殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するためのＰＣＲプライマー
【課題】 ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングするための遺伝子診断技術に有効な方法、ならびにこの方法に有用なＰＣＲプライマーを提供すること。
【解決手段】 本発明は、（ａ）ワタアブラムシのカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）のｃＤＮＡの５’末端非翻訳領域から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）ＣＥの構造遺伝子配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対を提供する。本発明の殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法は、ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；上記のＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程を含む。
【解決手段】 本発明は、（ａ）ワタアブラムシのカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）のｃＤＮＡの５’末端非翻訳領域から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）ＣＥの構造遺伝子配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対を提供する。本発明の殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法は、ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；上記のＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するためのＰＣＲプライマーおよびこのプライマーを用いる殺虫剤抵抗性ワタアブラムシの識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワタアブラムシ（Aphis gossypii Glover）は、野菜、果樹、花卉などの極めて広範囲な農作物に被害を及ぼす害虫である。このワタアブラムシの防除には、主に化学合成殺虫剤が用いられている。しかし、１９８０年代から有機リン剤やカーバメート剤に対して抵抗性が発達し始め、さらにその後、これらの代替薬剤として卓効を示していたピレスロイド剤にも抵抗性が生じ、難防除害虫となっている。
【０００３】
殺虫剤抵抗性は遺伝的性質である。ここで「抵抗性の発達」とは、個体群中にごくわずかに存在する抵抗性遺伝子保持虫が殺虫剤散布によって選択的に生き残り、同様の性質を持つ子孫を残すことによって、個体群における抵抗性遺伝子保持虫の発生頻度を増していく現象をいう。ワタアブラムシを含む多くのアブラムシ種は、春から秋にかけて「胎生単為生殖」という繁殖様式をとり、単一の親から胎生単為生殖で生じた全く同じゲノムを有する「系統」を形成する。そのため、一旦獲得された抵抗性は、この系統において、胎生単為生殖により維持され得る。
【０００４】
一般的に、作用機作の異なる殺虫剤に対しては抵抗性の原因となる生化学的因子が異なる場合が多い。そこで、抵抗性の発達を避けるために、作用機作の異なる薬剤をローテーション使用して、特定の抵抗性遺伝子の蓄積を防止するのが有効であるといわれている。そのためには、圃場における抵抗性の発達の動向を常に監視し（「モニタリング」と呼ばれる）、的確に把握しておく必要がある。
【０００５】
ワタアブラムシの有機リン剤抵抗性の主要因は、体内における解毒酵素の一種カルボキシルエステラーゼ（以下、ＣＥという）の活性増強（量的増大）であることが明らかになっている（非特許文献１）。ワタアブラムシのＣＥは有機リン剤を分解・解毒するのではなく、ＣＥ自身が有機リン剤を捕捉し、そして有機リン剤によってほぼ不可逆的にリン酸化を受ける。すなわち、有機リン剤抵抗性ワタアブラムシで大量に発現しているＣＥは、有機リン剤を捕捉し、有機リン剤が殺虫性を発揮するための作用対象であるアセチルコリンエステラーゼに到達するのを事前に妨げることにより機能している。このＣＥのようなタンパク質は、「捕捉タンパク（Sequestering protein）」と呼ばれる。
【０００６】
これまで、ワタアブラムシの有機リン剤抵抗性のモニタリングは、生物検定およびＣＥ活性の測定によって行われてきた（非特許文献２〜４）。生物検定は、個体群あるいはそこから分離・確立した系統に対して濃度を変えた薬剤を施用し、一定時間後の死虫率から抵抗性の発達の程度を測定する。しかし、１回の検定に多くの個体を必要とする上、労力、時間を要し、採集時の虫の状態などの定量化できない要因の影響を受けることなど、ルーチンワークとしては不適切な点が多い。ＣＥ活性は、酢酸ナフチルを基質とする比色法によって測定する。これは、１匹ごとの測定が可能であるが、測定した活性値は当然虫のサイズにも依存するため、これを相殺するため虫体重もしくは総タンパク量を測定して除する操作が併せて必要となり、多数の個体を一回に検定するには限界がある。また、ワタアブラムシにおいてはまだ報告されてはいないが、モモアカアブラムシの有機リン剤抵抗性系統の中には、殺虫剤の施用を中止するとＣＥの生産量が感受性系統並みに低下するものが見いだされている（revertantと呼ばれる）（非特許文献５）。Revertantは、再び殺虫剤に曝されると、速やかにＣＥの生産量を増大し抵抗性を回復すると報告されている。これは、抵抗性系統において増幅しているＣＥ遺伝子が、メチル化によって転写制御を受けているためである。このような点から、ＣＥ活性のみをもって感受性・抵抗性の判断をするのは危険である。
【０００７】
上述したように、殺虫剤抵抗性は遺伝的性質なので、個体群内の抵抗性発達の実態や動向を正確に把握するには、抵抗性遺伝子保持虫の発現頻度を直接検定する遺伝子診断法を用いることが望ましい。例えば、ＣＥのｃＤＮＡ配列が明らかにされているモモアカアブラムシ（Myzus persicae Sulzer）では、Ｅ４あるいはＦＥ４と呼ばれる感受性系統にも存在するＣＥ遺伝子のいずれかが増幅しており、感受性と抵抗性との識別には定量的競合ＰＣＲによる定量的方法が行われている（非特許文献６）。また、衛生害虫のネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus Say）も増幅しているエステラーゼ遺伝子の構造が明らかにされており、この識別にもリアルタイムＰＣＲによる定量的方法が適用されている（非特許文献７）。しかし、いずれにおいても、感受性系統と抵抗性系統との間で、ＣＥ遺伝子の構造的相違に基づいて定性的に識別することは可能ではない。さらに、これまで、ワタアブラムシの殺虫剤抵抗性遺伝子に関しては、遺伝子構造に関する知見が乏しく、有用な遺伝子診断法は開発されていない。
【非特許文献１】K. Suzukiら，「Carboxylesterase of the Cotton Aphid, Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae), Responsible for Fenitrothion Resistance as a Sequestering Protein」，Applied Entomology and Zoology，1993年，第28巻，第4号，439−450頁
【非特許文献２】西東力，「ワタアブラムシAphis gossypii Gloverの薬剤抵抗性 I.静岡県における薬剤感受性低下の実態とエステラーゼ活性」，日本応用動物昆虫学会誌，1989年，第33巻，第4号，204−210頁
【非特許文献３】奥田裕志および鳥倉英徳，「ジャガイモのワタアブラムシの薬剤感受性について」，北日本病虫研報、1990年，第41巻，154−156頁
【非特許文献４】細田昭男ら，「ワタアブラムシの薬剤抵抗性に関する研究 第１報 ナスとキュウリに寄生する個体群のアリエステラーゼ活性と有機リン剤感受性」，日本応用動物昆虫学会誌，1992年，第36巻，第2号，101−111頁
【非特許文献５】C. A. Hickら，「Changes in the Methylation of Amplified Esterase DNA During Loss and Reselection of Insecticide Resistance in Peach-potato Aphids, Myzus persicae」，Insect Biochem. Molec. Biol., 1996年，第26巻，第1号，41−47頁
【非特許文献６】L. M. Fieldら，「Relationship between amount of esterase and gene copy number in insecticide-resistant Myzus persicae Sulzer」，Biochem. J.，1999年，第339巻，737−742頁
【非特許文献７】M. Weillら，「Quantitative Polymerase Chain Reaction to Estimate the Number of Amplified Esterase Genes in Insecticide-Resistant Mosquitoes」，Analytical Biochemistry，2000年，第285巻，267−270頁
