活性化Ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるＴＨ１型／ＴＨ２型サイトカインの発現の調節
【課題】活性化Ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるＴＨ１型／ＴＨ２型サイトカインの発現を調節すること。
【解決手段】リバビリンは、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、１種以上のリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。
【解決手段】リバビリンは、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、１種以上のリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は免疫学である。
【背景技術】
【０００２】
リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群のポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割の解明が進められた。ヘルパーＣＤ４＋（及びＣＤ８＋）Ｔ細胞により産生されるリンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、２種の表現型、Ｔｈ１及びＴｈ２のどちらかに属する場合が多い〔Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：２５６−２５７，Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３〕。Ｔｈ１型細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生し、主として遅延型過敏症などの細胞性免疫に関与する。Ｔｈ２型細胞は、インターロイキン類、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生し、主としてＩｇＥ及びＩｇＧ４抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与する（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３）。
【０００３】
強度に分極したＴｈ１型及びＴｈ２型応答は、保護において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Ｔｈ１型応答は、実験的自己免疫型ぶどう膜網膜炎（Ｄｕｂｅｙら，１９９１，Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２：１４７−１５２）、実験的自己免疫型脳炎（ＥＡＥ）（Ｂｅｒａｕｄら，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３７９−３８９）及びインスリン依存性糖尿病（Ｈａｈｎら，１９８７，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：２０３７−２０４２）などの器官特異的自己免疫状態や、接触性皮膚炎（Ｋａｐｓｅｎｂｅｒｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：３９２−３９５）及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Ｔｈ２型応答は、（一般的な環境性アレルゲンに対する）アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘息（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐ Ｄｉｓ １４８：１０９−１１５）及びアトピー性皮膚炎（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎら，１９９１，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ ９７：３８９−３９４）の誘発に関与し、蠕虫蠕虫（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：Ａ６２−６６）やＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ（Ｃａｃｅｒｅｓ−Ｄｉｔｔｍａｒら，１９９３，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９１：５００−５０５）などの組織寄生原虫類感染症を悪化させると考えられ、高ＩｇＥ症候群（Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら，１９８９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：５６−６０）などの特定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高ＩｇＥ症候群（Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら，１９８９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：５６−６０）の低下に関連し、ＨＩＶ複製抑制能（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１１３５−１１１３９）の低下に関連する。
【０００４】
従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有用なことは明らかである。恐らく、Ｔｈ１型応答を促進するとＴｈ２表現型が抑制され、Ｔｈ２型応答を促進するとＴｈ１表現型が抑制されるであろう。リンホカインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、リンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸化防止剤（Ｊｅａｎｎｉｎら，１９９５，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２ １７８５−１７９２）は、疾患促進サイトカインパターン、Ｔｈ１又はＴｈ２のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因を逆転させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、ＩＦＮγにより抑制され、ＩＬ−４により悪化するが、線虫感染症は、ＩＬ−４により抑制され、ＩＦＮγにより悪化する（Ｈｅｉｎｚｅｌら，１９８９，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６２：５９−７２，Ｅｌｓｅら，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：３４７−３５１）。ＮＯＤマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのＥＡＥは、該疾患が発症する前にＩＬ−４又は抗ＩＦＮγ ｍＡｂで治療すると改善され得る（Ｒａｐｏｐｏｒｔら，１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：８７−９９，Ｒａｃｋｅら，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：１９６１−１９６６，Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８７：７３９−７４２）。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）は、Ｔｈ２型リンホカインの産生に関連し、抗ＩＬ−４抗体によって阻害される（Ｕｍｌａｎｄら，１９９２，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ６３：６６−７３）。一方、Ｔｈ１型サイトカインは、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＴＬになり、宿主の免疫系を破壊する急性ＧＶＨＤにおいて産生される。抗ＩＦＮγ又は抗ＴＮＦα ｍＡｂで治療すると疾患が改善され、抗ＩＬ−２ｍＡｂで治療すると急性ＧＶＨＤが自己免疫型ＧＶＨＤに変化する（Ｖｉａ及びＦｉｎｋｅｌｍａｎ，１９９３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５６５−５７２）。
【０００５】
