治療、診断およびクロマトグラフィーに使用するためのタンパク質複合体
本発明は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく少なくとも１つのポリペプチド分子と少なくとも１つの機能性成分との間の共有結合を含む複合体に関する。さらに、本発明は、前記複合体の調製のための方法、ならびに診断、治療およびクロマトグラフィーにおける前記複合体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチド分子と１以上の機能性成分との間における共有結合を含む複合体に関する。さらに、本発明は、前記複合体の製造方法、ならびに、診断、治療およびクロマトグラフィーにおける前記複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−II−クリスタリンは、β−γ−クリスタリンファミリーに属し、脊椎動物において、偏在的に分布する眼の水晶体の構造タンパク質である（非特許文献１）。前記β−γ−クリスタリンは、構造的に同一な２つのドメイン、および、主にβシート構造からなるという特徴を有する、高度に相同なタンパク質ファミリーを形成する（非特許文献２）。β−γ−クリスタリンの重ね合わせ構造のモチーフは、グリークキー形態と呼ばれる。それは、４つの逆平行のβ鎖からなり、その内の２つ（一方が他方に横たわる）が、クリスタリンの１つのドメインを形成する（非特許文献３）。
【０００３】
クリスタリンの本来の機能は、８６０ｍｇ／ｍＬに達する極めて高い局所タンパク質濃度により達成される、眼の水晶体における高屈折率の発生に基づいている（非特許文献４）。それらの空間構造により、クリスタリンは、高いプロテアーゼ耐性を有する、非常に安定した可溶性タンパク質である。さらに、眼の水晶体内における局在は、γ−クリスタリンがタンパク質ターンオーバーの影響を受けないという効果を有する。従って、β−γ−クリスタリンは、最も長い半減期を有するタンパク質として知られている（非特許文献５）。
【０００４】
このタンパク質ファミリーの中で最も優れた特性を有するのが、ウシのγ−クリスタリンである。その空間構造は、異なる解像度で、野生型タンパク質および全範囲の点変異を決定できる（非特許文献６；非特許文献４；非特許文献７）。このことは、前記タンパク質が、２つのドメイン間の疎水性間隙を介して安定化されていることを示している。この間隙は、Ｎ末端ドメインにおける３残基およびＣ末端ドメインにおける形態的に同一の３残基からなる６つの疎水性残基の分子内相互作用により形成される（非特許文献８）。化学薬品に対する安定性は、主に、前記２つのドメインに結合する短いペプチドに大きく依存する（非特許文献９）。
【０００５】
前記ウシγ−クリスタリンは、分子量約２０ｋＤａで、並外れた高い安定性により特徴付けられる。それは、中性ｐＨで８Ｍ尿素に耐性を示す。ｐＨ１〜９の範囲において、天然状態で存在し（非特許文献１０；非特許文献１１）、７５℃に達する温度でさえ、前記タンパク質は７Ｍ尿素に安定である（非特許文献１２）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるγ−クリスタリンの組換え細胞質発現は、非常に高収率で成功している（非特許文献９）。
【０００６】
高い安定性、低分子量、高い細胞質発現率というタンパク質の化学的特性により、γ−クリスタリンのタンパク質クラスは、代替結合分子の発生のための有力な候補になり得る。
【０００７】
ファージミドライブラリー（ＧＣＵＣ１）は、足場タンパク質としてのウシγ−II−クリスタリンに基づいてＦｉｅｄｌｅｒ＆Ｒｕｄｏｌｐｈにより確立され、表面に露出した２、４、６、１５、１７、１９、３６および３８部位（開始メチオニンを除く）の８つのアミノ酸が、ＤＮＡレベルでランダム化された。ファージディスプレイ法により数回の選択を行った後、μＭの範囲でエストラジオールへの特異的な結合および親和性を有するバリエーションが検出された。これらの結果は、ウシγ−II−クリスタリンにおいて、新しく発生される前には存在しなかった結合特性を示しており、前記γ−クリスタリンは、前記代替結合分子の単離のための足場タンパク質として、一般的に適していることを示している（特許文献１参照）。
【０００８】
後の研究において、新しいライブラリが、ヒトγ−II−クリスタリンに基づいて確立された。前記足場タンパク質としてのヒトγ−II−クリスタリンの選択、および、新しいライブラリの付随的構成は、重要な利点を有する。
１．ウシタンパク質と比較して、ヒトγ−II−クリスタリンは、変性作用に対して著しく高い安定性を有している。
２．ヒト由来タンパク質は、治療的応用において、各変異の免疫原生が非常に低いという結果をもたらす。そして、
３．より高度な複雑性を有する新しく構築されたライブラリは、さらに高い親和性を有する結合分子の単離を可能とするであろう（非特許文献１３）。
前記ＧＣＵＣ１ライブラリと同様に、同じ８個のアミノ酸部位（開始メチオニンを除く、２、４、６、１５、１７、１９、３６および３８部位）が、ランダム化のために選択された。新しいライブラリＣＲ２０は、それぞれ独立した理論上５×１０８通りの変異体を有するヒトγ−ＩＩ−クリスタリンに基づき、特許文献１に記載された方法で確立され、前記ライブラリにおいて変異体は約１３０倍で表される。２００以上の独立した変異体をシークエンスした後、全変異体の８０％以上が、前記８箇所のランダム化部位においてのみ置換を有することがわかった。さらに、３番目のコドン部位を除く置換部位における変異の配列は、可能性のある全てのヌクレオチドと、ほとんど同一の分布を示した。このように、前記８箇所のランダム化部位における全３２の可能性のあるコドンを有するこのライブラリは、質が高い。
【０００９】
代替結合分子の生産に使用される第２の足場タンパク質は、ヒトユビキチンから作製される。ユビキチンは、小型、単量体、その配列で高く保存された細胞質タンパク質であり、原生動物から脊椎動物まで全ての公知真核生物の細胞において存在する。
【００１０】
ユビキチンのペプチド鎖は、７６個のアミノ酸からなり、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれている（非特許文献１４）。ポリペプチド鎖のほぼ８７％が、水素結合を介した２次構造要素の形成に関与している。著名な２次構造として、３．５α−へリックスターン、および、５本鎖からなる逆平行βシートが、報告されている。これらの要素（逆平行βシートは、その裏面上においてタンパク質表面に露出し、αヘリックスは、その上部において垂直に横たわって詰め込まれる）の特性の変化は、一般的に、いわゆる、ユビキチン様折りたたみモチーフと考えられている。他の構造的特性は、α−へリックスとβシートとの間における前記タンパク質の内部の、著しい疎水性領域である。
【００１１】
サイズが小さいために、ユビキチンの人工調製は、化学合成およびバイオテクノロジーの手段の両方により行うことができる。好ましい折りたたみ特性のために、ユビキチンは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物を用いた遺伝子工学により、細胞質または細胞膜周辺腔において比較的大量に生産できる。
【００１２】
単純で効率的な微生物調製のため、ユビキチンは、その生産に問題がある他の外来タンパク質のための融合パートナーとして使用できる。ユビキチンに対する融合手段によって溶解度が改善し、それにより、改善した収量が達成される（非特許文献１５）。
【００１３】
コンピュータ分析を用いた結晶構造の利用可能なデータ（ＰＤＢデータベースエントリー１ＵＢＩ）に基づくと、ユビキチン足場タンパク質におけるこれらのアミノ酸の部位は、表面、すなわち、溶媒または可能な結合パートナーに対して露出される側鎖に局在する。選択された部位は、第１アミノ末端βシート鎖のはじめ（２、４、６部位）、ループ（６２、６３部位）、および、カルボキシ末端βシート鎖のはじめ（６４、６５、６６部位）において、それぞれ空間的に接近して局在化し、それらのアミノ酸側鎖によりユビキチン表面の接触領域が形成される。このようにして、表面が露出した高頻度可変領域が、まだ変化していないユビキチンのタンパク質構造上の分析領域において、ランダムなアミノ酸置換により発生した（国際特許出願／ＥＰ２００４／００５７３０号、未発行）。
【００１４】
βシートタンパク質上での人工的な結合表面の発生は、従来の抗体に対する、新規で興味深い代替性を示す。γ−II−クリスタリンまたはユビキチン様のタンパク質表面における新規で人工的に発生させた結合部位が、結果として、機能性結合分子をもたらすことの証明が得られた（特許文献１）（国際特許出願／ＥＰ２００４／００５７３０号、未発行）。
【００１５】
しかしながら、今まで、２つの成分のうちの１つの機能または両成分の機能の損失を受けることなく、診断、治療および分析応用に有用性を与える複合体を形成するために、他の成分に対してこれらのポリペプチド分子をカップリングすることは示唆がなかった。
【特許文献１】ドイツ公開特許第１９９３２６８８Ａ１号公報
【非特許文献１】Jaenicke, R., and Slingsby, C. (2001). Lens crystallins and their microbial homologs: structure, stability, and function. Crit Rev Biochem Mol Biol 36, 435-499.
【非特許文献２】Wistow, G. J., and Piatigorsky, J. (1988). Lens crystallins: the evolution and expression of proteins for a highly specialized tissue. Annu Rev Biochem 57, 479-504.
【非特許文献３】Blundell, T., Lindley, P., Miller, L., Moss, D., Slingsby, C., Tickle, I., Turnell, B., and Wistow, G. (1981). The molecular structure and stability of the eye lens: x-ray analysis of gamma-crystallin II. Nature 289, 771-777.
【非特許文献４】Kumaraswamy, V. S., Lindley, P. F., Slingsby, C., and Glover, I. D. (1996). An eye lens protein-water structure: 1.2 angstrom resolution structure of gamma B-crystallin at 150K. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 52, 611.
【非特許文献５】Jaenicke, R. (1996). Stability and folding of ultrastable proteins: eye lens crystallins and enzymes from thermophiles. Faseb J 10, 84-92.
【非特許文献６】Najmudin, S., Nalini, V., Driessen, H. P., Slingsby, C., Blundell, T., Moss, D., and Lindley, P. (1993). Structure of bovine gB (g II)-crystalline at 1.47 angstrom. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49, 223-233.
【非特許文献７】Norledge, B. V., Mayr, E. M., Glockshuber, R., Bateman, O. A., Slingsby, C., Jaenicke, R., and Driessen, H. P. (1996). The X-ray structures of two mutant crystallin domains shed light on the evolution of multi-domain proteins. Nat Struct Biol 3, 267-274.
【非特許文献８】Wistow, G., Turnell, B., Summers, L., Slingsby, C., Moss, D., Miller, L., Lindley, P., and Blundell, T. (1983). X-ray analysis of the eye lens protein gamma-II crystallin at 1.9 A resolution. J Mol Biol 170, 175-202.
【非特許文献９】Mayr, E. M., Jaenicke, R., and Glockshuber, R. (1994). Domain interactions and connecting peptides in lens crystallins. J Mol Biol 235, 84-88.
【非特許文献１０】Rudolph, R., Siebendritt, R., Nesslauer, G., Sharma, A. K., and Jaenicke, R. (1990). Folding of an all-beta protein: independent domain folding in gamma II-crystallin from calf eye lens. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 4625-4629.
【非特許文献１１】Sharma, A. K., Minke-Gogl, V., Gohl, P., Siebendritt, R., Jaenicke, R., and Rudolph, R. (1990). Limited proteolysis of gamma II-crystallin from calf eye lens. Physicochemical studies on the N-terminal domain and the intact two-domain protein. Eur J Biochem 194, 603-609.
【非特許文献１２】Jaenicke, R. (1994). Eye-lens proteins: structure, superstructure, stability, genetics. Naturwissenschaften 81, 423-429.
【非特許文献１３】Ling, M. M. (2003). Large antibody display libraries for isolation of high-affinity antibodies. Comb Chem High Throughput Screen 6, 421-432.
【非特許文献１４】Vijay-Kumar, S., Bugg, C. E., and Cook, W. J. (1987). Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution. J Mol Biol 194, 531-544.
【非特許文献１５】Butt, T. R., Jonnalagadda, S., Monia, B. P., Sternberg, E. J., Marsh, J. A., Stadel, J. M., Ecker, D. J. and Crooke, S. T. (1989) Ubiquitin fusion augments the yield of cloned gene products in Escherichia coli. PNAS 86, 2540-2544.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチドと機能性成分との複合体であって、それぞれのポリペプチド分子が、野性型ポリペプチドと比較して変化したリガンドに対する特異的結合のための結合特性を有し、互いに結合した後、前記複合体の両成分が、維持されたそれらの機能、または、このようなカップリングにより増強されたそれらの機能を有する。
【００１７】
本発明の他の目的は、このような複合体が、同定され、調製され、および、その機能特性を試験できることによる方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的は、独立項の主題により達成される。好ましい実施形態は、従属項に見られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、例えば、タンパク質（発色団タンパク質（色素タンパク質）および酵素）、マトリクス（例えば、デキストラン、ポリメタクリル酸、アガロース、セファロース、ポリスチレン誘導体およびセルロース）および小分子（例えば、蛍光標識、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位元素および抗生物質）のような様々な分子に対する、γ−クリスタリンおよびユビキチンに基づく新規結合タンパク質の部位特異的および選択的な非方向性（ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）のカップリングに関する。これらのいわゆるＡｆｆｉｌｉｎ（商標）分子は、タンパク質のβシート構造における結合領域の新たな設計により特徴づけられる。このように、これらは、自然界において結合性タンパク質のもっとも著名な種類である抗体とは異なる。抗体の場合、結合領域は、タンパク質の可動性ループ領域（ＣＤＲ’ｓ）に局在する。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）と抗体との間における他の相違は、分子のサイズである。本発明の複合体の第１成分の基礎として使用される２つのポリペプチドは、それぞれ、分子量２０ｋＤａ（γ−クリスタリン）および分子量１０ｋＤａ（ユビキチン）である。一方、抗体は、１５０ｋＤａ（ＩｇＧ）の分子量である。
【００２０】
本発明は、これらのポリペプチドおよびそれぞれの結合パートナーからの複合体の調製方法、および、異なる応用におけるそれらの使用も含んでいる。また、驚いたことに、これらのカップリング手法は、前記カップリングパートナーの生物学的活性の損失だけでなく、リガンドに対するポリペプチドの結合特性の損失も起こらないという結果を示す。
【００２１】
本発明の具体例として、ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおけるデキストランマトリクス、蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６、色素タンパク質フィコエリスリン（ＰＥ）および西洋わさびペルオキシダーゼ酵素に対する前記ポリペプチド成分のカップリング、ならびに、アフィニティークロマトグラフィーに使用するための支持基材に対するポリペプチドの固定が、記載されている。本発明によれば、前記カップリングは、前記ポリペプチド、例えば、タンパク質の求核性側鎖に対して直接的に、または、Ｃ末端ペプチドリンカーに対するターゲット法により行われた。驚くことに、前記カップリング法は、両方の足場タンパク質に適応でき、これらの分子の結合特性の機能障害を起こさなかった。前記相対的に小さなポリペプチド分子（それぞれ、１０および２０ｋＤａ）が、それらの結合活性を維持したまま、大きなタンパク質、例えば、フィコエリスリン（２４０ｋＤａ）に対して、結合されたことは、特に期待されていなかった。
【００２２】
驚いたことに、この方法において得られた複合体は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）分子の結合能力を制限せず、対照的に、巨視解離定数（アビディティー効果）の増加が、ポリペプチド分子の他の利用可能性（例えば、治療）を与える、ある複合体で確認された。さらに、これらのポリペプチド分子は、水に不溶性のマトリクスにカップリングした後でも、結合活性を示し、尿素、グアニジウム、エタノール、水酸化ナトリウムまたは塩酸のような変性試薬で処置した後に、再生、例えば、前記結合特性が回復されることがわかった。
【００２３】
γ−クリスタリンおよびユビキチンに基づく分子の構造データの詳細な分析は、リジン残基の特別なターゲティングにより、非特異的なカップリング選択を与える可能性を提供した。構造分析は、γ−クリスタリンにおいて、リジンがタンパク質のＣ末端ドメインに存在することを示しており、このため、カップリングに適している（図１）。ユビキチンにおいても、このようなリジン残基の同定は可能であった。しかしながら、これらのカップリングストラテジーを実行する前に、結合領域に別のリジンがないことを、確認しなければならない。
【００２４】
本発明のために、ＩｇＧ Ｆｃ（ヒト由来）またはｐｒｏＮＧＦに対して特異的に結合するポリペプチドが、ヒトγ−クリスタリンライブラリ（ＣＲ２０）から選択され、ＮＧＦ−結合ポリペプチドは、ヒトユビキチンライブラリ（ＵＢ１０）から選択され、これらは続いて精製された。システインを含む規定の長さの特異的なＣ末端ペプチドリンカーの導入により、結合活性の機能障害なしに選択的なカップリングが得られる方法で、ペプチド分子の修飾が可能であった。効果的なカップリングのため、全ての残存する露出システインを除去する必要がある。ポリペプチド分子の非特異的なカップリング方法により、驚いたことに、前記ポリペプチドの結合活性を維持することが可能であり、さらに、アビディティー手段により親和性の向上が達成でき、そのため、診断および治療のための非常に魅力的なポリペプチドベースの分子複合体を調製することが可能となった。
【００２５】
このような代替結合分子は、治療、診断およびクロマトグラフィーにおける多くの使用を見出す。様々なパートナーに対するポリペプチドのカップリングにより、使用の幅広い分野が、これらの新しい結合分子のために提供されるであろう。
【００２６】
本発明は、特に下記の側面と実施形態を含む。第１の側面によれば、本発明は、下記の成分を含む複合体に関する。
ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づく１以上のポリペプチド（Ｉ）であって、対応する野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させた、リガンドに特異的に結合するための結合特性をそれぞれ有するポリペプチドと、
それに共有結合的に結合される１以上の機能性成分（II）とを含み、
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリング後、全ての成分の機能性が維持されている、複合体。
【００２７】
言い換えれば、本発明の複合体は、ユビキチンまたはγ−クリスタリンを野生型の形態では含まないが、特異的なリガンドに適応した形態でのみ含む。この特異的に適応した形態は、野生型の形態と比較して、変化させた（向上させた）または新たに発生させた、各リガンドに対する結合特性を提供する。γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチドの共通の原理として、両方において、関心のあるリガンドに対する特異的な結合を可能にするため、βシート構造上に人工的な結合表面を発生させることが指摘されるだろう。そこで、人工的な結合表面を提供するための少なくとも１つのβシート構造の存在は、本発明の必須の特徴である。
【００２８】
この状況において、複合体とは、翻訳後の、他の成分へのポリペプチド分子の共有結合を意味し、このため、例えば、遺伝子レベルにおけるポリペプチドの融合とは異なる。融合ポリペプチドは、いわゆる融合の結果である。
【００２９】
本発明によれば、ユビキチンに基づく前記ポリペプチド分子は、ユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質、ならびに、それらの断片または融合タンパク質からなる群から選択されることが好ましい。前記断片または融合タンパク質は、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖および任意に非βシート領域を含むタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域における１以上のアミノ酸修飾による、ユビキチン様折りたたみモチーフを有する。前記タンパク質は、それぞれ、所定の結合パートナーまたはリガンドに対する結合親和性を有しており、前記結合親和性は、ユビキチン様折りたたみモチーフが保持されなければ、存在しない。
【００３０】
従って、本発明は、それぞれユビキチン様折りたたみモチーフを有する、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質、および、それらの断片または融合タンパク質からなる群から選択されたものが、置換、挿入、欠損、化学的修飾または結合により修飾されたタンパク質を含む。この修飾によって前記タンパク質は、以下の方法により得られる前には存在しなかった、所望の結合パートナーに関する結合親和性を示す：
ａ）修飾されたタンパク質の選択
ｂ）結合パートナーの決定
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖および任意に非βシート領域を含むタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の選択
ｄ）ユビキチン様折りたたみモチーフが保持される間、置換、挿入、欠損および／または化学的な修飾により、選択されたアミノ酸の修飾
ｅ）工程ｂ）において決定された結合パートナーへの前記修飾タンパク質の接触
ｆ）工程ｂ）において決定された結合パートナーへの結合親和性を有するタンパク質の検出
【００３１】
さらに、前述のユビキチンに基づく修飾タンパク質の製造およびこれらの修飾タンパク質の使用のための各方法が、記載されている。
【００３２】
従って、本発明の複合体において、使用されるユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）は、本出願において言及されるユビキチン様折りたたみモチーフをそれぞれ有するタンパク質またはポリペプチドの修飾により調製されることが好ましい。これらは、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有する全てのタンパク質、ならびに、ユビキチン様モチーフを有していることを条件に、これらのタンパク質の断片または融合タンパク質を含む。これらの各タンパク質またはポリペプチドを基準として、本来のタンパク質またはポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸が修飾される。特に、前記修飾は、アミノ酸の置換だけでなく、少なくとも１つ以上のアミノ酸の挿入および欠損、ならびに、アミノ酸の化学的な修飾を含んでいる。これらの修飾は、タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域において、修飾されることで行われる。少なくとも１つのアミノ酸の修飾は、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖を含む。前記βシート鎖は、前記結合パートナーまたはリガンドのそれぞれに接近（露出）するために、前記タンパク質の表面に局在しなければならず、決定され得る親和性により、前記修飾タンパク質に結合することが可能である。本発明の別の実施形態において、βシート領域のβシート鎖における前記変異に加えて、非βシート領域もまた、修飾される。好ましくは、影響を与えるため、特に、予定された結合パートナーに対する結合親和性を増加させ、これにより特異性を増強させるために、表面が露出されていることが好ましい。
【００３３】
１つ以上のアミノ酸の修飾のため、本来公知の様々な技術が、当業者に利用可能である。これらは、下記において、より詳細に述べられるであろう。加えて、Ａｕｓｕｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９の刊行物を参照にすることが可能である。
【００３４】
前記ユビキチンの非表面露出のコア領域のアミノ酸の修飾は、既に公知である（Ｆｉｎｕｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ここでの変異は、溶媒や可能性のある結合パートナーに接近することができないため、疎水性コア内の局在に起因して、結合に関与しない部位を対象とする。
【００３５】
“前には存在しなかった結合特性”、“新規に産出された人工的な結合部位”および“野生型タンパク質と比較して変化させたリガンドへの特異的な結合のための結合特性”という用語の意味は、それぞれ、本発明の文脈において、下記のように説明できる。これらの用語は、修飾された領域における修飾タンパク質が、予定された結合パートナーまたは前記ユビキチンの本来の結合パートナーに対する結合特性をこれまで示していないことを意味すると解される。
【００３６】
リガンドとして定義できる前記結合パートナーは、本発明における前記修飾タンパク質に対する測定可能な親和性を有する。本発明によれば、形成された複合体の解離定数ＫＤ＝１０−５Ｍ以下は、定量化できる結合特性の存在、すなわち、パートナーが結合される親和性の存在のための最小値として見なすことができる。応用に依存して、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍの値が好ましく、より好ましくは、例えば、クロマトグラフィーへの応用には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍの値、または例えば、診断もしくは治療への応用には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍの値である。さらに好ましい結合親和性は、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲、好ましくは、１０−１１Ｍまでである。前記結合親和性の決定方法は、本来公知であり、以下においてさらに述べられる。
【００３７】
本発明における修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠損または化学的な修飾を意味することを意図している。
【００３８】
本発明における修飾されたタンパク質として、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質が使用できる。本発明によれば、このスーパーファミリーは、Ｍｕｒｚｉｎら（１９９５）においてリストアップされたサブグループを含む。これらは、例えば、前記“ユビキチン関連タンパク質”、“ＵＢＸドメイン”、“ＧＡＢＡＲＡＰ様”、“ＲＡＳ−結合ドメイン”等のタンパク質ファミリーを含んでいる。好ましくは、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーのタンパク質が使用される。本発明によれば、それらのタンパク質は、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質からなる。これらの例は、ＳＵＭＯ−１、ＦＡＵ、ＮＥＤＤ−８、ＵＢＬ−１およびＧＤＸならびにＲｕｂ１、ＡＰＧ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＨＵＢ１、エロンギンＢ、ＰＬＩＣ２（Ｎ−末端ドメイン）、ヒトのパーキン（Ｎ−末端ドメイン）である。
【００３９】
本発明において、ユビキチン様タンパク質のスーパーファミリーから使用できるタンパク質は、高い範囲に特徴付けられる。参照の例でしかないが、下記のインターネットサイト、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｐ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｃｏｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに示されている。このサイトによれば、ユビキチン様タンパク質のファミリーは、前記ユビキチン関連タンパク質のファミリーが属するスーパーファミリーとして定義されている。このスーパーファミリーの全てのメンバーは、第１に、逆平行に配置しているβシートにより特徴付けられ、αおよびβセグメントに細分化される。その折りたたみは、β−Ｇｒａｓｐおよびユビキチン様として定義される。そのコア領域は、下記に定義されるβ（２）−α−β（２）であり、前記数字は、鎖の数を示し、鎖の全体がβシートを形成する。前記シートを左から右まで（底部のアミノ末端、頂部のカルボキシ末端）見ると、鎖の部位に関して、混合されたβシートは、２１４３通りもある。このように、ユビキチン様タンパク質のメンバーの特徴は、そのトップにおいて垂直に横たわってパックされているα−ヘリックスの背面上で、タンパク質の一表面に露出された逆平行βシートである。このユビキチン様折りたたみモチーフは、本発明において使用でき、また、修飾できるタンパク質の特徴であり、他のタンパク質からのファミリーメンバーを明確に区別できる。この定義の点において、ＰＬＩＣ―２のユビキチン様Ｎ末端ドメインおよび前記パーキンのユビキチン様ドメインは、本発明により含まれる。
【００４０】
当業者は、配列比較、いわゆる、アライメントを用いることによって、または、構造の重ね合わせ法により、前記タンパク質が、ユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるか否かを、予備的に判断できる。当然、最新の証拠は、たいてい、構造分析、例えば、Ｘ線結晶学または多次元的な核磁気共鳴分光法による構造分析によって提供される。近年、遺伝学的なアルゴリズムを用いる構造分析も、また、良好な予測を成し遂げてきている。
【００４１】
ユビキチンスーパーファミリーに関するさらなる情報が、例えば、Ｌａｒｓｅｎの２００２年の刊行物において見いだされる。加えて、Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌの２００１年の刊行物も参考になる。Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒは、β−β−α−β−β−α−β構成、すなわち、２１５３４配置における“混合シート”のフォームにおける５つのβ鎖の配置の２次構造を有するユビキチン様タンパク質の特性として、典型的なβ Ｇｒａｓｐフォールドを述べている。この点において、ＵＢＸが、例えば、ユビキチン（Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）の１次配列において、有意な相同性を有さないにも関わらず、三次元構造が、例えば、ユビキチンと同一であるために、前記ユビキチン様タンパク質に分類されると指摘された。この点において、ユビキチンにおける、４８番目および４９番目のアミノ酸は、時々、別々のβ鎖として考えられる（非特許文献１４）。この５番目の鎖は、前記ユビキチン構造において、前記へリックスの後方に局在し、前記２１５３４配置における“混合シート”を提供するであろう。しかし、２つのアミノ酸のみからなる構成が、実際のところ、２つのアミノ酸のこの鎖が、βシート鎖と呼び得るか否かは疑わしい。Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）によれば、上記で説明した通り、２１５３４の配置を有するタンパク質もまた、ユビキチン様タンパク質のスーパーファミリーに問題もなく分類され得た。本発明において、上記でより詳細に述べられた２１５４３の定義が、ユビキチンにおける前記β鎖の配置に選択された。
【００４２】
前述したファミリーおよびスーパーファミリーのタンパク質は、通常、高く保存されている。既知のデータによれば、前記ユビキチンは、例えば、全ての哺乳動物において、同一のアミノ酸配列を有している。酵母のユビキチンは、この配列と三つのアミノ酸が異なるのみである。ヒトのユビキチンまたは哺乳動物のユビキチンは、それぞれ７６個のアミノ酸からなり、最初に述べた構造を有している。
【００４３】
本発明において用いられる修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列において、修飾される元のタンパク質、例えば、前記ヒトユビキチンに対して、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０または５０％、さらに好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有しており、どのような場合でも、前記タンパク質は、上記で述べたユビキチン様折りたたみモチーフを有している。
【００４４】
本発明によれば、修飾タンパク質の調製のために選択される前記タンパク質は、好ましくは、ヒトのユビキチンまたは異なる起源のユビキチン、例えば、異なる哺乳類のユビキチンである。前記哺乳類のユビキチンとして、特に、哺乳類の分野における、げっ歯類、家畜および農業用の動物のユビキチンが、用いられる。本発明によれば、前記調製したタンパク質の使用分野は公知であり、すなわち、前記修飾タンパク質が、例えば、ヒトの疾病の治療のために薬学的な組成として用いられる場合、ヒトのタンパク質が、修飾される元のタンパク質として用いられることが好ましい。同様の方法において、これは他の分野にも使用される。
【００４５】
前記ヒトおよび哺乳類のユビキチンは、それぞれ、７６個のアミノ酸を有している。ＰＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）における１ＵＢＱの構造によれば、逆平行βシートの形成に寄与するβ鎖の４つのアミノ酸は、本発明によれば、下記のアミノ酸部位である。
【００４６】
第１の鎖（Ｎ末端）：２〜７番目；第２のβシート鎖：１２〜１６番目；第３の鎖：４１〜４５番目；第４の鎖（Ｃ末端）：６６〜７１番目。前記シートを頂点（底面のアミノ末端、頂点のカルボキシ末端）から、または左から右に見た場合、前記鎖の部位は、第２、第１、第４、第３番の鎖であり、第１と第４の鎖の間において、ポリペプチド鎖は、αへリックスを形成する。
【００４７】
修飾のための前記アミノ酸の選択および修飾
【００４８】
例えば、無料で使用できるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（商標）（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）のような、対応する構造データに基づき、側鎖が表面に露出された、すなわち、溶媒または可能性のある結合パートナーに配向した、開始タンパク質（例えば、ユビキチン足場タンパク質）におけるアミノ酸を、コンピュータ分析手法により局在化できる。さらに、おそらく、ランダム置換が足場タンパク質の安定性にネガティブな影響を与えない、または、わずかの影響である、開始タンパク質（例えば、ユビキチン等）におけるこれらのアミノ酸を、コンピュータ分析により同定できる。
【００４９】
この情報は、結合部位の要素として、各アミノ酸の適正に関する最初の指示を提供でき、それから、実際の試験を必要とする。本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、前記ヒトのユビキチンにおける２、４、６、６２、６３，６４，６５および６６番目のアミノ酸が、それらの表面への露出、および、それらのランダムな置換のための構造全体の耐性のために、選択された。
【００５０】
前述した部位は、第１のアミノ末端βシート鎖（２、４、６番目の部位）の開始部、および、前記ループ（６２、６３番目の部位）またはカルボキシ末端βシート鎖（６４、６５、６６番目の部位）の開始部において、それぞれ互いに空間的に近接して局在し、アミノ酸側鎖により、前記ユビキチンの表面における近接領域を形成する（図１）。分析された領域におけるランダムなアミノ酸置換（ランダム化）の方法により、抗体の高原結合部位と類似する形態で、ユビキチンの他の無処理の構造上の超可変領域の表面露出領域が産出される。
【００５１】
ＰｒｏＳＡIIソフトウェア（“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”；Ｐｒｏｃｅｒｙｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ザルツブルグ）を用いることで、例えば、ユビキチン（ＷＴ）と比較したタンパク質安定性が、１０４通りの変異について、また、“コントロールエピトープ”の残基（ランダム化部位２４、２８、３１、３２、３５、３７、３８、３９）が置換されたランダムに得られた同数の変異体サンプルについて、決定された。この場合、結合部位の領域においてランダムに置換された、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで産生された変異体の約１９％は、少なくともユビキチン（ＷＴ）の安定性と同じ程度の安定性を有している。一方、約９０％は、“コントロールエピトープ”の安定性よりも安定である（図２）。このコンピュータに基づく結果は、適切なアミノ酸の選択のための基礎として用いられ得る。
【００５２】
前記ヒトのユビキチンの利用可能な構造データをはじめとして、産出される結合部位の領域における８つのアミノ酸部位は、最初に選択されることが好ましい。この領域における１次配列のランダム変異（ランダム変異誘発）の方法、および、後の特異的な選択により、それらの変異が得られた。これらは、予定されたハプテンもしくは抗原、または、一般的に予定された結合パートナーの、それぞれに対する所望の結合活性を示した。この方法において、新規の結合特性は、結果として修飾されたタンパク質により与えられるが、その構造およびタンパク質の化学的な特性は、元のタンパク質と高い度合いで同一のままである。そのため、例えば、小型、高い安定性、コスト効率の調整、ならびに、前述のリガンドに対する高い親和性と特異性による互いの容易な修飾というような利点を発揮する。この観点において、人工的な結合タンパク質の産出のための足場構造としてのユビキチンの安定性は、１）ユビキチンが小型なために、多数のアミノ酸置換についての足場の耐久性は、予期できず、また、２）硬く、柔軟性がないと考えられるβシートを含む人工的な結合部位の機能性は、あらかじめ可能とは考えられなかったため、予期されなかった。
【００５３】
代わって、本発明によれば、γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子が用いられる。
【００５４】
初めに述べたように、脊椎動物のクリスタリンの１分類であるγ−クリスタリンは、約２２ｋＤａの分子量を有する単量体タンパク質である。γ−クリスタリンの主要な構造的なモチーフは、逆平行のβシートである（Ｈａｚｅｓ ａｎｄ Ｈｏｌ，１９９２，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｅｍｍｉｎｇｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。γ−クリスタリンは、２つの非常によく似た球状ドメインからなり、一方のＮ末端ドメインと他方のＣ末端ドメインとが互いにＶ型リンカーペプチドによって結合している。γ−クリスタリンの折りたたみパターン特性は（“グリークキー”モチーフ、Ｓｌｉｎｇｓｂｙ，１９８５，特許文献２）は、おそらく、十分な熱安定性、および、変性試薬に対する安定性（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）の理由である。
【００５５】
通常の折りたたまれた状態において、γ−II−クリスタリンは、どのような結合特性も示さない。βシート構造モチーフからなるこのタンパク質の、選択された溶媒に曝される領域の変異（変異誘発）は、驚いたことに、前記タンパク質の表面構造の変化および電荷（ｃｈａｒｇｅ）パターンの変化をもたらし、このため、新しい結合特性を発生する。この場合、タンパク質の構造の維持には実質的には寄与しない領域またはアミノ酸部位のみが選択される。小型βシートタンパク質の変異誘発（Ｒｉｄｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、後の配列変異にかかわらず、タンパク質の高いパーセンテージが、βシートの元の構造を形成し得ることを示している。
【００５６】
ここで述べた方法において、標的変異誘発は、βシートの硬い領域においてどのような結合特性も欠損しているタンパク質について行われる。このように、抗体分子と比較可能な、十分な安定性および特異的な結合特性を持つタンパク質が産出されている。
【００５７】
前記ファージディスプレイシステムは、新しく産出された結合特性を有する変異誘発されたβシートタンパク質の単離に適したシステムとして働く。前記システムは、特異的な結合特性のためのタンパク質変異体の幅広いレパートリーを、非常に効果的にスクリーニングすることが可能である（Ｓｍｉｔｈ，１９８５）。この目的のために、各タンパク質変異体は、繊維状ファージの表面上に準備され、固相に固定された標的分子に作用できる。前記標的分子に結合するタンパク質は、前記ファージの溶出により得られる。ファージＤＮＡの単離後、特異的に結合するタンパク質変異体のＤＮＡ配列を決定できる。前記ファージディスプレイシステムの他に、例えば、細菌ディスプレイ（Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のような他の選択システムを用いても良い。
【００５８】
前述の工程の方法により、驚いたことに、非結合タンパク質を特異的な結合特性を有するタンパク質に変異させるという方法で、例えば、βシートにおける標的部位特異的な変異誘発法により、非常に安定なβシートタンパク質γ−II−クリスタリンの変異が可能である。このように、８つのアミノ酸部位のランダム化により、最初に、タンパク質の相対的に硬い領域内で、足場分子に変異誘発が行われる。従って、特異的な結合特性に関して“抗体様”タンパク質種は、βシートタンパク質であるγ−II−クリスタリンから調製される。一般的に、γ−II−クリスタリン、または、他の小型で安定なβシートタンパク質は、新しい結合特性を設計するための新しい足場分子として、述べたられた方法とともに使用できる。モデル化された前記βシートタンパク質は、例えば、別の応用において、組換え抗体の代替となりうる。