【非特許文献８】K. SuzukiおよびH. Hama，「Carboxylesterase of the cotton aphid, Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphidiae) Isoelectric point variants in an organophosphorus insecticide resistant clone」，Appl. Entomol. Zool.，1998年，第33巻，第1号，11−20頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングするための遺伝子診断技術に有効な方法、ならびにこの方法に有用なＰＣＲプライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、有機リン剤感受性および抵抗性ワタアブラムシのＣＥ遺伝子（ｃＤＮＡ）の構造を比較したところ、構造遺伝子領域に３カ所の塩基相違があること、さらに、５’非翻訳領域の配列にも大きな違いがあることを見出した。そこで、これらの違いを利用して感受性系統と抵抗性系統とを遺伝子のレベルで識別することを試みた。そして識別のために有効なＰＣＲプライマーを設計し、抵抗性系統のＣＥ遺伝子のみを特異的に増幅して、「定性的」に識別できる方法を確立した。
【００１０】
本発明は、（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対を提供する。
【００１１】
好適な実施態様では、上記（ａ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択される。
【００１２】
他の好適な実施態様では、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列である。
【００１３】
さらに他の好適な実施態様では、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択される。
【００１４】
本発明はまた、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法を提供し、該方法は、
ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；
上記のいずれかのＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および
該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程；
を含む。
【００１５】
本発明はさらに、上記のいずれかのＰＣＲプライマー対を含む、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを確実に識別できる。したがって、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者は、有機リン殺虫剤に抵抗性を示すワタアブラムシ系統から、抵抗性の原因となる解毒酵素であるカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）をコードする全長２２２８塩基のｃＤＮＡ配列を初めて決定した（配列番号１、ACCESSION No. AB016720、図１）。このｃＤＮＡ配列は、５２６アミノ酸（配列番号２）をコードする１５７８塩基のオープンリーディングフレームおよび３２０塩基の５’末端非翻訳領域を含む。
【００１８】
ワタアブラムシの抵抗性系統と公知の感受性系統とのＣＥのｃＤＮＡ（配列番号３）を比較すると、配列番号１の３６０位（翻訳開始点のメチオニンコドンの最初の塩基を１番目とすると、４０番目、図１参照）、４４６位（同１２６番目）、および１３８０位（同１０６０番目）に普遍的に塩基置換が見いだされた（図２）。このうち、３６０位（４０番目）および１３８０位（１０６０番目）では、アミノ酸置換も伴っている。さらに、感受性系統では５’末端非翻訳領域のＤＮＡ配列が抵抗性系統の配列（特に配列番号１の１位から３２０位までの領域）と著しく異なっているか、あるいはかなり短いことが予想される。
【００１９】
このような感受性系統と抵抗性系統との間に見られるＣＥ構造遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列上の普遍的塩基置換および５’末端非翻訳領域の相違に基づいて、抵抗性系統に特異的な配列を検出することにより、抵抗性系統のワタアブラムシの識別が可能である。
【００２０】
抵抗性系統を識別するために、特異的なＤＮＡ配列を検出する方法としては、サザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な点、および精度を向上させる点で、本発明においてはＰＣＲ法が好ましく用いられる。本発明におけるＰＣＲは、抵抗性系統に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。
【００２１】
ＰＣＲ法は、例えば、以下のように行われる。まず、抵抗性系統のＣＥ遺伝子中のｃＤＮＡ配列上の５’末端非翻訳領域およびオープンリーディングフレームから、それぞれプライマーとして１箇所ずつを選択し、それぞれのプライマーを合成する。この一対のプライマーを用いて、プライマー対に挟まれた領域のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅する。次いで、増幅産物の有無を、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法などの検出方法によって検出する。これによって、抵抗性系統型のＣＥ遺伝子のみが特異的に増幅され、明確に識別できる。
【００２２】
ＰＣＲにおける鋳型は、ワタアブラムシから調製されるＣＥ遺伝子を含むＤＮＡ配列であれば特に限定されない。ＣＥのｃＤＮＡ配列であってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。ワタアブラムシからのｃＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行う。ワタアブラムシ１匹を、約１０倍量の緩衝液中でビーズ破砕法で破砕した後、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用いて抽出する。次いで、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽出、濃縮操作などを行って、ＤＮＡを得る。ＤＮＡの抽出法は、ここで記述した方法に限定されず、その他の方法も利用し得ることは、当業者に明らかである。
【００２３】
プライマーは、任意の長さのＤＮＡ配列であり、通常、少なくとも１０塩基かつ多くとも３０塩基、好ましくは１５から２５塩基、より好ましくは１７から２３塩基の長さである。５’末端側非翻訳領域から選択されるプライマーは、（ａ）フォワードプライマーとし、オープンリーディングフレームから選択されるプライマーは、（ｂ）リバースプライマーとする。本発明においては、（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列（５’末端非翻訳領域）から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列（構造遺伝子配列）から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対が好適である。また、（ｂ）については、普遍的塩基置換部分を含むＤＮＡ配列をもとに設計されることが好ましい。
【００２４】
より詳細には、上記（ａ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択されるプライマーが好ましい。また、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列であることが好ましい。あるいは、さらに好ましくは、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択されるプライマーである。これらの（ａ）のフォワードプライマーと（ｂ）のリバースプライマーとの任意の組み合わせにより、以下の実施例に示すように、抵抗性系統のワタアブラムシを明確に検出することができる。
【００２５】
プライマーとして選択された領域のＤＮＡ配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、約0.4μＭで使用することが好ましい。
【００２６】
ワタアブラムシから調製したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型として、上記の選択したプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞれ適切な条件を設定する。あるいは、市販のＰＣＲキットを用い、製造業者の指針に従ってＰＣＲを行ってもよい。一般的には、例えば、まず95℃で９分熱変性した後、変性：92℃、30秒〜１分；アニーリング：40〜65℃、30秒〜２分；伸長：72℃、30秒〜２分の反応を、30〜50サイクル繰り返し、最後に72℃、５分反応させてＰＣＲを終了する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、AmpliTaq GOLDポリメラーゼなどが用いられる。プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）の大きさは、選択されたプライマー対間の塩基数に応じて変動するが、好ましくは約１００ｂｐ〜約５００ｂｐであり得る。このＰＣＲ産物は、次いで、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを行う。
