水稲の粒形状および葉形状に関連するタンパク質、これのコーディング遺伝子ならびに使用
本発明は、水稲の粒の形状および葉の形状に関連するタンパク質ＯｓＸＣＬ、その誘導化タンパク質ならびにこれらのコーディング遺伝子を提供する。ＯｓＸＣＬを過剰に発現する形質転換水稲は、粒の長さ、粒の重さ及び１つの穂当たりの粒の数の増加、ならびに巻葉(leaf rolling)などとしての表現型を提示する。本発明はまた、ＯｓＸＣＬまたはその誘導化タンパク質のコーディング遺伝子を所望の植物に形質転換することによって形質転換植物を得る方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に水稲の粒長さ、粒重量、１穂当たりの粒数および巻葉(rolled leaf)に関連するタンパク質、これのコーディング遺伝子およびこれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の説明
コメは、ヒトの生活が依存し、世界の人口の半分近くの主食を提供する主要な穀類作物のひとつである。中国では、コメは、生産量ですべての穀類作物のうち一位を占め、中国での居住者の穀物の配給消費量の６０％を占める；農業従事者の半分近くがコメの生産に従事している。したがって、コメは、中国の食用作物を主導している。世界人口がますます成長し（コメを消費する国の人口成長率が世界人口の平均成長率より早く）、工業化や都市化が迅速に発展し、さらに自然災害による損害が多くなるなどにつれて、水田が減少傾向にあり、世界的なコメの供給及び需要の間で切迫した葛藤が生じている。安定したコメの供給を確保できるようにどのようにしてより少ない水田でより多くの食物が生産できるのか？これは、我々が直面し解決しなければならない緊急の課題である。しかしながら、大規模生産でのコメの生産高は、たいてい非常に低い。１９９９年に国連の食糧農業機関（ＦＡＯ）によって行われた調査によると、１単位面積当たりの世界の平均のコメの出来高はたったの３．８ｔ・ｈａ−１（中国では６．３ｔ・ｈａ−１）でしかない。この目的のために、中国は、高収量品種の生産力を発達させ、これによりコメの出来高を実質的に向上するために、ここ３０年、超高い出来高のための水稲の育種プロジェクト（超水稲育種プロジェクト）を進めてきている。粒重量及び１穂当たりの粒数は穀物の生産高に影響を与える重要な因子であり、粒の大きさ、粒の重量または１穂当たりの粒の数を増加させることはコメの出来高を増加させる有効なアプローチである。さらに、粒の長さは重要な形態学的特徴であり、コメの品質を決定する。生物学者や農学者にとって、コメの生産量及び品質双方を向上することは最も追求する価値のある目標である。
【発明の概要】
【０００３】
発明の開示
本発明の目的は、下記１）または２）：
１）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成される、タンパク質；
２）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸を置換および／または欠失および／または付加することにより１）から誘導化され、かつ植物の粒の長さ、粒の重量、１穂当たりの粒数および葉の形状に関連する、タンパク質
である、ＯｓＸＣＬと称される、水稲由来のタンパク質を提供することである。
【０００４】
配列番号：２は、２５５個のアミノ酸を有するＯｓＸＣＬのアミノ酸配列であり、この際、７２個の疎水性アミノ酸（プロリンを含む）、１８３個の親水性アミノ酸、３４個の酸性アミノ酸及び３８個の塩基性アミノ酸が存在する。このタンパク質は、２６．７３ｋＤａの分子量及び９．８の等電点を有する。これは、今まで報告されていない新規なタンパク質である。
【０００５】
表１に記載のタグは、１）のＯｓＸＣＬの簡便な精製を目的として、配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成されるタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に連結されてもよい。
【０００６】
【表１】
【０００７】
上記２）におけるＯｓＸＣＬは、人工的に合成することによって得られても、あるいは生物学的に発現させる前にそのコーディング遺伝子を合成することによって得られてもよい。上記２）のＯｓＸＣＬのコーディング遺伝子は、配列表の配列番号：１の５’末端から出発する１０６〜８７０番目の位置の塩基について、１以上のアミノ酸残基のコドンを欠失させる、および／または１以上の塩基対をミスセンス変異を行う、および／または５’末端および／または３’末端で表１に記載されるようなタグのコーディング配列を連結することによって得られてもよい。
【０００８】
ＯｓＸＣＬと称される、上記タンパク質のコーディング遺伝子はまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【０００９】
上記コーディング遺伝子は、下記１）または２）または３）または４）の遺伝子：
１）配列表の配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
２）配列表の配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
３）高ストリンジェントな条件で１）または２）で規定される遺伝子とハイブリダイズし、かつ当該タンパク質をコード化する、遺伝子；
４）１）または２）で規定される遺伝子と８０％以上の相同性を有し、かつ当該タンパク質をコード化する、遺伝子
である。
【００１０】
配列番号：１は、５’側の非翻訳領域が１０５塩基からなり、３’側の非翻訳領域が１９２塩基からなり、コーディング領域が７６５塩基（１０６〜８７０番目の位置）からなり、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列を有するＯｓＸＣＬタンパク質をコード化する、１０６２塩基から構成されるＯｓＸＣＬコード化全長ｃＤＮＡである。コーディング領域では、Ａは１５．１６％（１１６）を占め、Ｃは４０．６５％（３１１）を占め、Ｇは３２．２９％（２４７）を占め、Ｔは１１．９％（９１）を占め、Ａ＋Ｔは２７．０６％（２０７）を占め、また、Ｃ＋Ｇは７２．９４％（５５８）を占める。
【００１１】
上記高ストリンジェントな条件は、６５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションするためにプレハイブリダイゼーション溶液（０．２５モル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、７％ ＳＤＳ）中にハイブリッドフィルムを置き；プレハイブリダイゼーション溶液を除き、６５℃で１２時間、ハイブリダイゼーションするためにハイブリダイゼーション溶液（０．２５モル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、７％ ＳＤＳ、同位体標識されたヌクレオチドフラグメント）を加え；ハイブリダイゼーション溶液を除き、膜洗浄溶液Ｉ（２０ミリモル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、５％ ＳＤＳ）を加え、膜を６５℃で２回洗浄し、それぞれ３０分間継続し；膜洗浄溶液ＩＩ（２０ミリモル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、１％ ＳＤＳ）を加え、膜を６５℃で３０分間洗浄する。
【００１２】
上記ＯｓＸＣＬ遺伝子またはこのフラグメントの全長を増幅するのに使用されるプライマー対もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１３】
上記遺伝子を含む形質転換細胞系もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１４】
上記遺伝子を含む組換株もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１５】
上記遺伝子を含む組換ベクターもまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１６】
ＯｓＸＣＬ遺伝子を含む組換発現ベクターは、公知の植物の発現ベクターを用いて構築されうる。植物の発現ベクターとしては、Agrobacteriumベクター及び植物の微粒子銃(microprojectile bombardment)に使用されるベクターなど、例えば、ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００、ｐＢＩ１２１、ｐＢｉｎ１９、ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−ＵｂｉＮ、ｐＢＹ５０５または他の誘導化された植物の発現ベクターが挙げられる。ＯｓＸＣＬ遺伝子を有する組換発現ベクターを構築する際には、単独であるいはカリフラワー・モザイク・ウイルス(cauliflower mosaic virus)（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーター、ユビキチン遺伝子プロモーター(ubiquitin gene promoter)（ｐＵｂｉ）、アクチンプロモーター(Actin promoter)等の、他の植物プロモーターと組み合わせて使用してもよい、エンハンスメントプロモーター(enhancement promote)、構成プロモーター(constitutive promoter)、組織特異的プロモーター(tissue specific promoter)または誘導性プロモーター(inducible promoter)を、転写開始ヌクレオチドの前に付加してもよい。
【００１７】
加えて、本発明の遺伝子を用いて植物の発現ベクターを構築する際には、翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサー等のエンハンサーをまた使用してもよい。これらのエンハンサー領域は、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する領域の開始コドンであってもよく、これは全配列の正確な翻訳を保証するためにコーディング配列のリーディングフレームと一致する必要がある。翻訳調節シグナルや開始コドンの源が豊富に存在し、この際、これらは天然のものであってもあるいは合成されたものであってもよい。翻訳開始領域は、転写開始領域または構造遺伝子由来であってもよい。