【００５９】
この点において、他のより詳細な情報は、それら全体における参照により本明細書中に取り込まれる国際公開ＷＯ０１／０４１４４号パンフレットにおいて確認できる。
【００６０】
ここで定義される“リガンド”という用語は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチド分子により、特異的に結合される物質に言及される。
【００６１】
この結合パートナー、いわゆる、リガンドとしては、生化学的、生物工学的、診断的および治療的に関係する分子全てが用いられる。可能性のあるリガンドのリストは、ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、ウイルスタンパク質、および、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４のような細胞表層マーカー）、ペプチド（例えば、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグのようなアフィニティタグ、および、ウイルス由来のペプチド）、低分子量物質（例えば、ステロイド、コレステロールおよびハロゲン化炭化水素のような有毒物質）、脂質（例えば、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質）、糖（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｙのような細胞表層マーカー）、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、有機および無機ポリマー、ならびに、これらの物質の誘導体を含んでいる。この点において、下記で述べた好ましい実施形態を参照する。
【００６２】
ここで用いられる“機能性成分”という用語は、前記γ−クリスタリンまたは前記ユビキチンに基づいたポリペプチド分子に共有結合的に結合する複合体の第２の成分と定義する。“機能性”という用語は、診断、治療、クロマトグラフィーおよび分析における使用に適した成分、あるいは、すでに知られている成分を意味すると解される。一般的に、“機能性成分”は、例えば、酵素活性、分光学的に測定可能な特性または毒性等の測定可能な特性を有するあらゆる成分として定義される。それとは別に、本複合体における機能性成分の構造および機能は、制限されない。唯一必要なのは、前記ポリペプチド分子と前記機能性成分との共有結合後、全ての成分の機能性が維持されていることである。前記ポリペプチド分子の場合、この機能性は、特異的なリガンドへの結合能力であり、前記機能性成分の場合、例えば、染料としてのその効果である。
【００６３】
本発明によれば、１以上、例えば、２つの機能性成分がポリペプチド分子に結合することができる（上記で規定）。前記ポリペプチド分子に対して前記成分が特異的な結合を達成するために、例えば、成分の一方は、リジン残基に対して特異的に結合するように形成され、他方は、前記ポリペプチド分子におけるシステイン残基に対して特異的に結合するように形成される。このタイプの２つの成分の例は、蛍光染料であり、一方が、蛍光供与体として働き、もう一方が、蛍光受容体として働く。
【００６４】
前記成分の結合特性、および、好ましく用いられる前記結合成分の詳細は、以下に述べられている。
【００６５】
リガンドに対するポリペプチド分子の結合活性、および、カップリングパートナー（機能性成分）の活性の検出は、上記で述べた通り、重要な特徴である。リガンドへに対する結合活性の検出は、異なる方法によって行うこともできる。ＥＬＩＳＡ技術において、結合は、抗体−ペルオキシダーゼ複合体の手段により検出されるのに対して、前記Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、検出のために、表面プラズモン共鳴現象を利用する。蛍光滴定、蛍光偏光法または蛍光相関分光法（ＦＣＳ）のような他の技術は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）のフルオロフォアの特性に基づいている。カップリングパートナー、いわゆる、機能性成分の活性の検出のために、それらの公知の特性は重要である。このように、蛍光染料もしくはフィコエリスリンのような発色団またはフルオロファア分子は、それらのスペクトル特性の手段により分析される。ペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼのような酵素は、モデル物質のターンオーバーにより検査される。毒素のような他の分子は、細胞培養実験において、直接的に生物学的活性を試験できる。放射性同位元素の場合、その放射能は、適切なカウンターを用いて測定できる。糖および核酸のような様々な他の分子のために、商用的に利用可能な検出試薬がある。
【００６６】
一実施形態において、上述の通り、野生型ポリペプチドと比較して、新しく産出されたまたは変化させた結合特性は、前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域における１つ以上のアミノ酸置換に基づく。この目的のために、前記ポリペプチド分子（Ｉ）当たり約６〜１０、好ましくは８つのアミノ酸が置換される。このことは、ユビキチンおよびγ−クリスタリンに基づく前記ポリペプチド分子（Ｉ）に等しく適用する。
【００６７】
前記（Ｉ）の（II）へのカップリングは、リガンドに対する特異的な結合を対象とするポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域の外側領域において、行われることが好ましいことを指摘できる。このように、本発明の複合体に対する重要な必要性が、すなわち、全成分の機能の維持が達成されることがわかる。
【００６８】
ここでは、リガンドに対する結合表面の外側、より正確には、ｄｅｎリガンドへの結合に関与するβシートの外側に局在するユビキチンの２９、３３番目のリジン（２９、３３番目のリジンは、αへリックスに局在する）へのカップリングを一例として示す。リガンドに対する結合部位から離れて位置する、このアミノ酸残基側鎖を介するカップリングは、複合体の成分の機能的障害を導かない。
【００６９】
この点において、特に、リガンドに対する特異的なカップリングのための新しく産出された、または、変化された結合特性を有する前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの外側領域において、前記（Ｉ）の（II）への結合が行われることが好ましい。前述の場合、この領域は、例えば、ユビキチン分子のαへリックスであり、または、γ−クリスタリンに関して、βシートの他（すなわち、前記βシートは、リガンドへの結合に関与しない）である。特に、クリスタリンのＮ末端ドメイン（βシート）は、リガンドに対する新たに産出された結合表面を有していることが、図１から明らかであり、リジン残基は、Ｃ末端部位（ハイライト）は、機能性成分（II）とのカップリングに適している。
【００７０】
一実施形態によれば、前記（Ｉ）の（II）に対するカップリングまたは連結は、それぞれ、（Ｉ）のアミン酸残基を介して生じる。言い換えれば、前記カップリングは、前記ポリペプチド分子（Ｉ）自体に存在するアミノ酸残基を介してなし遂げられる。
【００７１】
この場合、前記カップリングは、前記（Ｉ）のシステインまたはリジン残基鎖を介して、部位特異的または選択的に非配向性（非方向性）の方法で、行われる。ここで、“部位特異的に”という用語は、正確に規定された部位を定義するために、前記分子（Ｉ）における的確に規定された部位に、システインまたはリジンが存在または導入されることを意味する。“選択的に、非配向性（非方向性）の方法”とは、このような残基が数個存在し、選択的に起こるけれども、これらの残基に結合する数が、あるランダムファクターに支配されていることを意味する。
【００７２】
本発明の複合体の２つの成分のカップリング、すなわち、それらの共有結合に関して、下記の説明が与えられる。
【００７３】
タンパク質は、多数の官能基を含んでおり、それにより、他の分子へのカップリングが達成できる。これらの明確な例示は、下記で述べる。例えば、適切な架橋結合試薬を介したパートナーとの共有結合により、１つの分子において、異なる活性を組み合わせることが可能である。一例として、抗体について述べる。前記抗体は、染料分子に結合し、このように、後に診断に使用できる、容易に検出可能な検出試薬の提供が見出されている。
【００７４】
類似の方法において、抗体は、他のタンパク質、好ましくは、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼのようないわゆるレポーター酵素と結合される。これらのレポーター酵素は、基質を変換し、それによって、吸光、蛍光または発光により検出されるシグナルを得ることができる。
【００７５】
適切な架橋結合試薬の選択により、タンパク質、すなわち、本発明のポリペプチド分子を、多くの他の基質クラス由来の他の機能性成分に結合させることができる。有機および無機ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖ならびに低分子量物質の多数もまた、この目的のために使用できる。前記ポリマーの分類からの好ましいカップリングパートナーは、例えば、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリスチレン、ポリビニル、シリカゲル、セルロースまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。後者の修飾は、例えば、生物学的治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の薬物動態学的特性の調節のために用いられる。適切かつカップリングのための予め活性化された官能基を有するＰＥＧ誘導体の多くは、商用的に入手できる（ネクタール Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）。先で述べた前記他のポリマー材料は、多くの生化学的、生物工学的および治療方法において、キャリア物質として働く。特に、ここでは、例えば、クロマトグラフィーへの応用、特に、親和性クロマトグラフィーについて述べる。これらのポリマー物質は、ゲルマトリクスとして用いられる。この目的のために、適切な化学基を有するポリマービーズの表面は、機能化され、例えば、所望の活性でタンパク質のカップリングが可能となるように活性化されている。この方法において、特定のリガンドに対する特異性を有する結合タンパク質もまた、固定される。その結果、ゲルマトリクスは、複雑な基質混合物からのリガンドを有効かつ迅速に濃縮するために使用できる。この濃縮は、カラムクロマトグラフィーまたはフィルター表面によっても行うことができる。さらに、磁力特性を有し、混合物から効率的に分離できるポリマービーズ（磁力ビーズ）も、親和性向上のために、有利に用いられる。
【００７６】
重要な一例は、マトリクス結合タンパク質Ａ（抗体分子に対して固有親和性を有する細菌タンパク質）に対するアフィニティークロマトグラフィーにより、真核細胞の上清から、治療目的のために抗体をラージスケールで精製する例である。
【００７７】
前述の抗体−レポーター酵素融合体の他に、２つのタンパク質成分のカップリングの例は、多数ある。従って、最も簡単なケースの一例として、ホモ２量体またはホモ多量体が、２以上の同一タンパク質分子のカップリングにより産出できる。
【００７８】
前記結合タンパク質の場合、アビディティー効果は、多量化により達成できる。すなわち、標的物質に対する多量体の親和性は、単量体の結合タンパク質の親和性と比較して、著しく増加する。また一方、異なる標的物質に対する特異性を有する２つの結合タンパク質のカップリングにより、例えば、互いに空間的に近接で、各ターゲット物質を運ぶアダプターとして使用できる、いわゆる２特異性結合分子が得られる。
【００７９】
生細胞に対して毒性を有するタンパク質、いわゆる、毒素（例えば、ヒマ毒、コレラ毒素、シュードモナス属の菌体外毒素等）もまた、抗体または他の結合分子に対する興味深いカップリングパートナーになる。カップリングに続いて、この２機能複合体は、例えば、ガン細胞の表面において、前記結合タンパク質を介して、特異的なターゲット物質と選択的に結合でき、その後、ターゲット細胞は、細胞毒活性により破壊される。
【００８０】
タンパク質の性質に関連する他のカップリングパートナーは、例えば、ＧＦＰおよびその誘導体のようなタンパク質発色団、または、フィコエリスリンのような色素含有タンパク質である。十分に検出可能なレポーター物質があると、結果的に得られる発色団または蛍光カップリング産物自体が、研究または診断の有用なツールとなる。
【００８１】
一方、既に前述したが、色素または蛍光タンパク質複合体もまた、低分子量染料分子のカップリングにより入手できる。架橋結合基を有する適切な染料分子の多くは、商用的に、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。診断および治療で使用するための、タンパク質複合体を得る他の低分子量カップリングパートナーは、例えば、ビオチン、ジゴキシジニン、重金属誘導体、キレート試薬、放射性同位元素、細胞毒物質または抗生物質である。
【００８２】
本発明において、タンパク質およびポリペプチド分子、ならびに、主にカップリングに適した機能性成分に含まれる官能基は、アミノ基、カルボキシ基、水酸基およびスルフヒドリル基である。また、チロシンのフェノール基も官能基であり、芳香環系は、カップリング試薬の攻撃のための部位として働き得る。カップリングに適したアミノ酸残基は、特異的な性質により特徴付けられる。一方では、前記カップリング試薬に露出可能な反応性側鎖を有する必要がある。理想的なケースでは、この官能基は、タンパク質表面に局在し、溶媒に曝される。さらに、この残基の修飾は、タンパク質の機能を妨げない。好ましくは、本発明において、修飾される残基は、酵素の活性部位またはポリペプチドの結合表面から著しく離れている。さらに、これらの領域は、同型のアミノ酸残基の空隙でもあり、修飾されるとタンパク質の機能を損ない得る。従って、利点は、それぞれのタンパク質のまれなアミノ酸残基でもある。
【００８３】
前述のように、ユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）にとって、ユビキチン分子の２９番目および３３番目のリジン残基を介したカップリングが、好ましいと考えられる。より好ましくは、前記２９番目および３３番目の残基より、リガンドに対する結合表面にさらに短い距離で局在している１１番目および４８番目のリジン残基を介したカップリングが可能である。
【００８４】
前記γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）の場合、野生型ポリペプチドと比較して、新たに産出または変化されたリガンドに対する特異的な結合のための結合特性を有するペプチドドメインは、Ｎ末端ドメインであり、前記（II）対する（Ｉ）のカップリングは、Ｃ末端ドメインを介して行われる。これは、好ましくは、システインを含むＣ末端ペプチド融合の可能性に適用し、また、Ｃ末端ドメインに存在し、且つ、前記機能性成分に対するカップリングのために利用可能なリジンのようなアミノ酸側鎖にも適用できる。前記γ−クリスタリンの９１番目および１６３番目の残基が使用されることが好ましい（図１参照。）。
【００８５】
非タンパク質構成（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸の中で、まず、側鎖にε−アミノ基を有するリジン、および、スルフヒドリル機能を有するシステインについて指摘する。特に、これらの官能基は、反応性があるため、本発明において、機能性分子に対するポリペプチド分子の特異的なカップリングのためのパートナーとして非常に適している。このため、スルフヒドリル基のみと特異的に反応する試薬、ひいては、例えば、マレインイミド、ヨード酢酸、ヒドロキシメルクリ安息香酸、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬等の本発明において使用できる試薬が、文献に開示されている。さらに、他の例も、Ｖｏｅｔ＆Ｖｏｅｔ（１９９５）およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ＆Ｚｏｒｂａｓ（１９９８）のような各文献において記載されている。
【００８６】
例えば、酸無水物（本発明でも使用できる無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等）のようなリジン特異的側鎖試薬も、多数述べられている。それらの反応性に加えて、リジンは、カップリングのための他の有利な特性を有している。その側鎖は荷電しているため、ほとんどが、タンパク質の表面に局在している、すなわち、生物系において、溶媒（主に水）に露出することができる。この露出度も、前記カップリング試薬に必要であり、このため不可欠である。
【００８７】
タンパク質において、表面に露出した遊離システインは、相対的にまれであり、細胞外タンパク質において、これらのシステインのほとんどは、２量体の相互作用を安定化するジスルフィド結合に関与する。しかしながら、含まれるシステインが修飾を受け易い状態になるために、ジスルフィド結合は、還元によって切断され得る。本発明におけるポリペプチド分子が、カップリング試薬に露出可能なシステインを含まない場合、変異誘発により、適切な部位にこのような残基を導入することができる。この点において、カップリングに適した表面に露出されたアミノ酸部位の予測を促進することから、タンパク質の空間的構造の知見は、有利な知見である。また一方、数個のシステイン残基が、部位特異的カップリングを生じるタンパク質に存在する場合（定義されたシステイン残基、上記参照）、部位直接的変異誘発法により、これらを除去するのは不可能である。この場合、システイン残基と類似の性質を有するセリン残基による置換が、好ましい。
【００８８】
また、対象のタンパク質配列における変異誘発により、カップリングに適切なアミノ酸残基を得ることは、しばしば不可能である。タンパク質が、アミノ酸残基の挿入、または、カップリングに適したアミノ酸残基を含むＮ−末端もしくはＣ−末端のペプチド配列での融合を許容する場合、遺伝学的なレベルでこれらの部位に導入され得る。
【００８９】
従って、他の実施形態において、前記（II）に対する（Ｉ）のカップリングは、（Ｉ）に対する付加的な末端ペプチド融合におけるアミノ酸残基を介して行われる。
【００９０】
これらの末端ペプチド融合の露出度の試験は、例えば、発色特性を有する側鎖特異的なカップリング試薬、例えば、システイン用のＥｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬の使用により行うことができる（前記例示参照）。他にも、前記末端ペプチド融合の露出度は、それらの長さにより制御することができる。ペプチド融合の場合、例えば、結合用のアミノ酸側鎖とタンパク質との間へのいわゆるスペーサーの挿入により、結合用のアミノ酸側鎖の露出度の増加が可能である。ペプチド融合の場合、これらは、付加的で不活性なアミノ酸残基ある。サイズが小さく、非常に柔軟な構造であると想定できるため、特に、グリシンおよびセリン残基が適している。
【００９１】
カップリング試薬に対して露出可能であるタンパク質の官能基の数に依存して、カップリングの特異性が異なるタイプに区別できる。例えば、システイン特異的カップリング試薬を使用した場合、システイン残基のみが選択的に反応するが、例えば、数個のシステイン残基が存在する場合、カップリングの正確な部位は、決定できない。これは、選択的であるが、非配向性（非方向性；ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）のカップリングと呼ばれる。しかしながら、カップリング試薬に対して露出されるシステインが１つだけ存在する場合、カップリングは、部位特異的に生じる。
【００９２】
適切なカップリング試薬の多くは、商用的に入手できる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社）。本発明において、使用できるカップリング試薬の特異的な形態は、架橋剤または単にリンカーと呼ばれる（Ｈｅｒｒｍａｎｎ＆Ｍｏｒｓｅ，１９７３；Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９７５；Ｒｅｉｃｈｌｉｎ，１９８０）。
【００９３】
リンカーは、共有結合により２つ（またはそれ以上）の分子を結合する物質として定義される。リンカーは、２つ（またはそれ以上）の反応性（活性化された）官能基を含み、その空間的距離は、それらに結合する化学基によってさらに制御できる。異なる官能基を有するヘテロ−２官能性リンカーと対象的に、同一の官能基を有するリンカーは、ホモ−２官能性と呼ばれる。そのため、リンカー物質の適切な選択により、完全に異なる物質類を互いに結合することも可能である。
【００９４】
本発明において、使用できるリンカーの一例として、ＳＰＣ１−Ａ７＿ＣｙｓのＣ末端部位を参照できる（表２参照）。
【００９５】
しかしながら、例えば、タンパク質の二量化におけるジスルフィド結合の形成のような、タンパク質のカップリングの特異的なケースは、活性化されたリンカーを必要としない。酸化的条件下、スルフヒドリル残基は、ジスルフィドを形成するため、すなわち、２つの硫黄原子の間の共有結合のために、十分に高い反応性を有している。
【００９６】
本発明において、カップリング反応は、１工程反応として、または、複数工程においても、行うことができる。２つの同一分子の単なる二量体化の場合、それぞれが１つの反応性残基のみを有していれば、定義された複合体を得るためのホモ−２官能性リンカーを用いて、カップリング成分とインキュベートするだけで充分である。異なる反応基を有する異なるカップリングパートナーの場合も、前記１工程反応は、適したヘテロ−２官能性リンカーを用いてのみ可能である。
【００９７】
代わりに、同一の反応基を持つ異なる結合パートナー（反応体）の間でのカップリングもまた、複数工程において行うことができる。この目的のため、ほとんどの場合、まず、一方のカップリングパートナーのみを過剰なリンカーとインキュベートし、結果として得られた一価の反応体−リンカー複合体を単離し、その後に、リンカーの残存する遊離官能基を介して、第２の反応体に結合させる。生化学および生物工学において使用を見出された化学物質の多くは、いわゆる、活性化形態、すなわち、すでに反応性リンカーに結合した状態で、商用的に入手できる（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【００９８】
カップリングの度合い、すなわち、前記複合体における個々の成分の相対比は、２以上の反応基が存在する場合、使用する反応体の化学量論により、ある範囲に制御できる。異なるカップリングパートナーを有する定義された複数のカップリングは、逐次的なカップリングにより、または、異なるカップリング化学の使用により、例えば、機能性成分２が、各ポリペプチドのリジンに結合するのと同時に、第１の機能性成分がシステインにカップリングすることにより、可能である。典型的な例が、ＦＲＥＴ測定のための蛍光供与体／受容体対への結合である。この目的に適した染料分子の組合せは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。
【００９９】
本発明において、複合体をもたらす選択されたカップリングメカニズムには非依存的に、本複合体の機能性能力が予想されるものではなく、驚くべきものであったことを、改めて指摘する。従って、ここで説明されたことを参照することが可能である。
【０１００】
さらに、本発明において開示された複合体が産生でき、さらに、個々の成分の全機能が保持され、または、増強されることも、当業者にとって予想できなかったことであることを述べておく。
【０１０１】
本発明において、一方のポリペプチド分子と、他方の機能性成分との間におけるサイズ比は、非常に異なっている。例えば、フィコエリスリンに前記分子を結合させた場合、時々、前記ポリペプチド分子の１０〜２０倍になるが、蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）のように小さい場合もある。驚いたことに、特に、非常に大きな分子との結合において、前記ポリペプチド分子の構造およびリガンドへの結合親和性は、両方とも維持されている。このことは、この方法において、予期され得なかった。
【０１０２】
上述の説明のように、機能性成分に対するカップリングのための側鎖は、リガンドへの結合の機能性が損なわれないために、リガンドに対する（Ｉ）の結合表面の外側に局在されることが好ましい。
【０１０３】
別の好ましい実施形態によれば、前述のように、（Ｉ）に対する前記末端ペプチド融合は、１以上のシステイン残基または１以上のリジン残基を含んでおり、これらのアミノ酸残基は、リガンドとの（Ｉ）の相互作用に関与していないことが好ましい。
【０１０４】
前記機能性成分（II）は、ポリペプチドおよびタンパク質、有機および無機ポリマー、核酸、脂質、糖、低分子量物質、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択されることが好ましい。結合の原理およびカップリング試薬に関しては、上記の説明を参照。
【０１０５】
好ましい実施形態によれば、前記機能性成分（II）は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、好ましくは、発色タンパク質、酵素、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、毒素またはＩ由来のポリペプチドである。
【０１０６】
前記機能性成分（II）がポリマーの場合、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリビニル、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースもしくはポリエチレングリコール、または、ポリマー誘導体から選択されることが好ましい。
【０１０７】
前記機能性成分（II）が低分子量物質の場合、染料、ビオチン、ジゴキシジニン、重金属、キレート試薬、放射性同位元素、抗生物質または細胞毒物質であることが好ましい。
【０１０８】
好ましい実施形態によれば、成分（Ｉ）に特異的に結合するリガンドは、ポリペプチド、ペプチド、低分子量物質、脂質、糖、核酸、有機および無機ポリマー、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０９】
このリガンドがポリペプチドまたはタンパク質の場合、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、糖化タンパク質、ウイルスタンパク質ならびに細胞表層マーカー、好ましくは、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４が、用いられることが好ましい。
【０１１０】
前記リガンドがペプチドの場合、アフィニティタグ、好ましくは、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグもしくはＦＬＡＧ−タグ、または、ウイルス由来ペプチドであることが好ましい。
【０１１１】
前記リガンドは、低分子量物質、好ましくは、ステロイド、コレステロールおよび、例えば、ハロゲン化炭化水素のような有毒物質、または、脂質もしくは脂質誘導体、好ましくは、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質であっても良い。
【０１１２】
好ましい実施形態によれば、本発明の複合体の成分（II）は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチドであり、それと共有結合することにより、（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果によって達成される。詳細な説明は上記の記述を参照。
【０１１３】
さらに、前記成分（II）は、複数の方法において、（Ｉ）のリガンドへの前記親和性の向上が、アビディティー効果により達成されることにより、前記（Ｉ）が共有結合的に結合されるポリペプチド、タンパク質またはポリマーであることが好ましい。前記に代えて、成分（II）は、成分（Ｉ）に共有結合後に、（Ｉ）のリガンドへの前記親和性の向上が、アビディティー効果により達成されることにより、同型の別の複合体に共有結合的または非共有結合的な結合を受けるポリペプチドまたはポリマーである。
【０１１４】
好ましい実施形態によれば、成分（Ｉ）は、ＳＰＣ１−Ａ１（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：３）、ＳＰＵ１１−３−Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２および１３）、ＳＰＣ１−Ｇ３（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：４）、およびＳＰＣ７−Ｅ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の分子の１つである。
【０１１５】
しかしながら、本発明は、正確な核酸配列のみではなく、それらの変異体をも含む。本発明における“変異体”は、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．で規定された核酸と比較して、１以上の置換、挿入および／または欠損が存在する核酸のことを言う。これらの変異体において、少なくとも１つ、または、２、３、４つ以上のヌクレオチドが、核酸の片方の末端または両方の末端、または、核酸の内側の部分において、欠損し、または、別のヌクレオチドにより置換されることが好ましい。
【０１１６】
このように、本発明の前記核酸は、それぞれのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の核酸に実質的に対応する配列を有する核酸も含んでいる。本発明における前記核酸は、例えば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の核酸に対して、少なくとも約８０％、典型的に少なくとも約９０％または９５％の配列相同性を有してもよい。
【０１１７】
前記“核酸配列”という用語は、ヌクレオチドのヘテロポリマー、または、これらのヌクレオチドの配列に関する。ここで用いられる前記“核酸”という用語は、ＲＮＡと、ｃＤＮＡを含むＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成塩基（例えば、化学的合成）、ＰＮＡのように他のポリマーに結合した塩基も含んでいる。
【０１１８】
本発明は、適度にストリンジェントな条件において、本発明の前記核酸に対してハイブリダイズする変異体も含んでいる。
【０１１９】
一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、オリゴヌクレオチドと所望の標的分子との間における二本鎖分子（完全なハイブリッド）のみが形成される、または、所望の標的有機体のみが検出される、反応条件を参照する。特に、この観点におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６５℃で、０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）のことである。短い断片、例えば、２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドの場合、前記ハイブリダイゼーション温度は６５℃以下、例えば、５５℃より高く、好ましくは、６０℃より高い。どのような場合でも６５℃以下である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション温度は、ヌクレオチドのサイズまたは長さ、および、ヌクレオチドの組成のそれぞれに依存し、マニュアル化された実験により、当業者により決定できる。適度にストリンジェントな条件とは、例えば、４２℃、および、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することにより達成できる。
【０１２０】
前記それぞれの温度条件は、選択した実験的条件に依存して異なり、また、試験する核酸サンプルに依存する。この場合、適切に調節する必要がある。前記ハイブリダイゼーション産物の検出は、例えば、放射ラベルされた分子の場合、オートラジオグラフィーにより、または、蛍光標識された分子が使用された場合は、蛍光定量法により行われ得る。
【０１２１】
当業者は、実際に適度にストリンジェントな条件を達成し、特異的な検出方法が可能になる、それ自体公知の方法において、選択された実験方法に対する条件を適応できる。適度にストリンジェントな条件は、例えば、参考となるハイブリダイゼーションの方法により決定できる。適した核酸またはオリゴヌクレオチド濃度で使用する必要がある。前記ハイブリダイゼーションは、適した温度（より高い温度にすれば、ハイブリッドの結合は弱まる）で行う必要がある。
【０１２２】
第２の側面において、本発明は、既知の配列の成分（Ｉ）で開始される前述で定義した複合体の調製方法に関し、下記工程を含む。
タンパク質の空間構造の分析による、カップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外側のアミノ酸残基の同定；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【０１２３】
カップリングに適したアミノ酸残基が同定されていない既知配列の成分（Ｉ）から開始される本発明の複合体の調製のための改良された方法であり、下記工程を含む。
置換、挿入または融合によるカップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外側表面に曝されるアミノ酸残基の導入；
導入されたアミノ酸残基の露出度の検出；
この方法により変化させた成分（Ｉ）の機能性の検出；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【０１２４】
カップリング方法等のより詳細な説明は、上記を参照。
【０１２５】
第３の側面によれば、本発明は、前述の方法により調製される複合体を提供する。
【０１２６】
さらに、本発明は、上記で規定した複合体を含む診断キットを含む。
【０１２７】
本発明の他の側面は、本発明の複合体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学組成物である。
【０１２８】
前記薬学組成物において、複合体は、疾病の治療または少なくとも緩和のための投与において、適切なキャリアまたはキャリア物質と混合される。このタイプの組成は、（前記活性剤および前記キャリアに加えて、）賦形剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および、技術分野で周知の他の物質を含んでもよい。前記“薬学的に許容される”という用語は、活性成分または活性薬のそれぞれの生物学的活性の有効性を損なわない無毒な物質と規定する。前記キャリアの選択は、投与経路に依存する。
【０１２９】
前記薬学的組成物は、付加的に、前記活性剤の活性を強める、もしくは、活性を補う別の成分を含んでもよく、または、治療において、それらを用いても良い。このような付加的な要因および／または物質は、前記薬学的組成物に、相乗的な効果を達成するため、または、副作用もしくは有害作用のそれぞれを最小化するために含まれてもよい。
【０１３０】
本出願の複合体の形成、調製、および、投与のための技術は、それぞれ、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（最新版）において見出される。さらに、治療に効果的な量は、症状の改善、例えば、処置、治療、予防またはこのような状態の改善等を達成するのに十分な化合物量に関する。適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜または腸管投与ならびに筋肉内、皮下、髄内注射、および、くも膜下腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内もしくは鼻腔内注射を含む非経口投与を含む。中でも、患者への静脈内投与が、好ましい。
【０１３１】
他の側面によれば、本発明は、ここで規定した複合体の使用、診断、治療および親和性クロマトグラフィーにおけるキットまたは組成の使用に関する。
【０１３２】
カップリング方法が提示され、それに加えて、親和性クロマトグラフィーにおける複合体の使用を含む複合体の種々の応用を可能にするデータも得られた。この使用のための例は、アフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製および血漿タンパク質、成長因子またはインフルエンザワクチンの精製、ならびに、遺伝子工学により調製されたアフィニティータグを有するタンパク質の精製のため、ならびに、エンドトキシンおよびアルブミンのそれぞれの減少のための、プロテインＡの交換である。さらに、マトリクスに対するカップリングにより、血液血漿交換またはバイオレメデーションへの使用が考察できる。
【０１３３】
使用の他分野は、診断である。この点において、細菌またはウイルス感染のための血液バンクのスクリーニング、もしくは、ＥＬＩＳＡのような古典的な検出技術、または、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムのような新規技術開発においての使用が、考案できる。治療だけでなく診断において、このような複合体は細胞分離に使用可能である。
【０１３４】
治療において、本発明の複合体の使用が可能であり、特に、輸送分子として一般的に使用できる。治療における他の応用は、本発明のポリペプチド分子による方向性ターゲティングにおける遺伝子治療、遺伝子輸送の系のためのカップリングである。方向性のあるターゲティングや細菌毒性に対するカップリングにより、治療における免疫毒性としての使用が、良好に得られるであろう。
【０１３５】
下記において、本発明は、複数の図および付随の例示に関して説明されているが、これらの図および例示は、単に本発明を図示するだけであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３６】
ヒトγ−II−クリスタリンライブラリからの、ＩｇＧ ＦｃおよびｐｒｏＮＧＦに結合するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の選択、発現および精製
【０１３７】
ヒトγ−クリスタリンライブラリＣＲ２０から始まり、選択工程は、ファージディスプレイシステム法により行った。最初の１ラウンドで、単一ファージＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧ Ｆｃに対する特異的な結合を示す複数のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を選択および単離できた。ここで用いられる“Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）”という用語は、本発明の複合体におけるポリペプチド分子成分に相当し、ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づき、且つ、野生型と比較してリガンドに対する特異的な結合のための変化された結合特性を有する。ｐＥＴ２０ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）への遺伝子のクローニングに続き、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を組換え法により過剰発現させ、続いて、２種類のクロマトグラフィー工程（ＩＭＡＣおよびゲルろ過）により精製した。タンパク質濃度依存ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ検査で、ｎＭ範囲において解離定数を有するＩｇＧ Ｆｃに対する特異的な結合を決定できた。
【０１３８】
ＩｇＧ Ｆｃに結合するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を選択するため、１ｍＬのＣＲ２０ライブラリ（６．５×１０１０ｃｆｕ）を、１Ｌの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有）において、３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．４の吸光度に達するまで培養した。その後、前記細菌培養液に、感染用ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスルーエ、ドイツ）を１０倍量過剰量添加して、１時間、３７℃、１００ｒｐｍで培養した。それから、前記細菌の懸濁液を、２０分間、１０００×ｇで遠心し、そのペレットを、１Ｌの２×ＹＴ培地（８ｍＭ ＧＳＨ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有）に再度懸濁させた。
【０１３９】
ファージの産出またはファージの放出を、それぞれ、３０℃、２００ｒｐｍで一晩行った。前記ファージの単離には、Ｋａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ＆ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９６）に記載されたプロトコールを使用した。
【０１４０】
１ｍＬの単離ファージ（１．４×１０１４ｃｆｕ）を、１ｍＬの６％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を用いて、１時間、室温（ＲＴ）でブロッキングした。一方、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社）の１０ウェルを、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ中）モノクローナルＩｇＧ Ｆｃ（Ｒｏｃｈｅ社）溶液１００μＬを用いて、常温で一晩コートし、ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて３回洗浄した。その後、各ウェルにおける未結合部位を、３００μＬのＰＢＳ（３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて、２時間、常温でブロッキングした。続いて、ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて３回ウェルを洗浄した。ウェル当たりブロッキングされた前記ファージを１００μＬ添加した後、１時間、常温、２０ｒｐｍでインキュベートした。未結合または弱い結合のファージを、それぞれ、２×ＰＢＳを用いて２回、２×ＰＢＳ（３％ＢＳＡ含有）を用いて２回、最後に、２×ＰＢＳを用いて２回、洗浄することにより除去した。残った結合ファージを、ウェル当たり１００μＬの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、１０分間、室温でインキュベートすることにより溶出した。基本培地に溶出された前記ファージの中和ため、これに（計１ｍＬ）に５００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に添加した。引き続いて、前記ウェルをＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１４１】
トリエチルアミンを用いた溶出にもかかわらず、マイクロタイタープレートに強固に結合したファージを、再感染のために、直接、ＸＬ１−ｂｌｕｅの対数増殖期の細菌培養液（ＯＤ６００＝０．４）１００μＬを用いて、３０分間、３７℃でインキュベートした。基本培地中に溶出された前記ファージを用いたＸＬ１−ｂｌｕｅの再感染のために、７５０μＬの中和溶出液を、９ｍＬのＯＤ６００＝０．４のＸＬ１−ｂｌｕｅと共に、３０分間、３７℃でインキュベートした。その後、基本培地に溶出したファージに再感染した菌体と、強固にファージが結合した再感染菌体とを混合し、ＳＯＢＡＧ培地（アンピシリン含有）を含む１６×１６ｃｍのプレートに蒔き、３７℃で一晩培養した。パニング工程の後、約２０００のクローンが得られた。これらを、約１２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（２０％グリセロール含有）から採取し、−８０℃で保存した。
【０１４２】
単一のファージを培養するために、パニングの第１ラウンドで得られた細胞プールを、選択培地（ＳＯＢＡＧ）に蒔き、３７℃で一晩培養した。前記ＳＯＢＡＧプレートから、９２個の単一のクローンを、ウェル当たり２ｍＬの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）を含む２４×５ｍＬディープウェルプレートに移し、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。加えて、プレートあたり、ファージミドベクター内にヒト野生型γ−クリスタリン遺伝子を含む１つの単一のコロニー（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）を、コントロールとして用いた。ウェル当たり２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）を含む滅菌２４×５ｍＬディープウェルプレートを、それぞれ、一晩培養した培養液の種菌１％と共にインキュベートし、細菌培養液を３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が約０．４に達するまで培養した。その後、前記培養液を、ウェル当たり２．５μＬのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（１０１３ｃｆｕ／ｍＬ）を用いて感染させ、１時間、３７℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。それから、細菌を遠心によりペレット化し、上清を除き、前記ペレットを、ウェル当たり２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（８ｍＭグルタチオン、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）に再懸濁し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。ファージが含まれる上清を得るために、プレートの遠心を、４６００ｒｐｍで行った。前記ファージの沈殿およびペレット化を、Ｋａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ＆ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに記載の方法で行った。そして、前記ファージペレットを、約２００μＬのＰＢＳ（３％ＢＳＡ含有、ｐＨ７．４）に再懸濁した。この手順により、前記ファージを濃縮し、その後、ＥＬＩＳＡに用いた。
