微小なタンパク質デバイス、その製造方法、及び止血のためのこのような装置の使用。
ヒト又は動物起源由来の血清アルブミンのような生体座利用により製造されるデバイスは、任意の次元において５ミクロン未満であり、通常、直径１ミクロン未満である。それは、試験管内でそれに結合する、任意の他の生物学的分子又は薬剤分子を含まない。しかし、前記デバイスは、試験管内で血漿に暴露した後に、凝固因子又は潜在的な他の薬剤のような修飾分子を捕獲、濃縮又は輸送することを可能にする性質を有する。前記デバイスを身体に静脈注射により注入した後、止血効果が示される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈内投与に適した生物材料で構成されている微小粒子装置、その製造方法及び病状を治療するための体内におけるこのような装置の使用に関する。すなわち、それ自体不活性であるが、血中に既にある生体分子又は薬剤分子を捕獲、濃縮又は輸送するための装置としての機能を果たし、該装置と、捕獲した生体分子又は薬剤分子との組み合わせが、予想外又は向上した薬理効果を有し得るような、任意の次元において５ミクロンより小さいタンパク質粒子の分野に関する。
【０００２】
１種の特定用途は止血の分野にあり、ここで、静脈注射後に装置が、体内の分子、例えば単一成分又は種々の凝固因子を捕獲し得、血液損失の減少又は出血時間の短縮（改善）を可能にする装置及び生体分子の組み合わせを提供する。内因性分子の捕獲のメカニズムは未知であり、医学的な利点の正確なメカニズムも未知である。
【０００３】
これらの装置は、不十分な血小板濃度血小板機能の低下を煩っている患者、又は他の原因による出血傾向のある患者に大きな利点を期待させる。利益を受けることが期待される患者には、希釈性血小板減少症（ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）に由来する血小板減少性患者、癌、癌治療に由来する血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、臓器移植患者、抗凝血薬の過剰摂取、並びにエボラ熱又はデング熱の発生のような出血症状の発現が含まれる。これらの装置は、術中の出血が多量であると予想されるが、赤血球又は血小板の輸血サービスを欠いている外科患者；輸血サービスが困難である戦場状態におけるような、潜在的に治療及び予防用途のために用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
薬剤投与の従来の方法には、経口投与、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、吸入経路、鼻及び粘膜塗布が含まれる。Ｙｅｎを含む多数の著者が、特に静脈注射後の、薬剤の全身性毒性を減少し、及び／又は作用部位における有効性を向上するために、特定の器官又は部位を標的として送達する目的で、薬剤がタンパク質球の表面又は内部に封入され得る製造法及び製品を開示している。
【０００５】
米国特許第５，０６９，９３６号（タンパク質ミクロスフェアの製造）において、Ｙｅｎは２種の方法によるアルブミン球体の製造方法を開示している（カラム４、３５行〜カラム５、２８行）。両方の方法とも、タンパク質溶液からの球体の形成前にタンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えることの重要性を強調している。第一の方法（「プレ−リンク」法）は、球体を形成するための脱可溶化又は脱溶媒和剤（エタノール等）の添加前に、ゲルを形成することなく、溶液中で穏やかにタンパク質分子を架橋するのに十分な濃度で架橋剤を用いている。しかし、この架橋剤の濃度は、たとえ、後に脱溶媒和剤を希釈又は除去したとしても、球体の形状で不可逆的に一緒にタンパク質を結合し得る。他の方法（「ポスト−リンク」法）は、最初にタンパク質溶液に脱可溶化剤を加えることにより球体を（可逆的又は不可逆的に）形成する。この工程は、その後に（脱溶媒和剤を希釈又は除去する時）、更なる工程の間の再溶解に対して球体を安定化するのに十分な濃度で架橋剤を添加する必要がある。
【０００６】
米国特許第５，０６９，９３６号は、タンパク質球体の製造方法を開示するのみでなく、開示されたいずれかの方法により製造された球体が、患者への投与前に、架橋剤（例えば、ＩｇＧ、実施例７、カラム２９）による球体への薬剤の共有結合によって、他の生体分子は薬剤分子を結合するために用い得ることを教示している。これは、基本的に、球体が形成され、再溶解に対して不可逆的に安定化された後に、追加量の架橋剤分子（グルタルアルデヒド等）を加えることにより達成される。この架橋剤を追加する追加工程は、追加の分子が球体に結合することを意図しており、球体自体の形成又は安定化を意図していなかった。生体分子又は薬剤分子（球体の内部又は表面）と共有結合する、このような球体の生物学的活性は、全体的に結合した生体分子又は薬剤分子に由来する。実際、コントロールの「ブランク」球体（すなわち、生物学的修飾のないタンパク質ミクロスフェア、実施例９、カラム３１）は、アドリアマイシンのような可溶化薬剤、又は球体に封入された同じ薬剤（アドリアマイシン）と比較し、効果を有しないことが証明された。
【０００７】
本発明は、球体の形成前にタンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えるか含ませる必要のない、一連の新規なタンパク質の球体の製造方法を開示する。製造された球体懸濁液は、患者に静脈注射した時に毛細管を詰まらせ得る、凝集体を含まず、大きい球体（直径において５ミクロンより大きい）を含まない、単分散した球体である。
【０００８】
本発明を用いて製造された生成物の他の利点は、その小さいサイズである。本発明を用いて製造することのできる球体は直径が１ミクロンより小さいので、長く保存する間に沈殿せず、懸濁液中に残存する傾向にある。従って、先行技術において開示された方法を用いて製造された製剤では必要であった、懸濁液を凍結乾燥する必要がない。先行技術を用いて製造された生成物を用いた凍結乾燥の高価な工程があっても凍結乾燥粉末を液体で再構成することにより、先行技術により製造した大きな球体は懸濁液から、未だに沈殿し、いつか後にケーキを形成する。
【０００９】
本発明において開示される一連の新規な方法を用いて製造される球体の他の特性は、血小板減少症からの出血の治療に有効である。本出願において開示されるべき製造方法における、特定の変化により、コントロール又は「ブランク」の球体が血小板減少症の動物に静脈注射された後に止血効果を示すことは全く予期されていない。これらの球体は、合成手順の間に、それらに結合する、任意のフィブリノーゲン又は他の凝固物（又は他の薬剤）を有していなかった。また、長期間、懸濁液として室温に維持した後の、本発明の新規な方法により製造された球体は、有効なままであった。
【００１０】
本発明を用いて製造された、これら新規な「ブランク」球体又は顕微鏡的装置による、血小板減少症の動物の出血時間の短縮のメカニズムは未知である。人は、多くの組み合わせにおける多くの凝固因子のような、生体内において生体分子と結合するこれら新規な装置の能力を含む、理論的に多くのメカニズムを推論することができる。このような装置を体内に注入した後に、このような分子の潜在的な結合が生じる。仮説的に、球体に自発的に結合する生体分子の正確な同一性及び濃度は確認することが困難であり、分子は循環する血液に由来し、体外において試験管内で加えられないので、このような球体は、基本的に装置として供給される。装置は、臨床効果をもたらすための適切な生体分子を捕獲し、又は濃縮し、又は輸送するための明らかに適切な特性を有している。しかし、装置は、生体内で導入される適切な追加分子なしで、それ自身で任意の臨床効果を有しないと予想される。
【００１１】
装置と効果的な分子との、この仮説的な組み合わせ（以後、「活性化装置」と呼ぶ）も未知であるが、傷口に対して装置を標的とし、若しくは内在性血小板機能（血小板減少症状態において、又は正常な血小板濃度を有する患者において）又は未知の多くのメカニズムを強化することができる。
【００１２】
他の特許、米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号（「フィブリノーゲンで被覆したミクロスフェア」）において、Ｙｅｎは、安定化アルブミン球体にフィブリノーゲンが付着した生成物及びその製造方法を開示している。また、球体は、脱溶媒和剤を加える前に、タンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤を加えて製造された。しかし、開示された製造方法は、サイズがあまりに大きい、球体の少数集団を有する球体の懸濁液をもたらす。特許は、球体にフィブリノーゲン分子を加える前又は後における、「大きい粒子」（毛細血管を詰まらせるであろう、７μｍより大きい直径、カラム８）を除去するためのろ過又は遠心分離の使用を開示している。一方、本発明により製造される球体は、全て５ミクロンより小さく、その結果、懸濁液をろ過又は遠心分離工程に供する必要がない。特に、本発明に対する重要な関連性は、米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号における、前記開示された方法により製造された、フィブリノーゲンを加えずに製造されたアルブミン球体である、「コントロール球体」（ＣＳ）の効果の欠如である。ＣＳは、（案の定）出血時間の修正（図６）又は血小板減少症のウサギ中での血液損失量（図７Ｂ）において生体内活性を示さなかった。ヒト血小板を用いたＣＳ混合物を凝集させるＡＤＰを用いた試験管内試験は、ヒト血小板が純粋な血小板が凝集体を形成する間、ＣＳの関与を示さなかった。
【００１３】
従って、フィブリノーゲン又は他の凝固因子のような生物学的修飾分子を試験管内で添加しないで、タンパク質球体を製造する本明細書に開示される新規な方法が、生体内での生物学的及び臨床効果をもたらし得ることは、全体的に予想外であり新規である。
【００１４】
このような効果のメカニズムを調査する試みは、いくつかの理由のために有益である：（１）血小板の断片、内皮細胞の残骸及び他のタンパク質凝集体のような小さい粒子を含む、注入された被験者の循環区画に由来する融合タンパク質粒子を回収することは困難であり；（２）任意の回収した粒子は、単に、粒子の注入した集団の画分である。毛細血管及び血管壁の近くに、流体力学的に小さい粒子が流れているが、大きい粒子は血管の中心を流れていることは周知である。回収した粒子において実施されたあらゆる試験は、おそらく装置の元の集団ではなく、循環区画の中心の近くから集めた粒子の回収された集団の特性を示しただけである；（３）生体内で装置に付着するようになる生物学的に修飾された分子は、生物学的修飾分子を血液画分から得られる。それは、分離後、特に可溶性血漿タンパク質及び他の血液成分、例えば赤血球及び血小板を除去するように設計された精製工程後に粒子から分離される。
【００１５】
しかし、試験管内での試験は、試験管内で血漿又はフィブリノーゲン溶液と混合した時に結合し得る粒子状装置に関して、ある程度の見識を提供し得る。これらは、各実施例が以下の項において開示されるように議論されるであろう。
【００１６】
他の特許（米国特許第５７２５８０４号、「治療及び診断用途のための非架橋タンパク質粒子」）において、Ｙｅｎは、脱溶媒和剤の除去又は希釈により再溶解されない球体の製造方法を開示している。安定化のメカニズムは未知であるが、多くの関係のない化学物質又は薬剤を加えることにより達成することができる。その特許の特別の目的は、あらゆる製造工程において架橋剤の存在又は添加なしで、どのようにして非架橋剤が球体を安定化させることができるかを教示することであるので、この先行技術は当業者のために、非架橋剤が用いられる方法で架橋剤を用いる動機付けを提供しない。従って、本明細書に開示される一連の方法が、タンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤を加えることなく球体懸濁液を製造することができ、架橋された球体が所望の特性及び臨床効果を有するという結果は予想外であり、新規かつ非自明である
【００１７】
公開されたＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｖｏｌ ５，ｓｕｐｐ１，Ａｕｇ，２００７の要約において、Ａｐｐｌｅｂｙらは、フィブリノーゲン結合ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ）に結合する、ヒトアルブミン微小粒子を用いた、「血小板代替物」の設計を開示している。従って、フィブリノゲンの微小粒子への直接的結合に代え、これらの研究者らは中間体ペプチド（ＧＰＲＰ）を微粒子に結合させた。フィブリノーゲンの微小粒子への間接的結合のアプローチは明らかに新規でない。公開されたデータは、粒子（例えば、赤血球）及びフィブリノーゲン分子に由来する断片の間の連結が、粒子（血球と呼ばれる）と血小板との付着を促進し得ることを示した（Ｃｏｌｌｅｒ ＢＳらによる”Ｔｈｒｏｍｂｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １９９２，８９：５４６−５５５を参照されたい）。対照的に、本発明に対する以下に示すデータは、試験管内又は生体内のいずれかで球体にフィブリノーゲンを結合させるために、本発明を用いて製造された球体には中間体分子が必要でないことを示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第５，０６９，９３６号
【特許文献２】米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号
【特許文献３】米国特許第５７２５８０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
以下の全ての方法は、球体を製造するための脱溶媒和剤の添加前に、タンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えない。いくつかの名称は先行技術に開示されたものと同様であるが、これら新規な方法を用いて製造された生成物は、先行技術において製造されたものとは異なる。名称は、方法又はこの方法により製造される生成物を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
１．「プレ−リンク（ｐｒｅ−ｌｉｎｋ）」は、脱溶媒和剤を加える前に、タンパク質溶液に架橋剤を加えることを意味する。この方法において、可溶剤は、水分子に囲まれたタンパク質分子の部位に結合し、タンパク質分子は最も自然な状態に折りたたまれる。次いで、脱溶媒和剤を加えると、可溶剤と結合したタンパク質分子は、一緒に球体を形成する。
【００２１】
２．「ミド−リンク（ｍｉｄ−ｌｉｎｋ）」は、架橋剤が、最初に脱溶媒和剤と予備混合され、次いで、混合物をタンパク質溶液に加えることを意味する。このケースにおいては、タンパク質分子と架橋剤との相互作用時間は脱溶媒和剤との時間と同じである。この方法においては、それらに隣接する分子としての他のタンパク質分子を有する（水和の水により部分的に包囲され）ものと同様に、架橋剤は、溶液中、いくつかの個々のタンパク質分子と結合する（水和の水により包囲される）。球体が、脱溶媒和剤と予備混合した架橋剤との同時作用下の工程中にあるので、それらが一緒にあるか、又はまだ一緒にないかのように、いくつかのタンパク質分子が、（完全又は部分的）に結合した架橋剤を既に有していると考えられる。追加の架橋剤は、基本的に球体が形成された後に球体に結合すると考えられる。タンパク質分子の立体構造を変える近くの隣接する分子（水和の水に代え）としての他のタンパク質分子を有するので、架橋剤のための結合部位は、前記「プレ−リンク」法又は後述する他の方法により架橋剤により結合するタンパク質部位とは異なっている。
【００２２】
３．「ポスト−リンク（Ｐｏｓｔ−ｌｉｎｋ）」脱溶媒和剤をタンパク質溶液に加え、球体が形成された後に架橋剤を加えることを意味する。このケースにおいては、球体の混濁溶液に架橋剤を加え、そうでなければ、脱溶媒和剤が希釈又は除去される場合に再溶解される。このケースにおいては、架橋剤は、既に球体として集合したタンパク質分子の部位に結合するであろう。架橋剤による結合部位は、前記「プレ−リンク」又は「ミド−リンク」法、若しくは後述する他の方法で用いられる時の架橋剤による結合のために利用できるタンパク質部位とは異なっている。
【００２３】
「バイ−リンク（Ｂｉ−ｌｉｎｋ）」は、架橋剤が２種の別個の工程に加えられることを意味する。最初の工程は、タンパク質溶液に、低濃度の架橋剤溶液を短時間で加えることを含む。この、安定でない濃度（ｓｕｂ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の架橋剤は、脱溶媒和剤の希釈又は除去による球体の再溶解を防止するのに十分でないが、懸濁液中で、大部分の球体より大きい、球体の小数集団の形成を防止する有益な高価を有する。次いで、脱溶媒和剤を添加し、脱溶媒和剤の除去又は希釈による再溶解から球体を保護する安定濃度の架橋剤を添加する第二工程が続く。また、球体の形成前及び球体の形成後に架橋剤により結合するためのタンパク質分子の部位はこの項において言及される他の全ての方法とは異なっている。
【００２４】
「バイミド−リンク（ＢｉＭｉｄ−ｌｉｎｋ）」は、架橋剤を２回の別個の工程において加えることを意味する。バイ−リンク法のような、第一の工程は、安定でない濃度の架橋剤を、短時間でタンパク質溶液に加えることを含む。第二工程は、脱溶媒和剤と予備混合した、安定濃度の架橋剤を加えることを含む。この方法の利点は、形成された大部分の球体と比較し、異常なサイズの球体の検出可能な任意の小数集団の球体を有しないことであり、バイ−リンク法と比較し、添加又は混合物小数の工程がある。架橋剤が、脱溶媒和剤と予備混合されるので、一工程で混合物をタンパク質溶液に加え（安定でない濃度の架橋剤と予備処理）、球体を形成する。前記で議論したように、タンパク質分子上の架橋剤による結合部位は、この項において言及される他の方法により生成するものとは異なっている。
【００２５】
本発明は、新規な微小なタンパク質装置及びその製造方法、並びに止血のためのこのような装置の使用に関する。ヒト又は動物源に由来する血清アルブミンのような生体物質で製造された装置は、いずれの次元においも５ミクロン未満であり、通常、直径１ミクロン未満である。試験管内でそれに結合する任意の他の生物学的又は薬剤分子を有していない。しかし、該装置は、又は試験管内（及び潜在的に同様に生体内において）で血漿に暴露された後、凝固因子又は潜在的に薬剤のような生物学的修飾分子を捕獲、濃縮、輸送又は結合することを可能にする特性を有する。前記装置を静脈注射により体内に注入した後、止血効果を示すことができる。前記タンパク質装置を注入された血小板減少症の動物は、改善した止血時間を示し、外科創傷に由来する血液損失を少なくする。前記タンパク質装置の注入後に正常な血小板数を有する動物は、また、接種した場合に血液損失又は出血の傾向があることが予想される。生物学的に修飾された分子の提案される結合メカニズムは未知であり、医学的利点のメカニズムも、また未知である。
【００２６】
実施例１における、この開示及び記載により、種々の製造業者から購入したヒト血清アルブミン溶液が賦形剤溶液の組成において異なり、同じ製造方法を用いて同様の球体懸濁液をもたらさないことがわかった。特に、界面活性剤の添加を必要としない新規な合成方法が、直径５ミクロンより大きい球体を有さないか、凝集体が存在しない懸濁液をもたらすことがわかった。
【００２７】
実施例２における、この開示及び記載により、タンパク質球体の合成方法が非常に効果的であることがわかった。架橋剤が、脱溶媒和剤と予備混合されるので、この方法はミド−リンク法と呼ばれた。次いで、混合物を追加の界面活性剤の非存在下にタンパク質溶液に加え、有用な球体懸濁液を形成した。
【００２８】
実施例３における、この開示及び記載により、ミド−リンク法の更なる改良が、直径５ミクロンより大きい球体のない懸濁液を製造し得ることがわかった。これは、先行技術の方法により製造された、血管を詰まらせ得る大きい球体をろ過又は除去する必要のない球体の製造を可能にする。
【００２９】
実施例４における、この開示及び記載により、いずれも追加の界面活性剤をタンパク質溶液に存在させる必要のない、新規なポスト−リンク及びミド−リンク法により製造された球体が試験管内でフィブリノーゲンと結合し得ることがわかった。
【００３０】
実施例５における、この開示及び記載により、架橋剤の追加を２回の別個の工程に分けることにより、他の新規な球体の製造方法は、懸濁液の合成の間の大きな球体又は粒子の形成を減少するという意外な効果を有することがわかった。第一工程は、溶媒和剤を希釈することにより球体の再可溶化を防止するのにそれ自体では不十分であった、ある濃度の架橋剤を用いることを含む。第二工程は、再度の溶解から球体を不可逆的に安定化するために、ある濃度の架橋剤を混濁懸濁液に加えることを含む。
【００３１】
実施例６における、この開示及び記載により、試験管内で血漿に暴露された場合、プレ−リンク球体は、追加の架橋剤を加えることなしに、１種以上の凝固因子と自発的に結合することができることがわかった。
【００３２】
実施例７における、この開示及び記載により、新規なバイ−リンク法がフィブリノーゲンと結合し得る球体をもたらし得ることがわかった。
【００３３】
実施例８における、この開示及び記載により、試験管内でフィブリノーゲンでコーティングされたバイ−リンク球体と、試験管内でフィブリノーゲンでコーティングされていないものとが、血小板減少症のウサギにおける出血時間の改善においていずれも効果のあることがわかった。タンパク質溶液中に界面活性剤を加えることを含むが、試験管内でフィブリノーゲンを加えない方法を用いた先行技術により製造されたコントロールのポスト−リンク球体が、血小板減少症のウサギにおいて繰り返して薬効を示さないので、これは最も予想外の結果であった。
【００３４】
実施例９における、この開示及び記載により、ブランクプレ−リンク及びブランクバイ−リンク球体（すなわち、試験管内でフィブリノーゲンを加えない球体）が、血小板減少症のウサギの出血時間の改善において効果的であることがわかった。
【００３５】
実施例１０における、この開示及び記載により、球体が、最終滅菌の手段としての極度の静水圧に暴露され得ることがわかった。この過程は懸濁液を損傷せず、血小板減少症のウサギの治療における効果を残存していた。
【００３６】
実施例１１における、この開示及び記載により、塩濃度の低い、透析したヒト血清アルブミンを用いることにより、懸濁液中で高濃度の球体を得ることができる。
【００３７】
実施例１２における、この開示及び記載により、本発明の新規な合成方法を用いて、透析したヒト血清アルブミンから製造した球体が、先行技術に開示されたものと異なることがわかった。
【００３８】
実施例１３における、この開示及び記載により、血漿中で低濃度のフィブリノーゲンに暴露された場合に、新規なミド−リンク法により製造された球体が、血漿に由来するフィブリノーゲンを捕獲、濃縮及び結合することができ、その結果、ブランクの球体が、なぜ血小板減少症のウサギの治療における装置として供給され得るかの洞察を提供することがわかった。
【００３９】
実施例１４における、この開示及び記載により、ミド−リンク法を大量生産法に向けて容易に適応することができ、得られた球体を、血小板減少症のウサギの出血時間の改善における効果を維持する間、６０℃に１０時間加熱することにより最終的に滅菌することができることがわかった。
【００４０】
実施例１５における、この開示及び記載により、新規なバイミド−リンク法が、基本的に、通常は大きいサイズの球体の少数集団でないサイズで非常に均一に球体を製造することができることがわかった。球体は、フィブリノーゲンでコーティングされるかコーティングされないで試験管内で製造することができる。この方法により製造された両方のタイプの球体が、血小板減少症の動物の出血の治療において有効であることがわかった。
【００４１】
この開示により、血小板減少症又は血小板機能障害に由来する出血の新規治療法が、本発明により製造されるように、製造工程の間、試験管内でフィブリノーゲンを加えない、微小な生物学的装置の注入に達成することができることがわかった。
【００４２】
この開示により、血小板減少症又は血小板機能障害に由来する出血の新規治療法が、本発明により製造されるように、製造工程の間、試験管内でフィブリノーゲンを加える、微小な生物学的装置の注入に達成することができることがわかった。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
患者（ヒト及び動物）は種々の理由のために出血し得る。１つの理由は、外傷からのような又は外科の間の外部損傷である。希釈性血小板減少症、全血の大部分の損失後の血小板の注入なしでの赤血球の置換のみの結果としての出血状態は、周術期出血の非常にありふれた原因である。
【００４４】
出血の他の理由は、凝固系における関節内障により、これは、遺伝子異常又はウイルス感染又は薬剤の結果であり得る。これは、内部器官における長期間の出血又は過剰量の血液損失を導くであろう
【００４５】
凝固系は、共同して機能する主に２つの系からなる。一般に公知なものは、主に凝固因子を含む可溶性システムである。あまり周知でない系は非常に小さいが、血液中で可視のままであり、通常、容積中、７．４〜１０．４ファモリットル（立法マイクロメートル）の範囲である。本発明は、主に血小板の機能を模倣することができる、小さい球体の製造及び使用に関し、どうかすると「人工粒子」と考えられる。
【００４６】
凝固因子は、（カスケード又は増幅系により）傷口の周囲で活性化されるようになり、傷口を「塞ぐ」ための不溶性の「フィブリン塊」を形成するであろう、血液中に溶解しているタンパク質分子である。しかし、このシステムのみを用いて、この種類の可溶化システムについて安定な不溶性の塊を形成するにはいくらかの時間がかかる。血小板系である、より高速の系は、傷口の周囲で活性化される場合、不活性な血小板（既に小さい粒子である）を数秒で活性化血小板に変化させることができる。血小板活性化の主要な生化学的事象は、血小板表面への凝固因子の結合、特にフィブリノーゲン（第Ｉ因子）の結合である。血小板結合フィブリノーゲンが、活性化血小板表面上でフィブリンに変化し得る速度は、血液中の（血小板に結合していない）可溶性フィブリノーゲンがフィブリンに変化する速度よりも速い。従って、離れているが、２種の系は、一緒に機能して傷口の周囲で効率的に塊を形成する。当然、活性化血小板により実施される多くの他の重要な機能があり、これは、血小板の詳細な知識を有する当業者が離解するであろう。
【００４７】
血小板の濃度は非常に重要である。健康なヒト患者においては、血小板の正常範囲は１３０〜１４０（×１０００）個の血小板／１μＬの血液である。不十分な濃度の血小板に悩まされている患者（ヒト又は動物）は、長い「出血時間」（自発的に出血を止めるための傷口のためにとられる時間）及び「出血量」（出血時間の間の血液損失容量）を伴うであろう。血小板減少症は、十分な血小板を有しない患者の病状を表わす医学用語である。この病状は、血小板の骨髄の生産能力を損傷する癌により、又は癌の治療から引き起こされ得る。
【００４８】
血小板減少症の患者が長い出血時間を伴う理由は、最終的に血小板プラグを形成するために物理的に連結するために、お互いに（低濃度のため）届くための活性化血小板の無能であると記載される場合がある。従って、ある方法で空間を満たすことができ、血小板プラグの形成工程の間、活性化血小板と結合し、又は活性化血小板を用いて凝集体を形成する手段を供給する人工的な血小板生成物は、内科及び外科の患者にとって非常に重要であろう。人工血小板の生成の１つのアプローチは、ボディが血小板として考慮され、「模倣される」、相溶性のあるタンパク質球体の表面へのフィブリノーゲンの結合である。フィブリノーゲン分子を、製造工程の間に試験管内で球体に加えることができ、又は患者に「ブランク」の球体を投与した後、生体内で球体に加えることができる。低濃度の血小板中における任意の内因性血小板機能の刺激凝固系の生化学における当業者にとって明らかな任意の他のメカニズムのような、人工粒子による作用の他のメカニズムは当然に可能である。
【００４９】
患者は、しばしば、脳卒中又は心発作の病歴を伴う患者におけるような、血小板プラグの形成を防止するための抗血小板薬が与えられる。アスピリン、及びＡｇｇｒａｓｔａｔ（チロフィバン）、Ａｇｒｙｌｉｎ（アナグレリド）、Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ（エプチフィバチド）， Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ（ジピリダモール）、Ｐｌａｖｉｘ（クロピドグレル）、Ｐｌｅｔａｌ（シロスタゾール），ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、Ｔｉｃｌｉｄ（チクロピジン）、Ｖｅｎｔａｖｉｓ（イロプロスト）のような抗血小板薬が、いくつかの具体例である。薬剤は、通常、血小板濃度（又は血小板数）に影響をしないが、血小板機能に影響する。患者は血小板減少症と呼ばれ得る。しかし、正常な血小板生産能力を有する身体が、骨髄から機能的血小板を連続的に生産するので、ある医師は、このような抗血小板薬が誘導する血小板減少症状態を「機能性血小板減少症」と考え：新たに生産され、影響を受けない血小板の低濃度はまだ機能し得るが、十分な数ではない。従って、人工血小板生成物はこれらの条件下でも機能し得る。
【００５０】
時々、抗血小板薬を服用している患者は過剰投与になり得、又は患者は緊急手術が必要になり得る。現在、抗血小板薬のための拮抗薬の準備はない。抗血小板生成物は、機能性血小板減少症を改善するために注入され得る。
【００５１】
本発明のような人工血小板生成物は、まだ、血小板減少症又は血小板細胞変性でない患者の予防的治療として与えられる時、患者の止血状態を改善し得ることが期待されるが、大量の出血を導くであろう外科手術又は任意の危険な状態に直面する間の予想される大量の血液損失のため、早急の血小板の注入を必要とすることが期待される。ある状況においては、血小板は入手できず、従って、人工血小板生成物は、理想的な代替物であろう。
【００５２】
本発明は、生物学的装置、その製造方法、並びにヒト及び動物患者におけるその使用を開示する。装置は生体材料から製造され、タンパク質分子、すなわち、ヒト又は動物起源の血清アルブミンのような界面活性剤又は洗浄剤を加えていない。装置は、患者への投与に適している。生物学的装置は、最初は、それに結合する活性分子を有さないが、生物学的装置は、少なくとも１種の他の生物学的活性分子、例えば、薬剤又は可溶性凝固因子を直接捕獲する能力を有している。少なくとも１種の生物学的活性分子の捕獲は試験管内又は生体内で起こり得る。
【００５３】
以前の出版物は、凝集体の形成を防止するため、製造工程の間にアルブミン溶液への界面活性剤又は洗浄剤の添加が重要であると示したが、本発明は、本発明による、有用な凝集体のない球体の懸濁液を製造するために、アルブミン溶液のようなタンパク質溶液に海面活性剤又は洗浄剤を加える必要がないことを発見した。
【００５４】
特に興味のあるものは、患者に投与された後に医療効果を有し得る、製造工程の間（又は「試験管内で」）、アルブミン球体に、任意の「生物学的活性分子」又は生物学的修飾分子が加えられていない球体として定義される、「ブランク」球体である。生物学的修飾分子は、凝固因子、ホルモン、抗体及び公知の医療効果を有する任意の分子のような、身体の全体の生理学又は細胞生理学に影響することが知られている分子である。このような「ブランク」球体の作用の１つのメカニズムは、血液中に存在する他の生物学的活性分子を直接捕獲する能力である。例えば、本発明において製造された球体が、患者に注入した後に、患者の血液中のフィブリノーゲン分子に結合することができる場合、混合生成物（生体内において活性分子を有する装置）は身体における医療効果を有し得る。
【００５５】
特に興味のあるものは、製造日のずっと後、及び合成条件と非常に異なる条件下でフィブリノーゲンと結合することができる、本発明を用いて製造された球体である。従って、球体は、患者に注入した後に、患者により生産されたフィブリノーゲンに結合し得ることが可能である。健康な患者は、血漿１ｍＬあたり、１．７７〜３．７５ｍｇの範囲の（可溶性）フィブリノーゲン濃度を有する。しかし、患者が血小板生成物である場合、出血時間は上昇したままであり、（可溶性）フィブリノーゲンの正常濃度は、血小板の適切な濃度の機能と置換し得ないことを示す。しかし、生体内で結合する内因性フィブリノーゲンを有する球体は、活性化血小板を模倣し得、可溶性又は非結合型フィブリノーゲンの予期できない効果を有するが、輸血される血小板の効果と同様の効果を有する。
【００５６】
本発明において、アルブミンは、装置の製造のための原資料として開示されているが、他のタンパク質分子を用い得ることは当業者には明らかである。
【００５７】
本発明に開示された球体は、患者が血小板輸血を受けたかのように、血小板減少症患者の出血時間を改善することができるが、球体は、生体内に存在する任意の薬剤のような、身体内の他の生物学的活性分子とも結合することができると予想される。
【００５８】
本発明の生成物は主に球体であるが、非球状粒子は同様に有効であり得る。全体的な形状と関係なく、これらの装置のサイズは、毛細血管の閉塞を防止するため、直径を含む任意の次元において５ミクロンを超えるべきでない。生物学的装置は、理想的に懸濁液の形状であり、患者への静脈投与に適合する媒体中に懸濁されている。生物学的装置は球体であり得、０．３〜０．５ミクロンの平均直径、理想的には０．３ミクロン未満の直径を有する。
【００５９】
粒子のサイズ及び密度は、粒子又は球体が貯蔵される媒体中でのブラウン運動により懸濁液中に残存するのに十分に小さいべきであることも重要である。これは、時々振盪しないでも、容器の底に物質が形成することをもたらす沈殿（患者への静脈投与のために適していない）を防止するためである。
【００６０】
ドナーの血小板が、ドナーの不足、または取り入れる不十分な基盤にかかわらず利用可能でないか、又は血小板、又は血小板への反応又は関連する血液製剤の歴史を維持する場合、いかなる理由であれ血小板輸血を必要とする本発明で製造された生成物は、どのような患者にも提供することができる。
【００６１】
患者の恒常的状態が、本発明に開示される装置の投与によって改善されることが予想される。
【００６２】
以下は、生成物をどのように製造し、それをどのように使用するかを示す実施例の詳細な開示である。
【００６３】
実施例１
いくつかの市販のＨＳＡ調製品からのタンパク質粒子の製造
目的：同一条件下で、コントロールのタンパク質粒子（試験管内で他の生体分子を加えない）の形成について種々の供給業者から購入した２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が同一であるかどうかを評価するため。
【００６４】
原理：
ＨＳＡの商業生産は、薬品、温度、滅菌条件、ろ過条件、保存条件及び添加する賦形剤、バッファー、電解質及び本発明のタンパク質粒子の製造のために用いられるタンパク質溶液の条件に影響を及ぼし得る他の物質を含む、その製造工程においてバリエーションがある。この実施例は、このようなあらゆる相違を発見及び評価することを目的とする。
【００６５】
米国特許第５，０６９，９３６号は、脱溶媒和剤の添加前にタンパク質溶液に洗浄剤又は界面活性剤を加えることの重要性を議論している（カラム４、２１〜２４行）。本実施例の目的の１つは、脱溶媒和剤の添加の前又は後に、タンパク質溶液に、任意のこのような洗浄剤又は界面活性剤を加えないことの影響を評価することであった。
【００６６】
この実施例の他の目的は、脱溶媒和剤の添加前に、タンパク質溶液中に種々の濃度の塩を加えることの影響を評価することである。
【００６７】
米国特許第５，３０８，６２０号（タンパク質ナノ粒子及びその製造方法）は、
凝集のない球体の形成を促進するために、２５％ＨＳＡの塩含有量を減少することの影響を開示している（実施例１３、ヒトアルブミンナノマトリクスの合成における浸透圧［低浸透圧］の影響、カラム１９〜２２）。全体的な結論は、「実質的に全てのフリーのナトリウムイオンを除去した水中で大規模に透析したＨＳＡを用いることにより、７．７ｍｇ／ｍＬのＳＴＳ濃度と関連し、１１０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ濃度の有用なナノマトリクス（表１３）が得られた（カラム２０、３５〜３９行）。要するに、高い塩化ナトリウム含有量は、「使い物にならない凝集体」をもたらす傾向にある。」であった。
【００６８】
前記理由について、実施例１は、前もって透析していない、塩化ナトリウムのＨＳＡ溶液への意図的な追加をもって設計された。エタノール（水中、７０％）の添加前に、塩を加えた。（もしあれば）ＨＳＡの５種のバッチのいずれが、凝集体のない、球体又は粒子の形成のために最も有利であるかを調べるために、エタノールは脱可溶化剤（又は脱溶媒和剤）として用いられた。
【００６９】
材料及び方法：
ＨＳＡの５種のバッチ（全て２５ｍＬ）を、それぞれ、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃｏｒｐ，ロサンゼルス（Ａ）；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ，グレンデール（Ｂ）；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ，Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｗｉｓｓ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ（Ｃ）；Ｉｍｍｕｎｏ−ＵＳ，Ｉｎｃ，ロチェスター、ミシガン州（Ｉ）；ＺＬＢ Ｂｉｏｐｌａｓｍａ，スイス（Ｚ）から購入した。グルタルアルデヒド（ＧＬ）は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ワシントンとりで、ペンシルベニア州）から購入した。
【００７０】
種々のＨＳＡの電解質含有量を標準的な臨床検査室の化学パネリストにより測定し、結果を表１に示した。
【００７１】
透析していないＨＳＡ（２５％）の一定量（３２μＬ）を、市販のＨＳＡ（２５％）の供給業者のそれぞれからの新規な瓶から取り出した。一定量を、任意の洗浄剤を加えることなく、６８μＬの塩化ナトリウム溶液と試験管内で室温（１９〜２３℃）で混合した（Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＷと呼ばれる調製品は、それぞれ、９．０、７．２、５．４、３．６、１．８及び０ｍｇの塩化ナトリウム／水１ｍＬを含む溶液を表わす）。
【００７２】
従って、３０本全ての試験管（表２）が８０ｍｇ／ｍＬの均一な濃度のＨＳＡを含むが、ナトリウム及び塩化物イオンの濃度は変化する。次いで、１００μＬのグルタルアルデヒド（ＧＬ、１．６ｍｇ／１ｍＬの水）を加えた。これは、後述するように、エタノールを加える前のタンパク質とのＧＬの相互作用の時間の短いこと；及びタンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤を加えないことを除き、先行技術に開示されている「プレリンク」法と同じである。試験管内の内容物を完全に混合した後、３３３μＬのエタノール（水中、７０％）をＧＬの添加の１５秒以内にタンパク質溶液に加え、混合物は、すぐに濁ったか、又は透明及び清澄のままであった。
【００７３】
形成された粒子のサイズを評価するため、１８μＬの懸濁液を顕微鏡スライドに置き、１５００倍のパワー拡大における位相コントラスト中のカバースリップ下で観察した。球体の最も普通の集団の直径を、接眼部内に置かれた標準マイクロメートルと比較した。通常、目視検査により、あらゆる調製品中の９９％を超える粒子が球体であった。しかし、１ミクロンを超える直径の球体を含む調製品において、「ジャガイモ」のような不規則な形態を有する非球体の粒子が時々観察される（目視検査による１％未満の手段であった）。
【００７４】
結果：
表１：ＨＳＡ２５％（未透析、未希釈、オリジナル）の種々の調製品の電解質含有量
【００７５】
【表１】

