樹状細胞、該樹状細胞を含む医薬、該樹状細胞を用いた治療方法およびγδＴ細胞の培養方法
【課題】本発明は、γδＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率よく活性化及び／または増殖させるための樹状細胞、それを含む医薬、並びに該樹状細胞を用いた治療方法及び該樹状細胞によるγδＴ細胞培養方法を提供する。
【解決手段】末梢血単核球由来の未成熟樹状細胞をビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスし、γδＴ細胞を活性化する能力を有するようにした後、γδＴ細胞を含む細胞群と培養することによりγδＴ細胞を活性化及び／または増殖させる。これにより、患者に負担をかけることなく、γδＴ細胞を容易に増殖させることが可能となり、γδＴ細胞を用いた免疫細胞療法の実用化につながる。
【解決手段】末梢血単核球由来の未成熟樹状細胞をビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスし、γδＴ細胞を活性化する能力を有するようにした後、γδＴ細胞を含む細胞群と培養することによりγδＴ細胞を活性化及び／または増殖させる。これにより、患者に負担をかけることなく、γδＴ細胞を容易に増殖させることが可能となり、γδＴ細胞を用いた免疫細胞療法の実用化につながる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビスホスホネート系骨代謝改善薬（以下ビスホスホネートと記す）でパルスされた樹状細胞に関する。また、該樹状細胞を含む医薬、該樹状細胞を用いた治療方法、γδＴ細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は抗原提示細胞として働き、抗原を貪食・断片化して細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）分子上に抗原エピトープとして提示する。リンパ節で、この樹状細胞とＴ細胞が接触すると、Ｔ細胞はその抗原エピトープを認識する。
【０００３】
また、Ｔ細胞には、αβＴ細胞レセプターを発現したαβＴ細胞とγδＴ細胞レセプターを発現したγδＴ細胞が存在する。αβＴ細胞は獲得免疫を中心に担っており、γδＴ細胞は結核などの特殊な細菌感染症や腫瘍に対する免疫応答のエフェクター細胞として働き、主に自然免疫を担っている。
【０００４】
最近、このγδＴ細胞が癌細胞に対する細胞傷害活性をも有していることが明らかとなり、γδＴ細胞の持つ強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の開発が注目されている。しかし、一般に血中にあるＴ細胞のうち大部分がαβＴ細胞であり、γδＴ細胞は１〜５％程度にしか過ぎない。そのため、γδＴ細胞を増やす方法として、マグネット法等で分離したγδＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養を行い生体内へ戻すことが行われている。
【０００５】
ここで、γδＴ細胞は非ペプチド抗原によっても活性化および／または増殖されることが知られており、アルキルアミン等のアルカロイド、ピロリン酸モノエステル、ビスホスホネートにより活性化および／または増殖されることが知られている。
【０００６】
なかでも、ビスホスホネートを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでのγδＴ細胞培養方法は様々な研究によって検討されているが、得られるγδＴ細胞数が十分ではなく、治療に用いることが十分に可能な量のγδＴ細胞を得ようとすると、患者からの採血量を増やすことになり、患者に対する負担も大きくなる。それ故、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ ｖｉｖｏでも容易に十分な量のγδＴ細胞を得ることができる技術の確立が望まれていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、γδＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率よく活性化および／または増殖させるための樹状細胞、該樹状細胞を含む医薬、並びに該樹状細胞を用いた治療方法および該樹状細胞を用いたγδＴ細胞培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために、研究を行った結果、γδＴ細胞に直接ビスホスホネートによる刺激を与えるのではなく、通常ＣＴＬ誘導のために用いられる樹状細胞をビスホスホネートによりパルスしたものを用いることにより、γδＴ細胞を活性化および／または増殖できることを見出し、さらに、疾病抗原ペプチドを用いて抗原特異的なαβＴ細胞を誘導する場合と異なり、意外にも、未成熟樹状細胞を用いるとより好適にγδＴ細胞を活性化および／または増殖させ得ることを見出し、本発明を完成した。
本発明により、γδＴ細胞を患者に負担をかけることなく、容易に増殖させることが可能となり、γδＴ細胞を用いた免疫細胞療法の実用化につながる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
（１）ビスホスホネートでパルスされたことを特徴とする樹状細胞、
（２）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（１）記載の樹状細胞、
（３）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（１）または（２）記載の樹状細胞。
【００１１】
（４）ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を含むことを特徴とする医薬、
（５）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（４）記載の医薬、
（６）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（４）または（５）記載の医薬。
【００１２】
（７）ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を投与することを特徴とする治療方法、
（８）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（７）記載の治療方法、
（９）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（７）又は（８）記載の治療方法、
（１０）治療が癌及び／又は感染症治療であることを特徴とする（７）〜（９）いずれかの項記載の治療方法、
（１１）前記樹状細胞が自己由来であることを特徴とする（７）〜（１１）いずれかの項記載の治療方法。
【００１３】
（１２）Ｔ細胞の培養において、ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を加えることを特徴とするγδＴ細胞の培養方法、
（１３）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（１２）記載のγδＴ細胞の培養方法、
（１４）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（１２）又は（１３）記載のγδＴ細胞の培養方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例３の結果を示す。コントロール（ビスホスホネートでパルスされなかった樹状細胞）、Ａｒｅｄｉａ、Ｏｎｃｌａｓｔ、Ｚｏｍｅｔａでパルスされた樹状細胞と、反応細胞を共培養し、７日後血球計算板を用いて細胞数を測定し、さらにフローサイトメーターでγδＴ細胞が占める割合を測定した結果および２つの数値から算出したγδＴ細胞数を示す。
【図２】図２は、実施例５の結果を示す。グラフの縦軸はスポット数を横軸はスポットの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。ネガティブコントロールとしてγδＴ細胞のみ、γδＴ細胞＋Ａｒｅｄｉａ、樹状細胞のみのＩＦＮ−γ産生を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）第一の実施形態；本発明樹状細胞の作製
まず、本発明の樹状細胞について詳説する。
【００１６】
本発明の樹状細胞とはビスホスホネートでパルスされたことを特徴とする樹状細胞である。
【００１７】
本発明の樹状細胞としては未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞およびそれらの混合物のいずれを用いてもよいが、未成熟樹状細胞のほうがより好適にγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができるため、未成熟樹状細胞を用いるほうが好ましい。
【００１８】