【０１４３】
この目的のために、ＮＵＮＣプレートのウェルを、１００μＬ抗原溶液（それぞれ、１０μｇ／ｍＬヒトのモノクローナルＩｇＧ ＦｃまたはＢＳＡ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて、２時間、室温でインベートした。洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて前記ウェルを洗浄した後、前記ブロッキングしたファージ調製液１００μＬを、それぞれ前記ウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて、前記ウェルを洗浄した後、モノクローナル抗Ｍ１３抗体（ＰＯＤ複合体；ＭｏＢｉＴｅｃ社、ゲーチンゲン）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４（１００μＬ／ウェル））で１：５０００に希釈して添加し、再度、１時間、室温でインキュベートした。その後、前記ウェルを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて３回、および、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ＴＭＢ Ｐｌｕｓ（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ社、デンマーク）を用いて呈色反応を開始した（１００μＬ／ウェル）。２０分後、前記呈色反応を、０．２Ｍ硫酸の添加により停止した。得られた黄色を４５０ｎｍ（参照波長：６２０ｎｍ）で測定し、記録した。
【０１４４】
モノクローナルＩｇＧ Ｆｃへの結合に関し、明らかなシグナルを示し、かつ、ＢＳＡに対する検出可能な結合をほとんど示さないファージ調製液から、γ−II−クリスタリン変異体遺伝子を、プライマーｐＣＡＮ７００を用いて配列決定した。結果として、その中から３つのクローンＳＰＣ１−Ａ１、ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ｇ３を、ｐＥＴ２０ｂ発現ベクター中に、ＮｃｏＩおよびＢｓｔＥIIの制限酵素部位を用いてサブクローニングし、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＵＢＳ５２０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。
【０１４５】
前記菌体を、２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）において、ＯＤ６００が０．６〜０．８の吸光度になるまで、３７℃、２００ｒｐｍで培養し、その後、組換えタンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）で誘導した。３０℃、２００ｒｐｍ、４時間の培養後、細胞を遠心（６０００×ｇ、２０分間、４℃）により回収した。細胞破砕を、ＮＰＩ−１０バッファー（Ｑｉａｇｅｎ社）中、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの存在下、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）法、および、超音波（６×１５秒、氷を用いた冷却下）により行った。遠心（４０，０００×ｇ、３０分間、４℃）後、上清をＩＭＡＣカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に添加し、ＮＰＩ−２０（Ｑｉａｇｅｎ社、＋５ｍＭ β−メルカプトエタノール）を用いて洗浄した（カラムの２０倍量）。溶出は、ＮＰＩ−５００（Ｑｉａｇｅｎ社、＋５ｍＭ β−メルカプトエタノール）を用いたリニアグラジエント（直線勾配）により行った（カラムの３０倍量）。γ−II−クリスタリンを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析し、各画分をプールし、ゲルろ過カラム（１．６×６０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に添加した。ＰＢＳを、流速０．７５ｍＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。ゲルろ過分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により行い、γ−II−クリスタリン含有画分を混合し、４℃で保存した。この精製工程の後、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、９５％以上の純度であった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【０１４６】
前記精製タンパク質の結合特性を、前述の濃度依存ＥＬＩＳＡにおいて、直ちに試験した。この目的のため、異なる濃度（１００ｎＭ〜１０μＭ）のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を用い、抗γ−II−クリスタリン抗体（ＰＯＤとのモノクローナル抗体複合体）を、検出抗体として用いた。試験した全３種類のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対する特異的結合を示し、ＢＳＡまたはマイクロタイタープレートへの非特異的な結合は、検出されないことがわかった。コントロールとして用いた前記ヒト野生型γ−II−クリスタリンは、ＩｇＧ Ｆｃ、ＢＳＡまたはマイクロタイタープレートに対する結合を示さなかった。
【０１４７】
ＢＩＡＣＯＲＥ試験において、前記３種類のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の解離定数を測定した。この目的のために、約１８０ＲＵのヒトＩｇＧ Ｆｃ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム中５０μｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）を、ＣＭ５チップに固定化した。未結合部位を、最終的に１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）により不活性化した。
【０１４８】
それから、流速３０μＬ／分で、６つの異なる濃度（１６６ｎＭ〜１μＭ）を、前記チップに１８０秒間通過させた。その後、前記チップを０．００５％界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を含むＨＢＳを用いて、同じ流速で１８０秒間洗浄した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて得られたセンサーグラムから、ＩｇＧ Ｆｃに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の解離定数を決定した（ＳＰＣ１−Ａ１：２３０ｎＭ、ＳＰＣ１−Ａ７：２８０ｎＭおよびＳＰＣ１−Ｇ３：８００ｎＭ）。競合実験において、ＩｇＧ Ｆｃに対する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の特異的結合は検出されたが、前記チップマトリックスに対する結合は検出されなかった（図２）。
【０１４９】
前記変異体ＳＰＣ１−Ａ１、ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ｇ３の選択と類似の方法により、標的分子ｐｒｏＮＧＦに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ７−Ｅ９を単離した。解離定数を、１〜６ｎＭの範囲で、ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｍｕｓｓｕｎｇｅｎ法により決定することができた（図３）。
【実施例２】
【０１５０】
ヒトユビキチンライブラリ（ＵＢ１０）からの、システインノットタンパク質に対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の選択、発現および精製
【０１５１】
新たに生じた結合親和性を有する修飾タンパク質の選択のための合成ユビキチン遺伝子の提供
【０１５２】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）のように当業者に公知の標準プロトコールによって、遺伝子工学の研究を行った。
【０１５３】
人工結合タンパク質の調製の開始点として、置換Ｉｌｅ４４Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｒｇ５４Ｌｅｕ、Ｖａｌ７０Ａｌａ、Ａｒｇ７２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ７５Ａｌａ、および、欠失Ｇｌｙ７６を有する修飾ユビキチン足場タンパク質のＤＮＡ配列（Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ：２）を調製するために、下記工程を行った。遺伝子合成のため、ＰＣＲ反応を５０μＬの容量で行った。これには、遺伝子の塩基対配列で表される６種類のオリゴデオキシヌクレオチド（それぞれ０．１μＭ ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２６、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２７、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２８、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２９、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：３０、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：３１）各２．５μＬを含み、合成される遺伝子が鋳型として存在する。使用した前記オリゴデオキシヌクレオチドの配列は、それぞれ、約１５塩基対によりそれらの３’末端および５’末端が交互にオーバーラップする４０〜５０塩基対の長さの人工遺伝子の、翻訳ＤＮＡ鎖ならびに非翻訳ＤＮＡ鎖の領域に相当する。さらに、前記試料は、２．５μＬの各フランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３２、ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３３；１０μＭ）、５μＬの１０×Ｔａｑバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、３μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２および４μＬのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む。水を充填した後、前記反応試料を、変性のために、サーモサイクラーにより、２分間、９４℃で加熱した。それから、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加熱中に添加（加熱開始）し、ＰＣＲプログラムを開始した。インキュベーションは、それぞれ、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間を、２５サイクル行った。最後のインキュベーションを、７２℃で５分間行った。
【０１５４】
所望のＰＣＲ産物を、分析アガロースゲル電気泳動法により同定し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑａｉｇｅｎ社）を用いて、前記試料から精製した。単離したＤＮＡ １．０ｎｇを２回目の増幅の鋳型として使用し、前記２回目の増幅を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、５０μＬの容量で行った。この目的のために、５μＬの提供１０×Ｐｆｕバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）および４μＬのｄＮＴＰ混合物を用い、水で充填した。さらに、前記試料は、適切な制限酵素部位の導入のためのフランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３２、ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３３；１０μＭ）を含む。所望のＰＣＲ産物を、調製アガロースゲル電気泳動法により単離し、クローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）に、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（商標）ＴＯＰＯ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、メーカーの説明書に従って挿入した。供給された化学的コンピテントセルを、対応する連結反応試料を用いて形質転換し、ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ培地のアガープレート上にまいた。前記プレートを、１６時間、３７℃で培養し、生育したコロニーについて、所望の連結産物の分析を行った。この目的のため、プラスミドＤＮＡを、Ｑａｉｇｅｎ社のプラスミド単離キットを用いて、メーカーの説明書に従って、ミニスケールで調製し、前記フランキングプライマー法により前記ＰＣＲ産物に導入された認識配列に対して、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた制限消化を行った。期待された切断パターンを示すプラスミドを用いて、Ｔａｑポリメラーゼにより挿入された遺伝子カセット領域内のＤＮＡ配列分析を行った。この目的のために、メーカーの説明書に従って、ＣｙｃｌｅＲｅａｄｅｒ（商標）ＡｕｔｏＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、０．５μｇプラスミドＤＮＡおよび１．０ｐｍｏｌ各蛍光標識プライマーを用いた。新たに合成されたＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ反応中に標識し、ジデオキシヌクレオチドの取り込みによる塩基特異的な方法により、統計的に終結させた。それから、結果的に得られた蛍光ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミド−尿素ゲル電気泳動により、Ｌｉｑｕｏｒシークエンシング装置において分離し、隣接するレーンにおけるＡＣＧＴのバンドパターンとして視覚化した。
【０１５５】
正確なＤＮＡ配列を有する遺伝子カセットを、調製用ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限消化により、クローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）から切り出し、調製用アガロースゲル電気泳動で単離した。ユビキチン変異体のライブラリ構築のため、修飾ユビキチン足場タンパク質の遺伝子の挿入を、対応するタンパク質産生用の発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、または、ファスミドベクターｐＭＵＢＩ−１に行った。
【０１５６】
ユビキチン変異体のライブラリの調製
【０１５７】
前記合成ユビキチン遺伝子のＮ末端およびＣ末端それぞれにおける８つのコドンのランダム部位特異的変異誘発のため、２つ連続的ＰＣＲ反応を行った。第１回目の増幅工程は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、１０×５０μＬの容量で行った。この目的のために、各試料当たり、供給１０×Ｐｆｕバッファー５μＬのおよびｄＮＴＰ混合物４μＬを使用し、水で充填した。さらに、各試料は、所望の塩基対置換の導入のため、フランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ Ｎｏ．３４、ＳｅｑＩＤ Ｎｏ．３５；１０μＭ）を各２．５μＬ含む。非変異ユビキチン遺伝子を保有するために、テンプレートとして１．０ｎｇのｐＭＵＢＩ−１を用いた。Ｐｆｕポリメラーゼ（上記参照）２．５Ｕを添加後、インキュベーションを、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間を２５サイクル行った。最後のインキュベーションを、７２℃で５分間行った。使用したテンプレートＤＮＡの選択的切断のため、反応試料当たり１０ＵのＤｐｎＩを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。所望のＰＣＲ産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法およびＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により単離した。
【０１５８】
第２回目の増幅工程は、１０００μＬの試料容量で行い、前記１回目のＰＣＲ反応で得られた産物約１．０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼを用いた。前記反応試料を、ピペットで２０倍容量に調節した。上記の詳細は、１０×Ｔａｑバッファー、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、および、５’末端がビオチン化され且つＳｆｉＩエンドヌクレアーゼ用認識配列を保有する互いに共通しないフランキングプライマー（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．３６、Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．３７；１０μＭ）からなる。水で充填した後、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを加熱下で添加（上記参照）し、ＰＣＲプログラムを開始した。インキュベーションは、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間を、２５サイクル行った。最後のインキュベーションは、７２℃で５分間行った。
【０１５９】
得られた増幅産物の切断は、ＰＣＲ反応試料において直接行った。この目的のため、総容量４０００μＬにおいて、完了したＰＣＲ反応溶液を、同量の供給１０×ｂｕｆｆｅｒII（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール含有）、１０×ＢＳＡ溶液および水と混合した。さらに、４０００Ｕの制限酵素ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を添加し、１６時間、５０℃でインキュベートした。ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑａｉｇｅｎ社）を用いて、前記試料からＤＮＡを単離し、４００μＬの滅菌水に懸濁した。ＳｆｉＩに切断されなかった前記ＰＣＲ産物の分離のため、前記単離ＤＮＡを、表面にストレプトアビジンが結合した磁力ビーズ（“Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｂｉｎｄｅｒ”）１．０ｍｇ／ｍＬを含む同量の“Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｙｎａｌ社）と混合し、室温（ＲＴ）、４．５時間、ローラーミキサー上でインキュベートした。任意に存在するビオチン化ＤＮＡに結合した前記ビーズは、沈殿するが、ＳｆｉＩにより完全に切断されたＤＮＡは、ビオチン化末端を持たず、上清に残るはずであった。一晩沈殿させた。結果的に得られたＳｆｉＩにより切断され且つ所望の部位で変異誘発されたユビキチン遺伝子を、滅菌水に溶解し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて脱塩した。前記遺伝子は、最終的に水中で２００ｆｍｏｌｅｓ／μＬの濃度であった。
【０１６０】
レシピエントベクターの調製のため、前記プラスミドｐＭＵＢＩ−１を、メーカーの説明書に従ってＳｆｉＩにより切断し、長い方の（ベクターの）断片を、調製用アガロースゲル電気泳動法およびＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により単離した。分子内の連結を避けるために、５’末端を脱リン酸化した。この目的のため、０．５Ｕのエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）由来アルカリフォスファターゼおよび前記供給バッファーを、総容量２００μＬで使用した。前記混合物を、９０分間、３７℃でインキュベートし、ＤＮＡを、前記試料から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて脱塩した。最終的に、前記ベクター断片のＤＮＡは、水中で、５０ｆｍｏｌ／μＬの濃度であった。
【０１６１】
連結のため、１．６ｐｍｏｌの前記ＰＣＲ断片および８．０ｐｍｏｌのｐＭＵＢＩ−１のベクター断片を、２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）の存在下、総容量１６００μＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８，０００）において、３日間、１６℃でインキュベートした。６５℃で１５分間、前記試料を加熱した後、前記ＤＮＡを沈殿させた。この目的のため、１００μＬの前記各反応溶液に、１００μＬのエタノールおよび１０μＬのＮａＡｃ（５Ｍ、ｐＨ３．０）を混合し、１６時間、−２０℃で保管した。続いて、遠心（６０分間、１２５００×ｇ）を行い、前記サンプルをエタノール（７０％ｖ／ｖ、−２０℃）で洗浄し、再度遠心し、最終的に沈殿したＤＮＡを６０μＬの滅菌水に溶解した。
【０１６２】
エレクトロポレーションのために、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標）IIシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）および１．０ｍｍの電極間隔を有するキュベット（Ｂｉｏｚｙｍ社）を、４℃の冷温室で使用した。前述の上記で得られた各溶液３．５μＬを用いて、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、メーカーの説明書に従って形質転換した。得られた細胞懸濁液を、ＬＢ／クロラムフェニコール培地のアガープレート（２０Ｘ２０ｃｍ）５枚に蒔いた。これらのプレートを、１６時間、３７℃で培養し、生育したコロニーを計測した。それに伴い、構築したライブラリには、独立した２．８×１０７種類のクローンが含まれており、前記ライブラリにおいて通常の１０，０００倍である。それから、前記コロニーを、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール含有ＳＯＣ培地（総量１００ｍＬ）に採取し、そのうちの１．０ｍＬを−８０℃で保存した。得られたクローン（１２のランダムに選択したクローン）から、Ｑｉａｇｅｎ社より購入したＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて、ファスミドベクターを単離し、ＤＮＡ配列を、変異誘発されたユビキチン遺伝子の領域について分析した。これらのクローンの全てが、機能的な配列を示した。すなわち、挿入または欠損による読み枠シフトを示さず、変異誘発させた部位において、質的に完全に異なる置換を示した。変異誘発させた領域外におけるランダム置換は、存在しなかった。
【０１６３】
ヒトユビキチンに基づくこのライブラリの基礎において、選択は、実施例１と同様に、当業者に公知の前記ファージディスプレイシステム法により行った。小さな修飾は、単に、使用した抗生物質（アンピシリンの代わりにクロラムフェニコール）の選択に関して導入された。
【０１６４】
システインノットタンパク質のファミリー由来の成長因子を、標的として用いた。前記ユビキチンＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１は、ＥＬＩＳＡにより決定されたように、ｎＭ範囲の解離定数を有し、前記ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおけるカップリング研究に使用した。
【０１６５】
選択された変異体の１つであるＳＰＵ１１−３−Ａ１を、制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて、ｐＥＴ２０ｂ発現ベクターにクローン化した。培養条件および精製工程は、実施例１において述べたＳＰＣ Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）に用いたものと同様であった（ＩＭＡＣ、ゲルろ過）。結合特性の検出のために、濃度依存ＥＬＩＳＡを行った。この目的のため、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を異なる濃度（１０ｎＭ〜１μＭ）で、前記標的分子でコートしたマイクロタイタープレート（以下、ＭＴＰ）に添加し、ポリクローナル抗ユビキチン抗血清（Ｓｉｇｍａ社）を１次検出試薬として用いた。室温でインキュベーション（１時間）後、前記ＭＴＰのウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２次工程において、ＰＯＤを有するモノクローナル抗体複合体（抗ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ社）を検出抗体として用いた。試験したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、ヒトＮＧＦに対する特異的な結合を示すこと、および、ＢＳＡまたは前記マイクロタイタープレートに対する非特異的な結合が検出されないことがわかった。コントロールとして用いたヒト野生型ユビキチンは、ＮＧＦ、ＢＳＡまたは前記マイクロタイタープレートへの結合を示さなかった。
【実施例３】
【０１６６】
異なる分子に対する選択的なカップリングのためのシステイン含有ペプチドリンカーとの、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）のＣ末端融合
【０１６７】
ＩｇＧ Ｆｃに結合する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７が、Ｃ末端システインを介して異なる分子に選択的に結合できたことを、下記の実施例において説明する。
【０１６８】
７つのシステインが、前記タンパク質内部に局在することに加えて、使用したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７は、溶液−接近性（露出性）であり且つ遊離したシステインを可変性部位４において有している。まず、この部位を、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲを用いてセリンに置換した。この修飾Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）（ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ）から開始して、２つのグリシンおよび１つのシステイン、ならびに、既に存在する６つのヒスチジンに加えて４つの別のヒスチジンを、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ法により、Ｃ末端に挿入した。１０個のヒスチジンを伸張した親和性タグの目的は、改良された精製を可能にすることである。Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬を用いた滴定試験は、前記導入されたシステインが、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体に存在する他のシステインによるシステイン混合現象のため、カップリング実験に不適切であることを示していた。この理由のために、前記システインを、ＤＮＡレベルでセリンに置換し（ＴＣＴ）、この構築物から開始して、新たなシステインをＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの後に導入した。このことは、前記タンパク質におけるシステインからの前記挿入システインの距離を長くし、且つ、システイン混合を抑制する。最終的に、得られた構築物を配列決定し、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬を用いた滴定試験がカップリング試験に適していることを示した。
【０１６９】
前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７の部位４におけるセリンによるシステインの置換のため、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社、ラジョラ、アメリカ）を、プライマーＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ＿フォワードおよびＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ＿リバースと共に用いた。ＰＣＲ反応のため、５μＬの１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）、各１２５ｎｇの２種類のプライマー、１μＬのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、１μＬ ｄＮＴＰ混合物および水を、総容量５０μＬで用いた。ｐＥＴ２０ｂベクターのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７の遺伝子を、テンプレートＤＮＡとして用いた。９５℃で３分間の１回目の変性工程により反応を開始し、変性、プライマーアニーリングおよび合成を１８サイクル繰り返した。９５℃での変性を３０秒間行い、前記プライマーアニーリングは、６０℃で１分間行った。合成工程の時間を、６８℃で５分間とした。ＰＣＲの最後に、６８℃で５分間の最終合成を行った。増幅は、アガロースゲル電気泳動によりモニターした。増幅に成功した後、使用したテンプレートＤＮＡの制限消化を、制限酵素ＤｐｎＩにより行った。１μＬの前記酵素（１０Ｕ／μＬ）を前記ＰＣＲ試料にピペットで加えて混合し、１時間、３７℃でインキュベートした。それから、前記ベクターを、エレクトロポレーション法により、コンピテント株（ＸＬ１−ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。この目的のため、１μＬのＤｐｎＩ処理制限試料（氷中）を５０μＬのエレクトロコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にピペットで加えて混合し、氷冷したエレクトロポレーションキュベット（０．１ｍｍ）において、２．５ｋＶ，２５μＦおよび２００Ωの条件でパルスした。細胞を１ｍＬのＳＯＣ培地に再度懸濁し、６０分間、５００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で培養した。その後、細胞を選択培地（２×ＹＴ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に蒔き、１６時間、３７℃で培養した。得られた１２種類のクローンを、正しく挿入されているかを確認するために、ｐＥＴＴｅｒｍプライマーを用いて、別々に配列決定した。前記正確なクローンのベクターを、Ｃ末端に２つのグリシンと１つのシステインと４つの付加的ヒスチジンを導入するために、次のＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして用いた。前述のように、２種類のプライマーＡ７Ｇｌｙ２Ｃｙｓ＿フォワードおよびＡ７Ｇｌｙ２Ｃｙｓ＿リバースを用いたＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ後、ＤｐｎＩ消化およびエレクトロポレーション法によるＸＬ１−ｂｌｕｅ株の形質転換を行った。正確な導入をコントロールするために、前記１２種類のクローンのプラスミドを、再度配列決定した。前記正確なクローン（ＳＰＣ−１Ａ７ＪＪ）のプラスミドを、プラスミドｐＵＢＳ５２０を有するＢＬ２１発現株中に導入し、引き続いて、発現させた。さらに、前述のように（実施例１）、２回のクロマトグラフィー工程（Ｎｉ−ＮＴＡでの親和性クロマトグラフィーおよびＳｅｐｈａｄｅｘ ７５でのゲルろ過）において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢを精製した。
【０１７０】
導入したシステイン残基の接触性を試験するため（Ｈａｂｅｒ、１９７２）、全ての遊離ＳＨ基を、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬（ＤＴＮＢ溶液）法により滴定する。この目的のため、１ｍＬのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＪＪのタンパク質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０中に５０〜３５０μｇのタンパク質）に、３０μＬのＤＴＮＢ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０中に４ｍｇ／ｍＬのＤＴＮＢ）を添加した。３０μＬのバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０）を加えた１ｍＬのタンパク質溶液を、ブランク値１として用いた。３０μＬのＤＴＮＢ溶液を加えた１ｍＬのバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０）を、ブランク値２として用いた。前記試料を、１５分間、室温でインキュベートし、４１０ｎｍの吸光度を測定した。ブランク値１およびブランク値２の吸光度を、前記テストサンプルの吸光度から引き算した。得られた吸光度値から、遊離ＳＨ基のモル濃度を、ＤＴＮＢ−ＳＨの吸光係数（ε４１０〔ＤＴＮＢ−ＳＨ〕＝１３，６００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて計算し、使用したタンパク質濃度により割った。結果として、タンパク質分子当たりの遊離チオール基の数を得た。遊離システイン残基を、構築したＡｆｆｉｌｉｎ（変異体）ＳＰＣ１−Ａ７ＪＪ ３−４において、滴定できた。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ４Ｓｅｒを用いた滴定のコントロールにより証明されたように、前記タンパク質に存在するシステインが接触性でないため、１つの遊離システイン残基が予測された。このことは、Ｃ末端システインのシステイン混合が、タンパク質に埋められたシステインにより導入されたことを示し、そのため、タンパク質に導入されたシステインの距離が非常に短いことを示唆している。この理由のため、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ−１−Ａ７ＪＪのＣ末端システインを、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲにおいて、前述のプライマーＡ７Ｇｌｙ２Ｓｅｒ＿フォワードおよびＡ７Ｇｌｙ２Ｓｅｒ＿リバースを用いて、セリンに置換した。正確な導入の確認の後、この構築物を、システインに続いてＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを導入するためのＰＣＲ用テンプレートとして用いた。プライマーＧｌｙ４ＳｅｒＣｙｓ ＨｉｎｄIIIおよびＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ Ｎｄｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のため、５μＬの１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）、各１２５ｎｇの前記２種類のプライマー、１μＬのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、１μＬ ｄＮＴＰ混合物および水を、総容量５０μＬで用いた。さらに、前記プライマーの２次構造物を分離するために、２μＬのＤＭＳＯを前記反応混合物に添加した。前述の手順と比較して、変性、プライマーアニーリングおよび合成の繰り返し工程を、プライマーアニーリング温度を５８℃に代えて、２５回行った。このＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体（ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ）のＰＣＲ産物の増幅を、アガロースゲル電気泳動法により確認した。表２は、ここで述べた構築物の概要である（表２）。プライマーＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ Ｎｄｅは、酵素ＮｄｅＩ用の組み込まれた制限酵素部位を含んでおり、プライマーＧｌｙ４ＳｅｒＣｙｓ ＨｉｎｄIIIは、酵素ＨｉｎｄIII用の組み込まれた制限酵素部位を含んでいる。そのことにより、精製、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで処理されるベクターｐＥＴ２０ｂ内の前記２酵素による制限の後、前記ＰＣＲ産物の連結が可能となる。前記２種類の酵素による制限は、ダブルダイジェストで同時に行われる。この目的のため、約１μｇのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿ＣｙｓのＰＣＲ産物、または、１μｇのベクターｐＥＴ２０ｂを、それぞれ、１μＬの前記制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ、２０Ｕ／μＬ）および１μＬの制限酵素ＨｉｎｄIII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ、２０Ｕ／μＬ）ならびに１０μＬの１０×反応バッファーであるＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、総容量１００μＬ、４時間、３７℃でインキュベートした。得られた断片を、調製用アガロースゲル電気泳動を介して別々に精製した。前記連結のため、２０ｎｇの精製されＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIII処理されたベクターｐＥＴ２０の断片、ならびに、１２０ｎｇの同様に処理されたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの断片、２μＬの１０×反応バッファー（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ）および０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マンハイム、ドイツ、１〜３Ｕ／μＬ）を、総容量２０μＬで使用した。前記反応試料を、１６時間、１６℃でインキュベートし、得られたベクターを、前述のように、ＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞にエレクトロポレーションにより導入した。遺伝子の正確な導入を、形質転換後に得られた１２種類のクローンから、プライマーｐＥＴＴｅｒｍを用いた配列決定により検証した。引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体（ＢＬ２１（ＤＥ３）、＋ｐＵＢＳ５２０）を、正確な配列を有する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓのベクターを用いて形質転換した。前述のように、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの発現および精製の後（実施例１）、前記遊離システイン残基を、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬の方法により、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓについて、再度滴定した。適切なパートナーに対する選択的なカップリングのため、タンパク質と十分な距離で、溶媒に接触可能なＣ末端システインの成功した導入の予測した確証として、１つのシステイン残基のみを検出することができた（表１）。この単一の接触可能なシステインの検出は、適切なカップリングパートナーおよびマトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の選択的カップリングのための基礎となる。
【０１７１】
Ｃ末端システインを有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１を提供するために、ＳＰＵ１１−３−Ａ１遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位を介して、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７（上記参照）のために修飾されたｐＥＴ２０ｂにクローン化した。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓの発現および精製は、ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓのための手順と同様である。
【実施例４】
【０１７２】
ペプチドリンカー（Ｃ末端システイン）を有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合特性の分析
【０１７３】
実施例３において精製したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合特性を、濃度依存ＥＬＩＳＡで試験した。この目的のため、ＮＵＮＣプレートのウェルを、１００μＬの抗原溶液（１０μｇ／ｍＬ ヒトモノクローナルＩｇＧ Ｆｃ部位、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、４℃で一晩コートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、２時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてウェルを洗浄した後、前記修飾されたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）を、濃度依存法（濃度範囲：１０μＭ〜０μＭ）で、前記ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて別のウェルを洗浄した後、モノクローナル抗ヒトＧＣ抗体（ＰＯＤ−複合体；Ｂｉｏｇｅｎｅｓ社、ベルリン）を１：１０００の希釈で添加し（５０μＬ／ウェル）、再度、１時間、室温でインキュベートした。その後、前記ウェルをＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回、およびＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ Ｐｌｕｓ（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ社、デンマーク）で呈色反応を開始した（５０μＬ／ウェル）。室温で２０分間のインキュベート後、前記呈色反応を０．２Ｍ硫酸５０μＬ／ウェル）の添加により停止した。得られた黄色を４５０ｎｍ（参照波長：６２０ｎｍ）で検出し記録した（図４）。測定値の評価は、２３３ｎＭの見かけＫＤ値が明らかにした。この値は、非修飾のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（２８０ｎＭ）と、ほとんど同じである。従って、システインを含むペプチドリンカーを有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７のＣ末端修飾は、変異体の結合能力に影響しなかった。
