標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法
【課題】１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む少なくとも１種の核酸を、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的に正確に測定できる新規方法を提供すること。
【解決手段】（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素と、（Ｇ）非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーとを含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【解決手段】（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素と、（Ｇ）非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーとを含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の核酸を測定する方法、詳しくは、蛍光色素等の物質で標識されたヌクレオチドを用いて、未知核酸及び／又は既知核酸（標的核酸）の少なくとも１種の核酸を測定することができる核酸の測定方法に関する。又、複数の核酸の場合は同時に測定できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸プローブを用いて標的核酸を測定する方法は数多く知られている。例えば、
（１）FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献１及び２参照）。
（２）蛍光色素が特定の核酸塩基と相互作用して蛍光発光量を減少させる特性を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献３参照）等で代表される方法等、数多くの例を挙げることができる。これらの方法は、均一系で、蛍光色素等で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることで及び／又は標的核酸を増幅させることで、核酸プローブに標識された蛍光色素等の光学的キャラクター（蛍光強度）の変化若しくは変化量を測定するものである。以下、本件明細書全体において当該核酸プローブを「均一溶液系核酸プローブ」と呼ぶ。又は単に「核酸プローブ」という場合がある。
【０００３】
しかしながら、上記の方法において必要な均一溶液系核酸プローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質でオリゴヌクレオチドを標識する必要がある。又、当該プローブの設計法は、標準化されていない。このことが、時間と費用の浪費に繋がっていた。又、測定感度が改善されてきてはいるが、更なる改善が要望されていた。又、自然界の１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む複数の核酸を同時に、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的、正確に測定できるものではない。
【０００４】
【非特許文献１】Morrison et al.,Anal. Biochem.,vol.183,231-244、1989
【非特許文献２】Xiangnin Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, 10756-10761, 1997
【非特許文献３】KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む少なくとも１種の核酸を、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的に正確に測定できる新規方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、核酸の合成を行う過程で、蛍光標識ヌクレオチド或はクエンチャー標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、標識された蛍光色素の蛍光キャラクターが、取り込ませる前に較べて、著しく変化することを知見した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明は、
１）（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｂ）（ａ）蛍光色素と、（ｂ）クエンチャー物質及び（ｃ）蛍光色素若しくはクエンチャー物質を含有する免疫関連物質からなる群から選ばれた少なくとも１種の標識物質で標識された、少なくとも１種のヌクレオチドモノマーと、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素を含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
【０００８】
上記本発明の方法においては、
２）標識物質が、少なくとも１種のドナー蛍光色素と少なくとも１種のアクセプター蛍光色素との組み合わせであることが好ましい。
３）又、標識物質が、少なくとも１種の蛍光色素と少なくとも１種のクエンチャー物質の組み合わせであることが好ましい。
４）又、核酸重合系が、（Ｄ）標識物質で標識されていない少なくとも１種のヌクレオチドモノマーを含むことが好ましい。
【０００９】
５）又、核酸重合系が、更に、（Ｅ）鋳型核酸に特異的に結合する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを含むことが好ましい。
６）上記５）の方法においては、核酸プライマーが、（Ｅ’）前記１）に記載の標識物質で標識されていることが好ましい。
７）又、前記１）の方法では、核酸重合系が、非標識ヌクレオチドを含有することが好ましい。
８）上記７）の方法では、蛍光標識及び／又は非標識ヌクレオチドが、グアニン（ｇ）を含有するか、及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つのグアニン（ｇ）を含むことが好ましい。
９）前記１）の方法では、核酸重合系が、更に、前記１）に記載のＢ成分を含まず、非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーを含有することが好ましい。
【００１０】
１０）上記９）の方法では、非標識ヌクレオチドがグアニン（ｇ）塩基を含むことが好ましい。
１１）前記１）、７）及び９）の方法では、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体であることが好ましい。
１２）又、本発明は、鋳型核酸と、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種クエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマーと、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
１３）上記１２）の方法では、核酸重合系が、標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチド或は両者を含む系であることが好ましい。
１４）前記１２）の方法では、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含むことが好ましい。
１５）前記１）、７）、９）及び１２）の方法では、核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有していることが好ましい。
【００１１】
１６）又、本発明は、鋳型核酸と、非標識ジデオキシヌクレオチドモノマーと、標識ヌクレオチドと、非標識核酸プライマーと、核酸に結合することで蛍光を発する少なくとも１種の蛍光色素と、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
１７）前記１２）、１６）の方法においては、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体であることが好ましい。
１８）前記１）、７）、９）、１２）、１６）の方法では、核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる核酸重合反応を行う際に、核酸重合系の蛍光強度変化をモニタリングすることで、ハイブリダイズすることにより蛍光強度の変化する均一溶液系核酸プローブが不要な、簡便・迅速且つ低コストで高感度な核酸の測定方法が実現する。この方法により、自然界の２系内に存在する遺伝子等の全核酸が測定できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明を詳細に説明する前に、特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって使用する用語の定義をする。本発明に用いている用語は、特別な断りがない場合、生物学、分子生物学、遺伝学若しくは遺伝子工学、微生物学若しくは微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１４】
ヌクレオチドモノマーとは、少なくとも１種の核酸合成酵素により核酸重合体に取り込まれ得るヌクレオチドのことをいう。好適にはオリゴヌクレオチドの核酸の構成成分のモノヌクレオチドであるが、本発明においては、モノヌクレオチドの他に、２〜３０量体のオリゴヌクレオチドを含む。好適な例としは、ヌクレオシドモノリン酸体（NMP）、２リン酸体（NDP）及び３リン酸体（NTP）を挙げることができる。より好適な例としては、３リン酸体である。塩基として、核酸構成成分のもの、即ち、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、それらの誘導体、ＲＮＡに含まれる微量成分等を挙げることができる。糖はリボース、デオシキシリボースである。前記のオリゴヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズするものであるならば、エキソヌクレアーゼ活性を有さない核酸合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）とリガーゼを用いることにより、核酸重合系で核酸重合体に取り込まれる。
【００１５】
ヌクレオシドモノリン酸体又は２リン酸体が用いられる理由は、核酸重合系に当該リン酸体を３リン酸体にするキナーゼ（kinase）類、ホスホリラーゼ類若しくはそれらの生成系を含んでいてもよいからである。例えば、精製していない粗鋳型核酸若しくは粗核酸合成酵素には、これらの酵素及び／又は生成系を含む例が多い。核酸重合系にＡＴＰが過分に含まれている場合は、ＡＴＰ以外の３リン酸体が形成し易い。即ち、本発明の核酸重合系とは、これらの酵素及び／又は生成系を含むことができると定義する。尚、標識ヌクレオチド及び免疫関連標識ヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。又、ジデオキシヌクレオチドモノマー及び標識若しくは非標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。
【００１６】
標識ヌクレオチドとは、後記する蛍光色素、クエンチャー物質等の少なくとも一種で標識されたヌクレオチドモノマーのことをいう。そして、蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーを蛍光標識ヌクレオチドと、又、クエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーをクエンチャー標識ヌクレオチドという。更にドナー蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをドナー標識ヌクレオチドと、又、アクセプター蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをアクセプター標識ヌクレオチドという。当該標識ヌクレオチドについては、詳しく後記した。
非標識ヌクレオチドとは、前記ような標識物質で標識されないヌクレオチドモノマーのことをいう。
核酸プライマーとは、鋳型核酸に特異的に結合する１種のプライマーのことをいう。又、核酸プライマーが、蛍光色素、及びクエンチャー物質で標識されたものを、順に、蛍光標識核酸プライマー及びクエンチャー標識核酸プライマーという。又、２者を総称して、標識核酸プライマーという。アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンを順にＡ若しくはａ、Ｇ若しくはｇ、Ｕ若しくはｕ、Ｃ若しくはｃ、Ｔ若しくはｔとした。核酸に結合することで、蛍光を発する蛍光色素を核酸特異的蛍光色素と定義した。
【００１７】
鋳型核酸とは、核酸重合体の鋳型になり得るものである。本発明においては、未知の核酸（「未知核酸」という場合がある。）、既知の核酸（「標的核酸」という場合がある。）、又、それらの混合物を指す。そして、それらはＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。即ち、本発明の鋳型核酸とは、測定を目的とした特定の核酸（標的核酸）とは限らず、不特定の核酸をも含む。勿論、遺伝子等を含む。それらの核酸が混在していもよい。又、濃度又は大きさの大小も問わない。即ち、１つの系内に存在する特定及び不特定の核酸をも意味する。即ち、鋳型核酸とは、本発明方法により重合及び／又は増幅されて検出若しくは測定できる核酸のこという。
【００１８】
核酸合成酵素とは、前記の鋳型核酸を鋳型として前記の非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドを重合して、核酸重合体を合成する能力を有するものであればどのようなものでもよい。代表的な例として、ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類(reverse transcriptase)、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系、及びそれらの遺伝子工学的に改変された改変蛋白質を有する酵素類を挙げることができる。ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類及び逆転写酵素類は、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系を含んでいる酵素類は、本発明においては、好適に利用され得る。本発明においては、これらのものが、単独若しくは併用で用いられる。
【００１９】
勿論、酵素は、これら酵素の活性を十分に発揮させる各種因子を含んでいても、いなくともよい。ＤＮＡポリメラーゼの場合は、エキソヌクレアーゼ活性を有していても、有さなくてもよい。精製されたもの若しくはされない粗酵素の状態のどちらでもよい。又、酵素の起源（微生物、動物、植物）については特に限定されない。好適には耐熱性を有するものがよい。好適な具体例として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-) DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold polymerase、T7 Sequenase DNA Polymerase等を挙げることができる。
【００２０】
蛍光色素等で標識された核酸重合体又は核酸プライマーと鋳型核酸又は核酸重合体等の対応核酸とのハイブリダイゼーションによる複合体のことをハイブリッド（又はハイブリット）複合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・核酸重合体複合体という。
【００２１】
本発明において「核酸を測定する」、或いは「核酸濃度を測定する」なる用語は、標的核酸の濃度を定量することは勿論のこと、定量的検出をすること、定性的検出をすること、核酸重合系の蛍光強度を単に測定するか若しくは単にモニタリングすること、単なる検出をすること、又、核酸を分析若しくは解析すること、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析すること等を意味するものとする。又、このようにして得られたデーターを公知の蔵田らの方法（EP特許公開公報、EP1 046 717 A9号）で解析して、１つの系内に存在している濃度（コピー数等）を求める操作等も含めるものとする。又、公知の方法（基礎生化学実験法、第４巻（核酸・遺伝子実験）、日本生化学会編、東京化学同人社）等により塩基配列を決める操作等も含めるものとする。
【００２２】
又、核酸の重合反応とは、単なる重合（合成、又は伸長反応）反応だけでなく、核酸の増幅反応、例えば、ＰＣＲ方法、リアルタイム定量的ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法、それらの方法に伴う、ハイブリダイゼーション反応、伸長、変性等を含める。そして、重合反応の具体的例として以下の例を挙げることができる。
（１）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＤＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（２）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＲＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＤＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応。
【００２３】
（３）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素で、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（４）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体及びデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応、即ち、ＤＮＡ合成反応を介する反応。
【００２４】
（５）上記の反応系にリガーゼを併用する反応系。
（６）上記の反応系に各種のキナーゼ類及び／又はヌクレオチド３リン体生成系を併用する反応系。
上記において、好ましいものは（１）〜（４）で、より好ましいものは（１）〜（３）で、特に好ましいものが、（１）及び（２）である。
【００２５】
「光学的キャラクター」なる用語は、ヌクレオチドを標識する蛍光色素、クエンチャー物質等の各種の吸収スペクトル、若しくは蛍光発光スペクトル、及びそれらの吸収強度、偏光、蛍光発光、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光異方性等の光学的特性等のこという（「蛍光強度」で総称する。）。又、標識ヌクレオチド等に標識されている少なくとも１つの蛍光色素等について少なくとも１種以上の測定波長で測定された測定値を総合的に評価して得た性質のこともいう。例えば、核酸の変性反応の蛍光強度曲線等もその１つである。
【００２６】
本発明において、「蛍光強度の変化若しくは変化量から」なる用語は、本発明の核酸重合体に基づく蛍光強度の変化だけでなく、当該核酸重合体に、蛍光色素及び／又はクエンチャーで標識された均一溶液系核酸プローブをハイブリダイズさせたときの、そのハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の変化若しくは変化量をも含めるものとする。
【００２７】
又、核酸重合系は、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを、標識又は非標識ヌクレオチドと共に含むこともできる。この場合の核酸の重合は、当該ジデオキシヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点でストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより、標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても前記標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００２８】
蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド及び核酸特異的蛍光色素について詳しく記載する。本発明でいう蛍光色素（「蛍光物質」という場合もある。）とは、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられている蛍光色素の類である。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate)(FITC)若しくはその誘導体等｝、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joe、EDANS、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体｛例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）（TMRITC）、ｘ−ローダミン（x-rhodamine）｝、テキサスレッド（Texas red）、ボデピー（BODIPY）FL｛ボデピー（BODIPY）は商標名、FLは商品名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国；以下同様｝、ボデピー（BODIPY）FL/C3、ボデピー（BODIPY）FL/C6、ボデピー（BODIPY）5-FAM、ボデピー（BODIPY）TMR、又はその誘導体｛例えば、ボデピー（BODIPY）TR、ボデピー（BODIPY）R6G、ボデピー（BODIPY）５６４｝、ボデピー（BODIPY）５８１等を挙げることができる。
【００２９】
上記の中でも、FITC、EDANS、テキサスレッド、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を好適なものとして挙げることができる。
【００３０】
クエンチャー物質とは、前記蛍光色素に作用して、その発光を抑制若しくは消光する物質である。例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）、Ferrocene又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を挙げることができる。
【００３１】
本発明の蛍光標識ヌクレオチドとは、少なくとも１種の蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーである。その標識は５’側の糖部位及び／又はそのリン酸部位、塩基部位、３’側の糖部位及び／又はリン酸部位のどちらでもよい。そして、蛍光色素とは前記に例示されるような色素で、ドナー色素となり得る色素、アクセプター色素となり得る色素の双方を意味するものとする。又、同様に、クエンチャー標識ヌクレオチドとは前記に例示されるようなクエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーである。尚、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドの双方を総称して、「標識ヌクレオチド」という場合がある。蛍光標識ジデオキシヌクレオチド及びクエンチャー標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様である。この場合は、糖の３’位にＯＨ基がないので、核酸重合に当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で、核酸重合反応がストップする。
【００３２】
標識ヌクレオチドにおいて糖の３’ＯＨ基に標識されている場合は、核酸の重合は、当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で重合がストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００３３】
ヌクレオチドモノマーに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる。標識部位は、５’リン酸部のＯＨ基、塩基のＯＨ基、アミノ基である。アミノ基に標識する場合、キット試薬、例えば、Uni-link aminomodifier(CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kit)F-6082、F-6083、F-6084、F-10220（いずれもモルキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該ヌクレオチドモノマーに前記標識物質分子を結合させることができる。
【００３４】
ＯＨ基に標識する場合、5'Amino-Modifier C6キット（Glen Research社、米国）等を用いる。例えば、塩基のＯＨ基に前記標識物質分子を結合させる場合は、先ず、常法に従ってＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する前記標識物質又はそれらの誘導体を結合させることにより標識ヌクレオチドモノマーを合成できる。アミノ基に標識する場合も同様である。リボース及びデオキシリボースの３’位のＯＨ基、リボースの２’位のＯＨ基、又、５’リン酸部位のＯＨ基を前記と同様にして標識することができる。このようにして合成された前記標識物質で標識された各種のヌクレオチドモノマーは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して、本発明で用いる標識ヌクレオチドとすることができる。勿論、委託合成を行って入手してもよい。
【００３５】
本発明で用いる核酸プライマーとは、核酸重合体の前駆体、即ち、プレカーサー(precursor)と成り得るものであり、オリゴヌクレオチドからなるものである。デオキシリボース体、リボース体のどちらでもよい。そして鎖長は公知の核酸合成に利用できるものでよく、特に限定されないが、例示するならば、２〜５０塩基、好適には、３〜４０塩基、より好適には５〜３０塩基である。鋳型核酸に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するもの、又、単に共通の塩基配列若しくはコンセンサス配列だけを有するもののどちらも用いることができる。前者の場合は、特定の鋳型核酸を鋳型とする核酸重合体が得られる。後者の場合は不特定のものが得られる。
【００３６】
本発明の前記プライマーは、前記の蛍光色素、クエンチャー物質で標識されていても、いなくとも用いることができる。標識はこれらの標識物質の少なくとも１種で為されていればよい。そして、好ましい核酸プライマーは５’末端及び／又は鎖中の塩基が標識され、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されていないものである。この場合は得られる核酸重合体はプライマーを標識した標識物質で標識されたものになる。勿論、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されたものも用いることができる。この場合は単に核酸プローブとして利用される。
【００３７】
本発明の核酸プライマーのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である。
【００３８】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、前記の標識ヌクレオチドモノマーの場合と同様にすればよい。この場合、オリゴヌクレオチドの５’末端塩基、３’末端塩基、鎖中の塩基、５’末端リン酸基、３’末端のリボース、デオキシリボースが標識対象になる。当該オリゴヌクレオチドの合成、当該標識核酸プライマーの合成は、委託合成を行うのが最も簡便な方法である。
【００３９】
本発明において、核酸特異的蛍光色素とは、核酸に結合することで蛍光を発する物質のことである。結合する核酸種は、標識又は非標識の核酸プライマー・鋳型核酸複合体、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの２本鎖、２本鎖ＲＮＡ等の核酸であればよく、特に限定されない。核酸特異的蛍光色素としての１例を挙げれば、エチジュウムブロミド、Sybr green 1、Sybr green 2、YOYO、TOTO、YO-PRO-1等のインターカレター類を挙げることができる。しかしながら、本発明においては核酸に結合することで蛍光を発する物質であれば、全ての本発明の方法に適用可能である。
【００４０】
本発明は次の手順からなる核酸の測定方法である。
１）下記｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つの核酸重合系で核酸重合反応（単独）、又は核酸重合反応及び核酸増幅反応（双方の反応）を開始する。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む核酸重合系。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む核酸重合系。
【００４１】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む核酸重合系。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１項において核酸特異的蛍光色素を含む核酸重合系。
【００４２】
２）前記の反応過程で、反応産物である核酸重合体に標識ヌクレオチド及び／又は核酸特異的蛍光色素が取り込まれるので、核酸重合系の蛍光強度が変化する。その変化若しくは変化量を測定する。核酸プローブを存在させた場合は、プローブと核酸重合体とが、ハイブリダイズし、核酸重合反応系の蛍光強度が独特な変化をする。
３）必要に応じて、前記反応物を電気泳動、ＨＰＬＣで分析する。
尚、上記の核酸重合系において、特に、核酸プライマーを含有する（６）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＤＮＡの場合が好適である。又、（１）及び（２）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＲＮＡの場合が好適である。又、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを含む系は、後記する多型（ＳＮＰを含む。）又は変異の測定、分析若しくは解析に用いるのが好適である。
【００４３】
本発明において、「少なくとも１種の核酸プライマーを存在させるか存在させずして」の意味は、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料、粗核酸合成酵素類には、鋳型核酸にハイブリダイズして核酸重合体の前駆体になり得るオリゴヌクレオチドが存在する例が多いからである。又、粗鋳型核酸、粗核酸合成酵素類の中に、当該前駆体を合成する酵素類が含まれている例が多い。
又、ＲＮＡ系の核酸重合反応は前記の核酸プライマーが存在させなくとも進む場合がある。
【００４４】
又、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば、粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料中に、核酸合成系が含まれている場合（例えば、各種生物の細胞抽出液）は、核酸合成酵素を添加しなくとも、核酸重合反応がおこる。この場合は、少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、及び核酸特異的蛍光色素からなる群から選ばれた少なくとも１種のもの、又は、核酸プライマーを反応系に存在させて、反応を開始すればよい。
【００４５】
上記の反応は、公知の反応条件で行ってよいのであるが、例示するならば、温度１０℃〜核酸変性温度未満、具体的には、核酸合成酵素の種類に依存する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、温度１０℃〜核酸変性温度未満、好適には、３０〜９０℃、より好適には３０〜８０℃である。ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合は、３０〜６０℃、逆転写酵素を使う場合は、３０〜７０℃である。反応時間は核酸重合系の蛍光強度を時間の関数として、モニタリニグした場合、平衡に達するまでである。例えば、１０秒〜１０時間、好適には１０秒〜２時間、より好適には１０秒〜１時間である。
【００４６】
上記の蛍光強度の変化は、次の現象からなる群の少なくとも１種の現象によって引き起こされるものと推定されている。そして複雑にかみ合っているものである。
（１）核酸特異的蛍光色素と蛍光色素間の相互作用（FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象）。
（２）蛍光色素間の相互作用（FRET現象）。
（３）クエンチャー物質と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）（前記（２）と同じ）。
（４）グアニン塩基と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）。
尚、本発明でいう相互作用とは、一方の励起エネルギーが他方へ移動する反応である。又、”蛍光消光現象”を単に”蛍光消光”と略称する場合がある。
【００４７】
以下、蛍光強度の変化若しくは変化量を測定する好ましい実際的方法は、リアルタイムで核酸重合系の蛍光強度を測定し、測定値を求める方法である。この場合、少なくとも１種の入射光若しくは励起光を出し、且つ少なくとも１種のホトマル等の受光面をもつ、即ち、マルチチャンネルを有する市販装置を使用するのが望ましい。例えば、スマートサイクラー（タカラバイオ株式会社）、ABI PRISMTM 7700Sequence Detection System(SDS 7700)(PE Applied Biosystems)、LightCyclerTM System(Roche Diagnostics,Mannheim Germany)等を使用すればよい。
【００４８】
実際の測定値を求める場合は、以下の少なくとも何れか１つを実施する。
（１）核酸重合反応の前後の核酸重合系の測定。
（２）核酸合成を行なわせない系（例えば、鋳型核酸又は核酸合成酵素を添加しない系）を対照としての核酸重合系の測定。
（３）核酸合成が平衡に達した系の核酸重合系の蛍光強度を先ず測定し、次いで、核酸重合系の核酸変性処理（例えば、９０〜９８℃での処理）後、測定する。
【００４９】
前記の方法により得られた測定値を、後記するデータ解析方法で処理（解析）することにより、自然界の１つの系内に存在する鋳型核酸（未知核酸、標的核酸）種、及びそれらの核酸が重合若しくは増幅される前のコピー数等の濃度を知ることができる。そしてよりよいデータになる。
【００５０】
以下に本発明の特徴を図面を参照して説明する。
１）本発明方法Ａ（図１参照）
（１）少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませ、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド間の標識された蛍光色素（Ａ）と標識された蛍光色素（Ｂ）間の相互作用に由来する核酸重合系の蛍光キャラクターの変化を測定するか、又はその変化を時間の関数としてモニタリングする（以下、単にモニタリングするという。）ことから、鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項１〜３の発明に相当する。
【００５１】
（２）前記（１）において、核酸プライマーを含有する核酸重合系で、核酸重合反応を行う方法である。この場合は、核酸プライマーが核酸重合体の前駆体（プライマー）として利用される。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項５の発明に相当する。
【００５２】
前記（１）及び（２）のように、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドに標識された蛍光色素（Ａ、Ｂ）間の距離が著しく接近し、溶液中に分散した状態では発生しなかった蛍光色素間の相互作用が発生する（図１参照）。蛍光色素間の相互作用に由来する蛍光強度の変化若しくは変化量を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。