【００７６】
結果は、ナトリウム濃度が５種の貯蔵液全てで同程度であり、塩化物濃度は４８ミリモル未満から７１．５ミリモルまで変化することを示し、これは、異なる貯蔵液は、貯蔵液のｐＨを生理的ｐＨに調整するための他のアニオンを含んでいることを示す。同様に、重炭酸塩（ＣＯ_２）濃度は３未満〜１８ミリモルに変化した。
【００７７】
表２は、種々の希釈剤塩化ナトリウム水溶液による貯蔵ＨＳＡ溶液の希釈後の全体の塩化物及びナトリウムイオン濃度を示した。これらの塩化物及びナトリウムイオン濃度は、ＧＬを加えた後のタンパク質溶液中のそれぞれのイオン濃度である。表２は、前記材料及び方法の項に記載されたような種々の溶液を混合することにより得られた、結果として得られる生成物（球体又は凝集体）をも示す。
【００７８】
要約すると：試験管１〜６は供給業者Ａから；試験管７〜１２は供給業者Ｂから；試験管１３〜１８は供給業者Ｃから：試験管１９〜２４は供給業者Ｉから；試験管２５〜３０は供給業者Ｚから購入したアルブミンを含む。
【００７９】
ＧＬの添加前のタンパク質溶液中の塩化物イオンの総濃度は、希釈剤由来の寄与、及び希釈後のそれぞれの貯蔵ＨＳＡ溶液（２５％）由来の寄与の合計であった。例えば、試験管１において：供給業者Ａに由来する２５％アルブミン３２μＬから得られる１９．６ミリモルの塩化物（２５％貯蔵溶液中に６１．４ミリモルの塩化物を含む）と比較し、６８μＬ容量の希釈剤Ｐ（９ｍｇ ＮａＣｌ／ｍＬ又は１５４ミリモル）は１０４．７ミリモルの塩化物イオンに寄与する。
【００８０】
ナトリウムイオン濃度に関しては、貯蔵溶液中のナトリウムイオン濃度は１３３〜１３８ミリモルでのみ変化したので、試験管１、７、１３、１９、２５中のナトリウムイオン濃度は同程度であり（１４７〜１４９ミリモル）；試験管２、８、１４、２０、２６のナトリウムイオン濃度は１２６〜１２８ミリモルであり；試験管３、９、１５、２１、２７のナトリウムイオン濃度は１０５〜１０７ミリモルであり；試験管４、１０、１６、２２、２８のナトリウムイオン濃度は８４〜８６ミリモルであり；試験管５、１１、１７、２３、２９のナトリウムイオン濃度は６４〜６５ミリモルであり；試験管６、１２、１８、２４、３０のナトリウムイオン濃度は４３〜４４ミリモルであった。
【００８１】
濁度の点では、透明かつ清澄のままであった試験管１０、１１、１２を除き、脱溶媒和剤を加えた後に試験管は混濁した。
【００８２】
Ｂａｘｔｅｒから購入した２５％ＨＳＡ貯蔵溶液を用いた場合を除き、高濃度の塩化ナトリウム溶液で希釈した試験管内で凝集体が試験管内で観察された。
【００８３】
水で、又は希釈剤Ｓ及びＴ（試験管１０、１１、１２）で希釈した場合、Ｂａｘｔｅｒから購入した２５％ＨＳＡ貯蔵溶液から球体は生成されなかった。Ｂａｘｔｅｒから購入した２５％ＨＳＡ貯蔵溶液は、この方法により球体が形成される前に、最小濃度の塩化ナトリウムを含む希釈剤（例えば、希釈剤Ｐ、Ｑ、Ｒ）を用いた希釈を必要とした。
【００８４】
凝集体のない有用な球体（０．７〜１ミクロン）が、高濃度塩化ナトリウム条件下に製造され（例えば、試験管７、８、９）、他の４者の供給業者から得られたＨＳＡ２５％からの生成物は、役に立たない凝集体を均一に形成した（試験管１〜３：試験管１３〜１５；試験管１９〜２１；試験管２５〜２７）。
【００８５】
表２．架橋剤添加前の各試験管中の塩化物イオン（ｍＥｑ）及びナトリウムイオン（ｍＥｑ）、並びにそれぞれのタンパク質溶液から製造された球体懸濁液の特定の性質。
【００８６】
【表２】