【実施例５】
【０１７４】
フィコエリスリン（ＰＥ）に対するＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの選択的なカップリング
【０１７５】
ＩｇＧにするＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの活性化ＰＥに対するカップリングを、下記のように行った。１ｍｇ／ｍＬのＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ（ＰＢＳ中）を、１０ｍＭＤＴＴを用いて、３０分間、室温で還元した。還元段階の間、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、カラムの５倍量のＰＢＳで洗浄した。前記還元を行った後、過剰なＤＴＴを分離するために、前記反応混合物を平衡化したＰＤ−１０カラムに添加した。この方法により、還元されたＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓを、マレイミド活性化フィコエリスリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）に、５：１のモル比で加え、ゆるやかな攪拌下、１時間、室温でインキュベートした。その後、未反応の前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）の遊離スルフヒドリル基を、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄ）添加により、２０分間、室温でブロッキングした。引き続いて、前記反応混合物を、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ−２００ ＨＲ）法により精製し、対応する画分を混合し、４℃で保存した。複合体の分析を分光学的に行った。この目的のため、２５０〜７５０ｎｍの範囲における吸光スペクトルを測定し、ＰＥおよびＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の濃度を、決定または提供された吸光係数法により測定した。前記得られたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）とＰＥとの複合体（ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ＿ＰＥ）について、ＩｇＧ Ｆｃに対する結合特性を前記ＢＩＡＣＯＲＥで試験した。この目的のため、ＩｇＧ Ｆｃに結合させたＣＭ５チップを、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰと共に、連続的な流れ３０μ／Ｌで用いた。ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ＿ＰＥを異なる濃度で、次々に前記チップを通過させ、得られたセンサーグラムを、前記ＢＩＡＣＯＲＥ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。肉眼的解離定数でＫＤ＝１０−７Ｍから１０−８Ｍに減少する結果となったカップリングにより、アビディティー効果が得られたことがわかった（図５）。
【実施例６】
【０１７６】
前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対する蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６の非特異的なカップリング
【０１７７】
前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を、前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（遊離システインを有さない）に結合させ、結合に関する試験を行った。
【０１７８】
カップリング工程を下記のように行った。１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．５）中、１ｍｇ／ｍＬのＳＰＣ１−Ａ７ＢＢを、前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６（２０μＬの無水ＤＭＦに溶解）に１：２のモル比で加え、３０分間、室温でインキュベートした。前記カップリング反応を等量の１０％グリセロール溶液の添加により停止し、前記試料をＰＤ−１０カラムと通して精製した。その後、カップリングの程度を分光学的に定量化した。この目的のために、複合体の濃度を２８０ｎｍでの吸光法により決定し、提供された補正因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて補正した。それから、カップリングの程度をＯｙｓｔｅｒ（商標）５５６および複合体の濃度の商（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）から求め、１分子Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）／０．８分子Ｏｙｓｔｅｒ（商標）であることを決定した。前記得られた複合体の結合能力の分析は、濃度依存ＥＬＩＳＡ（実施例１のように行った）およびＢｉａｃｏｒｅ測定により行った（図６）。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢの結合能力が、前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）へのカップリング後、影響されないことがわかった。
【実施例７】
【０１７９】
前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素（ＰＯＤ）の非特異的なカップリング
【０１８０】
Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢは、非特異的に前記ＰＯＤ酵素に結合された。結合試験は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）の結合活性およびＰＯＤの酵素活性を保持することを示した。前記複合体を、下記のプロトコールにより調製した。
【０１８１】
５ｍｇの凍結乾燥ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、Ｓｈｇｍａ社）を２５０μＬの純水に溶解し、３７．５μＬの０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え、１０分間、２０℃でインキュベートした。その後、２５μＬのエチレングリコールを加え、さらに５分間、２０℃でインキュベートした。前記ペルオキシダーゼを、ゲルろ過（Ｇ２５、ＮＡＰ−５カラム）により純水で透析した。
【０１８２】
２５０μＬの精製Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（ＩＭＡＣ、ゲルろ過、４ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を、１００μＬの０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に加え、１ｍｇの活性化ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を加えた（約１００μＬ）。前記カップリング混合物を、攪拌下、２時間、２０℃でインキュベートした。その後、カップリング混合液１ｍＬ当たり１０μＬの０．５Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを加え、短時間で混合し、攪拌なしで、２時間、４℃でインキュベートした。前記反応試料を、Ｇ２５カラムを用いて、ＰＢＳに緩衝した。０．１％チオメルサール（Ｒｏｔｈ）を保存のために添加した。ヒトＩｇＧに対する複合体の結合活性の試験を、以下のように行った。
【０１８３】
前記標識化Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）をＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チオメルサール）で希釈し、前記溶液を、ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）でコートしたマイクタイタープレートに添加した。インキュベーション時間を、室温で１時間とした。その後、各ウェルを、それぞれ、２５０μＬのＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チオメルサール）で３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢを用いて１０〜２０分間、室温で再度インキュベートした。反応は、１００μＬの０．５Ｍ硫酸の添加により停止させた。吸光（４５０ｎｍ、参照として６２０ｎｍ）をマイクロプレート測光器で測定した（図７）。ＰＯＤ活性は、前記反応試料１：１０，０００の希釈まで検出でき、これはＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対するＰＯＤの成功したカップリングを示す、コントロール測定により、シグナルを妨げる非結合ＰＯＤを除外した。
【実施例８】
【０１８４】
マトリクスに対するγ−II―クリスタリンおよびユビキチンに基づくＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の特異的および非特異的なカップリング
【０１８５】
マトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）のカップリングが、下記の方法により得られた。
１．）デキストランマトリクスに対するＣ末端システインを介したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓのカップリング、
２．）ＢＩＡＣＯＲＥシステムの前記デキストランマトリクスに対する第１級アミノ基を介したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９のカップリング、および、
３．）ＥＤＣ／ＮＨＳによるポリメタクリル酸マトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９の非特異的なカップリング。
【０１８６】
１．）ＢＩＡＣＯＲＥシステムのデキストランマトリクスに対するＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓのカップリングを、導入したＣ末端システインを介して、選択的に行った。この目的のため、デキストランマトリクスのカルボキシル基を、ＮＨＳ／ＥＤＣを用いて、接触時間２分間で活性化し、続いて、チオールカップリング試薬ＰＤＥＡ（０．１Ｍホウ酸バッファーｐＨ８．５中に２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン）を加えた。４分間の反応時間の後、精製されたＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０）を、この方法において修飾された前記デキストランチップに添加し、前記反応を７分間続けた。未反応ＰＤＥＡの不活性化を、５０ｍＭ Ｌ−システイン（１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて４分間行った。この方法により、３５０ユニット（ＲＵ）のＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓを前記チップ上に固定化でき、さらに反応速度分析に使用できた。反応速度測定の後、前記チップを、０．１グリシン（ｐＨ２．２）、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。この方法において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）チップの結合活性は、２０〜３０回の再生サイクル後でさえ変化しなかった（図８）。
【０１８７】
２．）さらに、以下の方法により、ＳＰＣ７−Ｅ９を、前記ＢＩＡＣＯＲＥデキストランマトリクスのカルボキシル基に対して、ＮＨＳ／ＥＤＣ法により、表面に露出したアミノ基（リジン）を介して、非特異的に結合することができた。前記ＣＭ５チップを、７分間、ＮＨＳ／ＥＤＣを用いて活性化し、その後、精製ＳＰＣ７−Ｅ９（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０）を、さらに、７分間、前記チップに通過させた。カップリングを行った後、残留した反応性基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を用いて７分間不活性化した。解離定数の分析のため、標的ｐｒｏＮＧＦを異なる濃度で前記チップに通過させ、結合をオンラインでモニターし（図９）、続いて、曲線を前記ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて評価した。この方法において、ＫＤ値を１．４ｎＭと決定できた。反応速度測定の後、前記チップを０．１グリシン（ｐＨ２．２）、１０ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨ、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。この方法において、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）チップの結合活性は、複数回の再生サイクル後でさえ変化しなかった。
【０１８８】
３．）精製ＳＰＣ７−Ｅｐタンパク質（４ｍｇ）を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に通して、０．１Ｍホウ酸バッファー（０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ９）に緩衝させ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｅｐｏｘｙ（Ｍ）に結合させた。この目的のため、前記ゲル（０．５ｇ）を、０．１Ｍホウ酸バッファー（０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ９）において、２時間、室温でインキュベートし、その後、このバッファーを用いて数回洗浄した。カップリング反応を前記エポキシマトリクスへのＳＰＣ７−Ｅ９の添加により開始し、２４時間、室温で連続的に攪拌を続けた。コントロールとして、ＳＰＣ７−Ｅ９を有しない標準カラムを用い、同様の方法で処理した。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ９．５）により、前記反応を、４８時間、室温で停止し、前記ゲルマトリクスを、酢酸ナトリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）、１Ｍ ＮａＣｌおよびＰＢＳを用いて（それぞれカラムの５０倍量ずつ）洗浄した。この方法により産出された前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９親和性マトリクスをＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、１×１０ｃｍ）に充填し、クロマトグラフィーシステム（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に連結した。全てのケースにおいて、ＰＢＳ（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を、ランニングバッファーとして、流速１ｍＬ／分で用いた。この方法において産出された前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムの結合能力を検査するために、精製ｐｒｏＮＧＦを添加した。前記カラムを１０〜２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、結合したｐｒｏＮＧＦを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）を用いて溶出した（図１０）。さらに、ＢＳＡの基質混合物およびＥ．ｃｏｌｉの粗抽出液から、ｐｒｏＮＧＦを分離することが可能であった。この目的のため、１ｍＬのＢＳＡ溶液（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社）を、０．５ｍＬのｐｒｏＮＧＦ（１．３ｍｇ／ｍＬ）に混合し、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムに添加した。前記カラムを、カラムの２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、結合したｐｒｏＮＧＦをグリシン（０．１Ｍ、ｐＨ２．２）で溶出した。カラムの１０倍量の６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌで、前記カラムを再生した後、さらに、１ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液（５０ｍＬのＢｌ２１の一晩培養液の菌体ペレットの細胞破壊（リゾチーム／ベンゾナーゼ／超音波）後の可溶化上清）と０．５ｍＬのｐｒｏＮＧＦ（１．３ｍｇ／ｍ）との混合物を、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムに添加した。前記カラムを、カラムの２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、グリシン（０．１Ｍ、ｐＨ２．２）で、結合したｐｒｏＮＧＦを溶出した。続いて、前記カラムを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）、１０ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨ、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。ＢＳＡおよびＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液からのｐｒｏＮＧＦの分離からの前記溶出画分を、ゲル電気泳動法により分析した（図１１）。１０回のテストの後、前記ＳＰＣ７−Ｅ９カラムに対するｐｒｏＮＧＦの未変化の結合が観測できた。
【０１８９】
【表１】
【０１９０】
【表２】
【０１９１】
ヒトγ−II−クリスタリンライブラリのＤＮＡ配列
CR20 (SEQ ID NO:1)
ATGGGTNNKATCNNKTTCNNKGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTNNKTACNNKTGCNNKACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCNNKGTTNNKTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaatt
cactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
【０１９２】
γ−II−クリスタリンに基づくAffilin（商標）のＤＮＡ配列
SPC1-A1 (SEQ ID NO:2)
ATGGGTTTTATCTGGTTCATGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACGATTGCGGTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAAGGTTAAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-A7 (SEQ ID NO:3)
ATGGGTCTGATCTGTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-G3 (SEQ ID NO:4)
ATGGGTTCTATCATTTTCCTTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTATTTACGGTTGCACTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCGTGGTTCAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-A7BB (SEQ ID NO:5)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTgCCTGACCGACTGCCCGAaCCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGaACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTgTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7JJ (His10を含む) (SEQ ID NO:6)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTgCCTGACCGACTGCCCGAaCCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGaACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTgTACCTCGAGTgCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7_Cys (His10を含む) (SEQ ID NO:7)
ATGGGtCTGATCTCTtTcTcTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGtAcAtgTGCCTgAcCGacTgCccGAACCTGCAGCCGTACTTcTcCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGAcTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCtGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGaGTCATgGATTTgTACCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGaTCTTgCCATCACCATCACCACCaCCACCAcCACCAC
SPC7-E9 (His6を含む) (SEQ ID NO:8)
ATGGGTTTTATCTGTTTCTTGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTTCTTACGCTTGCGATACTGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAGTGTTCTGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTgCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
【０１９３】
ヒトユビキチンライブラリのＤＮＡ配列
Ubiquitin wildtype (SEQ ID NO:9)
ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAAAATGTGAAGGCCAAGATCCAAGATAAAGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGACTACAACATCCAGAAAGAGTCGACCCTGCACCTGGTCCTCCGCCTGAGGGGCGGC
Modified ubiquitin (MUBI) (SEQ ID NO:10)
ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
UB10 (library) (SEQ ID NO:11)
ATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCNNKNNKNNKNNKNNKCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
【０１９４】
ユビキチンに基づくAffilin（商標）のＤＮＡ配列
SPU11-3-A1 (His6を含む) (SEQ ID NO:12)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGaGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGcACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SPU11-3-A1_Cys (His10を含む) (SEQ ID NO:13)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGaGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGcACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
【０１９５】
プライマー
pCAN700 (SEQ ID NO:14)
(5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’)
A7Cys4Ser_for (SEQ ID NO:15)
(5’-CCA TGG GTC TGA TCT CTT TCT CTG AAG ACC G-3’)
A7Cys4Ser_rev (SEQ ID NO:16)
(5’-CGG TCT TCA GAG AAA GAG ATC AGA CCC ATG G-3’)
pETTerm (SEQ ID NO:17)
(5’-GCT AGT TAT TGC TCA GCG GTG GC-3’)
A7Gly2Cys_for (SEQ ID NO:18)
(5’-GGA TTT GTA CCT CGA GTG CGG CGG CCA TCA CCA TCA CCA CCA CCA CCA CCA CCA CTG AGA TCC GGC-3’)
A7Gly2Cys_rev (SEQ ID NO:19)
(5’-GCC GGA TCT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGA TGG TGA TGG CCG CCG CAC TCG AGG TAC AAA TCC-3’)
A7Gly2Ser_for (SEQ ID NO:20)
(5’-GGA TTT GTA CCT CGA GTC CGG CGG CCA TCA CC-3’)
A7Gly2Ser rev (SEQ ID NO:21)
(5’-GGT GAT GGC CGC CGG ACT CGA GGT ACA AAT CC-3’)
A7Gly2Ser_rev (SEQ ID NO:22)
(5’-GGT GAT GGC CGC CGG ACT CGA GGT ACA AAT CC-3’)
Gly4SerCys_HindIII (SEQ ID NO:23)
(5’-GGG GGA AGC TTT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGA TGG TGA TGG CAA GAT-3’)
A7Cys4Ser_Nde (SEQ ID NO:24)
(5’-GGA GAT ATA CAAT ATG GGT CTG ATC TCT TTC TCT G-3’)
【０１９６】
SEQ ID NO: 25:
ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCGGC CCAGCCGGCC 60
ATGGCCATGC AAATCTTCGT TAAAACCCTG ACGGGAAAGA CTATCACCCT GGAGGTAGAA 120
CCGTCCGACA CCATCGAAAA TGTCAAAGCT AAAATCCAAG ACAAAGAAGG AATTCCACCT 180
GACCAGCAAC GCCTAGCTTT CGCAGGACGA CAACTAGAGG ACGGGCTCAC CCTGTCTGAC 240
TACAACATCC AAAAAGAATC CACCCTCCAC CTGGCACTCC TCCTGCGGGC C 291
SEQ ID NO: 26
ATGCAAATCT TCGTTAAAAC CCTGACGGGA AAGACTATCA CCCTGGAGGT 50
SEQ ID NO: 27
GGATTTTAGC TTTGACATTT TCGATGGTGT CGGACGGTTC TACCTCCAGG GTG 53
SEQ ID NO: 28
GTCAAAGCTA AAATCCAAGA CAAAGAAGGA ATTCCACCTG ACCAGCAACG CCT 53
SEQ ID NO: 29
GGGTGAGCCC GTCCTCTAGT TGTCGTCCTG CGAAAGCTAG GCGTTGCTGG 50
SEQ ID NO: 30
GACGGGCTCA CCCTGTCTGA CTACAACATC CAAAAAGAAT CCACCCTCCA 50
SEQ ID NO: 31
GAGTGCTCGC AGCAGGAGTG CCAGGTGGAG GGTGGATTC 39
SEQ ID NO: 32
GATATACATA TGCAAATCTT CG 22
SEQ ID NO: 33
GTGGTGCTCG AGTGCTCG 18
SEQ ID NO: 34
CCAGCCGGCC ATGGCCATGN NKATCNNKGT TNNKACCCTG ACGGGAAAGA CTATC 55
SEQ ID NO: 35
CAGGAGGAGT GCCAGGTGGA GMNNMNNMNN MNNMNNGATG TTGTAGTCAG ACAGG 55
SEQ ID NO: 36
GTTATTACTC GCGGCCCAGC CGGCCATGGC CATG 34
SEQ ID NO: 37
GAGTTTTTGT TCGGCCTCGA GGGCCCGCAG GAGGAGTGCC AGGTGGAG 48
【０１９７】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】γ−II−クリスタリンの空間的構造。Ｎ末端ドメインにおいて、新規に産出した結合表面を黄色で示す。前記結合表面の外側に局在したリジン残基のＣ末端部位を、赤の球により強調する。
【図２】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ１（Ａ）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｂ）およびＳＰＣ１−Ｇ３（Ｃ）の結合を競合させるための、Ｂｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。前記試験のため、１８０ＲＵのポリクローナルＩｇＧ Ｆｃを固定化した。結合競合のため、表示された濃度の変異体およびＩｇＧ Ｆｃを用いた。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。
【図３】ｐｒｏＮＧＦに対するＳＰＣ７−Ｅ９の結合の検出のための濃度依存ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍＬのｐｒｏＮＧＦでコートした。１：:１０００の希釈で抗ヒトのγ−II−クリスタリン抗体−ＰＯＤ複合体を、検出抗体として用いた。示された吸光度は、２つの同時測定の平均値である。２００ｎＭの見かけ上のＫＤ値が計算された。
【図４】ヒトのＩｇＧ Ｆｃに対するＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合を検出するための濃度依存ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ Ｆｃでコートした。１：１０００の希釈で抗ヒトγ−II−クリスタリン抗体―ＰＯＤ複合体を、検出抗体として用いた。示された吸光度は、２つの同時測定の平均値である。２３３ｎＭの見かけ上のＫＤ値が計算された。
【図５】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ−ＰＥ複合体の結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。３０００ＲＵのＩｇＧ Ｆｃを固定化し、１２１ｎＭ（赤）、７５ｎＭ（緑）、６ｎＭ（青）濃度のＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ−ＰＥ複合体を、前記チップに通過させた。結合段階を１分間、続けて、解離段階を３分間とした。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、肉眼でのＫＤ値１５ｎＭが計算された。
【図６】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ１−Ａ７Ｏｙｓｔｅｒ５５６の結合を試験するためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。１０００ＲＵのＩｇＧ Ｆｃを前記チップ上に固定化し、１μＭ（青）および５μＭ（赤）濃度のＳＰＣ１−Ａ７Ｏｙｓｔｅｒ５５６を、前記チップに通過させた。結合および解離段階をどちらも３分間とした。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。
【図７】ＥＬＩＳＡによるＩｇＧに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）−ＰＯＤ複合体の結合の検出。１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧをマイクロタイタープレート上に固定化した。ＰＢＳ中のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）―ＰＯＤ複合体の別の希釈液をマイクロタイタープレート上で１時間インキュベートした。洗浄工程の後、結合したＰＯＤの活性をＴＭＢ基質溶液により検出した。
【図８】ＮＧＦに対するＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓの結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。２００ＲＵのＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓを、ＰＤＥＡ法によりＣＭ５チップに結合させ、異なる濃度のＮＧＦを、前記チップに通過させた。結合および解離段階をどちらも３分間とした。ＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０含有）を、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、ＫＤ値４６ｎＭが計算された。
【図９】ｐｒｏＮＧＦを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ７−Ｅ９の結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。２８０ＲＵのｐｒｏＮＧＦを、固定化し、異なる濃度のｐｒｏＮＧＦを、前記チップに通過させた。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、ＫＤ値１．４ｎＭが計算された。
【図１０】ＳＰＣ７−Ｅ９親和性カラムからのｐｒｏＮＧＦの溶出。４００μｇの精製されたｐｒｏＮＧＦを添加し（時間０、ピンクの点線）、後の洗浄を、カラム体積の２０倍量のランニングバッファーにより行った。前記溶出を、０．１ＭグリシンｐＨ２．２（緑線）により行った。前記作業を、１ｍＬ／分の流速で行った。タンパク質の検出を、２８０ｎｍ（青線）により行った。
【図１１】ＢＳＡ溶液およびＥ．ｃｏｌｉの粗抽出液からのｐｒｏＮＧＦ分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（左から右に向かって）レーン１：マーカータンパク質、レーン２：ＢＳＡ標準、レーン３：ｐｒｏＮＧＦ標準、レーン４：ＢＳＡおよびｐｒｏＮＧＦ標準の混合物（開始）、レーン５：フロースルー、レーン６：０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）による溶出液、レーン７：なし、レーン８：Ｅ．ｃｏｌｉの粗抽出液（Ｂｌ２１）およびｐｒｏＮＧＦ標準、レーン９：フロースルー、レーン１０：０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）による溶出液。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチド分子と１以上の機能性成分との間における共有結合を含む複合体に関する。さらに、本発明は、前記複合体の製造方法、ならびに、診断、治療およびクロマトグラフィーにおける前記複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−II−クリスタリンは、β−γ−クリスタリンファミリーに属し、脊椎動物において、偏在的に分布する眼の水晶体の構造タンパク質である（非特許文献１）。前記β−γ−クリスタリンは、構造的に同一な２つのドメイン、および、主にβシート構造からなるという特徴を有する、高度に相同なタンパク質ファミリーを形成する（非特許文献２）。β−γ−クリスタリンの重ね合わせ構造のモチーフは、グリークキー形態と呼ばれる。それは、４つの逆平行のβ鎖からなり、その内の２つ（一方が他方に横たわる）が、クリスタリンの１つのドメインを形成する（非特許文献３）。
【０００３】
クリスタリンの本来の機能は、８６０ｍｇ／ｍＬに達する極めて高い局所タンパク質濃度により達成される、眼の水晶体における高屈折率の発生に基づいている（非特許文献４）。それらの空間構造により、クリスタリンは、高いプロテアーゼ耐性を有する、非常に安定した可溶性タンパク質である。さらに、眼の水晶体内における局在は、γ−クリスタリンがタンパク質ターンオーバーの影響を受けないという効果を有する。従って、β−γ−クリスタリンは、最も長い半減期を有するタンパク質として知られている（非特許文献５）。
【０００４】
このタンパク質ファミリーの中で最も優れた特性を有するのが、ウシのγ−クリスタリンである。その空間構造は、異なる解像度で、野生型タンパク質および全範囲の点変異を決定できる（非特許文献６；非特許文献４；非特許文献７）。このことは、前記タンパク質が、２つのドメイン間の疎水性間隙を介して安定化されていることを示している。この間隙は、Ｎ末端ドメインにおける３残基およびＣ末端ドメインにおける形態的に同一の３残基からなる６つの疎水性残基の分子内相互作用により形成される（非特許文献８）。化学薬品に対する安定性は、主に、前記２つのドメインに結合する短いペプチドに大きく依存する（非特許文献９）。
【０００５】
前記ウシγ−クリスタリンは、分子量約２０ｋＤａで、並外れた高い安定性により特徴付けられる。それは、中性ｐＨで８Ｍ尿素に耐性を示す。ｐＨ１〜９の範囲において、天然状態で存在し（非特許文献１０；非特許文献１１）、７５℃に達する温度でさえ、前記タンパク質は７Ｍ尿素に安定である（非特許文献１２）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるγ−クリスタリンの組換え細胞質発現は、非常に高収率で成功している（非特許文献９）。
【０００６】
高い安定性、低分子量、高い細胞質発現率というタンパク質の化学的特性により、γ−クリスタリンのタンパク質クラスは、代替結合分子の発生のための有力な候補になり得る。
【０００７】
ファージミドライブラリー（ＧＣＵＣ１）は、足場タンパク質としてのウシγ−II−クリスタリンに基づいてＦｉｅｄｌｅｒ＆Ｒｕｄｏｌｐｈにより確立され、表面に露出した２、４、６、１５、１７、１９、３６および３８部位（開始メチオニンを除く）の８つのアミノ酸が、ＤＮＡレベルでランダム化された。ファージディスプレイ法により数回の選択を行った後、μＭの範囲でエストラジオールへの特異的な結合および親和性を有するバリエーションが検出された。これらの結果は、ウシγ−II−クリスタリンにおいて、新しく発生される前には存在しなかった結合特性を示しており、前記γ−クリスタリンは、前記代替結合分子の単離のための足場タンパク質として、一般的に適していることを示している（特許文献１参照）。
【０００８】
後の研究において、新しいライブラリが、ヒトγ−II−クリスタリンに基づいて確立された。前記足場タンパク質としてのヒトγ−II−クリスタリンの選択、および、新しいライブラリの付随的構成は、重要な利点を有する。
１．ウシタンパク質と比較して、ヒトγ−II−クリスタリンは、変性作用に対して著しく高い安定性を有している。
２．ヒト由来タンパク質は、治療的応用において、各変異の免疫原生が非常に低いという結果をもたらす。そして、
３．より高度な複雑性を有する新しく構築されたライブラリは、さらに高い親和性を有する結合分子の単離を可能とするであろう（非特許文献１３）。
前記ＧＣＵＣ１ライブラリと同様に、同じ８個のアミノ酸部位（開始メチオニンを除く、２、４、６、１５、１７、１９、３６および３８部位）が、ランダム化のために選択された。新しいライブラリＣＲ２０は、それぞれ独立した理論上５×１０８通りの変異体を有するヒトγ−ＩＩ−クリスタリンに基づき、特許文献１に記載された方法で確立され、前記ライブラリにおいて変異体は約１３０倍で表される。２００以上の独立した変異体をシークエンスした後、全変異体の８０％以上が、前記８箇所のランダム化部位においてのみ置換を有することがわかった。さらに、３番目のコドン部位を除く置換部位における変異の配列は、可能性のある全てのヌクレオチドと、ほとんど同一の分布を示した。このように、前記８箇所のランダム化部位における全３２の可能性のあるコドンを有するこのライブラリは、質が高い。
【０００９】
代替結合分子の生産に使用される第２の足場タンパク質は、ヒトユビキチンから作製される。ユビキチンは、小型、単量体、その配列で高く保存された細胞質タンパク質であり、原生動物から脊椎動物まで全ての公知真核生物の細胞において存在する。
【００１０】
ユビキチンのペプチド鎖は、７６個のアミノ酸からなり、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれている（非特許文献１４）。ポリペプチド鎖のほぼ８７％が、水素結合を介した２次構造要素の形成に関与している。著名な２次構造として、３．５α−へリックスターン、および、５本鎖からなる逆平行βシートが、報告されている。これらの要素（逆平行βシートは、その裏面上においてタンパク質表面に露出し、αヘリックスは、その上部において垂直に横たわって詰め込まれる）の特性の変化は、一般的に、いわゆる、ユビキチン様折りたたみモチーフと考えられている。他の構造的特性は、α−へリックスとβシートとの間における前記タンパク質の内部の、著しい疎水性領域である。
【００１１】
サイズが小さいために、ユビキチンの人工調製は、化学合成およびバイオテクノロジーの手段の両方により行うことができる。好ましい折りたたみ特性のために、ユビキチンは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物を用いた遺伝子工学により、細胞質または細胞膜周辺腔において比較的大量に生産できる。
【００１２】
単純で効率的な微生物調製のため、ユビキチンは、その生産に問題がある他の外来タンパク質のための融合パートナーとして使用できる。ユビキチンに対する融合手段によって溶解度が改善し、それにより、改善した収量が達成される（非特許文献１５）。
【００１３】
コンピュータ分析を用いた結晶構造の利用可能なデータ（ＰＤＢデータベースエントリー１ＵＢＩ）に基づくと、ユビキチン足場タンパク質におけるこれらのアミノ酸の部位は、表面、すなわち、溶媒または可能な結合パートナーに対して露出される側鎖に局在する。選択された部位は、第１アミノ末端βシート鎖のはじめ（２、４、６部位）、ループ（６２、６３部位）、および、カルボキシ末端βシート鎖のはじめ（６４、６５、６６部位）において、それぞれ空間的に接近して局在化し、それらのアミノ酸側鎖によりユビキチン表面の接触領域が形成される。このようにして、表面が露出した高頻度可変領域が、まだ変化していないユビキチンのタンパク質構造上の分析領域において、ランダムなアミノ酸置換により発生した（国際特許出願／ＥＰ２００４／００５７３０号、未発行）。
【００１４】
βシートタンパク質上での人工的な結合表面の発生は、従来の抗体に対する、新規で興味深い代替性を示す。γ−II−クリスタリンまたはユビキチン様のタンパク質表面における新規で人工的に発生させた結合部位が、結果として、機能性結合分子をもたらすことの証明が得られた（特許文献１）（国際特許出願／ＥＰ２００４／００５７３０号、未発行）。
【００１５】
しかしながら、今まで、２つの成分のうちの１つの機能または両成分の機能の損失を受けることなく、診断、治療および分析応用に有用性を与える複合体を形成するために、他の成分に対してこれらのポリペプチド分子をカップリングすることは示唆がなかった。
【特許文献１】ドイツ公開特許第１９９３２６８８Ａ１号公報
【非特許文献１】Jaenicke, R., and Slingsby, C. (2001). Lens crystallins and their microbial homologs: structure, stability, and function. Crit Rev Biochem Mol Biol 36, 435-499.
