されず、例えば、細胞やベクターの種類に応じて適宜決定でき、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクョン法、リポソームにより導入する方法等があげられる。また、ウイルスをもとに作製したベクターの場合、例えば、ウイルスを介して細胞に導入させてもよい。このようなベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等をもとに作製したベクターがあげられる。また、ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで導入してもよい。
【００３７】
前記細胞は、制限されない。本発明は、例えば、前述のように、標的組換えが起こりにくい細胞に対して、標的組換え効率に優れる系を新たに構築する際、得られた細胞が標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断するのに有用である。このような目的で本発明を実施する場合、前記細胞として、例えば、標的組換えが起こり難い細胞があげられる。具体的には、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＩＭＲ９０、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ２１、Ｖｅｒｏ、ＰＣ１２、ＭＤＣＫ、Ｓ２、Ｓｆ９細胞等があげられる。また、遺伝子解析が求められている重要性の高い細胞について、さらに標的組換え効率を向上させる技術の開発も望まれることから、例えば、Ｎａｌｍ−６細胞、ＨＣＴ１１６、ＤＴ４０、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ＥＳ ｃｅｌｌ）等の細胞も好ましい。なお、本発明は、これには制限されず、例えば、真核細胞があげられ、詳細には、ヒトをはじめとする哺乳類由来の様々な細胞があげられる。より詳細には、造血幹細胞；Ｎａｌｍ−６、ＢＡＬＬ１、ＮＡＬＭ１、Ｒａｊｉ等のｐｒｅ−Ｂ細胞ならびにＢ細胞、Ｔ細胞、白血球、単球・マクロファ−ジ、赤血球、血小板等の血球系細胞、血液細胞；筋原細胞、肝細胞、リンパ球、ニューロン細胞、皮膚上皮、気道上皮、受精卵母細胞、各種腫瘍細胞（例えば、Ｈｅｌａ、ＣＨＯ、ＭＣＦ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２）、神経系細胞等があげられる。また、細胞の培養条件は、使用する細胞に応じて適宜決定できる。
【００３８】
（Ｂ）第１ベクター導入細胞の選択
続いて、前記工程により前記第１ベクターが導入された細胞（以下、「第１ベクター導入細胞」という）を選択する。すなわち、図３（Ｂ）に示すように、前記第１ベクターが前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた細胞を選択する。第１ベクターが組み込まれた細胞は、例えば、図４（Ｂ）に示すように第１蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）を有し、第１蛍光タンパク質を発現する。
【００３９】
この第１ベクターの選択方法は、制限されないが、本発明においては、例えば、第１蛍光タンパク質の蛍光検出により選択できる。蛍光検出の方法は、制限されず、従来公知の方法が使用できる。具体例としては、例えば、蛍光顕微鏡、セルソーティング、ＦＡＣＳｃａｎ等が使用できる。また、検出の際には、例えば、励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックミラー等、前述の各種光学素子を組み合わせて使用することが好ましい。
【００４０】
また、前記第１ベクターが、薬剤耐性遺伝子を有する場合には、前記薬剤耐性を示す細胞を、第１ベクター導入細胞として選択することもできる。このように薬剤耐性によって細胞を選択する場合、前述のように、薬剤耐性遺伝子をバイシストロニック性制御配列の上流または下流に機能的に配置した第１ベクターを使用することが好ましい。このベクターによれば、バイシストロニック性制御遺伝子の性質上、例えば、薬剤耐性を示す細胞は、第１蛍光タンパク質コード遺伝子が導入された細胞と判断できる。
【００４１】
（Ｃ）第２ベクターの導入
つぎに、前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する（図３（Ｃ））。前記第２ベクターは、前述と同様に、線状化ベクターであることが好ましい。また、細胞へのベクターの導入方法は、前述と同様である。
【００４２】
（Ｄ）蛍光タンパク質の検出、および、（Ｅ）組換えの判定
前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の検出を行う。前記（Ｃ）工程により第２ベクターが導入された細胞は、例えば、標的組換え体またはランダム挿入体となる。具体的に説明すると、図３（Ｃ）に示すように、すでにゲノムＤＮＡに組み込まれた第１ベクターと導入された第２ベクターとの間で標的組換え（相同組換え）が生じると、図３（Ｄ１）に示す標的組換え体となる。この細胞では、標的組換えが生じたため、第１ベクター由来の蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）が、第２ベクター由来の蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ２）と置き換わっている。このため、この細胞では、例えば、図４（Ｄ１）に示すように、第２蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）を有し、第２蛍光タンパク質のみを発現する。他方、ランダム挿入が生じると、図３（Ｄ２）に示すように、ゲノムＤＮＡにおいて、第１ベクターとは異なる部位に、第２ベクターが組み込まれる。このため、ランダム挿入体では、例えば、図４（Ｄ２）に示すように、第１蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ１）と第２蛍光タンパク質コード配列（Ｃｏｌｏｒ２）との両方を有し、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質を発現する。したがって、得られた細胞について、第１蛍光タンパク質の検出および第２蛍光タンパク質の検出を行えば、標的組換え体であるか、ランダム挿入体であるかを判別できる。すなわち、第２蛍光タンパク質のみが検出された場合は、例えば、図３（Ｄ１）と判断できることから、標的組換え体であると判定できる。他方、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とが検出された場合は、例えば、図３（Ｄ２）と判断できることから、ランダム挿入体であると判定できる。