【００８７】
コメント：データは、多くの意外な結果を示した：
（１）米国特許第５，０６９，９３６号は、脱溶媒和剤の添加前に、タンパク質溶液中に適切な濃度の界面活性剤又は洗浄剤を有することの重要性を開示した（カラム４、２０〜３５行）。しかし、本実施例においては、いずれの試験管にも界面活性剤又は洗浄剤は添加されていないが、明らかにナトリウム及び塩化物イオンの濃度が適切である場合に、直径０．３〜０．７ミクロン球体が凝集体なしで製造することができた（例えば、試験管５、６、７、８、９、１７、１８、２２、２３、２４、３０）。
【００８８】
（２）低濃度のナトリウムイオンは、種々の供給業者から購入した５種のＨＳＡ貯蔵溶液のうちの４種において凝集体のない、球体の形成において有利な因子であると思われる。例外は、そのアルブミン貯蔵溶液が、高濃度のナトリウムイオンでさえ凝集体のない球体を形成するために用いることのできる、供給業者Ｂａｘｔｅｒであった（例えば、試験管７、８、９）。
【００８９】
（３）凝集体の体球体の形成という点で、ナトリウムイオンの最も高い耐用し得る濃度は、供給業者毎に変化した。例えば、試験管４（供給業者Ａ）及び試験管１６（供給業者Ｃ）において、ナトリウム濃度が８４ｍＥｑ以上の場合に凝集塊又は大きい凝集体が観察された。しかし、Ｉｍｍｕｎｏ−ＵＳ Ｉｎｃ．により供給されたＨＳＡを用いることにより（例えば、試験管２２）、ナトリウム濃度が８６ミリモルである場合に、凝集体のない球体が形成された。それに対し、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐから製造されたタンパク質溶液については、ナトリウムイオン濃度が８４ミリモル未満の場合（試験管１０、１１、１２）、球体が形成された。実際、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐに由来するアルブミン貯蔵溶液を用いることにより、架橋剤及びエタノール溶液を加える前に、１４７ミリモルのナトリウム濃度において凝集体のない球体を形成することができた。
【００９０】
（４）塩化物イオン濃度は、凝集体のない球体を形成することができるかどうかについて決定的なものではないと思われた。１５．４ミリモル未満（試験管２４）、及び１２０．１ミリモル未満（試験管７）の塩化物濃度は、貯蔵溶液が、それぞれ、供給業者Ｉ及び供給業者Ｂにより供給された場合に、凝集体のない球体の製造において成功した。これに対し、他の供給業者により供給された貯蔵溶液から、塩化物濃度の中間の範囲まで希釈したアルブミン溶液を含む他の試験管（例えば、試験管２、３、４、１４、１５、１６、２７、２８、２９）は凝集塊及び凝集体をもたらした。
【００９１】
意外にも、供給業者Ｂから購入したアルブミン貯蔵溶液は、総塩化物濃度が５７ミリモル以下である場合、８４ミリモル以下のナトリウム濃度と併せ（試験管１０、１１、１２）、球体を形成しなかった；溶液は、他の試験管に加えたように、同量の架橋剤及びエタノール（７０％）を加えた後に透明のままであった。製造業者Ｂは、その生成物が６０℃における加熱に１０時間さらされていることを開示した。他の製造業者は同様の開示をしていなかった。球体形成の独特のパターン又は球体形成の失敗（しかし凝集体の形成なし）が、他の供給業者により用いられる方法に対抗するような、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐの製造方法によるなら、それは明らかでない。
【００９２】
（６）全ての凝集体のない球体の製造を顕微鏡下で注意深く試験した場合、球体は、サイズ分布において単分散でることが観察された。例外は、球体のほとんど（約９９％）が約１ミクロンであり、いくらかの（１％未満）球体が直径１ミクロンを越え、５ミクロンであることが、試験管２５、２６、２７において観察された。これら３種の懸濁液は、サイズ分布において著しく不均一であった。
【００９３】
（７）球体の平均直径が約１ミクロン又は１ミクロン未満である、全ての調製品において、球体のサイズ分布は不均一であると思われた。これらの任意の調製品中に非球形粒子は観察されず、直径が５ミクロンより大きい球体はなかった。
【００９４】
考察：
狭いサイズ分布であり、懸濁液中で凝集体の同時形成のない球体の成功した製造のための条件は非常に厳しい。先行技術は、医学的に有用な球体懸濁液を製造するのに失敗したが、本発明の方法が開示されたように成功した全ての潜在的な理由を表すことは可能ではない。
【００９５】
本発明において、タンパク質溶液に洗浄剤又は追加の界面活性剤を加えることなく、球体を形成することができるという発見については、１つの理由又は仮説は、脱溶媒和剤を加えた後のタンパク質分子とのＧＬとの相互作用時間の短縮された時間（１５秒）であり得る。米国特許第５，０６９，９３６号に開示された方法（例えば、カラム２２、５６行〜カラム２３、３０行の実施例４、実験例１）は、脱溶媒和剤の添加前の、ＧＬのタンパク質分子とのより長い反応時間を用いた（例えば、バッファーの添加前に５分間、エタノールの添加前に、部分的に結合したタンパク質溶液と５分間の相互作用、すなわち、合計１０分間）。
【００９６】
米国特許第５，０６９，９３６号は、タンパク質溶液中での短い「可溶剤相互作用時間」の重要性について教示していなかった。長い架橋時間（例えば、１０分間）が、最終的に「ありあまるほどの、使い物にならない凝集塊」をもたらし（カラム２３、１５行）、これは、脱溶媒和剤の添加前にタンパク質溶液に洗浄剤を含ませることにより回避し得る。
【００９７】
結論：
評価した、全ての２５％ヒトアルブミン貯蔵溶液（臨床用途のためにＦＤＡによって承認された市販のアルブミン製品）は、同程度のアルブミン濃度、ナトリウム濃度及びｐＨを有していたが、本実施例に開示された「プレ−リンク」法に供した時に、同程度の球体懸濁液を生成しなかった。
【００９８】
水で単純に希釈した（洗浄剤又は界面活性剤を加えず）、４者の商業的供給業者（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐを除く）により供給された、透析されていない貯蔵アルブミン溶液（２５％）は、本実施例において開示された条件を用いて、架橋剤及び脱溶媒和剤を加えた後に、凝集体の体球体懸濁液をもたらすことができた。
【００９９】
特定の条件が、なぜ凝集体のない球体形成に有利であり、他の条件が球体を形成せず、又は反対に凝集体を形成かを、本実施例において用いられた、それぞれナトリウム及び塩化物濃度の評価から明らかでない。
【０１００】
本発明は、直径５ミクロンより大きい球体（又は粒子）による汚染のない、実質的に５ミクロンより小さい球体をも製造し、以前に開示された方法は、このような大きい凝集体又は粒子を除去する追加工程を必要としていた。
【０１０１】
開示された特許における以前の教示とは反対に、ＨＳＡの特定の貯蔵溶液（例えば、Ｂａｘｔｅｒから購入）は、球体を形成する前に、塩化ナトリウム含有溶液（貯蔵タンパク質溶液を、所望の初期濃度に希釈するという追加の目的を供給する）を補充する必要がある。
【０１０２】
種々の製造供給元により供給された貯蔵アルブミン溶液は、それらがどのように製造されたか、及び凝集体の体球体を製造する前に種々の合成条件を必要とすることで、独自に異なっていてもよい。得られた球体は、視覚、又は他の物理的な検査により揺曳に検出可能でない、試験管内又は生体内での種々の特性を有しているかもしれない。動物、特に血小板減少症のウサギにおける研究は、種々の調製品の生物学的性質における任意の相違を評価する唯一の方法であるかもしれない。
【０１０３】
実施例２
３種の新規方法を用いたタンパク質粒子の製造
目的：任意の次元において５ミクロンより大きい粒子を基本的に有しない、タンパク質球体の新規な合成方法、及び生成物の安定性を評価する方法を開発すること。
【０１０４】
原理：米国特許第５，０６９，９３６号は、タンパク質球体合成のための２種の方法を開示した。第一の方法は「プレ−リンク」（濁度の出現前又は球体の形成前に架橋剤を加えることを意味する）と呼ばれる。それは、基本的に、（ａ）タンパク質分子を溶解し；（ｂ）更なる架橋のために一緒に押し込まれる前に、タンパク質分子の関連づけられた部分に架橋剤を加え；（ｃ）界面活性剤を加え、タンパク質表面と相互作用させ；（ｄ）粒子をミクロスフェアに一緒に押し込むために脱溶媒和剤を加えることを含む（カラム４、５３行〜カラム５、７行）。用いられる架橋剤（グルタルアルデヒド、ＧＬ）の濃度は、脱溶媒和剤（水によるか、又は処理の追加工程等）の希釈による可溶化に抵抗性のある安定な球体をもたらす。
【０１０５】
米国特許第５，０６９，９３６号は、更に、基本的に、（ａ）タンパク質分子を溶解し；（ｂ）界面活性剤を加え；（ｃ）脱溶媒和剤を加え；（ｄ）ミクロスフェアを内部的に架橋するために架橋剤を加えることを含む。この方法は「ポスト−リンク」（球体の形成後に架橋剤を加えることを意味する）と呼ばれる。懸濁液が水による希釈に供される場合、又は処理の追加工程の間、懸濁液が希釈液にさらされる場合、架橋剤の非存在下に最初に形成される球体を溶解（再溶解）する。再溶解に対してそれらを安定化させるため、個々の球体の構造体を完全に架橋するために球体懸濁液に架橋剤を加える。
【０１０６】
この先行技術に開示された方法は、いずれも脱溶媒和剤を加える前に、タンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えることを含む。
【０１０７】
しかし、開示された「ポスト−リンク」法から得られる懸濁液は、球体がフィブリノーゲンによってコーティングされたかどうかが真実であった、多くの５ミクロンより大きい球体を含む。実際、米国特許第６，２６３，９８８Ｂ１号は、ＴＳ１が、フィブリノーゲンにより球体をコーティングする追加の工程を有することを除き（カラム１０、５０〜６１行）、ＴＳ１１と同様の方法（カラム１１、３４〜３５行）により製造されたことを開示している。更に、ＴＳ１を作成するための懸濁液に対するフィブリノーゲンの添加は、球体のサイズを大きくせず、サイズ分布を変化させる（カラム２４、１６〜１７行は、Ｌｏｔ Ｋ９４０１のように見えるＣＳを示す、すなわち多くの大きい球体が存在する）。その記載に一致し、米国特許第６，２６３，９８８Ｂ１号の表１１は、Ｋ９４０１が、１ｍＬ（再構築懸濁液）あたり、直径７ミクロンより大きいサイズの球体を少なくとも８６５００００００個含むことを示した（カラム２４、５２行）。この方法により製造されたＣＳに同じことが予想された。
【０１０８】
本実施例の原理は、タンパク質溶液に洗浄剤又は界面活性剤を加えない、本発明により製造された３種の生成物を比較することであった。第一の生成物は、「プレ−リンク」法とも呼ばれる新規な方法（本発明においてタンパク質溶液中に洗浄剤を加えないこと、及び通常、１分未満の、短い「架橋剤相互作用時間」を除く）によって製造された第二の生成物は、「ポスト−リンク」法とも呼ばれる方法（同様に、タンパク質溶液に添加剤を加えず、短い「架橋剤相互作用時間」を用いる）によって製造された。
【０１０９】
第三の生成物は、あらゆる先行技術に以前に開示されていない、新規な「ミド−リンク」法により製造された。この「ミド−リンク」法においては、架橋剤を、まず脱溶媒和剤と予備混合し、次いで、混合物をタンパク質溶液に加える（界面活性剤又は洗浄剤を加えることなく）。従って、架橋剤は、脱溶媒和剤と同時に加えられた。タンパク質分子上における架橋剤による架橋作用の開始は、可溶性タンパク質分子からの球体の形成における脱溶媒和剤の作用と同時に開始するであろう。可溶性タンパク質分子から球体が形成される時に、正確に架橋剤を加える効果は、「プレ−リンク」又は「ポスト−リンク」法のいずれかから予測することはできなかった。詳細な動物試験のみが、「ミド−リンク」球体の生体適合性、並びに他の生物学的又は化学的分子の送達のためのそれらの使用、又は単独使用の効果を示すことができた。
【０１１０】
本実施例は、凝集体のない、医学的に有用な球体の製造における、この「ミド−リンク」法の効果、及び懸濁液を希釈した場合の再溶解に対してどのくらいで生成物が安定化し得るかを評価することを目的とする。
【０１１１】
材料及び方法：
２５％ＨＳＡは、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃｏｒｐ，グレンデールから購入し、洗浄剤又は他の界面活性剤を加えずに、水で６％まで希釈した。「プレ−リンク」及び「ポスト−リンク」なる用語は、既に開示された技術分野においては同様であるが、本明細書で用いられる方法は、球体の形成の任意の時間においてタンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えず、短い「（１５秒未満の）架橋剤相互作用時間」が用いられる点で新規である。
【０１１２】
（ａ）新規な「プレリンク」法：２００μＬの６％ＨＳＡ（市販の２５％ＨＳＡを水で希釈）をポリプロピレン製の微小遠心管に入れ、ここに２００μＬのグルタルアルデヒド、ＧＬ（１．６ｍＬ／水１ｍＬ）を加え、振盪した。３０秒以内に６４０μＬのエタノール（水中、７０％）を加え、混合物は混濁した。懸濁液中のＧＬの最終濃度は０．３１ｍｇ／ｍＬであった。
（ｂ）新規な「ポストリンク」法：４００μＬの３％ＨＳＡ（市販の２５％ＨＳＡを水で希釈）をポリプロピレン製の微小遠心管に入れ、次いで、６４０μＬのエタノール（水中、７０％）を加え、混合物は混濁した。５分後、懸濁液に５２μＬのＧＬ（６．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。懸濁液中のＧＬの最終濃度は０．３１ｍｇ／ｍＬであった。
（ｃ）新規な「ミドリンク」法：４００μＬの３％ＨＳＡ（市販の２５％ＨＳＡを水で希釈）をポリプロピレン製の微小遠心管に入れ、次いで、６４０μＬの溶液（水中に７０％エタノール、０．５ｍｇ／ｍＬのＧＬをも含む）を加えた。混合物はすぐに混濁した。懸濁液中のＧＬの最終濃度は０．３１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１３】
前記３種の新規方法に従い、種々の時間ポイントにおいて、完全に架橋し、再溶解に対して粒子を安定化する効果を評価するために、以下を実施した。前記方法のそれぞれについて、脱溶媒和剤の添加後の種々の時間において生成物の一定量（４０μＬ）を除去し、１６０μＬの水で希釈した。１時間後、全ての試験管中の懸濁液を微小遠心管中で遠心し（５分間、最高速度）、再溶解しない任意の安定な球体を除去した。上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｒｐ．）により測定した。
【０１１４】
製造された球体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を、全ての試薬を加えた後のアルブミンの最終濃度（全てのケースにおいて、１０４０μＬである上清の最終容量により割った１２ｍｇのアルブミン）と、上清から測定した可溶性タンパク質の濃度（その時間ポイントにおいて安定に架橋されていない、任意の球体を再溶解するための水で５倍希釈し補正した後）との差から得た。安定な球体の「収率」は、球体懸濁液を製造するための全ての試薬の添加後のアルブミン分子の最終濃度で割った、製造された球体の濃度である
【０１１５】
結果：新規な「プレ−リンク」法を用いたＧＬによる安定化の反応速度は、新規な「ポスト−リンク」法を用いたものと同様であった。両方の方法は、エタノールの添加４分後に最大の安定に達した。最大収量（停滞状態）は、懸濁液中の利用できる全てのアルブミン分子（溶液中のままである全てのアルブミン分子と球体形状のものの合計）の約３６％であると思われた。対照的に、新規な「ミド−リンク」法により製造された球体は再溶解に対して最大安定に達するのに８分以上を必要とした。最も高い収率は約３７％であった。
【０１１６】
表３は、「プレ−リンク」及び「ミド−リンク」法を用いて製造された球体の種々の希釈時間の収率を記載した（ポストリンク法からのデータは、プレ−リンク法のものと同じであり、ここには含まれていない）。
【０１１７】
表３：混濁の出現後の種々の時間における、プレ−リンク及びミド−リンク法による安定化球体の収率
【０１１８】
【表３】