【００５３】
この場合、相互作用し合う蛍光色素の内、一方は、FRET現象の励起エネルギーを与える色素でドナー色素（Ａ）という。そして他方はエネルギーを受けて蛍光発光する色素でアクセプター（Ｂ）という。
【００５４】
又、アクセプター色素は一般にFRET現象において、ドナー色素との対において、アクセプター色素となり得る色素、即ち、ドナー色素からエネルギー転移を受け得る（言葉を換えるとドナー色素に対してクエンチング（消光作用）作用をする）色素であればどのようなものでもよい。そして、ドナー色素は、アクセプター色素に励起エネルギーを転移できるものであれば、どのようなものでもよい。前記色素の中から該当するものを適当に選択することができる。
【００５５】
例えば、好適なドナー色素として、FITC、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を、より好適なものとして、FITC、BODIPY FL、BODIPY 493/503、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を挙げることができる。
【００５６】
好適なアクセプター色素は、対を形成するドナー色素の種類に依存する。例示するならば、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等をドナー色素とするならば、rhodamine X、BODIPY 581/591等をアクセプター色素とすることができる。本方法は、標識ヌクレオチドの蛍光色素、即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。ドナー色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の減少、アクセプター色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の増加を測定することになる。
【００５７】
２）本発明方法Ｂ（図２参照）
本発明の核酸重合系が、核酸特異的蛍光色素を含有する例である。そして、核酸重合系が前記核酸重合系（８）の１例である。核酸特異的蛍光色素（Ｃ）は、核酸重合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体に結合する。そして核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）と核酸特異的蛍光色素（Ｃ）間の相互作用が発生する。この相互作用に由来する蛍光強度の変化を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。この方法は、特許請求の範囲の請求項１５の発明に相当し、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の蛍光強度の減少、又、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の蛍光強度の増加を測定することになる。即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。
【００５８】
前記したように、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の存在下で、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる反応を行う過程で、合成された核酸重合体に核酸特異的蛍光色素（Ｃ）が結合し、この蛍光色素（Ｃ）と、反応過程で取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の距離が著しく接近する（図２参照）。このため前記同様の蛍光色素間の相互作用が発生する。
【００５９】
この場合の蛍光色素（Ｄ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるが、好ましいものはFITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。又、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の前記したものがすべて利用できるが、好ましいものはSybr green 1及びYO-PRO-1である。好ましい蛍光色素の組合わせは、Syber greenとTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、x-Rhodamineの組み合わせ、及びYO-PRO-1とTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。
【００６０】
３）本発明方法Ｃ
非標識核酸プライマーが存在するか、存在せずして、蛍光標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、鋳型核酸、核酸合成酵素を含有してなる核酸重合系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の減少若しくは減少量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして非標識ヌクレオチドの少なくとも一種がグアニン（ｇ）を含むか及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む場合が好適である。即ち、核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの塩基に対応する鋳型核酸の塩基がｇｃ（ＧＣ）対を形成するか、又は、上記蛍光標識ヌクレオチドの塩基から１乃至３塩基離れて（当該対応塩基を１と数える。）、鋳型核酸中にＧが存在するか若しくは核酸重合体中に塩基がＧである非標識ヌクレオチドが存在し、蛍光強度の変化が蛍光色素（Ｅ）とＧとの相互作用によるものである核酸の測定方法。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項７及び８に相当する発明である。
【００６１】
重合反応系の蛍光強度の減少は、次の何れかの場合におこる。
（１）蛍光標識ヌクレオチドの塩基がシトシン（ｃ）又はグアニン（ｇ）である。
（２）少なくとも一種の非標識ヌクレオチドの塩基がグアニン（ｇ）である。
（３）鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む。
【００６２】
前記したように、蛍光標識ヌクレオチド及び／又は非標識ヌクレオチドを用いて核酸重合反応を行う過程で、鋳型核酸中のグアニン（ｇ）、又は合成された核酸重合体中の、グアニン（ｇ）を含む非標識ヌクレオチドのグアニン（ｇ）と取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｅ）との距離が著しく接近する（図３参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった、標識された蛍光色素（Ｅ）の励起エネルギーがグアニン（ｇ）塩基に移動するようになる。
【００６３】
この場合の標識される蛍光色素（Ｅ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるのであるが、好ましいものは、FITC、EDANS、Texas red、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等である。
【００６４】
蛍光標識される好ましいヌクレオチドモノマーはシトシン（以下、ｃと略称する。）を塩基とするヌクレオチドモノマー（cytidylic acid、cytidine 5'-phosphate，cytidine 5'-diphosphate,cytidine 5'-triphosphate、若しくはそれらの重合体若しくはcytidylic acidを含有する重合体）であり、そして標識部位は塩基部（アミノ基）、又はリン酸部（ＯＨ基）、又はリボース部（２’又は３’位のＯＨ基）である。好ましい部位は塩基部、又はリン酸部である。
【００６５】
４）本発明方法Ｄ（図４参照）
本発明方法Ａの（１）又は（２）において、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを使用する例である。即ち、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを核酸重合体に取り込ませると、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）とクエンチャー標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）が接近し、相互作用する（図４参照）ことにより核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び／又は（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項３及び／又は４の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の減少を測定することになる。
【００６６】
本方法で利用できるクエンチャー物質（別名として”蛍光消光物質”ともいう。）は、例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を例示できる。
【００６７】
前記したように、核酸重合系に蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドを存在させて、核酸重合反応を行うと、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとの距離が著しく接近する。その結果として標識された蛍光色素（Ａ）とクエンチャー物質（Ｑ）の間の距離も著しく接近する（図４参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった標識されたクエンチャー物質（Ｑ）と標識された蛍光色素（Ａ）間の相互作用（発光エネルギーの移動現象）が発生するようになる。
【００６８】
５）本発明方法Ｅ（図５及び図６参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用いる例である。鋳型核酸の重合を行う過程で、標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）間の相互作用により蛍光強度が変化する。この変化を測定するか、又はモニタリングすることから鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定する方法である。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項６の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。この場合、蛍光強度の増加、又は減少は、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）と標識核酸プライマーの標識物質の蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）の組合せに依存する。ドナー色素とアクセプター色素の関係の場合は、本発明方法Ａと同様である。クエンチャー物質と蛍光色素の関係の場合は、本発明方法Ｄと同様である。
【００６９】
前記のように、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドを用いて本発明方法Ａの（２）のような核酸重合反応を行うと、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドは核酸重合体に取り込まれる。そして重合体に取り込まれた標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）との距離が著しく接近する（図５、図６参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった当該プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）の間で相互作用が発生する。
【００７０】
本発明で起こり得る物質間相互作用として、（１）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｂ）間の相互作用、（２）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）の間の相互作用、（３）標識核酸プライマーのクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）の間の相互作用の３つのケースが考えられる（図５は（１）のケースを、図６は（３）のケースを図示してある。）。標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系核酸プローブ（後記した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ａと同様である。又、クエンチャー物質は本発明方法Ｄと同様である。
【００７１】
６）本発明方法Ｆ（図７参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用い、標識ヌクレオチドの代わりに非標識ヌクレオチドを用いた（即ち、標識ヌクレオチドを用いない）例である。標識核酸プライマーに標識した蛍光色素（Ａ）と、取り込まれたＧ塩基を有する非標識ヌクレオチドのＧ間の相互作用により核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項９及び１０に相当する発明である。
【００７２】
即ち、非標識ヌクレオチドがＧを含むものであり、合成された核酸重合体中の蛍光標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）で標識された塩基から１乃至３塩基離れて（標識された塩基を１と数える。）、新たに重合された（当該プライマーの鎖中の塩基ではないという意味）核酸重合体中に少なくとも１つのＧが存在する場合に起こる（図７参照）。前項で記述した標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系の核酸プローブとは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本発明方法Ｅと同じく、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ｃと同様である。
【００７３】
７）本発明方法Ｇ（図８参照）
本発明方法Ａ〜Ｆにおいて、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドを用いる代わりに、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種で標識されたヌクレオチドモノマー（免疫関連標識ヌクレオチド）を用いた例である。例示して説明すると、前記のヌクレオチドモノマーに標識された抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている、前記の抗原、抗抗体に対応する抗原又は抗抗体が結合する。その結果、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。又、抗原には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。抗抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。その結果、前記免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。
尚、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種でヌクレオチドを標識するには、前記の従来公知の方法により達成出来る。又、前記と同様に委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した方が好適である。
【００７４】
本方法は、前記の通りであるので、免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、前記の免疫関連標識ヌクレオチドの免疫関連物質に対応する免疫関連物質が１つの対を形成する。そしてこの対は、免疫関連標識ヌクレオチドを標識している免疫関連物質は、ヌクレオチドに標識されていなくとも、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している前記の免疫関連物質と結合し複合体を形成する。それで、この複合体がヌクレオチドを標識している構造になっているとも認識することができる。従って、本発明においては、簡便化のために、この複合体を蛍光色素及びクエンチャー物質と同じものとして扱うことにした。それで、本発明の蛍光色素とは、前記した蛍光色素の他に蛍光色素を含有する前記複合体を含むものと定義する。又、同様にして、本発明のクエンチャー物質とは、前記したクエンチャー物質の他にクエンチャー物質を含有する前記複合体を含むものと定義する。蛍光色素を含有する複合体、即ち免疫関連物質で標識ヌクレオチドを蛍光標識ヌクレオチドの概念の中に入れ、蛍光標識ヌクレオチドと称することにした。クエンチャー物質についても同様にし、クエンチャー物質を含有する免疫関連物質で標識ヌクレオチドをクエンチャー標識ヌクレオチドと称する。又、免疫関連物質で標識した核酸プライマーにおいても前記ヌクレオチドと同様に、蛍光色素を含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーを蛍光標識核酸プライマーと、又、クエンチャーを含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーをクエンチャー標識核酸プライマーと称することにした。
【００７５】
それで、免疫関連標識ヌクレオチド、免疫関連標識核酸プライマーとは、当該ヌクレオチド、当該プライマーは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、当該ヌクレオチド、当該プライマーの免疫関連物質に対応する免疫関連物質を含むものと定義する。具体的には、当該ヌクレオチド及び／又は当該プライマーと、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している当該免疫関連物質を一緒に核酸重合系に存在せしめて、核酸重合系の蛍光強度を測定することになる。
【００７６】
それで、前記の本発明方法Ａ〜Ｆと同様にして、核酸重合体若しくはその鋳型核酸、又は鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定できる。以上より本方法は、後記する方法を含めて本発明の全てに相当し、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。
【００７７】
前記したように、前述の本発明方法Ａ〜Ｆに示した物質間相互作用の内のいずれかが起こるよう、抗原或は抗体或は抗抗体にてヌクレオチドを標識し、核酸重合反応を行う過程で、核酸重合体にそれらで標識されたヌクレオチドを取り込ませる。図８は、本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している図である。公知技術で示した均一溶液系核酸プローブ（後記に示した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。
【００７８】
８）本発明方法Ｈ（図示なし）
本方法は、２つの発明を含む。
ｉ）核酸重合系が前記核酸重合系（３）の１例で、特許請求の範囲の請求項１２〜１５に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（前者を「蛍光標識ジデオキシヌクレオチド」、後者を「クエンチャー標識ジデオキシヌクレオチド」という。両者を総称して「標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして、核酸重合系が、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む系である。又、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む系である。
【００７９】
ii）核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項１６に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識されていない、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（「非標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、標識ヌクレオチド、非標識核酸プライマー、核酸特異的蛍光色素、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。上記のｉ）、ii）の発明において、蛍光色素及びクエンチャー物質の概念は、前記の本発明方法Ｇと同様である。
【００８０】
尚、当該方法は、１塩基伸長反応方法と組合せることにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析又は分析に好適に利用できる。即ち、核酸プライマーの３’末端塩基が鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異部位の塩基に隣接するように設計してなる核酸プライマーと、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か若しくは相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドを用いて、当該発明の核酸重合反応又は核酸増幅反応を行うと、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基の存在若しくは不存在により、核酸重合系の蛍光強度に差が出る。その差により目的が達成できる。具体的には、実施例５及び実施例６に示した。
【００８１】
９）本発明方法Ｉ（図９参照）
各種核酸合成酵素を用いて、固体表面上に固定化された１種以上の核酸プライマーから鋳型核酸の重合を行うことを特徴とする前述の本発明方法Ａ〜Ｇの何れかに記載の方法である。
【００８２】
前記したように、１種以上の核酸プライマーを固体表面上に固定化し、各種核酸合成酵素により鋳型核酸の重合反応を行う。この際、前述の本発明方法Ａ〜Ｈの内、いずれかの物質間の相互作用が発生するように、核酸プライマー、蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、核酸特異的蛍光色素等を用意する。この際に発生する蛍光強度の変化若しくは変化量をモニタリングすることで単に核酸重合体又はその鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる（図９参照：図中では本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している。）。
【００８３】
本方法は、前記したように、１つの鋳型核酸又は当該鋳型核酸と新たに重合合成された核酸重合体との１つの複合体から観察した場合、新たに重合合成された核酸重合体に複数の蛍光色素を含むようになるので、測定感度が、単数種の蛍光色素の蛍光強度変化に基づく均一溶液系核酸プローブを使用する方法より更に改善される。又、鋳型核酸と非標識若しくは標識核酸プライマー又は新たに重合合成された核酸重合体との複合体に取り込まれた核酸特異的蛍光色素から、標識ヌクレオチドの蛍光色素へのエネルギー移動による蛍光強度の変化に基づく測定方式であるので、測定感度が格段に改善される。しかも、標的遺伝子等を含む１種以上の各種核酸を簡便且つ迅速に同時に測定できるという利点を有する。
【００８４】
尚、前記の本発明方法で得られたデータの解析方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をするとより好ましいデータになる。それで、このデータ処理方法も本発明に含まれる。
【００８５】
本発明方法においては、下記（１）〜（７）の公知の均一溶液系核酸プローブ（鋳型核酸に特異的にハイブリダイズし、蛍光色素又はクエンチャー物質で標識されたオリゴヌクレオチド）、及び公知の核酸測定方法を本発明方法、特に標識核酸プライマーに好適に適用することができる。当該プライマーとして利用される場合は前記した通りである。又、核酸増幅方法に記載した単なるプローブとして利用する場合、核酸合成酵素としてエキソヌクレアーゼを欠いたＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼとリガーゼを用いるのが好適である。均一溶液系核酸プローブが鋳型核酸にハイブリダイズしたとき、本発明の核酸重合体に組み込まれる。又、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いた場合、分解されてしまう。分解されたヌクレオチドがカイネース等で３リン酸体にされた後、本発明の核酸重合体に組み込まれてしまう。
【００８６】
（１）Morrisonらのプローブ（Morrison et al.,Anal.Biochem.,183:231-244,1989）で代表されるプローブ。
（２）Mergneyらのプローブ（Mergney et al.,Nucleic acid Res.,22:920-928,1994)で代表されるプローブ。
（３）分子ビーコン（molecular beacon)方法（Tyagi et al.,Nature Biotech.,14:303-308,1996;Schofield et al.,Applied and Environ. Microbiol.,63:1143-1147，１９９７）で代表されるプローブ。
（４）Livakらのプローブ（US patent No.5,538,848）で代表されるプローブ。
【００８７】
（５）KURATAらのプローブ（KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34）で代表されるプローブ。このプローブは、１本鎖のオリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識した均一溶液系核酸プローブであるが、蛍光色素で標識した塩基がＧ又はＣであるか、又は対応核酸の標識塩基に対応する塩基から１乃至３塩基離れて（標識塩基に対応する塩基を１と数える。）Ｇ又はＣが存在する均一溶液系核酸プローブである。
【００８８】
（６）Davisらのプローブ（Davis et al.,Nucleic acids Res.,24:702-706,1996）で代表されるプローブ。
（７）HORNらのプローブ（US Patent Application Publication No.US2001/0009760A1,Pub.Date:Jul.26,2001）で代表されるプローブ。
【００８９】
前記に記載した核酸重合方法が核酸増幅方法である場合について以下に記す。本発明でいう核酸増幅方法とは、インビトロ（in vitro）で核酸を増幅する方法のことをいう。公知、未公知を問わない。例えば、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction）、ＴＡＳ方法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＲＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＵＣＡＮ方法等を全て含めるものとする。
【００９０】
又、このＰＣＲとは、公知の各種のＰＣＲを意味するものである。例えば、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ-primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ、ＰＣＲにより増幅した核酸について、融解曲線の解析若しくは分析する方法等をも含むものとする。
【００９１】
具体的には、前記した核酸重合系、特に、核酸プライマー若しくは核酸プローブを含む系で、ハイブリダイゼーション反応、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして従来公知の条件(KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34)で核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する核酸の測定方法である。そして、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が観察（目視）され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと標準の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、試料中の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を求めることができる。具体的には、実施例４〜１１に記載されている。
【００９２】
前記した均一溶液系核酸プローブを好適に、核酸プライマー（リバース及び／又はフォワードプライマー）として利用できる。この場合、均一溶液系核酸プローブから標識されている蛍光色素及び／又はクエンチャー物質を離脱した非標識の核酸プライマーも好適に利用できる。当該核酸増幅方法で増幅された核酸重合体は少なくとも一種の蛍光色素を含むので、少なくとも一種の測定波長を用いて当該重合体の解離曲線から得られる情報は有用である。
【００９３】
本発明の核酸増幅系は、前記の核酸重合反応のための核酸重合系の｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つである。
【００９４】
本発明方法は、又、以下のデータ処理方法も含む。即ち、上記の核酸増幅方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正すると、好ましいデータになる。又、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をして補正したデータは好適なものになる。このような補正をする演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有する手順を記録した電子記録媒体も本発明である。測定及び／又はデーター解析装置において当該電子記録媒体を装備したもの、又、当該装置を用いた測定も当然本発明の範囲内である。
【００９５】
本発明の核酸の重合反応を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られるデータを解析する方法は具体的には以下の通りである。リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出する装置、ユーザーインターフェース、即ち、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software System）、及びそれらを制御し、データ解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われるのがよい。
【００９６】
尚、ＰＣＲ反応装置は、鋳型核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。又、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフならびにＣＣＤカメラからなっている。更に、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされて使用され、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデータを解析処理するプログラムを記録したものである。
【００９７】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、即ち、ＰＣＲのamplification plotとしてコンピュータのディスプレー上に表示する過程、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number：Ｃｔ）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデータ、プロット値を印字する過程からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の測定対象の核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って、既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の鋳型核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、鋳型核酸のＰＣＲ開始時の初期コピー数を計算できる。
【００９８】
本発明方法を用いる多型(polymorphism)及び／又は変異(mutation)を測定若しくは解析する方法について、以下に記す。即ち、核酸重合方法及び核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（９）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つで、核酸重合反応又は核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的若しくは非経時的に測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法である。好適には、当該方法を配列特異的伸長方法と組合せることがよい。具体的には、実施例７〜実施例１０に示した。
【００９９】
この場合、非標識若しくは標識核酸プライマーを、その３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補しない（相互の塩基が水素結合できる。）よう（他の塩基は相補する。）に作製してなる、少なくとも一種の非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行うのが好適である。当該プライマーを含有する核酸重合系では、当該プライマーを前駆体として、核酸重合若しくは核酸増幅反応が進まない場合は、核酸重合系の蛍光強度の変化が起きない。逆に進む場合は、蛍光強度の変化が起きる。尚、反応温度は、一般的には、当該プライマーのＴＭ値以上変性反応温度（例えば、９５℃）未満であるのが好適である。又、当該プライマーの３’末端から３番目の塩基を、鋳型核酸の塩基に相補しない塩基にし、鋳型核酸と当該プライマーとの間で人工的なミスマッチを形成させることで、非特異的な伸長反応が抑えられる。即ち、より正確な多型の判定が可能になる。この場合の反応温度は、当該プライマーのＴＭ値より５℃程低い温度から変性反応温度未満であることが好適である。尚、本発明において、鋳型核酸の多型若しくは変異の塩基とは相補しない塩基を有する当該プライマーをＡ型プライマーと称した場合に、相補する塩基を有する当該プライマーをＢ型プライマーと称することにする。この測定方法において、Ａ型プライマーとＢ型プライマーを併用することにより確かなデータが得られる。
【０１００】
具体的には、以下の方法で行う。
以下の核酸重合系で核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を行う。尚、詳しくは実施例７及び８に示した。
１）前記した核酸重合若しくは核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つのものである。この場合、好適には、標識又は非標識核酸プライマーとしてＡ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＡ型プライマーを少なくとも１種、及びＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１０１】