【００２７】
電気泳動したゲル上のＤＮＡ断片は、当業者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって検出され得る。
【００２８】
本発明のプライマーは、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キットとして提供され得る。このキットには、上記プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマー対が含まれる。好ましくは、ワタアブラムシのＤＮＡ調製用の試薬、ＰＣＲ用の試薬などが含まれ得る。
【００２９】
なお、以下に述べる実施例においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、あるいはその配列において１または２以上の塩基配列の置換、欠失、または挿入、および５’末端側に塩基の追加を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし得、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを特異的に検出し得る配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【実施例】
【００３０】
（実施例１：有機リン殺虫剤抵抗性系統ワタアブラムシのＣＥをコードするｃＤＮＡの配列決定および感受性系統との比較）
（１）抵抗性系統のＣＥタンパクの単離・精製および部分アミノ酸配列解析
まず、1987年６月に広島県東広島にてキュウリから採集し、その後、農業環境技術研究所にてキュウリの葉で継代飼育したＣＥ活性の高いＣ系統のワタアブラムシを材料とし、抵抗性系統のＣＥタンパクを、非特許文献８に記載のように単離・精製した。7.8ｇの無翅胎生メス成虫を、約60mLのリン酸緩衝液（pH7.2）中でホモジナイズした後、遠心分離してサイトゾル画分を得、さらに硫安分画して50％飽和硫安沈殿画分を粗タンパク質として得た。次いで、粗タンパク質を、25mM Bis-Tris/HCl緩衝液(pH7.1)で平衡化したMono Pカラム（Pharmacia Biotech）にアプライしてクロマトフォーカシングを行い、Superdex 200HR 10/30カラム（Pharmacia Biotech）でゲル濾過し、さらに上記と同様にクロマトフォーカシングを行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて単一バンドの精製タンパク質を得た。次いで、クリーブランド法（D.W. Cleavelandら，J. Biol. Chem.，1977年，第252巻，1102−1106頁）に従って、得られた精製タンパク質をS. aureus V8プロテアーゼで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで消化断片を分離し、各断片のＮ末端配列を分析した。３つのバンドについて配列を決定し、このうちの２つの配列をつなぎ合わせて３１アミノ酸からなる一続きのペプチド配列を決定した（配列番号１１）。
【００３１】
（２）ｃＤＮＡ部分配列の増幅および塩基配列決定
上記（１）で同定した一続きの３１アミノ酸配列の両端近くで、縮重ができるだけ少なくなるように、プライマーを含めて８６塩基を挟むセンスプライマー（ＤＧＰＦ：配列番号１２）およびアンチセンスプライマー（ＤＧＰＲ：配列番号１３）を設計・合成した（図３）。これらのプライマーとAmpliTaq Gold (2.5mM MgCl2)とを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（95℃で９分熱変性した後、変性：95℃、30秒；アニーリング：42℃、30秒；伸長：72℃、30秒の反応を、43サイクル繰り返し、最後に72℃、７分反応）を行った。ＰＣＲ増幅物についてアガロース電気泳動を行い、86bpのメインバンドを切り出し、MERMade DNA extraction kit (Bio 101社）で抽出した。これをTA Cloning Kit（Invitrogen社）を用いてプラスミドに挿入し、ブルーホワイトセレクションで陽性を示したコロニーについて挿入断片サイズを確認した。次いで、Cy-5ラベルしたM13-universalおよびM13-reversalプライマーを用いてThermoSequenase Cycle Sequencing Kit（Amasham Biosciences）でシークエンス反応を行い、ALFRed DNA Sequencer（Amasham Biosciences）で両方向から塩基配列を決定した（図３）。
【００３２】
（３）ｍＲＮＡの精製ならびに３’および５’端へのアダプター配列の導入
25mgのＣ系統無翅胎生メス成虫から、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit（Amersham Biosciences）を用いて約６μgのｍＲＮＡを精製した。次いで、１チューブ当たり１μgのｍＲＮＡを使用し、Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads（Amersham Biosciences）でNot I-(dT)18プライマーを用いて５’端にNot IアダプターのついたFirst-strand cDNAを合成した。さらに、５’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0（Invitrogen）を用いてFirst-strand cDNAの３’端にポリｄＣ配列を導入した。
【００３３】
（４）３’RACEによるFirst-strand cDNAの５’端（ｍＲＮＡの３’端）の塩基配列解析
上記（３）で逆転写の際にｃＤＮＡの５’端に導入したNot Iアダプター配列部分ならびに上記（２）で決定した86bp断片の塩基配列部分に特異的なプライマー（ＳＰＦ１：配列番号１４：図４)を、それぞれ設計・合成した。上記（２）と同様にＲＴ−ＰＣＲを行い、約1.1kbpのメジャーな増幅断片を得て、クローニングし塩基配列を決定した。
【００３４】
（５）５’RACEによるFirst-strand cDNAの３’端（ｍＲＮＡの５’端）の塩基配列解析
上記（３）でｃＤＮＡの３’端に導入したポリｄＣ配列部分にアニーリングするポリdG配列（一部配列中にイノシンが挿入されている）を３’端に有する既知配列のアンカープライマー（キットに付属）と、上記（４）で決定したFirst-strand cDNAの５’端（ｍＲＮＡの３’端）の塩基配列部分に特異的なプライマー（ＳＰＲ１：配列番号１５：図４）とを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行って、約1.3kbpのメジャーな増幅断片を得た。さらに、ＳＰＲ１の上流にＳＰＲ２（配列番号１６：図４）を設計し、上記の1.3kbp断片をテンプレートとしてnested PCRを行い、目的のやや短い増幅産物が得られたことを確認した。この1.3kbp断片について上記と同様にクローニング後、塩基配列を解析した。しかし、この比較的長い断片の配列の中央付近に多少曖昧な部分が残ったので、決定した配列を利用してさらに上流にＳＰＲ３（配列番号１７：図４）を設計し、再びnested PCRを行った。その結果、約750bpの増幅産物を得、同様にクローニングおよび塩基配列を解析し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）全長の塩基配列を確定した。
【００３５】
有機リン殺虫剤に抵抗性を示すワタアブラムシのＣ系統から、抵抗性の原因となる解毒酵素であるカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）をコードする全長２２２８塩基のｃＤＮＡ配列を初めて決定した（配列番号１、ACCESSION No. AB016720、図１）。このｃＤＮＡ配列は、５２６アミノ酸（配列番号２）をコードする１５７８塩基のオープンリーディングフレームおよび３２０塩基の５’末端非翻訳領域を含んでいた。この配列中には、エドマン法によって得られたアミノ酸配列をコードする領域（図４の下線部分）、ならびにＣＥのモチーフ配列をコードする領域（図４のアミノ酸配列の斜体文字部分）が含まれていることも確認した（図４）。
【００３６】
（６）感受性系統との比較
上記（５）で得た配列を基にオーバーラップするようにオープンリーディングフレーム部分をカバーする４組のプライマー対を設計した（それぞれ、図１におけるＦ１とＲ１、Ｆ２とＲ２、Ｆ３とＲ３、およびＦ４とＲ４の矢印部分；なお、Ｒ１〜Ｒ４は、図示のＤＮＡ配列に相補的な配列である）。これらのプライマー対を用いて、有機リン殺虫剤感受性の４系統および公知の抵抗性の４系統についてＲＴ−ＰＣＲを行い、各増幅産物についてダイレクトシークエンシングにより塩基配列を決定し、比較した。ＰＣＲは、Thermal cyclerとしてABI GeneAmp 2400を用い、0.5U/100μLのTaKaRa Ex Taq Hot Start Version、2.5mM MgCl2、2mMの各dNTP、0.5μMのフォワードおよびリバースプライマー、ならびにテンプレートとして上記（５）で決定したｃＤＮＡの逆転写産物のＰＣＲ溶液の１／５０量を、10〜20μLの量で反応させた。ＰＣＲ反応は、94℃で１分熱変性した後、変性：94℃、30秒；アニーリング：60℃、30秒；伸長：72℃、30秒の反応を、40サイクル繰り返し、最後に72℃、７分反応させた。