【０１１９】
３種の方法により製造した球体のサイズ分布を評価するため、安定化球体（安定化の２８分後）を位相差顕微鏡により観察した。「プレ−リンク」法により製造した球体は、通常、直径０．３ミクロンであり、サイズにおいて非常に均一であり、凝集体はなく、５ミクロンより大きい球体及び非球形状粒子を含んでいなかった。
【０１２０】
「ポスト−リンク」法により製造された球体は、直径約０．１ミクロンであり、ブラウン運動のため、個々の球体を見ることは非常に困難であったが、明らかに凝集体はなく、５ミクロンより大きい球体及び非球形状粒子を含んでいなかった。
【０１２１】
興味あるものは、これらの条件下における「ミド−リンク」法により製造された球体であり：ほとんど（９９．９％以上）が直径０．５ミクロンであるが、直径５ミクロンより大きい明らかに小数集団（血球計算板により１ｍＬあたり約１０，０００個と推定される）があり、それらのいくつかは直径１５ミクロンに達した。「５ミクロンより大きい球体」の濃度はＫ９４０１（米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号、表１１）において観察されるより約３桁大きく、ＣＳと同程度であり；その結果、低用量を用いた静脈投与に許容され得る。「ミド−リンク」法で製造した生成物中に凝集体はなく、非球形の粒子もなかった。
【０１２２】
エタノールの添加時のアルブミンの最終濃度は同じであり、架橋剤の最終濃度が同じであるけれども、３種の方法からの生成物は異なっている。新規な「ミド−リンク」法を用いた合成の他の条件は、安全度の高い静脈注射の医学的応用に適した懸濁液を製造するために、合成の間に５ミクロンより大きい球体の存在を回避することを探索することを必要とする（後述する）。
【０１２３】
実施例３
合成の間に５ミクロンより大きい球体の製造を回避するための「ミド−リンク」法の改良
目的：新規な「ミド−リンク」法に由来する生成物が、サイズ分布において不均一でない、改良された合成条件を見つけること。特に、製造された懸濁液は、直径５ミクロンより大きい、あらゆる球体又は粒子を含んでいない。
【０１２４】
米国特許第５，０６９，９３６号に開示されたデータは、アルブミンの高い初期濃度（例えば、４０、６０〜８０ｍｇ／ｍL；実施例５の表、カラム２５）が、より大きい球体をもたらすことを示した（加えた洗浄剤の各濃度において）。また、米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号は、用いられるアルブミン（ＴＳ１、カラム１０、３８行；Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，カリフォルニア州から購入）の初期濃度が１５％である場合に、６４８０００００００個の大きい球体（１０ミクロンより大きい直径を有する；表１２、カラム２６）／ｍLの存在を開示している。従って、新規な「ミド−リンク」法を用いた球体の合成において３％より高い初期濃度のアルブミンを用いた場合、より「大きい球体」（直径５ミクロンより大きい球体として定義される）が生じると予想される。
【０１２５】
材料及び方法：
高濃度のＨＡＳ（５％〜６％の範囲ＨＳＡを供給業者Ａから購入し、界面活性剤又は洗浄剤を加えることなく、水のみで希釈した）を用いることを除き、実施例２に開示された「ミド−リンク」法を繰り返した。
【０１２６】
結果：アルブミン濃度のこの範囲内で形成された球体は常に１〜２ミクロンであり、
５ミクロンより大きい球体、凝集体、不規則な粒子又は球体でない形状のものは観察されなかった。
【０１２７】
結論：プレ−リンク法及びポスト−リンク法（米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号）を用いた、既に開示された特許（米国特許第５，０６９，９３６号）（両者とも界面活性剤を加える）からのデータは、高い初期濃度のアルブミンが直径５ミクロンより大きい球体を製造しそうであることを示唆するが、新規なミド−リンク法により製造した場合、高濃度のアルブミン（水中、５％及び６％）を用いることにより、反対の効果（３％アルブミン溶液を用いて合成した生成物と比較し）が得られた。
【０１２８】
本実施例においては、ほとんどの球体が１〜２ミクロンのサイズであったが（実施例２における０．５ミクロンの平均と比べ）、５ミクロンより大きい球体又は粒子は存在していなかった。従って、大きい球体（直径５ミクロンより大きい）の小数集団の出現は、平均サイズの大多数の集団を用いた「ミド−リンク」法において相互に関連しない。大多数のサイズの全体的な増大は、大きい球体の生理的に危険な亜集団の任意の外観と関連しなかった。
【０１２９】
実施例４
種々の方法により製造された球体へのフィブリノーゲン分子の結合
目的：新規なポスト−リンク及び新規なミド−リンク法により製造された球体が、追加の架橋剤を加え、フィブリノーゲン含有懸濁液中で凝集体を形成する必要なく、両者ともフィブリノーゲン溶液と混合することによりフィブリノーゲンと結合し得るかどうかを評価すること。
【０１３０】
原理：実施例２は、プレ−リンク及びポスト−リンク法が、架橋剤が最大効果をもって球体を安定化し得る前に少なくとも４分間を必要とすることを示した。ミド−リンク法は８分以上を必要とした。他の予備的実験は、グルタルアルデヒド分子が極めて急速にタンパク質分子に結合し、反応が数分以内に完了することを示差した（ここではデータを示さない）。懸濁液中におけるグルタルアルデヒドに由来するあらゆる影響を更に最小化するため、わずかな、又は「更に反応」しないグルタルアルデヒド分子が存在する時に、フィブリノーゲン分子をこの実施例において、調製品中の混濁が出願した後少なくとも１０分間、混濁した懸濁液に加えた。
【０１３１】
フィブリノーゲンの商業的市販供給品は、通常、高濃度の塩を含む（例えば、１５％クエン酸ナトリウム及び２５％塩化ナトリウム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ由来の製品Ｆ３８７９を参照されたい）。このように高濃度の塩の添加は球体の凝集をもたらすが、フィブリノーゲン溶液に由来する、このような塩の添加なしで、調製品は安定である。この実施例は、懸濁液中に既に形成された球体の凝集を引き起こすことなく薬理効果を有する球体にフィブリノーゲンが結合するのには十分であろう、フィブリノーゲンの市販供給品の適切な希釈度を評価することを目的とする。
【０１３２】
材料及び方法：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｃｈ Ｃｏ．からヒトフィブリノーゲン粉末を購入し、１．０ｍＬの球体懸濁液に対して０．５ｍＬ〜１．０ｍＬ比率のフィブリノーゲン溶液で、球体調製物と混合する前に、１ｍｇの凝固し得るタンパク質／ｍＬになるように、通常の食塩水（０．９％塩化ナトリウム）に溶解した。他の供給業者により供給されるフィブリノーゲンは、同様に有効であると予想される。
【０１３３】
ポスト−リンクアルブミン球体を、（１）タンパク質溶液に洗浄剤を加えず、（２）溶液をシリコンチューブシステム内を硬質プラスチックチューブ中で混合し、（３）球体懸濁液の容量あたりに加えるフィブリノーゲン溶液の種々の容量比を前述したように用いたことを除き、米国特許第６２６４９８８Ｂ１号におけるＴＳ１について開示された方法のようにして製造した。
【０１３４】
再度、タンパク質溶液に洗浄剤を加えず、混濁の出現の１０分後に、混濁した球体懸濁液にフィブリノーゲン溶液を加え、実施例３におけるようにしてミド−リンク球体を製造した。
【０１３５】
ポスト−リンク及びミド−リンクの球体調製物は、いずれも、遠心分離し、エタノール及び上清中の残余の架橋剤又はフィブリノーゲンを除去した。沈殿物を通常の食塩水中に再懸濁した。
【０１３６】
フィブリノーゲンをコーティングした球体が、試験管内でトロンビン誘発性凝集体を形成し得るかどうかを評価するため、既に開示された方法を用いた。「最低限に達しない（ｓｕｂ−ｍｉｎｉｍａｌ）」濃度の可溶性フィブリノーゲン下における粒子の凝集は、米国特許第６，３９１，３４２Ｂ１号「治療用途のためのフィブリノーゲンでコーティングした粒子」のカラム１９、４７〜６０行に既に開示されている。基本的に、トロンビンを加えた（３単位／ｍＬ）、通常は目に見える塊を形成しない低濃度（「最低限に達しない」濃度）のフィブリノーゲン溶液を、コントロール球体（ＣＳ）又は既にフィブリノーゲンでコーティングされた球体と混合した。次いで、トロンビンを加えた。ＣＳはその表面にフィブリノーゲンを有しておらず、先行技術においては、これらの条件下で混合物にトロンビンを加えて凝集体を形成しないことが示されている。球体は既にフィブリノーゲンでコーティングされているが、トロンビン溶液を加えた後、「最低限に達しない」濃度のフィブリノーゲン中に懸濁した時に凝集体を形成するであろう。
【０１３７】
結果：本実施例の条件下での球体溶液へのフィブリノーゲン溶液（通常の食塩水で希釈）の添加は、フィブリノーゲン溶液を用いて導入された塩からの凝集体の形成をもたらさなかった。
【０１３８】
フィブリノーゲンでコーティングしたポスト−リンク球体及びフィブリノーゲンでコーティングしたミド−リンク球体は、いずれも、開示されたように、トロンビン溶液を加えた後、最低限に達しない濃度のフィブリノーゲンの存在下、凝集体を形成する。データは、ミド−リンク球体がポスト−リンク球体と同じ程度でフィブリノーゲンと結合し得ることを示し；いずれの球体調製物も、血小板減少症の動物の治療に有効であるかもしれない。
【０１３９】
コントロールのポスト−リンク球体及びコントロールのミド−リンク球体は、いずれも最低限濃度のフィブリノーゲン溶液と混合する前に、フィブリノーゲンを加えることなく、これらの条件下でトロンビン誘導性凝集体を形成しなかった。
【０１４０】
コメント：
予備的実験からのデータ（ここでは示さない）は、ＧＬのタンパク質分子への結合が５分未満で完了し得ることを示した。本実施例において、混濁の出現１０分後にフィブリノーゲン分子を球体と混合したので、フィブリノーゲン分子の球体への結合は、おそらくまだ反応していて、架橋剤の残量を必要としないか、又はそれによらなかった（すなわち、それからの残りは、再溶解に対して球体を安定化するのに必要であった）。
【０１４１】
タンパク質溶液中で洗浄剤の存在下、先行技術により製造された、フィブリノーゲンでコーティングされたポスト−リンク球体は、最低限に達しない濃度のフィブリノーゲン中でトロンビン誘導体の球体凝集体を形成することができた。これらの球体は、試験管内で、ＡＤＰ又はコラーゲンのような凝集剤を加えた後、ヒト血小板と共凝集を形成することもできた（米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号の図１３）。従って、最低限に達しないフィブリノーゲン濃度の存在下に、トロンビン誘導性球体−球体凝集体（ミド−リンク法により製造された単一の球体に由来）を形成する、新規なポスト−リンク及びミド−リンク法の両者により製造されたフィブリノーゲンをコーティングした球体の能力は、２種の新規な方法を用いて製造されたフィブリノーゲンをコーティングした球体が、試験管内及び生体内においてヒト血小板と同様に共凝集体を形成し得ることを示した。
【０１４２】
新規なポスト−リンク法又は新規なミド−リンク法のいずれかにより製造されたコントロール球体の、トロンビン誘導性球体凝集体を形成することの不成功は、低濃度（最低限に達しない）フィブリノーゲンの条件下、両者いずれかの種類の球体が結合しないか、又はトロンビンを添加した後に球体−球体凝集体の形成に効果的であるのに十分なフィブリノーゲン分子と結合しなかったことを示した。
【０１４３】
新規な「ミド−リンク」法は、大きな球体（５ミクロンより大きい）の共同生産なしで、天然の血小板（約２ミクロンである）のサイズに接近する球体を製造することができた。架橋剤を消耗する（球体形状又は残りの可溶性の形態のいずれかにおける、アルブミン分子への完全な結合から）時間ポイントにおけるフィブリノーゲンの球体への結合は、フィブリノーゲンの球体への結合が、薬理効果の供給に効果的である組み合わせのために、共有結合である必要がないことを示した。
【０１４４】
実施例５
新規なバイ−リンク法を用いたタンパク質球体の製造
目的：高濃度のタンパク質溶液及び２種の濃度の架橋剤を用いることにより、基本的に直径５ミクロンより大きい球体を含まない、高濃度の球体を製造する新規な方法を開発すること。
【０１４５】
原理：実施例２は、５ミクロンより大きい球体のない、球体懸濁液を製造することのできる、「プレリンク」及び「ポストリンク」法の両者を示した。しかし、目的を達成するため、初期タンパク質濃度は相対的に低くなければならない（例えば、脱溶媒和剤を加えた時点で３％）。結果として、最終懸濁液中の球体の濃度も相対的に低かった。
【０１４６】
高濃度の球体が望ましい場合があるので、１つのアプローチは、低い初期タンパク質濃度で開始し相対的に均一な球体を形成し、次いで、過剰の液体を除去するためのろ過により、生成物中の球体を濃縮する。しかし、フィルターは簡単に詰まり、ろ過される生成物の性能を変化させると思われた（米国特許第６，２６４，９８８号、表１３）。従って、本実施例は、相対的に高濃度のタンパク質溶液を用いるが、２工程において架橋剤を用いず、最初に「無効な」（「安定でない」（ｓｕｂ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）ともいう）濃度、次いで「安定化」濃度を用いる、新規方法を調べることを試みる。「無効な」濃度は、脱溶媒和剤を加えた時に、球体が再溶解するか、それ未満の架橋剤の濃度として定義された。この意味で、「無効な」濃度は、実際に「安定でない」濃度であった。「安定化」濃度は、球体が再溶解に対して安定化する場合に存在するか、それを超える濃度であった。
【０１４７】
形成された、どのような安定な球体生成物もないであろうから、これらの実施例より前には、「安定化でない」濃度の架橋剤の添加は無意味であったので、「バイ−リンク」法は新規である。他の濃度の架橋剤の添加は以前に考慮されなかった。投与の間の時間間隔が球体の性質にとって重要であるかもしれず、１秒後に、懸濁液が単一の単分散球体を含んだままであるかどうかは明らかでなく、高濃度の架橋剤（「安定化」濃度）を懸濁液に加える。
【０１４８】
本実施例においては、実際、球体の再溶解に関する効果にかかわらず、安定でない濃度は、効果があったのがわかった。安定化していない濃度は、球体のサイズ分布の均一性を増加について予想しない効果を有していた。
【０１４９】
この工程の利用（球体の形成前の安定化しない濃度の添加、それに続く、球体の出現後の「安定化」濃度の架橋剤の添加）は、直径５ミクロンを超える球体の小数集団の形成を排除した。この工程を用いないと、他の同一な製造工程の下、ほとんどの球体が直径５ミクロン未満である場合であっても、５ミクロンより大きい球体が混合物中にもたらされる。
【０１５０】
理論上は、安定でない濃度の架橋剤を加えることができる２つの時間ポイントがある。安定でない濃度の架橋剤は、（Ａ）脱溶媒和剤の添加前に可溶性タンパク質溶液に加えることができ、又は（Ｂ）混濁の出現後であるが、安定化濃度の架橋剤を加える前に加えることができる。いずれかのケースにおいて、示さない限り、懸濁液の希釈により（任意の脱溶媒技を含まない溶媒により）混濁は消失し、それに続く「安定化」濃度の架橋剤が添加される（脱溶媒和剤の希釈又は除去の前）。
【０１５１】
しかし、前のパラグラフにおけるオプション（Ｂ）において議論したように、脱溶媒和剤を加えた後に（しかし、安定化濃度の架橋剤を加える前）、安定化しない濃度をタンパク質溶液に加えた場合、５ミクロンより大きい球体がすぐに形成された。従って、このようなアプローチは、安定化濃度の架橋剤がいったん加えられると球体は再溶解しないので、このようなアプローチは大きな球体を含む不均一な集団のみを生産するであろう。
【０１５２】
従って、本実施例においては、脱溶媒和剤を加える前に、安定でない濃度の架橋剤が常にタンパク質溶液に加えられ、次いで、後に第二の安定化濃度の架橋剤が加えられた。
【０１５３】
本発明において、第２の濃度の架橋剤は、「安定化」濃度の架橋剤と呼ばれた。この薬剤は、「安定化しない」薬剤又は異なる化学物質又は薬剤と同じ化学物質であり得る。
この濃度は、安定な球体を作成するために必要であり、既に安定化した球体に他の生体分子を共有結合により結合するために用いられた、米国特許第５，０６９，９３６号の実施例１４に開示されたような架橋剤の「第二の濃度」の使用に関連していなかった
【０１５４】
球体内でのタンパク質分子を架橋する種々の方法の生体内における影響、及び個々のタンパク質分子がどのようにして球体内に折りたたまれるかは現在のところ未知であり、動物、特に血小板減少症の動物を用いてのみ評価することができる。従って、「バイ−リンク」法は非自明として認識すべきであり、単に、「プレ−リンク」及び「ポスト−リンク」法の組み合わせとして認識することはできない。
【０１５５】
材料及び方法：
パートＡ：用いられた条件下で安定でなかった架橋剤の濃度の評価。供給業者Ｚから購入したＨＳＡ２５％を、任意の洗浄剤又は他の界面活性剤を含まない水で、更に任意の塩溶液を加えずに、１２％にまで希釈した。グルタルアルデヒド（ＧＬ）の溶液は、貯蔵ＧＬ溶液（１０％、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ワシントンとりで、ペンシルベニア州から購入）を、水で、以下の濃度：１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０ｍｇ／ｍＬにそれぞれ希釈することにより調製した。一連の試験管において、２００μＬのＨＳＡ（１２％）を２００μＬのＧＬ（種々の公知の濃度）と混合した。エタノール（水中、７０％、７２０μL)を１５秒以内に加えた。５ミクロンの直径より大きく形成された粒子があるかどうかを、位相差顕微鏡下に観察するため、試料を取り出した。更に１０分後、２００μLの混濁した懸濁液を、４００μＬの水に加え、混濁した懸濁液が透明になるかどうかを見た。ＧＬの安定でない濃度を、実験のこの部分に加えた。
【０１５６】
再溶解の各試験管中の球体の「収率」を以下のようにして、すなわち、水で希釈した後のそれぞれの生成物の２００μＬを含む一定量（透明であるか又は混濁したままである）を遠心し、球体を除去して測定した。次いで、上清中に残っている可溶性タンパク質の濃度をアッセイした。コントロールの試験管に由来する上清中のタンパク質の濃度（架橋剤を加えず、エタノールの添加後に形成された全ての球体は、水を加えた後に完全に再溶解した）は、「総タンパク質濃度」として用いられた。全てのタンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｒｐ．）により測定した。試験管内の球体の「収率」は、「総タンパク質濃度から試験管中の上清タンパク質濃度を引き」、これを「総タンパク質濃度」で割った。
【０１５７】
部分Ｂ：バイ−リンク法を用いた再溶解に対して安定な球体の製造は、安定でないＧＬ濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）及び安定化濃度のＧＰＬ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を必要とした。基本的に、球体を形成するための（不安定なままである）のエタノールの添加、及び安定化濃度のＧＬを加えたことを除き、パートＡにおけるのと同じ製造工程が用いられた。
種々の時間におけるＧＬの安定化濃度の添加の効果を評価するため、エタノール添加の２、４、６、１０又は１５分に安定化濃度を加えた。ＧＬの安定化濃度を、混濁した懸濁液の１１２０μＬあたり４５μＬの比で加えた。その後、安定化濃度のＧＬを加えた１０分後に懸濁液を水で希釈することにより惹起し、球体懸濁液の収率を開示されたようにして実施した。
【０１５８】
このバイ−リンク法により製造された球体を、適切な賦形剤を加えた後に凍結又は凍結乾燥した。凍結した試料の解凍後の球体の外観及び特性、又は水による凍結乾燥粉末の再構成を評価した。
【０１５９】
結果：
パートＡ：水で希釈することにより、初期濃度（タンパク質溶液と１：１に混合する前）のＧＬが、それぞれ１．６及び０．８ｍｇ／ｍＬである２本の試験管を除き、全ての混濁する懸濁液が透明に変化した。ＧＬの初期濃度が１．６及び０．８ｍｇ／ｍＬの場合、球体の収率は２５％を超えた。ＧＬ濃度が０．４ｍｇ／ｍＬの場合、収率は５％に落ち、ＧＬの初期濃度が０．４ｍｇ／ｍＬ未満で１％未満まで落ちた。従って、成分の開示された濃度及び混合工程の下、架橋剤の「安定でない」濃度は０．４ｍｇ／ｍＬのＧＬ又はそれ以下であると決定された。
【０１６０】
安定でない濃度のＧＬ（水中、０．４〜０．０５ｍｇ／ｍＬ）の添加が、脱溶媒和剤の添加後に（安定化濃度のＧＬの添加又は添加なし）、大きな球体の小数集団の形成を防止するという効果を有することがわかった。希釈しないで顕微鏡下で観察した時に、懸濁液はサイズ分布において不均一であり、大きな球体を有していなかった。
【０１６１】
更に、ＧＬ（次いで、エタノール）を加えた後に形成された球体の通常のサイズが、
用いられたＧＬの最初の濃度とは関係なく、ほぼ同じであることがわかった（最初に１．６ｍｇ／ｍＬ〜０．０５ｍｇ／ｍＬ）。位相差顕微鏡により評価すると、全ての懸濁液（希釈しないで観察）は、直径が約０．８〜１．２ミクロンの球体を有していた。ＧＬを加えなかったコントロールの試験管を除き、全ての試験管において、５ミクロンより大きい粒子又は球体はなかった。コントロールの試験管において、大部分の球体は１ミクロンより大きく、５ミクロンより大きい球体は、１０，０００個／ｍＬの濃度では観察されなかった。
【０１６２】
パートＢ：安定化濃度のＧＬを加えた後の懸濁液の収率は、コントロールの試験管を含む全ての試験管において２５派を超えた。エタノールを加えた２分後の安定化濃度のＧＬの添加は、エタノールを加えた１５分後に加えたのと同程度の球体濃度を有する懸濁液をもたらした。データは、懸濁液中で球体を安定化するのに効果的なＧＬの安定化濃度のために２分以下を要することを示した。
【０１６３】
安定化濃度のＧＬ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた後の球体のサイズ分布の顕微鏡評価は、次に続く工程が球体のサイズを変えず、凝集体を生成しないことを示した。初期濃度のＧＬ（１．６ｍｇ／ｍＬ〜０．０５ｍｇ／ｍＬの範囲）を有する全ての試験管中の全ての懸濁液は、５ミクロンより大きい球体を有しておらず、脱溶媒和剤の添加後に凝集しない。安定化濃度のＧＬの添加後、全ての懸濁液のサイズ分布に変化はなかった。
【０１６４】
脱溶媒和剤を加えた後のコントロール試験管（最初の投与においてＧＬなし）中の球体へのＧＬの安定化濃度の添加は、水で希釈することにより球体を不溶性にしたが、調製品中で同じサイズ分布を維持した。
【０１６５】
マルトース（１８〜２８ｍｇ／ｍＬ）、乳糖（１８〜２８ｍｇ／ｍＬ）及びグリシン（０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する混合物を含む適切な賦形剤を、−１８度において凍結するか凍結乾燥する前に加えると、懸濁液中の球体のサイズ分布を維持する。それは、凍結試料の解凍又は凍結乾燥生成物の水による再構築後に、懸濁液の外観及び特性を変化させない。
【０１６６】
コメント及び結論：
米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号に開示されたような、「大きな球体」（直径が５ミクロンより大きい）の小数集団の存在（例えば、Ｌｏｔ Ｋ９４０１）は、低濃度の球体が投与された時に被験者によって容認され得る。
【０１６７】
５ミクロンより大きい球体又は粒子の最小量又は検出できない濃度を含む懸濁液を高濃度で投与することが有利であろう。
【０１６８】
本発明のアプローチは、低濃度（安定でない）架橋剤が、脱溶媒和剤の除去による球体の再溶解を防止し得ないが、その存在及び作用がより不均一な球体サイズを引き起こすという予期しない効果を有するという意外な発見を示す。このような、５ミクロンより大きい球体の除去は重大な医学的利点を有していた。安定でない球体の懸濁液は、凍結又は凍結乾燥を含む更なる処理工程において溶解しない球体の更なる利益を備えながら、球体の相対的に均一なサイズ分布を妨害又は変化させることなく、後に続く架橋剤濃度（安定化濃度）により持続的に安定化され得る。
【０１６９】
実施例６
試験管内における複数のヒト凝固因子でコーティングされたアルブミン球体
目的：ヒト血漿に暴露された球体は血漿由来の複数の凝固因子と同時に結合し得るかどうかを評価すること。
【０１７０】
原理：前の実施例において、フィブリノーゲン（第Ｉ因子としても知られている）を、Ｓｉｇｍａから購入し、例えば、Ｆ３８７９は約６０重量％のタンパク質を含み、８０％を超えるタンパク質は凝固可能であり；残りはクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムである。
【０１７１】
通常、粉末を通常の食塩水に溶解し、球体の懸濁液に加え、表面にフィブリノーゲンのコーティング又は球体のマトリクス内への埋め込みを達成した。
【０１７２】
本実施例は、球体を、試験管内において、凝固因子の完全な補体を含むヒト血漿に加えた時に、１種以上の凝固因子が自発的に球体に結合し得るかどうかを評価することを目的とする。
【０１７３】
材料及び方法：
界面活性剤を加えない、新規な「プレ−リンク」法を用いた。ＨＳＡ ２５％を供給業者Ａから購入し、洗浄剤又は任意の他の界面活性剤を加えることなく、水で１０％まで希釈した。試験管内のこのタンパク質溶液４ｍＬに、４ｍＬのＧＬ（水中に希釈した、１．６ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を振盪することにより混合した。３０秒後、１２ｍＬのエタノール（水中、７０％）を加え、混合物は混濁した。室温は約２１℃であった。１９℃〜２３℃の温度が許容される。
【０１７４】
血漿は、ヘパリン−抗凝固全血に由来する全ての細胞成分を除去した後に、健康なボランティアから得た。血漿は２．１７ｍｇのフィブリノーゲン／ｍＬを含んでおり；フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）及び第ＩＸ因子は正常範囲であった。
【０１７５】
フィブリノーゲン濃度は、競合免疫アッセイにより測定した。Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈから購入したフィブリノーゲン標準品を、１０％遮断薬（Ｐｉｅｒｃｅから購入；本実験において、この溶液をＮＳＢと呼んだ）を含む通常の食塩水で０〜５μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１７６】
結合フィブリノーゲン含有量のためにアッセイされる球体を、同様に、アッセイに適した、予想されるフィブリノーゲン濃度（球体結合形状において）の範囲に希釈した。ヤギ抗ヒトフィブリノーゲン抗体（本明細書においてＧＡＦと呼ぶ）及びペルオキシダーゼ酵素と結合したウサギ抗ヤギＩｇＧ（本明細書においてＲＡＧと呼ぶ）をＳｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈから購入し、それぞれ（ＮＳＢで）１：３０００及び１：２０００に希釈した。抗原（標準溶液、又は球体、通常２５μＬ）の一定量を１００μＬのＧＡＦ（加える抗原に対して過剰の抗体を含む）と混合した。インキュベーション後、９６穴プレート中のウェルに対し、１００μＬの混合物を加えた。ウェルを、飽和濃度のフィブリノーゲンを用いてプレコーティングした。次いで、過剰のＧＡＦ（球体上のフィブリノーゲンに結合した後の残り）を、プラスチックのウェル上に予め結合させたフィブリノーゲンと結合させた。適切な洗浄の後、１００μＬのＲＡＧを加えた。更に適切な洗浄の後、ペルオキシダーゼの基質を加え、黄色の反応物を生成させた。最も高いフィブリノーゲン濃度を有する試料は、大量のＧＡＦ（過剰濃度に由来）を除去し、その結果、最小の残余物がプラスチックのウェルに結合する。従って、試料中のフィブリノーゲン濃度が高くなると、ウェル中の色が濃くなる（可溶性の形態であろうと、球体表面又は内部に結合していようとも）。標準溶液の光学的濃度との光学的濃度（分光光度計）の比較により、興味のある試料中のフィブリノーゲン濃度が得られる。
【０１７７】
プラスチックウェルに結合するために利用できる（フィブリノーゲンを用いて可能であったように）、精製ヒトｖＷＦ又はヒト第ＩＸ因子の市販の供給品がないので、これらの凝固因子（球体に結合した）のアッセイは、ウサギＩｇＧマーカーに対して特異的ヒト抗原に最初に「変換する」間接的方法を必要とする。ウサギ抗−ｖＷＦ（Ｆ３５２０）及びウサギ抗−第ＩＸ因子（Ｆ０６５２）及びウサギ非特異的ＩｇＧ（Ｉ５００６）をＳｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈから購入した。適切な濃度のそれぞれの抗体溶液は、ＮＳＢで希釈することにより調製した。次いで、それぞれ１００μＬの抗体を１００μＬの球体と混合した。次いで、過剰（溶解したままである）の抗体を、球体懸濁液の遠心分離により除去した。この処理は、球体上の特定の抗原（ｖＷＦ又は第ＩＸ因子）の特定の量を、等量の球体に結合したウサギＩｇＧの一般化された抗原に変換した。
【０１７８】
次いで、再懸濁した球体を競合免疫アッセイに供し、球体に結合したウサギＩｇＧの量を測定した（球体上のヒトｖＷＦ又は第ＩＸ因子によって）。用いた抗体はペルオキシダーゼ酵素と既に結合している、ヤギ抗−ウサギ抗体（ＧＡＲ、過剰量）であった。次いで、残りの（ウサギＩｇＧにより球体に結合しない）ＧＡＲを、非特異的ウサギＩｇＧを予め結合したプラスチックウェルに結合させた。標準溶液について、非特異的ウサギＩｇＧを、ＧＡＲと反応させるために５〜２００μｇ／ｍＬの範囲に希釈した。プラスチックウェル表面に結合したＧＡＲの量を、ペルオキシダーゼ基質を加えることにより測定した。
【０１７９】
結果：
開示されたような「プレ−リンク」法を用いて製造されたアルブミン球体懸濁液（２００μＬ）の一定量を、ドナーの血漿（水で希釈し、血漿中、１．５ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン濃度を達成した，１６０μＬ）と混合した（エタノールの添加２０分以内）。比較のため、同じ懸濁液の他の一定量（２００μＬ）を１６０μＬの精製フィブリノーゲン（１．５ｍｇ／ｍＬ）と混合した。混合後、懸濁液は、約６ｍｇの球体／ｍＬを含んでいた。
【０１８０】
血漿、及び精製フィブリノーゲン溶液でコーティングした球体上のフィブリノーゲン含有量は、それぞれ、２０．４及び１８．１μｇフィブリノーゲン／球体１ｍｇであった。
【０１８１】
ＶＷＦ及び第ＩＸ因子のための特異的なウサギ抗体の量は、用いられた実験条件下で、それぞれ、５．２μｇ／ｍｇ及び０．４７μｇ／ｍｇ球体であった。
【０１８２】
コメント及び結論：
データは、血漿に由来する内在性フィブリノーゲン分子が、商業的供給源から得られた、精製フィブリノーゲン調製品と、同じ効果を有する球体と自発的に結合し得ることを示した。血漿を用いた場合、追加の凝固因子が同時に結合し得る。本実施例においては、ｖＷＦ及び第ＩＸ因子に対する抗体が市販されているので、これらの因子のみ（一例として凝固因子）を試験した。球体を全血と混合した時に、他の凝固因子、また、非凝固因子、タンパク質又は非タンパク質分子さえもが球体と結合し得ると期待される。
【０１８３】
５．２μｇ等量のウサギＩｇＧ（抗−ｖＷＦ）と比較し、１ｍｇの球体あたり０．４７μｇ等量のウサギＩｇＧ（抗−第ＩＸ因子）が結合するという事実は、ｖＷＦ分子と比較し、１ｍｇの球体あたりの第ＩＸ因子分子が少ないことを意味しない。この特異的抗体のそれぞれの抗原への結合特異性（１ｍｇの好転に対して結合する抗体のμｇ）は未知であり、これら２種の抗体及び抗原について非常に異なり得る。
【０１８４】
脱溶媒和剤を加える前に、タンパク質溶液に洗浄剤を加えないので、本実施例における「プレ−リンク」法は新規であった。また、３０秒という、タンパク質との短い「架橋剤反応時間」が用いられた。前に開示された特許において用いられたＧＬ相互作用時間と比較し、３０秒は短い時間であった。懸濁液は、５ミクロンより大きい球体を含まず、凝集体を含まなかった。
【０１８５】
本実施例においては、「プレ−リンク」球体の新規方法のみを試験したが、「ポスト−リンク」及び「ミド−リンク」及び「バイ−リンク」及び「バイミド−リンク」の新規な方法（全て界面活性剤を加えない）により製造された球体は、試験管内及び生体内において血漿と接触させることにより、全て複数の凝固因子、他の生体分子又は薬剤と結合することができると予想される。
【０１８６】
複数の凝固因子の組み合わせを含む球体は、結合フィブリノーゲンのみを含む球体と比較し、少なくとも同程度であるほど、又は優れてさえいる医学的効果を有し得ると予想される。
【０１８７】
実施例７
バイ−リンク法を用いたアルブミン球体の合成、それに続く種々の濃度のフィブリノーゲンによるコーティング
目的：
球体上に結合したフィブリノーゲンの最小量が、血小板減少症のウサギにおいて出血時間を改善するかどうかを評価する目的のため、バイ−リンク法及びＡｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，カリフォルニア以外の供給業者を用いた、濃度の高いフィブリノーゲンを含む、多くの球体調製物を製造すること。
【０１８８】
原理：Ｙｅｎ（米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号「フィブリノーゲンでコーティングしたミクロスフェア」）は、血小板減少症のウサギにおける出血時間の改善をもたらす、フィブリノーゲンでコーティングされた球体の製造方法の詳細な説明を開示している（図４、５、６）。この開示中で球体を製造するために用いられたＨＳＡは、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，カリフォルニア州から購入した（カラム１０、１行）。有利な性質が、原資料としてこの供給業者由来のＨＳＡを用いることの特定の結果であったかどうかは明らかでない。Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ’ｓの製品（Ｂｕｍｉｎａｔｅ、ブミネート）は、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより供給されるＨＳＡとは大部分異なっている（塩化物及び重炭酸塩の濃度に関して）（実施例１を参照）ように思われたので、本実施例において、ブミネートは、血小板減少症のウサギにおいて更に評価される粒子を製造するために用いられた（実施例に開示）。
【０１８９】
更に、既にフィブリノーゲンでコーティングされた球体は、全て、凝集体形成を防止するために界面活性剤の存在下に製造された。このような化学物質、特にテトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）が、特に、それらの効果をもたらすか寄与する球体の表面特性又は他の特性について効果を有するかどうかは明らかでなかった。必要な変数を減らすため、本発明において示される新規な方法はＳＴＳの存在を必要としないが、本実施例におけるバイ−リンク球体を、フィブリノーゲンの存在又は非存在下、ＳＴＳの存在下に製造した
【０１９０】
また、米国特許第６，２６５，９８８Ｂ１号には、シリコーンチューブシステムを通してそれぞれの試薬を、混合のために重大な混合ポイントに送達するための種々のポンプを用いることにより、球体を製造する方法が開示されている。それは、大量の球体懸濁懸濁液の製造のために設計されている。本実施例は、対照的に、剛直なプラスチックチューブ又はガラスフラスコ中で少量の薬剤の混合を達成した。
【０１９１】
材料及び方法：ＢＳＡ ２５％及びヒトフィブリノーゲンは、いずれもＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．から購入した。グルタルアルデヒド（ＧＬ）はＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＥＭグレード、ポートワシントン、ペンシルベニア州）から購入した。テトラデシル硫酸ナトリウム（以前はＴｅｒｇｉｔｏｌの名称でＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅにより製造されていたアニオン性界面活性剤と同じであるＳＴＳ ２７％、Ｎｉａｐｒｏｆ４）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから購入した。
【０１９２】
米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号の開示された先行技術のような混合接合部における濃度に可能な限り接近させるため、本実施例のために以下の工程が用いられた：
（ａ）正確な濃度の塩とともに洗浄剤を含むアルブミン溶液の調製：最初に、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに６．２５ｍＬの水、次いで５ｍＬのＳＴＳ（水中に０．２ｍｇ／ｍＬに希釈）、次いで３．７５ｍＬの１０倍の食塩溶液（９０ｍｇの塩化ナトリウム／ｍＬ）、及び最後に３５ｍＬのブミネート（２５％）を加えた。この溶液は、次の工程に使える状態である、タンパク質溶液中に適切な量のＳＴＳ及び塩化ナトリウムを含み、ｓｎＨＳＡと呼ばれる。
【０１９３】
従って、ｓｎＨＳＡ中の成分の濃度（ＧＬ及び他の試薬を加える前）は以下の通り、すなわち：ＨＳＡ（１７．５％）：ＳＴＳ（０．０２ｍｇ／ｍＬ）であり；塩化ナトリウム（６．７５ｍｇ／ｍＬ、２５％のＨＳＡ貯蔵溶液から寄与する任意のカチオン又はアニオンを計算しない）を加えた。
（ｂ）安定でない濃度及び安定化濃度のＧＬを、ＧＬの貯蔵溶液（１０％）を、水で、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＬ調製）及び１２．５ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＬ調製）まで希釈することにより調製した。
（ｃ）５００ｍＬのガラス製フラスコ中で、エタノールを水で７０％まで希釈した。
相対的に大量が必要なため、溶液混合物の一部内で局所でのアルコールの高濃度を防止するため、全量を２個の等しい一定量ずつタンパク質溶液に加えた。
（ｄ）ヒトフィブリノーゲン溶液（各１０ｍＬ）を、フィブリノーゲン貯蔵溶液（２％）を通常の食塩水で希釈し、それぞれ２．０、１．７５及び１．５ｍｇ／ｍＬとすることにより調製した。この濃度は、混濁した球体懸濁液に加える前のフィブリノーゲン濃度を意味する（混濁した球体懸濁液の容量に対し、約０．２容量の比のフィブリノーゲン溶液を加える）。
【０１９４】
室温（許容される、１９℃〜２３℃）における各工程の後に、前記成分のそれぞれを振盪することによって混合した。各工程において示される時間は、時間０に続く実際の時間であって、前の工程からの時間間隔であった。工程毎の混合処理は以下の通りである：
【０１９５】
調製品７−Ａについて：（１）貯蔵溶液から６．２ｍＬのｓｎＨＳＡを除去し；（２）時間０において、６．２ｍＬの、安定でない濃度のＧＬを加え；（３）１５秒において、脱溶媒和剤として、１０．５ｍＬのエタノール（７０％）を加え、溶液の一部でわずかに濁った外観を観察することができ、これはポリプロピレンチューブを振盪することによりすぐに再溶解（又は透明になる）され（アルコールの局所的な高濃度は、混合を改善することにより再分配された）；（４）３０秒において、別にエタノール（７０％）を加え；懸濁液が、完全かつ安定的に混濁し；（５）２分において、１．３ｍＬの、安定でない濃度のＧＬを加え；（６）５分において、４．１ｍＬの、１０倍の食塩水（９０ｍｇ／塩化ナトリウム／ｍＬ）を加え、懸濁液を生理的等張にし；（７）６．５分において、８．３ｍＬのフィブリノーゲン溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。
【０１９６】
調製品７−Ｂ及び調製品７−Ｃについて：フィブリノーゲン濃度が、それぞれ１．７５及び１．５０ｍｇ／ｍＬであったことを除き、前記方法を繰り返した。
【０１９７】
コントロール球体懸濁液である調製品７−Ｄについては工程（７）を省略した。
【０１９８】
４種の球体調製品を製造した後、少なくとも１０倍過剰の蒸留水に対して３回透析し、脱溶媒和剤、任意の透析可能な分子及び洗浄剤を除去した。マルトース、乳糖及びグリシンからなる適切な賦形剤を、−１８℃における凍結による貯蔵を容易にするために加えた。
【０１９９】
結果：
調製品７−Ａ、７−Ｂ、７−Ｃ及び７−Ｄ中の球体の濃度（凍結した調製品を解凍した後の試料における）は、それぞれ、４．６、４．６、３．０及び７．１ｍｇ球体／懸濁液１ｍＬであり；結合したフィブリノーゲンの量は、それぞれ１ｍｇの球体あたり３．５、２．７、３．１及び０μｇであった。
【０２００】
４種全ての調製品中の球体の平均サイズは、直径約０．８ミクロンであり、５ミクロンより大きい球体又は粒子を含んでいなかった。調製品は、全て、サイズ分布において均一であると思われた。
【０２０１】
コメント及び結論：データは、新規なバイ−リンク法を用いて、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ以外の供給業者（このケースにおいては、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ）に由来するＨＳＡを用いて、ＳＴＳの存在下に製造されたアルブミン球体がフィブリノーゲンと結合し得ることを示した。用いられたフィブリノーゲン溶液が１．５ｍｇ／ｍＬである場合、結合したフィブリノーゲンの量は３．１μｇ／ｍｇ球体であり、用いられたフィブリノーゲン溶液が１．７５ｍｇ／ｍＬである場合、結合したフィブリノーゲンの量は２．７μｇ／ｍｇ球体に匹敵するので、データは、これらの混合条件下で１．５ｍｇフィブリノーゲン／ｍＬは、本発明における球体をコーティングするのに用いられる飽和濃度に達することを示した。
【０２０２】
データは、有用な球体が、タンパク質溶液中に洗浄剤を加えることなく新規なバイ−リンク法により製造されてもよく、フィブリノーゲン溶液を、このような球体懸濁液に加えることができることを示した。新規な方法を用いて製造された懸濁液は、大きな球体の亜母集団をもたらす任意の先行技術の方法（同一の初期濃度の試薬を用いた）により製造された懸濁液に対し、検出可能な量の大きい球体又は粒子（５ミクロンを超える）を含まない。
【０２０３】
データは、脱溶媒和剤が２回の工程に分けて加えられ、生物学的有用性及び安全な球体懸濁液をもたらすことを示した。
【０２０４】
実施例８
血小板減少症のウサギにおける、フィブリノーゲンでコーティングされたアルブミン球体の医療効果、及びコントロール球体の医療効果
目的：フィブリノーゲンでコーティングされた球体及びフィブリノーゲンを含まない球体（ＣＳ）と比較した、バイ−リンク法により製造されたアルブミン球体の静脈注射の医学的な利点を評価すること。
【０２０５】
原理：出血時間（ＢＴ）又は出血量（ＢＶ）の改善における効果を証明するための、血小板減少症のウサギを用いた以前の生体内試験は、界面活性剤の存在下にポスト−リンク法で製造された球体（ＳＴＳ）を必要とした。本実施例は、バイ−リンク法により製造された球体が同じ効果を有するかどうかを評価するために設計された。
【０２０６】
バイ−リンク法により製造した球体を、以前に開示されたポスト−リンク法を用いて製造されたものと可能な限り同じにするために、本発明において新規なバイ−リンク法は界面活性剤又は洗浄剤の任意の追加の存在を必要としないが、本実施例における球体はＳＴＳの存在下で製造した。これは、医療効果における洗浄剤又は界面活性剤の追加の効果が知られていないという事実を考慮して実施された。血小板減少症のウサギの出血時間を短縮しない球体を製造するバイ−リンク法においては、それほど紛らわしくない１つの要因（製造工程における、界面活性剤の潜在的な有利な効果の要因）があるであろう。
【０２０７】
本実施例におけるデータは、界面活性剤の存在下に製造されたバイ−リンク球体が生体内で効果的であることを示した。以下に開示する、それに続く実験は、タンパク質溶液中の洗浄剤の存在がこの新規なバイ−リンク法により製造される球体の効果における要因でないことを示すであろう。タンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤を加えないで製造された球体も、生体内で効果的であった。
【０２０８】
材料及び方法：
バイ−リンク球体の製造方法を実施例７に開示した。特に、３．５μｇフィブリノーゲン／球体１ｍｇを含む球体（懸濁液１ｍＬあたり４．６ｍｇの球体を含む、調製品７−Ａ）、及びフィブリノーゲンを含まないコントロール球体（懸濁液１ｍＬあたり７．１ｍｇの球体を含む、調製品７−Ｄ）を、本明細書において生体内試験のために用いた。
【０２０９】
種々の血小板代替物製品を評価するためにＢＴを用いる方法は、Ｄ．Ｈ．Ｌｅｅ及びＭＡ．Ｂｌａｊｃｈｍａｎによる「新規な血小板生成物及び代替物」（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ １２，Ｎｏ ３，Ｊｕｌｙ １９９８，ｐｐ １７５−１８７）に開示された。ウサギ血小板の総数は手作業による方法により実施し、動物に注入したタンパク質球体によって影響されなかった。
【０２１０】
結果：
表８−１は、種々の時間における血小板の総数（×１０億／Ｌ）、及びＢＴ（秒）を示した。９００秒を超えて出血が続くウサギは、出血を止めるために一時的に傷を圧迫された。従って、９００秒を超えるＢＴは、注入された生成物の効果の欠如を示すと解釈された。
【０２１１】
等量の液体の注入を確実にするため、６羽全てのウサギは、体重１ｇあたり６ｍＬの球体懸濁液の静脈投与を受けた。
【０２１２】
ウサギ１、２、３は、フィブリノーゲンを有する球体（調製品７−Ａ）を注入され、ウサギ４、５、６はコントロール球体（調製品７−Ｄ）を注入された。
【０２１３】
表８−１ 照射された血小板減少症の血小板総数、並びに球体の投与後１時間及び２時間における出血時間
【０２１４】
【表４】