尚、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合は、上記（１）と（２）の反応系で、核酸重合反応、又は核酸増幅反応を行い、経時的若しくは非経時的に蛍光強度の変化若しくは変化量を測定して、その測定値を比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）若しくは変異を測定できる。異種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合、上記（３）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。尚、この場合でも、上記（１）と（２）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。
尚、上記のＡ型若しくはＢ型プライマーの替わりに、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か又は相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドの少なくとも一種を用いることでも、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することが達成出来ることは、前記した通りである。
【０１０２】
そして、Ａ型プライマーを少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーを少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、免疫関連標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類である。
【０１０３】
本発明の核酸の測定方法は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。又、複合微生物系、共生微生物系といわれ、色々の種類の微生物が混在するか、若しくは少なくとも１種類の微生物が他の動物、植物由来の細胞と共に混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。又、本発明は各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法、ＴＡＳ方法等に好適に適用できる。
本発明は、特許請求の範囲の請求項１〜１８の発明を開示するが、その他に以下に記載する幾つかの好ましい実施形態を開示する。
【０１０４】
［１］下記の何れか１つの核酸重合系で、核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０５】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０６】
［２］下記の何れか１つの核酸重合系で、ハイブリダイゼーション反応（アニーリング反応）、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０７】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０８】
［３］各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度の変化若しくは変化量が観察され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［４］前記［２］に記載の核酸重合系で、核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定して、その測定値から、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［５］非標識若しくは標識核酸プライマーの３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に対応する非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
【０１０９】
［６］下記の核酸重合系で、核酸重合反応、又は核酸増幅を行い、得られるデータを比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
１）前記した核酸重合系｛（１）〜（８）｝の何れか１つのものが、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補しない塩基を有するもの（Ａ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補する塩基を有するもの（Ｂ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、Ａ型プライマーの少なくとも１種、Ｂ型プライマーの少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１１０】
［７］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項で得られたデータを解析する方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的蛍光色素の、経時的若しくは非経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をすることを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
［８］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項に記載の方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正することを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
【０１１１】
［９］Ａ型プライマーの少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーの少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類。
［１０］核酸合成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-)DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold、Ｔ７ Sequenase DNA Polymeraseである前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［４］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１２】
［１１］核酸増幅方法が、ＰＣＲ方法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法のいずれかの方法である前記［４］に記載の核酸の測定方法。
［１２］ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ法である前記［１１］の核酸の測定方法。
［１３］前記請求項５に記載の標識核酸プライマーの少なくとも１種で標識された核酸プライマーを固体表面上に固定化させて、前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］の何れか１項に記載の方法を実施できるようにしたことを特徴するデバイス（ＤＮＡチップ）類。
［１４］前記のデバイス（ＤＮＡチップ）類を用いて鋳型核酸の核酸重合反応を行う前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１３】
［１５］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］、［４］のいずれか１項に記載の方法で鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体若しくは核酸増幅体を測定するための、温度を変化させながら蛍光測定可能な装置で、且つ前記［７］、［８］に記載のデータ処理若しくは解析方法の過程を、コンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体を組み込んだことを特徴とする測定装置。
［１６］前記請求項１、７、９、１２、前記［２］の何れか１項に記載の方法を用いて、均一溶液系核酸プローブの任意の位置の塩基を蛍光色素で標識する方法。
【実施例】
【０１１４】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。以下の実施例においては、以下のように用語を短略して用いた。
１）「鋳型核酸」を「鋳型」という場合がある。
２）「核酸プライマー」を「プライマー」とした。
３）dNTSs、dATP、dGTP、dTTP、dUTPは現在分子で生物学等で用いられている意味と同じである。
本実施例で用いた、鋳型、標識又は非標識ヌクレオチド及び標識又は非標識プライマーは特別の記載がない限り、委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した。
【０１１５】
本実施例にて使用したプライマー及び塩基配列は以下のものである。尚、塩基配列は右が３’末端で左が５’末端である。
（合成１本鎖ＤＮＡの塩基配列）
プライマー１：CAGACTCGACAGTGTAGACCCG
プライマー２：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
プライマー３：TTGCATGTGTTAGGCCTG
【０１１６】
又、鋳型１〜９は次の塩基配列を有していた。塩基配列は右が３’側で左が５’側である。
鋳型１：
ACACACACACACACTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型２：
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型３：
TTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型４：
TTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型５：
TTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１７】
鋳型６：
TTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型７：
TTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型８：
TTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型９：
TTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１０：
GCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１１：
GCTCCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１８】
実施例１（本発明方法Ｂ（２））
２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間のFRET現象を利用して鋳型核酸を測定する。
【０１１９】
Ａ）各種方法
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した１本鎖ＤＮＡ（鋳型１〜９）及び２２塩基のプライマー（プライマー１）はＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製、米国）で調製した。鋳型１から９はプライマー１と相補的な共通の配列を３´側に有する。又、これらの鋳型は伸長反応の過程で標識されたｄＵＴＰが７つ取り込まれるように設計してある。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す：
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが５個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１２０】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが７個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが８個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１０個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型７とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１２１】
２）重合（増幅）反応条件
ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたサーモコッカス・リトラリス由来のVent(exo-)DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs,Beverly，MA）を用いた。蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTP(650nm/668nm)、LissamineTM-5-dUTP(570nm/588nm)、Texas Red(r)-5-dUTP(593nm/612nm)（カッコ内は最大吸収波長／最大蛍光波長、PerkinElmer米国）を用いた。ＤＮＡポリメラーゼにより取り込まれた標識ヌクレオチドへFRET現象を起こさせるためのドナー色素に、２本鎖核酸に特異的に結合し４９７ｎｍに最大励起波長を持ち、５２０ｎｍ付近で最大の蛍光を発するSYBR(r)Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular probes、米国）を用いた。
【０１２２】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1%Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM dATP ・200nM dGTP
・200nM dCTP ・200nM Cyanine5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U（単位） Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１２３】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）を用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をSYBR(r)Green Iの検出に、Ｆ２（６４０ｎｍ）をLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTPの検出、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCyanine 5-dUTPの検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１２４】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用した。
・モデル１０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１１〜１９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。・モデル２０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル２１〜２９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用した。
・モデル３０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル３１〜３９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。
・モデル４０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１２５】
結果を図１０〜１６に示した。モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化を図１０に、Ｆ３蛍光強度変化を図１１に示す。モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化を図１２に、Ｆ２蛍光強度変化を図１３に示す。モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化を図１４、Ｆ２蛍光強度変化を図１５に示す。モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化を図１６に示す。
【０１２６】
その結果、モデル１〜９ではＦ１の蛍光が最大で約４０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約４倍増加した。酵素非添加のモデル１０の反応ではＦ１は若干蛍光強度が減少したものの、Ｆ３の蛍光強度に変化はみられなかった（図１０、１１）。モデル１１〜１９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル２０のＦ２の蛍光強度は変化しなかった（図１２、１３）。モデル２１〜２９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約８倍増加した。酵素非添加のモデル３０ではＦ２の蛍光強度に変化はなかった（図１４、１５）。SYBR(r)Green Iのみのモデル３１〜３９ではＦ１の蛍光強度が最大で３倍増加した（図１６）。
【０１２７】
このように、２本鎖核酸特異的蛍光色素（今回はSYBR(r)Green I）と蛍光標識ヌクレオチドとの間にエネルギー移動現象が観察され、鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナーとなる２本鎖核酸特異的蛍光色素がアクセプターとなる各蛍光標識ヌクレオチドにエネルギーを供与したことで、ドナーの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプターの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度値の変化はみられなかった。又、蛍光標識ヌクレオチドを入れないSYBR(r)Green Iだけの系では、エネルギー移動は起こらないためにSYBR(r)Green Iの蛍光強度（Ｆ１）のみが増加した。この手法では、エネルギー移動現象におけるドナー側の蛍光強度の減少、又、アクセプター側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。
【０１２８】
実施例２（本発明方法Ａ）
蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用して鋳型核酸を測定する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
実施例１で使用したプライマーならびに鋳型１本鎖ＤＮＡを用いた。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す。
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド１個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド２個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１２９】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド３個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが取り込まれた後、非標識ヌクレオチド３個が取り込まれる。次に、蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれる。この繰り返しである。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド５個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型９とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド６個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１３０】
２）重合（増幅）反応条件
蛍光標識ヌクレオチドには、実施例１と同様の蛍光標識ヌクレオチドとしてCyanine 5-dUTP、LissamineTM-5-dUTP、Texas Red(r)-5-dUTPを用いた。ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドはFITC-dGTP（PerkinElmer、米国）を用いた。
【０１３１】
尚、反応液を以下のように調製した。
・20mM TrisHCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM FITC-dGTP（ドナー色素）
・200nM dCTP ・200nM dATP ・200nM Cyanine 5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP (アクセプター色素） ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１３２】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出はＦ１、Ｆ２、Ｆ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１３３】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜７：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Cyanine 5-dUTPを用いる。
・モデル８：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル９〜１５：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、LissamineTM-5-dUTPを用いる。
【０１３４】
・モデル１６：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにLissamineTM-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１７〜２３：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６。プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Texas Red(r)-5-dUTPを用いる。
・モデル２４：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにRed(r)-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１３５】
結果を図１７〜２２に示した。モデル１〜８のＦ１の蛍光強度変化を図１７に、Ｆ３の蛍光強度変化を図１８に示す。モデル９〜１６のＦ１の蛍光強度変化を図１９に、Ｆ２の蛍光強度変化を図２０に示す。モデル１７〜２４のＦ１の蛍光強度変化を図２１、Ｆ２の蛍光強度変化を図２２に示す。
【０１３６】
その結果、モデル１〜７はＦ１の蛍光強度が最大で約５０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約５倍増加した。酵素非添加のモデル８の反応では蛍光変化はみられなかった（図１７、１８）。モデル９〜１５はＦ１の蛍光強度が最大で６０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル１６の蛍光強度は変化しなかった（図１９、２０）。モデル１７〜２３はＦ１の蛍光強度が最大で５０％以上減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約４．５倍増加した。酵素非添加のモデル２４では変化しなかった（図２１、２２）。
【０１３７】
以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成された蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象によって蛍光強度値の変化から鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナー蛍光色素であるＦＩＴＣ標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプター蛍光色素となるCyanine5,LissamineTM、Texas Red(r)標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度の変化はみられなかった。実施例１と同様、ドナー蛍光色素側の蛍光強度の減少、又、アクセプター蛍光色素側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。よって、アクセプター蛍光色素の蛍光強度値／ドナー蛍光色素の蛍光強度値を求めることで、より高いＳ／Ｎ比を得ることができ、感度の良い鋳型核酸測定法であることがわかった。本結果より、均一溶液系核酸プローブを使用しないで、簡便且つ高感度に鋳型核酸を測定可能であることが示された。
【０１３８】
実施例３（本発明方法Ａ（２））
ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドとＣｙ５標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
１）鋳型の合成
鋳型はPseudomonas fluorescens DSM 50108(PF)16SリボゾーマルＤＮＡの１４００ｂｐのＤＮＡ断片を使用した。該鋳型は以下のようにして調製した。プライマー２、３を使用し、ＰＦゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。該増幅断片はマイクロコンＰＣＲ（ｒ）（ミリポア社、米国）で精製後、濃度を測定しコピー数に換算した。
【０１３９】
２）ＰＣＲ反応条件
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5 mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０9〜１×１０5コピーの鋳型DNA
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・6μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・2.5μM dTTP ・0.25μM Cy5 5-dUTP ・0.25μM FITC-5-dUTP
【０１４０】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、変性反応９５℃、１０秒、アニーリング反応５６℃、１０秒、伸長反応７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステム用いた。検出にはＦ１及びＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１４１】
前記に示した条件でＰＣＲを行い、各サイクルの蛍光強度を実測した。その結果を図２３、２４に示す。即ち、各コピー数の鋳型リボゾーマルＤＮＡについて、各サイクルのアニーリング反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。６サイクル目あたりからＦ１の蛍光強度が減少し、Ｆ３の蛍光強度が増加しているのが観察される。更にＦ１（ドナー蛍光色素）の蛍光強度の減少、Ｆ３（アクセプター蛍光色素）の蛍光強度の増加はコピー数が多い順に起こることがわかる。ここで、鋳型ＤＮＡが添加されていない０コピーのブランクでも、サイクル数を重ねるごとにＦ１蛍光強度が減少している様子が観察される。そこで、この点について蛍光強度値を補正した。即ち、各サイクルのＦ１蛍光強度値を同じサイクル数でのブランク蛍光強度値で割った。
Ｆｎ＝ｆｎ（５６℃）／ｆ’ｎ（５６℃）
但し、Ｆｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の補正値、ｆｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるサンプルの５６℃の蛍光強度値、ｆ’ｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるブランクの５６℃における蛍光強度値
【０１４２】
又、鋳型リボゾーマルＤＮＡの各コピー数について、初期のサイクル数の蛍光強度値が２様ではないことがわかる。そこで、この点についても蛍光強度値を補正した。即ち、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算した。
Ｃｎ＝Ｆｎ（５６℃）／Ｆ５（５６℃）
但し、Ｃｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の換算値、Ｆｎ（５６℃）＝各サイクルの５６℃の蛍光強度値、Ｆ５（５６℃）＝５サイクル目の５６℃における蛍光強度値。
以上２点の補正方法は、アニーリング反応後（ここでは５６℃）、若しくは伸長反応後（７２℃）のどちらの蛍光強度値を用いても構わない。
【０１４３】
この方法で処理すると、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度を換算し、その換算値を対応するサイクル数に対してプロットした図となる。前記の過程で処理したデータを図２５、図２６に示す。スレッシュホールド値を設定し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、鋳型リボゾーマルDNAの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。実際にはＹ軸がＦ１蛍光強度の時のスレッシュホールド値を０．８５、Ｙ軸がＦ３蛍光強度の時のスレッシュホールド値を１．５とした。これらの過程で処理して求めた相関係数（Ｒ２）は各々０．９９６５（図２７）、０．９９３１（図２８）であった。
【０１４４】
２種類の蛍光標識ヌクレオチドを含んだｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に２種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。このことを利用し、１分子中に標識された２種類の蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、ドナーの蛍光強度値（ここではＦ１）は約５０％減少、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約３倍に増加した。この蛍光強度値を用い、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、正確な鋳型核酸の定量が可能であった。この手法では、ドナー及びアクセプターのどちらの蛍光強度値の変化を測定しても定量可能であった。更にＦ３をＦ１で割ることで、ＳＮ比を高くすることも可能である。
【０１４５】
実施例４
２本鎖核酸特異的蛍光色素とCy5標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
鋳型とプライマーは実施例５と同様のものを使用した。以下に反応液組成を示す。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０9〜１×１０5コピーの鋳型ＤＮＡ
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・4μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・1μM dTTP ・1μM Cy5-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I
【０１４６】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、９５℃、１０秒、５６℃、１０秒、７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出にはＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。結果を図２９に示す。実施例５と同様の方法で蛍光強度値を補正した。スレッシュホールド値を２でとった場合の相関係数（Ｒ２）は０．９９８４であった（図３０）。
【０１４７】
１種類の蛍光標識ヌクレオチドを含むｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に１種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。この時、ある種の鋳型核酸に結合する蛍光色素を混ぜておき、この蛍光色素と分子中の蛍光標識ヌクレオチドとの間のエネルギー移動現象を利用してリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約４倍に増加した。この蛍光強度値と、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の蛍光強度の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、鋳型核酸の測定（定量）が可能であった。
【０１４８】
実施例５
標識ヌクレオチドを用いた１塩基伸長反応によるＳＮＰの測定
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した２６塩基の１本鎖ＤＮＡ（鋳型１０、１１）ＤＮＡ合成機ABI394で調製した。鋳型１０と１１は５’末端から数えて４塩基目がそれぞれＴ、Ｃであり、その他の配列は同じである。このように、鋳型１０と１１は特定の部位がＴ若しくはＣであるＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；１塩基多型、以下ＳＮＰと略す）を含んだＤＮＡ断片と考えることができる。これらの鋳型は３’側にプライマー１と相補的な配列を持ち、該プライマーとハイブリダイズした際、プライマーの３’末端塩基が鋳型のSNP部位の塩基に隣接するように設計してある。尚、蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-ddATP(PerkinElmer 米国）、Cy5TM-5-ddGTP(Amersham Biosciences）を用いた。又、核酸重合系にSYBR(r)Green 1を添加した。
【０１４９】
２）１塩基伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM Texas Red(r)-5-ddATP
・200nM Cyanine5TM-5-ddGTP ・1×SYBR(r)Green I ・20nM プライマー
・200nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１５０】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、６５℃で１０分間保温した。蛍光の検出には蛍光測定機器パーキンエルマーＬＳ−５０Ｂを用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１５１】
３）実施した実験系の内容
・モデル１：プライマー１と鋳型１０の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない（ブランクコントロール）