【００４３】
また、第１タンパク質のみが検出された場合は、第２ベクターが細胞内に導入されていないと判定できる。このように第２ベクターが導入されていない細胞を除外するためには、例えば、薬剤耐性遺伝子を有する第２ベクターを使用することが好ましい。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、第１ベクターが同様に薬剤耐性遺伝子（第１薬剤耐性遺伝子）を有する場合、前述のように、前記第１薬剤耐性遺伝子とは異なる遺伝子（第２薬剤耐性遺伝子）であることが好ましい。このように第２ベクターの薬剤耐性遺伝子によって細胞を選択すれば、第２ベクターが細胞に導入されていない細胞を除外できる。また、このように薬剤耐性によって細胞を選択する場合は、前記第１ベクターと同様に、薬剤耐性遺伝子をバイシストロニック性制御配列の上流または下流に機能的に配置した第２ベクターを使用することが好ましい。このベクターによれば、バイシストロニック性制御遺伝子の性質上、例えば、薬剤耐性を示す細胞は、標的組換え体かランダム挿入体であるかは別として、少なくとも第２蛍光タンパク質コード遺伝子が導入された細胞と判断できる。
【００４４】
また、本発明の判別方法は、例えば、後述するような標的組換え効率の評価だけでなく、細胞に目的配列を標的組換えにより組み込む際にも利用できる。例えば、第２ベクターにおいて、プロモーターの制御下、ＩＲＥＳの上流および下流に、第２蛍光タンパク質コード配列と目的配列を配置して、前述と同様に組換えを行う。そして、得られた細胞において、第２タンパク質の蛍光のみが検出された細胞を、標的組換えによって目的配列が組み込まれた細胞として判別できる。第２蛍光タンパク質が検出されれば、ＩＲＥＳの性質上、目的配列も標的組換えにより組み込まれていると判断できるからである。
【００４５】
＜標的組換え効率の評価方法＞
本発明は、細胞の標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む。
（ａ） 本発明の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【００４６】
細胞に遺伝子を導入した場合、前述のように、多数のランダム挿入体が混在しており、いずれの細胞が標的組換え体であるか同定することが極めて困難であった。しかしながら、本発明の判別方法によれば、前述のように、簡便に、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判別できる。このため、ベクターの導入により得られる多数の細胞について、標的組換え体の細胞数とランダム挿入体数を計数でき、これによって標的組換え効率を算出（定量化）できる。前記標的組換え効率の表し方は、制限されないが、例えば、標的組換え体の細胞数とランダム挿入体の細胞数との比で表すことが好ましい。具体例としては、例えば、標的組換え体数（Ａ）とランダム挿入体数（Ｂ）との比（Ａ：Ｂ）、全細胞数（Ａ＋Ｂ）における標的細胞数（Ａ）の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））およびその百分率（１００×Ａ／（Ａ＋Ｂ））等があげられる。
【００４７】
＜判別用キット＞
本発明は、標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、前記第１ベクターおよび第２ベクターを含む。本発明の判別用キットを用いれば、前述の本発明の判別方法を実施できる。なお、第１ベクターおよび第２ベクターは、前述の通りである。
【００４８】
＜標的組換え効率評価定用キット＞
本発明は、標的組換え効率を評価するためのキットであり、前記本発明の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む。本発明の評価用キットを用いれば、前述の本発明の標的組換え効率の評価方法を実施できる。
【００４９】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００５０】
＜第１ベクターおよび第２ベクターの構築＞
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の薬剤耐性遺伝子「ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子」を、別の薬剤耐性遺伝子「ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子」のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片で置き換えた。このベクターをｐＩＲＥＳｎｅｏｍｙｃｉｎと呼び、第１ベクター構築用のベクターとした。また、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、第２ベクター構築用のベクターとした。
【００５１】