【０２１５】
データは、重量及び血小板の総数が６羽のウサギについて同程度であることを示し、ウサギ６が最も重い血小板減少症であった。
【０２１６】
ウサギ１は、調製品７−Ａが、フィブリノーゲンでコーティングされた球体の注入の２４時間まで（好ましくはこれを超え）続く効果を明らかに有することを示した。ウサギ２は、注入後１時間において効果のなかったものが２４時間において明らかに効果的であったことを示した。遅延の理由は明らかでない。効果は注入の１時間後にすぐに起こるが、このような時間ポイント（例えば、４時間の時間ポイント）におけるＢＴは実施していない。ウサギ３は、注入１時間後に効果的であったものが、この濃度で注入２４時間後には観察されなかったことを示した。この観察が、改善することができた相対的低濃度（測定するのに必要な有効濃度と比較し）のためであったかどうかは、この実施例からは明らかでない。しかし、全体として、ウサギ１〜３由来のデータの組み合わせは、予想されたように、新規なバイ−リンク法（しかし、ＳＴＳの存在下で）により製造した場合でさえ、合成工程の一部として試験管内でフィブリノゲンでコーティングされた球体が効果的であることを示した。
【０２１７】
ウサギ５、６により、全体的に意外な結果が示された。ウサギ４は、調製品７−Ｄ（生体内でフィブリノーゲンが加えられていない球体）の投与１時間及び２４時間後における効果を示さなかったが、ウサギ５及び６は、試験管内でフィブリノーゲンでプレコーティングされていない球体の明らかな効果を示した。ウサギ６は、注入前に最も低い血小板総数を示したが、ＢＴの改善は明らかに最良であった（２４時間の時間ポイントにおいて１４５秒）。ウサギ５及び６におけるＣＳの効果は２４時間まで続き、実際に、２４時間の時間ポイントにおいては１時間における値よりも良好であることがわかった。
【０２１８】
コメント：なぜ、製造工程の一部として生体内で加えられたフィブリノーゲンを含まないコントロール球体が、生体内で効果を示すかを説明するための仮説はいくらでもある。１つの有望な理論は、バイ−リンク法により製造されたコントロール又はブランク球体が、循環システム中に入った後に、内在性フィブリノーゲン及び／又は他の凝固因子及び／又は他の生体分子を捕獲し得ることであった。
【０２１９】
異なる製造方法（開示された先行技術に従い）を用いて、以前に製造されたコントロールポスト−リンク球体が、同じ動物モデル内における効果の証明に失敗した理由は明らかでなかった。本発明のバイ−リンク球体のバッチは、界面活性剤の存在下（本発明は、それを必要としないが）に、意図的に製造されたので、結果における相違は、タンパク質溶液中の界面活性剤又は洗浄剤の非存在又は存在に由来する効果によらなかった。
【０２２０】
バイ−リンク法により製造されたコントロール球体は、フィブリノーゲンを含む生体内でプレコーティングされた球体と比較し、いくつかの利点を有する。（１）フィブリノーゲンを加えることを必要とする工程が排除され、時間及び材料の費用を節約する；（２）動物又は患者は、「活性化装置」において、種特異的フィブリノーゲンの天然源、又は活性生物学的成分を供給し、その結果、異なる種由来の外来抗原の供給源への暴露を回避する。
【０２２１】
種特異的血清アルブミンの商業的供給源は、 種特異的フィブリノーゲン、又は他の有用な生体分子よりも入手しやすそうであるので、必要であれば、種特異的フィブリノーゲン供給源、又は種特異的な有用な生体分子を位置づけるか製造しなければならないという問題なしで、獣医師の応用のために種特異的アルブミンを用いて球体を製造することができる。
【０２２２】
バイ−リンク法により製造した球体の毒性は、本明細書で実施しなかった。しかし、ポスト−リンク球体の以前の研究は、ポスト−リンク球体懸濁液（直径５ミクロンより大きい球体を含む）は、大きな粒子の排除により除去し得る。従って、バイ−リンク球体は、大きな球体を含むポスト−リンク調製物と比較し、改善された毒性プロフィールをしめすことが予想される。
【０２２３】
実施例９
新規なプレ−リンク及びバイ−リンク法により製造されたコントロール球体の医療効果の比較
目的：生体内での血小板減少症のウサギの出血時間による潜在的な改善における生成物の評価のための、２種の方法を用いた、異なるサイズを有する、４種のコントロール球体（ＣＳ）を製造すること。
【０２２４】
原理：
実施例８は、バイ−リンク法により製造されたＣＳ（調製品７−Ｄ）が血小板減少症のウサギにおけるＢＴを改善することを示した。本実施例は、生体内における血小板減少症のウサギにおける出血時間（ＢＴ）の改善における、球体のサイズによる効果の相違を評価するため、再度バイ−リンク法を用いて、球体、１つは約１〜２ミクロン（中間サイズの球体）及び他は直径１ミクロンより小さい球体（小さい球体）を製造することを目的とし
【０２２５】
球体におけるサイズの相違は、得られたアルブミン溶液を他の非タンパク質溶液又は試薬と混合する前に、アルブミン溶液に加えた塩化ナトリウムの量によって調製された
【０２２６】
更に、本発明の新規なプレ−リンク法はタンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤が存在する必要がないが、本実施例においては、また、界面活性剤の添加の存在下に、プレ−リンク球体も製造された。開示された先行技術（ポスト−リンク球体懸濁液をもたらす）との比較を可能にするため、本実施例において合成されたプレ−リンク球体の平均サイズを、可能な限り１〜２ミクロンに近づけ（本明細書において、「中間サイズの球体」と呼ぶ）、大きな球体の集団がないようにした。
【０２２７】
更なる改良（アルブミン溶液中の塩化ナトリウム濃度を調整することにより）は、直径１ミクロンより小さいプレ−リンク球体を製造した（本明細書において、「小さい球体」と呼ぶ）。
【０２２８】
４種全ての懸濁液を、生体内での血小板減少症のウサギにおけるＢＴの改善における効果について評価した。
【０２２９】
材料及び方法：
材料は、実施例７と同じ供給業者から得た；特に、用いた２５％ ＨＳＡはＢａｘｔｅｒ由来のブミネートであった。
【０２３０】
「中間サイズの球体」（１〜２ミクロン）の合成のために、「ｓｎＨＳＡ−Ｍ」溶液を以下のように調製した：（ａ）５０ｍＬのポリプロピレンチューブに、２１．２５ｍＬの水を加え；（ｂ）次いで、３．７５ｍＬの１０倍食塩水（９０ｍｇ塩化ナトリウム／ｍＬ）を加え；（ｃ）次いで、５ｍＬのＳＴＳ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を加え；（ｄ）次いで、２０ｍＬの、供給業者Ｂ由来のＨＳＡ−２５％を加えた。全ての成分を十分に混合し、後述するような種々の球体を合成するのに用いられる一定量を除去した。
【０２３１】
「ｓｎＨＳＡ−Ｍ」と、最初の非ｓｎＨＳＡ−Ｍ試薬とを混合する時間である時間０から特定の時間において試薬を加えた。これらの時間指定は、即時に加える試薬の添加からの時間間隔ではなかった。
【０２３２】
プレ−リンクで製造した中間サイズの球体（ＰＭＳ）について：６．２７ｍＬの「ｓｎ−ＨＳＡ−Ｍ」（前述）を、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。次いで、時間０において、６．２７ｍＬのＧＬ（水中、１．６ｍｇ／ｍＬ）を加えた。１５秒において、１２ｍＬのエタノール（水中、７０％）を加えた。３０秒において、追加の１２ｍＬのエタノール（水中、７０％）を加えた。次いで、混濁した懸濁液を水中で透析し、懸濁液から、全ての拡散性分子を除去した。この調製品を、ＰＭＳと呼んだ。
【０２３３】
バイ−リンクで製造した、中間サイズの球体（ＢＭＳ）について：６．２７ｍＬの「ｓｎ−ＨＳＡ−Ｍ」（前述）を、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。次いで、時間０において、６．２７ｍＬの安定でない濃度のＧＬ（水中、０．１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。１５秒において、１２ｍＬのエタノール（水中、７０％）を加えた。３０秒において、追加の１２ｍＬのエタノール（水中、７０％）を加えた。次いで、混濁した懸濁液を水中で透析した。この調製品を、ＢＭＳと呼んだ。
【０２３４】
顕微鏡検査は、ＭＰＳ及びＢＭＳ調製品のいずれにも、凝集体又は５ミクロンより大きい球体を示さなかった。
【０２３５】
小さい球体（１ミクロン未満）の合成について、「ｓｎＨＳＡ−Ｓ」は以下のようにして製造した：（ａ）５０ｍＬのポリプロピレンチューブに、２２．５ｍＬの水を加え；（ｂ）次いで、２．５ｍＬの１０倍食塩水（９０ｍｇ塩化ナトリウム／ｍＬ）を加え；（ｃ）次いで、５ｍＬのＳＴＳ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を加え；（ｄ）次いで、２０ｍＬの、供給業者Ｂ由来のＨＳＡ−２５％を加えた。全ての成分を十分に混合し、後述するような種々の球体を合成するのに用いられる一定量を除去した。「ｓｎＨＳＡ−Ｓ」及び「ｓｎＨＳＡ−Ｍ」の間の相違は、加える塩化ナトリウム含有量であった。
【０２３６】
プレ−リンクによる小さい球体（ＰＳＳ）の製造法について：ｓｎＨＳＡ−Ｍ溶液に代え、「ｓｎＨＳＡ−Ｓ」（直前に記載したような）を用いたことを除き、プレ−リンクによる中間サイズの球体（ＰＭＳ）におけるのと同じ容量及び工程を用いた。この球体懸濁液は、ＰＳＳと呼ばれた。
【０２３７】
バイ−リンクによる小さい球体（ＢＳＳ）の製造法について：ｓｎＨＳＡ−Ｍ溶液に代え、「ｓｎＨＳＡ−Ｓ」（直前に記載したような）を用いたことを除き、バイ−リンクによる中間サイズの球体（ＢＭＳ）におけるのと同じ容量及び工程を用いた。この球体懸濁液は、ＢＳＳと呼ばれた。
【０２３８】
顕微鏡検査は、ＰＳＳ及びＢＳＳ調製品のいずれにも、凝集体又は５ミクロンより大きい球体を示さなかった。最も一般的な球体サイズは、量調製品において０．８ミクロンであると思われた。
【０２３９】
結果：
ＰＭＳ、ＢＭＳ、ＰＳＳ及びＢＳＳ懸濁液中の球体濃度（解凍により球体の凝集を起こすことなく、試料を凍結するために適切な賦形剤を加えた後）は、それぞれ懸濁液の３．３、２．０６、４．４６及び２．５４ｍｇ／ｍＬであることがわかった。
【０２４０】
また、体重１ｋｇあたり、各懸濁液６ｍＬを、血小板減少症のウサギに注入した（注入により、同じ程度の水和を維持するため）。
【０２４１】
表９−１は、全て、生体内で、フィブリノーゲンを予め加えないか、プレコーティングしていない、各球体の調製品を注入した後に、血小板減少症のウサギ中で出血時間の改善を示した。
【０２４２】
任意の球体の注入を受けていないが、又は通常の食塩水のみを注入された、血小板減少症のウサギの出血時間は、歴史上、９００秒の間、一貫しており、その結果、本実施例において繰り返さないか又は報告されない。
【０２４３】
ウサギ１、２、３は調製品ＰＭＳ（プレ−リンクによる中程度の球体）を注入され、ウサギ４、５、６は調製品ＢＭＳ（バイ−リンクによる中程度の球体）を注入され、ウサギ７、８、９は調製品ＰＳＳ（プレ−リンクによる小さい球体）を注入され、ウサギ１０、１１、１２、１３は調製品ＢＳＳ（バイ−リンクによる小さい球体）を注入された。
【０２４４】
表９−１：血小板減少症のウサギにおける、血小板総数及び出血時間
【０２４５】
【表５】