・モデル２：プライマー１と鋳型１０の組み合わせ（鋳型１０のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル３：プライマー１と鋳型１１の組み合わせ（鋳型１１のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル４：プライマー１、鋳型１０、１１を１００ｎＭずつ等量加えた組み合わせ（鋳型１０と１１のヘテロ）Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
【０１５２】
その結果、モデル１の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル２の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２、４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル３における６１０ｎｍの蛍光強度値は０．５９、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．３１であった。モデル４の６１０ｎｍの蛍光強度値は２．０１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．２１であった。
【０１５３】
鋳型１０のホモを想定したモデル２は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高くなっている。これは鋳型１０のＳＮＰ部位に相補的なTexas Red(r)標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Red(r)の６１０ｎｍの蛍光強度値が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないCy5TM標識ヌクレオチドは取り込まれない為６７０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。鋳型１１のホモを想定したモデル３はブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約３倍高い。これは鋳型１１のＳＮＰ部位に相補的なCy5TM標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしCy5TMの６７０ｎｍの蛍光が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red(r)標識ヌクレオチドは取り込まれず６１０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。鋳型１０と鋳型１１が等量入ったヘテロの系のモデル４では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red(r)標識ヌクレオチド、Cy5TM標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＳＮＰの測定のような、１分子につき２つの蛍光標識ヌクレオチドを取り込んだ場合にも、蛍光強度の変化が測定可能であった。更に、二種類の蛍光標識ヌクレオチドを用いて、１つのチューブ内で二種類の鋳型核酸の測定が可能であった。
【０１５４】
実施例６
一塩基伸長反応によるｐ５３遺伝子コドン２８２の一塩基多型検出
（１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用したＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてプライマー１４、１５を用いて調製した。
【０１５５】
（ＰＣＲ反応条件）
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムDNA
・1U AmpliTaqGold(Applied Biosystems) ・200μM dNTPs
【０１５６】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
【０１５７】
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物には大過剰のＰＣＲプライマーとｄＮＴＰが含まれるため、キアゲンＰＣＲ産物精製キット(Qiagen)による精製、若しくは、シュリンプ由来アルカリフォスファターゼ（usb）とエキソヌクレアーゼＩ（usb)をそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃１５分間加熱して酵素を不活性化した溶液を鋳型とした。
【０１５８】
（３）一塩基伸長反応
ジェノタイピングプライマーとして、プライマー１６に示したオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応で調製した鋳型とハイブリダイズした際、その３’末端塩基がＳＮＰ部位に隣接するように設計してある。
反応液は以下のように調製した。
・1U Thermo Sequenase I DNA Polymerase(Amersham-Pharmacia Biotech)
・10×Thermo Sequenase I DNA Polymerasｅバッファー
・200nM Texas Red-5-ddATP ・200nM Cy5-5-ddGTP
・1×SYBR Green I ・200nM プライマー
・鋳型ＤＮＡ
【０１５９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、５０℃で１分間保温した。これを１サイクルとして、４０サイクル行った。蛍光の検出には蛍光測定機器ＬＳ−５０Ｂ（Perkin Elmer）を用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１６０】
その結果、Ｃアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は２．１０であった。Ｔアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２．４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．５８であった。ヘテロ接合体における６１０ｎｍの蛍光強度値は１．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は１．２３であった。鋳型ＤＮＡを添加していないブランク試験の６１０ｎｍの蛍光強度値は０．６１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．６０であった。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型法）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。
【０１６１】
Ｃアレルホモ接合体は、ブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約５倍高くなっている。これは、CY5標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしCY5の６７０ｎｍの蛍光強度値が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red標識ヌクレオチドは取り込まれない為６１０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。Ｔアレルホモ接合体を鋳型とした場合は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高い。これは、ＳＮＰ部位に相補的なTexas Red標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Redの６１０ｎｍの蛍光が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないＣＹ５標識ヌクレオチドは取り込まれず６７０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。ヘテロ接合体では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red標識ヌクレオチド、Cy5標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＰＣＲ産物を鋳型とした場合にも、本発明の方法を用いて、ワンチューブ内での２種類の核酸の検出が可能であった。
【０１６２】
実施例７
アレル特異的プライマーを用いた配列特異的伸長法によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ALDH2）遺伝子の一塩基多型検出
ALDH２は、１２番染色体長腕に存在するアルコール代謝関連遺伝子の１つである。日本人に頻繁にみられる変異型アレル（ALDH2*2）は、ALDH2 exon 12中４８７番目のアミノ酸Ｇｌｕ（グルタミン酸）をコードするＧＡＡが、Ｌｙｓ（リジン）をコードするＡＡＡに変異した点突然変異である。
【０１６３】
（１）鋳型の合成
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてヒトゲノムＤＮＡよりプライマー４、５を用いて調製した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムＤＮＡ
・1U AmpliTaqGold ・200μM dNTPs 混合物
【０１６４】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）、若しくは酵素処理（シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化）した溶液を鋳型として一塩基多型解析に用いた。
【０１６５】
（３）配列特異的伸長反応
３’末端がそれぞれのＳＮＰに相補的なアレル特異的プライマーを合成した。プライマー６は３’末端がＣ、プライマー７はＴであり、その他は鋳型と相補的な同じ配列を有している。配列特異的伸長反応による一塩基多型解析は、プライマーの３’末端にミスマッチが存在すると、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が阻害されるという原理に基づいている。従って３’末端が相補的な場合、伸長反応により取り込まれた２種類の蛍光色素標識ヌクレオチドによりFRETが起き、蛍光強度が変化する。相補的でない場合、蛍光標識ヌクレオチドは取り込まれないため蛍光強度は変化しない。
【０１６６】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・2μM dATP ・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP
・400nM FITC-5-dCTP ・200nM プライマー ・精製ＰＣＲ産物
・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１６７】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１６８】
３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Tアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３１、図３２に示した。プライマー７を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３３、図３４に示した。Cアレルホモ接合体では、３’末端がCであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、ドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターのCY5の蛍光強度が増加した。３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合は、蛍光強度の変化はみられなかった。これは、３’末端が鋳型と相補的なプライマー６を添加した場合にのみ、伸長反応が起こったためと考えられる。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるCY5の蛍光強度が増加した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光強度の変化がみられた。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。従って、本発明の方法と配列特異的伸長法を組み合わせて、一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１６９】
実施例８
ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）で調製した鋳型を用いた配列特異的伸長法によるALDH2遺伝子の一塩基多型の検出
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法で調製した。その際使用したプライマーは、プライマー４及び５と同じ塩基配列を有し、その３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わっている。
【０１７０】
（１）鋳型DNAの合成
（ＩＣＡＮ反応条件）
・35mM Tris-HCl(pH7.8) ・10mM MgSO4 ・5% DMSO ・1μM プライマー対
・200ng ヒトゲノムDNA ・2.2U BcaBEST DNA polymerase（宝酒造）
・15U RNase H（宝酒造） ・1mM dNTPs
【０１７１】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、５５℃、６０分反応させた後、９０℃、５分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＩＣＡＮ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７２】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4 ・2μM dATP
・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP
・100nM プライマー6、7 ・ICAN増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７３】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１７４】
その結果、Cアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FRET現象のドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるＣＹ５の蛍光強度が増加した。それに対し、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合、変化はみられなかった。Tアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＩＣＡＮ増幅産物を鋳型とした場合にも、一塩基多型検出が可能であることが確認された。
【０１７５】
実施例９
ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)法で調製した鋳型を用いた、配列特異的伸長法によるProstate-specific antigenの一塩基多型検出
本実施例で使用する鋳型ＤＮＡは、４つのプライマーを使用し、さらに酵素として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する等温遺伝子増幅法で調製した。
【０１７６】
（１）鋳型ＤＮＡの合成
ＬＡＭＰ反応条件
・10×Thermopol Buffer(NEB) ・2mM MgSO4 ・200ng ヒトゲノムDNA
・8U Bst DNA polymerase(NEB) ・4M Betaine(Sigma) ・10mM dNTPs
・40pmol プライマー８ ・40pmol プライマー９ ・5pmol プライマー１０
・5pmol プライマー１１
【０１７７】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、６５℃、６０分反応させた後、８０℃、１０分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＬＡＭＰ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７８】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・400nM CY5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP ・2μM dATP ・2μM dGTP
・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・100nM プライマー12及びプライマー13
・LAMP増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をFITCの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１８０】
その結果、Ｃアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー１２を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FITCの蛍光強度が減少し、CY5の蛍光強度が増加した。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー１３を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー１２及び１３のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＬＡＭＰ法で増幅した産物を鋳型とした場合にも一塩基多型検出が可能であることが示された。
【０１８１】
実施例１０
逆転写酵素を用いたアレル特異的伸長反応による１塩基多型解析
ＬＣＨＡＤ(長鎖３−ヒドロキシアシル コエンザイムＡ デヒドロゲナーゼ）、ＯＡＴ(有機アニオントランスポーター）の一塩基多型を、逆転写酵素を用いた配列特異的伸長法により解析した。
（１）鋳型ＲＮＡの合成
本実施例に鋳型として使用するＲＮＡは以下のように調製した。
後記の配列番号１７、１８、２１、２２のプライマーを用いて２−プレックスＰＣＲを行った。１組のプライマーの一方には５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付けた。マルチプレックスＰＣＲ反応条件は、Ampli Taq Gold 1U 200nM、プライマー対50ng、ヒトゲノムDNA、Ampli Taq Gold buffer 200μM、dNTPsを均一に混合し、最終容量２５μｌとした。９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６５℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。続いて、T7 Ampliscribe Kit（Epicentre Technologies）を用いて転写反応を行った。
【０１８２】
（２）マイクロアレイの調製
マイクロアレイは、標準的なマイクロスコープガラススライドを用いた。イソチオシアネートで表面を活性化させた後、ＮＨ2−修飾オリゴヌクレオチド（配列番号１９、２０、２３、２４）を固定化した。オリゴヌクレオチドは２０μＭになるよう４００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で溶解した。直径２ｍｍにスポットした後、気化したアンモニアにさらし蒸留水で三回洗浄した。
【０１８３】
（３）配列特異的伸長法
調製した鋳型ＲＮＡを、10mM Tris-HCl、（pH7.4）、1mM EDTA、0.2M NaCl、0.1% Triton X-100に溶解後、１０μｌをアレイに添加し３７℃、２０分間温置してアニーリングさせた。0.1M NaClで洗浄後、逆転写酵素MMLV（Epicentre Technologies)6U、dNTPs（dATP、dGTP、FITC-dUTP、CY5-dCTP）６μＭ、酵素付属バッファーを添加し、５２℃で１時間反応させた。
【０１８４】
（４）シグナルの検出
マイクロスコープ ガラス スライドは、コンフォーカル スキャン アレイ4000(GSI Lumonics)を用いて励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６５０ｎｍでスキャンした。バックグランドの蛍光強度値を引いた値をジェノタイプの判定に用いた。
【０１８５】
LCHADのＣアレル特異的プライマーであるプライマー１９が固定化されたスライドは、LCHADのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約９００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。LCHADのＧアレル特異的プライマーであるプライマー２０が固定化されたスライドでは、LCHADのＧアレル接合体を含む鋳型をスポットした場合のみ高いシグナル強度（８００付近）が得られた。それに対してＧアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。OATのＣアレル特異的プライマーであるプライマー２３が固定化されたスライドは、OATのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約１２００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。このように、本発明の核酸検出方法において、逆転写酵素を用いた一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１８６】
実施例１１
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＣ（デオキシシチジン）ヌクレオチドモノマーを利用して、グアニンによる消光現象により核酸を検出する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマー
プライマー１と、鋳型１２を用いた。
・モデル１：プライマー１と鋳型１２の組み合わせ
・モデル２：プライマー１と鋳型１２の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１８７】
２）増幅反応条件
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.5% Triton X100 ・5% DMSO ・0.25mg/ml BSA
・200nM フルオレセインクロロトリアジニル-4-dC
・200nM dGTP ・200nM dATP ・200nM dUTP ・2nM プライマー
・50nM 合成一本鎖鋳型DNA ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１８８】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出はＦ１を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１８９】
その結果、モデル１ではＦ１の蛍光強度が最大で２４％減少した。酵素非添加のモデル２の反応では蛍光変化はみられなかった。以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成中の鎖に取り込まれたdC-FITC標識ヌクレオチドが、相補鎖に存在するグアニンと相互作用した結果、蛍光が減少したと考えられる。
【０１９０】
［プライマーの配列］
プライマー４：GTGTAACCCATAACCCCCAAGA
プライマー５：CACCAGCAGACCCTCAAGC
プライマー６：CCCACACTCACAGTTTTCACTTC
プライマー７：CCCACACTCACAGTTTTCACTTT
プライマー８：TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
プライマー９：TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
プライマー１０：TGCTTGTGGCCTCTCGTG
プライマー１１：GGGTGTGGGAAGCTGTG
【０１９１】
プライマー１２：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGC
プライマー１３：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGT
プライマー１４：ACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC
プライマー１５：GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
プライマー１６：TGTGCCTGTCCTGGGAGAGAC
プライマー１７：TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTTGCCAGGTGATTGGC
プライマー１８：GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGTTTCTGTGGTCACGAAGTC
【０１９２】
プライマー１９：CTCTAATAGTGCTGGCTC
プライマー２０：CTCTAATAGTGCTGGCTG
プライマー２１：
TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTGTAGCTGGGA ACTTC
プライマー２２：
GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTACCAAAACCTGGTAAATACGG
プライマー２３：GAGATAGCAGACAACGTCC
プライマー２４：GAGATAGCAGACAACGTCG
鋳型１２：
TTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１９３】
［図１０］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化。
［図１１］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ３蛍光強度変化。
［図１２］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化。
［図１３］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ２蛍光強度変化。
［図１４］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化。
［図１５］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ２蛍光強度変化。
［図１６］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化。
［図１７］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ１蛍光変化。
［図１８］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ３蛍光変化。
［図１９］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ１蛍光変化。
［図２０］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ２蛍光変化。
［図２１］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ１蛍光変化。
［図２２］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ２蛍光変化。
［図２３］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ１蛍光変化）。
［図２４］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ３蛍光変化）。
［図２５］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ１蛍光変化）。
［図２６］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
［図２９］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる核酸重合反応を行う際に、核酸重合系の蛍光強度変化をモニタリングすることで、ハイブリダイズすることにより蛍光強度の変化する均一溶液系核酸プローブが不要な、簡便・迅速且つ低コストで高感度な核酸の測定方法が実現する。この方法により、自然界の２系内に存在する遺伝子等の全核酸が測定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】本発明方法Ａの概要：蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図２】本発明方法Ｂの概要：核酸特異的蛍光色素・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図３】本発明方法Ｃの概要：Ｇ塩基・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図４】本発明方法Ｄの概要：クエンチャー物質・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図５】本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（１）。
【図６】本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（２）。
【図７】本発明方法Ｆの概要：特異的プライマーに標識された蛍光色素とＧ塩基間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図８】本発明方法Ｇの概要：抗原又は抗体で標識されたヌクレオチドを用いる核酸測定方法。
【図９】本発明方法Ｈの概要：固体表面上に固定化された特異的プライマーを用いる核酸測定方法。
【図１０】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化。
【図１１】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ３蛍光強度変化。
【図１２】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化。
【図１３】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ２蛍光強度変化。
【図１４】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化。
【図１５】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ２蛍光強度変化。
【図１６】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化。
【図１７】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ１蛍光変化。
【図１８】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ３蛍光変化。
【図１９】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ１蛍光変化。
【図２０】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ２蛍光変化。
【図２１】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ１蛍光変化。
【図２２】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ２蛍光変化。
【図２３】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ１蛍光変化）。
【図２４】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ３蛍光変化）。
【図２５】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ１蛍光変化）。
【図２６】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図２７】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ１蛍光値）。
【図２８】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ３蛍光値）。
【図２９】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図３０】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図３１】３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３２】３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【図３３】プライマー７を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３４】プライマー７を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【符号の説明】
【０１９６】
Ｎ：ヌクレオチドモノマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の核酸を測定する方法、詳しくは、蛍光色素等の物質で標識されたヌクレオチドを用いて、未知核酸及び／又は既知核酸（標的核酸）の少なくとも１種の核酸を測定することができる核酸の測定方法に関する。又、複数の核酸の場合は同時に測定できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸プローブを用いて標的核酸を測定する方法は数多く知られている。例えば、
（１）FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献１及び２参照）。
（２）蛍光色素が特定の核酸塩基と相互作用して蛍光発光量を減少させる特性を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献３参照）等で代表される方法等、数多くの例を挙げることができる。これらの方法は、均一系で、蛍光色素等で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることで及び／又は標的核酸を増幅させることで、核酸プローブに標識された蛍光色素等の光学的キャラクター（蛍光強度）の変化若しくは変化量を測定するものである。以下、本件明細書全体において当該核酸プローブを「均一溶液系核酸プローブ」と呼ぶ。又は単に「核酸プローブ」という場合がある。
【０００３】
しかしながら、上記の方法において必要な均一溶液系核酸プローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質でオリゴヌクレオチドを標識する必要がある。又、当該プローブの設計法は、標準化されていない。このことが、時間と費用の浪費に繋がっていた。又、測定感度が改善されてきてはいるが、更なる改善が要望されていた。又、自然界の１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む複数の核酸を同時に、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的、正確に測定できるものではない。
【０００４】
【非特許文献１】Morrison et al.,Anal. Biochem.,vol.183,231-244、1989