λファージのゲノムＤＮＡから、ＤＮＡ断片を調製した。具体的には、下記プライマーセット１を用いて、２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、下記プライマーセット２を用いて５．１ｋｂのＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲ増幅により調製した。λファージのゲノムＤＮＡ（４８５０２ｂｐ）において、２．５ｋｂの断片は、１７０１０〜１３１９８番目の領域であり、５．１ｋｂのＤＮＡ断片は、５５２５〜１０６１７番目の領域である。前記２．５ｋｂのＤＮＡ断片をＮｒｕＩおよびＮｏｔＩで切断し、前記ｐＩＲＥＳｎｅｏｍｙｃｉｎおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３のＮｒｕＩ−ＮｏｔＩサイトに、それぞれ挿入した。得られたベクターをＮｏｔＩおよびＮｓｉＩで切断し、これに、前記５．１ｋｂのＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＮｓｉＩで処理して得られた４．８ｋｂの前記ＤＮＡ断片を、同様に連結した。得られたプラスミドを、ｐＩＲＥＳｎｅｏλおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏλと呼ぶ。
（プライマーセット１）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGGTCGCGAGCTGCACAGAAAGCGGGGATTTC−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−ATAAGAAGCGGCCGCCGCTCGCTGAGAATAGCCATCAC−３’
（プライマーセット２）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−ATAAGAAGCGGCCGCCACTAGTGCTCACGGACGCGAAGAACAG−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGCTCGAGTTGGCGCGCCCTCTGGCCATCTGCTCGTCAAATC−３’
【００５２】
他方、生体由来蛍光タンパク質ＡｃＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２の完全コード配列を、それぞれ制限酵素認識部位（５’側にＭｕｎＩサイト、３’側にＥｃｏＲＩサイト）を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ＭｕｎＩ／ＥｃｏＲＩ処理したＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。使用したプライマーセットを以下に示す。なお、各蛍光タンパク質のコード遺伝子の開始コドン近傍は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）とした。そして、このベクターから、ＣＡＧプロモーターおよび前記蛍光タンパク質のコード配列を含むＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切り出し、これを平滑化して、前述のｐＩＲＥＳｎｅｏλおよびｐＩＲＥＳｐｕｒｏλのＮｓｉＩ部位（平滑末端）に挿入した。前記断片をｐＩＲＥＳｎｅｏλに挿入して得られたベクターを、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）、前記断片をｐＩＲＥＳｐｕｒｏλに挿入して得られたベクターを第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）という。図５に、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３に２．５ｋｂのＤＮＡ断片、４．８ｋｂのＤＮＡ断片、ＣＡＧプロモーターおよびＤｓＲｅｄ２コード配列が挿入された、環状の第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）を示す。同図において、ｐｒｏＣＡＧは、ＣＡＧプロモーター、Ｃｏｌｏｒ２は、ＤｓＲｅｄ２コード配列、ｐｕｒｏｒは、ピューロマイシン耐性遺伝子を、それぞれ示す。また、矢印は、後述する線状化の際の切断部位を示す。なお、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）は、図５において、ｐｕｒｏｒがｎｅｏｒ（ネオマイシン耐性遺伝子）であり、Ｃｏｌｏｒ２（ＤｓＲｅｄ２コード配列）がＣｏｌｏｒ１（ＡｃＧＦＰコード配列）となった構造である。
（ＡｃＧＦＰプライマーセット）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGCAATTGTCGCCACCATGGTGAGCAAG−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−GGGGAATTCTACTTGTACAGCTCATCCATGCCGTG−３’
（ＤｓＲｅｄ２プライマーセット）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGCAATTGTCGCCACCATGGACAACACC−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
５’−CCGGAATTCTACTGGGAGCCGGAGTGGC−３’
【００５３】
＜ベクターの導入＞
Ｎａｌｍ−６細胞に、第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）および第２ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒ）を、以下の方法により導入した。なお、第１ベクターおよび第２ベクターは、ＮｏｔＩでの切断により線状化したものを導入に使用した。図６に、ＮｏｔＩでの切断により線状化した第１ベクターおよび第２ベクターの構成の概略を示す。ＮｏｔＩ処理によって、例えば、図６に示すベクターにおいて、λＤＮＡ断片２．５ｋｂとλＤＮＡ断片４．８ｋｂとの間が切断される。そして、蛍光タンパク質コード領域の上流が、レフトアーム、薬剤耐性遺伝子の下流が、ライトアームとなる。前記各ベクターの導入は、遺伝子導入システム（商品名Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）、ａｍａｘａ社製）および前記システム専用の遺伝子導入試薬を用いて行った。図７に、本実施例における、第１ベクターおよび第２ベクターのヒトゲノムＤＮＡに対する組み込みを表す概略図を示す。
【００５４】