【０２４６】
データは、１３羽全てのウサギが血小板減少症であり、注入２４時間後の血小板総数を回復しなかったことを示した。
【０２４７】
調製品ＰＭＳは、４種の調製品の中で最も効果がないように思われた。１時間及び２時間の時間ポイントにおけるＢＴの改善の欠如が注入１時間後において測定した効果の発現遅延による−かどうかは、ウサギ１が２４時間で軽度の改善を示したので、明らかでない。観察の他の説明は、１ｍＬあたりの粒子の数に関する量的効果であった。例えば、直径２．４ミクロンの球体の質量を計算する式は、直径０．８ミクロンである他の球体の質量の２７倍の質量を有することを示した。従って、１ｋｇあたりの球体ｍｇに関して同じ投与量が注入された場合、注入される２．４ミクロンの球体の数は、注入される０．８ミクロンの球体の数よりも２７倍少ないであろう。
【０２４８】
調製品ＢＭＳを注入したウサギ（ナンバー４、５６）においては、３羽のウサギのうち１羽が、１時間でＢＴにおいて改善を示した。２４時間までに、３羽全てが効果を示した。
【０２４９】
小さい球体を注入されたウサギ、例えば、ウサギ７、８、９（ＰＳＳを注入）においては、３羽全てのウサギは１時間で効果を示さなかったが、３羽全ては注入２４時間までに改善を示した。
【０２５０】
ＢＳＳを注入したウサギにおいては、ナンバー１０、１１、１３のウサギは、１時間及び２４時間の時間ポイント、いずれにおいても効果を示した。また、２４時間の時間ポイントにおける結果は、１時間の時間ポイントにおけるＢＴの結果よりも更に良好であり、これは、これらの球体の効果が２４時間よりも長く持続することを示す。なぜ、ウサギ＃１２が、１時間及び２４時間の時間ポイントのいずれにおいても効果をしめさなかったのかは明らかでない。ウサギ＃１２は、他の３羽のウサギよりも血小板総数が実質的に少なかった。実際、ウサギ１３は、全体として血小板の総数が低かったが、１時間及び２４時間の時間ポイントのいずれにおいてもＢＴの良好な改善を示した。
【０２５１】
結論：また、バイ−リンク法（サイズに関係なく）を用いて製造されたコントロール又はブランクの球体は、ＢＴの改善において効果を示し、実施例８の結果を確認した。プレ−リンク法（サイズに関係なく）を用いて製造されたコントロール又はブランクの球体も効果を示した。これらの結果は全体的に意外であった。
【０２５２】
本実施例においては、４種全ての調製品は、タンパク質溶液内における追加の界面活性剤の存在下で製造したが、後述する実施例は、界面活性剤又は洗浄剤の非存在下で製造した球体が、生体内で血小板減少症のウサギにおいても効果的であったことを示した。
【０２５３】
血小板減少症のウサギモデルは、高度に再現可能であり、実施例間で一貫性がある。なぜ、以前に開示されたポスト−リンク法により製造されたコントロール球体が、フィブリノーゲンをコーティングしたポスト−リンク球体（合成法の一部として試験管内で加えたフィブリノーゲン）のための実験的コントロールとしてその評価の長期間の間、生体内でＢＴの改善をもたらさなかった（例えば、米国特許第６２６４９８８Ｂ１号の図６中の「ＣＳ」）かは、この時点では明らかでなかった。
【０２５４】
本明細書において、データは、本明細書で開示されたプレ−リンク及びバイ−リンク法に対し、先行技術におけるポスト−リンク法により製造された球体の性質において本質的な相違があり得ることを示した。
【０２５５】
他の種類のアルブミン（例えば、組換え型アルブミン又は修飾アルブミン）、若しくは他の種に由来するアルブミン、例えば、ウシ又はウマアルブミン、若しくは更なる単離又は精製なしで様々な種から得た血漿から直接得たアルブミンを用いて、バイ−リンク又はプレ−リンク法、若しくは本明細書に開示された他の方法を用いて製造された球体懸濁液が、動物への投与前に、試験管内におけるフィブリノーゲンを用い、プレコーティングなしで、等しく効果を生じ得ることが予想される。
【０２５６】
新規なミド−リンク法又は本発明において開示された、任意の新規方法を用いて製造された球体に関し、それらの球体が、生体内に投与された後にフィブリノーゲン又は他の有用な生体分子にも結合することができ、（血小板数の低下又は機能障害の原因に関係なく）血小板減少症の患者においてＢＴの改善に効果的となることも予想される。
【０２５７】
実施例１０
界面活性剤の添加なしでのミド−リンク球体の製造、及び最終滅菌後の血小板減少症のウサギにおけるそれらの効果の評価
目的：本実施例はいくつかの目的を有する：（１）Ｂａｘｔｅｒから購入したＨＳＡ溶液を用いてミド−リンク法により小さい球体を製造することができるかどうかを見ること。（２）このような球体が、最終滅菌としての密封プラスチックボトル内における高圧に耐え得るかどうかを評価すること。（３）このような処理が、血小板減少症のウサギにおける出血時間の改善において、界面活性剤の非存在下に製造されたこれらの球体懸濁液の効果に影響をおよぼすかどうか。
【０２５８】
原理：球体調製品の効果を評価する全ての前の実施例において、先行技術において開示された血小板減少症のウサギのデータと比較するために、球体は、常に界面活性剤（特にＳＴＳ）を加えて製造された。しかし、本発明においては、５種全てのアプローチを用いる新規な試験管内での方法（新規なプレ−リンク、新規なミド−リンク、新規なポスト−リンク、新規なバイ−リンク及び新規なバイミド−リンク）が、追加の界面活性剤の存在を必要とせず、大きな球体（５ミクロンを超える）がなく、凝集のない懸濁液をもたらし得ることが発見された。
【０２５９】
試験管内での製造方法への追加した界面活性剤の存在又は非存在が、生体内でなんらかの影響を及ぼすかどうかは、理論から予測することができない。例えば、球体の表面が製造の間にわずかに変性した場合、界面活性剤の存在又は非存在のため、身体は、食作用により、又は生体内の効果の減少又は欠如を導く他の生理的防衛により、このような球体を除去する傾向にあるであろう。生体内で血小板減少症のウサギに注入することによる評価は、相変わらず、界面活性剤の非存在における新規な方法により製造される球体が効果的であるかどうかを評価するための最良の方法である。
【０２６０】
良好な製造工程は、瓶の内部の内容物が、シールを固定した後に滅菌に供される「最終滅菌」工程を予期するであろう。食品工業にいおては、味及び触感を損失することなく魚介類を滅菌するために高圧が用いられてきた。例えば、Ｒ．Ｃｈｅｒｅｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７０（８），ｅ４７７−ｅ４８３による、「シーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ Ｌ．）の切り身の触感及び微細構造における高圧の影響」を参照されたい。
【０２６１】
材料及び方法：
予備的な実験（データは示さず）は、全てグルタルアルデヒド（ＧＬ）を、０．５ｍｇのＧＬ／ｍＬの濃度で含むエタノールの混合物（１００％エタノールを、水で４５％〜７５％の範囲に希釈）が、多くのアルブミン濃度（３％〜１８％の範囲）を有する球体懸濁液を製造するために用いることができることを示した。
【０２６２】
先行技術において議論した球体懸濁液は、脱溶媒和剤として、その中にＧＬを含まない７０％アルコールを用いるのみで製造された。更に、先行技術においては、ＧＬは、分離工程において、エタノールを添加する前又は後に加えた。従って、混合物中に４５％という低濃度のエタノールを含むエタノール溶液の使用は新規なアプローチであった。更に、脱溶媒和剤中の架橋剤を含ませることは革新的であった。
【０２６３】
架橋剤としてＧＬを含む、このようなエタノール溶液の任意の混合物（ミド−リンク法において脱溶媒和剤として用いられる混合物）は、アルコール含有濃度を示すための番号を付随し、ＥＧと呼ばれるであろう。例えば、ＥＧ７０は、７０％のエタノール濃度であることを意味する（ＧＬは０．５ｍｇ／ｍＬで一定）。予備的実験において（データは示さず）、脱溶媒和剤として用いられるＥＧ混合物中のエタノールの高い濃度、球体の高収率が、アルブミン溶液の所定の初期濃度（ＥＧを加える前の濃度）から得ることができることがわかった。また、アルブミンの高い初期濃度（ＥＧを加える前の濃度）は、ＥＧ溶液を加えた後に懸濁液中で高濃度球体をもたらすであろう。
【０２６４】
本実施例においては、以下の工程が続く：（１）２５％ブミネートを水（界面活性剤又は洗浄剤を加えていない）で希釈し、９２．３ｍＬの５．５％溶液を作成し；（２）５．５％アルブミン溶液に、３０７．７ｍLのＥＧ６０を急速に加え、４００ｍＬの混濁した球体懸濁液を作成する。
【０２６５】
懸濁液を、室温で、それぞれ１０倍過剰の水で３回透析し、透析可能な分子を除去した。透析した懸濁液の顕微鏡試験により、０．１ミクロン未満の微粒子（おそらく球体）が、非常に密集して観察された。固体は小さすぎ、１０００倍拡大の位相差顕微鏡下では、個々の球体として見えなかった。
【０２６６】
２７グラムの乳糖、２７グラムのマルトース及び１２グラムのグリシン（全て、Ｓｉｇｍａから購入）を３００ｍＬの水に溶解することにより賦形剤を調製した。全ての糖類及びアミノ酸を加えた後の最終容量は３００ｍＬを超えた。溶液を０．２ミクロンのフィルターでろ過し、１容量部を、３容量部の球体懸濁液と混合した。
【０２６７】
球体の濃度（透析後及び賦形剤添加後）は約５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２６８】
最終滅菌：球体懸濁液（賦形剤を含む）をプラスチックボトル（ポリオレフィン、エチレン及びプロピレンのコポリマー、又はＨｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃにより販売されているＬｉｆｅＳｈｉｌｄ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｖｉａｌｓ，注射用滅菌水のためのＬａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＵＳＰ）中に分散させた後（１０ｍＬ）、灰色のブチルストッパーをきつく配置し、アルミニウムのフリップオフキャップ（Ｋｉｍｂｌｅから購入）を付けた。文献に開示されたもののような標準的な高圧装置を用いて瓶を加圧した。タンク内の温度は３９°Ｆで開始し、最も高い稼働温度は７９°Ｆであった。非常に高い静水圧（６００ＭＰａ）が適用され、平均上昇時間は約２：１２分であった。各１分の連続稼働を、リセット及びタンク水の再冷却のための時間を可能にするために各稼働間に焼く５分をもたせて実施した。加圧処理後のプラスチックボトル中の球体懸濁液の肉眼に対する全体的な外観は、加圧前から変化しなかった。位相差顕微鏡下での検査は、サイズにおける認識できる変化は示さなかった。球体懸濁液中で、凝集体又は塊は残存しなかった。この６００ＭＰａの高圧下、全ての通常の細菌及びウイルスが死滅することが期待される。
【０２６９】
最終滅菌後、球体懸濁液を含む瓶の一部を室温に、他を冷蔵温度に、残りは−１８℃で凍結した。それぞれの条件下で、少なくとも７ヶ月間、視覚及び顕微鏡検査により、全ては変化がないように思われた。
【０２７０】
室温に保存した球体懸濁液を調製品１０−Ｂと命名した。
【０２７１】
結果：
表１０−１は、プラスチック瓶中で最終滅菌し、室温（２２〜２８℃）に約３．５ヶ月（ウサギ１、２、３について）又は約８ヶ月（ウサギ２１、２２、２３について）保存した球体を注入した後の血小板減少症のウサギにおける出血時間（ＢＴ）の改善を示した。基本的に、ウサギは同じプロトコールにより調製し、ウサギ１ｋｇあたり６ｍＬの調製品１０−Ｂを注入した。調製品１０−Ｂ中の球体の濃度は４．６ｍｇ／ｍＬであり；従って、投与量は２７ｍｇ球体／ウサギ１ｋｇであった。
【０２７２】
表１０−１：最終滅菌のために非常に高い静水圧に暴露された球体の注入前（ｐｒｅ）及び注入後（ｐｏｓｔ）の血小板減少症のウサギにおける血小板総数（Ｐｌｔ Ｃｔ，１０億／Ｌ）及び出血時間（秒）。
【０２７３】
【表６】

【０２７４】
コメント：
以前の実験においては、任意の時間にある容量のエタノール（通常、水で７０％に希釈し、ＧＬ又は他の架橋剤を含まない）を、２：１の比を超えてアルブミン溶液に加え、肉眼により観察できる塊及び大きい凝集体が形成した。従って、本実施例においては、ＧＬをも含む（０．５ｍｇ／ｍＬ）、低い濃度のエタノール（本実施例において６０％）を用い、脱溶媒和剤混合物を、アルブミン溶液の容量あたり３．３３容量で加えることができた。
【０２７５】
更に、得られた懸濁液は、直径０．１ミクロン未満の球体を含み、凝集体、塊、大きな球体又は大きな粒子を含まなかった。
【０２７６】
更に、これらの球体は、製造工程の一部として、試験管内で任意の界面活性剤又は洗浄剤を添加しないで製造された。球体は、試験管内でフィブリノーゲン、若しくは凝固又は止血に有用であることが知られている他の生体分子でプレコーティングされていなかった。
【０２７７】
ガラス製の瓶のような固体容器は、最終滅菌のための極端な高圧下で容易に割れると予想された。しかし、本明細書で用いられたプラスチックボトルは、３回の連続したパルスにおいて圧力に耐えるのに十分に柔軟であると思われた。１回の高圧パルスによって完全に不活性化されない感染因子が、繰り返しパルスにより不活性化され得ることが知られていた。球体が、圧力状態又はそれからの放出の間、塊又は凝集体を形成するために一緒に圧迫されることなく、その形状及び個性を維持し得ることは、全体として予想されなかった。
【０２７８】
可溶性凝固因子上の高圧の影響を評価する予備的実験は、高圧が分子の生物学的活性に影響を及ぼさないことを示した（「極端な高圧による血漿中の感染因子の不活性化」として出願された仮出願）。界面活性剤又は洗浄剤を加えない、本明細書に開示された新規な方法により製造された球体は、試験管内で任意の数の凝固因子又はその組み合わせによりプレコーティングされ、次いで、最終滅菌工程として試験管内で生成物は加圧される。このような高圧処理は、球体懸濁液を製造するために用いられた任意の成分又は工程から導入された多くの病原体を死滅されると期待される。
【０２７９】
血小板減少症のウサギにおける評価は、界面活性剤の非存在下、試験管内でフィブリノーゲンを加えないで製造された調製品１０−Ｂが、ＢＴを改善し得ることを示した。ウサギ１及びウサギ３は、いずれも、調製品１０−Ｂの注入２時間後に何らの改善を示さなかったが、ウサギ２は、明らかな（穏やかであるが）改善を示した。この結果は、ウサギ３がウサギ２よりも高い血小板総数を有していたので、血小板の欠乏の程度によって説明することができなかった。
【０２８０】
同様に、室温に８ヶ月保存した球体については、ウサギ２２及び２３への注入は２時間以内に効果を示さなかったが、３羽全てのウサギ（ナンバー２１、２２、２３）は、２４時間の時間ポイントにおいて効果を示した。
【０２８１】
処理された何百もの血小板減少症のウサギが、全て９００秒を超えるＢＴを有していたので（ここで、データは示さない）、ＢＴｓの事前注入は実施しなかった。
【０２８２】
注入の２４時間後、６羽全てのウサギはＢＴの改善を示した。また、２４時間における結果が、注入２時間後において得られたものより良好であったことに注目すべきである。データは、有利な効果が２４時間より長く持続し得ることを示した。
【０２８３】
２４時間におけるＢＴの改善は、この時間におけるウサギの血小板総数の回復により説明することができなかった。６羽全てのウサギは、まだ血小板減少症であった。貧血がＢＴ値に影響し得るので、何羽かのウサギが他のウサギよりも貧血ではないことを確認するために、ヘマトクリットを測定した（ＨＣＴ％）。６羽全てのウサギについてのヘマトクリット値は同程度であった。
【０２８４】
本実施例における調製品を透析し、アルコール及び任意の他の透析可能な分子を除去したが、透析されない球体懸濁液を、最終滅菌を達成するのと同様な高圧法を用いて容器内で処理することができた。このケースにおいては、球体懸濁液の成分、例えば、脱溶媒和剤の除去は、最終滅菌前が好ましく、中空糸透析ユニット、逆浸透、ろ過、遠心分離を含む、多くの方法を用いることができる。
【０２８５】
結論：
球体懸濁液は、試験管内で、界面活性剤の添加なし、及びフィブリノーゲンの添加なしで製造することができた。エタノール及び架橋剤を含む脱溶媒和剤を、本実施例に開示されるように、アルブミン溶液の容量あたり２倍を超える容量比で加えることができた。
【０２８６】
分解、凝集又は性質における検出可能な変化なしで、球体を、単一又は繰り返しパルスにおける、極端に高い静水圧に供することができる。球体は、特に注入２時間後に、血小板減少症のウサギにおいてＢＴを改善する効果があった。
【０２８７】
高圧により処理した球体は、生体内における効果を損失せずに、少なくとも８ヶ月間、室温に保存することができた。
【０２８８】
試験管内で、全て界面活性剤又は洗浄剤を加えないか、全てフィブリノーゲンを加えない、全ての５種の新規な方法（プレ−リンク、ポスト−リンク、ミド−リンク、バイ−リンク、バイミド−リンク）により製造された球体は、生体内における球体又はその有効性を害することなく、感染因子を不活性化するための単一又は繰り返しパルス内の極端な高圧に耐えることができると予想される。
【０２８９】
実施例１１
透析したヒト血清アルブミン溶液を用いた、ミド−リンク法により製造した超小型球体
【０２９０】
目的：
血小板減少症のウサギモデル中での種々の球体調製品の評価後の１つの疑問は、用量効果、すなわち、注入用量の増加（動物の水分過剰なしで）が出血時間を更に改善するかどうかであった。
【０２９１】
開示された先行技術においては、アルブミンの透析した試料が凝集体を形成する傾向にないことが指摘されていた。しかし、２５％ ＨＳＡの透析の間、アルブミンの膨張圧が透析バッグ中で水に近づき、その結果、ＨＳＡの濃度を実質的に希釈する。本実施例の１つの目的は、得られたＨＳＡ溶液が、相対的に高い濃度を維持することができるように、透析バッグ内への可能な限りの水の取り込みを減らすために、透析バッグに対する外圧を伴い、２５％ ＨＳＡを透析することである。
【０２９２】
このような、透析したアルブミン溶液の高い初期濃度は、製造した球体の平均サイズを調整する目的のために少量の塩化ナトリウムの補給を可能にし得る。得られた球体の濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、アルブミン溶液の低い初期濃度により製造された懸濁液と比較し、上昇していることも予想された。
【０２９３】
材料及び方法：
洗浄した、滅菌透析チューブ（Ｓｉｇｍａ Ｄ９６５２）に、２５％ ブミネート（２０ｍＬ）を加えた。バッグを結んだ後、水の流入に対抗するためのＣ−クランプを用いた圧力下に保持した全体のバッグを２枚の金属プレートにより締め付け、蒸留水に対して一晩透析した。予備的なデータは、２５倍過剰の水に対する３．５時間の透析が、基本的にタンパク質溶液から全ての塩化物イオンの完全な除去をもたらし、３０ｍＥｑ未満のナトリウムイオンの残留をもたらすことを示した。ＨＳＡ溶液の透析後の濃度は２２．７％であった。
【０２９４】
ＥＧ６０は、１００％エタノールを水で６０％まで希釈し、ＧＬの最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるのに十分なＧＬを加えることにより調製した。
【０２９５】
２２．７％の透析したＨＳＡ溶液を、更に希釈することなく、種々の用量のＥＧ６０と混合した。界面活性剤又は洗浄剤は加えなかった。
【０２９６】
また、低濃度のＨＳＡ溶液は、２２．７％溶液を、界面活性剤又は洗浄剤を添加することなく水で希釈することにより調製した。
【０２９７】
得られた懸濁液を位相差顕微鏡で観察し、最も一般的なサイズ分布を評価した。
【０２９８】
結果：
表１１は、１００μＬの種々の濃度のＨＳＡ（２２．７％〜１５％の範囲）を、種々の容量のＥＧ６０と混合した結果を示した。
【０２９９】
最初に、２２．７％のＨＳＡ溶液（１００μＬ一定量）を、増加する容量のＥＧ６０と直接混合するために用いた。データ（チューブ１〜５）は、全て、凝集体を有さないか、又は直径５ミクロンを超える大きな球体を含まない、直径１ミクロン〜０．１ミクロンの範囲の球体を得ることができたことを示した。これらのチューブ内で収率は６８．８％を超え、球体濃度は２５．７ｍｇ／ｍＬ〜１４．５ｍｇ／ｍＬの範囲であった。
【０３００】
予備的データ（ここでは示さず）は、最適でない量の脱溶媒和剤をタンパク質溶液に加えた場合、懸濁液が低濃度の球体を含むことを示した。しかし、理想的な（ピーク）比が上回る時、脱溶媒和剤の追加の容量は球体の生成を増加させないが、たとえ、この条件下で、最大量の球体が生成され得るとしても、単に希釈されるために供給される。表１１中に示されるデータは、可溶性アルブミン分子に由来する球体の収率が、高い停滞状態に達し、２２．７％のアルブミン溶液の１部に対し、５部を超えるＥＧ６０を加えることにより上昇することができないことを示した（チューブ１）。実際、５より高い比（すなわち、２２．７％アルブミン１容量あたり５容量を超えるＥＧ６０）でＥＧ６０を加えることは、球体の希釈された懸濁液をもたらす（懸濁液に加えられたＥＧの大容量のため）。
【０３０１】
表１１：透析した、塩化物を含まず低ナトリウムのアルブミン溶液を、架橋剤を含む種々の量の脱溶媒和剤と混合することにより得られた結果。
【０３０２】
【表７】