１９８３年以来、ＨＩＶ感染患者の治療において天然及び組換えＩＬ−２の臨床実験が進められている（Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇら，１９８７，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，３：１１５−１２４）。この場合、両者の関係は、ＡＩＤＳの発症が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来する（Ｃｌｅｒｉｃｉ及びＳｈｅａｒｅｒ，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５：５７５−５８１）。発症に向かって進行している感染患者では、ＩＬ−２などのＴｈ１型リンホカインの発現が経時的に低下する（Ｍａｇｇｉら，１９８７，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：１６８５−１６９０，Ｇｒｕｔｅｒｓら，１９９０，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：１０３９−１０４４，Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９１：７５９−７６５）と同時に、ＩＬ−４及びＩＬ−１０などのＴｈ２型リンホカインの産生が増大する（Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９３：７６８−７７５，Ｈｏｆｆｍａｎら，１９８５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：３２６−３３５）。ＩＬ−２で治療した非症候性又は長期生存患者由来のＴ細胞は、その抗ＨＩＶ活性が増強されていたが、ＩＬ−４又はＩＬ−１０に暴露すると、そのＨＩＶ複製抑制能及びＩＬ−２産生能が低下した（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１１３５−１１１３９）。
【０００６】
しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬（ｍＡｂ及び組換えサイトカイン）には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。ｍＡｂに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減させる「人化」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）モノクローナル抗体が開発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なｍＡｂは依然、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免疫型ＧＶＨＤをＩＬ−１２で治療すると急性ＧＶＨＤが発症する。
【０００７】
リバビリン（登録商標）（１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである（Ｈｕｆｆｍａｎら，１９７３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３：２３５，Ｓｉｄｗｅｌｌら，１９７２，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７７：７０５）。本発明者は、リバビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認した（Ｊｏｌｌｅｙ及びＳｕｃｈｉｌ，１９８４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ：９３−９６ページを再検討した）。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化Ｔ及びＢリンパ球の増殖に影響を与え〔Ｔａｍら、１９９５（データ示さず），Ｐｅａｖｙら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９：５８３−５８９〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合わせると、長期の同種移植生存に効力を示す（Ｊｅｌｌｅｙら，１９８８，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ ２０：７０３−７０６）という他の人々の所見を確認した。
【０００８】
また、本発明者は、リバビリンが、Ｔｈ１型応答を促進し且つＴｈ２型応答を抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第１に、リバビリンが機能性体液性免疫応答（Ｐｅａｖｙら，１９８１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６：８６１−８６４，Ｐｏｗｅｒｓら，１９８２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２２：１０８−１１４）及び肥満細胞分泌のＩｇＥ媒介性調節（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら，１９８７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４０：１４５−１４９）（いずれもＴｈ２型リンホカイン媒介性事象である）のどちらをも阻害することは公知である。第２に、リバビリンは、ＨＩＶ患者由来の末梢血リンパ球においてアジドチミジン（ＡＺＴ）の抗ウイルス作用を拮抗する（Ｖｏｇｔら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１３７６−１３７９）。この知見は重要である。というのは、ＡＺＴはＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を低下させるがＩＬ−２の発現は低下させないからである（Ｖｉｏｒａ及びＣａｍｐｏｎｅｓｃｈｉ，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：２８９−２９５）。従って、リバビリンが、ＩＬ−２の発現を調節し且つ低下したＩＬ−２Ｒレベルを上昇させることによりＡＺＴを拮抗することは可能である。第３に、慢性ＧＶＨＤ（Ｔｈ２媒介性疾患）を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである（Ｃａｓｓａｎｏ，１９９１，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７：２４７−２４８）。最後に、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者をリバビリンで（１年間）治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球の凝集率が低下し且つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した（Ｄｕｓｈｅｉｋｏら，１９９４，Ｊａｎ；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９（１）：１３−８）。この所見は、Ｃ型肝炎に対する主要免疫応答はＴｈ１型リンホカインにより媒介されるが、Ｔｈ０／Ｔｈ２表現型のＴ細胞はＨＣＶを介して感染し得る（Ｚｉｇｎｅｇｏら，１９９４，未公開データ）ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）として表す。
【００１０】
図２は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２（Ａ及びＣ）及びＩＬ−４（Ｂ及びＤ）の細胞外発現に及ぼす、２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下の２、１０又は５０ｍＭのリバビリンの作用（左側パネル）と、１０ｍＭのリバビリンの存在下の５００、１，０００又は２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの作用（右側パネル）を表すグラフである。
【００１１】
図３は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。
【００１２】
図４は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率（％）として表す。
【００１３】