【非特許文献２】Wistow, G. J., and Piatigorsky, J. (1988). Lens crystallins: the evolution and expression of proteins for a highly specialized tissue. Annu Rev Biochem 57, 479-504.
【非特許文献３】Blundell, T., Lindley, P., Miller, L., Moss, D., Slingsby, C., Tickle, I., Turnell, B., and Wistow, G. (1981). The molecular structure and stability of the eye lens: x-ray analysis of gamma-crystallin II. Nature 289, 771-777.
【非特許文献４】Kumaraswamy, V. S., Lindley, P. F., Slingsby, C., and Glover, I. D. (1996). An eye lens protein-water structure: 1.2 angstrom resolution structure of gamma B-crystallin at 150K. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 52, 611.
【非特許文献５】Jaenicke, R. (1996). Stability and folding of ultrastable proteins: eye lens crystallins and enzymes from thermophiles. Faseb J 10, 84-92.
【非特許文献６】Najmudin, S., Nalini, V., Driessen, H. P., Slingsby, C., Blundell, T., Moss, D., and Lindley, P. (1993). Structure of bovine gB (g II)-crystalline at 1.47 angstrom. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49, 223-233.
【非特許文献７】Norledge, B. V., Mayr, E. M., Glockshuber, R., Bateman, O. A., Slingsby, C., Jaenicke, R., and Driessen, H. P. (1996). The X-ray structures of two mutant crystallin domains shed light on the evolution of multi-domain proteins. Nat Struct Biol 3, 267-274.
【非特許文献８】Wistow, G., Turnell, B., Summers, L., Slingsby, C., Moss, D., Miller, L., Lindley, P., and Blundell, T. (1983). X-ray analysis of the eye lens protein gamma-II crystallin at 1.9 A resolution. J Mol Biol 170, 175-202.
【非特許文献９】Mayr, E. M., Jaenicke, R., and Glockshuber, R. (1994). Domain interactions and connecting peptides in lens crystallins. J Mol Biol 235, 84-88.
【非特許文献１０】Rudolph, R., Siebendritt, R., Nesslauer, G., Sharma, A. K., and Jaenicke, R. (1990). Folding of an all-beta protein: independent domain folding in gamma II-crystallin from calf eye lens. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 4625-4629.
【非特許文献１１】Sharma, A. K., Minke-Gogl, V., Gohl, P., Siebendritt, R., Jaenicke, R., and Rudolph, R. (1990). Limited proteolysis of gamma II-crystallin from calf eye lens. Physicochemical studies on the N-terminal domain and the intact two-domain protein. Eur J Biochem 194, 603-609.
【非特許文献１２】Jaenicke, R. (1994). Eye-lens proteins: structure, superstructure, stability, genetics. Naturwissenschaften 81, 423-429.
【非特許文献１３】Ling, M. M. (2003). Large antibody display libraries for isolation of high-affinity antibodies. Comb Chem High Throughput Screen 6, 421-432.
【非特許文献１４】Vijay-Kumar, S., Bugg, C. E., and Cook, W. J. (1987). Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution. J Mol Biol 194, 531-544.
【非特許文献１５】Butt, T. R., Jonnalagadda, S., Monia, B. P., Sternberg, E. J., Marsh, J. A., Stadel, J. M., Ecker, D. J. and Crooke, S. T. (1989) Ubiquitin fusion augments the yield of cloned gene products in Escherichia coli. PNAS 86, 2540-2544.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチドと機能性成分との複合体であって、それぞれのポリペプチド分子が、野性型ポリペプチドと比較して変化したリガンドに対する特異的結合のための結合特性を有し、互いに結合した後、前記複合体の両成分が、維持されたそれらの機能、または、このようなカップリングにより増強されたそれらの機能を有する。
【００１７】
本発明の他の目的は、このような複合体が、同定され、調製され、および、その機能特性を試験できることによる方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的は、独立項の主題により達成される。好ましい実施形態は、従属項に見られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、例えば、タンパク質（発色団タンパク質（色素タンパク質）および酵素）、マトリクス（例えば、デキストラン、ポリメタクリル酸、アガロース、セファロース、ポリスチレン誘導体およびセルロース）および小分子（例えば、蛍光標識、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位元素および抗生物質）のような様々な分子に対する、γ−クリスタリンおよびユビキチンに基づく新規結合タンパク質の部位特異的および選択的な非方向性（ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）のカップリングに関する。これらのいわゆるＡｆｆｉｌｉｎ（商標）分子は、タンパク質のβシート構造における結合領域の新たな設計により特徴づけられる。このように、これらは、自然界において結合性タンパク質のもっとも著名な種類である抗体とは異なる。抗体の場合、結合領域は、タンパク質の可動性ループ領域（ＣＤＲ’ｓ）に局在する。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）と抗体との間における他の相違は、分子のサイズである。本発明の複合体の第１成分の基礎として使用される２つのポリペプチドは、それぞれ、分子量２０ｋＤａ（γ−クリスタリン）および分子量１０ｋＤａ（ユビキチン）である。一方、抗体は、１５０ｋＤａ（ＩｇＧ）の分子量である。
【００２０】
本発明は、これらのポリペプチドおよびそれぞれの結合パートナーからの複合体の調製方法、および、異なる応用におけるそれらの使用も含んでいる。また、驚いたことに、これらのカップリング手法は、前記カップリングパートナーの生物学的活性の損失だけでなく、リガンドに対するポリペプチドの結合特性の損失も起こらないという結果を示す。
【００２１】
本発明の具体例として、ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおけるデキストランマトリクス、蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６、色素タンパク質フィコエリスリン（ＰＥ）および西洋わさびペルオキシダーゼ酵素に対する前記ポリペプチド成分のカップリング、ならびに、アフィニティークロマトグラフィーに使用するための支持基材に対するポリペプチドの固定が、記載されている。本発明によれば、前記カップリングは、前記ポリペプチド、例えば、タンパク質の求核性側鎖に対して直接的に、または、Ｃ末端ペプチドリンカーに対するターゲット法により行われた。驚くことに、前記カップリング法は、両方の足場タンパク質に適応でき、これらの分子の結合特性の機能障害を起こさなかった。前記相対的に小さなポリペプチド分子（それぞれ、１０および２０ｋＤａ）が、それらの結合活性を維持したまま、大きなタンパク質、例えば、フィコエリスリン（２４０ｋＤａ）に対して、結合されたことは、特に期待されていなかった。
【００２２】
驚いたことに、この方法において得られた複合体は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）分子の結合能力を制限せず、対照的に、巨視解離定数（アビディティー効果）の増加が、ポリペプチド分子の他の利用可能性（例えば、治療）を与える、ある複合体で確認された。さらに、これらのポリペプチド分子は、水に不溶性のマトリクスにカップリングした後でも、結合活性を示し、尿素、グアニジウム、エタノール、水酸化ナトリウムまたは塩酸のような変性試薬で処置した後に、再生、例えば、前記結合特性が回復されることがわかった。
【００２３】
γ−クリスタリンおよびユビキチンに基づく分子の構造データの詳細な分析は、リジン残基の特別なターゲティングにより、非特異的なカップリング選択を与える可能性を提供した。構造分析は、γ−クリスタリンにおいて、リジンがタンパク質のＣ末端ドメインに存在することを示しており、このため、カップリングに適している（図１）。ユビキチンにおいても、このようなリジン残基の同定は可能であった。しかしながら、これらのカップリングストラテジーを実行する前に、結合領域に別のリジンがないことを、確認しなければならない。
【００２４】
本発明のために、ＩｇＧ Ｆｃ（ヒト由来）またはｐｒｏＮＧＦに対して特異的に結合するポリペプチドが、ヒトγ−クリスタリンライブラリ（ＣＲ２０）から選択され、ＮＧＦ−結合ポリペプチドは、ヒトユビキチンライブラリ（ＵＢ１０）から選択され、これらは続いて精製された。システインを含む規定の長さの特異的なＣ末端ペプチドリンカーの導入により、結合活性の機能障害なしに選択的なカップリングが得られる方法で、ペプチド分子の修飾が可能であった。効果的なカップリングのため、全ての残存する露出システインを除去する必要がある。ポリペプチド分子の非特異的なカップリング方法により、驚いたことに、前記ポリペプチドの結合活性を維持することが可能であり、さらに、アビディティー手段により親和性の向上が達成でき、そのため、診断および治療のための非常に魅力的なポリペプチドベースの分子複合体を調製することが可能となった。
【００２５】
このような代替結合分子は、治療、診断およびクロマトグラフィーにおける多くの使用を見出す。様々なパートナーに対するポリペプチドのカップリングにより、使用の幅広い分野が、これらの新しい結合分子のために提供されるであろう。
【００２６】
本発明は、特に下記の側面と実施形態を含む。第１の側面によれば、本発明は、下記の成分を含む複合体に関する。
ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づく１以上のポリペプチド（Ｉ）であって、対応する野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させた、リガンドに特異的に結合するための結合特性をそれぞれ有するポリペプチドと、
それに共有結合的に結合される１以上の機能性成分（II）とを含み、
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリング後、全ての成分の機能性が維持されている、複合体。
【００２７】
言い換えれば、本発明の複合体は、ユビキチンまたはγ−クリスタリンを野生型の形態では含まないが、特異的なリガンドに適応した形態でのみ含む。この特異的に適応した形態は、野生型の形態と比較して、変化させた（向上させた）または新たに発生させた、各リガンドに対する結合特性を提供する。γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチドの共通の原理として、両方において、関心のあるリガンドに対する特異的な結合を可能にするため、βシート構造上に人工的な結合表面を発生させることが指摘されるだろう。そこで、人工的な結合表面を提供するための少なくとも１つのβシート構造の存在は、本発明の必須の特徴である。
【００２８】
この状況において、複合体とは、翻訳後の、他の成分へのポリペプチド分子の共有結合を意味し、このため、例えば、遺伝子レベルにおけるポリペプチドの融合とは異なる。融合ポリペプチドは、いわゆる融合の結果である。
【００２９】
本発明によれば、ユビキチンに基づく前記ポリペプチド分子は、ユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質、ならびに、それらの断片または融合タンパク質からなる群から選択されることが好ましい。前記断片または融合タンパク質は、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖および任意に非βシート領域を含むタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域における１以上のアミノ酸修飾による、ユビキチン様折りたたみモチーフを有する。前記タンパク質は、それぞれ、所定の結合パートナーまたはリガンドに対する結合親和性を有しており、前記結合親和性は、ユビキチン様折りたたみモチーフが保持されなければ、存在しない。
【００３０】
従って、本発明は、それぞれユビキチン様折りたたみモチーフを有する、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質、および、それらの断片または融合タンパク質からなる群から選択されたものが、置換、挿入、欠損、化学的修飾または結合により修飾されたタンパク質を含む。この修飾によって前記タンパク質は、以下の方法により得られる前には存在しなかった、所望の結合パートナーに関する結合親和性を示す：
ａ）修飾されたタンパク質の選択
ｂ）結合パートナーの決定
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖および任意に非βシート領域を含むタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の選択
ｄ）ユビキチン様折りたたみモチーフが保持される間、置換、挿入、欠損および／または化学的な修飾により、選択されたアミノ酸の修飾
ｅ）工程ｂ）において決定された結合パートナーへの前記修飾タンパク質の接触
ｆ）工程ｂ）において決定された結合パートナーへの結合親和性を有するタンパク質の検出
【００３１】
さらに、前述のユビキチンに基づく修飾タンパク質の製造およびこれらの修飾タンパク質の使用のための各方法が、記載されている。
【００３２】
従って、本発明の複合体において、使用されるユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）は、本出願において言及されるユビキチン様折りたたみモチーフをそれぞれ有するタンパク質またはポリペプチドの修飾により調製されることが好ましい。これらは、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折りたたみモチーフを有する全てのタンパク質、ならびに、ユビキチン様モチーフを有していることを条件に、これらのタンパク質の断片または融合タンパク質を含む。これらの各タンパク質またはポリペプチドを基準として、本来のタンパク質またはポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸が修飾される。特に、前記修飾は、アミノ酸の置換だけでなく、少なくとも１つ以上のアミノ酸の挿入および欠損、ならびに、アミノ酸の化学的な修飾を含んでいる。これらの修飾は、タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域において、修飾されることで行われる。少なくとも１つのアミノ酸の修飾は、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖を含む。前記βシート鎖は、前記結合パートナーまたはリガンドのそれぞれに接近（露出）するために、前記タンパク質の表面に局在しなければならず、決定され得る親和性により、前記修飾タンパク質に結合することが可能である。本発明の別の実施形態において、βシート領域のβシート鎖における前記変異に加えて、非βシート領域もまた、修飾される。好ましくは、影響を与えるため、特に、予定された結合パートナーに対する結合親和性を増加させ、これにより特異性を増強させるために、表面が露出されていることが好ましい。
【００３３】
１つ以上のアミノ酸の修飾のため、本来公知の様々な技術が、当業者に利用可能である。これらは、下記において、より詳細に述べられるであろう。加えて、Ａｕｓｕｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９の刊行物を参照にすることが可能である。
【００３４】
前記ユビキチンの非表面露出のコア領域のアミノ酸の修飾は、既に公知である（Ｆｉｎｕｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ここでの変異は、溶媒や可能性のある結合パートナーに接近することができないため、疎水性コア内の局在に起因して、結合に関与しない部位を対象とする。
【００３５】
“前には存在しなかった結合特性”、“新規に産出された人工的な結合部位”および“野生型タンパク質と比較して変化させたリガンドへの特異的な結合のための結合特性”という用語の意味は、それぞれ、本発明の文脈において、下記のように説明できる。これらの用語は、修飾された領域における修飾タンパク質が、予定された結合パートナーまたは前記ユビキチンの本来の結合パートナーに対する結合特性をこれまで示していないことを意味すると解される。
【００３６】
リガンドとして定義できる前記結合パートナーは、本発明における前記修飾タンパク質に対する測定可能な親和性を有する。本発明によれば、形成された複合体の解離定数ＫＤ＝１０−５Ｍ以下は、定量化できる結合特性の存在、すなわち、パートナーが結合される親和性の存在のための最小値として見なすことができる。応用に依存して、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍの値が好ましく、より好ましくは、例えば、クロマトグラフィーへの応用には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍの値、または例えば、診断もしくは治療への応用には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍの値である。さらに好ましい結合親和性は、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲、好ましくは、１０−１１Ｍまでである。前記結合親和性の決定方法は、本来公知であり、以下においてさらに述べられる。
【００３７】
本発明における修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠損または化学的な修飾を意味することを意図している。
【００３８】
本発明における修飾されたタンパク質として、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質が使用できる。本発明によれば、このスーパーファミリーは、Ｍｕｒｚｉｎら（１９９５）においてリストアップされたサブグループを含む。これらは、例えば、前記“ユビキチン関連タンパク質”、“ＵＢＸドメイン”、“ＧＡＢＡＲＡＰ様”、“ＲＡＳ−結合ドメイン”等のタンパク質ファミリーを含んでいる。好ましくは、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーのタンパク質が使用される。本発明によれば、それらのタンパク質は、ユビキチン様折りたたみモチーフを有するタンパク質からなる。これらの例は、ＳＵＭＯ−１、ＦＡＵ、ＮＥＤＤ−８、ＵＢＬ−１およびＧＤＸならびにＲｕｂ１、ＡＰＧ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＨＵＢ１、エロンギンＢ、ＰＬＩＣ２（Ｎ−末端ドメイン）、ヒトのパーキン（Ｎ−末端ドメイン）である。
【００３９】
本発明において、ユビキチン様タンパク質のスーパーファミリーから使用できるタンパク質は、高い範囲に特徴付けられる。参照の例でしかないが、下記のインターネットサイト、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｐ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｃｏｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに示されている。このサイトによれば、ユビキチン様タンパク質のファミリーは、前記ユビキチン関連タンパク質のファミリーが属するスーパーファミリーとして定義されている。このスーパーファミリーの全てのメンバーは、第１に、逆平行に配置しているβシートにより特徴付けられ、αおよびβセグメントに細分化される。その折りたたみは、β−Ｇｒａｓｐおよびユビキチン様として定義される。そのコア領域は、下記に定義されるβ（２）−α−β（２）であり、前記数字は、鎖の数を示し、鎖の全体がβシートを形成する。前記シートを左から右まで（底部のアミノ末端、頂部のカルボキシ末端）見ると、鎖の部位に関して、混合されたβシートは、２１４３通りもある。このように、ユビキチン様タンパク質のメンバーの特徴は、そのトップにおいて垂直に横たわってパックされているα−ヘリックスの背面上で、タンパク質の一表面に露出された逆平行βシートである。このユビキチン様折りたたみモチーフは、本発明において使用でき、また、修飾できるタンパク質の特徴であり、他のタンパク質からのファミリーメンバーを明確に区別できる。この定義の点において、ＰＬＩＣ―２のユビキチン様Ｎ末端ドメインおよび前記パーキンのユビキチン様ドメインは、本発明により含まれる。
【００４０】
当業者は、配列比較、いわゆる、アライメントを用いることによって、または、構造の重ね合わせ法により、前記タンパク質が、ユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるか否かを、予備的に判断できる。当然、最新の証拠は、たいてい、構造分析、例えば、Ｘ線結晶学または多次元的な核磁気共鳴分光法による構造分析によって提供される。近年、遺伝学的なアルゴリズムを用いる構造分析も、また、良好な予測を成し遂げてきている。
【００４１】
ユビキチンスーパーファミリーに関するさらなる情報が、例えば、Ｌａｒｓｅｎの２００２年の刊行物において見いだされる。加えて、Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌの２００１年の刊行物も参考になる。Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒは、β−β−α−β−β−α−β構成、すなわち、２１５３４配置における“混合シート”のフォームにおける５つのβ鎖の配置の２次構造を有するユビキチン様タンパク質の特性として、典型的なβ Ｇｒａｓｐフォールドを述べている。この点において、ＵＢＸが、例えば、ユビキチン（Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）の１次配列において、有意な相同性を有さないにも関わらず、三次元構造が、例えば、ユビキチンと同一であるために、前記ユビキチン様タンパク質に分類されると指摘された。この点において、ユビキチンにおける、４８番目および４９番目のアミノ酸は、時々、別々のβ鎖として考えられる（非特許文献１４）。この５番目の鎖は、前記ユビキチン構造において、前記へリックスの後方に局在し、前記２１５３４配置における“混合シート”を提供するであろう。しかし、２つのアミノ酸のみからなる構成が、実際のところ、２つのアミノ酸のこの鎖が、βシート鎖と呼び得るか否かは疑わしい。Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）によれば、上記で説明した通り、２１５３４の配置を有するタンパク質もまた、ユビキチン様タンパク質のスーパーファミリーに問題もなく分類され得た。本発明において、上記でより詳細に述べられた２１５４３の定義が、ユビキチンにおける前記β鎖の配置に選択された。
【００４２】
前述したファミリーおよびスーパーファミリーのタンパク質は、通常、高く保存されている。既知のデータによれば、前記ユビキチンは、例えば、全ての哺乳動物において、同一のアミノ酸配列を有している。酵母のユビキチンは、この配列と三つのアミノ酸が異なるのみである。ヒトのユビキチンまたは哺乳動物のユビキチンは、それぞれ７６個のアミノ酸からなり、最初に述べた構造を有している。
【００４３】
本発明において用いられる修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列において、修飾される元のタンパク質、例えば、前記ヒトユビキチンに対して、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０または５０％、さらに好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有しており、どのような場合でも、前記タンパク質は、上記で述べたユビキチン様折りたたみモチーフを有している。
【００４４】
本発明によれば、修飾タンパク質の調製のために選択される前記タンパク質は、好ましくは、ヒトのユビキチンまたは異なる起源のユビキチン、例えば、異なる哺乳類のユビキチンである。前記哺乳類のユビキチンとして、特に、哺乳類の分野における、げっ歯類、家畜および農業用の動物のユビキチンが、用いられる。本発明によれば、前記調製したタンパク質の使用分野は公知であり、すなわち、前記修飾タンパク質が、例えば、ヒトの疾病の治療のために薬学的な組成として用いられる場合、ヒトのタンパク質が、修飾される元のタンパク質として用いられることが好ましい。同様の方法において、これは他の分野にも使用される。
【００４５】
前記ヒトおよび哺乳類のユビキチンは、それぞれ、７６個のアミノ酸を有している。ＰＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）における１ＵＢＱの構造によれば、逆平行βシートの形成に寄与するβ鎖の４つのアミノ酸は、本発明によれば、下記のアミノ酸部位である。
【００４６】
第１の鎖（Ｎ末端）：２〜７番目；第２のβシート鎖：１２〜１６番目；第３の鎖：４１〜４５番目；第４の鎖（Ｃ末端）：６６〜７１番目。前記シートを頂点（底面のアミノ末端、頂点のカルボキシ末端）から、または左から右に見た場合、前記鎖の部位は、第２、第１、第４、第３番の鎖であり、第１と第４の鎖の間において、ポリペプチド鎖は、αへリックスを形成する。
【００４７】
修飾のための前記アミノ酸の選択および修飾
【００４８】
例えば、無料で使用できるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（商標）（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）のような、対応する構造データに基づき、側鎖が表面に露出された、すなわち、溶媒または可能性のある結合パートナーに配向した、開始タンパク質（例えば、ユビキチン足場タンパク質）におけるアミノ酸を、コンピュータ分析手法により局在化できる。さらに、おそらく、ランダム置換が足場タンパク質の安定性にネガティブな影響を与えない、または、わずかの影響である、開始タンパク質（例えば、ユビキチン等）におけるこれらのアミノ酸を、コンピュータ分析により同定できる。
【００４９】
この情報は、結合部位の要素として、各アミノ酸の適正に関する最初の指示を提供でき、それから、実際の試験を必要とする。本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、前記ヒトのユビキチンにおける２、４、６、６２、６３，６４，６５および６６番目のアミノ酸が、それらの表面への露出、および、それらのランダムな置換のための構造全体の耐性のために、選択された。
【００５０】
前述した部位は、第１のアミノ末端βシート鎖（２、４、６番目の部位）の開始部、および、前記ループ（６２、６３番目の部位）またはカルボキシ末端βシート鎖（６４、６５、６６番目の部位）の開始部において、それぞれ互いに空間的に近接して局在し、アミノ酸側鎖により、前記ユビキチンの表面における近接領域を形成する（図１）。分析された領域におけるランダムなアミノ酸置換（ランダム化）の方法により、抗体の高原結合部位と類似する形態で、ユビキチンの他の無処理の構造上の超可変領域の表面露出領域が産出される。
【００５１】
ＰｒｏＳＡIIソフトウェア（“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”；Ｐｒｏｃｅｒｙｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ザルツブルグ）を用いることで、例えば、ユビキチン（ＷＴ）と比較したタンパク質安定性が、１０４通りの変異について、また、“コントロールエピトープ”の残基（ランダム化部位２４、２８、３１、３２、３５、３７、３８、３９）が置換されたランダムに得られた同数の変異体サンプルについて、決定された。この場合、結合部位の領域においてランダムに置換された、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで産生された変異体の約１９％は、少なくともユビキチン（ＷＴ）の安定性と同じ程度の安定性を有している。一方、約９０％は、“コントロールエピトープ”の安定性よりも安定である（図２）。このコンピュータに基づく結果は、適切なアミノ酸の選択のための基礎として用いられ得る。
【００５２】
前記ヒトのユビキチンの利用可能な構造データをはじめとして、産出される結合部位の領域における８つのアミノ酸部位は、最初に選択されることが好ましい。この領域における１次配列のランダム変異（ランダム変異誘発）の方法、および、後の特異的な選択により、それらの変異が得られた。これらは、予定されたハプテンもしくは抗原、または、一般的に予定された結合パートナーの、それぞれに対する所望の結合活性を示した。この方法において、新規の結合特性は、結果として修飾されたタンパク質により与えられるが、その構造およびタンパク質の化学的な特性は、元のタンパク質と高い度合いで同一のままである。そのため、例えば、小型、高い安定性、コスト効率の調整、ならびに、前述のリガンドに対する高い親和性と特異性による互いの容易な修飾というような利点を発揮する。この観点において、人工的な結合タンパク質の産出のための足場構造としてのユビキチンの安定性は、１）ユビキチンが小型なために、多数のアミノ酸置換についての足場の耐久性は、予期できず、また、２）硬く、柔軟性がないと考えられるβシートを含む人工的な結合部位の機能性は、あらかじめ可能とは考えられなかったため、予期されなかった。
【００５３】
代わって、本発明によれば、γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子が用いられる。
【００５４】
初めに述べたように、脊椎動物のクリスタリンの１分類であるγ−クリスタリンは、約２２ｋＤａの分子量を有する単量体タンパク質である。γ−クリスタリンの主要な構造的なモチーフは、逆平行のβシートである（Ｈａｚｅｓ ａｎｄ Ｈｏｌ，１９９２，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｅｍｍｉｎｇｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。γ−クリスタリンは、２つの非常によく似た球状ドメインからなり、一方のＮ末端ドメインと他方のＣ末端ドメインとが互いにＶ型リンカーペプチドによって結合している。γ−クリスタリンの折りたたみパターン特性は（“グリークキー”モチーフ、Ｓｌｉｎｇｓｂｙ，１９８５，特許文献２）は、おそらく、十分な熱安定性、および、変性試薬に対する安定性（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）の理由である。
【００５５】
通常の折りたたまれた状態において、γ−II−クリスタリンは、どのような結合特性も示さない。βシート構造モチーフからなるこのタンパク質の、選択された溶媒に曝される領域の変異（変異誘発）は、驚いたことに、前記タンパク質の表面構造の変化および電荷（ｃｈａｒｇｅ）パターンの変化をもたらし、このため、新しい結合特性を発生する。この場合、タンパク質の構造の維持には実質的には寄与しない領域またはアミノ酸部位のみが選択される。小型βシートタンパク質の変異誘発（Ｒｉｄｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、後の配列変異にかかわらず、タンパク質の高いパーセンテージが、βシートの元の構造を形成し得ることを示している。
【００５６】
ここで述べた方法において、標的変異誘発は、βシートの硬い領域においてどのような結合特性も欠損しているタンパク質について行われる。このように、抗体分子と比較可能な、十分な安定性および特異的な結合特性を持つタンパク質が産出されている。
【００５７】
前記ファージディスプレイシステムは、新しく産出された結合特性を有する変異誘発されたβシートタンパク質の単離に適したシステムとして働く。前記システムは、特異的な結合特性のためのタンパク質変異体の幅広いレパートリーを、非常に効果的にスクリーニングすることが可能である（Ｓｍｉｔｈ，１９８５）。この目的のために、各タンパク質変異体は、繊維状ファージの表面上に準備され、固相に固定された標的分子に作用できる。前記標的分子に結合するタンパク質は、前記ファージの溶出により得られる。ファージＤＮＡの単離後、特異的に結合するタンパク質変異体のＤＮＡ配列を決定できる。前記ファージディスプレイシステムの他に、例えば、細菌ディスプレイ（Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のような他の選択システムを用いても良い。
【００５８】
前述の工程の方法により、驚いたことに、非結合タンパク質を特異的な結合特性を有するタンパク質に変異させるという方法で、例えば、βシートにおける標的部位特異的な変異誘発法により、非常に安定なβシートタンパク質γ−II−クリスタリンの変異が可能である。このように、８つのアミノ酸部位のランダム化により、最初に、タンパク質の相対的に硬い領域内で、足場分子に変異誘発が行われる。従って、特異的な結合特性に関して“抗体様”タンパク質種は、βシートタンパク質であるγ−II−クリスタリンから調製される。一般的に、γ−II−クリスタリン、または、他の小型で安定なβシートタンパク質は、新しい結合特性を設計するための新しい足場分子として、述べたられた方法とともに使用できる。モデル化された前記βシートタンパク質は、例えば、別の応用において、組換え抗体の代替となりうる。
【００５９】
この点において、他のより詳細な情報は、それら全体における参照により本明細書中に取り込まれる国際公開ＷＯ０１／０４１４４号パンフレットにおいて確認できる。
【００６０】
ここで定義される“リガンド”という用語は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づくポリペプチド分子により、特異的に結合される物質に言及される。
【００６１】
この結合パートナー、いわゆる、リガンドとしては、生化学的、生物工学的、診断的および治療的に関係する分子全てが用いられる。可能性のあるリガンドのリストは、ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、ウイルスタンパク質、および、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４のような細胞表層マーカー）、ペプチド（例えば、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグのようなアフィニティタグ、および、ウイルス由来のペプチド）、低分子量物質（例えば、ステロイド、コレステロールおよびハロゲン化炭化水素のような有毒物質）、脂質（例えば、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質）、糖（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｙのような細胞表層マーカー）、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、有機および無機ポリマー、ならびに、これらの物質の誘導体を含んでいる。この点において、下記で述べた好ましい実施形態を参照する。
【００６２】
ここで用いられる“機能性成分”という用語は、前記γ−クリスタリンまたは前記ユビキチンに基づいたポリペプチド分子に共有結合的に結合する複合体の第２の成分と定義する。“機能性”という用語は、診断、治療、クロマトグラフィーおよび分析における使用に適した成分、あるいは、すでに知られている成分を意味すると解される。一般的に、“機能性成分”は、例えば、酵素活性、分光学的に測定可能な特性または毒性等の測定可能な特性を有するあらゆる成分として定義される。それとは別に、本複合体における機能性成分の構造および機能は、制限されない。唯一必要なのは、前記ポリペプチド分子と前記機能性成分との共有結合後、全ての成分の機能性が維持されていることである。前記ポリペプチド分子の場合、この機能性は、特異的なリガンドへの結合能力であり、前記機能性成分の場合、例えば、染料としてのその効果である。
【００６３】
本発明によれば、１以上、例えば、２つの機能性成分がポリペプチド分子に結合することができる（上記で規定）。前記ポリペプチド分子に対して前記成分が特異的な結合を達成するために、例えば、成分の一方は、リジン残基に対して特異的に結合するように形成され、他方は、前記ポリペプチド分子におけるシステイン残基に対して特異的に結合するように形成される。このタイプの２つの成分の例は、蛍光染料であり、一方が、蛍光供与体として働き、もう一方が、蛍光受容体として働く。
【００６４】
前記成分の結合特性、および、好ましく用いられる前記結合成分の詳細は、以下に述べられている。
【００６５】
リガンドに対するポリペプチド分子の結合活性、および、カップリングパートナー（機能性成分）の活性の検出は、上記で述べた通り、重要な特徴である。リガンドへに対する結合活性の検出は、異なる方法によって行うこともできる。ＥＬＩＳＡ技術において、結合は、抗体−ペルオキシダーゼ複合体の手段により検出されるのに対して、前記Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、検出のために、表面プラズモン共鳴現象を利用する。蛍光滴定、蛍光偏光法または蛍光相関分光法（ＦＣＳ）のような他の技術は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）のフルオロフォアの特性に基づいている。カップリングパートナー、いわゆる、機能性成分の活性の検出のために、それらの公知の特性は重要である。このように、蛍光染料もしくはフィコエリスリンのような発色団またはフルオロファア分子は、それらのスペクトル特性の手段により分析される。ペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼのような酵素は、モデル物質のターンオーバーにより検査される。毒素のような他の分子は、細胞培養実験において、直接的に生物学的活性を試験できる。放射性同位元素の場合、その放射能は、適切なカウンターを用いて測定できる。糖および核酸のような様々な他の分子のために、商用的に利用可能な検出試薬がある。
【００６６】
一実施形態において、上述の通り、野生型ポリペプチドと比較して、新しく産出されたまたは変化させた結合特性は、前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域における１つ以上のアミノ酸置換に基づく。この目的のために、前記ポリペプチド分子（Ｉ）当たり約６〜１０、好ましくは８つのアミノ酸が置換される。このことは、ユビキチンおよびγ−クリスタリンに基づく前記ポリペプチド分子（Ｉ）に等しく適用する。
【００６７】
前記（Ｉ）の（II）へのカップリングは、リガンドに対する特異的な結合を対象とするポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域の外側領域において、行われることが好ましいことを指摘できる。このように、本発明の複合体に対する重要な必要性が、すなわち、全成分の機能の維持が達成されることがわかる。
【００６８】
ここでは、リガンドに対する結合表面の外側、より正確には、ｄｅｎリガンドへの結合に関与するβシートの外側に局在するユビキチンの２９、３３番目のリジン（２９、３３番目のリジンは、αへリックスに局在する）へのカップリングを一例として示す。リガンドに対する結合部位から離れて位置する、このアミノ酸残基側鎖を介するカップリングは、複合体の成分の機能的障害を導かない。
【００６９】
この点において、特に、リガンドに対する特異的なカップリングのための新しく産出された、または、変化された結合特性を有する前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの外側領域において、前記（Ｉ）の（II）への結合が行われることが好ましい。前述の場合、この領域は、例えば、ユビキチン分子のαへリックスであり、または、γ−クリスタリンに関して、βシートの他（すなわち、前記βシートは、リガンドへの結合に関与しない）である。特に、クリスタリンのＮ末端ドメイン（βシート）は、リガンドに対する新たに産出された結合表面を有していることが、図１から明らかであり、リジン残基は、Ｃ末端部位（ハイライト）は、機能性成分（II）とのカップリングに適している。
【００７０】
一実施形態によれば、前記（Ｉ）の（II）に対するカップリングまたは連結は、それぞれ、（Ｉ）のアミン酸残基を介して生じる。言い換えれば、前記カップリングは、前記ポリペプチド分子（Ｉ）自体に存在するアミノ酸残基を介してなし遂げられる。
【００７１】
この場合、前記カップリングは、前記（Ｉ）のシステインまたはリジン残基鎖を介して、部位特異的または選択的に非配向性（非方向性）の方法で、行われる。ここで、“部位特異的に”という用語は、正確に規定された部位を定義するために、前記分子（Ｉ）における的確に規定された部位に、システインまたはリジンが存在または導入されることを意味する。“選択的に、非配向性（非方向性）の方法”とは、このような残基が数個存在し、選択的に起こるけれども、これらの残基に結合する数が、あるランダムファクターに支配されていることを意味する。
【００７２】
本発明の複合体の２つの成分のカップリング、すなわち、それらの共有結合に関して、下記の説明が与えられる。
【００７３】
タンパク質は、多数の官能基を含んでおり、それにより、他の分子へのカップリングが達成できる。これらの明確な例示は、下記で述べる。例えば、適切な架橋結合試薬を介したパートナーとの共有結合により、１つの分子において、異なる活性を組み合わせることが可能である。一例として、抗体について述べる。前記抗体は、染料分子に結合し、このように、後に診断に使用できる、容易に検出可能な検出試薬の提供が見出されている。
【００７４】
類似の方法において、抗体は、他のタンパク質、好ましくは、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼのようないわゆるレポーター酵素と結合される。これらのレポーター酵素は、基質を変換し、それによって、吸光、蛍光または発光により検出されるシグナルを得ることができる。
【００７５】