まず、指数増殖中のＮａｌｍ−６細胞（約２×１０６個）を用意し、遠心分離によって上澄みを除去した。回収した細胞を、１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＴ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｔ，ａｍａｘａ）に懸濁し、線状化した前記第１ベクター２μｇを混和し、前記キットに付随するキュベットに移した。そして、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃ−０５にて通電し、エレクトロポレーションにより前記ベクターの導入を行った。導入処理後、前記細胞を、３７℃に温めておいたＥＳ培地４ｍｌに添加し、２４時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。２４時間静置後の細胞を、細胞濃度が約５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＥＳ培地で希釈し、この細胞希釈液を９６ウェルプレートにまいた（２００μｌ細胞懸濁液／ウェル、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）。このプレートを、２週間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。２週間後、Ｇ４１８に耐性を示した細胞を選択した。ここで選択される細胞は、図７に示すように、Ｎａｌｍ−６細胞に第１ベクターが導入されることによって（図７（Ａ））、ヒトゲノムＤＮＡに線状化第１ベクターが組み込まれた細胞である（図７（Ｂ））。なお、ヒトゲノムＤＮＡに線状化第１ベクターが組み込まれた細胞を、以下、ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４（第１ベクター導入細胞株）ともいう。
【００５５】
続いて、得られたＧ４１８耐性細胞に、前記第１ベクターと同じ方法で、第２ベクターを導入した。導入後の細胞を、さらに、終濃度０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＥＳ培地において、３７℃で２週間培養した。そして、ピューロマイシンに耐性を示した細胞を選択した（合計６株）。これらのピューロマイシン耐性細胞を、それぞれ、Ｃｌｏｎｅ１〜６とする。ここで選択される細胞は、２種類の組換え体である。一つは、図７（Ｃ）に示すように、ヒトゲノムＤＮＡに組み込まれた前記第１ベクターと第２ベクターとの間で「標的組換え」が生じ、第１ベクターにおけるＣｏｌｏｒ１（ＡｃＧＦＰコード配列）がＣｏｌｏｒ２（ＤｓＲｅｄ２コード配列）に、ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒがＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒに置き換わった組換え体である（図７（Ｄ１））。他方は、図７（Ｄ２）に示すように、ランダム挿入によって、第１ベクターが組み込まれた領域とは別の領域に、第２ベクターが組み込まれた組換え体である。なお、後述するが、Ｃｌｏｎｅ６は、標的組換えが生じている細胞であるため、以下の図においては、便宜上「ＣｌｏｎｅＣ６」と記載する。
【００５６】
蛍光タンパク質の発現を利用した組換えの評価が可能であることを裏付けるため、得られたピューロマイシン耐性細胞について、以下の分析を行った。コントロールとして、ベクターを導入していない野生株Ｎａｌｍ−６細胞、蛍光タンパク質としてＡｃＧＦＰのみを発現する細胞（ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４）、および、蛍光タンパク質としてＤｓＲｅｄ２のみを発現する細胞（以下、「ＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５」という）についても同様に分析を行った。前記ＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４は、前述のとおり、Ｎａｌｍ−６細胞に第１ベクター（ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）のみを導入した細胞である。前記ＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５は、Ｎａｌｍ−６細胞にベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）のみを導入した細胞である。前記ベクター（ＤｓＲｅｄ２−ＩＲＥＳ−ｎｅｏｒ）は、前述と同様にしてＤｓＲｅｄ２の完全コード配列をサブクローニングしたｐＣＡＧＧＳから、ＣＡＧプロモーターおよびＤｓＲｅｄ２コード配列を含むＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、平滑化して、前記ｐＩＲＥＳｎｅｏλに挿入することにより作製した。
【００５７】
（ＰＣＲによる標的組換えの確認）
各細胞から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡｃＧＦＰコード配列およびＤｓＲｅｄ２コード配列に特異的なプライマーセットをそれぞれ用いて、ＰＣＲを行った。前記プライマーセットは、前記ベクター構築で使用したものと同じである。そして、各細胞のＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅断片の検出を行った。なお、増幅反応のコントロールとして、β−グロブリンの増幅を確認した。これらの結果を図８に示す。同図は、各細胞のゲノムにおけるＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【００５８】