【００３７】
その結果、感受性系統と抵抗性系統との間では、抵抗性系統の配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位（翻訳開始点のメチオニンコドンの最初の塩基を１番目とする場合、それぞれ４０番目、１２６番目、および１０６０番目；感受性の配列表の配列番号３においては、それぞれ４０位、１２６位、および１０６０位）に普遍的に塩基置換が見いだされた（図２）。特に、３６０位（４０番目）および１３８０位（１０６０番目）では、アミノ酸の置換も伴っていた。
【００３８】
（実施例２：ＰＣＲプライマーの設計）
抵抗性系統において決定した５’末端非翻訳領域内において、配列表の配列番号１の１９位〜３８位（−３０２〜−２８３番目）、１７４位〜２１３位（−１４７〜−１２８番目）、２７８位〜２９７位（−４３〜−２４番目）、および３０１位〜３２０位（−２０〜−１番目）（それぞれ、配列表の配列番号５〜８に相当）の４つのプライマーを、フォワードプライマーとして設計した。一方、リバースプライマーとしては、抵抗性および感受性の両方の系統に共通の部分である、配列表の配列番号１の５３８位〜５６０位（２１８〜２４０番目）に相補的な配列（配列表の配列番号９に相当）を設計した。これらのプライマーを、ＤＮＡ自動合成機により合成した。
【００３９】
次いで、抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれＣＥをコードするｍＲＮＡの逆転写物（ｃＤＮＡ）を、上記実施例１と同様にして調製した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマーを用いて上記実施例１と同様にＰＣＲを行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。ゲルの写真を白黒反転処理した結果を図５に示す。図５において、レーンは、左からＳ系統（1985年10月、京都北白川にてカボチャから採集し、農業環境技術研究所にてキュウリの葉で継代飼育）、Ｈ−１３系統（1990年5月北海道早来町にてジャガイモから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）、Ｈ−６系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、およびＧＳＭ系統（1987年12月、岐阜県白鳥町にてナスから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）（以上、感受性系統）、ならびにＨ−１６系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、Ｈ−１１系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、ＧＰ２系統（1987年10月、島根県出雲市にてナシから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）、およびＣ系統（以上、抵抗性系統）のｃＤＮＡ逆転写産物を鋳型とした場合である。
【００４０】
抵抗性系統では、いずれも明確なＰＣＲ増幅バンドが検出された。一方、−２３番目よりも上流に設定した３種のフォワードプライマー（配列表の配列番号５〜７）を用いた場合、感受性系統では、アミノ酸コード領域内に設定した感受性系統と抵抗性系統とに共通の配列に対応するリバースプライマーを用いたにもかかわらず、全くＰＣＲ増幅産物が検出できなかった。このことから、感受性系統では５’末端非翻訳領域の塩基配列が抵抗性系統のものと著しく異なっているか、あるいはかなり短いことが示唆される。
【００４１】
（実施例３：ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ）
抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれＣＥをコードするｍＲＮＡの逆転写物（ｃＤＮＡ）を、上記実施例１と同様にして調製した。また、抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれゲノムＤＮＡを、RapidPrep Micro Genomic DNA Isolation Kit for Cells and Tissue（Amasham Biosciences）を用い、各系統の無翅胎生メス成虫25mgからマニュアルに従って調製した。配列表の配列番号１の２７８位〜２９７位（−４３〜−２４番目）のＤＮＡ配列（配列表の配列番号７）をフォワードプライマーとし、抵抗性系統に対する特異性を高めるために塩基置換のある配列表の配列番号１の４４６位（１２６番目）を含む配列表の配列番号１の４４６位〜４６４位（１２６〜１４４番目）のＤＮＡ配列に相補的な配列（配列表の配列番号１０）をリバースプライマーとし、ＤＮＡ自動合成機により合成した。
【００４２】
このフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いてワタアブラムシのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例２と同様にＰＣＲを行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。結果を図６に示す。図６において、レーンは、左からＳ、Ｈ−１３、Ｈ−６、およびＧＳＭ系統（以上、感受性系統）、ならびにＨ−１６、Ｈ−１１、ＧＰ２、およびＣ系統（以上、抵抗性系統）の場合である。なお、今回供試した全ての系統で増幅産物が確認できたアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部を、ポジティブコントロール（ＰＣ）として用いた。
【００４３】
図６からわかるように、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのいずれを鋳型とした場合でも、抵抗性系統のＣＥのみが特異的に増幅産物が生成され、抵抗性系統を明確に識別できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の抵抗性ワタアブラムシの識別方法は、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングすることができる。そのため、ワタアブラムシ中への有機リン剤抵抗性遺伝子の蓄積を防止することに有用である。さらに、本発明の抵抗性ワタアブラムシの識別方法は、ＣＥのｃＤＮＡだけでなく、ゲノムＤＮＡを鋳型としても有効に利用し得る。このことは、虫一匹毎にＲＮＡやＤＮＡを調製する工程を経ることなく、昆虫そのもの、あるいは磨り潰し液をＰＣＲ反応溶液に直接投入するような、より簡便な識別法を開発するための基礎となり得る。より詳細には、昆虫体内には一般にＰＣＲに阻害的に作用する様々な成分が存在するため、現在のところ前処理せずに虫自体をＰＣＲ溶液に投入しても所望のバンドは得られてはいないが、今後、簡便な前処理法やＰＣＲ溶液への添加物などを検討することにより、簡便な識別法の確立に繋がる可能性は高い。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】有機リン剤抵抗性系統のワタアブラムシのＣＥのｃＤＮＡ配列およびそのコード配列、ならびに構造比較に用いたプライマーの対応する位置を示す図である。
【図２】有機リン剤抵抗性系統と感受性系統のワタアブラムシとのＣＥのｃＤＮＡの構造比較を示す模式図である。
【図３】有機リン剤抵抗性系統のＣＥタンパクの部分アミノ酸配列およびｃＤＮＡ決定のための縮重プライマーの位置を示す図である。
【図４】有機リン剤抵抗性系統のワタアブラムシのＣＥのｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ決定のための縮重プライマーの位置を示す図である。
【図５】種々のプライマーの配置を示す模式図、ならびにこれらのプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】プライマーの配置を示す模式図、ならびにこれらのプライマーを用いて、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するためのＰＣＲプライマーおよびこのプライマーを用いる殺虫剤抵抗性ワタアブラムシの識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワタアブラムシ（Aphis gossypii Glover）は、野菜、果樹、花卉などの極めて広範囲な農作物に被害を及ぼす害虫である。このワタアブラムシの防除には、主に化学合成殺虫剤が用いられている。しかし、１９８０年代から有機リン剤やカーバメート剤に対して抵抗性が発達し始め、さらにその後、これらの代替薬剤として卓効を示していたピレスロイド剤にも抵抗性が生じ、難防除害虫となっている。
【０００３】
殺虫剤抵抗性は遺伝的性質である。ここで「抵抗性の発達」とは、個体群中にごくわずかに存在する抵抗性遺伝子保持虫が殺虫剤散布によって選択的に生き残り、同様の性質を持つ子孫を残すことによって、個体群における抵抗性遺伝子保持虫の発生頻度を増していく現象をいう。ワタアブラムシを含む多くのアブラムシ種は、春から秋にかけて「胎生単為生殖」という繁殖様式をとり、単一の親から胎生単為生殖で生じた全く同じゲノムを有する「系統」を形成する。そのため、一旦獲得された抵抗性は、この系統において、胎生単為生殖により維持され得る。