【００１８】
使用される植物の発現ベクターは、形質転換植物細胞または植物の公知の同定及びスクリーニングを目的として、植物中で発現して、色の変化する酵素または発光化合物（ＧＵＳ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等）、耐性を有する抗生物質マーカー（ゲンタシンマーカー、カナマイシンマーカー等）または抗化学試薬に対するマーカー遺伝子（例えば、抗除草剤遺伝子）等を生産する遺伝子を導入することによって、プロセッシングを受けて(processed)もよい。
【００１９】
特に、上記組換ベクターは、発現ベクター１６３−１３００の複数のクローニング部位に上記遺伝子を挿入することによって得られる組換ベクターであってもよく；
この際、この発現ベクター１６３−１３００の構築方法は、ｐＪＩＴ１６３をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断することによって製造されるＤｏｕｂｌｅ ３５Ｓプロモーターを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断することによって製造されるラージフラグメントと連結して、組換発現ベクターを得るものである。
【００２０】
本発明の他の目的は、粒の重量が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される粒の重量が増した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の粒重量より重い粒重量を有する形質転換植物を得ることである。
【００２１】
本発明の他の目的は、粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の粒長さより長い粒長さを有する形質転換植物を得ることである。
【００２２】
本発明の他の目的は、１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の１穂当たりの粒数より多い１穂当たりの粒数を有する形質転換植物を得ることである。
【００２３】
本発明の他の目的は、巻葉(rolled leaf)を有する形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される巻葉を有する形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、巻葉を有する形質転換植物を得ることである。
【００２４】
上記遺伝子は、上記組換ベクターを介してターゲットとなる植物に導入される。本発明のＯｓＸＣＬ遺伝子を有する植物の発現ベクターは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウィルスベクター、遺伝子銃(gene gun)、花粉管経路(pollen tube pathway)、マイクロインジェクション(microinjection)、電気的形質転換(electrical transformation)、Agrobacterium法(Agrobacterium mediation)等の、公知の生物学的な方法によって植物細胞または組織に形質転換されうる。
【００２５】
上記植物は、双子葉植物または単子葉植物であってもよく；前記単子葉植物は、好ましくは水稲であり、双子葉植物は、好ましくはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＰＣＲによって増幅されたＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示すものであり、この際、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２及び３は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡである。
【図２】図２は、ＯｓＸＣＬをＴベクターに連結した後のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで酵素的に切断したものの確認図であり、この際、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２〜５は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡのクローニングベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのダブルで酵素的に切断した結果である。
【図３】図３は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡをＴベクターに連結した後のＢａｍＨＩで酵素的に切断したものの確認図であり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、ＢａｍＨＩで酵素的に切断する前のＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡプラスミドのバンドであり；１、２、３及び４は、ＢａｍＨＩで酵素的に切断した後のＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡプラスミドのバンドであり、Ｍは、ＤＮＡマーカーである。
【図４】図４は、ｐＪＩＴ１６３のマップである。
【図５】図５は、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００のマップである。
【図６】図６は、ＯｓＸＣＬを含むｐＭＤ１８−Ｔベクターのマップの一部である。
【図７】図７は、ＯｓＸＣＬを発現ベクターに連結した後のＥｃｏＲＩで酵素的に切断したものの確認図であり；レーン１〜５は、ＥｃｏＲＩで酵素的に切断したＯｓＸＣＬ発現ベクターの酵素的切断結果である。
【図８】図８は、ＯｓＸＣＬを発現ベクターに連結した後のＨｉｎｄＩＩＩで酵素的に切断したものの確認図であり；レーン１〜５は、ＨｉｎｄＩＩＩで酵素的に切断したＯｓＸＣＬ発現ベクターである。
【図９】図９は、Agrobacteriumから単離されたプラスミドでそれぞれ行われたＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで１つの酵素による切断したものの確認図であり；レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２は、ＥｃｏＲＩによる酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクタープラスミドの結果であり；レーン３は、ＨｉｎｄＩＩＩによる酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクタープラスミドの結果である。
【図１０】図１０は、ハイグロマイシン耐性遺伝子に従って設計されたプライマーを用いて行われたＰＣＲの確認図である。この際、Ｍは、ＤＮＡマーカーであり；レーン１〜９及び１２〜２１は、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲植物のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行われたハイグロマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ結果であり；レーン１０及び２２は、発現ベクタープラスミドを鋳型として用いて増幅したハイグロマイシン耐性遺伝子であり、ポジティブコントロールとして使用し；レーン１１及び２３は、鋳型を用いない（水）のネガティブコントロールである。
【図１１】図１１は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を用いて形質転換されたＴ０ ９３−１１植物で行われた定量リアルタイムＰＣＲ(quantitative real-time PCR)の相対的な発現分析である。Ｓ１は、非形質転換コントロール水稲であり；Ｓ２は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない空のベクターを有するコントロール水稲であり；Ｓ３〜Ｓ２５は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を用いて形質転換されたＴ０ ９３−１１水稲植物である。
【図１２】図１２は、OｓＸＣＬ形質転換水稲の粒及びコントロールの粒の写真である。
【図１３】図１３は、葉が巻いている(leaves rolled up)ＯｓＸＣＬで形質転換されたＴ０世代の水稲及び後にカールした刀のように細長く先の尖った葉脚(flag leaf base)を有するＴ２世代の水稲の写真である。
【図１４】図１４は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲のＴ２世代の１穂当たりの粒数が増加したことを示す写真である。
【図１５】図１５は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲の粒の成長を示すグラフである。
【図１６】図１６は、長角果(siliques)及び巻葉(leaves curled)を劇的に増加したＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明を実施するための最良の形態
本発明を、下記特定の実施例を参照しながらさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２８】
特記しない限り、下記実施例の方法はそれぞれ公知の方法である。
【００２９】
実施例１：長い、大きい及び複数の粒ならびに巻葉(rolled leaf)を有する形質転換水稲の育種(breeding)
Ｉ．組換発現ベクターの構築
１．ＯｓＸＣＬ遺伝子のクローニング
５’末端にそれぞれＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位が付加されるプライマー対を人工的に合成した。上記上流プライマー及び下流プライマーは下記のとおりである：
【００３０】
【化１】
【００３１】
水稲Ｐｅｉ’ａｉ ６４Ｓ(Chinese National Center for Rice Hybridization and Breeding, Changsha, China)から抽出した、ＲＮＡを、逆転写してｃＤＮＡの第１の鎖を得た。