図５は、休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはＰＭＡ／イオノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はＰＭＡ／イオノマイシン処理を１０ｍＭのリバビリンの存在下（Ｃ及びＧ）若しくは５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下（Ｄ及びＨ）に行った活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（上部パネル）若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞（下部パネル）における細胞内ＩＬ−２の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデータを示し、ＩＬ−２とＣＤ４又はＣＤ８の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。
【００１４】
図６は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
【００１５】
図７は、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。
【００１６】
発明の要旨
本発明の１つの態様によれば、このヌクレオシド、即ちリバビリンを、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。
【００１７】
従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の異常の治療に用いる。そのような異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性アトピー性疾患、蠕虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫不全に付随するものとして見出され得る。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、１種以上のリバビリン類似体を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。
【００１９】
発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して０．２５〜１２．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２．５ｍｇ／ｍｌの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、１日につき体重１ｋｇ当たり約４．５ｍｇであり、都合２００〜１，２００ｍｇの投薬量で投与し得る。１日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい。
【００２０】
リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形や投与経路が公知となっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、１種以上の医薬上許容し得る担体をさらに含み得、該担体は、（長期貯蔵用の）安定剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。
【００２１】
リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。
【００２２】
さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかった（既知又は未知の）数種のビラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するビラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るためにビラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的なＤ型ビラゾールにも、Ｌ型ビラゾールにも適用し得るように企図されている。
【実施例】
【００２３】
細胞系及びＴ細胞の精製
健康なドナー由来の血液６０ｍｌをフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離にかけた後、バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、Ｔ細胞に特異的なＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋリンパ球単離試薬（ＬＫ−２５Ｔ，Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用い、ＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。次いで、平均収量４０〜６０×１０６個のＴ細胞を、２０〜３０ｍｌのＲＰＭＩ−ＡＰ５〔２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、５％の自己由来血漿、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０５％の２−メルカプトエタノールを含むＰＲＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）〕中３７℃で一晩インキュベートして、不純混合付着細胞を除去した。全ての実験において、Ｔ細胞をＲＰＭＩ−ＡＰ５で洗浄し、次いで、９６ウエルマイクロタイタープレート上に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で平板培養した。
【００２４】
Ｔ細胞活性化及びリバビリン処理
５００ｎｇのイオノマイシン及び１０ｎｇのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を添加してＴ細胞を活性化し、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＴ細胞を、活性化直後に０．５〜５０ｍＭのリバビリン又は２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの対照抗ウイルス剤、インターフェロンα（Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で処理し、２４時間後に再処理した。各プレートからのＴ細胞を免疫蛍光法分析に用い、上清を細胞外サイトカインの測定に用いた。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、免疫蛍光法による細胞内サイトカインレベル及びサイトカイン受容体の発現の分析に用いた。
【００２５】
細胞外サイトカインの分析
各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒトサイトカインの濃度を定量した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いるか、又はＩＬ−２依存性細胞系、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いたバイオアッセイにかけて、活性化により誘発されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）のレベルの変化を定量した。ＥＬＩＳＡキットを用い、活性化により誘発された、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のレベルの変化を定量した。全てのＥＬＩＳＡの結果はｐｇ／ｍｌとして表し、ＣＴＬＬ−２バイオアッセイは、ＣＴＬＬ−２細胞による３Ｈ−チミジン（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）のＩＬ−２依存性細胞取込みを表す１分当たりのカウント数として表した。
【００２６】
直接免疫蛍光法実験（サイトカイン受容体）
蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色するために、細胞を生理食塩液、ｐＨ７．４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で２回洗浄し、５０ｍｌの生理食塩液に再懸濁し、２つの試料に分割した。一方の試料アリコートをＰＥ抗ＣＤ２５／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４又はＰＥ−ラット抗マウスＩｇＧ＋抗ＣＤｗ１２４／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４ ｍＡｂで同時染色し、第２のアリコートをＰＥ／ＦＩＴＣで標識したアイソタイプマッチド対照モノクローナル抗体で染色して、非特異的蛍光を評価した。蛍光標識したモノクローナル抗体は全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手したが、抗ＣＤｗ１２４はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手した。インキュベーションは、飽和ｍＡｂ濃度を用い暗所で４５分間４℃で行った。取り込まれなかった標識をＰＢＳで洗浄して除去した後、ＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００２７】