【０００４】
一般的に、作用機作の異なる殺虫剤に対しては抵抗性の原因となる生化学的因子が異なる場合が多い。そこで、抵抗性の発達を避けるために、作用機作の異なる薬剤をローテーション使用して、特定の抵抗性遺伝子の蓄積を防止するのが有効であるといわれている。そのためには、圃場における抵抗性の発達の動向を常に監視し（「モニタリング」と呼ばれる）、的確に把握しておく必要がある。
【０００５】
ワタアブラムシの有機リン剤抵抗性の主要因は、体内における解毒酵素の一種カルボキシルエステラーゼ（以下、ＣＥという）の活性増強（量的増大）であることが明らかになっている（非特許文献１）。ワタアブラムシのＣＥは有機リン剤を分解・解毒するのではなく、ＣＥ自身が有機リン剤を捕捉し、そして有機リン剤によってほぼ不可逆的にリン酸化を受ける。すなわち、有機リン剤抵抗性ワタアブラムシで大量に発現しているＣＥは、有機リン剤を捕捉し、有機リン剤が殺虫性を発揮するための作用対象であるアセチルコリンエステラーゼに到達するのを事前に妨げることにより機能している。このＣＥのようなタンパク質は、「捕捉タンパク（Sequestering protein）」と呼ばれる。
【０００６】
これまで、ワタアブラムシの有機リン剤抵抗性のモニタリングは、生物検定およびＣＥ活性の測定によって行われてきた（非特許文献２〜４）。生物検定は、個体群あるいはそこから分離・確立した系統に対して濃度を変えた薬剤を施用し、一定時間後の死虫率から抵抗性の発達の程度を測定する。しかし、１回の検定に多くの個体を必要とする上、労力、時間を要し、採集時の虫の状態などの定量化できない要因の影響を受けることなど、ルーチンワークとしては不適切な点が多い。ＣＥ活性は、酢酸ナフチルを基質とする比色法によって測定する。これは、１匹ごとの測定が可能であるが、測定した活性値は当然虫のサイズにも依存するため、これを相殺するため虫体重もしくは総タンパク量を測定して除する操作が併せて必要となり、多数の個体を一回に検定するには限界がある。また、ワタアブラムシにおいてはまだ報告されてはいないが、モモアカアブラムシの有機リン剤抵抗性系統の中には、殺虫剤の施用を中止するとＣＥの生産量が感受性系統並みに低下するものが見いだされている（revertantと呼ばれる）（非特許文献５）。Revertantは、再び殺虫剤に曝されると、速やかにＣＥの生産量を増大し抵抗性を回復すると報告されている。これは、抵抗性系統において増幅しているＣＥ遺伝子が、メチル化によって転写制御を受けているためである。このような点から、ＣＥ活性のみをもって感受性・抵抗性の判断をするのは危険である。
【０００７】
上述したように、殺虫剤抵抗性は遺伝的性質なので、個体群内の抵抗性発達の実態や動向を正確に把握するには、抵抗性遺伝子保持虫の発現頻度を直接検定する遺伝子診断法を用いることが望ましい。例えば、ＣＥのｃＤＮＡ配列が明らかにされているモモアカアブラムシ（Myzus persicae Sulzer）では、Ｅ４あるいはＦＥ４と呼ばれる感受性系統にも存在するＣＥ遺伝子のいずれかが増幅しており、感受性と抵抗性との識別には定量的競合ＰＣＲによる定量的方法が行われている（非特許文献６）。また、衛生害虫のネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus Say）も増幅しているエステラーゼ遺伝子の構造が明らかにされており、この識別にもリアルタイムＰＣＲによる定量的方法が適用されている（非特許文献７）。しかし、いずれにおいても、感受性系統と抵抗性系統との間で、ＣＥ遺伝子の構造的相違に基づいて定性的に識別することは可能ではない。さらに、これまで、ワタアブラムシの殺虫剤抵抗性遺伝子に関しては、遺伝子構造に関する知見が乏しく、有用な遺伝子診断法は開発されていない。
【非特許文献１】K. Suzukiら，「Carboxylesterase of the Cotton Aphid, Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae), Responsible for Fenitrothion Resistance as a Sequestering Protein」，Applied Entomology and Zoology，1993年，第28巻，第4号，439−450頁
【非特許文献２】西東力，「ワタアブラムシAphis gossypii Gloverの薬剤抵抗性 I.静岡県における薬剤感受性低下の実態とエステラーゼ活性」，日本応用動物昆虫学会誌，1989年，第33巻，第4号，204−210頁
【非特許文献３】奥田裕志および鳥倉英徳，「ジャガイモのワタアブラムシの薬剤感受性について」，北日本病虫研報、1990年，第41巻，154−156頁
【非特許文献４】細田昭男ら，「ワタアブラムシの薬剤抵抗性に関する研究 第１報 ナスとキュウリに寄生する個体群のアリエステラーゼ活性と有機リン剤感受性」，日本応用動物昆虫学会誌，1992年，第36巻，第2号，101−111頁
【非特許文献５】C. A. Hickら，「Changes in the Methylation of Amplified Esterase DNA During Loss and Reselection of Insecticide Resistance in Peach-potato Aphids, Myzus persicae」，Insect Biochem. Molec. Biol., 1996年，第26巻，第1号，41−47頁
【非特許文献６】L. M. Fieldら，「Relationship between amount of esterase and gene copy number in insecticide-resistant Myzus persicae Sulzer」，Biochem. J.，1999年，第339巻，737−742頁
【非特許文献７】M. Weillら，「Quantitative Polymerase Chain Reaction to Estimate the Number of Amplified Esterase Genes in Insecticide-Resistant Mosquitoes」，Analytical Biochemistry，2000年，第285巻，267−270頁
【非特許文献８】K. SuzukiおよびH. Hama，「Carboxylesterase of the cotton aphid, Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphidiae) Isoelectric point variants in an organophosphorus insecticide resistant clone」，Appl. Entomol. Zool.，1998年，第33巻，第1号，11−20頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングするための遺伝子診断技術に有効な方法、ならびにこの方法に有用なＰＣＲプライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、有機リン剤感受性および抵抗性ワタアブラムシのＣＥ遺伝子（ｃＤＮＡ）の構造を比較したところ、構造遺伝子領域に３カ所の塩基相違があること、さらに、５’非翻訳領域の配列にも大きな違いがあることを見出した。そこで、これらの違いを利用して感受性系統と抵抗性系統とを遺伝子のレベルで識別することを試みた。そして識別のために有効なＰＣＲプライマーを設計し、抵抗性系統のＣＥ遺伝子のみを特異的に増幅して、「定性的」に識別できる方法を確立した。
【００１０】
本発明は、（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対を提供する。
【００１１】
好適な実施態様では、上記（ａ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択される。
【００１２】
他の好適な実施態様では、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列である。
【００１３】
さらに他の好適な実施態様では、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択される。
【００１４】
本発明はまた、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法を提供し、該方法は、
ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；
上記のいずれかのＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および
該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程；
を含む。
【００１５】
本発明はさらに、上記のいずれかのＰＣＲプライマー対を含む、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを確実に識別できる。したがって、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者は、有機リン殺虫剤に抵抗性を示すワタアブラムシ系統から、抵抗性の原因となる解毒酵素であるカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）をコードする全長２２２８塩基のｃＤＮＡ配列を初めて決定した（配列番号１、ACCESSION No. AB016720、図１）。このｃＤＮＡ配列は、５２６アミノ酸（配列番号２）をコードする１５７８塩基のオープンリーディングフレームおよび３２０塩基の５’末端非翻訳領域を含む。