【００３２】
ＰＣＲを行い、上記上流プライマー及び下流プライマーをプライマーとしておよび水稲Ｐｅｉ’ａｉ ６４ＳのｃＤＮＡを鋳型として用いて、配列番号：１に記載されるｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲプログラムでは、１０５℃の加熱蓋の下で９４℃で５分間予備変性を開始した後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニール、７２℃で１分２０秒間の伸長(extension)を３２サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の最終伸長(extension)を行い、温度は２２℃に維持した。
【００３３】
ＰＣＲシステムは、下記のとおりである：
【００３４】
【化２】
【００３５】
アガロースゲル電気泳動を、ＴＥＡ電気泳動緩衝液を用いて行い、得られた約８００ｂｐのフラグメント（図１）をＯｓＸＣＬと称した。
【００３６】
上記ＯｓＸＣＬのバンドを、ＴＩＡＮＧＥＮのキットを用いて、gel slug-press recoveryの方法によって回収した。回収したフラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクター(TA Cloning, Jinan TaiTianHe Biotechnology Limited Company)に連結し、この際の連結システムは、下記のとおりである：
【００３７】
【化３】
【００３８】
ライゲーションを２時間行い、大腸菌(E.coli) ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換し、プレートにスプレッドし、アンピシリンでスクリーニングした。単一のクローン(monoclone)を選択し、これからプラスミドを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩの２つの酵素で切断することによって同定した。酵素の切断物から、図２に示されるように、約８００ｂｐのＯｓＸＣＬのバンドの存在が示された。
【００３９】
プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、ターゲットとなるフラグメントＯｓＸＣＬがＴベクターに連結する方向を確認し、その結果では、図３に示されるように、ＢａｍＨＩ部位が下流プライマーに付加されたので、Ｔベクターに逆に挿入されることにより約８４０ｂｐのバンドが生じた；図３において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は未切断のプラスミドを表わし、そのバンドの大きさは右側ではマーカーに１ｋｂたしたもので示され、さらに、１、２、３及び４は切断後の結果を表わし、そのバンドの大きさは左側ではマーカーに１ｋｂたしたもので示される。結果を比較することにより、プラスミド４以外の、プラスミド１、２及び３はそれぞれオープンになるように切断され(cut open)、ターゲットとなるフラグメントが順方向に連結された（即ち、それぞれが約８００ｂｐである）。プラスミド１、２及び３に相当する細菌溶液の配列を決定し、その配列の結果から、ターゲットとなるフラグメントＯｓＸＣＬは配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置の配列を有し、ＯｓＸＣＬ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に示される配列と完全に一致した配列を有することが示唆された。
【００４０】
２．組換発現ベクターの構築
１）発現ベクター１６３−１３００の構築
図４に示されるｐＪＩＴ１６３(pGreen, http://www.pgreen.ac.uk/)を、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断し、酵素による切断物の結果を、ダブル３５Ｓプロモーター(Double 35S promoter)を含むＤＮＡバンドを回収する前に、アガロースゲル電気泳動により同定した。図５に示されるように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００(CambiaLabs, http://www.cambia.org/daisy/bioforge_ legacy/3725.html)を、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断し、ラージフラグメントを回収した。ＸｈｏＩ及びＳａｌＩは、イソカウダマー(isocaudarner)である。これら２つの回収フラグメントをＴ４リガーゼで一晩ライゲートし、１６３−１３００コンプレックスベクター(complex vector)を構築した。
【００４１】
２）組換発現ベクターの構築
図６に示される、ＯｓＸＣＬを含むＴベクターを、酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断した（ＢａｍＨＩは、設計されたプライマーによる８７２番目の位置に導入される酵素切断部位または８８７番目のＴベクターの酵素切断部位に作用し、回収されたフラグメントはそれぞれＯｓＸＣＬ ＯＲＦの終始コドンを含む）。また、発現ベクター１６３−１３００をこれら２つの酵素で切断し、回収した後、連結し、即ち、遺伝子ＯｓＸＣＬを発現ベクター１６３−１３００に連結して、ＯｓＸＣＬ−１６３−１３００と称される、組換発現ベクターを構築し、これを、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩの１種の酵素で切断することによって確認した。図７及び８に示されるように（１、２、３、４及び５は、それぞれ、酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクターのバンドを表す）、結果から、１、３、４及び５は、それぞれ、ＯｓＸＣＬを含む約１６００ｂｐの正しいターゲットとしたバンドを有することが示される。
【００４２】
ＩＩ．粒が長く、巻葉を有する形質転換水稲の育種および検出
１．粒が長く、大きくかつ複数ありかつ巻葉を有する形質転換水稲を得る
ステップＩ．２の組換発現ベクターを用いて、Agrobacteriumの形質転換のための凍結融解法を用いてAgrobacterium EHA105（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.で市販）に形質転換した。Agrobacteriumから単離したプラスミドについて、それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの１種の酵素切断により確認した（図９）。この際、Agrobacteriumの形質転換のための凍結融解法のステップは下記のとおりである：
凍結融解法のステップは下記のとおりである：−７０℃で貯蔵されたAgrobacterium EHA105のコンピテント細胞を取り出し、氷浴において、融解し；１０〜２０μｌのpCAMBIA1300-2×CaMV35S-OsMsr1 -CaMV35S-Term plasmid DNA（約１〜２μｇ）を、滅菌したガンチップ(gun tip)で撹拌しながら、Agrobacteriumの融解したコンピテント細胞 ２００ｍｌに添加し、数分間放置し；この混合物を液体窒素中に１分間、さらに３７℃の水浴に５分間、入れた後、７００〜８００μｌのＬＢ液体培地を添加し、さらに２８℃で４時間、２００ｒｐｍで振盪し；１０００ｇで３０秒間遠心して、上清の一部を捨てて、１００〜１５０μｌを残し、これをガンチップと共に吸入・排出(inhalation and ejection)して再懸濁し、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌ リファンピシン及び３４ｍｇ／Ｌ クロロマイシンを含むＬＢプレートにスプレッドし；次に、このプレートをひっくり返して(invertly)置き、２８℃で２日間培養した。
【００４３】
上記で確認された組換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いて、感染法により、ライス９３−１１(rice 93-11)(Chinese National Center for Rice Hybridization and Breeding, Changsha, China)のカルス組織に感染させた。次に、感染カルスを、ハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含む選択培地で生育させて、ハイグロマイシン耐性再生植物体を得た。
【００４４】
ゲノムＤＮＡを、ハイグロマイシン耐性再生植物体の葉から抽出し、ハイグロマイシン耐性遺伝子に基づいて設計された下記プライマーを用いてＰＣＲ確認用鋳型として使用した：
【００４５】
【化４】
【００４６】
確認結果を図１０に示すが、ターゲットとなるバンドが、１、２、３、４、５、６、１２、１３、１５、１６、１８及び２０の計１２植物系で得られた、すなわち、形質転換植物のＴ０世代で計１２の陽性植物が存在した（ＯｓＸＣＬと接近して連結したハイグロマイシン遺伝子は水稲のゲノムに既に組み込まれていた）。
【００４７】
２．検出分析
上記ＯｓＸＣＬ形質転換水稲を栽培を目的として温室に移し、袋に入れ、自家交配して、形質転換水稲の種を集めた。
【００４８】
一方、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない発現ベクター１６３−１３００の形質転換水稲を空のベクターコントロールとして使用した；また、非形質転換水稲をコントロールとして使用した。
【００４９】
１）定量ＰＣＲ検出
定量ＰＣＲ検出を、ＯｓＸＣＬ遺伝子のＤＮＡ配列プライマー１０８−Ｆ及び１０８−Ｒを用いてＯｓＸＣＬ形質転換水稲及び非形質転換水稲で行った；結果を図１１に示し、ＯｓＸＣＬは、非形質転換水稲９３−１１では発現レベルが比較的低く、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲では発現レベルが劇的に向上した。
【００５０】
ここで、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは下記のとおりであった：
【００５１】