ゲートをかけた生きているＣＤ４＋Ｔ細胞中で抗原密度を間接定量し、平均蛍光チャンネル（ＭＣＦ）として表した。特異的抗原（ＣＤｗ１２４，ＣＤ２５）の表面発現を、ＦＩＴＣ又はＰＥ標識した抗原特異的ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦからＦＩＴＣ又はＰＥ標識したアイソタイプマッチド（ＩｇＧ１）対照ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦを減算して得られた平均チャンネル変化（ＭＣＳ）として表した。あるいは、ＣＤ２８ｍＡｂで染色された細胞のＣＤ４＋サブセットの表面発現を、ＣＤ２８−ＣＤ４−細胞のＭＣＦからＣＤ２８＋ＣＤ４＋のＭＣＦを減算して測定した。
【００２８】
未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロンα処理細胞の生存能力を、生体染料、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（最終濃度：５ｍｇ／ｍｌ）で染色することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチドを有する各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウムを除去した生存細胞の百分率をフロー・サイトメトリーで測定すると、用いた全ての濃度において、処理した後、＞９０％（９０〜９９％の範囲）であった。
【００２９】
細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２の細胞内発現を分析するために、先ず、４８〜７２時間の活性化の最後の４時間に、Ｔ細胞を１０ｍｇのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理して、新たに合成されるＩＬ−２の細胞外への分泌を最小限にした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。ＦＩＴＣ標識した細胞表面抗原、ＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体で直接染色（３０分間、４℃、暗所）する前に、細胞を生理的食塩液、ｐＨ７．４で２回洗浄し、１００〜１５０ｍｌの染色緩衝液〔１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生食液、ｐＨ７．４〕に再懸濁し、２つの試料に分割した。染色された細胞を１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、上清を吸引した後、細胞ペレットを１００ｍｌの固定緩衝液（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。固定された細胞を２０分間４℃に維持し、次いで、１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを５０ｍｌの透過性化緩衝液〔ＰＢＳ中０．１％サポニン（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）〕に攪拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で３０分間４℃で、ＰＥ標識したＩＬ−２抗体で染色し、次いで、１ｍｌの透過性化緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ分析にかける前に２５０ｍｌの染色緩衝液に再懸濁した。
【００３０】
サイトカインｍＲＮＡの分析
商業用のグラニジウムチオシアネート／フェノール抽出剤〔Ｔｒｉｚｏｌ剤（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）〕を用い、休止Ｔ細胞、リバビリン処理Ｔ細胞及びインターフェロンα処理Ｔ細胞、並びに非処理活性化Ｔ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し、最後に、ＤＥＰＣ処理した水１０μｌに再懸濁した。
【００３１】
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｏｎ，ＷＩ）の指示に従ってｃＤＮＡ合成反応を行った。簡略的に言えば、全ＲＮＡ（１μｇ）を６５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却してから、１０×逆転写緩衝液〔１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５００ｍＭのＫＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍＭのＭｇＣｌ〕（２μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ：１ｍＭ）（２μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（０．５μｌ）、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（０．５μｇ／μｇＲＮＡ）（１μｌ）及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｈ．Ｃ．）（０．６５μｌ）と合わせた。反応混合物を４２℃で１時間次いで９５℃で１０分間次いで氷上で５分間インキュベートした。
【００３２】
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、ＰＣＲ反応を行った。新しい試験管中で、ＲＴ反応混合物（３μｌ）を、１０×ＰＣＲ緩衝液〔５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン〕（５μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（１μｌ）並びにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）と合わせた。用いたプライマーは以下の通りであった：インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターフェロンγ（ヒト）プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びｐＨＥ７リボソーム遺伝子。増幅条件は、９４℃で４５秒間、５７℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３５回、次いで、７２℃で８分間であった。臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分析した。電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を２０×ＳＳＣ中で一晩かけてＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いて固定化した。ブロットをＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中４２℃で１時間、３２Ｐ−γＡＴＰ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。（指示に従って）各サイトカインプライマーミックスを放射線標識プローブとして用いた。ｐＨＥ７センスプライマーから作製したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が等しいことを確認した。次いで、洗浄したブロットをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで分析した。
【００３３】
活性化Ｔ細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンの作用