【００１８】
ワタアブラムシの抵抗性系統と公知の感受性系統とのＣＥのｃＤＮＡ（配列番号３）を比較すると、配列番号１の３６０位（翻訳開始点のメチオニンコドンの最初の塩基を１番目とすると、４０番目、図１参照）、４４６位（同１２６番目）、および１３８０位（同１０６０番目）に普遍的に塩基置換が見いだされた（図２）。このうち、３６０位（４０番目）および１３８０位（１０６０番目）では、アミノ酸置換も伴っている。さらに、感受性系統では５’末端非翻訳領域のＤＮＡ配列が抵抗性系統の配列（特に配列番号１の１位から３２０位までの領域）と著しく異なっているか、あるいはかなり短いことが予想される。
【００１９】
このような感受性系統と抵抗性系統との間に見られるＣＥ構造遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列上の普遍的塩基置換および５’末端非翻訳領域の相違に基づいて、抵抗性系統に特異的な配列を検出することにより、抵抗性系統のワタアブラムシの識別が可能である。
【００２０】
抵抗性系統を識別するために、特異的なＤＮＡ配列を検出する方法としては、サザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な点、および精度を向上させる点で、本発明においてはＰＣＲ法が好ましく用いられる。本発明におけるＰＣＲは、抵抗性系統に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。
【００２１】
ＰＣＲ法は、例えば、以下のように行われる。まず、抵抗性系統のＣＥ遺伝子中のｃＤＮＡ配列上の５’末端非翻訳領域およびオープンリーディングフレームから、それぞれプライマーとして１箇所ずつを選択し、それぞれのプライマーを合成する。この一対のプライマーを用いて、プライマー対に挟まれた領域のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅する。次いで、増幅産物の有無を、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法などの検出方法によって検出する。これによって、抵抗性系統型のＣＥ遺伝子のみが特異的に増幅され、明確に識別できる。
【００２２】
ＰＣＲにおける鋳型は、ワタアブラムシから調製されるＣＥ遺伝子を含むＤＮＡ配列であれば特に限定されない。ＣＥのｃＤＮＡ配列であってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。ワタアブラムシからのｃＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行う。ワタアブラムシ１匹を、約１０倍量の緩衝液中でビーズ破砕法で破砕した後、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用いて抽出する。次いで、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽出、濃縮操作などを行って、ＤＮＡを得る。ＤＮＡの抽出法は、ここで記述した方法に限定されず、その他の方法も利用し得ることは、当業者に明らかである。
【００２３】
プライマーは、任意の長さのＤＮＡ配列であり、通常、少なくとも１０塩基かつ多くとも３０塩基、好ましくは１５から２５塩基、より好ましくは１７から２３塩基の長さである。５’末端側非翻訳領域から選択されるプライマーは、（ａ）フォワードプライマーとし、オープンリーディングフレームから選択されるプライマーは、（ｂ）リバースプライマーとする。本発明においては、（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列（５’末端非翻訳領域）から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列（構造遺伝子配列）から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対が好適である。また、（ｂ）については、普遍的塩基置換部分を含むＤＮＡ配列をもとに設計されることが好ましい。
【００２４】
より詳細には、上記（ａ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択されるプライマーが好ましい。また、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列であることが好ましい。あるいは、さらに好ましくは、上記（ｂ）のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択されるプライマーである。これらの（ａ）のフォワードプライマーと（ｂ）のリバースプライマーとの任意の組み合わせにより、以下の実施例に示すように、抵抗性系統のワタアブラムシを明確に検出することができる。
【００２５】
プライマーとして選択された領域のＤＮＡ配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、約0.4μＭで使用することが好ましい。
【００２６】
ワタアブラムシから調製したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型として、上記の選択したプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞれ適切な条件を設定する。あるいは、市販のＰＣＲキットを用い、製造業者の指針に従ってＰＣＲを行ってもよい。一般的には、例えば、まず95℃で９分熱変性した後、変性：92℃、30秒〜１分；アニーリング：40〜65℃、30秒〜２分；伸長：72℃、30秒〜２分の反応を、30〜50サイクル繰り返し、最後に72℃、５分反応させてＰＣＲを終了する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、AmpliTaq GOLDポリメラーゼなどが用いられる。プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）の大きさは、選択されたプライマー対間の塩基数に応じて変動するが、好ましくは約１００ｂｐ〜約５００ｂｐであり得る。このＰＣＲ産物は、次いで、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを行う。
【００２７】
電気泳動したゲル上のＤＮＡ断片は、当業者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって検出され得る。
【００２８】
本発明のプライマーは、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キットとして提供され得る。このキットには、上記プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマー対が含まれる。好ましくは、ワタアブラムシのＤＮＡ調製用の試薬、ＰＣＲ用の試薬などが含まれ得る。
【００２９】
なお、以下に述べる実施例においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、あるいはその配列において１または２以上の塩基配列の置換、欠失、または挿入、および５’末端側に塩基の追加を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし得、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを特異的に検出し得る配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【実施例】
【００３０】
（実施例１：有機リン殺虫剤抵抗性系統ワタアブラムシのＣＥをコードするｃＤＮＡの配列決定および感受性系統との比較）
（１）抵抗性系統のＣＥタンパクの単離・精製および部分アミノ酸配列解析
まず、1987年６月に広島県東広島にてキュウリから採集し、その後、農業環境技術研究所にてキュウリの葉で継代飼育したＣＥ活性の高いＣ系統のワタアブラムシを材料とし、抵抗性系統のＣＥタンパクを、非特許文献８に記載のように単離・精製した。7.8ｇの無翅胎生メス成虫を、約60mLのリン酸緩衝液（pH7.2）中でホモジナイズした後、遠心分離してサイトゾル画分を得、さらに硫安分画して50％飽和硫安沈殿画分を粗タンパク質として得た。次いで、粗タンパク質を、25mM Bis-Tris/HCl緩衝液(pH7.1)で平衡化したMono Pカラム（Pharmacia Biotech）にアプライしてクロマトフォーカシングを行い、Superdex 200HR 10/30カラム（Pharmacia Biotech）でゲル濾過し、さらに上記と同様にクロマトフォーカシングを行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて単一バンドの精製タンパク質を得た。次いで、クリーブランド法（D.W. Cleavelandら，J. Biol. Chem.，1977年，第252巻，1102−1106頁）に従って、得られた精製タンパク質をS. aureus V8プロテアーゼで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで消化断片を分離し、各断片のＮ末端配列を分析した。３つのバンドについて配列を決定し、このうちの２つの配列をつなぎ合わせて３１アミノ酸からなる一続きのペプチド配列を決定した（配列番号１１）。