【化５】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【化６】
【００５４】
２）表現型の観察および統計データ
Ａ．ＯｓＸＣＬ遺伝子の形質転換水稲９３−１１、空のベクターコントロール及び非形質転換水稲９３−１１のＴ０世代の種を秤量し、１００粒の重量(hundred-grain-weight)及び粒の長さを測定し、Ｔ０植物を観察し、巻葉を有する植物の数を数えた。
【００５５】
この試験を３回繰り返し、結果を図１２及び表２に示す。非形質転換水稲９３−１１及び空のベクターコントロールと比較すると、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲では、１００粒の重量及び粒の長さが有意に増加した。野生型の水稲と比較すると、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲の１００粒の重量は、新鮮な重量では２５．１％及び乾燥重量では２３％ほど増加し、粒の長さは、１／４ほど増加し、チョークのような粒の割合は減少した（コメの質が向上した）。
【００５６】
【表３】
【００５７】
非形質転換水稲及び空のベクターコントロールに比べて、ＯＳＸＣＬ形質転換水稲Ｔ０世代の植物は、若干幅広の歯及び刀のように細長く先の尖った巻葉(rolled flag leaf)を有する（図１３）。巻葉を有する植物は、ＯＳＸＣＬ形質転換水稲植物の最大９０％を占める。巻きは葉脚(leaf base)から開始し、後期の発達段階では、葉の上部にまで拡張する。
【００５８】
Ｂ．ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現するＴ２植物系およびpCAMBIA1300-163空のベクターで形質転換したコントロール植物系の１穂当たりの粒数を数え、巻葉を有するＴ２植物の数を観察した。
【００５９】
この試験を３回繰り返した。図１４及び表３に、１穂当たりの粒数を示す。空のベクターコントロールと比較すると、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３−１１水稲では、１穂当たりの粒数が有意に増加した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
図１３は、巻葉(leaf curls)の結果を示す。ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲の刀のように細長く先の尖った葉脚(flag leaf base)は、後期にカールした。
【００６２】
Ｃ．３０粒を、それぞれ、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現するＴ３植物系およびpCAMBIA1300-163空のベクターを形質転換したコントロール植物系から選択し、粒の長さを測定した。
【００６３】
この試験を３回繰り返し、結果を図１５に示す。空のベクターコントロール植物系では、平均の粒の長さが８．６２ｍｍであり；ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する植物系では、粒の長さが１１．３８ｍｍであり、空のベクターコントロール植物系の種より２４．３０％長かった。
【００６４】
したがって、すべてのＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する植物系は、Ｔ０世代からＴ３世代まで粒の長さ及び粒の重量が増加した表現型を発揮する。
【００６５】
実施例２：形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の育種
組換発現ベクター ＯｓＸＣＬ−１６３−１３００を、実施例１に記載の方法に従って得た後、Agrobacteriumによるｆｌｏｒａｌ−ｄｉｐ ｍｅｔｈｏｄによって、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（Ｃｏｌ−０、Arabidopsis Biological Resource Center, ABRCから市販）のゲノムに組み込んだ；ハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ培地でスクリーニングを行い、Ｔ２世代の種について、ハイグロマイシンを含むＭＳで連続してスクリーニングし、分離比が３：１である植物系をＴ３世代での連続スクリーニングのために選び；Ｔ３世代の種の１００％がハイグロマイシンを含むＭＳで生育したら、その植物系を同型接合系(homozygous line)と見なし、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を得た。
【００６６】
一方、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない発現ベクター１６３−１３００で形質転換したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を、空のベクターコントロールとして使用した。
【００６７】
ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)及び空のベクターコントロールのＴ３世代を育種し、長角果の数及び巻葉(leaf curl)を計測した。結果を図１６に示すが、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)では、長角果及び巻葉(leaf curl)が劇的に増加した。
【００６８】
産業上の用途
本発明によって育種されたＯｓＸＣＬ形質転換水稲は、野生型のコントロールに比して、１００粒の重量が最大４．２２４ｇ増加し、粒の重量が２５．１％増加し、粒の長さが１／４増加し、さらに１穂当たりの粒数が１１％増加する。ＯｓＸＣＬは水稲で過剰発現して、水稲で巻葉を生じさせ、コメの長さ及び１０００粒の重量(thousand-grain-weight)を有意に増加させ、さらにコメの品質及び１穂当たりの粒数を向上させる。ＯｓＸＣＬの適用によって、生産が増加するのみではなく、コメの品質が向上する；さらに、水稲の成長や発達には何ら否定的な影響がない。したがって、この遺伝子は、バイオテクノロジー及び遺伝子操作によって、コメ等の穀物の改良にとってかなり理想的な遺伝子であり、水稲や他の穀物の安全な生産に積極的な役割を果たすであろう。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に水稲の粒長さ、粒重量、１穂当たりの粒数および巻葉(rolled leaf)に関連するタンパク質、これのコーディング遺伝子およびこれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の説明
コメは、ヒトの生活が依存し、世界の人口の半分近くの主食を提供する主要な穀類作物のひとつである。中国では、コメは、生産量ですべての穀類作物のうち一位を占め、中国での居住者の穀物の配給消費量の６０％を占める；農業従事者の半分近くがコメの生産に従事している。したがって、コメは、中国の食用作物を主導している。世界人口がますます成長し（コメを消費する国の人口成長率が世界人口の平均成長率より早く）、工業化や都市化が迅速に発展し、さらに自然災害による損害が多くなるなどにつれて、水田が減少傾向にあり、世界的なコメの供給及び需要の間で切迫した葛藤が生じている。安定したコメの供給を確保できるようにどのようにしてより少ない水田でより多くの食物が生産できるのか？これは、我々が直面し解決しなければならない緊急の課題である。しかしながら、大規模生産でのコメの生産高は、たいてい非常に低い。１９９９年に国連の食糧農業機関（ＦＡＯ）によって行われた調査によると、１単位面積当たりの世界の平均のコメの出来高はたったの３．８ｔ・ｈａ−１（中国では６．３ｔ・ｈａ−１）でしかない。この目的のために、中国は、高収量品種の生産力を発達させ、これによりコメの出来高を実質的に向上するために、ここ３０年、超高い出来高のための水稲の育種プロジェクト（超水稲育種プロジェクト）を進めてきている。粒重量及び１穂当たりの粒数は穀物の生産高に影響を与える重要な因子であり、粒の大きさ、粒の重量または１穂当たりの粒の数を増加させることはコメの出来高を増加させる有効なアプローチである。さらに、粒の長さは重要な形態学的特徴であり、コメの品質を決定する。生物学者や農学者にとって、コメの生産量及び品質双方を向上することは最も追求する価値のある目標である。
【発明の概要】
【０００３】
発明の開示
本発明の目的は、下記１）または２）：
１）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成される、タンパク質；
２）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸を置換および／または欠失および／または付加することにより１）から誘導化され、かつ植物の粒の長さ、粒の重量、１穂当たりの粒数および葉の形状に関連する、タンパク質
である、ＯｓＸＣＬと称される、水稲由来のタンパク質を提供することである。
【０００４】
配列番号：２は、２５５個のアミノ酸を有するＯｓＸＣＬのアミノ酸配列であり、この際、７２個の疎水性アミノ酸（プロリンを含む）、１８３個の親水性アミノ酸、３４個の酸性アミノ酸及び３８個の塩基性アミノ酸が存在する。このタンパク質は、２６．７３ｋＤａの分子量及び９．８の等電点を有する。これは、今まで報告されていない新規なタンパク質である。
【０００５】
表１に記載のタグは、１）のＯｓＸＣＬの簡便な精製を目的として、配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成されるタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に連結されてもよい。
【０００６】
【表１】
【０００７】
上記２）におけるＯｓＸＣＬは、人工的に合成することによって得られても、あるいは生物学的に発現させる前にそのコーディング遺伝子を合成することによって得られてもよい。上記２）のＯｓＸＣＬのコーディング遺伝子は、配列表の配列番号：１の５’末端から出発する１０６〜８７０番目の位置の塩基について、１以上のアミノ酸残基のコドンを欠失させる、および／または１以上の塩基対をミスセンス変異を行う、および／または５’末端および／または３’末端で表１に記載されるようなタグのコーディング配列を連結することによって得られてもよい。
【０００８】