Ｃｌｏｎｅ１〜５は、それぞれ、同図に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列およびＤｓＲｅｄ２コード配列の増幅物が両方検出された。これは、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、ランダム挿入が生じ、第１ベクターによりＡｃＧＦＰコード配列が組み込まれ、且つ、異なる部位に、第２ベクターによりＤｓＲｅｄ２コード配列が組み込まれたことを意味する。他方、ＣｌｏｎｅＣ６は、同図に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列の増幅物は検出されず、コントロールＤｓＲｅｄ２ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ５と同様に、ＤｓＲｅｄ２コード配列のみが検出された。このことから、ＣｌｏｎｅＣ６は、初めに組み込まれた第１ベクターのＡｃＧＦＰコード配列が、第２ベクターのＤｓＲｅｄ２コード配列と置き換わっている、つまり標的組換えが生じていることがわかる。
【００５９】
（サザンブロットによる標的組換えの確認）
各細胞から単離したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動した。そして、ゲル内で分離されたＤＮＡ断片をナイロンメンブランに写し、ＡｃＧＦＰコード配列またはＤｓＲｅｄ２コード配列に対する下記プローブとのハイブリダイズを行った。これらのオートラジオグラフィーの結果を、図９に示す。同図は、各細胞のゲノムＤＮＡとプローブとのサザンハイブリダイゼーションの結果を示すオートラジオグラフィーであり、（Ａ）が、ＡｃＧＦＰコード配列を検出した結果であり、（Ｂ）が、ＤｓＲｅｄ２コード配列を検出した結果である。
【００６０】
ＡｃＧＦＰ用プローブは、ベクターｐＡｃＧＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理した、全長ＡｃＧＦＰの精製ＤＮＡ断片を使用した。また、ＤｓＲｅｄ２用プローブは、ベクターＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理した、全長ＤｓＲｅｄ２の精製ＤＮＡ断片を使用した。
【００６１】
Ｃｌｏｎｅ１〜５は、同図（Ａ）に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列が検出され、且つ、同図（Ｂ）に示すように、ＤｓＲｅｄ２コード配列が検出された。これは、Ｃｌｏｎｅ１〜５について、ランダム挿入が生じ、第１ベクターによりＡｃＧＦＰコード配列が組み込まれ、且つ、第２ベクターによりＤｓＲｅｄ２コード配列が組み込まれたことを意味する。また、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、同図（Ａ）におけるＡｃＧＦＰコード配列のバンドと、同図（Ｂ）におけるＤｓＲｅｄ２コード配列のバンドが、全く異なることからも、ＤｓＲｅｄ２コード配列は、ＡｃＧＦＰコード配列とは、全く別の部位に組み込まれていることがわかる。他方、ＣｌｏｎｅＣ６は、同図（Ａ）に示すように、ＡｃＧＦＰコード配列は検出されず、同図（Ｂ）に示すように、ＤｓＲｅｄ２コード配列のみが検出された。さらに、同図（Ａ）のＣｌｏｎｅ１〜５におけるＡｃＧＦＰコード配列のバンドと、同図（Ｂ）のＣｌｏｎｅＣ６におけるＤｓＲｅｄ２コード配列のバンドが同じであった。このことから、ＣｌｏｎｅＣ６は、初めに組み込まれた第１ベクターのＡｃＧＦＰコード配列が、第２ベクターのＤｓＲｅｄ２コード配列と置き換わっている、つまり標的組換えが生じていることがわかる。
【００６２】
（ＦＡＣＳｃａｎによる標的組換えの確認）
各細胞について、ＡｃＧＦＰの蛍光強度とＤｓＲｅｄ２の蛍光強度に従って、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を行った。フローサイトメーターとしては、商品名ＦＡＣＳｃａｎ(ベクトン・ディッキンソン社製)を使用し、ＡｃＧＦＰは、励起光波長４８８ｎｍ、検出波長５３０ｎｍ近傍（ＦＬ１）とし、ＤｓＲｅｄ２は、励起光波長４８８ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ近傍（ＦＬ２）とした。この結果を図１０に示す。同図において、各グラフの横軸は、ＧＦＰの蛍光強度を示し、縦軸は、ＤｓＲｅｄ２の蛍光強度を示す。同図に示すように、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、全て、緑の蛍光と赤の蛍光を示す領域に分布しているのに対し、ＣｌｏｎｅＣ６は、赤の蛍光を示す領域に略１００％が分布していた。つまり、Ｃｌｏｎｅ６は、ＦＡＣＳｃａｎの結果からも、標的組換えによりＤｓＲｅｄ２のみを発現していることがわかる。また、この結果は、標的組換え効率の測定に、ＦＡＣＳｃａｎによる解析が効果的であることも示唆している。
【００６３】
（標的組換えの蛍光顕微鏡解析）
以上のように、ピューロマイシン耐性細胞６株のうち、ＣｌｏｎｅＣ６のみがＤｓＲｅｄ２を発現し、Ｃｌｏｎｅ１〜５は、ＤｓＲｅｄ２とＡｃＧＦＰの両方を発現していることから、Ｃｌｏｎｅ６は標的組換えが生じ、Ｃｌｏｎｅ１〜５はランダム挿入が生じていることがわかった。つまり、蛍光タンパク質の検出によって、ランダム挿入体と標的組換え体を判断できることがわかった。そこで、実際に、得られたピューロマイシン耐性６株における組換えを視覚的に判断するため、蛍光顕微鏡観察を行った（商品名Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ社製）。蛍光顕微鏡観察の条件は、ＡｃＧＦＰについて、励起光波長４８５ｎｍ、検出波長５１５−５６５ｎｍ（蛍光フィルタＦｉｌｔｅｒ ｓｅｔ１７）とし、ＤｓＲｅｄ２について、励起光波長５５０ｎｍ、検出波長５７０−６４０ｎｍ（蛍光フィルタ４３−ＨＥ）とした。観察は、標的組換えが生じたＣｌｏｎｅＣ６、ランダム挿入が生じたＣｌｏｎｅ５、コントロールとして、野生株Ｎａｌｍ−６細胞およびＧＦＰ ｎｅｏ Ｃｌｏｎｅ４（第１ベクター導入細胞株）について行った。これらの結果を、図１１に示す。同図において、（Ａ）は、各細胞の顕微鏡写真の画像データであり、（Ｂ）は、ＡｃＧＦＰの検出波長での蛍光顕微鏡写真の画像データ、（Ｃ）は、ＤｓＲｅｄ２の検出波長での蛍光顕微鏡写真の画像データであり、（Ｄ）は、前記（Ｂ）および（Ｃ）を重ね合わせた画像データである。同図に示すように、標的組換えが生じたＣｌｏｎｅＣ６では、ＡｃＧＦＰは検出されず、赤色のＤｓＲｅｄ２のみが検出された。