【００３１】
（２）ｃＤＮＡ部分配列の増幅および塩基配列決定
上記（１）で同定した一続きの３１アミノ酸配列の両端近くで、縮重ができるだけ少なくなるように、プライマーを含めて８６塩基を挟むセンスプライマー（ＤＧＰＦ：配列番号１２）およびアンチセンスプライマー（ＤＧＰＲ：配列番号１３）を設計・合成した（図３）。これらのプライマーとAmpliTaq Gold (2.5mM MgCl2)とを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（95℃で９分熱変性した後、変性：95℃、30秒；アニーリング：42℃、30秒；伸長：72℃、30秒の反応を、43サイクル繰り返し、最後に72℃、７分反応）を行った。ＰＣＲ増幅物についてアガロース電気泳動を行い、86bpのメインバンドを切り出し、MERMade DNA extraction kit (Bio 101社）で抽出した。これをTA Cloning Kit（Invitrogen社）を用いてプラスミドに挿入し、ブルーホワイトセレクションで陽性を示したコロニーについて挿入断片サイズを確認した。次いで、Cy-5ラベルしたM13-universalおよびM13-reversalプライマーを用いてThermoSequenase Cycle Sequencing Kit（Amasham Biosciences）でシークエンス反応を行い、ALFRed DNA Sequencer（Amasham Biosciences）で両方向から塩基配列を決定した（図３）。
【００３２】
（３）ｍＲＮＡの精製ならびに３’および５’端へのアダプター配列の導入
25mgのＣ系統無翅胎生メス成虫から、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit（Amersham Biosciences）を用いて約６μgのｍＲＮＡを精製した。次いで、１チューブ当たり１μgのｍＲＮＡを使用し、Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads（Amersham Biosciences）でNot I-(dT)18プライマーを用いて５’端にNot IアダプターのついたFirst-strand cDNAを合成した。さらに、５’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0（Invitrogen）を用いてFirst-strand cDNAの３’端にポリｄＣ配列を導入した。
【００３３】
（４）３’RACEによるFirst-strand cDNAの５’端（ｍＲＮＡの３’端）の塩基配列解析
上記（３）で逆転写の際にｃＤＮＡの５’端に導入したNot Iアダプター配列部分ならびに上記（２）で決定した86bp断片の塩基配列部分に特異的なプライマー（ＳＰＦ１：配列番号１４：図４)を、それぞれ設計・合成した。上記（２）と同様にＲＴ−ＰＣＲを行い、約1.1kbpのメジャーな増幅断片を得て、クローニングし塩基配列を決定した。
【００３４】
（５）５’RACEによるFirst-strand cDNAの３’端（ｍＲＮＡの５’端）の塩基配列解析
上記（３）でｃＤＮＡの３’端に導入したポリｄＣ配列部分にアニーリングするポリdG配列（一部配列中にイノシンが挿入されている）を３’端に有する既知配列のアンカープライマー（キットに付属）と、上記（４）で決定したFirst-strand cDNAの５’端（ｍＲＮＡの３’端）の塩基配列部分に特異的なプライマー（ＳＰＲ１：配列番号１５：図４）とを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行って、約1.3kbpのメジャーな増幅断片を得た。さらに、ＳＰＲ１の上流にＳＰＲ２（配列番号１６：図４）を設計し、上記の1.3kbp断片をテンプレートとしてnested PCRを行い、目的のやや短い増幅産物が得られたことを確認した。この1.3kbp断片について上記と同様にクローニング後、塩基配列を解析した。しかし、この比較的長い断片の配列の中央付近に多少曖昧な部分が残ったので、決定した配列を利用してさらに上流にＳＰＲ３（配列番号１７：図４）を設計し、再びnested PCRを行った。その結果、約750bpの増幅産物を得、同様にクローニングおよび塩基配列を解析し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）全長の塩基配列を確定した。
【００３５】
有機リン殺虫剤に抵抗性を示すワタアブラムシのＣ系統から、抵抗性の原因となる解毒酵素であるカルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）をコードする全長２２２８塩基のｃＤＮＡ配列を初めて決定した（配列番号１、ACCESSION No. AB016720、図１）。このｃＤＮＡ配列は、５２６アミノ酸（配列番号２）をコードする１５７８塩基のオープンリーディングフレームおよび３２０塩基の５’末端非翻訳領域を含んでいた。この配列中には、エドマン法によって得られたアミノ酸配列をコードする領域（図４の下線部分）、ならびにＣＥのモチーフ配列をコードする領域（図４のアミノ酸配列の斜体文字部分）が含まれていることも確認した（図４）。
【００３６】
（６）感受性系統との比較
上記（５）で得た配列を基にオーバーラップするようにオープンリーディングフレーム部分をカバーする４組のプライマー対を設計した（それぞれ、図１におけるＦ１とＲ１、Ｆ２とＲ２、Ｆ３とＲ３、およびＦ４とＲ４の矢印部分；なお、Ｒ１〜Ｒ４は、図示のＤＮＡ配列に相補的な配列である）。これらのプライマー対を用いて、有機リン殺虫剤感受性の４系統および公知の抵抗性の４系統についてＲＴ−ＰＣＲを行い、各増幅産物についてダイレクトシークエンシングにより塩基配列を決定し、比較した。ＰＣＲは、Thermal cyclerとしてABI GeneAmp 2400を用い、0.5U/100μLのTaKaRa Ex Taq Hot Start Version、2.5mM MgCl2、2mMの各dNTP、0.5μMのフォワードおよびリバースプライマー、ならびにテンプレートとして上記（５）で決定したｃＤＮＡの逆転写産物のＰＣＲ溶液の１／５０量を、10〜20μLの量で反応させた。ＰＣＲ反応は、94℃で１分熱変性した後、変性：94℃、30秒；アニーリング：60℃、30秒；伸長：72℃、30秒の反応を、40サイクル繰り返し、最後に72℃、７分反応させた。
【００３７】
その結果、感受性系統と抵抗性系統との間では、抵抗性系統の配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位（翻訳開始点のメチオニンコドンの最初の塩基を１番目とする場合、それぞれ４０番目、１２６番目、および１０６０番目；感受性の配列表の配列番号３においては、それぞれ４０位、１２６位、および１０６０位）に普遍的に塩基置換が見いだされた（図２）。特に、３６０位（４０番目）および１３８０位（１０６０番目）では、アミノ酸の置換も伴っていた。
【００３８】
（実施例２：ＰＣＲプライマーの設計）
抵抗性系統において決定した５’末端非翻訳領域内において、配列表の配列番号１の１９位〜３８位（−３０２〜−２８３番目）、１７４位〜２１３位（−１４７〜−１２８番目）、２７８位〜２９７位（−４３〜−２４番目）、および３０１位〜３２０位（−２０〜−１番目）（それぞれ、配列表の配列番号５〜８に相当）の４つのプライマーを、フォワードプライマーとして設計した。一方、リバースプライマーとしては、抵抗性および感受性の両方の系統に共通の部分である、配列表の配列番号１の５３８位〜５６０位（２１８〜２４０番目）に相補的な配列（配列表の配列番号９に相当）を設計した。これらのプライマーを、ＤＮＡ自動合成機により合成した。
【００３９】
次いで、抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれＣＥをコードするｍＲＮＡの逆転写物（ｃＤＮＡ）を、上記実施例１と同様にして調製した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマーを用いて上記実施例１と同様にＰＣＲを行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。ゲルの写真を白黒反転処理した結果を図５に示す。図５において、レーンは、左からＳ系統（1985年10月、京都北白川にてカボチャから採集し、農業環境技術研究所にてキュウリの葉で継代飼育）、Ｈ−１３系統（1990年5月北海道早来町にてジャガイモから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）、Ｈ−６系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、およびＧＳＭ系統（1987年12月、岐阜県白鳥町にてナスから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）（以上、感受性系統）、ならびにＨ−１６系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、Ｈ−１１系統（Ｈ−１３系統と同じ由来）、ＧＰ２系統（1987年10月、島根県出雲市にてナシから採集し、農業環境技術研究所にてジャガイモの葉で継代飼育）、およびＣ系統（以上、抵抗性系統）のｃＤＮＡ逆転写産物を鋳型とした場合である。