ＯｓＸＣＬと称される、上記タンパク質のコーディング遺伝子はまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【０００９】
上記コーディング遺伝子は、下記１）または２）または３）または４）の遺伝子：
１）配列表の配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
２）配列表の配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
３）高ストリンジェントな条件で１）または２）で規定される遺伝子とハイブリダイズし、かつ当該タンパク質をコード化する、遺伝子；
４）１）または２）で規定される遺伝子と８０％以上の相同性を有し、かつ当該タンパク質をコード化する、遺伝子
である。
【００１０】
配列番号：１は、５’側の非翻訳領域が１０５塩基からなり、３’側の非翻訳領域が１９２塩基からなり、コーディング領域が７６５塩基（１０６〜８７０番目の位置）からなり、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列を有するＯｓＸＣＬタンパク質をコード化する、１０６２塩基から構成されるＯｓＸＣＬコード化全長ｃＤＮＡである。コーディング領域では、Ａは１５．１６％（１１６）を占め、Ｃは４０．６５％（３１１）を占め、Ｇは３２．２９％（２４７）を占め、Ｔは１１．９％（９１）を占め、Ａ＋Ｔは２７．０６％（２０７）を占め、また、Ｃ＋Ｇは７２．９４％（５５８）を占める。
【００１１】
上記高ストリンジェントな条件は、６５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションするためにプレハイブリダイゼーション溶液（０．２５モル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、７％ ＳＤＳ）中にハイブリッドフィルムを置き；プレハイブリダイゼーション溶液を除き、６５℃で１２時間、ハイブリダイゼーションするためにハイブリダイゼーション溶液（０．２５モル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、７％ ＳＤＳ、同位体標識されたヌクレオチドフラグメント）を加え；ハイブリダイゼーション溶液を除き、膜洗浄溶液Ｉ（２０ミリモル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、５％ ＳＤＳ）を加え、膜を６５℃で２回洗浄し、それぞれ３０分間継続し；膜洗浄溶液ＩＩ（２０ミリモル／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２、１％ ＳＤＳ）を加え、膜を６５℃で３０分間洗浄する。
【００１２】
上記ＯｓＸＣＬ遺伝子またはこのフラグメントの全長を増幅するのに使用されるプライマー対もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１３】
上記遺伝子を含む形質転換細胞系もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１４】
上記遺伝子を含む組換株もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１５】
上記遺伝子を含む組換ベクターもまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００１６】
ＯｓＸＣＬ遺伝子を含む組換発現ベクターは、公知の植物の発現ベクターを用いて構築されうる。植物の発現ベクターとしては、Agrobacteriumベクター及び植物の微粒子銃(microprojectile bombardment)に使用されるベクターなど、例えば、ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００、ｐＢＩ１２１、ｐＢｉｎ１９、ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−ＵｂｉＮ、ｐＢＹ５０５または他の誘導化された植物の発現ベクターが挙げられる。ＯｓＸＣＬ遺伝子を有する組換発現ベクターを構築する際には、単独であるいはカリフラワー・モザイク・ウイルス(cauliflower mosaic virus)（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーター、ユビキチン遺伝子プロモーター(ubiquitin gene promoter)（ｐＵｂｉ）、アクチンプロモーター(Actin promoter)等の、他の植物プロモーターと組み合わせて使用してもよい、エンハンスメントプロモーター(enhancement promote)、構成プロモーター(constitutive promoter)、組織特異的プロモーター(tissue specific promoter)または誘導性プロモーター(inducible promoter)を、転写開始ヌクレオチドの前に付加してもよい。
【００１７】
加えて、本発明の遺伝子を用いて植物の発現ベクターを構築する際には、翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサー等のエンハンサーをまた使用してもよい。これらのエンハンサー領域は、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する領域の開始コドンであってもよく、これは全配列の正確な翻訳を保証するためにコーディング配列のリーディングフレームと一致する必要がある。翻訳調節シグナルや開始コドンの源が豊富に存在し、この際、これらは天然のものであってもあるいは合成されたものであってもよい。翻訳開始領域は、転写開始領域または構造遺伝子由来であってもよい。
【００１８】
使用される植物の発現ベクターは、形質転換植物細胞または植物の公知の同定及びスクリーニングを目的として、植物中で発現して、色の変化する酵素または発光化合物（ＧＵＳ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等）、耐性を有する抗生物質マーカー（ゲンタシンマーカー、カナマイシンマーカー等）または抗化学試薬に対するマーカー遺伝子（例えば、抗除草剤遺伝子）等を生産する遺伝子を導入することによって、プロセッシングを受けて(processed)もよい。
【００１９】
特に、上記組換ベクターは、発現ベクター１６３−１３００の複数のクローニング部位に上記遺伝子を挿入することによって得られる組換ベクターであってもよく；
この際、この発現ベクター１６３−１３００の構築方法は、ｐＪＩＴ１６３をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断することによって製造されるＤｏｕｂｌｅ ３５Ｓプロモーターを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断することによって製造されるラージフラグメントと連結して、組換発現ベクターを得るものである。
【００２０】
本発明の他の目的は、粒の重量が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される粒の重量が増した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の粒重量より重い粒重量を有する形質転換植物を得ることである。
【００２１】
本発明の他の目的は、粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の粒長さより長い粒長さを有する形質転換植物を得ることである。
【００２２】
本発明の他の目的は、１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、ターゲットとなる植物の１穂当たりの粒数より多い１穂当たりの粒数を有する形質転換植物を得ることである。
【００２３】
本発明の他の目的は、巻葉(rolled leaf)を有する形質転換植物の育種(breeding)方法を提供することである。本発明によって提供される巻葉を有する形質転換植物の育種(breeding)方法は、上記遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、巻葉を有する形質転換植物を得ることである。
【００２４】
上記遺伝子は、上記組換ベクターを介してターゲットとなる植物に導入される。本発明のＯｓＸＣＬ遺伝子を有する植物の発現ベクターは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウィルスベクター、遺伝子銃(gene gun)、花粉管経路(pollen tube pathway)、マイクロインジェクション(microinjection)、電気的形質転換(electrical transformation)、Agrobacterium法(Agrobacterium mediation)等の、公知の生物学的な方法によって植物細胞または組織に形質転換されうる。
【００２５】
上記植物は、双子葉植物または単子葉植物であってもよく；前記単子葉植物は、好ましくは水稲であり、双子葉植物は、好ましくはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＰＣＲによって増幅されたＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示すものであり、この際、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２及び３は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡである。
【図２】図２は、ＯｓＸＣＬをＴベクターに連結した後のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで酵素的に切断したものの確認図であり、この際、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２〜５は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡのクローニングベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのダブルで酵素的に切断した結果である。