適切な架橋結合試薬の選択により、タンパク質、すなわち、本発明のポリペプチド分子を、多くの他の基質クラス由来の他の機能性成分に結合させることができる。有機および無機ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖ならびに低分子量物質の多数もまた、この目的のために使用できる。前記ポリマーの分類からの好ましいカップリングパートナーは、例えば、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリスチレン、ポリビニル、シリカゲル、セルロースまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。後者の修飾は、例えば、生物学的治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の薬物動態学的特性の調節のために用いられる。適切かつカップリングのための予め活性化された官能基を有するＰＥＧ誘導体の多くは、商用的に入手できる（ネクタール Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）。先で述べた前記他のポリマー材料は、多くの生化学的、生物工学的および治療方法において、キャリア物質として働く。特に、ここでは、例えば、クロマトグラフィーへの応用、特に、親和性クロマトグラフィーについて述べる。これらのポリマー物質は、ゲルマトリクスとして用いられる。この目的のために、適切な化学基を有するポリマービーズの表面は、機能化され、例えば、所望の活性でタンパク質のカップリングが可能となるように活性化されている。この方法において、特定のリガンドに対する特異性を有する結合タンパク質もまた、固定される。その結果、ゲルマトリクスは、複雑な基質混合物からのリガンドを有効かつ迅速に濃縮するために使用できる。この濃縮は、カラムクロマトグラフィーまたはフィルター表面によっても行うことができる。さらに、磁力特性を有し、混合物から効率的に分離できるポリマービーズ（磁力ビーズ）も、親和性向上のために、有利に用いられる。
【００７６】
重要な一例は、マトリクス結合タンパク質Ａ（抗体分子に対して固有親和性を有する細菌タンパク質）に対するアフィニティークロマトグラフィーにより、真核細胞の上清から、治療目的のために抗体をラージスケールで精製する例である。
【００７７】
前述の抗体−レポーター酵素融合体の他に、２つのタンパク質成分のカップリングの例は、多数ある。従って、最も簡単なケースの一例として、ホモ２量体またはホモ多量体が、２以上の同一タンパク質分子のカップリングにより産出できる。
【００７８】
前記結合タンパク質の場合、アビディティー効果は、多量化により達成できる。すなわち、標的物質に対する多量体の親和性は、単量体の結合タンパク質の親和性と比較して、著しく増加する。また一方、異なる標的物質に対する特異性を有する２つの結合タンパク質のカップリングにより、例えば、互いに空間的に近接で、各ターゲット物質を運ぶアダプターとして使用できる、いわゆる２特異性結合分子が得られる。
【００７９】
生細胞に対して毒性を有するタンパク質、いわゆる、毒素（例えば、ヒマ毒、コレラ毒素、シュードモナス属の菌体外毒素等）もまた、抗体または他の結合分子に対する興味深いカップリングパートナーになる。カップリングに続いて、この２機能複合体は、例えば、ガン細胞の表面において、前記結合タンパク質を介して、特異的なターゲット物質と選択的に結合でき、その後、ターゲット細胞は、細胞毒活性により破壊される。
【００８０】
タンパク質の性質に関連する他のカップリングパートナーは、例えば、ＧＦＰおよびその誘導体のようなタンパク質発色団、または、フィコエリスリンのような色素含有タンパク質である。十分に検出可能なレポーター物質があると、結果的に得られる発色団または蛍光カップリング産物自体が、研究または診断の有用なツールとなる。
【００８１】
一方、既に前述したが、色素または蛍光タンパク質複合体もまた、低分子量染料分子のカップリングにより入手できる。架橋結合基を有する適切な染料分子の多くは、商用的に、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。診断および治療で使用するための、タンパク質複合体を得る他の低分子量カップリングパートナーは、例えば、ビオチン、ジゴキシジニン、重金属誘導体、キレート試薬、放射性同位元素、細胞毒物質または抗生物質である。
【００８２】
本発明において、タンパク質およびポリペプチド分子、ならびに、主にカップリングに適した機能性成分に含まれる官能基は、アミノ基、カルボキシ基、水酸基およびスルフヒドリル基である。また、チロシンのフェノール基も官能基であり、芳香環系は、カップリング試薬の攻撃のための部位として働き得る。カップリングに適したアミノ酸残基は、特異的な性質により特徴付けられる。一方では、前記カップリング試薬に露出可能な反応性側鎖を有する必要がある。理想的なケースでは、この官能基は、タンパク質表面に局在し、溶媒に曝される。さらに、この残基の修飾は、タンパク質の機能を妨げない。好ましくは、本発明において、修飾される残基は、酵素の活性部位またはポリペプチドの結合表面から著しく離れている。さらに、これらの領域は、同型のアミノ酸残基の空隙でもあり、修飾されるとタンパク質の機能を損ない得る。従って、利点は、それぞれのタンパク質のまれなアミノ酸残基でもある。
【００８３】
前述のように、ユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）にとって、ユビキチン分子の２９番目および３３番目のリジン残基を介したカップリングが、好ましいと考えられる。より好ましくは、前記２９番目および３３番目の残基より、リガンドに対する結合表面にさらに短い距離で局在している１１番目および４８番目のリジン残基を介したカップリングが可能である。
【００８４】
前記γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）の場合、野生型ポリペプチドと比較して、新たに産出または変化されたリガンドに対する特異的な結合のための結合特性を有するペプチドドメインは、Ｎ末端ドメインであり、前記（II）対する（Ｉ）のカップリングは、Ｃ末端ドメインを介して行われる。これは、好ましくは、システインを含むＣ末端ペプチド融合の可能性に適用し、また、Ｃ末端ドメインに存在し、且つ、前記機能性成分に対するカップリングのために利用可能なリジンのようなアミノ酸側鎖にも適用できる。前記γ−クリスタリンの９１番目および１６３番目の残基が使用されることが好ましい（図１参照。）。
【００８５】
非タンパク質構成（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸の中で、まず、側鎖にε−アミノ基を有するリジン、および、スルフヒドリル機能を有するシステインについて指摘する。特に、これらの官能基は、反応性があるため、本発明において、機能性分子に対するポリペプチド分子の特異的なカップリングのためのパートナーとして非常に適している。このため、スルフヒドリル基のみと特異的に反応する試薬、ひいては、例えば、マレインイミド、ヨード酢酸、ヒドロキシメルクリ安息香酸、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬等の本発明において使用できる試薬が、文献に開示されている。さらに、他の例も、Ｖｏｅｔ＆Ｖｏｅｔ（１９９５）およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ＆Ｚｏｒｂａｓ（１９９８）のような各文献において記載されている。
【００８６】
例えば、酸無水物（本発明でも使用できる無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等）のようなリジン特異的側鎖試薬も、多数述べられている。それらの反応性に加えて、リジンは、カップリングのための他の有利な特性を有している。その側鎖は荷電しているため、ほとんどが、タンパク質の表面に局在している、すなわち、生物系において、溶媒（主に水）に露出することができる。この露出度も、前記カップリング試薬に必要であり、このため不可欠である。
【００８７】
タンパク質において、表面に露出した遊離システインは、相対的にまれであり、細胞外タンパク質において、これらのシステインのほとんどは、２量体の相互作用を安定化するジスルフィド結合に関与する。しかしながら、含まれるシステインが修飾を受け易い状態になるために、ジスルフィド結合は、還元によって切断され得る。本発明におけるポリペプチド分子が、カップリング試薬に露出可能なシステインを含まない場合、変異誘発により、適切な部位にこのような残基を導入することができる。この点において、カップリングに適した表面に露出されたアミノ酸部位の予測を促進することから、タンパク質の空間的構造の知見は、有利な知見である。また一方、数個のシステイン残基が、部位特異的カップリングを生じるタンパク質に存在する場合（定義されたシステイン残基、上記参照）、部位直接的変異誘発法により、これらを除去するのは不可能である。この場合、システイン残基と類似の性質を有するセリン残基による置換が、好ましい。
【００８８】
また、対象のタンパク質配列における変異誘発により、カップリングに適切なアミノ酸残基を得ることは、しばしば不可能である。タンパク質が、アミノ酸残基の挿入、または、カップリングに適したアミノ酸残基を含むＮ−末端もしくはＣ−末端のペプチド配列での融合を許容する場合、遺伝学的なレベルでこれらの部位に導入され得る。
【００８９】
従って、他の実施形態において、前記（II）に対する（Ｉ）のカップリングは、（Ｉ）に対する付加的な末端ペプチド融合におけるアミノ酸残基を介して行われる。
【００９０】
これらの末端ペプチド融合の露出度の試験は、例えば、発色特性を有する側鎖特異的なカップリング試薬、例えば、システイン用のＥｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬の使用により行うことができる（前記例示参照）。他にも、前記末端ペプチド融合の露出度は、それらの長さにより制御することができる。ペプチド融合の場合、例えば、結合用のアミノ酸側鎖とタンパク質との間へのいわゆるスペーサーの挿入により、結合用のアミノ酸側鎖の露出度の増加が可能である。ペプチド融合の場合、これらは、付加的で不活性なアミノ酸残基ある。サイズが小さく、非常に柔軟な構造であると想定できるため、特に、グリシンおよびセリン残基が適している。
【００９１】
カップリング試薬に対して露出可能であるタンパク質の官能基の数に依存して、カップリングの特異性が異なるタイプに区別できる。例えば、システイン特異的カップリング試薬を使用した場合、システイン残基のみが選択的に反応するが、例えば、数個のシステイン残基が存在する場合、カップリングの正確な部位は、決定できない。これは、選択的であるが、非配向性（非方向性；ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）のカップリングと呼ばれる。しかしながら、カップリング試薬に対して露出されるシステインが１つだけ存在する場合、カップリングは、部位特異的に生じる。
【００９２】
適切なカップリング試薬の多くは、商用的に入手できる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社）。本発明において、使用できるカップリング試薬の特異的な形態は、架橋剤または単にリンカーと呼ばれる（Ｈｅｒｒｍａｎｎ＆Ｍｏｒｓｅ，１９７３；Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９７５；Ｒｅｉｃｈｌｉｎ，１９８０）。
【００９３】
リンカーは、共有結合により２つ（またはそれ以上）の分子を結合する物質として定義される。リンカーは、２つ（またはそれ以上）の反応性（活性化された）官能基を含み、その空間的距離は、それらに結合する化学基によってさらに制御できる。異なる官能基を有するヘテロ−２官能性リンカーと対象的に、同一の官能基を有するリンカーは、ホモ−２官能性と呼ばれる。そのため、リンカー物質の適切な選択により、完全に異なる物質類を互いに結合することも可能である。
【００９４】
本発明において、使用できるリンカーの一例として、ＳＰＣ１−Ａ７＿ＣｙｓのＣ末端部位を参照できる（表２参照）。
【００９５】
しかしながら、例えば、タンパク質の二量化におけるジスルフィド結合の形成のような、タンパク質のカップリングの特異的なケースは、活性化されたリンカーを必要としない。酸化的条件下、スルフヒドリル残基は、ジスルフィドを形成するため、すなわち、２つの硫黄原子の間の共有結合のために、十分に高い反応性を有している。
【００９６】
本発明において、カップリング反応は、１工程反応として、または、複数工程においても、行うことができる。２つの同一分子の単なる二量体化の場合、それぞれが１つの反応性残基のみを有していれば、定義された複合体を得るためのホモ−２官能性リンカーを用いて、カップリング成分とインキュベートするだけで充分である。異なる反応基を有する異なるカップリングパートナーの場合も、前記１工程反応は、適したヘテロ−２官能性リンカーを用いてのみ可能である。
【００９７】
代わりに、同一の反応基を持つ異なる結合パートナー（反応体）の間でのカップリングもまた、複数工程において行うことができる。この目的のため、ほとんどの場合、まず、一方のカップリングパートナーのみを過剰なリンカーとインキュベートし、結果として得られた一価の反応体−リンカー複合体を単離し、その後に、リンカーの残存する遊離官能基を介して、第２の反応体に結合させる。生化学および生物工学において使用を見出された化学物質の多くは、いわゆる、活性化形態、すなわち、すでに反応性リンカーに結合した状態で、商用的に入手できる（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【００９８】
カップリングの度合い、すなわち、前記複合体における個々の成分の相対比は、２以上の反応基が存在する場合、使用する反応体の化学量論により、ある範囲に制御できる。異なるカップリングパートナーを有する定義された複数のカップリングは、逐次的なカップリングにより、または、異なるカップリング化学の使用により、例えば、機能性成分２が、各ポリペプチドのリジンに結合するのと同時に、第１の機能性成分がシステインにカップリングすることにより、可能である。典型的な例が、ＦＲＥＴ測定のための蛍光供与体／受容体対への結合である。この目的に適した染料分子の組合せは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。
【００９９】
本発明において、複合体をもたらす選択されたカップリングメカニズムには非依存的に、本複合体の機能性能力が予想されるものではなく、驚くべきものであったことを、改めて指摘する。従って、ここで説明されたことを参照することが可能である。
【０１００】
さらに、本発明において開示された複合体が産生でき、さらに、個々の成分の全機能が保持され、または、増強されることも、当業者にとって予想できなかったことであることを述べておく。
【０１０１】
本発明において、一方のポリペプチド分子と、他方の機能性成分との間におけるサイズ比は、非常に異なっている。例えば、フィコエリスリンに前記分子を結合させた場合、時々、前記ポリペプチド分子の１０〜２０倍になるが、蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）のように小さい場合もある。驚いたことに、特に、非常に大きな分子との結合において、前記ポリペプチド分子の構造およびリガンドへの結合親和性は、両方とも維持されている。このことは、この方法において、予期され得なかった。
【０１０２】
上述の説明のように、機能性成分に対するカップリングのための側鎖は、リガンドへの結合の機能性が損なわれないために、リガンドに対する（Ｉ）の結合表面の外側に局在されることが好ましい。
【０１０３】
別の好ましい実施形態によれば、前述のように、（Ｉ）に対する前記末端ペプチド融合は、１以上のシステイン残基または１以上のリジン残基を含んでおり、これらのアミノ酸残基は、リガンドとの（Ｉ）の相互作用に関与していないことが好ましい。
【０１０４】
前記機能性成分（II）は、ポリペプチドおよびタンパク質、有機および無機ポリマー、核酸、脂質、糖、低分子量物質、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択されることが好ましい。結合の原理およびカップリング試薬に関しては、上記の説明を参照。
【０１０５】
好ましい実施形態によれば、前記機能性成分（II）は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、好ましくは、発色タンパク質、酵素、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、毒素またはＩ由来のポリペプチドである。
【０１０６】
前記機能性成分（II）がポリマーの場合、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリビニル、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースもしくはポリエチレングリコール、または、ポリマー誘導体から選択されることが好ましい。
【０１０７】
前記機能性成分（II）が低分子量物質の場合、染料、ビオチン、ジゴキシジニン、重金属、キレート試薬、放射性同位元素、抗生物質または細胞毒物質であることが好ましい。
【０１０８】
好ましい実施形態によれば、成分（Ｉ）に特異的に結合するリガンドは、ポリペプチド、ペプチド、低分子量物質、脂質、糖、核酸、有機および無機ポリマー、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０９】
このリガンドがポリペプチドまたはタンパク質の場合、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、糖化タンパク質、ウイルスタンパク質ならびに細胞表層マーカー、好ましくは、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４が、用いられることが好ましい。
【０１１０】
前記リガンドがペプチドの場合、アフィニティタグ、好ましくは、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグもしくはＦＬＡＧ−タグ、または、ウイルス由来ペプチドであることが好ましい。
【０１１１】
前記リガンドは、低分子量物質、好ましくは、ステロイド、コレステロールおよび、例えば、ハロゲン化炭化水素のような有毒物質、または、脂質もしくは脂質誘導体、好ましくは、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質であっても良い。
【０１１２】
好ましい実施形態によれば、本発明の複合体の成分（II）は、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチドであり、それと共有結合することにより、（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果によって達成される。詳細な説明は上記の記述を参照。
【０１１３】
さらに、前記成分（II）は、複数の方法において、（Ｉ）のリガンドへの前記親和性の向上が、アビディティー効果により達成されることにより、前記（Ｉ）が共有結合的に結合されるポリペプチド、タンパク質またはポリマーであることが好ましい。前記に代えて、成分（II）は、成分（Ｉ）に共有結合後に、（Ｉ）のリガンドへの前記親和性の向上が、アビディティー効果により達成されることにより、同型の別の複合体に共有結合的または非共有結合的な結合を受けるポリペプチドまたはポリマーである。
【０１１４】
好ましい実施形態によれば、成分（Ｉ）は、ＳＰＣ１−Ａ１（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：３）、ＳＰＵ１１−３−Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２および１３）、ＳＰＣ１−Ｇ３（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ：４）、およびＳＰＣ７−Ｅ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の分子の１つである。
【０１１５】
しかしながら、本発明は、正確な核酸配列のみではなく、それらの変異体をも含む。本発明における“変異体”は、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．で規定された核酸と比較して、１以上の置換、挿入および／または欠損が存在する核酸のことを言う。これらの変異体において、少なくとも１つ、または、２、３、４つ以上のヌクレオチドが、核酸の片方の末端または両方の末端、または、核酸の内側の部分において、欠損し、または、別のヌクレオチドにより置換されることが好ましい。
【０１１６】
このように、本発明の前記核酸は、それぞれのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の核酸に実質的に対応する配列を有する核酸も含んでいる。本発明における前記核酸は、例えば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の核酸に対して、少なくとも約８０％、典型的に少なくとも約９０％または９５％の配列相同性を有してもよい。
【０１１７】
前記“核酸配列”という用語は、ヌクレオチドのヘテロポリマー、または、これらのヌクレオチドの配列に関する。ここで用いられる前記“核酸”という用語は、ＲＮＡと、ｃＤＮＡを含むＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成塩基（例えば、化学的合成）、ＰＮＡのように他のポリマーに結合した塩基も含んでいる。
【０１１８】
本発明は、適度にストリンジェントな条件において、本発明の前記核酸に対してハイブリダイズする変異体も含んでいる。
【０１１９】
一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、オリゴヌクレオチドと所望の標的分子との間における二本鎖分子（完全なハイブリッド）のみが形成される、または、所望の標的有機体のみが検出される、反応条件を参照する。特に、この観点におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６５℃で、０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）のことである。短い断片、例えば、２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドの場合、前記ハイブリダイゼーション温度は６５℃以下、例えば、５５℃より高く、好ましくは、６０℃より高い。どのような場合でも６５℃以下である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション温度は、ヌクレオチドのサイズまたは長さ、および、ヌクレオチドの組成のそれぞれに依存し、マニュアル化された実験により、当業者により決定できる。適度にストリンジェントな条件とは、例えば、４２℃、および、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することにより達成できる。
【０１２０】
前記それぞれの温度条件は、選択した実験的条件に依存して異なり、また、試験する核酸サンプルに依存する。この場合、適切に調節する必要がある。前記ハイブリダイゼーション産物の検出は、例えば、放射ラベルされた分子の場合、オートラジオグラフィーにより、または、蛍光標識された分子が使用された場合は、蛍光定量法により行われ得る。
【０１２１】
当業者は、実際に適度にストリンジェントな条件を達成し、特異的な検出方法が可能になる、それ自体公知の方法において、選択された実験方法に対する条件を適応できる。適度にストリンジェントな条件は、例えば、参考となるハイブリダイゼーションの方法により決定できる。適した核酸またはオリゴヌクレオチド濃度で使用する必要がある。前記ハイブリダイゼーションは、適した温度（より高い温度にすれば、ハイブリッドの結合は弱まる）で行う必要がある。
【０１２２】
第２の側面において、本発明は、既知の配列の成分（Ｉ）で開始される前述で定義した複合体の調製方法に関し、下記工程を含む。
タンパク質の空間構造の分析による、カップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外側のアミノ酸残基の同定；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【０１２３】
カップリングに適したアミノ酸残基が同定されていない既知配列の成分（Ｉ）から開始される本発明の複合体の調製のための改良された方法であり、下記工程を含む。
置換、挿入または融合によるカップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外側表面に曝されるアミノ酸残基の導入；
導入されたアミノ酸残基の露出度の検出；
この方法により変化させた成分（Ｉ）の機能性の検出；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【０１２４】
カップリング方法等のより詳細な説明は、上記を参照。
【０１２５】
第３の側面によれば、本発明は、前述の方法により調製される複合体を提供する。
【０１２６】
さらに、本発明は、上記で規定した複合体を含む診断キットを含む。
【０１２７】
本発明の他の側面は、本発明の複合体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学組成物である。
【０１２８】
前記薬学組成物において、複合体は、疾病の治療または少なくとも緩和のための投与において、適切なキャリアまたはキャリア物質と混合される。このタイプの組成は、（前記活性剤および前記キャリアに加えて、）賦形剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および、技術分野で周知の他の物質を含んでもよい。前記“薬学的に許容される”という用語は、活性成分または活性薬のそれぞれの生物学的活性の有効性を損なわない無毒な物質と規定する。前記キャリアの選択は、投与経路に依存する。
【０１２９】
前記薬学的組成物は、付加的に、前記活性剤の活性を強める、もしくは、活性を補う別の成分を含んでもよく、または、治療において、それらを用いても良い。このような付加的な要因および／または物質は、前記薬学的組成物に、相乗的な効果を達成するため、または、副作用もしくは有害作用のそれぞれを最小化するために含まれてもよい。
【０１３０】
本出願の複合体の形成、調製、および、投与のための技術は、それぞれ、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（最新版）において見出される。さらに、治療に効果的な量は、症状の改善、例えば、処置、治療、予防またはこのような状態の改善等を達成するのに十分な化合物量に関する。適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜または腸管投与ならびに筋肉内、皮下、髄内注射、および、くも膜下腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内もしくは鼻腔内注射を含む非経口投与を含む。中でも、患者への静脈内投与が、好ましい。
【０１３１】
他の側面によれば、本発明は、ここで規定した複合体の使用、診断、治療および親和性クロマトグラフィーにおけるキットまたは組成の使用に関する。
【０１３２】
カップリング方法が提示され、それに加えて、親和性クロマトグラフィーにおける複合体の使用を含む複合体の種々の応用を可能にするデータも得られた。この使用のための例は、アフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製および血漿タンパク質、成長因子またはインフルエンザワクチンの精製、ならびに、遺伝子工学により調製されたアフィニティータグを有するタンパク質の精製のため、ならびに、エンドトキシンおよびアルブミンのそれぞれの減少のための、プロテインＡの交換である。さらに、マトリクスに対するカップリングにより、血液血漿交換またはバイオレメデーションへの使用が考察できる。
【０１３３】
使用の他分野は、診断である。この点において、細菌またはウイルス感染のための血液バンクのスクリーニング、もしくは、ＥＬＩＳＡのような古典的な検出技術、または、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムのような新規技術開発においての使用が、考案できる。治療だけでなく診断において、このような複合体は細胞分離に使用可能である。
【０１３４】
治療において、本発明の複合体の使用が可能であり、特に、輸送分子として一般的に使用できる。治療における他の応用は、本発明のポリペプチド分子による方向性ターゲティングにおける遺伝子治療、遺伝子輸送の系のためのカップリングである。方向性のあるターゲティングや細菌毒性に対するカップリングにより、治療における免疫毒性としての使用が、良好に得られるであろう。
【０１３５】
下記において、本発明は、複数の図および付随の例示に関して説明されているが、これらの図および例示は、単に本発明を図示するだけであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３６】
ヒトγ−II−クリスタリンライブラリからの、ＩｇＧ ＦｃおよびｐｒｏＮＧＦに結合するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の選択、発現および精製
【０１３７】
ヒトγ−クリスタリンライブラリＣＲ２０から始まり、選択工程は、ファージディスプレイシステム法により行った。最初の１ラウンドで、単一ファージＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧ Ｆｃに対する特異的な結合を示す複数のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を選択および単離できた。ここで用いられる“Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）”という用語は、本発明の複合体におけるポリペプチド分子成分に相当し、ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づき、且つ、野生型と比較してリガンドに対する特異的な結合のための変化された結合特性を有する。ｐＥＴ２０ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）への遺伝子のクローニングに続き、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を組換え法により過剰発現させ、続いて、２種類のクロマトグラフィー工程（ＩＭＡＣおよびゲルろ過）により精製した。タンパク質濃度依存ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ検査で、ｎＭ範囲において解離定数を有するＩｇＧ Ｆｃに対する特異的な結合を決定できた。
【０１３８】
ＩｇＧ Ｆｃに結合するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を選択するため、１ｍＬのＣＲ２０ライブラリ（６．５×１０１０ｃｆｕ）を、１Ｌの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有）において、３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．４の吸光度に達するまで培養した。その後、前記細菌培養液に、感染用ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスルーエ、ドイツ）を１０倍量過剰量添加して、１時間、３７℃、１００ｒｐｍで培養した。それから、前記細菌の懸濁液を、２０分間、１０００×ｇで遠心し、そのペレットを、１Ｌの２×ＹＴ培地（８ｍＭ ＧＳＨ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有）に再度懸濁させた。
【０１３９】
ファージの産出またはファージの放出を、それぞれ、３０℃、２００ｒｐｍで一晩行った。前記ファージの単離には、Ｋａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ＆ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９６）に記載されたプロトコールを使用した。
【０１４０】
１ｍＬの単離ファージ（１．４×１０１４ｃｆｕ）を、１ｍＬの６％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を用いて、１時間、室温（ＲＴ）でブロッキングした。一方、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社）の１０ウェルを、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ中）モノクローナルＩｇＧ Ｆｃ（Ｒｏｃｈｅ社）溶液１００μＬを用いて、常温で一晩コートし、ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて３回洗浄した。その後、各ウェルにおける未結合部位を、３００μＬのＰＢＳ（３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて、２時間、常温でブロッキングした。続いて、ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて３回ウェルを洗浄した。ウェル当たりブロッキングされた前記ファージを１００μＬ添加した後、１時間、常温、２０ｒｐｍでインキュベートした。未結合または弱い結合のファージを、それぞれ、２×ＰＢＳを用いて２回、２×ＰＢＳ（３％ＢＳＡ含有）を用いて２回、最後に、２×ＰＢＳを用いて２回、洗浄することにより除去した。残った結合ファージを、ウェル当たり１００μＬの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、１０分間、室温でインキュベートすることにより溶出した。基本培地に溶出された前記ファージの中和ため、これに（計１ｍＬ）に５００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に添加した。引き続いて、前記ウェルをＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１４１】
トリエチルアミンを用いた溶出にもかかわらず、マイクロタイタープレートに強固に結合したファージを、再感染のために、直接、ＸＬ１−ｂｌｕｅの対数増殖期の細菌培養液（ＯＤ６００＝０．４）１００μＬを用いて、３０分間、３７℃でインキュベートした。基本培地中に溶出された前記ファージを用いたＸＬ１−ｂｌｕｅの再感染のために、７５０μＬの中和溶出液を、９ｍＬのＯＤ６００＝０．４のＸＬ１−ｂｌｕｅと共に、３０分間、３７℃でインキュベートした。その後、基本培地に溶出したファージに再感染した菌体と、強固にファージが結合した再感染菌体とを混合し、ＳＯＢＡＧ培地（アンピシリン含有）を含む１６×１６ｃｍのプレートに蒔き、３７℃で一晩培養した。パニング工程の後、約２０００のクローンが得られた。これらを、約１２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（２０％グリセロール含有）から採取し、−８０℃で保存した。
【０１４２】
単一のファージを培養するために、パニングの第１ラウンドで得られた細胞プールを、選択培地（ＳＯＢＡＧ）に蒔き、３７℃で一晩培養した。前記ＳＯＢＡＧプレートから、９２個の単一のクローンを、ウェル当たり２ｍＬの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）を含む２４×５ｍＬディープウェルプレートに移し、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。加えて、プレートあたり、ファージミドベクター内にヒト野生型γ−クリスタリン遺伝子を含む１つの単一のコロニー（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）を、コントロールとして用いた。ウェル当たり２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（２％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）を含む滅菌２４×５ｍＬディープウェルプレートを、それぞれ、一晩培養した培養液の種菌１％と共にインキュベートし、細菌培養液を３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が約０．４に達するまで培養した。その後、前記培養液を、ウェル当たり２．５μＬのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（１０１３ｃｆｕ／ｍＬ）を用いて感染させ、１時間、３７℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。それから、細菌を遠心によりペレット化し、上清を除き、前記ペレットを、ウェル当たり２．５ｍＬの２×ＹＴ培地（８ｍＭグルタチオン、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）に再懸濁し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。ファージが含まれる上清を得るために、プレートの遠心を、４６００ｒｐｍで行った。前記ファージの沈殿およびペレット化を、Ｋａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ＆ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに記載の方法で行った。そして、前記ファージペレットを、約２００μＬのＰＢＳ（３％ＢＳＡ含有、ｐＨ７．４）に再懸濁した。この手順により、前記ファージを濃縮し、その後、ＥＬＩＳＡに用いた。
【０１４３】
この目的のために、ＮＵＮＣプレートのウェルを、１００μＬ抗原溶液（それぞれ、１０μｇ／ｍＬヒトのモノクローナルＩｇＧ ＦｃまたはＢＳＡ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて、２時間、室温でインベートした。洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて前記ウェルを洗浄した後、前記ブロッキングしたファージ調製液１００μＬを、それぞれ前記ウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて、前記ウェルを洗浄した後、モノクローナル抗Ｍ１３抗体（ＰＯＤ複合体；ＭｏＢｉＴｅｃ社、ゲーチンゲン）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４（１００μＬ／ウェル））で１：５０００に希釈して添加し、再度、１時間、室温でインキュベートした。その後、前記ウェルを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて３回、および、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ＴＭＢ Ｐｌｕｓ（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ社、デンマーク）を用いて呈色反応を開始した（１００μＬ／ウェル）。２０分後、前記呈色反応を、０．２Ｍ硫酸の添加により停止した。得られた黄色を４５０ｎｍ（参照波長：６２０ｎｍ）で測定し、記録した。
【０１４４】
モノクローナルＩｇＧ Ｆｃへの結合に関し、明らかなシグナルを示し、かつ、ＢＳＡに対する検出可能な結合をほとんど示さないファージ調製液から、γ−II−クリスタリン変異体遺伝子を、プライマーｐＣＡＮ７００を用いて配列決定した。結果として、その中から３つのクローンＳＰＣ１−Ａ１、ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ｇ３を、ｐＥＴ２０ｂ発現ベクター中に、ＮｃｏＩおよびＢｓｔＥIIの制限酵素部位を用いてサブクローニングし、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＵＢＳ５２０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。
【０１４５】
前記菌体を、２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）において、ＯＤ６００が０．６〜０．８の吸光度になるまで、３７℃、２００ｒｐｍで培養し、その後、組換えタンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）で誘導した。３０℃、２００ｒｐｍ、４時間の培養後、細胞を遠心（６０００×ｇ、２０分間、４℃）により回収した。細胞破砕を、ＮＰＩ−１０バッファー（Ｑｉａｇｅｎ社）中、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの存在下、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）法、および、超音波（６×１５秒、氷を用いた冷却下）により行った。遠心（４０，０００×ｇ、３０分間、４℃）後、上清をＩＭＡＣカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に添加し、ＮＰＩ−２０（Ｑｉａｇｅｎ社、＋５ｍＭ β−メルカプトエタノール）を用いて洗浄した（カラムの２０倍量）。溶出は、ＮＰＩ−５００（Ｑｉａｇｅｎ社、＋５ｍＭ β−メルカプトエタノール）を用いたリニアグラジエント（直線勾配）により行った（カラムの３０倍量）。γ−II−クリスタリンを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析し、各画分をプールし、ゲルろ過カラム（１．６×６０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に添加した。ＰＢＳを、流速０．７５ｍＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。ゲルろ過分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により行い、γ−II−クリスタリン含有画分を混合し、４℃で保存した。この精製工程の後、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、９５％以上の純度であった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【０１４６】
前記精製タンパク質の結合特性を、前述の濃度依存ＥＬＩＳＡにおいて、直ちに試験した。この目的のため、異なる濃度（１００ｎＭ〜１０μＭ）のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を用い、抗γ−II−クリスタリン抗体（ＰＯＤとのモノクローナル抗体複合体）を、検出抗体として用いた。試験した全３種類のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対する特異的結合を示し、ＢＳＡまたはマイクロタイタープレートへの非特異的な結合は、検出されないことがわかった。コントロールとして用いた前記ヒト野生型γ−II−クリスタリンは、ＩｇＧ Ｆｃ、ＢＳＡまたはマイクロタイタープレートに対する結合を示さなかった。
【０１４７】
ＢＩＡＣＯＲＥ試験において、前記３種類のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の解離定数を測定した。この目的のために、約１８０ＲＵのヒトＩｇＧ Ｆｃ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム中５０μｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）を、ＣＭ５チップに固定化した。未結合部位を、最終的に１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）により不活性化した。
【０１４８】
それから、流速３０μＬ／分で、６つの異なる濃度（１６６ｎＭ〜１μＭ）を、前記チップに１８０秒間通過させた。その後、前記チップを０．００５％界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を含むＨＢＳを用いて、同じ流速で１８０秒間洗浄した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて得られたセンサーグラムから、ＩｇＧ Ｆｃに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の解離定数を決定した（ＳＰＣ１−Ａ１：２３０ｎＭ、ＳＰＣ１−Ａ７：２８０ｎＭおよびＳＰＣ１−Ｇ３：８００ｎＭ）。競合実験において、ＩｇＧ Ｆｃに対する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の特異的結合は検出されたが、前記チップマトリックスに対する結合は検出されなかった（図２）。
【０１４９】
前記変異体ＳＰＣ１−Ａ１、ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ｇ３の選択と類似の方法により、標的分子ｐｒｏＮＧＦに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ７−Ｅ９を単離した。解離定数を、１〜６ｎＭの範囲で、ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｍｕｓｓｕｎｇｅｎ法により決定することができた（図３）。
【実施例２】
【０１５０】
ヒトユビキチンライブラリ（ＵＢ１０）からの、システインノットタンパク質に対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体の選択、発現および精製
【０１５１】
新たに生じた結合親和性を有する修飾タンパク質の選択のための合成ユビキチン遺伝子の提供
【０１５２】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）のように当業者に公知の標準プロトコールによって、遺伝子工学の研究を行った。
【０１５３】
人工結合タンパク質の調製の開始点として、置換Ｉｌｅ４４Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｒｇ５４Ｌｅｕ、Ｖａｌ７０Ａｌａ、Ａｒｇ７２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ７５Ａｌａ、および、欠失Ｇｌｙ７６を有する修飾ユビキチン足場タンパク質のＤＮＡ配列（Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ：２）を調製するために、下記工程を行った。遺伝子合成のため、ＰＣＲ反応を５０μＬの容量で行った。これには、遺伝子の塩基対配列で表される６種類のオリゴデオキシヌクレオチド（それぞれ０．１μＭ ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２６、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２７、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２８、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：２９、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：３０、ＳｅｑＩＤ ＮＯ：３１）各２．５μＬを含み、合成される遺伝子が鋳型として存在する。使用した前記オリゴデオキシヌクレオチドの配列は、それぞれ、約１５塩基対によりそれらの３’末端および５’末端が交互にオーバーラップする４０〜５０塩基対の長さの人工遺伝子の、翻訳ＤＮＡ鎖ならびに非翻訳ＤＮＡ鎖の領域に相当する。さらに、前記試料は、２．５μＬの各フランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３２、ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３３；１０μＭ）、５μＬの１０×Ｔａｑバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、３μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２および４μＬのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む。水を充填した後、前記反応試料を、変性のために、サーモサイクラーにより、２分間、９４℃で加熱した。それから、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加熱中に添加（加熱開始）し、ＰＣＲプログラムを開始した。インキュベーションは、それぞれ、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間を、２５サイクル行った。最後のインキュベーションを、７２℃で５分間行った。
【０１５４】
所望のＰＣＲ産物を、分析アガロースゲル電気泳動法により同定し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑａｉｇｅｎ社）を用いて、前記試料から精製した。単離したＤＮＡ １．０ｎｇを２回目の増幅の鋳型として使用し、前記２回目の増幅を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、５０μＬの容量で行った。この目的のために、５μＬの提供１０×Ｐｆｕバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）および４μＬのｄＮＴＰ混合物を用い、水で充填した。さらに、前記試料は、適切な制限酵素部位の導入のためのフランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３２、ＳｅｑＩＤ ＮＯ．３３；１０μＭ）を含む。所望のＰＣＲ産物を、調製アガロースゲル電気泳動法により単離し、クローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）に、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（商標）ＴＯＰＯ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、メーカーの説明書に従って挿入した。供給された化学的コンピテントセルを、対応する連結反応試料を用いて形質転換し、ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ培地のアガープレート上にまいた。前記プレートを、１６時間、３７℃で培養し、生育したコロニーについて、所望の連結産物の分析を行った。この目的のため、プラスミドＤＮＡを、Ｑａｉｇｅｎ社のプラスミド単離キットを用いて、メーカーの説明書に従って、ミニスケールで調製し、前記フランキングプライマー法により前記ＰＣＲ産物に導入された認識配列に対して、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた制限消化を行った。期待された切断パターンを示すプラスミドを用いて、Ｔａｑポリメラーゼにより挿入された遺伝子カセット領域内のＤＮＡ配列分析を行った。この目的のために、メーカーの説明書に従って、ＣｙｃｌｅＲｅａｄｅｒ（商標）ＡｕｔｏＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、０．５μｇプラスミドＤＮＡおよび１．０ｐｍｏｌ各蛍光標識プライマーを用いた。新たに合成されたＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ反応中に標識し、ジデオキシヌクレオチドの取り込みによる塩基特異的な方法により、統計的に終結させた。それから、結果的に得られた蛍光ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミド−尿素ゲル電気泳動により、Ｌｉｑｕｏｒシークエンシング装置において分離し、隣接するレーンにおけるＡＣＧＴのバンドパターンとして視覚化した。
【０１５５】
正確なＤＮＡ配列を有する遺伝子カセットを、調製用ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限消化により、クローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）から切り出し、調製用アガロースゲル電気泳動で単離した。ユビキチン変異体のライブラリ構築のため、修飾ユビキチン足場タンパク質の遺伝子の挿入を、対応するタンパク質産生用の発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、または、ファスミドベクターｐＭＵＢＩ−１に行った。
【０１５６】
ユビキチン変異体のライブラリの調製
【０１５７】
前記合成ユビキチン遺伝子のＮ末端およびＣ末端それぞれにおける８つのコドンのランダム部位特異的変異誘発のため、２つ連続的ＰＣＲ反応を行った。第１回目の増幅工程は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、１０×５０μＬの容量で行った。この目的のために、各試料当たり、供給１０×Ｐｆｕバッファー５μＬのおよびｄＮＴＰ混合物４μＬを使用し、水で充填した。さらに、各試料は、所望の塩基対置換の導入のため、フランキングプライマー（ＳｅｑＩＤ Ｎｏ．３４、ＳｅｑＩＤ Ｎｏ．３５；１０μＭ）を各２．５μＬ含む。非変異ユビキチン遺伝子を保有するために、テンプレートとして１．０ｎｇのｐＭＵＢＩ−１を用いた。Ｐｆｕポリメラーゼ（上記参照）２．５Ｕを添加後、インキュベーションを、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間を２５サイクル行った。最後のインキュベーションを、７２℃で５分間行った。使用したテンプレートＤＮＡの選択的切断のため、反応試料当たり１０ＵのＤｐｎＩを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。所望のＰＣＲ産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法およびＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により単離した。
【０１５８】
第２回目の増幅工程は、１０００μＬの試料容量で行い、前記１回目のＰＣＲ反応で得られた産物約１．０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼを用いた。前記反応試料を、ピペットで２０倍容量に調節した。上記の詳細は、１０×Ｔａｑバッファー、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、および、５’末端がビオチン化され且つＳｆｉＩエンドヌクレアーゼ用認識配列を保有する互いに共通しないフランキングプライマー（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．３６、Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．３７；１０μＭ）からなる。水で充填した後、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを加熱下で添加（上記参照）し、ＰＣＲプログラムを開始した。インキュベーションは、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間を、２５サイクル行った。最後のインキュベーションは、７２℃で５分間行った。
【０１５９】
得られた増幅産物の切断は、ＰＣＲ反応試料において直接行った。この目的のため、総容量４０００μＬにおいて、完了したＰＣＲ反応溶液を、同量の供給１０×ｂｕｆｆｅｒII（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール含有）、１０×ＢＳＡ溶液および水と混合した。さらに、４０００Ｕの制限酵素ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を添加し、１６時間、５０℃でインキュベートした。ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑａｉｇｅｎ社）を用いて、前記試料からＤＮＡを単離し、４００μＬの滅菌水に懸濁した。ＳｆｉＩに切断されなかった前記ＰＣＲ産物の分離のため、前記単離ＤＮＡを、表面にストレプトアビジンが結合した磁力ビーズ（“Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｂｉｎｄｅｒ”）１．０ｍｇ／ｍＬを含む同量の“Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｙｎａｌ社）と混合し、室温（ＲＴ）、４．５時間、ローラーミキサー上でインキュベートした。任意に存在するビオチン化ＤＮＡに結合した前記ビーズは、沈殿するが、ＳｆｉＩにより完全に切断されたＤＮＡは、ビオチン化末端を持たず、上清に残るはずであった。一晩沈殿させた。結果的に得られたＳｆｉＩにより切断され且つ所望の部位で変異誘発されたユビキチン遺伝子を、滅菌水に溶解し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて脱塩した。前記遺伝子は、最終的に水中で２００ｆｍｏｌｅｓ／μＬの濃度であった。
【０１６０】
レシピエントベクターの調製のため、前記プラスミドｐＭＵＢＩ−１を、メーカーの説明書に従ってＳｆｉＩにより切断し、長い方の（ベクターの）断片を、調製用アガロースゲル電気泳動法およびＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により単離した。分子内の連結を避けるために、５’末端を脱リン酸化した。この目的のため、０．５Ｕのエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）由来アルカリフォスファターゼおよび前記供給バッファーを、総容量２００μＬで使用した。前記混合物を、９０分間、３７℃でインキュベートし、ＤＮＡを、前記試料から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて脱塩した。最終的に、前記ベクター断片のＤＮＡは、水中で、５０ｆｍｏｌ／μＬの濃度であった。
【０１６１】
連結のため、１．６ｐｍｏｌの前記ＰＣＲ断片および８．０ｐｍｏｌのｐＭＵＢＩ−１のベクター断片を、２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）の存在下、総容量１６００μＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８，０００）において、３日間、１６℃でインキュベートした。６５℃で１５分間、前記試料を加熱した後、前記ＤＮＡを沈殿させた。この目的のため、１００μＬの前記各反応溶液に、１００μＬのエタノールおよび１０μＬのＮａＡｃ（５Ｍ、ｐＨ３．０）を混合し、１６時間、−２０℃で保管した。続いて、遠心（６０分間、１２５００×ｇ）を行い、前記サンプルをエタノール（７０％ｖ／ｖ、−２０℃）で洗浄し、再度遠心し、最終的に沈殿したＤＮＡを６０μＬの滅菌水に溶解した。
【０１６２】
エレクトロポレーションのために、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標）IIシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）および１．０ｍｍの電極間隔を有するキュベット（Ｂｉｏｚｙｍ社）を、４℃の冷温室で使用した。前述の上記で得られた各溶液３．５μＬを用いて、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、メーカーの説明書に従って形質転換した。得られた細胞懸濁液を、ＬＢ／クロラムフェニコール培地のアガープレート（２０Ｘ２０ｃｍ）５枚に蒔いた。これらのプレートを、１６時間、３７℃で培養し、生育したコロニーを計測した。それに伴い、構築したライブラリには、独立した２．８×１０７種類のクローンが含まれており、前記ライブラリにおいて通常の１０，０００倍である。それから、前記コロニーを、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール含有ＳＯＣ培地（総量１００ｍＬ）に採取し、そのうちの１．０ｍＬを−８０℃で保存した。得られたクローン（１２のランダムに選択したクローン）から、Ｑｉａｇｅｎ社より購入したＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて、ファスミドベクターを単離し、ＤＮＡ配列を、変異誘発されたユビキチン遺伝子の領域について分析した。これらのクローンの全てが、機能的な配列を示した。すなわち、挿入または欠損による読み枠シフトを示さず、変異誘発させた部位において、質的に完全に異なる置換を示した。変異誘発させた領域外におけるランダム置換は、存在しなかった。
【０１６３】
ヒトユビキチンに基づくこのライブラリの基礎において、選択は、実施例１と同様に、当業者に公知の前記ファージディスプレイシステム法により行った。小さな修飾は、単に、使用した抗生物質（アンピシリンの代わりにクロラムフェニコール）の選択に関して導入された。
【０１６４】
システインノットタンパク質のファミリー由来の成長因子を、標的として用いた。前記ユビキチンＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１は、ＥＬＩＳＡにより決定されたように、ｎＭ範囲の解離定数を有し、前記ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおけるカップリング研究に使用した。
【０１６５】
選択された変異体の１つであるＳＰＵ１１−３−Ａ１を、制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて、ｐＥＴ２０ｂ発現ベクターにクローン化した。培養条件および精製工程は、実施例１において述べたＳＰＣ Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）に用いたものと同様であった（ＩＭＡＣ、ゲルろ過）。結合特性の検出のために、濃度依存ＥＬＩＳＡを行った。この目的のため、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体を異なる濃度（１０ｎＭ〜１μＭ）で、前記標的分子でコートしたマイクロタイタープレート（以下、ＭＴＰ）に添加し、ポリクローナル抗ユビキチン抗血清（Ｓｉｇｍａ社）を１次検出試薬として用いた。室温でインキュベーション（１時間）後、前記ＭＴＰのウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２次工程において、ＰＯＤを有するモノクローナル抗体複合体（抗ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ社）を検出抗体として用いた。試験したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体は、ヒトＮＧＦに対する特異的な結合を示すこと、および、ＢＳＡまたは前記マイクロタイタープレートに対する非特異的な結合が検出されないことがわかった。コントロールとして用いたヒト野生型ユビキチンは、ＮＧＦ、ＢＳＡまたは前記マイクロタイタープレートへの結合を示さなかった。
【実施例３】
【０１６６】
異なる分子に対する選択的なカップリングのためのシステイン含有ペプチドリンカーとの、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）のＣ末端融合
【０１６７】
ＩｇＧ Ｆｃに結合する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７が、Ｃ末端システインを介して異なる分子に選択的に結合できたことを、下記の実施例において説明する。
【０１６８】
７つのシステインが、前記タンパク質内部に局在することに加えて、使用したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７は、溶液−接近性（露出性）であり且つ遊離したシステインを可変性部位４において有している。まず、この部位を、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲを用いてセリンに置換した。この修飾Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）（ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ）から開始して、２つのグリシンおよび１つのシステイン、ならびに、既に存在する６つのヒスチジンに加えて４つの別のヒスチジンを、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ法により、Ｃ末端に挿入した。１０個のヒスチジンを伸張した親和性タグの目的は、改良された精製を可能にすることである。Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬を用いた滴定試験は、前記導入されたシステインが、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体に存在する他のシステインによるシステイン混合現象のため、カップリング実験に不適切であることを示していた。この理由のために、前記システインを、ＤＮＡレベルでセリンに置換し（ＴＣＴ）、この構築物から開始して、新たなシステインをＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの後に導入した。このことは、前記タンパク質におけるシステインからの前記挿入システインの距離を長くし、且つ、システイン混合を抑制する。最終的に、得られた構築物を配列決定し、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬を用いた滴定試験がカップリング試験に適していることを示した。
【０１６９】
前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７の部位４におけるセリンによるシステインの置換のため、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社、ラジョラ、アメリカ）を、プライマーＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ＿フォワードおよびＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ＿リバースと共に用いた。ＰＣＲ反応のため、５μＬの１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）、各１２５ｎｇの２種類のプライマー、１μＬのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、１μＬ ｄＮＴＰ混合物および水を、総容量５０μＬで用いた。ｐＥＴ２０ｂベクターのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７の遺伝子を、テンプレートＤＮＡとして用いた。９５℃で３分間の１回目の変性工程により反応を開始し、変性、プライマーアニーリングおよび合成を１８サイクル繰り返した。９５℃での変性を３０秒間行い、前記プライマーアニーリングは、６０℃で１分間行った。合成工程の時間を、６８℃で５分間とした。ＰＣＲの最後に、６８℃で５分間の最終合成を行った。増幅は、アガロースゲル電気泳動によりモニターした。増幅に成功した後、使用したテンプレートＤＮＡの制限消化を、制限酵素ＤｐｎＩにより行った。１μＬの前記酵素（１０Ｕ／μＬ）を前記ＰＣＲ試料にピペットで加えて混合し、１時間、３７℃でインキュベートした。それから、前記ベクターを、エレクトロポレーション法により、コンピテント株（ＸＬ１−ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。この目的のため、１μＬのＤｐｎＩ処理制限試料（氷中）を５０μＬのエレクトロコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にピペットで加えて混合し、氷冷したエレクトロポレーションキュベット（０．１ｍｍ）において、２．５ｋＶ，２５μＦおよび２００Ωの条件でパルスした。細胞を１ｍＬのＳＯＣ培地に再度懸濁し、６０分間、５００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で培養した。その後、細胞を選択培地（２×ＹＴ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に蒔き、１６時間、３７℃で培養した。得られた１２種類のクローンを、正しく挿入されているかを確認するために、ｐＥＴＴｅｒｍプライマーを用いて、別々に配列決定した。前記正確なクローンのベクターを、Ｃ末端に２つのグリシンと１つのシステインと４つの付加的ヒスチジンを導入するために、次のＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして用いた。前述のように、２種類のプライマーＡ７Ｇｌｙ２Ｃｙｓ＿フォワードおよびＡ７Ｇｌｙ２Ｃｙｓ＿リバースを用いたＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲ後、ＤｐｎＩ消化およびエレクトロポレーション法によるＸＬ１−ｂｌｕｅ株の形質転換を行った。正確な導入をコントロールするために、前記１２種類のクローンのプラスミドを、再度配列決定した。前記正確なクローン（ＳＰＣ−１Ａ７ＪＪ）のプラスミドを、プラスミドｐＵＢＳ５２０を有するＢＬ２１発現株中に導入し、引き続いて、発現させた。さらに、前述のように（実施例１）、２回のクロマトグラフィー工程（Ｎｉ−ＮＴＡでの親和性クロマトグラフィーおよびＳｅｐｈａｄｅｘ ７５でのゲルろ過）において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢを精製した。
【０１７０】
導入したシステイン残基の接触性を試験するため（Ｈａｂｅｒ、１９７２）、全ての遊離ＳＨ基を、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬（ＤＴＮＢ溶液）法により滴定する。この目的のため、１ｍＬのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＪＪのタンパク質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０中に５０〜３５０μｇのタンパク質）に、３０μＬのＤＴＮＢ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０中に４ｍｇ／ｍＬのＤＴＮＢ）を添加した。３０μＬのバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０）を加えた１ｍＬのタンパク質溶液を、ブランク値１として用いた。３０μＬのＤＴＮＢ溶液を加えた１ｍＬのバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ８．０）を、ブランク値２として用いた。前記試料を、１５分間、室温でインキュベートし、４１０ｎｍの吸光度を測定した。ブランク値１およびブランク値２の吸光度を、前記テストサンプルの吸光度から引き算した。得られた吸光度値から、遊離ＳＨ基のモル濃度を、ＤＴＮＢ−ＳＨの吸光係数（ε４１０〔ＤＴＮＢ−ＳＨ〕＝１３，６００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて計算し、使用したタンパク質濃度により割った。結果として、タンパク質分子当たりの遊離チオール基の数を得た。遊離システイン残基を、構築したＡｆｆｉｌｉｎ（変異体）ＳＰＣ１−Ａ７ＪＪ ３−４において、滴定できた。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ４Ｓｅｒを用いた滴定のコントロールにより証明されたように、前記タンパク質に存在するシステインが接触性でないため、１つの遊離システイン残基が予測された。このことは、Ｃ末端システインのシステイン混合が、タンパク質に埋められたシステインにより導入されたことを示し、そのため、タンパク質に導入されたシステインの距離が非常に短いことを示唆している。この理由のため、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ−１−Ａ７ＪＪのＣ末端システインを、ＱｕｉｃｋＣｈａｇｅ（商標）ＰＣＲにおいて、前述のプライマーＡ７Ｇｌｙ２Ｓｅｒ＿フォワードおよびＡ７Ｇｌｙ２Ｓｅｒ＿リバースを用いて、セリンに置換した。正確な導入の確認の後、この構築物を、システインに続いてＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを導入するためのＰＣＲ用テンプレートとして用いた。プライマーＧｌｙ４ＳｅｒＣｙｓ ＨｉｎｄIIIおよびＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ Ｎｄｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のため、５μＬの１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）、各１２５ｎｇの前記２種類のプライマー、１μＬのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、１μＬ ｄＮＴＰ混合物および水を、総容量５０μＬで用いた。さらに、前記プライマーの２次構造物を分離するために、２μＬのＤＭＳＯを前記反応混合物に添加した。前述の手順と比較して、変性、プライマーアニーリングおよび合成の繰り返し工程を、プライマーアニーリング温度を５８℃に代えて、２５回行った。このＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体（ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ）のＰＣＲ産物の増幅を、アガロースゲル電気泳動法により確認した。表２は、ここで述べた構築物の概要である（表２）。プライマーＡ７Ｃｙｓ４Ｓｅｒ Ｎｄｅは、酵素ＮｄｅＩ用の組み込まれた制限酵素部位を含んでおり、プライマーＧｌｙ４ＳｅｒＣｙｓ ＨｉｎｄIIIは、酵素ＨｉｎｄIII用の組み込まれた制限酵素部位を含んでいる。そのことにより、精製、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで処理されるベクターｐＥＴ２０ｂ内の前記２酵素による制限の後、前記ＰＣＲ産物の連結が可能となる。前記２種類の酵素による制限は、ダブルダイジェストで同時に行われる。この目的のため、約１μｇのＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿ＣｙｓのＰＣＲ産物、または、１μｇのベクターｐＥＴ２０ｂを、それぞれ、１μＬの前記制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ、２０Ｕ／μＬ）および１μＬの制限酵素ＨｉｎｄIII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ、２０Ｕ／μＬ）ならびに１０μＬの１０×反応バッファーであるＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、総容量１００μＬ、４時間、３７℃でインキュベートした。得られた断片を、調製用アガロースゲル電気泳動を介して別々に精製した。前記連結のため、２０ｎｇの精製されＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIII処理されたベクターｐＥＴ２０の断片、ならびに、１２０ｎｇの同様に処理されたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの断片、２μＬの１０×反応バッファー（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ）および０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マンハイム、ドイツ、１〜３Ｕ／μＬ）を、総容量２０μＬで使用した。前記反応試料を、１６時間、１６℃でインキュベートし、得られたベクターを、前述のように、ＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞にエレクトロポレーションにより導入した。遺伝子の正確な導入を、形質転換後に得られた１２種類のクローンから、プライマーｐＥＴＴｅｒｍを用いた配列決定により検証した。引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体（ＢＬ２１（ＤＥ３）、＋ｐＵＢＳ５２０）を、正確な配列を有する前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓのベクターを用いて形質転換した。前述のように、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの発現および精製の後（実施例１）、前記遊離システイン残基を、Ｅｌｌｍａｎｎ’ｓ試薬の方法により、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓについて、再度滴定した。適切なパートナーに対する選択的なカップリングのため、タンパク質と十分な距離で、溶媒に接触可能なＣ末端システインの成功した導入の予測した確証として、１つのシステイン残基のみを検出することができた（表１）。この単一の接触可能なシステインの検出は、適切なカップリングパートナーおよびマトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の選択的カップリングのための基礎となる。
【０１７１】
Ｃ末端システインを有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１を提供するために、ＳＰＵ１１−３−Ａ１遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位を介して、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７（上記参照）のために修飾されたｐＥＴ２０ｂにクローン化した。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓの発現および精製は、ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓのための手順と同様である。
【実施例４】
【０１７２】
ペプチドリンカー（Ｃ末端システイン）を有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合特性の分析
【０１７３】
実施例３において精製したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合特性を、濃度依存ＥＬＩＳＡで試験した。この目的のため、ＮＵＮＣプレートのウェルを、１００μＬの抗原溶液（１０μｇ／ｍＬ ヒトモノクローナルＩｇＧ Ｆｃ部位、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、４℃で一晩コートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、２時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてウェルを洗浄した後、前記修飾されたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）を、濃度依存法（濃度範囲：１０μＭ〜０μＭ）で、前記ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて別のウェルを洗浄した後、モノクローナル抗ヒトＧＣ抗体（ＰＯＤ−複合体；Ｂｉｏｇｅｎｅｓ社、ベルリン）を１：１０００の希釈で添加し（５０μＬ／ウェル）、再度、１時間、室温でインキュベートした。その後、前記ウェルをＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回、およびＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ Ｐｌｕｓ（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ社、デンマーク）で呈色反応を開始した（５０μＬ／ウェル）。室温で２０分間のインキュベート後、前記呈色反応を０．２Ｍ硫酸５０μＬ／ウェル）の添加により停止した。得られた黄色を４５０ｎｍ（参照波長：６２０ｎｍ）で検出し記録した（図４）。測定値の評価は、２３３ｎＭの見かけＫＤ値が明らかにした。この値は、非修飾のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７およびＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（２８０ｎＭ）と、ほとんど同じである。従って、システインを含むペプチドリンカーを有するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７のＣ末端修飾は、変異体の結合能力に影響しなかった。
【実施例５】
【０１７４】
フィコエリスリン（ＰＥ）に対するＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの選択的なカップリング
【０１７５】
ＩｇＧにするＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの活性化ＰＥに対するカップリングを、下記のように行った。１ｍｇ／ｍＬのＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ（ＰＢＳ中）を、１０ｍＭＤＴＴを用いて、３０分間、室温で還元した。還元段階の間、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、カラムの５倍量のＰＢＳで洗浄した。前記還元を行った後、過剰なＤＴＴを分離するために、前記反応混合物を平衡化したＰＤ−１０カラムに添加した。この方法により、還元されたＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓを、マレイミド活性化フィコエリスリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）に、５：１のモル比で加え、ゆるやかな攪拌下、１時間、室温でインキュベートした。その後、未反応の前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）の遊離スルフヒドリル基を、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄ）添加により、２０分間、室温でブロッキングした。引き続いて、前記反応混合物を、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ−２００ ＨＲ）法により精製し、対応する画分を混合し、４℃で保存した。複合体の分析を分光学的に行った。この目的のため、２５０〜７５０ｎｍの範囲における吸光スペクトルを測定し、ＰＥおよびＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の濃度を、決定または提供された吸光係数法により測定した。前記得られたＡｆｆｉｌｉｎ（商標）とＰＥとの複合体（ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ＿ＰＥ）について、ＩｇＧ Ｆｃに対する結合特性を前記ＢＩＡＣＯＲＥで試験した。この目的のため、ＩｇＧ Ｆｃに結合させたＣＭ５チップを、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰと共に、連続的な流れ３０μ／Ｌで用いた。ＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓ＿ＰＥを異なる濃度で、次々に前記チップを通過させ、得られたセンサーグラムを、前記ＢＩＡＣＯＲＥ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。肉眼的解離定数でＫＤ＝１０−７Ｍから１０−８Ｍに減少する結果となったカップリングにより、アビディティー効果が得られたことがわかった（図５）。
【実施例６】
【０１７６】
前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対する蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６の非特異的なカップリング
【０１７７】
前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を、前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（遊離システインを有さない）に結合させ、結合に関する試験を行った。
【０１７８】
カップリング工程を下記のように行った。１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．５）中、１ｍｇ／ｍＬのＳＰＣ１−Ａ７ＢＢを、前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）５５６（２０μＬの無水ＤＭＦに溶解）に１：２のモル比で加え、３０分間、室温でインキュベートした。前記カップリング反応を等量の１０％グリセロール溶液の添加により停止し、前記試料をＰＤ−１０カラムと通して精製した。その後、カップリングの程度を分光学的に定量化した。この目的のために、複合体の濃度を２８０ｎｍでの吸光法により決定し、提供された補正因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて補正した。それから、カップリングの程度をＯｙｓｔｅｒ（商標）５５６および複合体の濃度の商（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）から求め、１分子Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）／０．８分子Ｏｙｓｔｅｒ（商標）であることを決定した。前記得られた複合体の結合能力の分析は、濃度依存ＥＬＩＳＡ（実施例１のように行った）およびＢｉａｃｏｒｅ測定により行った（図６）。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢの結合能力が、前記蛍光染料Ｏｙｓｔｅｒ（商標）へのカップリング後、影響されないことがわかった。
【実施例７】
【０１７９】
前記ＩｇＧ結合Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素（ＰＯＤ）の非特異的なカップリング
【０１８０】
Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢは、非特異的に前記ＰＯＤ酵素に結合された。結合試験は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）の結合活性およびＰＯＤの酵素活性を保持することを示した。前記複合体を、下記のプロトコールにより調製した。
【０１８１】
５ｍｇの凍結乾燥ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、Ｓｈｇｍａ社）を２５０μＬの純水に溶解し、３７．５μＬの０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え、１０分間、２０℃でインキュベートした。その後、２５μＬのエチレングリコールを加え、さらに５分間、２０℃でインキュベートした。前記ペルオキシダーゼを、ゲルろ過（Ｇ２５、ＮＡＰ−５カラム）により純水で透析した。
【０１８２】
２５０μＬの精製Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ（ＩＭＡＣ、ゲルろ過、４ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を、１００μＬの０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に加え、１ｍｇの活性化ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を加えた（約１００μＬ）。前記カップリング混合物を、攪拌下、２時間、２０℃でインキュベートした。その後、カップリング混合液１ｍＬ当たり１０μＬの０．５Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを加え、短時間で混合し、攪拌なしで、２時間、４℃でインキュベートした。前記反応試料を、Ｇ２５カラムを用いて、ＰＢＳに緩衝した。０．１％チオメルサール（Ｒｏｔｈ）を保存のために添加した。ヒトＩｇＧに対する複合体の結合活性の試験を、以下のように行った。
【０１８３】
前記標識化Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）をＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チオメルサール）で希釈し、前記溶液を、ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）でコートしたマイクタイタープレートに添加した。インキュベーション時間を、室温で１時間とした。その後、各ウェルを、それぞれ、２５０μＬのＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チオメルサール）で３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢを用いて１０〜２０分間、室温で再度インキュベートした。反応は、１００μＬの０．５Ｍ硫酸の添加により停止させた。吸光（４５０ｎｍ、参照として６２０ｎｍ）をマイクロプレート測光器で測定した（図７）。ＰＯＤ活性は、前記反応試料１：１０，０００の希釈まで検出でき、これはＳＰＣ１−Ａ７ＢＢに対するＰＯＤの成功したカップリングを示す、コントロール測定により、シグナルを妨げる非結合ＰＯＤを除外した。
【実施例８】
【０１８４】
マトリクスに対するγ−II―クリスタリンおよびユビキチンに基づくＡｆｆｉｌｉｎ（商標）の特異的および非特異的なカップリング
【０１８５】
マトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）のカップリングが、下記の方法により得られた。
１．）デキストランマトリクスに対するＣ末端システインを介したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓのカップリング、
２．）ＢＩＡＣＯＲＥシステムの前記デキストランマトリクスに対する第１級アミノ基を介したＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９のカップリング、および、
３．）ＥＤＣ／ＮＨＳによるポリメタクリル酸マトリクスに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９の非特異的なカップリング。
【０１８６】
１．）ＢＩＡＣＯＲＥシステムのデキストランマトリクスに対するＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓのカップリングを、導入したＣ末端システインを介して、選択的に行った。この目的のため、デキストランマトリクスのカルボキシル基を、ＮＨＳ／ＥＤＣを用いて、接触時間２分間で活性化し、続いて、チオールカップリング試薬ＰＤＥＡ（０．１Ｍホウ酸バッファーｐＨ８．５中に２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン）を加えた。４分間の反応時間の後、精製されたＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０）を、この方法において修飾された前記デキストランチップに添加し、前記反応を７分間続けた。未反応ＰＤＥＡの不活性化を、５０ｍＭ Ｌ−システイン（１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて４分間行った。この方法により、３５０ユニット（ＲＵ）のＳＰＵ３−Ａ１＿Ｃｙｓを前記チップ上に固定化でき、さらに反応速度分析に使用できた。反応速度測定の後、前記チップを、０．１グリシン（ｐＨ２．２）、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。この方法において、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）チップの結合活性は、２０〜３０回の再生サイクル後でさえ変化しなかった（図８）。