図１に示されている代表的な実験において、リバビリンを０．５〜５０ｍＭの用量範囲で添加すると、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの活性化レベルが、それぞれ５ｍＭ（３０％）及び２０ｍＭ（３６％）で極大増大を示した。それに対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化Ｔ細胞におけるレベルに比べ、ＩＬ−２及びＴＮＦαの発現が用量依存的に阻害された（２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、極大阻害率はそれぞれ３３％及び３８％）。さらに、リバビリンはＴｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の活性化レベルの同時低下を媒介した（２ｍＭで７４％のピーク阻害率）が、インターフェロンαは細胞外ＩＬ−４を最大で２６％増大させた（１０，０００Ｕ／ｍｌ）。図２は、リバビリンとインターフェロンαを組み合わせて用いると、２，０００Ｕ／ｍｌの定濃度のインターフェロンαは活性化ＩＬ−２レベルのリバビリン用量依存性増大を抑制し（Ａ）、活性化ＩＬ−４レベルの阻害を逆転させた（Ｃ）ことを示している。同様に、１０ｍＭの定濃度のリバビリンは、活性化ＩＬ−２レベルのインターフェロンα媒介性用量依存性阻害を逆転させ（Ｂ）、活性化ＩＬ−４レベルの増大を抑制した（Ｄ）。
【００３４】
活性化Ｔ細胞におけるサイトカインｍＲＮＡレベルに及ぼすリバビリンの作用
活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンとインターフェロンαの上記対立作用は転写レベルにおいても認められた。図３は、ヒトＴ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡレベルが実質的に増大することを示している。Ｔ細胞を活性化した後でリバビリン（２、５及び１０ｍＭ）で処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは低下するが、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルには影響がない。それに対し、１，０００、２，０００及び５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαで処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは低下し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルは低下する。従って、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−４のｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαそれぞれの用量依存性作用はＥＬＩＳＡ分析と一致した。これらのデータは、リバビリンが、活性化ヒトＴ細胞において、Ｔｈ１型サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの合成を促進し、Ｔｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の発現を阻害することを示唆している。
【００３５】
活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体レベルに及ぼすリバビリンの作用
ＦＡＣＳ分析を用い、活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）及びＩＬ−４受容体（ＣＤｗ１２４）の発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαの作用を比較した。ＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＣＤ２５とＣＤｗ１２４の発現が、それぞれ５０．１６±０．４５及び６２．３１±１．４６の休止レベルから１６２．４８±２．８９及び８７．５３±３．９８の活性化レベルに増大する（ｎ＝４）。図４は、３回の実験のうち代表的なものでは、リバビリン（１〜５０ｍＭ）はＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の活性化レベルには殆ど作用しないが、インターフェロンαは、２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの用量範囲で、対照活性化Ｔ細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にＩＬ−２受容体の発現を低下させ且つＩＬ−４受容体の発現を増大させたことを示している。従って、これらのデータは、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サイトカイン受容体の発現とは独立に作用することを示している。それに対し、ＩＬ−２及びＩＬ−４受容体に及ぼすインターフェロンα処理の作用は、活性化ＩＬ−２及びＩＬ−４発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係にある。
【００３６】
活性化Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおける細胞内ＩＬ−２レベルに及ぼすリバビリンの作用
ＩＬ−２発現に及ぼすリバビリンの作用がＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞のどちらかに特異的であるかを調べた。固定され且つ透過性化された活性化Ｔ細胞における細胞内ＩＬ−２の発現を、蛍光標識したＣＤ４又はＣＤ８抗体及びＩＬ−２抗体を用い、２色フロー・サイトメトリーにより定量した。図５は、１０ｍＭのリバビリンで処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞は８２％から９１％に増大し、ＩＬ−２を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞は８１％から９１％に増大したことを示している。対照的に、インターフェロンα（５，０００Ｕ／ｍｌ）で処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ８１％と７１％であった。これらのデータは、リバビリンが、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットとを区別せずに細胞内ＩＬ−２発現に作用を及ぼすことを示している。それに対し、インターフェロンαによる処理は、ＣＤ４＋Ｔ細胞には殆どを作用を及ぼさず、しかも、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットではＩＬ−２の発現を低下させさえする。
【００３７】
リバビリン類似体
臨床的にＴｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の調節に有効であると考えられるリバビリン類似体は数種存在する。該類似体には、図６の一般式〔式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ又はＮ−ＣＯ−Ｒ１１であり；Ａ、Ｂ及びＣは独立に、Ｎ、Ｐ、ＣＨ、Ｃ−ＯＨ、Ｃ−ＣＨ３、Ｃ−アルキル、Ｃ−アルケニル、Ｃ−ＣＨ２、−ＣＮ、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−ＣＯＯＣＨ３、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＳＮＨ２、Ｃ−ＳＯ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＯＮＨ２、Ｃ−ＣＳ−ＮＨ２、Ｃ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＰＯ２−ＮＨ２又はＣ−複素環系であり；Ｄは、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＰＨ、ＮＨ又はＮＲ１２であり；Ｒ１は、Ｈ、（ＣＨ２）ｐ（ＯＨ）、ハロゲン、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＯＮＨ２、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＰＨ又は（ＣＨ２）−複素環であり；Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＣＨ３、（ＣＨ２）ＯＨ、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３又はＣＯＯＭｅであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＣＨ３、（ＣＨ２）ＯＨ、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＯＭｅ又はフェニルであり；Ｒ９は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ２、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＰＯ２ＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ、（ＣＨ２）ｐ−複素環系又は（ＣＨ２）ｐ−グルコースであり；Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ２、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＰＯ２ＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ、（ＣＨ２）ｐ−複素環系、（ＣＨ２）ｐ−グルコース、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３又はアミノ酸であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ・ＨＣｌ、ＮＯＨ、ＮＯＣＨ３又はＮＯＣＨ２ＰＨであり；Ｒ１０とＹは一緒になると、チアゾール、イミダゾールなどのような複素環系を形成し；Ｒ１１は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｐＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ−複素環、（ＣＨ２）ｐ−アミノ酸又は（ＣＨ２）ｐ−糖（グルコースなど）であり；ｐは０〜８の整数である〕を有する分子が含まれ、該分子には、ＬヌクレオシドもＤヌクレオシドも包含される。
【００３８】
そのような分子は、以下に例示する図式の１つ以上に従って製造し得る。
【００３９】
１． ＩＣＮ１３６９（ピラゾマイシン）の合成：該化合物の合成法は、以下の参考文献に記載されている：（ａ）Ｊ．Ｆａｒｋａｓ，Ｚ．Ｆｌｅｇｅｌｏｖａ及びＦ．Ｓｏｒｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２，２２７９（１９７２）；（ｂ）Ｓ．Ｄｅ Ｂｅｒｎａｒｄｏ及びＭ．Ｗｅｉｇｅｌｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４１，２８７（１９７６）；（ｃ）Ｊ．Ｇ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ａ．Ｓｔｏｂｉｅ及びＲ．Ｈ．Ｗｉｇｈｔｒｎａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９１６（１９８０）；Ｎ．Ｋａｒａｇｉｒｉ，Ｋ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｈａｎｅｄａ及びＴ．Ｋａｔｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓｄ．，５５３（１９８４）。
【００４０】
２． ＩＣＮ３４３８（１−β−Ｄ−キシロフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２（１）、１（１９７５）に記載の手順に従って行った。
【００４１】
３． ＩＣＮ３８４４（１（５−Ｏ−スルファモイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ、Ｂ．Ｍ．Ｈｅｎｒｙ、Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｒ，Ｒ．Ｌ．Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｃｈｉ，Ｈ．Ｃ．Ｎａｔｈａｎ及びＢ．Ｓ．Ｋｅｉｔｈｌｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，４４（１９９０）に開示されている手順に従って製造した。
【００４２】
４． ＩＣＮ４６２５（１（３−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下の合成法を用いて製造した。
【００４３】
【化１】
【００４４】
５． ＩＣＮ５５３１（５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシルピラゾール−４−カルボキサミド）の合成：標記化合物は、Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，２１，７９５（１９９０）に記載の合成法に従って製造した。
【００４５】
６． ＩＣＮ５６７６（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｆｌｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２（１），１（１９７５）に記載の手順に従って行った。
【００４６】
７． ＩＣＮ５８３９（１−β−Ｄ−エリスロフラノシル−１，２，４−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下に記載の合成順序を用いて製造した：
【００４７】
【化２】
【００４８】
８． ＩＣＮ６２４２（２−ブロモ−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）の合成：ＩＣＮ６２４２は、以下に示されている方法に従って製造した。
【００４９】
【化３】
【００５０】
９． ＩＣＮ１１８０８（１−β−Ｄ−リボフラノシル−ピラゾール−３，４−ジカルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ，Ｓ．Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．Ｊｏｌｌｅｙ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，３３６（１９９０）に記載されている方法に従って行った。
【００５１】
１０． ＩＣＮ１２２０４（２−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−５−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｉｇｏｌｅｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄｉｎｈ，Ａ．Ｋｅｉｂ及びＣ．Ｐｅｒｒｅｕｒ，Ｃｈｉｍｉｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，２０７（１９７２）に記載の手順に従って行った。
【００５２】
リバビリン類似体の炭素環式４′−チオ糖及び４′−アザ糖誘導体を得るには、以下の糖を適切な複素環式化合物と縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方法で誘導体化し得る。
【００５３】
【化４】
【００５４】
１． 炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製造し得る：Ｍ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ及びＮ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，９９６１（１９９４）；Ｌ．Ａｇｒｏｆｏｇｌｉｏ，Ｅ．Ｓｕｈａｓ，Ａ．Ｐａｒｅｓｅ，Ｒ．Ｃｏｎｄｏｍ，Ｓ．Ｒ．Ｃｈａｌｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．Ｅａｒｌ及びＲ．Ｇｕｅｄｊ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，１０６１１（１９９４）。
【００５５】
２． ４−アザ糖は、Ｅ．Ｊ．Ｒｅｉｓｔ，Ｄ．Ｅ．Ｇｕｅｆｆｒｏｙ及びＬ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７，６７７（１９６５）に記載の手順に従って製造した。
【００５６】
３． ４−チオ−Ｄ−リボフラノースは、Ｍ．Ｈｏｂｅｋ及びＲ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第１巻，２９２（１９６２）に記載の手順に従って製造した。
【００５７】