また、ビスホスホネートとは、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものであればよく、その例として、パミドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばパミドロン酸二ナトリウム・五水和物（Ａｒｅｄｉａ、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばアレンドロン酸ナトリウム三水和物（Ｏｎｃｌａｓｔ、萬有製薬））、ゾレドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばゾレドロン酸ナトリウム水和物（Ｚｏｍｅｔａ、ノバルティスファーマ））、リセドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばリセドロン酸ナトリウム水和物）、イバンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばイバンドロン酸ナトリウム）、インカドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばインカドロン酸二ナトリウム）、エチドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばエチドロン酸二ナトリウム）などが挙げられる。これらの中で、とりわけパミドロン酸、アレドロン酸、ゾレドロン酸、それらの塩および／またはそれらの水和物が好ましい。
【００１９】
次に、本発明の樹状細胞の調整方法について詳説する。
【００２０】
まず、樹状細胞の前駆細胞を得るための試料を取得する。試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血などが利用できるが、入手の容易さ、患者への負担の少なさを考慮して末梢血を利用することが好ましい。
【００２１】
採血量は提供者の負担とならない程度の量を採血するのが好ましい。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採取した血液には凝固が起こらないようにヘパリンやクエン酸を加えることができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取する方法を用いれば、直接末梢血単核球を入手することが可能である。
【００２２】
次に、採取した血液から樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を分離する。方法としては有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることもできる。例えばフィコール分画つまりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配または溶出を利用する方法が、一般的に使用される。
なお、回収した細胞は血小板等を除去するために培地、生理食塩水、リン酸生理食塩水（以下ＰＢＳと記す）等を用いて数回洗浄することが好ましい。
【００２３】
次に、回収した単核細胞から樹状細胞の前駆細胞を分離する。
ＣＤ１４は樹状細胞の前駆細胞に発現しているマーカーとして知られており、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，以下ＭＡＣＳと記す）を利用して単球（ＣＤ１４陽性細胞）を単離・回収する方法が簡単でかつ細胞の回収率が高いため好ましい。
あるいは、回収した単核細胞を培養フラスコに移し，３４℃〜３８℃、より好ましくは３７℃、２％〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２の条件下で１時間以上培養し、付着細胞を樹状細胞の前駆細胞として用いる方法等を使用してもよい。
【００２４】
その後、得られた樹状細胞の前駆細胞から未成熟樹状細胞あるいは成熟樹状細胞への分化誘導を行う。培養のための培地としてＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）を使用する。
またＡＩＭ−Ｖ培地のほかに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭと記す）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社、以下ＫＢＭと記す）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭと記す）等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５〜２０％の牛血清、牛胎児血清（以下ＦＢＳと記す）、ヒト血漿等を添加することができる。
【００２５】
未成熟樹状細胞の場合、培養培地に分化誘導因子を添加し、樹状細胞の前駆細胞を培養することにより未成熟樹状細胞を得る。
分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下ＧＭ−ＣＳＦと記す）、インターロイキン４（以下ＩＬ−４と記す）、ステムセルファクター（以下ＳＣＦと記す）、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（以下ＴＮＦ−αと記す）等が効率よく未成熟樹状細胞を誘導することが可能である。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４の組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。
培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養期間は５〜７日間が好ましい。
【００２６】
また、成熟樹状細胞を得る場合には培養開始後５〜７日目にさらなる分化誘導因子を添加して更に培養する。
分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、プロスタグランジンＥ２（以下ＰＧＥ２と記す）等で効率よく成熟樹状細胞を誘導することが好ましい。必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−αの組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。
培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養時間としては２４〜４８時間が好ましい。
【００２７】
また、樹状細胞の前駆細胞として造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αとｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、あるいはトロンボポエチン（ＴＰＯ）を単独、もしくは組合せで添加し、未成熟樹状細胞もしくは成熟樹状細胞を得る方法や、血液あるいは末梢血単核球を分離したものからパーコールなどの比重液を用いて直接樹状細胞分画を回収する方法も利用することができる。
【００２８】
得られた未成熟樹状細胞、または成熟樹状細胞にビスホスホネートを添加して培養し、刺激細胞（ビスホスホネートによりパルスされた樹状細胞）を作成する。ビスホスホネートを添加する濃度は０．１μＭ〜３０μＭが好ましく、さらに好ましくは１〜１０μＭである。
また、ビスホスホネートをパルスする時間は１時間〜３６時間が好ましく、より好ましくは１２時間である。
【００２９】
このようにして得られた樹状細胞は、γδＴ細胞を活性化および／または増殖させる能力を有しているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び ｉｎ ｖｉｖｏのいずれの場合でもγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができる医薬として使用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合はγδＴ細胞活性化および／または増殖させることができる組成物として利用することが可能となる。ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合は遊離ビスホスホネートを洗浄、除去したのち、γδＴ細胞活性化および／または増殖させることができる樹状細胞ワクチンとしての使用が可能である。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いるいずれの場合にも必要に応じて例えばサイトカイン（例えばＩＬ−２）やその他タンパク質（例えばアルブミン）等を加えてもよい。
【００３０】
（２）第二の実施形態；本発明樹状細胞を含む医薬
次に、本発明の樹状細胞を用いた治療方法について説明する。
【００３１】
第一の実施形態で得られた樹状細胞を遠心分離法等によって回収する。
【００３２】
回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能であるが、この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。