【非特許文献２】Xiangnin Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, 10756-10761, 1997
【非特許文献３】KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む少なくとも１種の核酸を、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的に正確に測定できる新規方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、核酸の合成を行う過程で、蛍光標識ヌクレオチド或はクエンチャー標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、標識された蛍光色素の蛍光キャラクターが、取り込ませる前に較べて、著しく変化することを知見した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明は、
１）（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｂ）（ａ）蛍光色素と、（ｂ）クエンチャー物質及び（ｃ）蛍光色素若しくはクエンチャー物質を含有する免疫関連物質からなる群から選ばれた少なくとも１種の標識物質で標識された、少なくとも１種のヌクレオチドモノマーと、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素を含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
【０００８】
上記本発明の方法においては、
２）標識物質が、少なくとも１種のドナー蛍光色素と少なくとも１種のアクセプター蛍光色素との組み合わせであることが好ましい。
３）又、標識物質が、少なくとも１種の蛍光色素と少なくとも１種のクエンチャー物質の組み合わせであることが好ましい。
４）又、核酸重合系が、（Ｄ）標識物質で標識されていない少なくとも１種のヌクレオチドモノマーを含むことが好ましい。
【０００９】
５）又、核酸重合系が、更に、（Ｅ）鋳型核酸に特異的に結合する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを含むことが好ましい。
６）上記５）の方法においては、核酸プライマーが、（Ｅ’）前記１）に記載の標識物質で標識されていることが好ましい。
７）又、前記１）の方法では、核酸重合系が、非標識ヌクレオチドを含有することが好ましい。
８）上記７）の方法では、蛍光標識及び／又は非標識ヌクレオチドが、グアニン（ｇ）を含有するか、及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つのグアニン（ｇ）を含むことが好ましい。
９）前記１）の方法では、核酸重合系が、更に、前記１）に記載のＢ成分を含まず、非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーを含有することが好ましい。
【００１０】
１０）上記９）の方法では、非標識ヌクレオチドがグアニン（ｇ）塩基を含むことが好ましい。
１１）前記１）、７）及び９）の方法では、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体であることが好ましい。
１２）又、本発明は、鋳型核酸と、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種クエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマーと、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
１３）上記１２）の方法では、核酸重合系が、標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチド或は両者を含む系であることが好ましい。
１４）前記１２）の方法では、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含むことが好ましい。
１５）前記１）、７）、９）及び１２）の方法では、核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有していることが好ましい。
【００１１】
１６）又、本発明は、鋳型核酸と、非標識ジデオキシヌクレオチドモノマーと、標識ヌクレオチドと、非標識核酸プライマーと、核酸に結合することで蛍光を発する少なくとも１種の蛍光色素と、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
１７）前記１２）、１６）の方法においては、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体であることが好ましい。
１８）前記１）、７）、９）、１２）、１６）の方法では、核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる核酸重合反応を行う際に、核酸重合系の蛍光強度変化をモニタリングすることで、ハイブリダイズすることにより蛍光強度の変化する均一溶液系核酸プローブが不要な、簡便・迅速且つ低コストで高感度な核酸の測定方法が実現する。この方法により、自然界の２系内に存在する遺伝子等の全核酸が測定できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明を詳細に説明する前に、特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって使用する用語の定義をする。本発明に用いている用語は、特別な断りがない場合、生物学、分子生物学、遺伝学若しくは遺伝子工学、微生物学若しくは微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１４】
ヌクレオチドモノマーとは、少なくとも１種の核酸合成酵素により核酸重合体に取り込まれ得るヌクレオチドのことをいう。好適にはオリゴヌクレオチドの核酸の構成成分のモノヌクレオチドであるが、本発明においては、モノヌクレオチドの他に、２〜３０量体のオリゴヌクレオチドを含む。好適な例としは、ヌクレオシドモノリン酸体（NMP）、２リン酸体（NDP）及び３リン酸体（NTP）を挙げることができる。より好適な例としては、３リン酸体である。塩基として、核酸構成成分のもの、即ち、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、それらの誘導体、ＲＮＡに含まれる微量成分等を挙げることができる。糖はリボース、デオシキシリボースである。前記のオリゴヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズするものであるならば、エキソヌクレアーゼ活性を有さない核酸合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）とリガーゼを用いることにより、核酸重合系で核酸重合体に取り込まれる。
【００１５】
ヌクレオシドモノリン酸体又は２リン酸体が用いられる理由は、核酸重合系に当該リン酸体を３リン酸体にするキナーゼ（kinase）類、ホスホリラーゼ類若しくはそれらの生成系を含んでいてもよいからである。例えば、精製していない粗鋳型核酸若しくは粗核酸合成酵素には、これらの酵素及び／又は生成系を含む例が多い。核酸重合系にＡＴＰが過分に含まれている場合は、ＡＴＰ以外の３リン酸体が形成し易い。即ち、本発明の核酸重合系とは、これらの酵素及び／又は生成系を含むことができると定義する。尚、標識ヌクレオチド及び免疫関連標識ヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。又、ジデオキシヌクレオチドモノマー及び標識若しくは非標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。
【００１６】
標識ヌクレオチドとは、後記する蛍光色素、クエンチャー物質等の少なくとも一種で標識されたヌクレオチドモノマーのことをいう。そして、蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーを蛍光標識ヌクレオチドと、又、クエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーをクエンチャー標識ヌクレオチドという。更にドナー蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをドナー標識ヌクレオチドと、又、アクセプター蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをアクセプター標識ヌクレオチドという。当該標識ヌクレオチドについては、詳しく後記した。
非標識ヌクレオチドとは、前記ような標識物質で標識されないヌクレオチドモノマーのことをいう。
核酸プライマーとは、鋳型核酸に特異的に結合する１種のプライマーのことをいう。又、核酸プライマーが、蛍光色素、及びクエンチャー物質で標識されたものを、順に、蛍光標識核酸プライマー及びクエンチャー標識核酸プライマーという。又、２者を総称して、標識核酸プライマーという。アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンを順にＡ若しくはａ、Ｇ若しくはｇ、Ｕ若しくはｕ、Ｃ若しくはｃ、Ｔ若しくはｔとした。核酸に結合することで、蛍光を発する蛍光色素を核酸特異的蛍光色素と定義した。
【００１７】
鋳型核酸とは、核酸重合体の鋳型になり得るものである。本発明においては、未知の核酸（「未知核酸」という場合がある。）、既知の核酸（「標的核酸」という場合がある。）、又、それらの混合物を指す。そして、それらはＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。即ち、本発明の鋳型核酸とは、測定を目的とした特定の核酸（標的核酸）とは限らず、不特定の核酸をも含む。勿論、遺伝子等を含む。それらの核酸が混在していもよい。又、濃度又は大きさの大小も問わない。即ち、１つの系内に存在する特定及び不特定の核酸をも意味する。即ち、鋳型核酸とは、本発明方法により重合及び／又は増幅されて検出若しくは測定できる核酸のこという。
【００１８】
核酸合成酵素とは、前記の鋳型核酸を鋳型として前記の非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドを重合して、核酸重合体を合成する能力を有するものであればどのようなものでもよい。代表的な例として、ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類(reverse transcriptase)、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系、及びそれらの遺伝子工学的に改変された改変蛋白質を有する酵素類を挙げることができる。ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類及び逆転写酵素類は、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系を含んでいる酵素類は、本発明においては、好適に利用され得る。本発明においては、これらのものが、単独若しくは併用で用いられる。
【００１９】
勿論、酵素は、これら酵素の活性を十分に発揮させる各種因子を含んでいても、いなくともよい。ＤＮＡポリメラーゼの場合は、エキソヌクレアーゼ活性を有していても、有さなくてもよい。精製されたもの若しくはされない粗酵素の状態のどちらでもよい。又、酵素の起源（微生物、動物、植物）については特に限定されない。好適には耐熱性を有するものがよい。好適な具体例として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-) DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold polymerase、T7 Sequenase DNA Polymerase等を挙げることができる。
【００２０】
蛍光色素等で標識された核酸重合体又は核酸プライマーと鋳型核酸又は核酸重合体等の対応核酸とのハイブリダイゼーションによる複合体のことをハイブリッド（又はハイブリット）複合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・核酸重合体複合体という。
【００２１】
本発明において「核酸を測定する」、或いは「核酸濃度を測定する」なる用語は、標的核酸の濃度を定量することは勿論のこと、定量的検出をすること、定性的検出をすること、核酸重合系の蛍光強度を単に測定するか若しくは単にモニタリングすること、単なる検出をすること、又、核酸を分析若しくは解析すること、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析すること等を意味するものとする。又、このようにして得られたデーターを公知の蔵田らの方法（EP特許公開公報、EP1 046 717 A9号）で解析して、１つの系内に存在している濃度（コピー数等）を求める操作等も含めるものとする。又、公知の方法（基礎生化学実験法、第４巻（核酸・遺伝子実験）、日本生化学会編、東京化学同人社）等により塩基配列を決める操作等も含めるものとする。
【００２２】
又、核酸の重合反応とは、単なる重合（合成、又は伸長反応）反応だけでなく、核酸の増幅反応、例えば、ＰＣＲ方法、リアルタイム定量的ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法、それらの方法に伴う、ハイブリダイゼーション反応、伸長、変性等を含める。そして、重合反応の具体的例として以下の例を挙げることができる。
（１）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＤＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（２）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＲＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＤＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応。
【００２３】
（３）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素で、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（４）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体及びデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応、即ち、ＤＮＡ合成反応を介する反応。
【００２４】
（５）上記の反応系にリガーゼを併用する反応系。
（６）上記の反応系に各種のキナーゼ類及び／又はヌクレオチド３リン体生成系を併用する反応系。
上記において、好ましいものは（１）〜（４）で、より好ましいものは（１）〜（３）で、特に好ましいものが、（１）及び（２）である。
【００２５】
「光学的キャラクター」なる用語は、ヌクレオチドを標識する蛍光色素、クエンチャー物質等の各種の吸収スペクトル、若しくは蛍光発光スペクトル、及びそれらの吸収強度、偏光、蛍光発光、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光異方性等の光学的特性等のこという（「蛍光強度」で総称する。）。又、標識ヌクレオチド等に標識されている少なくとも１つの蛍光色素等について少なくとも１種以上の測定波長で測定された測定値を総合的に評価して得た性質のこともいう。例えば、核酸の変性反応の蛍光強度曲線等もその１つである。
【００２６】
本発明において、「蛍光強度の変化若しくは変化量から」なる用語は、本発明の核酸重合体に基づく蛍光強度の変化だけでなく、当該核酸重合体に、蛍光色素及び／又はクエンチャーで標識された均一溶液系核酸プローブをハイブリダイズさせたときの、そのハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の変化若しくは変化量をも含めるものとする。
【００２７】
又、核酸重合系は、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを、標識又は非標識ヌクレオチドと共に含むこともできる。この場合の核酸の重合は、当該ジデオキシヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点でストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより、標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても前記標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００２８】
蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド及び核酸特異的蛍光色素について詳しく記載する。本発明でいう蛍光色素（「蛍光物質」という場合もある。）とは、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられている蛍光色素の類である。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate)(FITC)若しくはその誘導体等｝、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joe、EDANS、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体｛例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）（TMRITC）、ｘ−ローダミン（x-rhodamine）｝、テキサスレッド（Texas red）、ボデピー（BODIPY）FL｛ボデピー（BODIPY）は商標名、FLは商品名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国；以下同様｝、ボデピー（BODIPY）FL/C3、ボデピー（BODIPY）FL/C6、ボデピー（BODIPY）5-FAM、ボデピー（BODIPY）TMR、又はその誘導体｛例えば、ボデピー（BODIPY）TR、ボデピー（BODIPY）R6G、ボデピー（BODIPY）５６４｝、ボデピー（BODIPY）５８１等を挙げることができる。
【００２９】
上記の中でも、FITC、EDANS、テキサスレッド、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を好適なものとして挙げることができる。
【００３０】
クエンチャー物質とは、前記蛍光色素に作用して、その発光を抑制若しくは消光する物質である。例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）、Ferrocene又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を挙げることができる。
【００３１】
本発明の蛍光標識ヌクレオチドとは、少なくとも１種の蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーである。その標識は５’側の糖部位及び／又はそのリン酸部位、塩基部位、３’側の糖部位及び／又はリン酸部位のどちらでもよい。そして、蛍光色素とは前記に例示されるような色素で、ドナー色素となり得る色素、アクセプター色素となり得る色素の双方を意味するものとする。又、同様に、クエンチャー標識ヌクレオチドとは前記に例示されるようなクエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーである。尚、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドの双方を総称して、「標識ヌクレオチド」という場合がある。蛍光標識ジデオキシヌクレオチド及びクエンチャー標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様である。この場合は、糖の３’位にＯＨ基がないので、核酸重合に当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で、核酸重合反応がストップする。
【００３２】
標識ヌクレオチドにおいて糖の３’ＯＨ基に標識されている場合は、核酸の重合は、当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で重合がストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００３３】
ヌクレオチドモノマーに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる。標識部位は、５’リン酸部のＯＨ基、塩基のＯＨ基、アミノ基である。アミノ基に標識する場合、キット試薬、例えば、Uni-link aminomodifier(CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kit)F-6082、F-6083、F-6084、F-10220（いずれもモルキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該ヌクレオチドモノマーに前記標識物質分子を結合させることができる。
【００３４】
ＯＨ基に標識する場合、5'Amino-Modifier C6キット（Glen Research社、米国）等を用いる。例えば、塩基のＯＨ基に前記標識物質分子を結合させる場合は、先ず、常法に従ってＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する前記標識物質又はそれらの誘導体を結合させることにより標識ヌクレオチドモノマーを合成できる。アミノ基に標識する場合も同様である。リボース及びデオキシリボースの３’位のＯＨ基、リボースの２’位のＯＨ基、又、５’リン酸部位のＯＨ基を前記と同様にして標識することができる。このようにして合成された前記標識物質で標識された各種のヌクレオチドモノマーは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して、本発明で用いる標識ヌクレオチドとすることができる。勿論、委託合成を行って入手してもよい。
【００３５】
本発明で用いる核酸プライマーとは、核酸重合体の前駆体、即ち、プレカーサー(precursor)と成り得るものであり、オリゴヌクレオチドからなるものである。デオキシリボース体、リボース体のどちらでもよい。そして鎖長は公知の核酸合成に利用できるものでよく、特に限定されないが、例示するならば、２〜５０塩基、好適には、３〜４０塩基、より好適には５〜３０塩基である。鋳型核酸に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するもの、又、単に共通の塩基配列若しくはコンセンサス配列だけを有するもののどちらも用いることができる。前者の場合は、特定の鋳型核酸を鋳型とする核酸重合体が得られる。後者の場合は不特定のものが得られる。
【００３６】
本発明の前記プライマーは、前記の蛍光色素、クエンチャー物質で標識されていても、いなくとも用いることができる。標識はこれらの標識物質の少なくとも１種で為されていればよい。そして、好ましい核酸プライマーは５’末端及び／又は鎖中の塩基が標識され、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されていないものである。この場合は得られる核酸重合体はプライマーを標識した標識物質で標識されたものになる。勿論、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されたものも用いることができる。この場合は単に核酸プローブとして利用される。
【００３７】
本発明の核酸プライマーのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である。
【００３８】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、前記の標識ヌクレオチドモノマーの場合と同様にすればよい。この場合、オリゴヌクレオチドの５’末端塩基、３’末端塩基、鎖中の塩基、５’末端リン酸基、３’末端のリボース、デオキシリボースが標識対象になる。当該オリゴヌクレオチドの合成、当該標識核酸プライマーの合成は、委託合成を行うのが最も簡便な方法である。
【００３９】
本発明において、核酸特異的蛍光色素とは、核酸に結合することで蛍光を発する物質のことである。結合する核酸種は、標識又は非標識の核酸プライマー・鋳型核酸複合体、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの２本鎖、２本鎖ＲＮＡ等の核酸であればよく、特に限定されない。核酸特異的蛍光色素としての１例を挙げれば、エチジュウムブロミド、Sybr green 1、Sybr green 2、YOYO、TOTO、YO-PRO-1等のインターカレター類を挙げることができる。しかしながら、本発明においては核酸に結合することで蛍光を発する物質であれば、全ての本発明の方法に適用可能である。
【００４０】
本発明は次の手順からなる核酸の測定方法である。
１）下記｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つの核酸重合系で核酸重合反応（単独）、又は核酸重合反応及び核酸増幅反応（双方の反応）を開始する。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む核酸重合系。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む核酸重合系。
【００４１】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む核酸重合系。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１項において核酸特異的蛍光色素を含む核酸重合系。
【００４２】
２）前記の反応過程で、反応産物である核酸重合体に標識ヌクレオチド及び／又は核酸特異的蛍光色素が取り込まれるので、核酸重合系の蛍光強度が変化する。その変化若しくは変化量を測定する。核酸プローブを存在させた場合は、プローブと核酸重合体とが、ハイブリダイズし、核酸重合反応系の蛍光強度が独特な変化をする。
３）必要に応じて、前記反応物を電気泳動、ＨＰＬＣで分析する。
尚、上記の核酸重合系において、特に、核酸プライマーを含有する（６）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＤＮＡの場合が好適である。又、（１）及び（２）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＲＮＡの場合が好適である。又、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを含む系は、後記する多型（ＳＮＰを含む。）又は変異の測定、分析若しくは解析に用いるのが好適である。
【００４３】
本発明において、「少なくとも１種の核酸プライマーを存在させるか存在させずして」の意味は、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料、粗核酸合成酵素類には、鋳型核酸にハイブリダイズして核酸重合体の前駆体になり得るオリゴヌクレオチドが存在する例が多いからである。又、粗鋳型核酸、粗核酸合成酵素類の中に、当該前駆体を合成する酵素類が含まれている例が多い。
又、ＲＮＡ系の核酸重合反応は前記の核酸プライマーが存在させなくとも進む場合がある。
【００４４】
又、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば、粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料中に、核酸合成系が含まれている場合（例えば、各種生物の細胞抽出液）は、核酸合成酵素を添加しなくとも、核酸重合反応がおこる。この場合は、少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、及び核酸特異的蛍光色素からなる群から選ばれた少なくとも１種のもの、又は、核酸プライマーを反応系に存在させて、反応を開始すればよい。
【００４５】
上記の反応は、公知の反応条件で行ってよいのであるが、例示するならば、温度１０℃〜核酸変性温度未満、具体的には、核酸合成酵素の種類に依存する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、温度１０℃〜核酸変性温度未満、好適には、３０〜９０℃、より好適には３０〜８０℃である。ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合は、３０〜６０℃、逆転写酵素を使う場合は、３０〜７０℃である。反応時間は核酸重合系の蛍光強度を時間の関数として、モニタリニグした場合、平衡に達するまでである。例えば、１０秒〜１０時間、好適には１０秒〜２時間、より好適には１０秒〜１時間である。
【００４６】
上記の蛍光強度の変化は、次の現象からなる群の少なくとも１種の現象によって引き起こされるものと推定されている。そして複雑にかみ合っているものである。
（１）核酸特異的蛍光色素と蛍光色素間の相互作用（FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象）。
（２）蛍光色素間の相互作用（FRET現象）。
（３）クエンチャー物質と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）（前記（２）と同じ）。
（４）グアニン塩基と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）。
尚、本発明でいう相互作用とは、一方の励起エネルギーが他方へ移動する反応である。又、”蛍光消光現象”を単に”蛍光消光”と略称する場合がある。
【００４７】
以下、蛍光強度の変化若しくは変化量を測定する好ましい実際的方法は、リアルタイムで核酸重合系の蛍光強度を測定し、測定値を求める方法である。この場合、少なくとも１種の入射光若しくは励起光を出し、且つ少なくとも１種のホトマル等の受光面をもつ、即ち、マルチチャンネルを有する市販装置を使用するのが望ましい。例えば、スマートサイクラー（タカラバイオ株式会社）、ABI PRISMTM 7700Sequence Detection System(SDS 7700)(PE Applied Biosystems)、LightCyclerTM System(Roche Diagnostics,Mannheim Germany)等を使用すればよい。
【００４８】
実際の測定値を求める場合は、以下の少なくとも何れか１つを実施する。
（１）核酸重合反応の前後の核酸重合系の測定。
（２）核酸合成を行なわせない系（例えば、鋳型核酸又は核酸合成酵素を添加しない系）を対照としての核酸重合系の測定。
（３）核酸合成が平衡に達した系の核酸重合系の蛍光強度を先ず測定し、次いで、核酸重合系の核酸変性処理（例えば、９０〜９８℃での処理）後、測定する。
【００４９】
前記の方法により得られた測定値を、後記するデータ解析方法で処理（解析）することにより、自然界の１つの系内に存在する鋳型核酸（未知核酸、標的核酸）種、及びそれらの核酸が重合若しくは増幅される前のコピー数等の濃度を知ることができる。そしてよりよいデータになる。
【００５０】
以下に本発明の特徴を図面を参照して説明する。
１）本発明方法Ａ（図１参照）
（１）少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませ、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド間の標識された蛍光色素（Ａ）と標識された蛍光色素（Ｂ）間の相互作用に由来する核酸重合系の蛍光キャラクターの変化を測定するか、又はその変化を時間の関数としてモニタリングする（以下、単にモニタリングするという。）ことから、鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項１〜３の発明に相当する。
【００５１】
（２）前記（１）において、核酸プライマーを含有する核酸重合系で、核酸重合反応を行う方法である。この場合は、核酸プライマーが核酸重合体の前駆体（プライマー）として利用される。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項５の発明に相当する。
【００５２】
前記（１）及び（２）のように、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドに標識された蛍光色素（Ａ、Ｂ）間の距離が著しく接近し、溶液中に分散した状態では発生しなかった蛍光色素間の相互作用が発生する（図１参照）。蛍光色素間の相互作用に由来する蛍光強度の変化若しくは変化量を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。
【００５３】
この場合、相互作用し合う蛍光色素の内、一方は、FRET現象の励起エネルギーを与える色素でドナー色素（Ａ）という。そして他方はエネルギーを受けて蛍光発光する色素でアクセプター（Ｂ）という。
【００５４】
又、アクセプター色素は一般にFRET現象において、ドナー色素との対において、アクセプター色素となり得る色素、即ち、ドナー色素からエネルギー転移を受け得る（言葉を換えるとドナー色素に対してクエンチング（消光作用）作用をする）色素であればどのようなものでもよい。そして、ドナー色素は、アクセプター色素に励起エネルギーを転移できるものであれば、どのようなものでもよい。前記色素の中から該当するものを適当に選択することができる。
【００５５】
例えば、好適なドナー色素として、FITC、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を、より好適なものとして、FITC、BODIPY FL、BODIPY 493/503、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を挙げることができる。
【００５６】
好適なアクセプター色素は、対を形成するドナー色素の種類に依存する。例示するならば、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等をドナー色素とするならば、rhodamine X、BODIPY 581/591等をアクセプター色素とすることができる。本方法は、標識ヌクレオチドの蛍光色素、即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。ドナー色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の減少、アクセプター色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の増加を測定することになる。
【００５７】
２）本発明方法Ｂ（図２参照）
本発明の核酸重合系が、核酸特異的蛍光色素を含有する例である。そして、核酸重合系が前記核酸重合系（８）の１例である。核酸特異的蛍光色素（Ｃ）は、核酸重合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体に結合する。そして核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）と核酸特異的蛍光色素（Ｃ）間の相互作用が発生する。この相互作用に由来する蛍光強度の変化を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。この方法は、特許請求の範囲の請求項１５の発明に相当し、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の蛍光強度の減少、又、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の蛍光強度の増加を測定することになる。即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。
【００５８】