Ｔｈ１型及びＴｈ２型サイトカインの調節にリバビリンが有効であるという証拠が図７及び以下の表に示されている。該図及び表に示されているアッセイは、テストした３５種のリバビリン類似体のうち注目すべきもののリストを含み、アッセイは全て３回実施した。一般に、テストした化合物は主要な３種：（１）ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−Ｓ及びＴＮＦαを抑制したＩＣＮ１３６９及びＩＣＮ３８４４などの化合物；（２）ＩＬ−２及びＴＮＦαを促進し、ＩＬＡ及びＩＬ−５を抑制したリバビリンなどの化合物；及び（３）ＩＬ−２及びＩＦＮγを促進し、ＩＬ−４及びＩＬ−５を抑制したＩＣＮ６２４２，ＩＣＮ３８３９及びＩＣＮ３５３１などの化合物に分類されることがわかるであろう。上記にリストしたような活性は、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を与えるであろうという見通しのために潜在的に有用であると考えられる。
【００５８】
【表１】
【００５９】
このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞においてリンホカインの発現の調節に有効であることが証明された。特定の実施態様及び用途を記載したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに多くの変更を実施し得ることが明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲の精神においてのみ制限されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）として表す。
【図２】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２（Ａ及びＣ）及びＩＬ−４（Ｂ及びＤ）の細胞外発現に及ぼす、２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下の２、１０又は５０ｍＭのリバビリンの作用（左側パネル）と、１０ｍＭのリバビリンの存在下の５００、１，０００又は２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの作用（右側パネル）を表すグラフである。
【図３】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。
【図４】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率（％）として表す。
【図５】休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはＰＭＡ／イオノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はＰＭＡ／イオノマイシン処理を１０ｍＭのリバビリンの存在下（Ｃ及びＧ）若しくは５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下（Ｄ及びＨ）に行った活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（上部パネル）若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞（下部パネル）における細胞内ＩＬ−２の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデータを示し、ＩＬ−２とＣＤ４又はＣＤ８の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。
【図６】企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
【図７】ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は免疫学である。
【背景技術】
【０００２】
リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群のポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割の解明が進められた。ヘルパーＣＤ４＋（及びＣＤ８＋）Ｔ細胞により産生されるリンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、２種の表現型、Ｔｈ１及びＴｈ２のどちらかに属する場合が多い〔Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：２５６−２５７，Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３〕。Ｔｈ１型細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生し、主として遅延型過敏症などの細胞性免疫に関与する。Ｔｈ２型細胞は、インターロイキン類、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生し、主としてＩｇＥ及びＩｇＧ４抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与する（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３）。
【０００３】
強度に分極したＴｈ１型及びＴｈ２型応答は、保護において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Ｔｈ１型応答は、実験的自己免疫型ぶどう膜網膜炎（Ｄｕｂｅｙら，１９９１，Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２：１４７−１５２）、実験的自己免疫型脳炎（ＥＡＥ）（Ｂｅｒａｕｄら，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３７９−３８９）及びインスリン依存性糖尿病（Ｈａｈｎら，１９８７，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：２０３７−２０４２）などの器官特異的自己免疫状態や、接触性皮膚炎（Ｋａｐｓｅｎｂｅｒｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：３９２−３９５）及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Ｔｈ２型応答は、（一般的な環境性アレルゲンに対する）アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘息（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐ Ｄｉｓ １４８：１０９−１１５）及びアトピー性皮膚炎（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎら，１９９１，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ ９７：３８９−３９４）の誘発に関与し、蠕虫蠕虫（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：Ａ６２−６６）やＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ（Ｃａｃｅｒｅｓ−Ｄｉｔｔｍａｒら，１９９３，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９１：５００−５０５）などの組織寄生原虫類感染症を悪化させると考えられ、高ＩｇＥ症候群（Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら，１９８９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：５６−６０）などの特定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高ＩｇＥ症候群（Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら，１９８９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：５６−６０）の低下に関連し、ＨＩＶ複製抑制能（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１１３５−１１１３９）の低下に関連する。
【０００４】