【００３３】
回収された樹状細胞は生理食塩水に懸濁されることで投与用製剤として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカインを添加することができる。
【００３４】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、１０６〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０７個／人以上である。
【００３５】
投与する方法としては静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、所属リンパ節へ注射等により注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。
【００３６】
このようにして、本発明の樹状細胞を投与することにより患者体内のγδＴ細胞を活性化することができる。γδＴ細胞は非特異的細胞傷害活性を有するため、例えば、癌や感染症等、様々な治療に用いることが可能である。樹状細胞をワクチンとして用いることの利点として、ビスホスホネートを直接投与する場合、複数回投与するうちに体内でのγδＴ細胞に対する反応が弱化・消失していくため、繰り返しγδＴ細胞を増殖させることができないが、ビスホスホネートを樹状細胞にパルスし、ワクチンとして投与することでこの問題が回避できる。
【００３７】
（３）第三の実施形態；本発明樹状細胞を用いたγδＴ細胞の培養方法
次に、本発明のγδＴ細胞の培養方法について詳説する。
【００３８】
第一の実施形態で得られた樹状細胞と反応細胞を培養容器に播種する。
ここでいう反応細胞とはγδＴ細胞を含む細胞群を指す。末梢血由来の単核球等が好ましい。
【００３９】
培養容器は特に限定されるものではなく、通常、当該分野で使用される培養用プレート、シャーレ、フラスコ、バッグなどを利用することができる。各々の細胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。
【００４０】
樹状細胞、反応細胞の培養にはＡＩＭ−Ｖ培地を用いて培養する。また、ＡＩＭ−Ｖ培地のほか、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＴＩＬ、ＫＢＭ、ＩＭＥＭ等、細胞培養に使用されている市販の培地を利用することができる。さらに必要に応じて５％〜２０％の牛血清、ＦＢＳ、ヒト血漿などの血清、サイトカイン等を添加してもよい。
培養は３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養期間としては５〜８日間が好ましく、さらに７日間が好ましい。
【００４１】
播種する樹状細胞と反応細胞の数は播種する容器および用途に応じて設定することができる。また、樹状細胞と反応細胞の混合する割合は状況に応じて適宜設定することが可能であるが、反応細胞中のγδＴ細胞の割合を増加させるという目的から考え、樹状細胞を反応細胞よりも少なく設定することが好ましい。
【００４２】
これにより、従来の技術では、γδＴ細胞について選択・純化する工程を経なくては目的とするγδＴ細胞を得ることができなかったが、本発明の方法によれば、そのような煩雑な工程を経ることなく活性化されたγδＴ細胞を高純度に含んでいる細胞集団を大量かつ容易に回収することが可能である。また、このようにして得られた細胞集団はそのまま免疫細胞療法に用いることができ、活性化されたγδＴ細胞を該免疫細胞療法に用いた場合、腫瘍や感染症に対する高い治療効果が期待できる。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでγδＴ細胞を活性化／および増殖させることの利点としては、ビスホスホネートを直接投与する場合、複数回投与するうちに体内でのγδＴ細胞に対する反応が弱化・消失していくため、繰り返しγδＴ細胞を増殖させることができないが、γδＴ細胞を体外で活性化および／または増殖させ、投与することでこの問題が回避できる。
【００４４】
（４）第四の実施形態：本発明により得られるγδＴ細胞を含む医薬
次に前記方法で得られるγδＴ細胞を患者に投与する方法について説明する。
【００４５】
第三の実施形態に記載した方法により得られたγδＴ細胞を遠心分離法等によって回収する。
回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能であるが、この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。
【００４６】
回収されるγδＴ細胞は生理食塩水に懸濁されることで投与用製剤として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカイン等を添加することができる。
【００４７】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
【００４８】
投与する方法としては静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、所属リンパ節へ注射等により注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００５０】
実施例１
＜樹状細胞の採取及び調整＞
健常人ドナーから末梢血を３０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて単核細胞を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために数回洗浄した後，ＭＡＣＳによりＣＤ１４陽性細胞を単離した。
得られた樹状細胞前駆細胞から樹状細胞への分化誘導を行った。培地は１０％ ＦＢＳを添加したＡＩＭ−Ｖを使用し、これに５００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＭＭＵＮＥＸ）と５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を添加した。培養開始から５〜７日目で未成熟樹状細胞を得た。さらに、培養開始後５〜７日目に１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）、１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ２（ＳＩＧＭＡ）を添加して更に培養し、２４〜４８時間後の細胞を成熟樹状細胞とした。
【００５１】
実施例２
＜樹状細胞の状態の確認＞
調整して得た樹状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。測定する細胞をＰＢＳに懸濁したものに目的の抗体を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。抗体はＰＥ標識された抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ネガティブコントロールとしてそれぞれの抗体のアイソタイプを利用した。染色した細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬで測定した。
【００５２】
その結果、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４で培養した細胞はＣＤ１４、ＣＤ８３陰性、ＨＬＡ−ＤＲは陽性を示しており、未成熟樹状細胞集団であることを確認した。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＰＧＥ２で培養した細胞においては、ＣＤ１４以外は陽性を示し、成熟樹状細胞集団であることを確認した。
【００５３】
実施例３
＜樹状細胞によるγδＴ細胞の増殖＞
実施例１で調整した末梢血由来の未成熟樹状細胞、または成熟樹状細胞の懸濁液にビスホスホネート剤であるＡｒｅｄｉａ １０μＭ、Ｏｎｃｌａｓｔ １０μＭ、Ｚｏｍｅｔａ １μＭとなるように各々を添加し、約１２時間培養したものを刺激細胞（ビスホスホネートによりパルスされた樹状細胞）とした。ネガティブコントロールには、ビスホスホネートを添加せずに培養した樹状細胞を用いた。
【００５４】
これら刺激細胞５×１０５個を各々，全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）で反応細胞２×１０６個と混合培養を行った（反応細胞：刺激細胞＝４：１）。反応細胞としては実施例１でＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）を１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、凍結保存していたものを解凍、洗浄して用いた。培養は約３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間行った。