前記したように、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の存在下で、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる反応を行う過程で、合成された核酸重合体に核酸特異的蛍光色素（Ｃ）が結合し、この蛍光色素（Ｃ）と、反応過程で取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の距離が著しく接近する（図２参照）。このため前記同様の蛍光色素間の相互作用が発生する。
【００５９】
この場合の蛍光色素（Ｄ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるが、好ましいものはFITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。又、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の前記したものがすべて利用できるが、好ましいものはSybr green 1及びYO-PRO-1である。好ましい蛍光色素の組合わせは、Syber greenとTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、x-Rhodamineの組み合わせ、及びYO-PRO-1とTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。
【００６０】
３）本発明方法Ｃ
非標識核酸プライマーが存在するか、存在せずして、蛍光標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、鋳型核酸、核酸合成酵素を含有してなる核酸重合系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の減少若しくは減少量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして非標識ヌクレオチドの少なくとも一種がグアニン（ｇ）を含むか及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む場合が好適である。即ち、核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの塩基に対応する鋳型核酸の塩基がｇｃ（ＧＣ）対を形成するか、又は、上記蛍光標識ヌクレオチドの塩基から１乃至３塩基離れて（当該対応塩基を１と数える。）、鋳型核酸中にＧが存在するか若しくは核酸重合体中に塩基がＧである非標識ヌクレオチドが存在し、蛍光強度の変化が蛍光色素（Ｅ）とＧとの相互作用によるものである核酸の測定方法。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項７及び８に相当する発明である。
【００６１】
重合反応系の蛍光強度の減少は、次の何れかの場合におこる。
（１）蛍光標識ヌクレオチドの塩基がシトシン（ｃ）又はグアニン（ｇ）である。
（２）少なくとも一種の非標識ヌクレオチドの塩基がグアニン（ｇ）である。
（３）鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む。
【００６２】
前記したように、蛍光標識ヌクレオチド及び／又は非標識ヌクレオチドを用いて核酸重合反応を行う過程で、鋳型核酸中のグアニン（ｇ）、又は合成された核酸重合体中の、グアニン（ｇ）を含む非標識ヌクレオチドのグアニン（ｇ）と取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｅ）との距離が著しく接近する（図３参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった、標識された蛍光色素（Ｅ）の励起エネルギーがグアニン（ｇ）塩基に移動するようになる。
【００６３】
この場合の標識される蛍光色素（Ｅ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるのであるが、好ましいものは、FITC、EDANS、Texas red、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等である。
【００６４】
蛍光標識される好ましいヌクレオチドモノマーはシトシン（以下、ｃと略称する。）を塩基とするヌクレオチドモノマー（cytidylic acid、cytidine 5'-phosphate，cytidine 5'-diphosphate,cytidine 5'-triphosphate、若しくはそれらの重合体若しくはcytidylic acidを含有する重合体）であり、そして標識部位は塩基部（アミノ基）、又はリン酸部（ＯＨ基）、又はリボース部（２’又は３’位のＯＨ基）である。好ましい部位は塩基部、又はリン酸部である。
【００６５】
４）本発明方法Ｄ（図４参照）
本発明方法Ａの（１）又は（２）において、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを使用する例である。即ち、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを核酸重合体に取り込ませると、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）とクエンチャー標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）が接近し、相互作用する（図４参照）ことにより核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び／又は（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項３及び／又は４の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の減少を測定することになる。
【００６６】
本方法で利用できるクエンチャー物質（別名として”蛍光消光物質”ともいう。）は、例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を例示できる。
【００６７】
前記したように、核酸重合系に蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドを存在させて、核酸重合反応を行うと、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとの距離が著しく接近する。その結果として標識された蛍光色素（Ａ）とクエンチャー物質（Ｑ）の間の距離も著しく接近する（図４参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった標識されたクエンチャー物質（Ｑ）と標識された蛍光色素（Ａ）間の相互作用（発光エネルギーの移動現象）が発生するようになる。
【００６８】
５）本発明方法Ｅ（図５及び図６参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用いる例である。鋳型核酸の重合を行う過程で、標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）間の相互作用により蛍光強度が変化する。この変化を測定するか、又はモニタリングすることから鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定する方法である。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項６の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。この場合、蛍光強度の増加、又は減少は、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）と標識核酸プライマーの標識物質の蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）の組合せに依存する。ドナー色素とアクセプター色素の関係の場合は、本発明方法Ａと同様である。クエンチャー物質と蛍光色素の関係の場合は、本発明方法Ｄと同様である。
【００６９】
前記のように、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドを用いて本発明方法Ａの（２）のような核酸重合反応を行うと、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドは核酸重合体に取り込まれる。そして重合体に取り込まれた標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）との距離が著しく接近する（図５、図６参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった当該プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）の間で相互作用が発生する。
【００７０】
本発明で起こり得る物質間相互作用として、（１）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｂ）間の相互作用、（２）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）の間の相互作用、（３）標識核酸プライマーのクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）の間の相互作用の３つのケースが考えられる（図５は（１）のケースを、図６は（３）のケースを図示してある。）。標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系核酸プローブ（後記した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ａと同様である。又、クエンチャー物質は本発明方法Ｄと同様である。
【００７１】
６）本発明方法Ｆ（図７参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用い、標識ヌクレオチドの代わりに非標識ヌクレオチドを用いた（即ち、標識ヌクレオチドを用いない）例である。標識核酸プライマーに標識した蛍光色素（Ａ）と、取り込まれたＧ塩基を有する非標識ヌクレオチドのＧ間の相互作用により核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項９及び１０に相当する発明である。
【００７２】
即ち、非標識ヌクレオチドがＧを含むものであり、合成された核酸重合体中の蛍光標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）で標識された塩基から１乃至３塩基離れて（標識された塩基を１と数える。）、新たに重合された（当該プライマーの鎖中の塩基ではないという意味）核酸重合体中に少なくとも１つのＧが存在する場合に起こる（図７参照）。前項で記述した標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系の核酸プローブとは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本発明方法Ｅと同じく、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ｃと同様である。
【００７３】
７）本発明方法Ｇ（図８参照）
本発明方法Ａ〜Ｆにおいて、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドを用いる代わりに、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種で標識されたヌクレオチドモノマー（免疫関連標識ヌクレオチド）を用いた例である。例示して説明すると、前記のヌクレオチドモノマーに標識された抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている、前記の抗原、抗抗体に対応する抗原又は抗抗体が結合する。その結果、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。又、抗原には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。抗抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。その結果、前記免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。
尚、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種でヌクレオチドを標識するには、前記の従来公知の方法により達成出来る。又、前記と同様に委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した方が好適である。
【００７４】
本方法は、前記の通りであるので、免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、前記の免疫関連標識ヌクレオチドの免疫関連物質に対応する免疫関連物質が１つの対を形成する。そしてこの対は、免疫関連標識ヌクレオチドを標識している免疫関連物質は、ヌクレオチドに標識されていなくとも、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している前記の免疫関連物質と結合し複合体を形成する。それで、この複合体がヌクレオチドを標識している構造になっているとも認識することができる。従って、本発明においては、簡便化のために、この複合体を蛍光色素及びクエンチャー物質と同じものとして扱うことにした。それで、本発明の蛍光色素とは、前記した蛍光色素の他に蛍光色素を含有する前記複合体を含むものと定義する。又、同様にして、本発明のクエンチャー物質とは、前記したクエンチャー物質の他にクエンチャー物質を含有する前記複合体を含むものと定義する。蛍光色素を含有する複合体、即ち免疫関連物質で標識ヌクレオチドを蛍光標識ヌクレオチドの概念の中に入れ、蛍光標識ヌクレオチドと称することにした。クエンチャー物質についても同様にし、クエンチャー物質を含有する免疫関連物質で標識ヌクレオチドをクエンチャー標識ヌクレオチドと称する。又、免疫関連物質で標識した核酸プライマーにおいても前記ヌクレオチドと同様に、蛍光色素を含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーを蛍光標識核酸プライマーと、又、クエンチャーを含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーをクエンチャー標識核酸プライマーと称することにした。
【００７５】
それで、免疫関連標識ヌクレオチド、免疫関連標識核酸プライマーとは、当該ヌクレオチド、当該プライマーは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、当該ヌクレオチド、当該プライマーの免疫関連物質に対応する免疫関連物質を含むものと定義する。具体的には、当該ヌクレオチド及び／又は当該プライマーと、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している当該免疫関連物質を一緒に核酸重合系に存在せしめて、核酸重合系の蛍光強度を測定することになる。
【００７６】
それで、前記の本発明方法Ａ〜Ｆと同様にして、核酸重合体若しくはその鋳型核酸、又は鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定できる。以上より本方法は、後記する方法を含めて本発明の全てに相当し、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。
【００７７】
前記したように、前述の本発明方法Ａ〜Ｆに示した物質間相互作用の内のいずれかが起こるよう、抗原或は抗体或は抗抗体にてヌクレオチドを標識し、核酸重合反応を行う過程で、核酸重合体にそれらで標識されたヌクレオチドを取り込ませる。図８は、本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している図である。公知技術で示した均一溶液系核酸プローブ（後記に示した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。
【００７８】
８）本発明方法Ｈ（図示なし）
本方法は、２つの発明を含む。
ｉ）核酸重合系が前記核酸重合系（３）の１例で、特許請求の範囲の請求項１２〜１５に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（前者を「蛍光標識ジデオキシヌクレオチド」、後者を「クエンチャー標識ジデオキシヌクレオチド」という。両者を総称して「標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして、核酸重合系が、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む系である。又、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む系である。
【００７９】
ii）核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項１６に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識されていない、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（「非標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、標識ヌクレオチド、非標識核酸プライマー、核酸特異的蛍光色素、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。上記のｉ）、ii）の発明において、蛍光色素及びクエンチャー物質の概念は、前記の本発明方法Ｇと同様である。
【００８０】
尚、当該方法は、１塩基伸長反応方法と組合せることにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析又は分析に好適に利用できる。即ち、核酸プライマーの３’末端塩基が鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異部位の塩基に隣接するように設計してなる核酸プライマーと、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か若しくは相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドを用いて、当該発明の核酸重合反応又は核酸増幅反応を行うと、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基の存在若しくは不存在により、核酸重合系の蛍光強度に差が出る。その差により目的が達成できる。具体的には、実施例５及び実施例６に示した。
【００８１】
９）本発明方法Ｉ（図９参照）
各種核酸合成酵素を用いて、固体表面上に固定化された１種以上の核酸プライマーから鋳型核酸の重合を行うことを特徴とする前述の本発明方法Ａ〜Ｇの何れかに記載の方法である。
【００８２】
前記したように、１種以上の核酸プライマーを固体表面上に固定化し、各種核酸合成酵素により鋳型核酸の重合反応を行う。この際、前述の本発明方法Ａ〜Ｈの内、いずれかの物質間の相互作用が発生するように、核酸プライマー、蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、核酸特異的蛍光色素等を用意する。この際に発生する蛍光強度の変化若しくは変化量をモニタリングすることで単に核酸重合体又はその鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる（図９参照：図中では本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している。）。
【００８３】
本方法は、前記したように、１つの鋳型核酸又は当該鋳型核酸と新たに重合合成された核酸重合体との１つの複合体から観察した場合、新たに重合合成された核酸重合体に複数の蛍光色素を含むようになるので、測定感度が、単数種の蛍光色素の蛍光強度変化に基づく均一溶液系核酸プローブを使用する方法より更に改善される。又、鋳型核酸と非標識若しくは標識核酸プライマー又は新たに重合合成された核酸重合体との複合体に取り込まれた核酸特異的蛍光色素から、標識ヌクレオチドの蛍光色素へのエネルギー移動による蛍光強度の変化に基づく測定方式であるので、測定感度が格段に改善される。しかも、標的遺伝子等を含む１種以上の各種核酸を簡便且つ迅速に同時に測定できるという利点を有する。
【００８４】
尚、前記の本発明方法で得られたデータの解析方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をするとより好ましいデータになる。それで、このデータ処理方法も本発明に含まれる。
【００８５】
本発明方法においては、下記（１）〜（７）の公知の均一溶液系核酸プローブ（鋳型核酸に特異的にハイブリダイズし、蛍光色素又はクエンチャー物質で標識されたオリゴヌクレオチド）、及び公知の核酸測定方法を本発明方法、特に標識核酸プライマーに好適に適用することができる。当該プライマーとして利用される場合は前記した通りである。又、核酸増幅方法に記載した単なるプローブとして利用する場合、核酸合成酵素としてエキソヌクレアーゼを欠いたＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼとリガーゼを用いるのが好適である。均一溶液系核酸プローブが鋳型核酸にハイブリダイズしたとき、本発明の核酸重合体に組み込まれる。又、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いた場合、分解されてしまう。分解されたヌクレオチドがカイネース等で３リン酸体にされた後、本発明の核酸重合体に組み込まれてしまう。
【００８６】
（１）Morrisonらのプローブ（Morrison et al.,Anal.Biochem.,183:231-244,1989）で代表されるプローブ。
（２）Mergneyらのプローブ（Mergney et al.,Nucleic acid Res.,22:920-928,1994)で代表されるプローブ。
（３）分子ビーコン（molecular beacon)方法（Tyagi et al.,Nature Biotech.,14:303-308,1996;Schofield et al.,Applied and Environ. Microbiol.,63:1143-1147，１９９７）で代表されるプローブ。
（４）Livakらのプローブ（US patent No.5,538,848）で代表されるプローブ。
【００８７】
（５）KURATAらのプローブ（KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34）で代表されるプローブ。このプローブは、１本鎖のオリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識した均一溶液系核酸プローブであるが、蛍光色素で標識した塩基がＧ又はＣであるか、又は対応核酸の標識塩基に対応する塩基から１乃至３塩基離れて（標識塩基に対応する塩基を１と数える。）Ｇ又はＣが存在する均一溶液系核酸プローブである。
【００８８】
（６）Davisらのプローブ（Davis et al.,Nucleic acids Res.,24:702-706,1996）で代表されるプローブ。
（７）HORNらのプローブ（US Patent Application Publication No.US2001/0009760A1,Pub.Date:Jul.26,2001）で代表されるプローブ。
【００８９】
前記に記載した核酸重合方法が核酸増幅方法である場合について以下に記す。本発明でいう核酸増幅方法とは、インビトロ（in vitro）で核酸を増幅する方法のことをいう。公知、未公知を問わない。例えば、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction）、ＴＡＳ方法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＲＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＵＣＡＮ方法等を全て含めるものとする。
【００９０】
又、このＰＣＲとは、公知の各種のＰＣＲを意味するものである。例えば、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ-primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ、ＰＣＲにより増幅した核酸について、融解曲線の解析若しくは分析する方法等をも含むものとする。
【００９１】
具体的には、前記した核酸重合系、特に、核酸プライマー若しくは核酸プローブを含む系で、ハイブリダイゼーション反応、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして従来公知の条件(KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34)で核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する核酸の測定方法である。そして、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が観察（目視）され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと標準の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、試料中の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を求めることができる。具体的には、実施例４〜１１に記載されている。
【００９２】
前記した均一溶液系核酸プローブを好適に、核酸プライマー（リバース及び／又はフォワードプライマー）として利用できる。この場合、均一溶液系核酸プローブから標識されている蛍光色素及び／又はクエンチャー物質を離脱した非標識の核酸プライマーも好適に利用できる。当該核酸増幅方法で増幅された核酸重合体は少なくとも一種の蛍光色素を含むので、少なくとも一種の測定波長を用いて当該重合体の解離曲線から得られる情報は有用である。
【００９３】
本発明の核酸増幅系は、前記の核酸重合反応のための核酸重合系の｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つである。
【００９４】
本発明方法は、又、以下のデータ処理方法も含む。即ち、上記の核酸増幅方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正すると、好ましいデータになる。又、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をして補正したデータは好適なものになる。このような補正をする演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有する手順を記録した電子記録媒体も本発明である。測定及び／又はデーター解析装置において当該電子記録媒体を装備したもの、又、当該装置を用いた測定も当然本発明の範囲内である。
【００９５】
本発明の核酸の重合反応を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られるデータを解析する方法は具体的には以下の通りである。リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出する装置、ユーザーインターフェース、即ち、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software System）、及びそれらを制御し、データ解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われるのがよい。
【００９６】
尚、ＰＣＲ反応装置は、鋳型核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。又、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフならびにＣＣＤカメラからなっている。更に、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされて使用され、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデータを解析処理するプログラムを記録したものである。
【００９７】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、即ち、ＰＣＲのamplification plotとしてコンピュータのディスプレー上に表示する過程、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number：Ｃｔ）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデータ、プロット値を印字する過程からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の測定対象の核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って、既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の鋳型核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、鋳型核酸のＰＣＲ開始時の初期コピー数を計算できる。
【００９８】
本発明方法を用いる多型(polymorphism)及び／又は変異(mutation)を測定若しくは解析する方法について、以下に記す。即ち、核酸重合方法及び核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（９）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つで、核酸重合反応又は核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的若しくは非経時的に測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法である。好適には、当該方法を配列特異的伸長方法と組合せることがよい。具体的には、実施例７〜実施例１０に示した。
【００９９】
この場合、非標識若しくは標識核酸プライマーを、その３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補しない（相互の塩基が水素結合できる。）よう（他の塩基は相補する。）に作製してなる、少なくとも一種の非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行うのが好適である。当該プライマーを含有する核酸重合系では、当該プライマーを前駆体として、核酸重合若しくは核酸増幅反応が進まない場合は、核酸重合系の蛍光強度の変化が起きない。逆に進む場合は、蛍光強度の変化が起きる。尚、反応温度は、一般的には、当該プライマーのＴＭ値以上変性反応温度（例えば、９５℃）未満であるのが好適である。又、当該プライマーの３’末端から３番目の塩基を、鋳型核酸の塩基に相補しない塩基にし、鋳型核酸と当該プライマーとの間で人工的なミスマッチを形成させることで、非特異的な伸長反応が抑えられる。即ち、より正確な多型の判定が可能になる。この場合の反応温度は、当該プライマーのＴＭ値より５℃程低い温度から変性反応温度未満であることが好適である。尚、本発明において、鋳型核酸の多型若しくは変異の塩基とは相補しない塩基を有する当該プライマーをＡ型プライマーと称した場合に、相補する塩基を有する当該プライマーをＢ型プライマーと称することにする。この測定方法において、Ａ型プライマーとＢ型プライマーを併用することにより確かなデータが得られる。
【０１００】
具体的には、以下の方法で行う。
以下の核酸重合系で核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を行う。尚、詳しくは実施例７及び８に示した。
１）前記した核酸重合若しくは核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つのものである。この場合、好適には、標識又は非標識核酸プライマーとしてＡ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＡ型プライマーを少なくとも１種、及びＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１０１】
尚、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合は、上記（１）と（２）の反応系で、核酸重合反応、又は核酸増幅反応を行い、経時的若しくは非経時的に蛍光強度の変化若しくは変化量を測定して、その測定値を比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）若しくは変異を測定できる。異種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合、上記（３）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。尚、この場合でも、上記（１）と（２）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。
尚、上記のＡ型若しくはＢ型プライマーの替わりに、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か又は相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドの少なくとも一種を用いることでも、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することが達成出来ることは、前記した通りである。
【０１０２】
そして、Ａ型プライマーを少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーを少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、免疫関連標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類である。
【０１０３】
本発明の核酸の測定方法は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。又、複合微生物系、共生微生物系といわれ、色々の種類の微生物が混在するか、若しくは少なくとも１種類の微生物が他の動物、植物由来の細胞と共に混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。又、本発明は各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法、ＴＡＳ方法等に好適に適用できる。
本発明は、特許請求の範囲の請求項１〜１８の発明を開示するが、その他に以下に記載する幾つかの好ましい実施形態を開示する。
【０１０４】
［１］下記の何れか１つの核酸重合系で、核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０５】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０６】
［２］下記の何れか１つの核酸重合系で、ハイブリダイゼーション反応（アニーリング反応）、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０７】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０８】
［３］各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度の変化若しくは変化量が観察され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［４］前記［２］に記載の核酸重合系で、核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定して、その測定値から、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［５］非標識若しくは標識核酸プライマーの３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に対応する非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