他方、ランダム挿入が生じたＣｌｏｎｅ５は、緑色のＡｃＧＦＰと赤色のＤｓＲｅｄ２がともに検出され、これらを重ね合わせた画像データでは、黄色〜黄緑を示した。このように、蛍光顕微鏡観察において、ＣｌｏｎｅＣ６は、標的組換えによりＤｓＲｅｄ２のみを発現し、他のＣｌｏｎｅは、ランダム挿入によりＤｓＲｅｄ２とＡｃＧＦＰとを発現していた。この結果は、前述のゲノム解析、サザンブロット解析等における蛍光タンパク質遺伝子の組換え結果と同様の結果である。したがって、本実施例の手法によれば、蛍光タンパク質の検出によって標的組換えとランダム挿入を視覚的に区別でき、且つ、それに基づいて組換え効率を評価することが可能であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、最終的に得られる細胞について、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質を検出することによって、標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断できる。特に、本発明においては、前記第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを、それらが発する蛍光によって検出するため、視覚的な検出が可能であり、極めて簡便に標的組換え体であるかランダム挿入体であるかを判断できる。この蛍光検出には、例えば、ＰＣＲやハイブリダイゼーション等のように細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を抽出する必要はなく、例えば、細胞そのものへの励起光照射で足りることからも、極めて簡便かつ迅速な方法であるといえる。また、このように標的組換え体とランダム挿入体の判別を簡便に行えることから、それぞれの細胞数の計数も非常に容易に行うことができる。このため、本発明によれば、極めて簡便に標的組換え効率を評価できる。前述のように、近年、高効率で標的組換えが生じる細胞の検索や技術の確立が行われていることからも、本発明は、これらの研究を、例えば、簡便化且つ促進化できるため、非常に有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明のその他の実施形態における第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施形態において、第１ベクターおよび第２ベクターのゲノムＤＮＡに対する組み込みを示す概略図であり、（Ａ）は、細胞内に第１ベクターが導入された状態を示す図、（Ｂ）は、ゲノムＤＮＡに第１ベクターが挿入された状態を示す図、（Ｃ）は、第１ベクターが組み込まれたゲノムＤＮＡと第２ベクターとの相同組換えを示す図、（Ｄ１）は、第２ベクターが標的組換えによりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図、（Ｄ２）は、第２ベクターがランダム挿入によりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図をそれぞれ示す。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施形態において、図３における細胞が有する蛍光タンパク質を示す概略図であって、（Ｂ）は、図３（Ｂ）の第１ベクター導入細胞、（Ｄ１）は、図３（Ｄ１）の標的組換え体、（Ｄ２）は、図３（Ｄ２）のランダム挿入体をそれぞれ示す。
【図５】図５は、本発明の一実施例における、環状の第２ベクターの構成を示す概略図である。
【図６】図６は、本発明の一実施例における、第１ベクターおよび第２ベクターの構成を示す概略図である。
【図７】図７は、本発明の一実施例において、第１ベクターおよび第２ベクターのヒトゲノムＤＮＡに対する組み込みを示す概略図であり、（Ａ）は、細胞内に第１ベクターが導入された状態を示す図、（Ｂ）は、ゲノムＤＮＡに第１ベクターが挿入された状態を示す図、（Ｃ）は、第１ベクターが組み込まれたゲノムＤＮＡと第２ベクターとの相同組換えを示す図、（Ｄ１）は、第２ベクターが標的組換えによりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図、（Ｄ２）は、第２ベクターがランダム挿入によりゲノムＤＮＡに組み込まれた状態を示す図をそれぞれ示す。
【図８】本発明のその他の実施例における、ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図９】本発明のさらにその他の実施例における、サザンブロットのオートラジオグラフィー写真である。
【図１０】本発明のさらにその他の実施例における、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図１１】本発明のさらにその他の実施例における、蛍光顕微鏡解析の結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む、判別方法。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【請求項２】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１記載の判別方法。
【請求項３】
前記（Ｂ）工程において、第１蛍光タンパク質の蛍光を検出することにより、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する、請求項１または２記載の判別方法。
【請求項４】
第１ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第１蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項５】
前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記薬剤耐性を検出することにより、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する、請求項４記載の判別方法。
【請求項６】
第２ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項７】
バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ(Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列である、請求項４から６のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項８】
前記第１ベクターおよび前記第２ベクターが、それぞれ、異なる薬剤耐性遺伝子を有し、前記薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および、ヒスチジノール耐性遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項９】
前記第１蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであり、
前記第２蛍光タンパク質が、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から８のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項１０】
細胞が、真核細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項１１】
真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１０記載の判別方法。
【請求項１２】
前記ヒト細胞が、Ｎａｌｍ−６細胞である、請求項１１記載の判別方法。
【請求項１３】
標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、標的組換え効率算出方法。
（ａ） 請求項１から１２のいずれか一項に記載の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【請求項１４】
標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、
第１ベクターおよび第２ベクターを含み、
前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターであり、
前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターである、判別用キット。
【請求項１５】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１４記載の判別用キット。
【請求項１６】
第１ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第１蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１４または１５記載の判別用キット。
【請求項１７】
第２ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の判別用キット。
【請求項１８】
バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ(Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列である、請求項１６または１７記載の判別用キット。
【請求項１９】
前記第１ベクターおよび前記第２ベクターが、それぞれ、異なる薬剤耐性遺伝子を有し、前記薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および、ヒスチジノール耐性遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の判別キット。
【請求項２０】
前記第１蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであり、
前記第２蛍光タンパク質が、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の判別キット。
【請求項２１】
標的組換え効率を評価するためのキットであり、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む、標的組換え効率評価用キット。
【請求項１】
標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含む、判別方法。
（Ａ） 細胞に、第１ベクターを導入する工程であり、前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｂ） 前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する工程
（Ｃ） 前記第１ベクターが導入された細胞に、さらに、第２ベクターを導入する工程であり、前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されたベクターである、工程
（Ｄ） 前記（Ｃ）工程により得られた細胞について、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の蛍光を検出する工程
（Ｅ） 第２蛍光タンパク質のみを発現した細胞を標的組換え細胞、第１蛍光タンパク質および第２蛍光タンパク質の両方を発現した細胞をランダム挿入細胞と判定する工程
【請求項２】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１記載の判別方法。
【請求項３】
前記（Ｂ）工程において、第１蛍光タンパク質の蛍光を検出することにより、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する、請求項１または２記載の判別方法。
【請求項４】
第１ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第１蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項５】