この混合培養溶液中には５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２，１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。
【００５５】
７日後に血球計算板を用いて細胞数を測定し、さらにフローサイトメーターでγδＴ細胞が占める割合を測定した。抗体はＰＣ５標識された抗ＣＤ３抗体とＦＩＴＣ標識された抗ｐａｎγ／δ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。これらの抗体を培養後の細胞をＰＢＳで洗浄したものに加え、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。ネガティブコントロールには抗ｐａｎγ／δ抗体のアイソタイプを利用した。
【００５６】
図１に示されるように、コントロール（ビスホスホネートでパルスされなかった樹状細胞）と比較して、Ａｒｅｄｉａ、Ｏｎｃｌａｓｔ、Ｚｏｍｅｔａでパルスされた樹状細胞、未成熟樹状細胞のいずれもが、共培養した細胞群内のγδＴ細胞の割合を高くすることが明らかとなった。
さらに、ビスホスホネートでパルスされた未成熟細胞の方がビスホスホネートでパルスされた成熟樹状細胞よりもγδＴ細胞の割合が高くなることが明らかとなった。
【００５７】
実施例４
＜γδＴ細胞の採取及び調整＞
健常人ドナーから末梢血を３０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核細胞を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために数回洗浄した。
【００５８】
培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）に得られた末梢血単核球を懸濁し、末梢血単核球懸濁液に濃度が１０μＭとなるようにＡｒｅｄｉａを添加した。
１４日間培養を行った。この期間中、細胞増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）と最終濃度１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。
培養した細胞の表現型をフローサイトメーターを用いて確認し、γδＴ細胞を９５％以上含む細胞群であることを確認した。
【００５９】
実施例５
＜γδＴ細胞の活性化の確認＞
ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）の各ｗｅｌｌに７０％エタノールを添加し、２分以内に除去した。
プレートの各ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。
コーティング用抗インターフェロン（ＩＦＮ）−γ抗体（クローン：１−Ｄ１Ｋ、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を１５μｇ/ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを４℃で一晩静置した。
プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。
１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を２００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、３０分間以上室温でブロッキングを行った。
ブロッキング培地を除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。
【００６０】
実施例４で得られたγδＴ細胞群を遠心分離により回収し、ＡＩＭ−Ｖにより２回洗浄した。
【００６１】
回収したγδＴ細胞３００００ｃｅｌｌｓと実施例１で得られた未成熟樹状細胞もしくは成熟樹状細胞１５０００ｃｅｌｌｓ、最終濃度が１０μＭとなるように調整したＡｒｅｄｉａを添加し、１５ｍｌチューブ（ファルコン）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間の前培養を行った。同時にγδＴ細胞のみの前培養、γδＴ細胞にＡｒｅｄｉａのみを添加した前培養、各樹状細胞のみの前培養も行った。また、培養容量は３００μｌになるように調整した。
ブロッキング後ＰＢＳで洗浄したプレートに、各条件での前培養を終えた細胞を１００μｌ/ｗｅｌｌ、３ｗｅｌｌずつに播種した。
３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
【００６２】
細胞を含む培養液を除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
検出用のビオチン標識抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン：７−Ｂ６−１、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１μｇ/ｍｌに希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを室温で２時間静置した。
ビオチン標識ＩＦＮ−γ抗体を含むＰＢＳを除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
アルカリフォスファターゼを結合したストレプトアビジン（ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１０００に希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを室温で1時間静置した。
プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
ＢＣＩＰ/ＮＢＴｐｌｕｓ基質液（Ｗａｋｏ）を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、暗所でスポットが確認できるまで静置した。
肉眼でスポットが確認されたら蒸留水で十分に洗浄した。
プレートのメンブレンが乾燥したことを確認した後、ＥＬＩＳＰｏｔリーダー(ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ)を用いてスポット数を測定し、データをＡＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３.１ (ＡＩＤ)にて解析した。
【００６３】
その結果γδＴ細胞に樹状細胞とＡｒｅｄｉａを同時に添加した場合にのみ、スポット数が増加し、スポットの強度も増すことが明らかとなった。この結果においてもビスホスホネートでパルスされた未熟樹状細胞のほうが成熟樹状細胞よりもＩＦＮ−γの産生を刺激することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上説明したように、本発明のビスホスホネートでパルスされた樹状細胞は末梢血中に含まれるγδＴ細胞を選択的に活性化および／または増殖させることができる。そのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてはγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができる組成物として利用できる。さらに、投与用組成物として患者に投与することでｉｎ ｖｉｖｏにおいてγδＴ細胞を活性化し、癌治療やウイルス感染症の治療に対する効果が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はビスホスホネート系骨代謝改善薬（以下ビスホスホネートと記す）でパルスされた樹状細胞に関する。また、該樹状細胞を含む医薬、該樹状細胞を用いた治療方法、γδＴ細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は抗原提示細胞として働き、抗原を貪食・断片化して細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）分子上に抗原エピトープとして提示する。リンパ節で、この樹状細胞とＴ細胞が接触すると、Ｔ細胞はその抗原エピトープを認識する。
【０００３】
また、Ｔ細胞には、αβＴ細胞レセプターを発現したαβＴ細胞とγδＴ細胞レセプターを発現したγδＴ細胞が存在する。αβＴ細胞は獲得免疫を中心に担っており、γδＴ細胞は結核などの特殊な細菌感染症や腫瘍に対する免疫応答のエフェクター細胞として働き、主に自然免疫を担っている。
【０００４】
最近、このγδＴ細胞が癌細胞に対する細胞傷害活性をも有していることが明らかとなり、γδＴ細胞の持つ強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の開発が注目されている。しかし、一般に血中にあるＴ細胞のうち大部分がαβＴ細胞であり、γδＴ細胞は１〜５％程度にしか過ぎない。そのため、γδＴ細胞を増やす方法として、マグネット法等で分離したγδＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養を行い生体内へ戻すことが行われている。