【０１０９】
［６］下記の核酸重合系で、核酸重合反応、又は核酸増幅を行い、得られるデータを比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
１）前記した核酸重合系｛（１）〜（８）｝の何れか１つのものが、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補しない塩基を有するもの（Ａ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補する塩基を有するもの（Ｂ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、Ａ型プライマーの少なくとも１種、Ｂ型プライマーの少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１１０】
［７］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項で得られたデータを解析する方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的蛍光色素の、経時的若しくは非経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をすることを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
［８］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項に記載の方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正することを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
【０１１１】
［９］Ａ型プライマーの少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーの少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類。
［１０］核酸合成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-)DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold、Ｔ７ Sequenase DNA Polymeraseである前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［４］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１２】
［１１］核酸増幅方法が、ＰＣＲ方法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法のいずれかの方法である前記［４］に記載の核酸の測定方法。
［１２］ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ法である前記［１１］の核酸の測定方法。
［１３］前記請求項５に記載の標識核酸プライマーの少なくとも１種で標識された核酸プライマーを固体表面上に固定化させて、前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］の何れか１項に記載の方法を実施できるようにしたことを特徴するデバイス（ＤＮＡチップ）類。
［１４］前記のデバイス（ＤＮＡチップ）類を用いて鋳型核酸の核酸重合反応を行う前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１３】
［１５］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］、［４］のいずれか１項に記載の方法で鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体若しくは核酸増幅体を測定するための、温度を変化させながら蛍光測定可能な装置で、且つ前記［７］、［８］に記載のデータ処理若しくは解析方法の過程を、コンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体を組み込んだことを特徴とする測定装置。
［１６］前記請求項１、７、９、１２、前記［２］の何れか１項に記載の方法を用いて、均一溶液系核酸プローブの任意の位置の塩基を蛍光色素で標識する方法。
【実施例】
【０１１４】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。以下の実施例においては、以下のように用語を短略して用いた。
１）「鋳型核酸」を「鋳型」という場合がある。
２）「核酸プライマー」を「プライマー」とした。
３）dNTSs、dATP、dGTP、dTTP、dUTPは現在分子で生物学等で用いられている意味と同じである。
本実施例で用いた、鋳型、標識又は非標識ヌクレオチド及び標識又は非標識プライマーは特別の記載がない限り、委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した。
【０１１５】
本実施例にて使用したプライマー及び塩基配列は以下のものである。尚、塩基配列は右が３’末端で左が５’末端である。
（合成１本鎖ＤＮＡの塩基配列）
プライマー１：CAGACTCGACAGTGTAGACCCG
プライマー２：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
プライマー３：TTGCATGTGTTAGGCCTG
【０１１６】
又、鋳型１〜９は次の塩基配列を有していた。塩基配列は右が３’側で左が５’側である。
鋳型１：
ACACACACACACACTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型２：
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型３：
TTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型４：
TTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型５：
TTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１７】
鋳型６：
TTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型７：
TTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型８：
TTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型９：
TTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１０：
GCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１１：
GCTCCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１８】
実施例１（本発明方法Ｂ（２））
２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間のFRET現象を利用して鋳型核酸を測定する。
【０１１９】
Ａ）各種方法
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した１本鎖ＤＮＡ（鋳型１〜９）及び２２塩基のプライマー（プライマー１）はＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製、米国）で調製した。鋳型１から９はプライマー１と相補的な共通の配列を３´側に有する。又、これらの鋳型は伸長反応の過程で標識されたｄＵＴＰが７つ取り込まれるように設計してある。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す：
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが５個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１２０】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが７個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが８個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１０個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型７とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１２１】
２）重合（増幅）反応条件
ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたサーモコッカス・リトラリス由来のVent(exo-)DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs,Beverly，MA）を用いた。蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTP(650nm/668nm)、LissamineTM-5-dUTP(570nm/588nm)、Texas Red(r)-5-dUTP(593nm/612nm)（カッコ内は最大吸収波長／最大蛍光波長、PerkinElmer米国）を用いた。ＤＮＡポリメラーゼにより取り込まれた標識ヌクレオチドへFRET現象を起こさせるためのドナー色素に、２本鎖核酸に特異的に結合し４９７ｎｍに最大励起波長を持ち、５２０ｎｍ付近で最大の蛍光を発するSYBR(r)Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular probes、米国）を用いた。
【０１２２】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1%Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM dATP ・200nM dGTP
・200nM dCTP ・200nM Cyanine5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U（単位） Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１２３】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）を用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をSYBR(r)Green Iの検出に、Ｆ２（６４０ｎｍ）をLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTPの検出、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCyanine 5-dUTPの検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１２４】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用した。
・モデル１０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１１〜１９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。・モデル２０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル２１〜２９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用した。
・モデル３０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル３１〜３９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。
・モデル４０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１２５】
結果を図１０〜１６に示した。モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化を図１０に、Ｆ３蛍光強度変化を図１１に示す。モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化を図１２に、Ｆ２蛍光強度変化を図１３に示す。モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化を図１４、Ｆ２蛍光強度変化を図１５に示す。モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化を図１６に示す。
【０１２６】
その結果、モデル１〜９ではＦ１の蛍光が最大で約４０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約４倍増加した。酵素非添加のモデル１０の反応ではＦ１は若干蛍光強度が減少したものの、Ｆ３の蛍光強度に変化はみられなかった（図１０、１１）。モデル１１〜１９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル２０のＦ２の蛍光強度は変化しなかった（図１２、１３）。モデル２１〜２９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約８倍増加した。酵素非添加のモデル３０ではＦ２の蛍光強度に変化はなかった（図１４、１５）。SYBR(r)Green Iのみのモデル３１〜３９ではＦ１の蛍光強度が最大で３倍増加した（図１６）。
【０１２７】
このように、２本鎖核酸特異的蛍光色素（今回はSYBR(r)Green I）と蛍光標識ヌクレオチドとの間にエネルギー移動現象が観察され、鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナーとなる２本鎖核酸特異的蛍光色素がアクセプターとなる各蛍光標識ヌクレオチドにエネルギーを供与したことで、ドナーの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプターの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度値の変化はみられなかった。又、蛍光標識ヌクレオチドを入れないSYBR(r)Green Iだけの系では、エネルギー移動は起こらないためにSYBR(r)Green Iの蛍光強度（Ｆ１）のみが増加した。この手法では、エネルギー移動現象におけるドナー側の蛍光強度の減少、又、アクセプター側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。
【０１２８】
実施例２（本発明方法Ａ）
蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用して鋳型核酸を測定する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
実施例１で使用したプライマーならびに鋳型１本鎖ＤＮＡを用いた。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す。
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド１個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド２個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１２９】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド３個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが取り込まれた後、非標識ヌクレオチド３個が取り込まれる。次に、蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれる。この繰り返しである。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド５個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型９とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド６個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１３０】
２）重合（増幅）反応条件
蛍光標識ヌクレオチドには、実施例１と同様の蛍光標識ヌクレオチドとしてCyanine 5-dUTP、LissamineTM-5-dUTP、Texas Red(r)-5-dUTPを用いた。ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドはFITC-dGTP（PerkinElmer、米国）を用いた。
【０１３１】
尚、反応液を以下のように調製した。
・20mM TrisHCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM FITC-dGTP（ドナー色素）
・200nM dCTP ・200nM dATP ・200nM Cyanine 5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP (アクセプター色素） ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１３２】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出はＦ１、Ｆ２、Ｆ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１３３】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜７：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Cyanine 5-dUTPを用いる。
・モデル８：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル９〜１５：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、LissamineTM-5-dUTPを用いる。
【０１３４】
・モデル１６：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにLissamineTM-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１７〜２３：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６。プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Texas Red(r)-5-dUTPを用いる。
・モデル２４：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにRed(r)-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１３５】
結果を図１７〜２２に示した。モデル１〜８のＦ１の蛍光強度変化を図１７に、Ｆ３の蛍光強度変化を図１８に示す。モデル９〜１６のＦ１の蛍光強度変化を図１９に、Ｆ２の蛍光強度変化を図２０に示す。モデル１７〜２４のＦ１の蛍光強度変化を図２１、Ｆ２の蛍光強度変化を図２２に示す。
【０１３６】
その結果、モデル１〜７はＦ１の蛍光強度が最大で約５０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約５倍増加した。酵素非添加のモデル８の反応では蛍光変化はみられなかった（図１７、１８）。モデル９〜１５はＦ１の蛍光強度が最大で６０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル１６の蛍光強度は変化しなかった（図１９、２０）。モデル１７〜２３はＦ１の蛍光強度が最大で５０％以上減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約４．５倍増加した。酵素非添加のモデル２４では変化しなかった（図２１、２２）。
【０１３７】
以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成された蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象によって蛍光強度値の変化から鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナー蛍光色素であるＦＩＴＣ標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプター蛍光色素となるCyanine5,LissamineTM、Texas Red(r)標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度の変化はみられなかった。実施例１と同様、ドナー蛍光色素側の蛍光強度の減少、又、アクセプター蛍光色素側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。よって、アクセプター蛍光色素の蛍光強度値／ドナー蛍光色素の蛍光強度値を求めることで、より高いＳ／Ｎ比を得ることができ、感度の良い鋳型核酸測定法であることがわかった。本結果より、均一溶液系核酸プローブを使用しないで、簡便且つ高感度に鋳型核酸を測定可能であることが示された。
【０１３８】
実施例３（本発明方法Ａ（２））
ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドとＣｙ５標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
１）鋳型の合成
鋳型はPseudomonas fluorescens DSM 50108(PF)16SリボゾーマルＤＮＡの１４００ｂｐのＤＮＡ断片を使用した。該鋳型は以下のようにして調製した。プライマー２、３を使用し、ＰＦゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。該増幅断片はマイクロコンＰＣＲ（ｒ）（ミリポア社、米国）で精製後、濃度を測定しコピー数に換算した。
【０１３９】
２）ＰＣＲ反応条件
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5 mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０9〜１×１０5コピーの鋳型DNA
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・6μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・2.5μM dTTP ・0.25μM Cy5 5-dUTP ・0.25μM FITC-5-dUTP
【０１４０】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、変性反応９５℃、１０秒、アニーリング反応５６℃、１０秒、伸長反応７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステム用いた。検出にはＦ１及びＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１４１】
前記に示した条件でＰＣＲを行い、各サイクルの蛍光強度を実測した。その結果を図２３、２４に示す。即ち、各コピー数の鋳型リボゾーマルＤＮＡについて、各サイクルのアニーリング反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。６サイクル目あたりからＦ１の蛍光強度が減少し、Ｆ３の蛍光強度が増加しているのが観察される。更にＦ１（ドナー蛍光色素）の蛍光強度の減少、Ｆ３（アクセプター蛍光色素）の蛍光強度の増加はコピー数が多い順に起こることがわかる。ここで、鋳型ＤＮＡが添加されていない０コピーのブランクでも、サイクル数を重ねるごとにＦ１蛍光強度が減少している様子が観察される。そこで、この点について蛍光強度値を補正した。即ち、各サイクルのＦ１蛍光強度値を同じサイクル数でのブランク蛍光強度値で割った。
Ｆｎ＝ｆｎ（５６℃）／ｆ’ｎ（５６℃）
但し、Ｆｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の補正値、ｆｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるサンプルの５６℃の蛍光強度値、ｆ’ｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるブランクの５６℃における蛍光強度値
【０１４２】
又、鋳型リボゾーマルＤＮＡの各コピー数について、初期のサイクル数の蛍光強度値が２様ではないことがわかる。そこで、この点についても蛍光強度値を補正した。即ち、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算した。
Ｃｎ＝Ｆｎ（５６℃）／Ｆ５（５６℃）
但し、Ｃｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の換算値、Ｆｎ（５６℃）＝各サイクルの５６℃の蛍光強度値、Ｆ５（５６℃）＝５サイクル目の５６℃における蛍光強度値。
以上２点の補正方法は、アニーリング反応後（ここでは５６℃）、若しくは伸長反応後（７２℃）のどちらの蛍光強度値を用いても構わない。
【０１４３】
この方法で処理すると、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度を換算し、その換算値を対応するサイクル数に対してプロットした図となる。前記の過程で処理したデータを図２５、図２６に示す。スレッシュホールド値を設定し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、鋳型リボゾーマルDNAの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。実際にはＹ軸がＦ１蛍光強度の時のスレッシュホールド値を０．８５、Ｙ軸がＦ３蛍光強度の時のスレッシュホールド値を１．５とした。これらの過程で処理して求めた相関係数（Ｒ２）は各々０．９９６５（図２７）、０．９９３１（図２８）であった。
【０１４４】
２種類の蛍光標識ヌクレオチドを含んだｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に２種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。このことを利用し、１分子中に標識された２種類の蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、ドナーの蛍光強度値（ここではＦ１）は約５０％減少、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約３倍に増加した。この蛍光強度値を用い、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、正確な鋳型核酸の定量が可能であった。この手法では、ドナー及びアクセプターのどちらの蛍光強度値の変化を測定しても定量可能であった。更にＦ３をＦ１で割ることで、ＳＮ比を高くすることも可能である。
【０１４５】
実施例４
２本鎖核酸特異的蛍光色素とCy5標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
鋳型とプライマーは実施例５と同様のものを使用した。以下に反応液組成を示す。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０9〜１×１０5コピーの鋳型ＤＮＡ
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・4μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・1μM dTTP ・1μM Cy5-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I
【０１４６】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、９５℃、１０秒、５６℃、１０秒、７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出にはＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。結果を図２９に示す。実施例５と同様の方法で蛍光強度値を補正した。スレッシュホールド値を２でとった場合の相関係数（Ｒ２）は０．９９８４であった（図３０）。
【０１４７】
１種類の蛍光標識ヌクレオチドを含むｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に１種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。この時、ある種の鋳型核酸に結合する蛍光色素を混ぜておき、この蛍光色素と分子中の蛍光標識ヌクレオチドとの間のエネルギー移動現象を利用してリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約４倍に増加した。この蛍光強度値と、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の蛍光強度の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、鋳型核酸の測定（定量）が可能であった。
【０１４８】
実施例５
標識ヌクレオチドを用いた１塩基伸長反応によるＳＮＰの測定
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した２６塩基の１本鎖ＤＮＡ（鋳型１０、１１）ＤＮＡ合成機ABI394で調製した。鋳型１０と１１は５’末端から数えて４塩基目がそれぞれＴ、Ｃであり、その他の配列は同じである。このように、鋳型１０と１１は特定の部位がＴ若しくはＣであるＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；１塩基多型、以下ＳＮＰと略す）を含んだＤＮＡ断片と考えることができる。これらの鋳型は３’側にプライマー１と相補的な配列を持ち、該プライマーとハイブリダイズした際、プライマーの３’末端塩基が鋳型のSNP部位の塩基に隣接するように設計してある。尚、蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-ddATP(PerkinElmer 米国）、Cy5TM-5-ddGTP(Amersham Biosciences）を用いた。又、核酸重合系にSYBR(r)Green 1を添加した。
【０１４９】
２）１塩基伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM Texas Red(r)-5-ddATP
・200nM Cyanine5TM-5-ddGTP ・1×SYBR(r)Green I ・20nM プライマー
・200nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１５０】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、６５℃で１０分間保温した。蛍光の検出には蛍光測定機器パーキンエルマーＬＳ−５０Ｂを用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１５１】
３）実施した実験系の内容
・モデル１：プライマー１と鋳型１０の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない（ブランクコントロール）
・モデル２：プライマー１と鋳型１０の組み合わせ（鋳型１０のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル３：プライマー１と鋳型１１の組み合わせ（鋳型１１のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル４：プライマー１、鋳型１０、１１を１００ｎＭずつ等量加えた組み合わせ（鋳型１０と１１のヘテロ）Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
【０１５２】
その結果、モデル１の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル２の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２、４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル３における６１０ｎｍの蛍光強度値は０．５９、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．３１であった。モデル４の６１０ｎｍの蛍光強度値は２．０１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．２１であった。
【０１５３】
鋳型１０のホモを想定したモデル２は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高くなっている。これは鋳型１０のＳＮＰ部位に相補的なTexas Red(r)標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Red(r)の６１０ｎｍの蛍光強度値が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないCy5TM標識ヌクレオチドは取り込まれない為６７０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。鋳型１１のホモを想定したモデル３はブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約３倍高い。これは鋳型１１のＳＮＰ部位に相補的なCy5TM標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしCy5TMの６７０ｎｍの蛍光が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red(r)標識ヌクレオチドは取り込まれず６１０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。鋳型１０と鋳型１１が等量入ったヘテロの系のモデル４では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red(r)標識ヌクレオチド、Cy5TM標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＳＮＰの測定のような、１分子につき２つの蛍光標識ヌクレオチドを取り込んだ場合にも、蛍光強度の変化が測定可能であった。更に、二種類の蛍光標識ヌクレオチドを用いて、１つのチューブ内で二種類の鋳型核酸の測定が可能であった。
【０１５４】
実施例６
一塩基伸長反応によるｐ５３遺伝子コドン２８２の一塩基多型検出
（１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用したＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてプライマー１４、１５を用いて調製した。
【０１５５】
（ＰＣＲ反応条件）