【図３】図３は、ＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡをＴベクターに連結した後のＢａｍＨＩで酵素的に切断したものの確認図であり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、ＢａｍＨＩで酵素的に切断する前のＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡプラスミドのバンドであり；１、２、３及び４は、ＢａｍＨＩで酵素的に切断した後のＯｓＸＣＬ ｃＤＮＡプラスミドのバンドであり、Ｍは、ＤＮＡマーカーである。
【図４】図４は、ｐＪＩＴ１６３のマップである。
【図５】図５は、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００のマップである。
【図６】図６は、ＯｓＸＣＬを含むｐＭＤ１８−Ｔベクターのマップの一部である。
【図７】図７は、ＯｓＸＣＬを発現ベクターに連結した後のＥｃｏＲＩで酵素的に切断したものの確認図であり；レーン１〜５は、ＥｃｏＲＩで酵素的に切断したＯｓＸＣＬ発現ベクターの酵素的切断結果である。
【図８】図８は、ＯｓＸＣＬを発現ベクターに連結した後のＨｉｎｄＩＩＩで酵素的に切断したものの確認図であり；レーン１〜５は、ＨｉｎｄＩＩＩで酵素的に切断したＯｓＸＣＬ発現ベクターである。
【図９】図９は、Agrobacteriumから単離されたプラスミドでそれぞれ行われたＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで１つの酵素による切断したものの確認図であり；レーン１は、ＤＮＡマーカーであり；レーン２は、ＥｃｏＲＩによる酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクタープラスミドの結果であり；レーン３は、ＨｉｎｄＩＩＩによる酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクタープラスミドの結果である。
【図１０】図１０は、ハイグロマイシン耐性遺伝子に従って設計されたプライマーを用いて行われたＰＣＲの確認図である。この際、Ｍは、ＤＮＡマーカーであり；レーン１〜９及び１２〜２１は、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲植物のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行われたハイグロマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ結果であり；レーン１０及び２２は、発現ベクタープラスミドを鋳型として用いて増幅したハイグロマイシン耐性遺伝子であり、ポジティブコントロールとして使用し；レーン１１及び２３は、鋳型を用いない（水）のネガティブコントロールである。
【図１１】図１１は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を用いて形質転換されたＴ０ ９３−１１植物で行われた定量リアルタイムＰＣＲ(quantitative real-time PCR)の相対的な発現分析である。Ｓ１は、非形質転換コントロール水稲であり；Ｓ２は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない空のベクターを有するコントロール水稲であり；Ｓ３〜Ｓ２５は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を用いて形質転換されたＴ０ ９３−１１水稲植物である。
【図１２】図１２は、OｓＸＣＬ形質転換水稲の粒及びコントロールの粒の写真である。
【図１３】図１３は、葉が巻いている(leaves rolled up)ＯｓＸＣＬで形質転換されたＴ０世代の水稲及び後にカールした刀のように細長く先の尖った葉脚(flag leaf base)を有するＴ２世代の水稲の写真である。
【図１４】図１４は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲のＴ２世代の１穂当たりの粒数が増加したことを示す写真である。
【図１５】図１５は、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲の粒の成長を示すグラフである。
【図１６】図１６は、長角果(siliques)及び巻葉(leaves curled)を劇的に増加したＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明を実施するための最良の形態
本発明を、下記特定の実施例を参照しながらさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２８】
特記しない限り、下記実施例の方法はそれぞれ公知の方法である。
【００２９】
実施例１：長い、大きい及び複数の粒ならびに巻葉(rolled leaf)を有する形質転換水稲の育種(breeding)
Ｉ．組換発現ベクターの構築
１．ＯｓＸＣＬ遺伝子のクローニング
５’末端にそれぞれＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位が付加されるプライマー対を人工的に合成した。上記上流プライマー及び下流プライマーは下記のとおりである：
【００３０】
【化１】
【００３１】
水稲Ｐｅｉ’ａｉ ６４Ｓ(Chinese National Center for Rice Hybridization and Breeding, Changsha, China)から抽出した、ＲＮＡを、逆転写してｃＤＮＡの第１の鎖を得た。
【００３２】
ＰＣＲを行い、上記上流プライマー及び下流プライマーをプライマーとしておよび水稲Ｐｅｉ’ａｉ ６４ＳのｃＤＮＡを鋳型として用いて、配列番号：１に記載されるｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲプログラムでは、１０５℃の加熱蓋の下で９４℃で５分間予備変性を開始した後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニール、７２℃で１分２０秒間の伸長(extension)を３２サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の最終伸長(extension)を行い、温度は２２℃に維持した。
【００３３】
ＰＣＲシステムは、下記のとおりである：
【００３４】
【化２】
【００３５】
アガロースゲル電気泳動を、ＴＥＡ電気泳動緩衝液を用いて行い、得られた約８００ｂｐのフラグメント（図１）をＯｓＸＣＬと称した。
【００３６】
上記ＯｓＸＣＬのバンドを、ＴＩＡＮＧＥＮのキットを用いて、gel slug-press recoveryの方法によって回収した。回収したフラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクター(TA Cloning, Jinan TaiTianHe Biotechnology Limited Company)に連結し、この際の連結システムは、下記のとおりである：
【００３７】
【化３】
【００３８】
ライゲーションを２時間行い、大腸菌(E.coli) ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換し、プレートにスプレッドし、アンピシリンでスクリーニングした。単一のクローン(monoclone)を選択し、これからプラスミドを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩの２つの酵素で切断することによって同定した。酵素の切断物から、図２に示されるように、約８００ｂｐのＯｓＸＣＬのバンドの存在が示された。
【００３９】
プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、ターゲットとなるフラグメントＯｓＸＣＬがＴベクターに連結する方向を確認し、その結果では、図３に示されるように、ＢａｍＨＩ部位が下流プライマーに付加されたので、Ｔベクターに逆に挿入されることにより約８４０ｂｐのバンドが生じた；図３において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は未切断のプラスミドを表わし、そのバンドの大きさは右側ではマーカーに１ｋｂたしたもので示され、さらに、１、２、３及び４は切断後の結果を表わし、そのバンドの大きさは左側ではマーカーに１ｋｂたしたもので示される。結果を比較することにより、プラスミド４以外の、プラスミド１、２及び３はそれぞれオープンになるように切断され(cut open)、ターゲットとなるフラグメントが順方向に連結された（即ち、それぞれが約８００ｂｐである）。プラスミド１、２及び３に相当する細菌溶液の配列を決定し、その配列の結果から、ターゲットとなるフラグメントＯｓＸＣＬは配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置の配列を有し、ＯｓＸＣＬ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に示される配列と完全に一致した配列を有することが示唆された。
【００４０】
２．組換発現ベクターの構築
１）発現ベクター１６３−１３００の構築
図４に示されるｐＪＩＴ１６３(pGreen, http://www.pgreen.ac.uk/)を、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断し、酵素による切断物の結果を、ダブル３５Ｓプロモーター(Double 35S promoter)を含むＤＮＡバンドを回収する前に、アガロースゲル電気泳動により同定した。図５に示されるように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００(CambiaLabs, http://www.cambia.org/daisy/bioforge_ legacy/3725.html)を、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断し、ラージフラグメントを回収した。ＸｈｏＩ及びＳａｌＩは、イソカウダマー(isocaudarner)である。これら２つの回収フラグメントをＴ４リガーゼで一晩ライゲートし、１６３−１３００コンプレックスベクター(complex vector)を構築した。