【０００５】
ここで、γδＴ細胞は非ペプチド抗原によっても活性化および／または増殖されることが知られており、アルキルアミン等のアルカロイド、ピロリン酸モノエステル、ビスホスホネートにより活性化および／または増殖されることが知られている。
【０００６】
なかでも、ビスホスホネートを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでのγδＴ細胞培養方法は様々な研究によって検討されているが、得られるγδＴ細胞数が十分ではなく、治療に用いることが十分に可能な量のγδＴ細胞を得ようとすると、患者からの採血量を増やすことになり、患者に対する負担も大きくなる。それ故、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ ｖｉｖｏでも容易に十分な量のγδＴ細胞を得ることができる技術の確立が望まれていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、γδＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率よく活性化および／または増殖させるための樹状細胞、該樹状細胞を含む医薬、並びに該樹状細胞を用いた治療方法および該樹状細胞を用いたγδＴ細胞培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために、研究を行った結果、γδＴ細胞に直接ビスホスホネートによる刺激を与えるのではなく、通常ＣＴＬ誘導のために用いられる樹状細胞をビスホスホネートによりパルスしたものを用いることにより、γδＴ細胞を活性化および／または増殖できることを見出し、さらに、疾病抗原ペプチドを用いて抗原特異的なαβＴ細胞を誘導する場合と異なり、意外にも、未成熟樹状細胞を用いるとより好適にγδＴ細胞を活性化および／または増殖させ得ることを見出し、本発明を完成した。
本発明により、γδＴ細胞を患者に負担をかけることなく、容易に増殖させることが可能となり、γδＴ細胞を用いた免疫細胞療法の実用化につながる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
（１）ビスホスホネートでパルスされたことを特徴とする樹状細胞、
（２）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（１）記載の樹状細胞、
（３）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（１）または（２）記載の樹状細胞。
【００１１】
（４）ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を含むことを特徴とする医薬、
（５）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（４）記載の医薬、
（６）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（４）または（５）記載の医薬。
【００１２】
（７）ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を投与することを特徴とする治療方法、
（８）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（７）記載の治療方法、
（９）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（７）又は（８）記載の治療方法、
（１０）治療が癌及び／又は感染症治療であることを特徴とする（７）〜（９）いずれかの項記載の治療方法、
（１１）前記樹状細胞が自己由来であることを特徴とする（７）〜（１１）いずれかの項記載の治療方法。
【００１３】
（１２）Ｔ細胞の培養において、ビスホスホネートでパルスされた樹状細胞を加えることを特徴とするγδＴ細胞の培養方法、
（１３）前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする（１２）記載のγδＴ細胞の培養方法、
（１４）前記ビスホスホネートがパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする（１２）又は（１３）記載のγδＴ細胞の培養方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例３の結果を示す。コントロール（ビスホスホネートでパルスされなかった樹状細胞）、Ａｒｅｄｉａ、Ｏｎｃｌａｓｔ、Ｚｏｍｅｔａでパルスされた樹状細胞と、反応細胞を共培養し、７日後血球計算板を用いて細胞数を測定し、さらにフローサイトメーターでγδＴ細胞が占める割合を測定した結果および２つの数値から算出したγδＴ細胞数を示す。
【図２】図２は、実施例５の結果を示す。グラフの縦軸はスポット数を横軸はスポットの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。ネガティブコントロールとしてγδＴ細胞のみ、γδＴ細胞＋Ａｒｅｄｉａ、樹状細胞のみのＩＦＮ−γ産生を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）第一の実施形態；本発明樹状細胞の作製
まず、本発明の樹状細胞について詳説する。
【００１６】
本発明の樹状細胞とはビスホスホネートでパルスされたことを特徴とする樹状細胞である。
【００１７】
本発明の樹状細胞としては未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞およびそれらの混合物のいずれを用いてもよいが、未成熟樹状細胞のほうがより好適にγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができるため、未成熟樹状細胞を用いるほうが好ましい。
【００１８】
また、ビスホスホネートとは、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものであればよく、その例として、パミドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばパミドロン酸二ナトリウム・五水和物（Ａｒｅｄｉａ、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばアレンドロン酸ナトリウム三水和物（Ｏｎｃｌａｓｔ、萬有製薬））、ゾレドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばゾレドロン酸ナトリウム水和物（Ｚｏｍｅｔａ、ノバルティスファーマ））、リセドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばリセドロン酸ナトリウム水和物）、イバンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばイバンドロン酸ナトリウム）、インカドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばインカドロン酸二ナトリウム）、エチドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物（例えばエチドロン酸二ナトリウム）などが挙げられる。これらの中で、とりわけパミドロン酸、アレドロン酸、ゾレドロン酸、それらの塩および／またはそれらの水和物が好ましい。
【００１９】
次に、本発明の樹状細胞の調整方法について詳説する。
【００２０】
まず、樹状細胞の前駆細胞を得るための試料を取得する。試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血などが利用できるが、入手の容易さ、患者への負担の少なさを考慮して末梢血を利用することが好ましい。
【００２１】
採血量は提供者の負担とならない程度の量を採血するのが好ましい。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採取した血液には凝固が起こらないようにヘパリンやクエン酸を加えることができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取する方法を用いれば、直接末梢血単核球を入手することが可能である。
【００２２】
次に、採取した血液から樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を分離する。方法としては有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることもできる。例えばフィコール分画つまりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配または溶出を利用する方法が、一般的に使用される。
なお、回収した細胞は血小板等を除去するために培地、生理食塩水、リン酸生理食塩水（以下ＰＢＳと記す）等を用いて数回洗浄することが好ましい。