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムDNA
・1U AmpliTaqGold(Applied Biosystems) ・200μM dNTPs
【０１５６】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
【０１５７】
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物には大過剰のＰＣＲプライマーとｄＮＴＰが含まれるため、キアゲンＰＣＲ産物精製キット(Qiagen)による精製、若しくは、シュリンプ由来アルカリフォスファターゼ（usb）とエキソヌクレアーゼＩ（usb)をそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃１５分間加熱して酵素を不活性化した溶液を鋳型とした。
【０１５８】
（３）一塩基伸長反応
ジェノタイピングプライマーとして、プライマー１６に示したオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応で調製した鋳型とハイブリダイズした際、その３’末端塩基がＳＮＰ部位に隣接するように設計してある。
反応液は以下のように調製した。
・1U Thermo Sequenase I DNA Polymerase(Amersham-Pharmacia Biotech)
・10×Thermo Sequenase I DNA Polymerasｅバッファー
・200nM Texas Red-5-ddATP ・200nM Cy5-5-ddGTP
・1×SYBR Green I ・200nM プライマー
・鋳型ＤＮＡ
【０１５９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、５０℃で１分間保温した。これを１サイクルとして、４０サイクル行った。蛍光の検出には蛍光測定機器ＬＳ−５０Ｂ（Perkin Elmer）を用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１６０】
その結果、Ｃアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は２．１０であった。Ｔアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２．４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．５８であった。ヘテロ接合体における６１０ｎｍの蛍光強度値は１．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は１．２３であった。鋳型ＤＮＡを添加していないブランク試験の６１０ｎｍの蛍光強度値は０．６１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．６０であった。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型法）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。
【０１６１】
Ｃアレルホモ接合体は、ブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約５倍高くなっている。これは、CY5標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしCY5の６７０ｎｍの蛍光強度値が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red標識ヌクレオチドは取り込まれない為６１０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。Ｔアレルホモ接合体を鋳型とした場合は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高い。これは、ＳＮＰ部位に相補的なTexas Red標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Redの６１０ｎｍの蛍光が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないＣＹ５標識ヌクレオチドは取り込まれず６７０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。ヘテロ接合体では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red標識ヌクレオチド、Cy5標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＰＣＲ産物を鋳型とした場合にも、本発明の方法を用いて、ワンチューブ内での２種類の核酸の検出が可能であった。
【０１６２】
実施例７
アレル特異的プライマーを用いた配列特異的伸長法によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ALDH2）遺伝子の一塩基多型検出
ALDH２は、１２番染色体長腕に存在するアルコール代謝関連遺伝子の１つである。日本人に頻繁にみられる変異型アレル（ALDH2*2）は、ALDH2 exon 12中４８７番目のアミノ酸Ｇｌｕ（グルタミン酸）をコードするＧＡＡが、Ｌｙｓ（リジン）をコードするＡＡＡに変異した点突然変異である。
【０１６３】
（１）鋳型の合成
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてヒトゲノムＤＮＡよりプライマー４、５を用いて調製した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムＤＮＡ
・1U AmpliTaqGold ・200μM dNTPs 混合物
【０１６４】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）、若しくは酵素処理（シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化）した溶液を鋳型として一塩基多型解析に用いた。
【０１６５】
（３）配列特異的伸長反応
３’末端がそれぞれのＳＮＰに相補的なアレル特異的プライマーを合成した。プライマー６は３’末端がＣ、プライマー７はＴであり、その他は鋳型と相補的な同じ配列を有している。配列特異的伸長反応による一塩基多型解析は、プライマーの３’末端にミスマッチが存在すると、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が阻害されるという原理に基づいている。従って３’末端が相補的な場合、伸長反応により取り込まれた２種類の蛍光色素標識ヌクレオチドによりFRETが起き、蛍光強度が変化する。相補的でない場合、蛍光標識ヌクレオチドは取り込まれないため蛍光強度は変化しない。
【０１６６】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・2μM dATP ・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP
・400nM FITC-5-dCTP ・200nM プライマー ・精製ＰＣＲ産物
・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１６７】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１６８】
３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Tアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３１、図３２に示した。プライマー７を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３３、図３４に示した。Cアレルホモ接合体では、３’末端がCであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、ドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターのCY5の蛍光強度が増加した。３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合は、蛍光強度の変化はみられなかった。これは、３’末端が鋳型と相補的なプライマー６を添加した場合にのみ、伸長反応が起こったためと考えられる。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるCY5の蛍光強度が増加した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光強度の変化がみられた。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。従って、本発明の方法と配列特異的伸長法を組み合わせて、一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１６９】
実施例８
ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）で調製した鋳型を用いた配列特異的伸長法によるALDH2遺伝子の一塩基多型の検出
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法で調製した。その際使用したプライマーは、プライマー４及び５と同じ塩基配列を有し、その３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わっている。
【０１７０】
（１）鋳型DNAの合成
（ＩＣＡＮ反応条件）
・35mM Tris-HCl(pH7.8) ・10mM MgSO4 ・5% DMSO ・1μM プライマー対
・200ng ヒトゲノムDNA ・2.2U BcaBEST DNA polymerase（宝酒造）
・15U RNase H（宝酒造） ・1mM dNTPs
【０１７１】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、５５℃、６０分反応させた後、９０℃、５分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＩＣＡＮ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７２】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4 ・2μM dATP
・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP
・100nM プライマー6、7 ・ICAN増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７３】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１７４】
その結果、Cアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FRET現象のドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるＣＹ５の蛍光強度が増加した。それに対し、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合、変化はみられなかった。Tアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＩＣＡＮ増幅産物を鋳型とした場合にも、一塩基多型検出が可能であることが確認された。
【０１７５】
実施例９
ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)法で調製した鋳型を用いた、配列特異的伸長法によるProstate-specific antigenの一塩基多型検出
本実施例で使用する鋳型ＤＮＡは、４つのプライマーを使用し、さらに酵素として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する等温遺伝子増幅法で調製した。
【０１７６】
（１）鋳型ＤＮＡの合成
ＬＡＭＰ反応条件
・10×Thermopol Buffer(NEB) ・2mM MgSO4 ・200ng ヒトゲノムDNA
・8U Bst DNA polymerase(NEB) ・4M Betaine(Sigma) ・10mM dNTPs
・40pmol プライマー８ ・40pmol プライマー９ ・5pmol プライマー１０
・5pmol プライマー１１
【０１７７】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、６５℃、６０分反応させた後、８０℃、１０分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＬＡＭＰ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７８】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・400nM CY5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP ・2μM dATP ・2μM dGTP
・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・100nM プライマー12及びプライマー13
・LAMP増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をFITCの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１８０】
その結果、Ｃアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー１２を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FITCの蛍光強度が減少し、CY5の蛍光強度が増加した。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー１３を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー１２及び１３のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＬＡＭＰ法で増幅した産物を鋳型とした場合にも一塩基多型検出が可能であることが示された。
【０１８１】
実施例１０
逆転写酵素を用いたアレル特異的伸長反応による１塩基多型解析
ＬＣＨＡＤ(長鎖３−ヒドロキシアシル コエンザイムＡ デヒドロゲナーゼ）、ＯＡＴ(有機アニオントランスポーター）の一塩基多型を、逆転写酵素を用いた配列特異的伸長法により解析した。
（１）鋳型ＲＮＡの合成
本実施例に鋳型として使用するＲＮＡは以下のように調製した。
後記の配列番号１７、１８、２１、２２のプライマーを用いて２−プレックスＰＣＲを行った。１組のプライマーの一方には５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付けた。マルチプレックスＰＣＲ反応条件は、Ampli Taq Gold 1U 200nM、プライマー対50ng、ヒトゲノムDNA、Ampli Taq Gold buffer 200μM、dNTPsを均一に混合し、最終容量２５μｌとした。９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６５℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。続いて、T7 Ampliscribe Kit（Epicentre Technologies）を用いて転写反応を行った。
【０１８２】
（２）マイクロアレイの調製
マイクロアレイは、標準的なマイクロスコープガラススライドを用いた。イソチオシアネートで表面を活性化させた後、ＮＨ2−修飾オリゴヌクレオチド（配列番号１９、２０、２３、２４）を固定化した。オリゴヌクレオチドは２０μＭになるよう４００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で溶解した。直径２ｍｍにスポットした後、気化したアンモニアにさらし蒸留水で三回洗浄した。
【０１８３】
（３）配列特異的伸長法
調製した鋳型ＲＮＡを、10mM Tris-HCl、（pH7.4）、1mM EDTA、0.2M NaCl、0.1% Triton X-100に溶解後、１０μｌをアレイに添加し３７℃、２０分間温置してアニーリングさせた。0.1M NaClで洗浄後、逆転写酵素MMLV（Epicentre Technologies)6U、dNTPs（dATP、dGTP、FITC-dUTP、CY5-dCTP）６μＭ、酵素付属バッファーを添加し、５２℃で１時間反応させた。
【０１８４】
（４）シグナルの検出
マイクロスコープ ガラス スライドは、コンフォーカル スキャン アレイ4000(GSI Lumonics)を用いて励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６５０ｎｍでスキャンした。バックグランドの蛍光強度値を引いた値をジェノタイプの判定に用いた。
【０１８５】
LCHADのＣアレル特異的プライマーであるプライマー１９が固定化されたスライドは、LCHADのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約９００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。LCHADのＧアレル特異的プライマーであるプライマー２０が固定化されたスライドでは、LCHADのＧアレル接合体を含む鋳型をスポットした場合のみ高いシグナル強度（８００付近）が得られた。それに対してＧアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。OATのＣアレル特異的プライマーであるプライマー２３が固定化されたスライドは、OATのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約１２００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。このように、本発明の核酸検出方法において、逆転写酵素を用いた一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１８６】
実施例１１
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＣ（デオキシシチジン）ヌクレオチドモノマーを利用して、グアニンによる消光現象により核酸を検出する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマー
プライマー１と、鋳型１２を用いた。
・モデル１：プライマー１と鋳型１２の組み合わせ
・モデル２：プライマー１と鋳型１２の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１８７】
２）増幅反応条件
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.5% Triton X100 ・5% DMSO ・0.25mg/ml BSA
・200nM フルオレセインクロロトリアジニル-4-dC
・200nM dGTP ・200nM dATP ・200nM dUTP ・2nM プライマー
・50nM 合成一本鎖鋳型DNA ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１８８】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラーTMシステムを用いた。検出はＦ１を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１８９】
その結果、モデル１ではＦ１の蛍光強度が最大で２４％減少した。酵素非添加のモデル２の反応では蛍光変化はみられなかった。以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成中の鎖に取り込まれたdC-FITC標識ヌクレオチドが、相補鎖に存在するグアニンと相互作用した結果、蛍光が減少したと考えられる。
【０１９０】
［プライマーの配列］
プライマー４：GTGTAACCCATAACCCCCAAGA
プライマー５：CACCAGCAGACCCTCAAGC
プライマー６：CCCACACTCACAGTTTTCACTTC
プライマー７：CCCACACTCACAGTTTTCACTTT
プライマー８：TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
プライマー９：TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
プライマー１０：TGCTTGTGGCCTCTCGTG
プライマー１１：GGGTGTGGGAAGCTGTG
【０１９１】
プライマー１２：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGC
プライマー１３：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGT
プライマー１４：ACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC
プライマー１５：GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
プライマー１６：TGTGCCTGTCCTGGGAGAGAC
プライマー１７：TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTTGCCAGGTGATTGGC
プライマー１８：GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGTTTCTGTGGTCACGAAGTC
【０１９２】
プライマー１９：CTCTAATAGTGCTGGCTC
プライマー２０：CTCTAATAGTGCTGGCTG
プライマー２１：
TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTGTAGCTGGGA ACTTC
プライマー２２：
GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTACCAAAACCTGGTAAATACGG
プライマー２３：GAGATAGCAGACAACGTCC
プライマー２４：GAGATAGCAGACAACGTCG
鋳型１２：
TTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１９３】
［図１０］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化。
［図１１］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ３蛍光強度変化。
［図１２］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化。
［図１３］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ２蛍光強度変化。
［図１４］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化。
［図１５］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ２蛍光強度変化。
［図１６］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化。
［図１７］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ１蛍光変化。
［図１８］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ３蛍光変化。
［図１９］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ１蛍光変化。
［図２０］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ２蛍光変化。
［図２１］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ１蛍光変化。
［図２２］２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ２蛍光変化。
［図２３］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ１蛍光変化）。
［図２４］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ３蛍光変化）。
［図２５］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ１蛍光変化）。
［図２６］２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
［図２９］２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる核酸重合反応を行う際に、核酸重合系の蛍光強度変化をモニタリングすることで、ハイブリダイズすることにより蛍光強度の変化する均一溶液系核酸プローブが不要な、簡便・迅速且つ低コストで高感度な核酸の測定方法が実現する。この方法により、自然界の２系内に存在する遺伝子等の全核酸が測定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】本発明方法Ａの概要：蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図２】本発明方法Ｂの概要：核酸特異的蛍光色素・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図３】本発明方法Ｃの概要：Ｇ塩基・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図４】本発明方法Ｄの概要：クエンチャー物質・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図５】本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（１）。
【図６】本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（２）。
【図７】本発明方法Ｆの概要：特異的プライマーに標識された蛍光色素とＧ塩基間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図８】本発明方法Ｇの概要：抗原又は抗体で標識されたヌクレオチドを用いる核酸測定方法。
【図９】本発明方法Ｈの概要：固体表面上に固定化された特異的プライマーを用いる核酸測定方法。
【図１０】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化。
【図１１】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ３蛍光強度変化。
【図１２】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化。
【図１３】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ２蛍光強度変化。
【図１４】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化。
【図１５】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ２蛍光強度変化。
【図１６】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化。
【図１７】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ１蛍光変化。
【図１８】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ３蛍光変化。
【図１９】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ１蛍光変化。
【図２０】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ２蛍光変化。
【図２１】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ１蛍光変化。
【図２２】２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ２蛍光変化。
【図２３】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ１蛍光変化）。
【図２４】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ３蛍光変化）。
【図２５】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ１蛍光変化）。
【図２６】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図２７】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ１蛍光値）。
【図２８】２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ３蛍光値）。
【図２９】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図３０】２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図３１】３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３２】３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【図３３】プライマー７を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３４】プライマー７を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【符号の説明】
【０１９６】
Ｎ：ヌクレオチドモノマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素と、（Ｇ）非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーとを含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項２】
非標識ヌクレオチドがグアニン（ｇ）塩基を含む請求項１に記載の核酸の測定方法。
【請求項３】
非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体である請求項１に記載の核酸の測定方法。
【請求項４】
鋳型核酸と、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種クエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマーと、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項５】
核酸重合系が、標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチド或は両者を含む系である請求項４に記載の核酸の測定方法。
【請求項６】
核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む請求項４に記載の核酸の測定方法。
【請求項７】
核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有している請求項１又は４に記載の核酸の測定方法。
【請求項８】
鋳型核酸と、非標識ジデオキシヌクレオチドモノマーと、標識ヌクレオチドと、非標識核酸プライマーと、核酸に結合することで蛍光を発する少なくとも１種の蛍光色素と、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項９】
非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体である請求項４又は８に記載の核酸の測定方法。
【請求項１０】
核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１、４又は８に記載の核酸の測定方法。
【請求項１】
（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素と、（Ｇ）非標識ヌクレオチド及び蛍光標識核酸プライマーとを含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項２】
非標識ヌクレオチドがグアニン（ｇ）塩基を含む請求項１に記載の核酸の測定方法。
【請求項３】
非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体である請求項１に記載の核酸の測定方法。
【請求項４】
鋳型核酸と、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種クエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマーと、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項５】
核酸重合系が、標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチド或は両者を含む系である請求項４に記載の核酸の測定方法。
【請求項６】
核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む請求項４に記載の核酸の測定方法。
【請求項７】
核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有している請求項１又は４に記載の核酸の測定方法。
【請求項８】
鋳型核酸と、非標識ジデオキシヌクレオチドモノマーと、標識ヌクレオチドと、非標識核酸プライマーと、核酸に結合することで蛍光を発する少なくとも１種の蛍光色素と、核酸合成酵素とを含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項９】
非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドが、３リン酸体である請求項４又は８に記載の核酸の測定方法。
【請求項１０】
核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１、４又は８に記載の核酸の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【公開番号】特開２００８−２６４００５（Ｐ２００８−２６４００５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０１１６４（Ｐ２００８−２０１１６４）
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【分割の表示】特願２００３−１５５４９８（Ｐ２００３−１５５４９８）の分割
【原出願日】平成１５年５月３０日（２００３．５．３０）
【出願人】（０００１５６５８１）日鉄環境エンジニアリング株式会社 (67)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【分割の表示】特願２００３−１５５４９８（Ｐ２００３−１５５４９８）の分割
【原出願日】平成１５年５月３０日（２００３．５．３０）
【出願人】（０００１５６５８１）日鉄環境エンジニアリング株式会社 (67)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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