【００４１】
２）組換発現ベクターの構築
図６に示される、ＯｓＸＣＬを含むＴベクターを、酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断した（ＢａｍＨＩは、設計されたプライマーによる８７２番目の位置に導入される酵素切断部位または８８７番目のＴベクターの酵素切断部位に作用し、回収されたフラグメントはそれぞれＯｓＸＣＬ ＯＲＦの終始コドンを含む）。また、発現ベクター１６３−１３００をこれら２つの酵素で切断し、回収した後、連結し、即ち、遺伝子ＯｓＸＣＬを発現ベクター１６３−１３００に連結して、ＯｓＸＣＬ−１６３−１３００と称される、組換発現ベクターを構築し、これを、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩの１種の酵素で切断することによって確認した。図７及び８に示されるように（１、２、３、４及び５は、それぞれ、酵素切断後のＯｓＸＣＬ発現ベクターのバンドを表す）、結果から、１、３、４及び５は、それぞれ、ＯｓＸＣＬを含む約１６００ｂｐの正しいターゲットとしたバンドを有することが示される。
【００４２】
ＩＩ．粒が長く、巻葉を有する形質転換水稲の育種および検出
１．粒が長く、大きくかつ複数ありかつ巻葉を有する形質転換水稲を得る
ステップＩ．２の組換発現ベクターを用いて、Agrobacteriumの形質転換のための凍結融解法を用いてAgrobacterium EHA105（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.で市販）に形質転換した。Agrobacteriumから単離したプラスミドについて、それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの１種の酵素切断により確認した（図９）。この際、Agrobacteriumの形質転換のための凍結融解法のステップは下記のとおりである：
凍結融解法のステップは下記のとおりである：−７０℃で貯蔵されたAgrobacterium EHA105のコンピテント細胞を取り出し、氷浴において、融解し；１０〜２０μｌのpCAMBIA1300-2×CaMV35S-OsMsr1 -CaMV35S-Term plasmid DNA（約１〜２μｇ）を、滅菌したガンチップ(gun tip)で撹拌しながら、Agrobacteriumの融解したコンピテント細胞 ２００ｍｌに添加し、数分間放置し；この混合物を液体窒素中に１分間、さらに３７℃の水浴に５分間、入れた後、７００〜８００μｌのＬＢ液体培地を添加し、さらに２８℃で４時間、２００ｒｐｍで振盪し；１０００ｇで３０秒間遠心して、上清の一部を捨てて、１００〜１５０μｌを残し、これをガンチップと共に吸入・排出(inhalation and ejection)して再懸濁し、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌ リファンピシン及び３４ｍｇ／Ｌ クロロマイシンを含むＬＢプレートにスプレッドし；次に、このプレートをひっくり返して(invertly)置き、２８℃で２日間培養した。
【００４３】
上記で確認された組換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いて、感染法により、ライス９３−１１(rice 93-11)(Chinese National Center for Rice Hybridization and Breeding, Changsha, China)のカルス組織に感染させた。次に、感染カルスを、ハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含む選択培地で生育させて、ハイグロマイシン耐性再生植物体を得た。
【００４４】
ゲノムＤＮＡを、ハイグロマイシン耐性再生植物体の葉から抽出し、ハイグロマイシン耐性遺伝子に基づいて設計された下記プライマーを用いてＰＣＲ確認用鋳型として使用した：
【００４５】
【化４】
【００４６】
確認結果を図１０に示すが、ターゲットとなるバンドが、１、２、３、４、５、６、１２、１３、１５、１６、１８及び２０の計１２植物系で得られた、すなわち、形質転換植物のＴ０世代で計１２の陽性植物が存在した（ＯｓＸＣＬと接近して連結したハイグロマイシン遺伝子は水稲のゲノムに既に組み込まれていた）。
【００４７】
２．検出分析
上記ＯｓＸＣＬ形質転換水稲を栽培を目的として温室に移し、袋に入れ、自家交配して、形質転換水稲の種を集めた。
【００４８】
一方、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない発現ベクター１６３−１３００の形質転換水稲を空のベクターコントロールとして使用した；また、非形質転換水稲をコントロールとして使用した。
【００４９】
１）定量ＰＣＲ検出
定量ＰＣＲ検出を、ＯｓＸＣＬ遺伝子のＤＮＡ配列プライマー１０８−Ｆ及び１０８−Ｒを用いてＯｓＸＣＬ形質転換水稲及び非形質転換水稲で行った；結果を図１１に示し、ＯｓＸＣＬは、非形質転換水稲９３−１１では発現レベルが比較的低く、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲では発現レベルが劇的に向上した。
【００５０】
ここで、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは下記のとおりであった：
【００５１】
【化５】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【化６】
【００５４】
２）表現型の観察および統計データ
Ａ．ＯｓＸＣＬ遺伝子の形質転換水稲９３−１１、空のベクターコントロール及び非形質転換水稲９３−１１のＴ０世代の種を秤量し、１００粒の重量(hundred-grain-weight)及び粒の長さを測定し、Ｔ０植物を観察し、巻葉を有する植物の数を数えた。
【００５５】
この試験を３回繰り返し、結果を図１２及び表２に示す。非形質転換水稲９３−１１及び空のベクターコントロールと比較すると、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲では、１００粒の重量及び粒の長さが有意に増加した。野生型の水稲と比較すると、ＯｓＸＣＬ形質転換水稲の１００粒の重量は、新鮮な重量では２５．１％及び乾燥重量では２３％ほど増加し、粒の長さは、１／４ほど増加し、チョークのような粒の割合は減少した（コメの質が向上した）。
【００５６】
【表３】
【００５７】
非形質転換水稲及び空のベクターコントロールに比べて、ＯＳＸＣＬ形質転換水稲Ｔ０世代の植物は、若干幅広の歯及び刀のように細長く先の尖った巻葉(rolled flag leaf)を有する（図１３）。巻葉を有する植物は、ＯＳＸＣＬ形質転換水稲植物の最大９０％を占める。巻きは葉脚(leaf base)から開始し、後期の発達段階では、葉の上部にまで拡張する。
【００５８】
Ｂ．ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現するＴ２植物系およびpCAMBIA1300-163空のベクターで形質転換したコントロール植物系の１穂当たりの粒数を数え、巻葉を有するＴ２植物の数を観察した。
【００５９】
この試験を３回繰り返した。図１４及び表３に、１穂当たりの粒数を示す。空のベクターコントロールと比較すると、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３−１１水稲では、１穂当たりの粒数が有意に増加した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
図１３は、巻葉(leaf curls)の結果を示す。ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換９３１１水稲の刀のように細長く先の尖った葉脚(flag leaf base)は、後期にカールした。
【００６２】
Ｃ．３０粒を、それぞれ、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現するＴ３植物系およびpCAMBIA1300-163空のベクターを形質転換したコントロール植物系から選択し、粒の長さを測定した。
【００６３】
この試験を３回繰り返し、結果を図１５に示す。空のベクターコントロール植物系では、平均の粒の長さが８．６２ｍｍであり；ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する植物系では、粒の長さが１１．３８ｍｍであり、空のベクターコントロール植物系の種より２４．３０％長かった。
【００６４】
したがって、すべてのＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する植物系は、Ｔ０世代からＴ３世代まで粒の長さ及び粒の重量が増加した表現型を発揮する。
【００６５】
実施例２：形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の育種
組換発現ベクター ＯｓＸＣＬ−１６３−１３００を、実施例１に記載の方法に従って得た後、Agrobacteriumによるｆｌｏｒａｌ−ｄｉｐ ｍｅｔｈｏｄによって、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（Ｃｏｌ−０、Arabidopsis Biological Resource Center, ABRCから市販）のゲノムに組み込んだ；ハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ培地でスクリーニングを行い、Ｔ２世代の種について、ハイグロマイシンを含むＭＳで連続してスクリーニングし、分離比が３：１である植物系をＴ３世代での連続スクリーニングのために選び；Ｔ３世代の種の１００％がハイグロマイシンを含むＭＳで生育したら、その植物系を同型接合系(homozygous line)と見なし、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を得た。
【００６６】
一方、ＯｓＸＣＬ遺伝子を持たない発現ベクター１６３−１３００で形質転換したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を、空のベクターコントロールとして使用した。