【０１８７】
２．）さらに、以下の方法により、ＳＰＣ７−Ｅ９を、前記ＢＩＡＣＯＲＥデキストランマトリクスのカルボキシル基に対して、ＮＨＳ／ＥＤＣ法により、表面に露出したアミノ基（リジン）を介して、非特異的に結合することができた。前記ＣＭ５チップを、７分間、ＮＨＳ／ＥＤＣを用いて活性化し、その後、精製ＳＰＣ７−Ｅ９（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０）を、さらに、７分間、前記チップに通過させた。カップリングを行った後、残留した反応性基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を用いて７分間不活性化した。解離定数の分析のため、標的ｐｒｏＮＧＦを異なる濃度で前記チップに通過させ、結合をオンラインでモニターし（図９）、続いて、曲線を前記ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて評価した。この方法において、ＫＤ値を１．４ｎＭと決定できた。反応速度測定の後、前記チップを０．１グリシン（ｐＨ２．２）、１０ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨ、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。この方法において、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）チップの結合活性は、複数回の再生サイクル後でさえ変化しなかった。
【０１８８】
３．）精製ＳＰＣ７−Ｅｐタンパク質（４ｍｇ）を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に通して、０．１Ｍホウ酸バッファー（０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ９）に緩衝させ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｅｐｏｘｙ（Ｍ）に結合させた。この目的のため、前記ゲル（０．５ｇ）を、０．１Ｍホウ酸バッファー（０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ９）において、２時間、室温でインキュベートし、その後、このバッファーを用いて数回洗浄した。カップリング反応を前記エポキシマトリクスへのＳＰＣ７−Ｅ９の添加により開始し、２４時間、室温で連続的に攪拌を続けた。コントロールとして、ＳＰＣ７−Ｅ９を有しない標準カラムを用い、同様の方法で処理した。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ９．５）により、前記反応を、４８時間、室温で停止し、前記ゲルマトリクスを、酢酸ナトリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）、１Ｍ ＮａＣｌおよびＰＢＳを用いて（それぞれカラムの５０倍量ずつ）洗浄した。この方法により産出された前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）ＳＰＣ７−Ｅ９親和性マトリクスをＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、１×１０ｃｍ）に充填し、クロマトグラフィーシステム（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に連結した。全てのケースにおいて、ＰＢＳ（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を、ランニングバッファーとして、流速１ｍＬ／分で用いた。この方法において産出された前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムの結合能力を検査するために、精製ｐｒｏＮＧＦを添加した。前記カラムを１０〜２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、結合したｐｒｏＮＧＦを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）を用いて溶出した（図１０）。さらに、ＢＳＡの基質混合物およびＥ．ｃｏｌｉの粗抽出液から、ｐｒｏＮＧＦを分離することが可能であった。この目的のため、１ｍＬのＢＳＡ溶液（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社）を、０．５ｍＬのｐｒｏＮＧＦ（１．３ｍｇ／ｍＬ）に混合し、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムに添加した。前記カラムを、カラムの２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、結合したｐｒｏＮＧＦをグリシン（０．１Ｍ、ｐＨ２．２）で溶出した。カラムの１０倍量の６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌで、前記カラムを再生した後、さらに、１ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液（５０ｍＬのＢｌ２１の一晩培養液の菌体ペレットの細胞破壊（リゾチーム／ベンゾナーゼ／超音波）後の可溶化上清）と０．５ｍＬのｐｒｏＮＧＦ（１．３ｍｇ／ｍ）との混合物を、前記Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）カラムに添加した。前記カラムを、カラムの２０倍量のランニングバッファーで洗浄した後、グリシン（０．１Ｍ、ｐＨ２．２）で、結合したｐｒｏＮＧＦを溶出した。続いて、前記カラムを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）、１０ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨ、６Ｍ Ｇｕａ／ＨＣｌ、６Ｍ尿素および２０％エタノールを用いて再生した。ＢＳＡおよびＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液からのｐｒｏＮＧＦの分離からの前記溶出画分を、ゲル電気泳動法により分析した（図１１）。１０回のテストの後、前記ＳＰＣ７−Ｅ９カラムに対するｐｒｏＮＧＦの未変化の結合が観測できた。
【０１８９】
【表１】
【０１９０】
【表２】
【０１９１】
ヒトγ−II−クリスタリンライブラリのＤＮＡ配列
CR20 (SEQ ID NO:1)
ATGGGTNNKATCNNKTTCNNKGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTNNKTACNNKTGCNNKACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCNNKGTTNNKTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaatt
cactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
【０１９２】
γ−II−クリスタリンに基づくAffilin（商標）のＤＮＡ配列
SPC1-A1 (SEQ ID NO:2)
ATGGGTTTTATCTGGTTCATGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACGATTGCGGTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAAGGTTAAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-A7 (SEQ ID NO:3)
ATGGGTCTGATCTGTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-G3 (SEQ ID NO:4)
ATGGGTTCTATCATTTTCCTTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTATTTACGGTTGCACTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCGTGGTTCAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCgtcaccagtacttcctgcggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg
SPC1-A7BB (SEQ ID NO:5)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTgCCTGACCGACTGCCCGAaCCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGaACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTgTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7JJ (His10を含む) (SEQ ID NO:6)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTgCCTGACCGACTGCCCGAaCCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGaACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTgTACCTCGAGTgCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7_Cys (His10を含む) (SEQ ID NO:7)
ATGGGtCTGATCTCTtTcTcTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGtAcAtgTGCCTgAcCGacTgCccGAACCTGCAGCCGTACTTcTcCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTcCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGAcTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCtGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGaGTCATgGATTTgTACCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGaTCTTgCCATCACCATCACCACCaCCACCAcCACCAC
SPC7-E9 (His6を含む) (SEQ ID NO:8)
ATGGGTTTTATCTGTTTCTTGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTTCTTACGCTTGCGATACTGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAGTGTTCTGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTgCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
【０１９３】
ヒトユビキチンライブラリのＤＮＡ配列
Ubiquitin wildtype (SEQ ID NO:9)
ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAAAATGTGAAGGCCAAGATCCAAGATAAAGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGACTACAACATCCAGAAAGAGTCGACCCTGCACCTGGTCCTCCGCCTGAGGGGCGGC
Modified ubiquitin (MUBI) (SEQ ID NO:10)
ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
UB10 (library) (SEQ ID NO:11)
ATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCNNKNNKNNKNNKNNKCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
【０１９４】
ユビキチンに基づくAffilin（商標）のＤＮＡ配列
SPU11-3-A1 (His6を含む) (SEQ ID NO:12)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGaGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGcACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SPU11-3-A1_Cys (His10を含む) (SEQ ID NO:13)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGaGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGcACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
【０１９５】
プライマー
pCAN700 (SEQ ID NO:14)
(5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’)
A7Cys4Ser_for (SEQ ID NO:15)
(5’-CCA TGG GTC TGA TCT CTT TCT CTG AAG ACC G-3’)
A7Cys4Ser_rev (SEQ ID NO:16)
(5’-CGG TCT TCA GAG AAA GAG ATC AGA CCC ATG G-3’)
pETTerm (SEQ ID NO:17)
(5’-GCT AGT TAT TGC TCA GCG GTG GC-3’)
A7Gly2Cys_for (SEQ ID NO:18)
(5’-GGA TTT GTA CCT CGA GTG CGG CGG CCA TCA CCA TCA CCA CCA CCA CCA CCA CCA CTG AGA TCC GGC-3’)
A7Gly2Cys_rev (SEQ ID NO:19)
(5’-GCC GGA TCT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGA TGG TGA TGG CCG CCG CAC TCG AGG TAC AAA TCC-3’)
A7Gly2Ser_for (SEQ ID NO:20)
(5’-GGA TTT GTA CCT CGA GTC CGG CGG CCA TCA CC-3’)
A7Gly2Ser rev (SEQ ID NO:21)
(5’-GGT GAT GGC CGC CGG ACT CGA GGT ACA AAT CC-3’)
A7Gly2Ser_rev (SEQ ID NO:22)
(5’-GGT GAT GGC CGC CGG ACT CGA GGT ACA AAT CC-3’)
Gly4SerCys_HindIII (SEQ ID NO:23)
(5’-GGG GGA AGC TTT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGA TGG TGA TGG CAA GAT-3’)
A7Cys4Ser_Nde (SEQ ID NO:24)
(5’-GGA GAT ATA CAAT ATG GGT CTG ATC TCT TTC TCT G-3’)
【０１９６】
SEQ ID NO: 25:
ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCGGC CCAGCCGGCC 60
ATGGCCATGC AAATCTTCGT TAAAACCCTG ACGGGAAAGA CTATCACCCT GGAGGTAGAA 120
CCGTCCGACA CCATCGAAAA TGTCAAAGCT AAAATCCAAG ACAAAGAAGG AATTCCACCT 180
GACCAGCAAC GCCTAGCTTT CGCAGGACGA CAACTAGAGG ACGGGCTCAC CCTGTCTGAC 240
TACAACATCC AAAAAGAATC CACCCTCCAC CTGGCACTCC TCCTGCGGGC C 291
SEQ ID NO: 26
ATGCAAATCT TCGTTAAAAC CCTGACGGGA AAGACTATCA CCCTGGAGGT 50
SEQ ID NO: 27
GGATTTTAGC TTTGACATTT TCGATGGTGT CGGACGGTTC TACCTCCAGG GTG 53
SEQ ID NO: 28
GTCAAAGCTA AAATCCAAGA CAAAGAAGGA ATTCCACCTG ACCAGCAACG CCT 53
SEQ ID NO: 29
GGGTGAGCCC GTCCTCTAGT TGTCGTCCTG CGAAAGCTAG GCGTTGCTGG 50
SEQ ID NO: 30
GACGGGCTCA CCCTGTCTGA CTACAACATC CAAAAAGAAT CCACCCTCCA 50
SEQ ID NO: 31
GAGTGCTCGC AGCAGGAGTG CCAGGTGGAG GGTGGATTC 39
SEQ ID NO: 32
GATATACATA TGCAAATCTT CG 22
SEQ ID NO: 33
GTGGTGCTCG AGTGCTCG 18
SEQ ID NO: 34
CCAGCCGGCC ATGGCCATGN NKATCNNKGT TNNKACCCTG ACGGGAAAGA CTATC 55
SEQ ID NO: 35
CAGGAGGAGT GCCAGGTGGA GMNNMNNMNN MNNMNNGATG TTGTAGTCAG ACAGG 55
SEQ ID NO: 36
GTTATTACTC GCGGCCCAGC CGGCCATGGC CATG 34
SEQ ID NO: 37
GAGTTTTTGT TCGGCCTCGA GGGCCCGCAG GAGGAGTGCC AGGTGGAG 48
【０１９７】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】γ−II−クリスタリンの空間的構造。Ｎ末端ドメインにおいて、新規に産出した結合表面を黄色で示す。前記結合表面の外側に局在したリジン残基のＣ末端部位を、赤の球により強調する。
【図２】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）変異体ＳＰＣ１−Ａ１（Ａ）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｂ）およびＳＰＣ１−Ｇ３（Ｃ）の結合を競合させるための、Ｂｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。前記試験のため、１８０ＲＵのポリクローナルＩｇＧ Ｆｃを固定化した。結合競合のため、表示された濃度の変異体およびＩｇＧ Ｆｃを用いた。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。
【図３】ｐｒｏＮＧＦに対するＳＰＣ７−Ｅ９の結合の検出のための濃度依存ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍＬのｐｒｏＮＧＦでコートした。１：:１０００の希釈で抗ヒトのγ−II−クリスタリン抗体−ＰＯＤ複合体を、検出抗体として用いた。示された吸光度は、２つの同時測定の平均値である。２００ｎＭの見かけ上のＫＤ値が計算された。
【図４】ヒトのＩｇＧ Ｆｃに対するＳＰＣ１−Ａ７＿Ｃｙｓの結合を検出するための濃度依存ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ Ｆｃでコートした。１：１０００の希釈で抗ヒトγ−II−クリスタリン抗体―ＰＯＤ複合体を、検出抗体として用いた。示された吸光度は、２つの同時測定の平均値である。２３３ｎＭの見かけ上のＫＤ値が計算された。
【図５】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ−ＰＥ複合体の結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。３０００ＲＵのＩｇＧ Ｆｃを固定化し、１２１ｎＭ（赤）、７５ｎＭ（緑）、６ｎＭ（青）濃度のＳＰＣ１−Ａ７ＢＢ−ＰＥ複合体を、前記チップに通過させた。結合段階を１分間、続けて、解離段階を３分間とした。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、肉眼でのＫＤ値１５ｎＭが計算された。
【図６】固定化されたＩｇＧ Ｆｃを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ１−Ａ７Ｏｙｓｔｅｒ５５６の結合を試験するためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。１０００ＲＵのＩｇＧ Ｆｃを前記チップ上に固定化し、１μＭ（青）および５μＭ（赤）濃度のＳＰＣ１−Ａ７Ｏｙｓｔｅｒ５５６を、前記チップに通過させた。結合および解離段階をどちらも３分間とした。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。
【図７】ＥＬＩＳＡによるＩｇＧに対するＡｆｆｉｌｉｎ（商標）−ＰＯＤ複合体の結合の検出。１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧをマイクロタイタープレート上に固定化した。ＰＢＳ中のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）―ＰＯＤ複合体の別の希釈液をマイクロタイタープレート上で１時間インキュベートした。洗浄工程の後、結合したＰＯＤの活性をＴＭＢ基質溶液により検出した。
【図８】ＮＧＦに対するＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓの結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。２００ＲＵのＳＰＵ１１−３−Ａ１＿Ｃｙｓを、ＰＤＥＡ法によりＣＭ５チップに結合させ、異なる濃度のＮＧＦを、前記チップに通過させた。結合および解離段階をどちらも３分間とした。ＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０含有）を、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、ＫＤ値４６ｎＭが計算された。
【図９】ｐｒｏＮＧＦを有するＣＭ５チップに対するＳＰＣ７−Ｅ９の結合のためのＢｉａｃｏｒｅ試験のセンサーグラム。２８０ＲＵのｐｒｏＮＧＦを、固定化し、異なる濃度のｐｒｏＮＧＦを、前記チップに通過させた。ＨＢＳ−ＥＰを、流速３０μＬ／分で、ランニングバッファーとして用いた。曲線から、ＫＤ値１．４ｎＭが計算された。
【図１０】ＳＰＣ７−Ｅ９親和性カラムからのｐｒｏＮＧＦの溶出。４００μｇの精製されたｐｒｏＮＧＦを添加し（時間０、ピンクの点線）、後の洗浄を、カラム体積の２０倍量のランニングバッファーにより行った。前記溶出を、０．１ＭグリシンｐＨ２．２（緑線）により行った。前記作業を、１ｍＬ／分の流速で行った。タンパク質の検出を、２８０ｎｍ（青線）により行った。
【図１１】ＢＳＡ溶液およびＥ．ｃｏｌｉの粗抽出液からのｐｒｏＮＧＦ分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（左から右に向かって）レーン１：マーカータンパク質、レーン２：ＢＳＡ標準、レーン３：ｐｒｏＮＧＦ標準、レーン４：ＢＳＡおよびｐｒｏＮＧＦ標準の混合物（開始）、レーン５：フロースルー、レーン６：０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）による溶出液、レーン７：なし、レーン８：Ｅ．ｃｏｌｉの粗抽出液（Ｂｌ２１）およびｐｒｏＮＧＦ標準、レーン９：フロースルー、レーン１０：０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）による溶出液。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分を含む複合体であり、
ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づく１以上のポリペプチド（Ｉ）であって、対応する野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させたリガンドに対する特異的結合の結合特性を、それぞれ有する前記ポリペプチドと、
それに共有結合的に結合される１以上の機能性成分（II）とを含み、
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリング後、全ての成分の機能性が維持されている、複合体。
【請求項２】
前記野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させた前記結合特性が、前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域における１以上のアミノ酸置換に基づく、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、リガンドに特異的に結合するための前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域の外部領域において行われる、請求項１または２記載の複合体。
【請求項４】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、リガンドに対する特異的結合の新たに発生または変化させた結合特性を有する前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの外部領域において行われる、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、前記（Ｉ）のアミノ酸残基を介して行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、（Ｉ）への付加的な末端ペプチド融合におけるアミノ酸残基を介して行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記カップリングが、前記（Ｉ）におけるシステインまたはリジン側鎖を介して、未方向性（未配向性）の形式で、部位特異的または選択的に行われる、請求項５記載の複合体。
【請求項８】
前記リガンドに対する前記（Ｉ）の結合表面の外部側鎖が、カップリングに関与する、請求項５または７記載の複合体。
【請求項９】
前記ユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）において、前記カップリングが、前記ユビキチン分子のリジン残基２９および３３を介して行われる、請求項７または８記載の複合体。
【請求項１０】
前記γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）において、リガンドに対する特異的結合の新たに発生または変化させた結合特性を有するペプチドドメインが、Ｎ末端ドメインであり、且つ、前記（II）に対する（Ｉ）のカップリングが、Ｃ末端ドメインを介して行われる、請求項７または８記載の複合体。
【請求項１１】
前記（Ｉ）に対する付加的な末端ペプチド融合が、１以上のシステイン残基または１以上のリジン残基を含み、好ましくは、これらのアミノ酸残基は、リガンドとの（Ｉ）の相互作用に関与しない、請求項６記載の複合体。
【請求項１２】
前記機能性成分（II）が、ポリペプチドおよびタンパク質、有機ポリマーおよび無機ポリマー、核酸、脂質、糖、低分子量物質、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記機能性成分（II）が、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、好ましくは、タンパク質発色団、酵素、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、毒素または（Ｉ）のポリペプチドである、請求項１２記載の複合体。
【請求項１４】
前記機能性成分（II）が、ポリマー、好ましくは、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリビニル、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースもしくはポリエチレングリコール、またはポリマー誘導体である、請求項１２記載の複合体。
【請求項１５】
前記機能性成分（II）が、低分子量物質、好ましくは、染料、ビオチン、ジオキシゲニン、重金属、キレート剤、放射性同位元素、抗生物質または細胞毒物質である、請求項１２記載の複合体。
【請求項１６】
前記成分（Ｉ）が、ポリペプチド、ペプチド、低分子量物質、脂質、糖、核酸、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに、これらの物質の誘導体からなる群から選択されたリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記成分（Ｉ）が、ポリペプチドまたはタンパク質、好ましくは、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、糖化タンパク質、ウイルスタンパク質ならびに細胞表層マーカーであり、好ましくは、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記成分（Ｉ）が、ペプチド、好ましくは、アフィニティタグ、好ましくは、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグもしくはＦＬＡＧ−タグ、または、ウイルス由来ペプチドであるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
前記成分（Ｉ）が、低分子量物質、好ましくは、ステロイド、コレステロールおよび、例えば、ハロゲン化炭化水素のような有毒物質であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
前記成分（Ｉ）が、脂質または脂質誘導体、好ましくは、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記成分（II）が、前記（Ｉ）と同一の、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチドであり、それに共有結合されることによって、（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
前記成分（II）が、成分（Ｉ）が数回共有結合する、ポリペプチド、タンパク質またはポリマーであり、
これによって、前記（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２３】
前記成分（II）が、ポリペプチドまたはポリマーであり、前記成分（Ｉ）に対する共有結合の後、同型の他の複合体に対する共有結合または非共有結合を受け、
これによって、前記（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２４】
前記成分（Ｉ）が、ＳＰＣ１−Ａ１（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．２）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．３）、ＳＰＣ１−Ｇ３（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．４）、ＳＰＵ１１−３−Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２および１３）およびＳＰＣ７−Ｅ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）の分子のうちの１つである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法であって、既知配列の成分（Ｉ）から開始され、下記工程を含む方法。
タンパク質の空間構造の分析による、カップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外部残基の同定；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法であって、カップリングに適したアミノ酸残基が同定されていない既知配列の成分（Ｉ）から開始され、下記工程を含む方法。
置換、挿入または融合によるカップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用表面の外部表面に露出される残基の導入；
導入されたアミノ酸残基の露出度の検出；
この方法により変化させた成分（Ｉ）の機能性の検出；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【請求項２７】
請求項２５または２６記載の方法により製造される前記複合体。
【請求項２８】
請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体を含む診断キット。
【請求項２９】
請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体、および、薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学組成物。
【請求項３０】
前記機能性成分が、膜、ポリマービーズまたはクロマトグラフィー支持材である、請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体を含む親和性向上のための組成物。
【請求項３１】
診断、治療およびアフィニティークロマトグラフィーに使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体、請求項２７記載の複合体、または、請求項２８、２９もしくは３０記載のキットもしくは組成物の使用。
【請求項１】
下記成分を含む複合体であり、
ユビキチンまたはγ−クリスタリンに基づく１以上のポリペプチド（Ｉ）であって、対応する野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させたリガンドに対する特異的結合の結合特性を、それぞれ有する前記ポリペプチドと、
それに共有結合的に結合される１以上の機能性成分（II）とを含み、
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリング後、全ての成分の機能性が維持されている、複合体。
【請求項２】
前記野生型ポリペプチドと比較して新たに発生または変化させた前記結合特性が、前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域における１以上のアミノ酸置換に基づく、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、リガンドに特異的に結合するための前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの表面露出領域の外部領域において行われる、請求項１または２記載の複合体。
【請求項４】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、リガンドに対する特異的結合の新たに発生または変化させた結合特性を有する前記ポリペプチド分子（Ｉ）のβシートの外部領域において行われる、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、前記（Ｉ）のアミノ酸残基を介して行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記（II）に対する前記（Ｉ）のカップリングが、（Ｉ）への付加的な末端ペプチド融合におけるアミノ酸残基を介して行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記カップリングが、前記（Ｉ）におけるシステインまたはリジン側鎖を介して、未方向性（未配向性）の形式で、部位特異的または選択的に行われる、請求項５記載の複合体。
【請求項８】
前記リガンドに対する前記（Ｉ）の結合表面の外部側鎖が、カップリングに関与する、請求項５または７記載の複合体。
【請求項９】
前記ユビキチンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）において、前記カップリングが、前記ユビキチン分子のリジン残基２９および３３を介して行われる、請求項７または８記載の複合体。
【請求項１０】
前記γ−クリスタリンに基づくポリペプチド分子（Ｉ）において、リガンドに対する特異的結合の新たに発生または変化させた結合特性を有するペプチドドメインが、Ｎ末端ドメインであり、且つ、前記（II）に対する（Ｉ）のカップリングが、Ｃ末端ドメインを介して行われる、請求項７または８記載の複合体。
【請求項１１】
前記（Ｉ）に対する付加的な末端ペプチド融合が、１以上のシステイン残基または１以上のリジン残基を含み、好ましくは、これらのアミノ酸残基は、リガンドとの（Ｉ）の相互作用に関与しない、請求項６記載の複合体。
【請求項１２】
前記機能性成分（II）が、ポリペプチドおよびタンパク質、有機ポリマーおよび無機ポリマー、核酸、脂質、糖、低分子量物質、ペプチドならびにこれらの物質の誘導体からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記機能性成分（II）が、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、好ましくは、タンパク質発色団、酵素、免疫グロブリン、免疫グロブリン誘導体、毒素または（Ｉ）のポリペプチドである、請求項１２記載の複合体。
【請求項１４】
前記機能性成分（II）が、ポリマー、好ましくは、デキストラン、ポリメタクリル酸、セファロース、アガロース、ポリビニル、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースもしくはポリエチレングリコール、またはポリマー誘導体である、請求項１２記載の複合体。
【請求項１５】
前記機能性成分（II）が、低分子量物質、好ましくは、染料、ビオチン、ジオキシゲニン、重金属、キレート剤、放射性同位元素、抗生物質または細胞毒物質である、請求項１２記載の複合体。
【請求項１６】
前記成分（Ｉ）が、ポリペプチド、ペプチド、低分子量物質、脂質、糖、核酸、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに、これらの物質の誘導体からなる群から選択されたリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記成分（Ｉ）が、ポリペプチドまたはタンパク質、好ましくは、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン誘導体、血漿から得られるタンパク質、血液凝固因子および阻害剤、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、受容体タンパク質、糖化タンパク質、ウイルスタンパク質ならびに細胞表層マーカーであり、好ましくは、ＣＤ１４、ＣＤ２５およびＣＤ３４であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記成分（Ｉ）が、ペプチド、好ましくは、アフィニティタグ、好ましくは、Ｓ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｍｙｃ−タグもしくはＦＬＡＧ−タグ、または、ウイルス由来ペプチドであるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
前記成分（Ｉ）が、低分子量物質、好ましくは、ステロイド、コレステロールおよび、例えば、ハロゲン化炭化水素のような有毒物質であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
前記成分（Ｉ）が、脂質または脂質誘導体、好ましくは、細菌のリポポリサッカライド、リポソームおよびリポタンパク質であるリガンドに対する新たに発生または変化された特異的結合の結合特性を示す、請求項１から１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記成分（II）が、前記（Ｉ）と同一の、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく１以上のポリペプチドであり、それに共有結合されることによって、（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
前記成分（II）が、成分（Ｉ）が数回共有結合する、ポリペプチド、タンパク質またはポリマーであり、
これによって、前記（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２３】
前記成分（II）が、ポリペプチドまたはポリマーであり、前記成分（Ｉ）に対する共有結合の後、同型の他の複合体に対する共有結合または非共有結合を受け、
これによって、前記（Ｉ）のリガンドに対する親和性の向上が、アビディティー効果により達成される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２４】
前記成分（Ｉ）が、ＳＰＣ１−Ａ１（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．２）、ＳＰＣ１−Ａ７（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．３）、ＳＰＣ１−Ｇ３（Ｓｅｑ．ＩＤ ＮＯ．４）、ＳＰＵ１１−３−Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２および１３）およびＳＰＣ７−Ｅ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）の分子のうちの１つである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法であって、既知配列の成分（Ｉ）から開始され、下記工程を含む方法。
タンパク質の空間構造の分析による、カップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用の表面の外部残基の同定；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法であって、カップリングに適したアミノ酸残基が同定されていない既知配列の成分（Ｉ）から開始され、下記工程を含む方法。
置換、挿入または融合によるカップリングに適したアミノ酸残基、好ましくは、リガンドとの（Ｉ）の相互作用表面の外部表面に露出される残基の導入；
導入されたアミノ酸残基の露出度の検出；
この方法により変化させた成分（Ｉ）の機能性の検出；
適したカップリング試薬によるカップリングパートナーの活性化；
カップリング反応の実行；
複合体の単離；および
複合体の両成分の機能性の検出
【請求項２７】
請求項２５または２６記載の方法により製造される前記複合体。
【請求項２８】
請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体を含む診断キット。
【請求項２９】
請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体、および、薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学組成物。
【請求項３０】
前記機能性成分が、膜、ポリマービーズまたはクロマトグラフィー支持材である、請求項１から２４または２７のいずれか一項に記載の複合体を含む親和性向上のための組成物。
【請求項３１】
診断、治療およびアフィニティークロマトグラフィーに使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の複合体、請求項２７記載の複合体、または、請求項２８、２９もしくは３０記載のキットもしくは組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５１６２１０（Ｐ２００８−５１６２１０Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５１１９（Ｐ２００７−５３５１１９）
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４０１２９
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４０１２９
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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