【００２３】
次に、回収した単核細胞から樹状細胞の前駆細胞を分離する。
ＣＤ１４は樹状細胞の前駆細胞に発現しているマーカーとして知られており、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，以下ＭＡＣＳと記す）を利用して単球（ＣＤ１４陽性細胞）を単離・回収する方法が簡単でかつ細胞の回収率が高いため好ましい。
あるいは、回収した単核細胞を培養フラスコに移し，３４℃〜３８℃、より好ましくは３７℃、２％〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２の条件下で１時間以上培養し、付着細胞を樹状細胞の前駆細胞として用いる方法等を使用してもよい。
【００２４】
その後、得られた樹状細胞の前駆細胞から未成熟樹状細胞あるいは成熟樹状細胞への分化誘導を行う。培養のための培地としてＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）を使用する。
またＡＩＭ−Ｖ培地のほかに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭと記す）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社、以下ＫＢＭと記す）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭと記す）等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５〜２０％の牛血清、牛胎児血清（以下ＦＢＳと記す）、ヒト血漿等を添加することができる。
【００２５】
未成熟樹状細胞の場合、培養培地に分化誘導因子を添加し、樹状細胞の前駆細胞を培養することにより未成熟樹状細胞を得る。
分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下ＧＭ−ＣＳＦと記す）、インターロイキン４（以下ＩＬ−４と記す）、ステムセルファクター（以下ＳＣＦと記す）、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（以下ＴＮＦ−αと記す）等が効率よく未成熟樹状細胞を誘導することが可能である。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４の組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。
培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養期間は５〜７日間が好ましい。
【００２６】
また、成熟樹状細胞を得る場合には培養開始後５〜７日目にさらなる分化誘導因子を添加して更に培養する。
分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、プロスタグランジンＥ２（以下ＰＧＥ２と記す）等で効率よく成熟樹状細胞を誘導することが好ましい。必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−αの組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。
培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養時間としては２４〜４８時間が好ましい。
【００２７】
また、樹状細胞の前駆細胞として造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αとｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、あるいはトロンボポエチン（ＴＰＯ）を単独、もしくは組合せで添加し、未成熟樹状細胞もしくは成熟樹状細胞を得る方法や、血液あるいは末梢血単核球を分離したものからパーコールなどの比重液を用いて直接樹状細胞分画を回収する方法も利用することができる。
【００２８】
得られた未成熟樹状細胞、または成熟樹状細胞にビスホスホネートを添加して培養し、刺激細胞（ビスホスホネートによりパルスされた樹状細胞）を作成する。ビスホスホネートを添加する濃度は０．１μＭ〜３０μＭが好ましく、さらに好ましくは１〜１０μＭである。
また、ビスホスホネートをパルスする時間は１時間〜３６時間が好ましく、より好ましくは１２時間である。
【００２９】
このようにして得られた樹状細胞は、γδＴ細胞を活性化および／または増殖させる能力を有しているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び ｉｎ ｖｉｖｏのいずれの場合でもγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができる医薬として使用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合はγδＴ細胞活性化および／または増殖させることができる組成物として利用することが可能となる。ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合は遊離ビスホスホネートを洗浄、除去したのち、γδＴ細胞活性化および／または増殖させることができる樹状細胞ワクチンとしての使用が可能である。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いるいずれの場合にも必要に応じて例えばサイトカイン（例えばＩＬ−２）やその他タンパク質（例えばアルブミン）等を加えてもよい。
【００３０】
（２）第二の実施形態；本発明樹状細胞を含む医薬
次に、本発明の樹状細胞を用いた治療方法について説明する。
【００３１】
第一の実施形態で得られた樹状細胞を遠心分離法等によって回収する。
【００３２】
回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能であるが、この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。
【００３３】
回収された樹状細胞は生理食塩水に懸濁されることで投与用製剤として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカインを添加することができる。
【００３４】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、１０６〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０７個／人以上である。
【００３５】
投与する方法としては静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、所属リンパ節へ注射等により注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。
【００３６】
このようにして、本発明の樹状細胞を投与することにより患者体内のγδＴ細胞を活性化することができる。γδＴ細胞は非特異的細胞傷害活性を有するため、例えば、癌や感染症等、様々な治療に用いることが可能である。樹状細胞をワクチンとして用いることの利点として、ビスホスホネートを直接投与する場合、複数回投与するうちに体内でのγδＴ細胞に対する反応が弱化・消失していくため、繰り返しγδＴ細胞を増殖させることができないが、ビスホスホネートを樹状細胞にパルスし、ワクチンとして投与することでこの問題が回避できる。
【００３７】
（３）第三の実施形態；本発明樹状細胞を用いたγδＴ細胞の培養方法
次に、本発明のγδＴ細胞の培養方法について詳説する。
【００３８】
第一の実施形態で得られた樹状細胞と反応細胞を培養容器に播種する。
ここでいう反応細胞とはγδＴ細胞を含む細胞群を指す。末梢血由来の単核球等が好ましい。
【００３９】
培養容器は特に限定されるものではなく、通常、当該分野で使用される培養用プレート、シャーレ、フラスコ、バッグなどを利用することができる。各々の細胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。
【００４０】
樹状細胞、反応細胞の培養にはＡＩＭ−Ｖ培地を用いて培養する。また、ＡＩＭ−Ｖ培地のほか、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＴＩＬ、ＫＢＭ、ＩＭＥＭ等、細胞培養に使用されている市販の培地を利用することができる。さらに必要に応じて５％〜２０％の牛血清、ＦＢＳ、ヒト血漿などの血清、サイトカイン等を添加してもよい。
培養は３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養期間としては５〜８日間が好ましく、さらに７日間が好ましい。
【００４１】
播種する樹状細胞と反応細胞の数は播種する容器および用途に応じて設定することができる。また、樹状細胞と反応細胞の混合する割合は状況に応じて適宜設定することが可能であるが、反応細胞中のγδＴ細胞の割合を増加させるという目的から考え、樹状細胞を反応細胞よりも少なく設定することが好ましい。