【００６７】
ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)及び空のベクターコントロールのＴ３世代を育種し、長角果の数及び巻葉(leaf curl)を計測した。結果を図１６に示すが、ＯｓＸＣＬ遺伝子を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)では、長角果及び巻葉(leaf curl)が劇的に増加した。
【００６８】
産業上の用途
本発明によって育種されたＯｓＸＣＬ形質転換水稲は、野生型のコントロールに比して、１００粒の重量が最大４．２２４ｇ増加し、粒の重量が２５．１％増加し、粒の長さが１／４増加し、さらに１穂当たりの粒数が１１％増加する。ＯｓＸＣＬは水稲で過剰発現して、水稲で巻葉を生じさせ、コメの長さ及び１０００粒の重量(thousand-grain-weight)を有意に増加させ、さらにコメの品質及び１穂当たりの粒数を向上させる。ＯｓＸＣＬの適用によって、生産が増加するのみではなく、コメの品質が向上する；さらに、水稲の成長や発達には何ら否定的な影響がない。したがって、この遺伝子は、バイオテクノロジー及び遺伝子操作によって、コメ等の穀物の改良にとってかなり理想的な遺伝子であり、水稲や他の穀物の安全な生産に積極的な役割を果たすであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１）または２）：
１）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成される、タンパク質；
２）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸を置換および／または欠失および／または付加することにより１）から誘導化され、かつ植物の粒の形状および葉の形状に関連する、タンパク質
である、タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項３】
下記１）または２）または３）または４）の遺伝子である、請求項２に記載の遺伝子：
１）配列表の配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
２）配列表の配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
３）高ストリンジェントな条件で１）または２）で規定される遺伝子とハイブリダイズし、かつ請求項１に記載のタンパク質をコード化する、遺伝子；
４）１）または２）で規定される遺伝子と８０％以上の相同性を有し、かつ請求項１に記載のタンパク質をコード化する、遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子を有する形質転換細胞系または組換株。
【請求項５】
請求項２または３に記載の遺伝子を有する組換ベクター。
【請求項６】
前記組換ベクターは、請求項２または３に記載の遺伝子を発現ベクター１６３−１３００の多重クローニング部位中に挿入することによって得られる組換ベクターであり；
発現ベクター１６３−１３００の構築方法が、ｐＪＩＴ１６３をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断することによって製造されるダブル３５Ｓプロモーター(Double 35S promoter)を含むＤＮＡバンドを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断することによって製造されるラージフラグメントと連結して、組換発現ベクターを得るものである、請求項５に記載の組換ベクター。
【請求項７】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の粒重量より大きい粒重量を有する形質転換植物を得ることを有する、粒重量が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項８】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の粒長さより長い粒長さを有する形質転換植物を得ることを有する、粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の１穂当たりの粒数より多い１穂当たりの粒数を有する形質転換植物を得ることを有する、１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、巻葉(rolled leaf)を有する形質転換植物を得ることを有する、巻葉を有する形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項１１】
請求項２または３に記載の遺伝子を、請求項５または６に記載の組換ベクターを用いてターゲットとなる植物に導入する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物が、双子葉植物または単子葉植物であり；前記植物が好ましくは水稲またはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
下記１）または２）：
１）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列から構成される、タンパク質；
２）配列表の配列番号：２に記載されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸を置換および／または欠失および／または付加することにより１）から誘導化され、かつ植物の粒の形状および葉の形状に関連する、タンパク質
である、タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコード化する遺伝子。
【請求項３】
下記１）または２）または３）または４）の遺伝子である、請求項２に記載の遺伝子：
１）配列表の配列番号：１の５’末端から１０６〜８７０番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
２）配列表の配列番号：１の５’末端から５０〜８７３番目の位置に記載されるコーディング配列を有する、遺伝子；
３）高ストリンジェントな条件で１）または２）で規定される遺伝子とハイブリダイズし、かつ請求項１に記載のタンパク質をコード化する、遺伝子；
４）１）または２）で規定される遺伝子と８０％以上の相同性を有し、かつ請求項１に記載のタンパク質をコード化する、遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子を有する形質転換細胞系または組換株。
【請求項５】
請求項２または３に記載の遺伝子を有する組換ベクター。
【請求項６】
前記組換ベクターは、請求項２または３に記載の遺伝子を発現ベクター１６３−１３００の多重クローニング部位中に挿入することによって得られる組換ベクターであり；
発現ベクター１６３−１３００の構築方法が、ｐＪＩＴ１６３をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで酵素的に切断することによって製造されるダブル３５Ｓプロモーター(Double 35S promoter)を含むＤＮＡバンドを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで酵素的に切断することによって製造されるラージフラグメントと連結して、組換発現ベクターを得るものである、請求項５に記載の組換ベクター。
【請求項７】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の粒重量より大きい粒重量を有する形質転換植物を得ることを有する、粒重量が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項８】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の粒長さより長い粒長さを有する形質転換植物を得ることを有する、粒長さが増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、前記ターゲットとなる植物の１穂当たりの粒数より多い１穂当たりの粒数を有する形質転換植物を得ることを有する、１穂当たりの粒数が増加した形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の遺伝子をターゲットとなる植物に導入して、巻葉(rolled leaf)を有する形質転換植物を得ることを有する、巻葉を有する形質転換植物の育種(breeding)方法。
【請求項１１】
請求項２または３に記載の遺伝子を、請求項５または６に記載の組換ベクターを用いてターゲットとなる植物に導入する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物が、双子葉植物または単子葉植物であり；前記植物が好ましくは水稲またはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１３−５０２２３０（Ｐ２０１３−５０２２３０Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５８５２（Ｐ２０１２−５２５８５２）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００１０１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２９３０
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５１２０４３７２８）中国科学院亜熱帯農業生態研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００１０１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２９３０
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５１２０４３７２８）中国科学院亜熱帯農業生態研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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