【００４０】
抵抗性系統では、いずれも明確なＰＣＲ増幅バンドが検出された。一方、−２３番目よりも上流に設定した３種のフォワードプライマー（配列表の配列番号５〜７）を用いた場合、感受性系統では、アミノ酸コード領域内に設定した感受性系統と抵抗性系統とに共通の配列に対応するリバースプライマーを用いたにもかかわらず、全くＰＣＲ増幅産物が検出できなかった。このことから、感受性系統では５’末端非翻訳領域の塩基配列が抵抗性系統のものと著しく異なっているか、あるいはかなり短いことが示唆される。
【００４１】
（実施例３：ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ）
抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれＣＥをコードするｍＲＮＡの逆転写物（ｃＤＮＡ）を、上記実施例１と同様にして調製した。また、抵抗性系統および感受性系統のワタアブラムシ各４系統から、それぞれゲノムＤＮＡを、RapidPrep Micro Genomic DNA Isolation Kit for Cells and Tissue（Amasham Biosciences）を用い、各系統の無翅胎生メス成虫25mgからマニュアルに従って調製した。配列表の配列番号１の２７８位〜２９７位（−４３〜−２４番目）のＤＮＡ配列（配列表の配列番号７）をフォワードプライマーとし、抵抗性系統に対する特異性を高めるために塩基置換のある配列表の配列番号１の４４６位（１２６番目）を含む配列表の配列番号１の４４６位〜４６４位（１２６〜１４４番目）のＤＮＡ配列に相補的な配列（配列表の配列番号１０）をリバースプライマーとし、ＤＮＡ自動合成機により合成した。
【００４２】
このフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いてワタアブラムシのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例２と同様にＰＣＲを行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。結果を図６に示す。図６において、レーンは、左からＳ、Ｈ−１３、Ｈ−６、およびＧＳＭ系統（以上、感受性系統）、ならびにＨ−１６、Ｈ−１１、ＧＰ２、およびＣ系統（以上、抵抗性系統）の場合である。なお、今回供試した全ての系統で増幅産物が確認できたアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部を、ポジティブコントロール（ＰＣ）として用いた。
【００４３】
図６からわかるように、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのいずれを鋳型とした場合でも、抵抗性系統のＣＥのみが特異的に増幅産物が生成され、抵抗性系統を明確に識別できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の抵抗性ワタアブラムシの識別方法は、ワタアブラムシにおける有機リン剤抵抗性の発達の動向・現状を正確かつ簡便にモニタリングすることができる。そのため、ワタアブラムシ中への有機リン剤抵抗性遺伝子の蓄積を防止することに有用である。さらに、本発明の抵抗性ワタアブラムシの識別方法は、ＣＥのｃＤＮＡだけでなく、ゲノムＤＮＡを鋳型としても有効に利用し得る。このことは、虫一匹毎にＲＮＡやＤＮＡを調製する工程を経ることなく、昆虫そのもの、あるいは磨り潰し液をＰＣＲ反応溶液に直接投入するような、より簡便な識別法を開発するための基礎となり得る。より詳細には、昆虫体内には一般にＰＣＲに阻害的に作用する様々な成分が存在するため、現在のところ前処理せずに虫自体をＰＣＲ溶液に投入しても所望のバンドは得られてはいないが、今後、簡便な前処理法やＰＣＲ溶液への添加物などを検討することにより、簡便な識別法の確立に繋がる可能性は高い。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】有機リン剤抵抗性系統のワタアブラムシのＣＥのｃＤＮＡ配列およびそのコード配列、ならびに構造比較に用いたプライマーの対応する位置を示す図である。
【図２】有機リン剤抵抗性系統と感受性系統のワタアブラムシとのＣＥのｃＤＮＡの構造比較を示す模式図である。
【図３】有機リン剤抵抗性系統のＣＥタンパクの部分アミノ酸配列およびｃＤＮＡ決定のための縮重プライマーの位置を示す図である。
【図４】有機リン剤抵抗性系統のワタアブラムシのＣＥのｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ決定のための縮重プライマーの位置を示す図である。
【図５】種々のプライマーの配置を示す模式図、ならびにこれらのプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】プライマーの配置を示す模式図、ならびにこれらのプライマーを用いて、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対。
【請求項２】
前記（ａ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項３】
前記（ｂ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列である、請求項１または２に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項４】
前記（ｂ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１または２に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項５】
殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法であって、
ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；
請求項１から４のいずれかの項に記載のＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および
該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかの項に記載のＰＣＲプライマー対を含む、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キット。
【請求項１】
（ａ）配列表の配列番号１の１位から３００位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列と、（ｂ）配列表の配列番号１の３２１位から１８９８位までのＤＮＡ配列から選択される少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列とからなる、ＰＣＲプライマー対。
【請求項２】
前記（ａ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号５、６、および７のＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項３】
前記（ｂ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号１の３６０位、４４６位、および１３８０位から選択されるいずれか１つのＤＮＡを含む少なくとも１０の連続するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列である、請求項１または２に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項４】
前記（ｂ）のＤＮＡ配列が、配列表の配列番号９および１０のＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１または２に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項５】
殺虫剤抵抗性ワタアブラムシを識別するための方法であって、
ワタアブラムシのＤＮＡを調製する工程；
請求項１から４のいずれかの項に記載のＰＣＲプライマー対を用いて、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程；および
該ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかの項に記載のＰＣＲプライマー対を含む、殺虫剤抵抗性ワタアブラムシ検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−６２３５（Ｐ２００６−６２３５Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１８９５１８（Ｐ２００４−１８９５１８）
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【出願人】（５０１２４５４１４）独立行政法人農業環境技術研究所 (60)
【出願人】（５０４２４８１４８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【出願人】（５０１２４５４１４）独立行政法人農業環境技術研究所 (60)
【出願人】（５０４２４８１４８）
【Ｆターム（参考）】
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