前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程により得られた細胞について、前記薬剤耐性を検出することにより、前記第１ベクターが導入された細胞を選択する、請求項４記載の判別方法。
【請求項６】
第２ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項７】
バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ(Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列である、請求項４から６のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項８】
前記第１ベクターおよび前記第２ベクターが、それぞれ、異なる薬剤耐性遺伝子を有し、前記薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および、ヒスチジノール耐性遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項９】
前記第１蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであり、
前記第２蛍光タンパク質が、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質およびオレンジ色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から８のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項１０】
細胞が、真核細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の判別方法。
【請求項１１】
真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１０記載の判別方法。
【請求項１２】
前記ヒト細胞が、Ｎａｌｍ−６細胞である、請求項１１記載の判別方法。
【請求項１３】
標的組換え効率を評価する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、標的組換え効率算出方法。
（ａ） 請求項１から１２のいずれか一項に記載の判別方法により、前記第２ベクターを導入した複数の細胞について、標的組換え細胞であるかランダム挿入細胞であるかの判別を行う工程
（ｂ） 標的組換え細胞の細胞数とランダム挿入細胞の細胞数とを計数して、標的組換え効率を算出する工程
【請求項１４】
標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットであり、
第１ベクターおよび第２ベクターを含み、
前記第１ベクターが、プロモーター、第１蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第１蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターであり、
前記第２ベクターが、プロモーター、前記第１蛍光タンパク質とは異なる第２蛍光タンパク質のコード配列、および、２つのアームを含み、前記２つのアームの間に、前記プロモーターおよび前記第２蛍光タンパク質コード配列が配置されているベクターである、判別用キット。
【請求項１５】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１４記載の判別用キット。
【請求項１６】
第１ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第１蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１４または１５記載の判別用キット。
【請求項１７】
第２ベクターが、さらに、薬剤耐性遺伝子およびバイシストロニック性制御配列を含み、前記第２蛍光タンパク質コード配列と前記薬剤耐性遺伝子との間に、前記バイシストロニック性制御配列が配置されている、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の判別用キット。
【請求項１８】
バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ(Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列である、請求項１６または１７記載の判別用キット。
【請求項１９】
前記第１ベクターおよび前記第２ベクターが、それぞれ、異なる薬剤耐性遺伝子を有し、前記薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および、ヒスチジノール耐性遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の判別キット。
【請求項２０】
前記第１蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであり、
前記第２蛍光タンパク質が、前記第１蛍光タンパク質とは異なる色彩であり且つ青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の判別キット。
【請求項２１】
標的組換え効率を評価するためのキットであり、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の標的組換え細胞とランダム挿入細胞とを判別するためのキットを含む、標的組換え効率評価用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２７１８６５（Ｐ２００８−２７１８６５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１９７９１（Ｐ２００７−１１９７９１）
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
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