【０３０３】
次第に低くなる濃度のＨＳＡ溶液（それぞれ、２１％〜１５％、チューブ６〜チューブ１２）を、一定量のＥＧ６０と混合した時、以下のことが観察された。高い（初期）濃度のタンパク質溶液は、比較的大きい球体を生成した（ほとんど見えない、直径約＜０．１ミクロンの球体を含むチューブ１２と比較し、チューブ６は、直径約０．３ミクロンの球体をもたらした）。
【０３０４】
タンパク質溶液（ＥＧ６０を加える前）の初期濃度が低いと、得られた球体の濃度も徐々に低くなった。例えば、タンパク質の初期濃度が１５％であり、９．１ｍｇ／ｍＬの球体濃度をもたらすチューブ１２の濃度と比べ、チューブ６において２１％の濃度で開始し、球体の最終濃度は１６．５ｍｇ／ｍＬであった。
【０３０５】
１８％のアルブミン溶液で開始するチューブ１３、１４、１５を、それぞれ８００、９００及び１０００μＬのＥＧ６０と混合した。また、これらの条件下で用いられた大量のＥＧ６０は、チューブ１３及び１５において、それぞれ１０．９〜９．０ｍｇ／ｍＬの範囲の、球体の希釈懸濁液をもたらした。
【０３０６】
１７％のアルブミン溶液で開始するチューブ１６、１７、１８を、それぞれ８００、９００及び１０００μＬのＥＧ６０と混合した。また、大量のＥＧ６０は、更に希釈された球体の懸濁液をもたらした。アルブミンの初期濃度の相違は、わずか１％の違いであるけれど（チューブ１３〜１５中で１８％であるのと比べチューブ１６〜１８中で１７％）、チューブ１３〜１５中の球体は直径約０．２ミクロンであるが、チューブ１６〜１８中の球体は顕著に小さかった。
【０３０７】
コメント：
高濃度の、透析したアルブミン溶液（例えば、基本的に塩化物を含まず、わずか３０ミリ等量のナトリウムを含む２２．７％アルブミン）は、大量の脱溶媒和剤に耐用性がある。例えば、凝集体を形成することなく、この濃度のアルブミン（すなわち、チューブ５）の１容量に９容量のＥＧ６０を加えることができる。実際、約０．１〜０．２ミクロンの高濃度の小さい球体が懸濁液中で形成された。
【０３０８】
アルブミン溶液に対して小さい比の脱溶媒和剤（容量に対して容量）を用いた場合（例えば、チューブ１において）、結果は、単に、球体濃度は高くなかった（チューブ５における１４．５ｍｇ／ｍＬの球体と比べ、２５．７ｍｇ／ｍＬ）。球体は大きかった（チューブ１において０．５〜１ミクロン）。
【０３０９】
１８％未満の初期濃度（ＥＧ６０を加える前）の、透析したＨＳＡ溶液を用いることにより製造された球体のサイズは非常に小さくなり、１０００倍の位相差顕微鏡でさえ、見るのが困難であった。しかし、懸濁液は混濁したままであり、これは、固体粒子が存在することを示す。
【０３１０】
前記全ての球体懸濁液は、開示したような脱溶媒和剤を加える前に、タンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤の添加なしで首尾よく製造された。
【０３１１】
実施例１２
界面活性剤の非存在下に透析したアルブミン溶液により製造した超小型球体懸濁液の特徴づけ及び血小板減少症のウサギにおけるそれらの効果
目的：
（１）透析したアルブミン溶液から新規なミド−リンク法により製造した懸濁液の性質の性質を特徴づけること、（２）このような懸濁液が、血小板減少症のウサギにおいて出血時間を改善するかどうかを評価すること。
【０３１２】
原理：
先行技術（界面活性剤を加えることを含まないポスト−リンク法を用いて）により製造された球体懸濁液は、球体の画分が存在することを示した。米国特許第６，２６４，９８８Ｂ１号の図１２Ａ及び１２Ｂは、それぞれ、直径０．２５〜０．３ミクロンの球体の超小型サイズの画分、及び直径約０．８ミクロンの他の画分を示した。更に、図１２Ｄは、安全の理由のために除去する必要のある大きな球体（約３〜４ミクロン及びそれ以上）の画分を開示している。従って、新規なミド−リンク法により製造された懸濁液が、球体サイズの単一集団又は複数の画分を含むかどうかを評価することに興味がある。ミド−リンク法により製造された超小型球体が血小板減少症のウサギにおいて効果を有するかどうかにも興味がある。
【０３１３】
材料及び方法：
ブミネート ２５％を、実施例１１に開示したようにして透析した。透析したアルブミン溶液を、界面活性剤を加えずに、水で１８％まで希釈した。ＥＧ６０（４４ｍＬ）を、室温（約２１℃）で、６．３ｍＬの１８％アルブミン溶液と混合した。位相差顕微鏡は、懸濁液が非常に小さい球体を含み、凝集体又は不規則な粒子を含まないことを示した。賦形剤を加えた（懸濁液４０ｍＬあたり１０ｍＬのＬＭＧを加えた；ＬＭＧは、前述したように、水に加えた、それぞれ９重量％、９重量％、４重量％の乳糖、マルトース、グリシンである）。懸濁液中のアルコールは除去されなかった。
【０３１４】
試料は、動的光散乱法を用いた評価のために、Ｍｉｃｒｏｒｔａｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｂ（ラルゴ、フロリダ州）に送られた。懸濁液の残りは、前述したように、血小板減少症のウサギにおいて用いた。
【０３１５】
結果：
調製品１００１０６−Ｃにおける球体のサイズ分布は以下の通りであった：
【０３１６】
図１２−１。光散乱による調製品１００１０６−Ｃのサイズ分布（ＭＶ）
【０３１７】
【化１】

【０３１８】
表１２−１ 調製品１００１０６−Ｃ中の球体のサイズ分布の一覧
【０３１９】
【表８−１】

【表８−２】

【０３２０】
概要は以下の通りである：
【０３２１】
【表９】

【０３２２】
ＭＶは：分布の重心を表す「容積分布」のミクロンで表した平均直径を意味する。
【０３２３】
ＭＮは：容積分布データを用い、分布中の小さい分子に重みを加えて計算される「数分布」のミクロンで表した平均直径を意味する。
【０３２４】
ＭＡは：容積分布から計算する「面積分布」のミクロンで表した平均直径を意味する。
【０３２５】
ＣＳは：平方Ｍ／ｃｃを備えた、計算した表面積を意味する。ＣＳの計算は、平坦な、固形の球形粒子を仮定する。
【０３２６】
ＳＤは：ミクロンにおける標準偏差を意味する。
【０３２７】
Ｍｚは：ＭＶより小さい粗粒子加重平均粒径を提供するグラフィック平均を意味する。
それが、中央値を含んでいる場合、小さい粒子及び大きい粒子のいずれもが計算に含まれているので、それは、おそらく、異なった良好な対照値を提供し得る。
【０３２８】
Ａｉは：包括的なグラフィックス標準偏差を意味する。それは、９０％を超える分布を含み、分布の尾部を含む。ＳＤは、分布の６７％のみを含む。
【０３２９】
Ｓｋｉは：包括的なグラフィック歪を意味する。歪は、曲線がどのように非対称であるか、どのように正常なベル型分布から変わっているかの基準である。歪は、９０％を超える分布を含み、分布の「尾部」を含む。対称な曲線は０．００のＳｋｉ値を有する。１．００〜０．３０の値は、湾曲に影響を及ぼす微粒子を示す。−０．３０〜−１．００の値は、湾曲に影響を及ぼす粗粒子を示す。
【０３３０】
Ｋｇは：ピークが「どのくらい鋭いか」を表わす、尖度（ピーク度）（Ｐｅａｋｅｄｎｅｓｓ）を意味する。ピークは、値が０．９０〜１．１１の間である場合、メソカーチック（Ｍｅｓｏｃｕｒｔｉｃ）であるとして記載される。
【０３３１】
要するに、動的光散乱は、ほとんど対称的な分布を有し、最も小さい検出可能な球体が０．１５７６ミクロンより大きく、０．９７２ミクロンより大きい球体のない、１種の集団の球体が存在したことを示した。平均直径（分布の数による）は０．２８３１ミクロンであり、標準偏差は０．１３７３であった。
【０３３２】
重要なことは、この方法が６．５４ミクロンの大きさの粒子を検出できることである。１．０６０〜６．５４ミクロンの全体の範囲にわたり、この範囲のサイズの粒子は懸濁液中に存在していなかった。これは、生体内で毛細血管を詰まらせ得る粒子を含まないという観点において先行技術を超えた、本発明のミド−リンク法の重要な改善を示した。
【０３３３】
膨張によって懸濁液を血液と相溶性にするための、糖類及びアミノ酸の賦形剤を含む懸濁液内の球体の濃度は約１０ｍｇ／ｍＬであった。
【０３３４】
血小板減少症のウサギにおける調製品１００１０６Ｃの効果を表１２−２に示した（ウサギ４、５、６は３ｍＬ懸濁液／ｋｇを注入し；ウサギ７、８、９は１ｍＬ／ｋｇ；ウサギ１０、１１、１２は０．３ｍｇＬ／ｋｇを注入した）。
【０３３５】
【表１０】

【０３３６】
コメント：
生体内におけるデータは、生体内において界面活性剤を加えず、フィブリノーゲンを加えずにミド−リンク法により製造した球体が、単分散を有し、平均直径が約０．３ミクロンであったことを示した。
【０３３７】
これらの球体は、血小板減少症のウサギのＢＴの改善に効果的であった。興味のあるものは、最も高い濃度の球体（３０ｍｇ／ｋｇ）を受け入れたウサギ（ナンバー４、５、６）が、少なくとも注入２時間後に利益を得たという観察である。しかし、２４時間の時間ポイントにおいては顕著な改善はなかった。
【０３３８】
（ウサギ７、８、９に対する）１０ｍｇ／ｋｇの中間濃度は、３羽のうち２羽のウサギにＢＴの改善をもたらした。ナンバー７のウサギが、なぜ、これらの球体の１回投与後にＢＴの改善を示さなかったのかは明らかではなかった。
【０３３９】
一方、（ウサギ１０、１１、１２に対する）３ｍｇ／ｋｇの少ない濃度は、最も高い効果を有していた。これらのウサギは、注入の２時間後及び２４時間後のいずれにおいても改善を示した。データは、有益な時間は２４時間以上持続し得ることを示した。
【０３４０】
室温における、長期保存後の超小型球体による、試験管内でのフィブリノーゲンの自発的結合
目的：
（１）試験管内でフィブリノーゲンを加えていない超小型球体が、血小板減少症のウサギに注入した後に、なぜ有益な医療効果を有するかの見識を提供すること。（２）調製品１００１０６Ｃが、室温で長期保存した後に、更に架橋剤を用いることなく、試験管内でフィブリノーゲン分子を結合し得るかどうかを評価すること。
【０３４１】
原理：
先行技術においては、血小板減少症のウサギの出血時間の改善において有効であるタンパク質球体について、球体が試験管内でフィブリノーゲン分子でコーティングされる必要があった。その球体は、ポスト−リンク法により製造され、製造工程の間、界面活性剤を加えることを必要とした。
【０３４２】
実施例８、９、１０、１２は、全て、試験管内において界面活性剤の非存在下、フィブリノーゲンを加えずに、「プレ−リンク」、「ミド−リンク」及び「バイ−リンク」の新規な方法により製造した球体が、血小板減少症のウサギのＢＴを改善し得ることを示した。
１つの理論は、これらのタンパク質デバイスの宿主への注入後に、内因性フィブリノーゲン分子又は動物の血漿由来の他の有用な分子の自発的な結合又は捕獲を必要とすることである。
【０３４３】
本実施例の１つの目的は、これらの方法の１つにより製造された球体（ミド−リンク法、調製品１００１０６Ｃ）が試験管内で血漿に暴露した時に、架橋剤のあらゆる関与なしで、フィブリノーゲン分子と結合し得るかどうかを評価することであった。
【０３４４】
実施例６及び７は、既に、プレ−リンク及びバイ−リンク球体の、凝固タンパク質と結合する能力を示した。
【０３４５】
方法：
２０日前に製造した、球体懸濁液（調製品１００１０６Ｃ）を、本実施例において用いた。球体の小さいサイズのため、それらは懸濁液中の残存し、室温における保存の期間、沈殿しなかった。この一定量は、実施例１２に開示したようなアルコールを含み、任意の賦形剤を加えなかった。
【０３４６】
血漿は、抗凝固剤にさらすことなく、健康なドナーから得た。血漿を、通常の食塩水で１．２、０．６、０．３ｍｇフィブリノーゲン／ｍＬを含む、いくつかの濃度に希釈し、それぞれフィブリノーゲン溶液Ａ、Ｂ、Ｃと命名した。溶液Ｄは、コントロールとして供給される通常の塩水であった。
【０３４７】
調製品１００１０６Ｃの一定量（各１００μＬ、室温に２０分間保存した後）を、４００μＬのフィブリノーゲン溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びコントロール溶液Ｄと混合した。室温に１時間暴露した後、それぞれ、調製品１３−Ａ、１３−Ｂ、１３−Ｃ及び１３−Ｄと命名した球体を、繰り返して遠心分離することにより集め、通常の食塩水で洗浄し、可溶性タンパク質を除去した。
【０３４８】
球体の濃度（ｍｇ／ｍＬ）はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法により測定し、球体上に結合したフィブリノーゲン量は、以前の実施例に開示したように、競合免疫アッセイを用いて評価した。
【０３４９】
最後の洗浄における上清をフィブリノーゲンアッセイに組み入れ、無視してよいほどのフィブリノーゲンしか含まれていないことがわかった。
【０３５０】
調製品１３−Ａ、１３−Ｂ及び１３−Ｃの球体に結合しているフィブリノーゲンの濃度は、以下の通り：０．８５、０．８５、０．７２μｇ／球体１ｍｇであった５。正常な食塩水にのみ暴露したコントロール球体は、フィブリノーゲンと結合していなかった。
【０３５１】
コメント：
データは、合成の２０日後にミド−リンク法により製造した超小型球体が、ヒト血漿由来のフィブリノーゲンと自発的に結合し得ることを示した。
【０３５２】
球体１ｍｇあたりのフィブリノーゲン結合量の比較は、フィブリノーゲンについての球体の結合能力が球体１ｍｇあたり約０．８５μｇフィブリノーゲンで飽和に達することを示した。
【０３５３】
球体が、希釈した血漿試料由来のフィブリノーゲンを濃縮する能力を有するかどうかを評価するため、以下の計算を実施した。目的は、１つの平均球体容量における希釈血漿中の予想されるフィブリノーゲン量を計算し、これを、この希釈血漿画分に由来する平均的な球体に結合したフィブリノーゲン量と比較することである。
【０３５４】
表１２−１に記載されたサイズ（球体の直径）を用いて、集団中の単一の球体の平均容量は、５．２×１０［−１４］ｍＬであると計算することができる。この容量において、フィブリノーゲンの血漿濃度が０．３ｍｇ／ｍＬである場合、フィブリノーゲンの質量は１．５６×１０［−１１］μｇであろう。
【０３５５】
質量１ｍｇの球体により表わされる球体の数を見積もるために、以下の仮説をたてた。球体は、損傷せずに室温で２０日間定着しなかったので、密度は、実質的に１ｇ／ｍＬから異なっていた。単一（平均的な）球体の重量は５．２×１０［−１１］ｍｇであった。各ｍｇは、０．１９×１０［−１１］個の球体を含んでいた。
【０３５６】
調製品１３−Ｃ中の球体は０．１９×１０［−１１］個の球体あたり０．７２μｇのフィブリノーゲンを捕獲することができるので、１個の球体（平均的な）の容量中に捕獲されるフィブリノーゲンの量は３．８×１０［−１１］μｇフィブリノーゲンであった。この値は、希釈した血漿の同じ容量において予想されるフィブリノーゲンの質量の２倍である。従って、これらの球体は、希釈した血漿の試料に由来するフィブリノーゲン分子を捕獲し、濃縮する能力を有していた。
【０３５７】
アルブミン球体は、球体内部の表面からの通路を可能にするチャンネルと接続した、おそらくスポンジに類似する内部構造を有するので、濃縮効果は可能である。球体の表面及び内部のアルブミン分子はいずれも、フィブリノーゲン分子の接着又は吸着のための十分な表面を提供する足場を形成した。
【０３５８】
前記計算は、正常なフィブリノーゲン濃度（１．７７〜３．７５ｍｇ／ｍＬと測定）を有する患者において、球体の結合能力を十分に飽和するのに十分以上のフィブリノーゲンがあることをも示した。
【０３５９】
この実験からのデータは、有効なままであり得る球体１ｍｇあたりの、最も低いフィブリノーゲンの結合量を供給しなかった。しかし、低フィブリノーゲン溶液（ｈｙｐｏ−ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｅｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）から０．７２μｇのフィブリノーゲンを抽出し得るか場合に、データは、フィブリノーゲン溶液でさえ、これらの球体は、血小板減少症のための出血の処置のためにいまだに有効であるであろうことを示した。
【０３６０】
実施例１４
加熱による最終滅菌に暴露した超小型球体、及び血小板減少症のウサギにおけるその効果
目的：
（１）第二の最終滅菌法、すなわち加熱による方法を評価すること、（２）球体のこの処理が、血小板減少症のウサギの処理において効果を有したままであるかどうかを評価すること。
【０３６１】
原理：
実施例１０において極端な高圧で処理した球体を透析して、圧力による最終滅菌のためにプラスチックボトルに満たす前に、アルコール及び任意の他の透析可能な分子を除去した。ガラス瓶中に良好に保存されている、アルコールを含む懸濁液を第二の最終滅菌法の状態にすることは有利であるかもしれない。安定剤の存在下、６０℃における１０時間の加熱を、ヒト血清アルブミン溶液を用いて最終滅菌法として用いた。我々は、室温から６０℃までの１０時間以下又はそれ以上の加熱が、生物学的装置の最終滅菌のために有効であることを期待する。
【０３６２】
材料及び方法：
超小型球体を、（１）本明細書で用いられた方法が新規なミド−リンク法（ポスト−リンク法ではない）であることを除き、米国特許第６０１３２８５号（瞬時時混合及び制御特性を用いた大規模生産方法））及び米国特許第５７１６６４３号（架橋タンパク質ミクロスフェアでコーティングされた薬剤の大規模製造）に開示されたものと基本的に同じチューブシステムを用いて製造した。従って、アルブミン溶液を、単に界面活性剤又は洗浄剤を加えない水で、２５％アルブミン溶液（ブミネート）から希釈し、０．２ミクロンのフィルターにより、「ＨＳＡ」バッグに充填し；（２）架橋剤（０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度のグルタルアルデヒド）をエタノール（６０％）と混合し、混合物（ＥＧ６０）を第二のバッグに入れ、本明細書ではＥＧバッグと呼んだ（先行技術に開示されたエタノールバッグに相当）。本実施例においては、ＧＬ又はフィブリノーゲンバッグはなかった。
【０３６３】
１０％アルブミン溶液のｐＨは、７．０±０．５であった。
【０３６４】
アルブミン溶液（１０％）のためのポンプの速度は４３ｍＬ／分であり；ＥＧ６０溶液のためのポンプの速度は５１６ｍＬ／分であった。直後に、接合部で２種の成分が接触し、生成物バッグ中に生成物が満たされる前に、静的ミキサーは、２種を十分に混合するための排出管中に存在していた。実験は、室温、基本的に２１℃±２℃で実施した。
【０３６５】
球体懸濁液を、最初に水で希釈し、５．３３ｍｇ球体／ｍＬとし、次いで、１容量の賦形剤あたり３容量を混合し、４ｍｇ球体／ｍＬを含んでいた。予め洗浄し、滅菌した、それぞれの５０ｍＬ容量のガラス瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ）を、５０ｍＬの球体懸濁液で満たした。賦形剤は、（Ａ）３６ｇの乳糖、３６ｇのマルトース及び１６ｇのグリシン（４００ｍＬの水中）を溶解することにより調製したＬＭＧ；又は（ｂ）２２ｇのデキストロースを１００ｍＬの水に溶解することにより調製したデキストロース溶液のいずれかである。懸濁液を含む賦形剤中の最終アルコール濃度は約３１．１％であると計算された。
【０３６６】
加熱による最終滅菌は、球体（デキストロース賦形剤中）の瓶を、６０℃の水に、瓶の首まで１０時間浸すことにより実施した。水浴の温度は、期間中は０．５℃より高く又は低く変化させなかった。加熱処理後、懸濁液はわずかに黄色く見え、肉眼で見える沈殿又は顕微鏡的変化はなかった。市販のブミネート ２５％は、既にアルブミンの比率に対して適切な安定剤を含んでいるので、追加の安定剤（例えば、カプリル酸塩又はアセチルトリプトファン）を加えず、任意の安定剤を除去することができる、この球体調製品は透析しなかった。
【０３６７】
血小板減少症のウサギに、種々の投与量の球体を以下のように注入した：ウサギ２４、２５、２６（４ｍｇの加熱処理粗をしていない球体／ｋｇ）；ウサギ２７、２８、２９（１．３ｍｇの加熱処理をしていない球体／ｋｇ）。加熱処理していない球体懸濁液はＬＭＧ賦形剤を含んでいた。ウサギ３０、３１、３２は、ウサギ１ｋｇあたり、４ｍｇの加熱処理した球体を注入し：これらの球体懸濁液はデキストロース賦形剤を含んでいた。
【０３６８】
結果：
加熱処理の前後の球体懸濁液の顕微鏡試験は、直径約０．２ミクロン以下の球体を示し、懸濁液中に５ミクロンより大きい凝集体、粒子又は球体はなかった。懸濁液は、室温又は４℃における、少なくとも１ヶ月間の保存の間、球体又は固体物質の定着の兆候は示さなかった。
【０３６９】
表１４は、血小板減少症のウサギにおける加熱処理していないか、又は加熱処理した球体の種々の濃度による効果を示した。
【０３７０】
表１４：フィブリノーゲンコーティングしていない超小型球体で処理したウサギの出血時間（ＢＴ）の改善。
【０３７１】
【表１１】