【００４２】
これにより、従来の技術では、γδＴ細胞について選択・純化する工程を経なくては目的とするγδＴ細胞を得ることができなかったが、本発明の方法によれば、そのような煩雑な工程を経ることなく活性化されたγδＴ細胞を高純度に含んでいる細胞集団を大量かつ容易に回収することが可能である。また、このようにして得られた細胞集団はそのまま免疫細胞療法に用いることができ、活性化されたγδＴ細胞を該免疫細胞療法に用いた場合、腫瘍や感染症に対する高い治療効果が期待できる。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでγδＴ細胞を活性化／および増殖させることの利点としては、ビスホスホネートを直接投与する場合、複数回投与するうちに体内でのγδＴ細胞に対する反応が弱化・消失していくため、繰り返しγδＴ細胞を増殖させることができないが、γδＴ細胞を体外で活性化および／または増殖させ、投与することでこの問題が回避できる。
【００４４】
（４）第四の実施形態：本発明により得られるγδＴ細胞を含む医薬
次に前記方法で得られるγδＴ細胞を患者に投与する方法について説明する。
【００４５】
第三の実施形態に記載した方法により得られたγδＴ細胞を遠心分離法等によって回収する。
回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能であるが、この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。
【００４６】
回収されるγδＴ細胞は生理食塩水に懸濁されることで投与用製剤として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカイン等を添加することができる。
【００４７】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
【００４８】
投与する方法としては静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、所属リンパ節へ注射等により注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００５０】
実施例１
＜樹状細胞の採取及び調整＞
健常人ドナーから末梢血を３０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて単核細胞を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために数回洗浄した後，ＭＡＣＳによりＣＤ１４陽性細胞を単離した。
得られた樹状細胞前駆細胞から樹状細胞への分化誘導を行った。培地は１０％ ＦＢＳを添加したＡＩＭ−Ｖを使用し、これに５００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＭＭＵＮＥＸ）と５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を添加した。培養開始から５〜７日目で未成熟樹状細胞を得た。さらに、培養開始後５〜７日目に１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）、１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ２（ＳＩＧＭＡ）を添加して更に培養し、２４〜４８時間後の細胞を成熟樹状細胞とした。
【００５１】
実施例２
＜樹状細胞の状態の確認＞
調整して得た樹状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。測定する細胞をＰＢＳに懸濁したものに目的の抗体を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。抗体はＰＥ標識された抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ネガティブコントロールとしてそれぞれの抗体のアイソタイプを利用した。染色した細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬで測定した。
【００５２】
その結果、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４で培養した細胞はＣＤ１４、ＣＤ８３陰性、ＨＬＡ−ＤＲは陽性を示しており、未成熟樹状細胞集団であることを確認した。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＰＧＥ２で培養した細胞においては、ＣＤ１４以外は陽性を示し、成熟樹状細胞集団であることを確認した。
【００５３】
実施例３
＜樹状細胞によるγδＴ細胞の増殖＞
実施例１で調整した末梢血由来の未成熟樹状細胞、または成熟樹状細胞の懸濁液にビスホスホネート剤であるＡｒｅｄｉａ １０μＭ、Ｏｎｃｌａｓｔ １０μＭ、Ｚｏｍｅｔａ １μＭとなるように各々を添加し、約１２時間培養したものを刺激細胞（ビスホスホネートによりパルスされた樹状細胞）とした。ネガティブコントロールには、ビスホスホネートを添加せずに培養した樹状細胞を用いた。
【００５４】
これら刺激細胞５×１０５個を各々，全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）で反応細胞２×１０６個と混合培養を行った（反応細胞：刺激細胞＝４：１）。反応細胞としては実施例１でＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）を１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、凍結保存していたものを解凍、洗浄して用いた。培養は約３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間行った。
この混合培養溶液中には５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２，１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。
【００５５】
７日後に血球計算板を用いて細胞数を測定し、さらにフローサイトメーターでγδＴ細胞が占める割合を測定した。抗体はＰＣ５標識された抗ＣＤ３抗体とＦＩＴＣ標識された抗ｐａｎγ／δ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。これらの抗体を培養後の細胞をＰＢＳで洗浄したものに加え、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。ネガティブコントロールには抗ｐａｎγ／δ抗体のアイソタイプを利用した。
【００５６】
図１に示されるように、コントロール（ビスホスホネートでパルスされなかった樹状細胞）と比較して、Ａｒｅｄｉａ、Ｏｎｃｌａｓｔ、Ｚｏｍｅｔａでパルスされた樹状細胞、未成熟樹状細胞のいずれもが、共培養した細胞群内のγδＴ細胞の割合を高くすることが明らかとなった。
さらに、ビスホスホネートでパルスされた未成熟細胞の方がビスホスホネートでパルスされた成熟樹状細胞よりもγδＴ細胞の割合が高くなることが明らかとなった。
【００５７】
実施例４
＜γδＴ細胞の採取及び調整＞
健常人ドナーから末梢血を３０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核細胞を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために数回洗浄した。
【００５８】
培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）に得られた末梢血単核球を懸濁し、末梢血単核球懸濁液に濃度が１０μＭとなるようにＡｒｅｄｉａを添加した。
１４日間培養を行った。この期間中、細胞増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）と最終濃度１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。
培養した細胞の表現型をフローサイトメーターを用いて確認し、γδＴ細胞を９５％以上含む細胞群であることを確認した。
【００５９】
実施例５
＜γδＴ細胞の活性化の確認＞
ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）の各ｗｅｌｌに７０％エタノールを添加し、２分以内に除去した。
プレートの各ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。
コーティング用抗インターフェロン（ＩＦＮ）−γ抗体（クローン：１−Ｄ１Ｋ、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を１５μｇ/ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを４℃で一晩静置した。
プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。
１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を２００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、３０分間以上室温でブロッキングを行った。
ブロッキング培地を除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。
【００６０】
実施例４で得られたγδＴ細胞群を遠心分離により回収し、ＡＩＭ−Ｖにより２回洗浄した。
【００６１】
回収したγδＴ細胞３００００ｃｅｌｌｓと実施例１で得られた未成熟樹状細胞もしくは成熟樹状細胞１５０００ｃｅｌｌｓ、最終濃度が１０μＭとなるように調整したＡｒｅｄｉａを添加し、１５ｍｌチューブ（ファルコン）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間の前培養を行った。同時にγδＴ細胞のみの前培養、γδＴ細胞にＡｒｅｄｉａのみを添加した前培養、各樹状細胞のみの前培養も行った。また、培養容量は３００μｌになるように調整した。
ブロッキング後ＰＢＳで洗浄したプレートに、各条件での前培養を終えた細胞を１００μｌ/ｗｅｌｌ、３ｗｅｌｌずつに播種した。
３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
【００６２】
細胞を含む培養液を除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
検出用のビオチン標識抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン：７−Ｂ６−１、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１μｇ/ｍｌに希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを室温で２時間静置した。
ビオチン標識ＩＦＮ−γ抗体を含むＰＢＳを除去し、プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
アルカリフォスファターゼを結合したストレプトアビジン（ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１０００に希釈し、１００μｌ/ｗｅｌｌ添加した。
プレートを室温で1時間静置した。
プレートを２００μｌ/ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。
ＢＣＩＰ/ＮＢＴｐｌｕｓ基質液（Ｗａｋｏ）を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、暗所でスポットが確認できるまで静置した。
肉眼でスポットが確認されたら蒸留水で十分に洗浄した。
プレートのメンブレンが乾燥したことを確認した後、ＥＬＩＳＰｏｔリーダー(ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ)を用いてスポット数を測定し、データをＡＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３.１ (ＡＩＤ)にて解析した。
【００６３】
その結果γδＴ細胞に樹状細胞とＡｒｅｄｉａを同時に添加した場合にのみ、スポット数が増加し、スポットの強度も増すことが明らかとなった。この結果においてもビスホスホネートでパルスされた未熟樹状細胞のほうが成熟樹状細胞よりもＩＦＮ−γの産生を刺激することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上説明したように、本発明のビスホスホネートでパルスされた樹状細胞は末梢血中に含まれるγδＴ細胞を選択的に活性化および／または増殖させることができる。そのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてはγδＴ細胞を活性化および／または増殖させることができる組成物として利用できる。さらに、投与用組成物として患者に投与することでｉｎ ｖｉｖｏにおいてγδＴ細胞を活性化し、癌治療やウイルス感染症の治療に対する効果が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスされたことを特徴とする樹状細胞。
【請求項２】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬がパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の樹状細胞。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の樹状細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
癌及び／又は感染症治療用の請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記樹状細胞が投与する患者由来であることを特徴とする請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌及び／又は感染症治療のための医薬の製造のための、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の樹状細胞の使用。
【請求項８】
Ｔ細胞の培養において、ビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスされた樹状細胞を加えることを特徴とするγδＴ細胞の培養方法。
【請求項９】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項８に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬がパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする請求項８又は９に記載の培養方法。
【請求項１】
ビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスされたことを特徴とする樹状細胞。
【請求項２】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬がパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の樹状細胞。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の樹状細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
癌及び／又は感染症治療用の請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記樹状細胞が投与する患者由来であることを特徴とする請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌及び／又は感染症治療のための医薬の製造のための、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の樹状細胞の使用。
【請求項８】
Ｔ細胞の培養において、ビスホスホネート系骨代謝改善薬でパルスされた樹状細胞を加えることを特徴とするγδＴ細胞の培養方法。
【請求項９】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項８に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬がパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、および／またはそれらの水和物であることを特徴とする請求項８又は９に記載の培養方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１９１９５２（Ｐ２０１２−１９１９５２Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５１９７０（Ｐ２０１２−１５１９７０）
【出願日】平成２４年７月６日（２０１２．７．６）
【分割の表示】特願２００６−５２９１００（Ｐ２００６−５２９１００）の分割
【原出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月６日（２０１２．７．６）
【分割の表示】特願２００６−５２９１００（Ｐ２００６−５２９１００）の分割
【原出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
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