【０３７２】
加熱処理していない球体を注入したウサギ（ナンバー２４〜２９）の比較により、４ｍｇ／ｋｇの投与量が、３羽のウサギのうちの２羽が高い投与量で処理されたので、１．３３ｍｇ／ｋｇの投与量が、注入２時間と同じくらい速く改善を示し、より効果的であることがわかる。２４時間については、高い投与量で処理された３羽全てのウサギ（ナンバー２４、２５、２６）は改善を示したが、低い投与量で処理された３羽のうち１羽のみ（ナンバー２９）が改善を示した。ウサギナンバー２５は、注入後２．５及び２４時間の両方で、ウサギナンバー２７及び２８と同程度の血小板総数を有するが、対応する時間ポイントにおいてＢＴについて良好な改善を示すので、高濃度及び低濃度からの結果の間の相違は、血小板総数をベースにして説明することができない。
【０３７３】
加熱処理された球体は、血小板減少症のウサギ（例えば、ウサギ３０及び３１）において、ＢＴの改善において未だに効果的である。加熱処理した球体で処理したウサギと、加熱処理していない球体で処理したウサギ（いずれも同じ投与量、４ｍｇ球体／ｋｇを注入）との比較により、６０℃で１０時間の加熱が、球体の活性をいくらか減少させ得ることがわかる。しかし、用いられた多くのウサギは、この結果を出すのに不十分であり、賦形剤の影響を除外できない。
【０３７４】
本実施例は、新規なミド−リンク法を用いて球体を製造することを目的とするが、同様のチューブシステムを用いることにより、全ての他の新規な合成法（すなわち、タンパク質溶液に界面活性剤又は洗浄剤を加えない方法）、すなわち、ポスト−リンク、プレ−リンク、バイ−リンク及びバイミドリンク法が、ヒトを含む血小板減少症の動物における、出血量、出血症状及び出血の出血の重症度の改善に有効な球体を製造するために用いることができる。
【０３７５】
更に、本発明は、多くの病状に影響を及ぼし得る他の生体分子の添加を計画する。これらの分子は、脱溶媒和剤の添加前又は後に加えることができ、又は脱溶媒和剤と共混合することができる。
【０３７６】
このような分子の部分的なリストには、：アルカロイド、アミノ酸及びポリペプチド、炭水化物、発ガン物質、グロブリン及び免疫グロブリン、ハロゲン化化合物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ポルフィリン、ステロイド、ビタミン類、レクチン、ハロゲン化金属、酸化物又は硫化物、抗菌化合物、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物、酵素のような単一の分子又は分子の組み合わせが含まれる。特に興味のあるものには、フィブリノーゲン又はヴィレブランド因子のような凝固因子；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、シクロホスファミド又はブスルファン）を含む化学療法剤、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート又はその類似体、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル）、抗生物質（例えば、ダウノマイシン、アクチノマイシン−Ｃ又はアドリアマイシン）、メチルヒドラジン、ニトロソウレア、ヒドロキシウレア、イミダゾールカルボキシアミド、プロカルバジン、ミトタン、ストレプトゾトシン、５−アザシチジン及びそれらの類似体が含まれる。
【０３７７】
これらの球体に封入され、又は結合するための、又はガン細胞を標的にし、又は毒性を減少するために持続放出するための他の新規な化学療法剤又はアジュバントには：サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、メルファラン、プレドニゾン、レナリドミド、ビンクリスチン、クロドロネート、ゾレドロン酸、パミドロネート、フルダラビン、ミトキサントロン、アレムツズマブ、リツキシマブ及びそれらの類似体が含まれる。
【０３７８】
効果を増強し、作用を長期化し、副作用を低減し、生体内における分解から保護し、生体内内ぶおける標的化のために、インターフェロン（インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ及びインターフェロンガンマを含む全てのクラス）、インターロイキン（全てのクラス）及びそれらの抗体（全てのクラス）が、同様に、これらの球体に捕獲され又は結合され得る。
【０３７９】
結論：
６０℃における１０時間の加熱後の球体は、血小板減少症のウサギにおける出血時間の改善の効果を保持し続ける。
【０３８０】
先行技術と異なるチューブシステムは、瓶を満たすための水及び賦形剤を加える前に、１分間に少なくとも５５９ｍLの濃縮球体を製造することができた。
【０３８１】
これらの球体は、懸濁液中で長時間残存し（振盪しないで、少なくとも１ヶ月間、底に沈まない）、懸濁液は凍結乾燥しないでも安定であった。球体懸濁液は、静脈注射で患者に直接注入することができた。先行技術において製造された球体は、大きく、定期的に振盪しない限り、容器の底に沈殿を形成するので、安定に保存するために凍結乾燥が必要であった。凍結乾燥粉末は、闘病状態又は他の破壊的状態のような危機的状態において入手できない、液体を用いて再構築する必要がある。再構築後、これらの懸濁液を定期的に攪拌するか振盪しない限りは大きい球体が沈殿する。従って、本発明により製造された球体懸濁液は、先行技術の開示により製造されたものに比べ、多くの実用的な利点を有する。
【０３８２】
実施例１５
新規なバイミド−リンク法による超小型球体の製造
目的：（２）タンパク質溶液中に界面活性剤又は洗浄剤を加えずに、新規な二工程架橋法（第一工程が、安定でない濃度の架橋剤をタンパク質溶液と混合することを含み、第二工程が、脱溶媒和剤と予備混合した、架橋剤を安定化濃度で含む混合物を加えることを含む）により球体を製造することができるかどうかを評価すること。（２）バイミド−リンク法により製造された球体の特性を評価すること。
【０３８３】
原理：
実施例５及び７は、脱溶媒和剤の添加前に、タンパク質溶液を、安定でない濃度の架橋剤と約１５分間最初に混合し、安定でない濃度の架橋剤を用いないでタンパク質溶液に脱溶媒和剤を直接加えることにより生成した球体と比較し、より均一であることを示した。安定でない濃度の架橋剤は、脱溶媒和剤の濃度を希釈することにより球体を無傷の形態に維持することができないので、安定化濃度の架橋剤を、球体の形成後に、再溶解に対して球体を安定化させるために加えなければならない。
【０３８４】
本実施例は、有用かつ高度に均一な球体が、（１）タンパク質溶液を、安定でない濃度の架橋剤と約１５秒間混合し、（２）次いで、脱溶媒和剤と架橋剤との混合物を、前処理したタンパク質溶液と混合することにより、均一かつ再溶解に対して安定である球体が形成されるように、架橋剤と予備混合した脱溶媒和剤を加え、後に脱溶媒和剤を除去又は希釈することによって形成することができるかどうかを試験するために実施される。
【０３８５】
このバイミド−リンク法を用いることの利点は、バイ−リンク法と比較し、正確な時間を必要とする１工程減らせるという必要があることである。バイ−リンク法においては、時間０において、安定でない濃度の架橋剤を加え、次いで、１５秒（プラスマイナス５秒）において、脱溶媒和剤を加え；次いで、最終的に他の時間ポイントで安定化濃度の架橋剤を加える。これは、３種の異なる時間ポイントにおいて混合ステップが必要であろう。先行技術（米国特許第６０１３２８５号）に開示されたようなチューブセットにおいて、３種の混合ポイントが必要であり、次の混合ジャンクションにおいて次の成分が混合される前のそれぞれの時間遅延を可能にするための正確な長さの少なくとも２個の混合後セグメントが含まれるべきである。新規なバイミド−リンク法を用いると、２個の混合ジャンクションのみが必要である。
【０３８６】
タンパク質溶液が、単分散であり、凝集体がなく、５ミクロンより大きい球体のない、球体懸濁液を製造するために洗浄剤又は界面活性剤の添加を必要としないので、この方法は新規である。
【０３８７】
依然として溶液中のタンパク質分子上の安定でない架橋剤の結合の効果は、後に形成される球体の生理学的性質に関して未知である。可溶性の形態に由来する部分的に処理されたタンパク質分子を固体球体に不可逆的に結合するための脱溶媒和剤とともに、第二の投与量の架橋剤を加える効果も未知である。従って、この方法は新規であり、形成される球体懸濁液はを血小板減少症のウサギにおいて試験する必要があるだろう。
【０３８８】
本実施例は、製造工程の一部として、試験管内でフィブリノーゲンでコーティングする追加工程により製造される球体を含むであろう。試験管内でフィブリノーゲンを加えていないブランクの球体及び試験管内でフィブリノーゲンを加えたものをいずれも評価するであろう。
【０３８９】
材料及び方法：
Ｂａｘｔｅｒから購入した、ヒト血清アルブミン２５％溶液（ブミネート）の一定量を、界面活性剤又は洗浄剤を加えずに希釈し１０％溶液とした。安定でない濃度の架橋剤を、Ｓｉｇｍａから購入した２５％グルタルアルデヒド（ＧＬ）溶液（Ｇ６２５７）を水で０．１５ｍｇ／ｍＬの初期濃度に希釈することにより調製した。脱溶媒和剤は、０．５ｍｇ／ｍＬと予備混合した６０％（ｖ／ｖ）に希釈したエタノールであった。フィブリノーゲン水中に１ｍｇ／ｍＬでテトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）を含む溶液中に、０．４ｍｇフィブリノーゲン／ｍＬになるように溶解した。ＳＴＳは、フィブリノーゲン分子の溶解性を促進するために用いられ、決して、球体の形成又は合成後の安定性に影響を及ぼすために設計されたものではない。デキストロース溶液の賦形剤は、２２グラムのデキストロース（Ｓｉｇｍａから購入、Ｄ９４３４）を１００ｍＬの水に溶解することにより調製した。
【０３９０】
１０％アルブミン溶液の２．１ｍＬを含む一部を、２０〜２４℃の範囲の室温で５０ｍＬのポリエチレンチューブに加えた。時間０において、１．０ｇｍLの安定でない濃度のＧＬをチューブに加え、混合物を振盪により十分に混合した。１５秒の時間ポイントにおいて、３１．５ｍＬの脱溶媒和剤（０．５ｇ／ｍＬのＧＬを含むＥＧ６０）を加えた。成分を、再度、素早くかつ十分に混合した。３０秒の時間ポイントにおいて（時間０から計測）、３．１５ｍＬのフィブリノーゲン溶液を加えた。再度、すぐに混合物を十分に浸透した。１〜２時間後、１２．６ｍＬのデキストロース溶液を賦形剤として加えた。この調製品を調整品１５−Ｆと呼んだ。
【０３９１】
コントロールのために、安定でない濃度のＧＬを添加して（時間０）３０秒後の時間ポイントにおいて、３．１５ｍＬのフィブリノーゲン溶液に代え、３．１５ｍＬの水を加えた。このコントロール調製品を調整品１５−Ｂと呼んだ。
【０３９２】
結果：
調製品１５−Ｆ及び１５−Ｂの両者の顕微鏡試験は、球体が直径約０．１ミクロンであり非常に均一であることを示し；いくらかの凝集体もなく、１ミクロンより大きい球体もなかった。これは、懸濁液の１ｍＬ容量あたり１０，０００個を超える大きい粒子がなかったことを意味する。
【０３９３】
血小板減少症のウサギにおけるこれら球体懸濁液の効果は、表１５に示すように、これらの動物において、出血時間の減少において効果を示した。
【０３９４】
表１５：血小板減少症のウサギにおける種々の時間ポイントにおける血小板の計測及び出血時間
【０３９５】
【表１２】

【０３９６】
コメント：
データは、４ｍｇ球体／ｋｇが、調製品１５−Ｂ及び１５−Ｆのいずれにおいても１．３ｍｇ球体／ｍＬよりも効果的であった。本実施例における限られた数のウサギは、調製品１５−Ｂ（合成の間、試験管内でフィブリノーゲンを加えない）が、調整品１５−Ｆ（比較のために合成の間に試験管内でフィブリノーゲンを加えた）よりもより効果的であることを示した。しかし、これが本当であるかどうかは、より多くの動物を用いて確認する必要がある。
【０３９７】
両方の調製品を、調製品からの最初のアルコール除去なしでウサギに注入し、出血時間（ＢＴ）の性能の間、麻酔したウサギにおける病的影響を引き起こすと思われた。しかし、本発明は、注入前の球体調製品からのエタノールを最初に除去し、覚醒動物（臨床診療等）に移すと、アルコールの影響から起こる任意の混乱が減少する可能性を想像する。逆浸透、又は低級アルコール又はノンアルコール飲料を製造するためのワイン産業において用いられるような、中空糸フィルターを含む種々の方法を用いたダイアフィルトレーションによるような、アルコールを除去するための利用可能な多くの方法がある。
【０３９８】
結論：
新規なバイミド−リンク法は、合成工程の間に試験管内でフィブリノーゲンでコーティングされていようとなかろうと非常に均一で、かつ血小板減少症のウサギにおいて出血の治療に効果的な球体を製造する。
【０３９９】
実施例１６
ウシ血清アルブミンを用いた生物学的装置の製造
目的：
ヒトアルブミン以外の他のアルブミン源が、ヒトアルブミン球体の機能におけると同様の有用な球体懸濁液をもたらし得ることを示し、脱溶媒和剤に加えた塩がどのような副作用を有するかを評価すること。
【０４００】
原理：
フィブリノーゲンを有さないヒトの球体は、血小板減少症のウサギにおいて出血時間を減少する効果を有し、これは、ウサギのフィブリノーゲンがヒトのアルブミン球体に結合したことを示す。本実施例は、ウシ血清アルブミンから製造した球体が、生体内でウサギのフィブリノーゲンに血総し、同様な有益な医療効果をもたらし得るかどうかを評価する。
【０４０１】
本発明の条件下で製造した場合、どのような動物のアルブミン源も、ヒトアルブミン球体を用いて得られたような有利な効果をもたらし得ることが予想される。
【０４０２】
材料及び方法：
ウシアルブミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス，ミズーリ州）、Ｄｅｓｅｒｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（フェニックス，アリゾナ州）、Ｂｏｖａｌ（クリバーン，テキサス州）、ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（アルパイン， ユタ州）、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ（カーヴィル，テキサス州）及びＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ミルフォード，マサチューセッツ州）のような種々の源から購入することができる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，２５％）を、蒸留水で希釈し、それぞれ２４％、２０％及び１６％の１００ｍＬ溶液とした。希釈グルタルアルデヒド溶液を、２５％グルタルアルデヒド溶液を、水で０．１５ｍｇグルタルアルデヒド／ｍＬに希釈することにより調製した。脱溶媒和剤は、０．２６ｇ塩化ナトリウム／ｍＬ及び０．５ｍｇグルタルアルデヒド／ｍＬを補充した水中に７５％のエチルアルコールを含む溶液であった。
【０４０３】
室温（２０〜２３℃）で、時間０において、５０ｍＬの希釈したグルタルアルデヒドを、１００ｍＬの２４％ ＢＳＡに加え、すぐに十分に混合した。１５秒の時間で、９００ｍＬの脱溶媒和剤を加え、即座に混濁し、これは球体が形成されたことを示す。顕微鏡下における試験は、基本的に、凝集体の存在しない、直径約０．５ミクロン（又はそれより小さい）球体のみを示した。
【０４０４】
工程を、２０％及び１６％ ＢＳＡについて同様に繰り返し、同じ結果を得た。
【０４０５】
工程の間に界面活性剤又は洗浄剤を加えず、フィブリノーゲンを加えないで製造した、これらの球体の注入は、血小板減少症又は血小板細胞変性の患者における出血時間を減少し得ることが予想される。
【０４０６】
例えば、０〜０．９ｍｇ／ｍＬの範囲で脱溶媒和剤に加えた塩化ナトリウムが、球体の形成について悪影響を有しないことも予想される。脱溶媒和剤に加えられた、同程度の範囲の塩化ナトリウムも、本発明に開示されたような他の新規な合成方法（界面活性剤又は洗浄剤を加えない）が用いられた場合に、ごくわずかな効果をも有しているかもしれない。
【０４０７】
結論：全ての前記実施例において、脱溶媒和剤は任意の追加の塩を含んでいなかった。本実施例は、脱溶媒和剤中に０．２６ｍｇの塩化ナトリウムが含まれると「バイミド−リンク」アプローチを用いて、球体の形成に悪影響を及ぼさず、凝集体の存在しない懸濁液をもたらした。
【０４０８】
実施例の概要
前記実施例は、いくつかの新規な球体の製造方法、及び血小板減少症のウサギにおける出血の治療において有効である球体懸濁液について議論した。タンパク質溶液が、凝集体を含まず、５ミクロンを超える直径を有する大きい球体を含まない球体懸濁液をもたらすために、界面活性剤又は洗浄剤の添加を必要としないので、この方法は新規であり、予期しないものであった。
【０４０９】
本発見に開示された球体は、製造工程においてフィブリノーゲンのような凝固因子でコーティングする必要がなく、生体内で効果的であったので、新規であった。球体は、球体及び血漿を含む混合物中に架橋剤を含ませるか加えなくても、長期保存後にフィブリノーゲン及び血漿由来の他の因子と結合することができるという点においても新規であった。更に、球体は、低濃度のフィブリノーゲンを含む血漿と混合した場合に、その表面又は内部でフィブリノーゲン分子を濃縮することができるように思われる。
【０４１０】
本明細書における、この開示は、止血に影響を及ぼす、試験管内で結合する、どのような生体分子も含まないタンパク質デバイスの懸濁液の注入による、血小板減少症の新規な治療法を教示するが、内在性分子を含む、これらの装置の組み合わせは、血小板減少症の動物の出血時間を短くし、出血量を減少するように、生体内で血漿由来の分子と結合し得る。低い血小板総数の原因は、医学的、外科的又は生理学的理由のためであり得、それらは全て、これらの装置を用いて潜在的に治療することができる。抗血小板抗体（又は任意の他の方法における同種免疫）を有するか、又は任意の他の理由から出血傾向にある動物でさえ、これらの装置を用いて医学的に治療することができると予想される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤又は洗浄剤が添加されず、患者への投与に適している、生体材料からなる生物学的装置であって、前記生物学的装置は最初には、それに結合する生物学的活性分子を有さず、前記生物学的装置は、少なくとも１種の他の生物学的活性分子を直接捕獲する能力を有する、生物学的装置。
【請求項２】
前記生体材料がアルブミンからなる、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項３】
前記少なくとも１種の生物学的活性分子のそれぞれの捕獲が試験管内で起こる、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項４】
前記少なくとも１種の生物学的活性分子のそれぞれの捕獲が生体内で起こる、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項５】
前記少なくとも１種の生物学的活性分子のそれぞれの捕獲が、少なくとも１種の凝固因子の任意の組み合わせである、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項６】
前記少なくとも１種の凝固因子が、フィブリノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子及び第ＩＸ因子からなる群から選択される任意の組み合わせである、請求項５記載の生物学的装置。
【請求項７】
前記少なくとも１種の直接捕獲される他の生物学的活性分子が薬剤からなる、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項８】
前記生物学的装置のサイズが５ミクロン未満である、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項９】
前記生物学的装置が、平均直径０．３〜０．５ミクロンの球形である、請求項８記載の生物学的装置。
【請求項１０】
前記生物学的装置が、平均直径０．３ミクロン未満の球形である、請求項８記載の生物学的装置。
【請求項１１】
前記生物学的装置が、静脈注射投与に適合する媒体に懸濁されている、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項１２】
静脈注射投与に適合する媒体がグルコースを含む、請求項１１記載の生物学的装置。
【請求項１３】
前記生物学的装置が、最終滅菌のために室温を超える温度に暴露される、請求項１記載の生物学的装置。
【請求項１４】
前記温度が、３７℃〜６０℃である、請求項１３記載の生物学的装置。
【請求項１５】
室温を超える温度に暴露される時間が１０時間以下である、請求項１３記載の生物学的装置。
【請求項１６】
室温を超える温度に暴露される時間が１０時間を越える、請求項１３記載の生物学的装置。
【請求項１７】
試験管内において結合する生物学的活性分子を含まず、生体内で少なくとも１種の生物学的活性分子と結合し得る生物学的装置を投与することにより、患者を治療する方法。
【請求項１８】
投与方法が静脈注射による投与である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的装置がアルブミンからなる、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
生体内における、少なくとも１種の結合する生物学的活性分子が凝固因子からなる、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
凝固因子が、フィブリノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子及び第ＩＸ因子からなる群から選択される組み合わせからなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が、血小板の十分な濃度の欠如、又は十分な血小板機能の欠如のいずれかにより出血する傾向にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が、希釈性血小板減少症、癌、癌の治療、抗血小板薬、抗血小板薬の過剰投与及びウイルス感染に悩まされている、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、まだ血小板減少症でないが、血小板輸血が必要であると予想される、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
患者の止血状態が、前記生物学的装置の投与により改善される、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
界面活性剤又は洗浄剤の非存在下、タンパク質溶液に、脱溶媒和剤を加えることを含む、タンパク質球体の製造方法。
【請求項２７】
前記タンパク質がアルブミンである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
脱溶媒和剤が、架橋剤を含むエチルアルコールである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記脱溶媒和剤が、前記脱溶媒和剤１ｍＬあたり０．９ｍｇ以下の塩化ナトリウムを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質球体を、凝固因子含有流体と接触させる、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記凝固因子含有流体が、患者の血漿である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記溶液の温度が１９℃〜２３℃である、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
界面活性剤又は洗浄剤の非存在下に、架橋剤のタンパク質溶液への添加を含むタンパク質球体の製造方法であって、架橋剤の濃度が安定なタンパク質球体の形成をもたらすのに不十分であり、次いで脱溶媒和剤を前記タンパク質溶液に加える方法。
【請求項３５】
前記タンパク質溶液がアルブミン溶液である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記脱溶媒和剤がエチルアルコールである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記脱溶媒和剤が、脱溶媒和剤１ｍLあたり０．９ｍｇ以下の塩化ナトリウムを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記溶媒和剤が、安定なタンパク質球体の形成をもたらすのに十分な濃度で架橋剤を含むエチルアルコールである、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質球体を、凝固因子含有流体と接触させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記凝固因子含有流体が患者の血漿である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
直径１ミクロンより大きい球体を１ｍLあたり１０，０００個未満有し、基本的に直径０．１ミクロンのタンパク質球体の懸濁液であって、前記タンパク質が血清アルブミンからなる懸濁液。
【請求項４３】
生体内で用いるのに適している生理学的に適合性の賦形剤を含み、前記賦形剤が、グルコース、乳糖、マルトース、グリシンからなる群から選択される成分を含む、請求項４２記載の懸濁液。

【公表番号】特表２０１０−５２７３５３（Ｐ２０１０−５２７３５３Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８３８１（Ｐ２０１０−５０８３８１）
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６０１４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３８１２
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０９２８８９３２）
【Ｆターム（参考）】