従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有用なことは明らかである。恐らく、Ｔｈ１型応答を促進するとＴｈ２表現型が抑制され、Ｔｈ２型応答を促進するとＴｈ１表現型が抑制されるであろう。リンホカインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、リンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸化防止剤（Ｊｅａｎｎｉｎら，１９９５，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２ １７８５−１７９２）は、疾患促進サイトカインパターン、Ｔｈ１又はＴｈ２のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因を逆転させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、ＩＦＮγにより抑制され、ＩＬ−４により悪化するが、線虫感染症は、ＩＬ−４により抑制され、ＩＦＮγにより悪化する（Ｈｅｉｎｚｅｌら，１９８９，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６２：５９−７２，Ｅｌｓｅら，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：３４７−３５１）。ＮＯＤマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのＥＡＥは、該疾患が発症する前にＩＬ−４又は抗ＩＦＮγ ｍＡｂで治療すると改善され得る（Ｒａｐｏｐｏｒｔら，１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：８７−９９，Ｒａｃｋｅら，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：１９６１−１９６６，Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８７：７３９−７４２）。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）は、Ｔｈ２型リンホカインの産生に関連し、抗ＩＬ−４抗体によって阻害される（Ｕｍｌａｎｄら，１９９２，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ６３：６６−７３）。一方、Ｔｈ１型サイトカインは、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＴＬになり、宿主の免疫系を破壊する急性ＧＶＨＤにおいて産生される。抗ＩＦＮγ又は抗ＴＮＦα ｍＡｂで治療すると疾患が改善され、抗ＩＬ−２ｍＡｂで治療すると急性ＧＶＨＤが自己免疫型ＧＶＨＤに変化する（Ｖｉａ及びＦｉｎｋｅｌｍａｎ，１９９３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５６５−５７２）。
【０００５】
１９８３年以来、ＨＩＶ感染患者の治療において天然及び組換えＩＬ−２の臨床実験が進められている（Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇら，１９８７，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，３：１１５−１２４）。この場合、両者の関係は、ＡＩＤＳの発症が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来する（Ｃｌｅｒｉｃｉ及びＳｈｅａｒｅｒ，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５：５７５−５８１）。発症に向かって進行している感染患者では、ＩＬ−２などのＴｈ１型リンホカインの発現が経時的に低下する（Ｍａｇｇｉら，１９８７，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：１６８５−１６９０，Ｇｒｕｔｅｒｓら，１９９０，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：１０３９−１０４４，Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９１：７５９−７６５）と同時に、ＩＬ−４及びＩＬ−１０などのＴｈ２型リンホカインの産生が増大する（Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９３：７６８−７７５，Ｈｏｆｆｍａｎら，１９８５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：３２６−３３５）。ＩＬ−２で治療した非症候性又は長期生存患者由来のＴ細胞は、その抗ＨＩＶ活性が増強されていたが、ＩＬ−４又はＩＬ−１０に暴露すると、そのＨＩＶ複製抑制能及びＩＬ−２産生能が低下した（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１１３５−１１１３９）。
【０００６】
しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬（ｍＡｂ及び組換えサイトカイン）には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。ｍＡｂに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減させる「人化」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）モノクローナル抗体が開発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なｍＡｂは依然、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免疫型ＧＶＨＤをＩＬ−１２で治療すると急性ＧＶＨＤが発症する。
【０００７】
リバビリン（登録商標）（１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである（Ｈｕｆｆｍａｎら，１９７３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３：２３５，Ｓｉｄｗｅｌｌら，１９７２，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７７：７０５）。本発明者は、リバビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認した（Ｊｏｌｌｅｙ及びＳｕｃｈｉｌ，１９８４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ：９３−９６ページを再検討した）。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化Ｔ及びＢリンパ球の増殖に影響を与え〔Ｔａｍら、１９９５（データ示さず），Ｐｅａｖｙら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９：５８３−５８９〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合わせると、長期の同種移植生存に効力を示す（Ｊｅｌｌｅｙら，１９８８，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ ２０：７０３−７０６）という他の人々の所見を確認した。
【０００８】
また、本発明者は、リバビリンが、Ｔｈ１型応答を促進し且つＴｈ２型応答を抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第１に、リバビリンが機能性体液性免疫応答（Ｐｅａｖｙら，１９８１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６：８６１−８６４，Ｐｏｗｅｒｓら，１９８２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２２：１０８−１１４）及び肥満細胞分泌のＩｇＥ媒介性調節（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら，１９８７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４０：１４５−１４９）（いずれもＴｈ２型リンホカイン媒介性事象である）のどちらをも阻害することは公知である。第２に、リバビリンは、ＨＩＶ患者由来の末梢血リンパ球においてアジドチミジン（ＡＺＴ）の抗ウイルス作用を拮抗する（Ｖｏｇｔら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１３７６−１３７９）。この知見は重要である。というのは、ＡＺＴはＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を低下させるがＩＬ−２の発現は低下させないからである（Ｖｉｏｒａ及びＣａｍｐｏｎｅｓｃｈｉ，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：２８９−２９５）。従って、リバビリンが、ＩＬ−２の発現を調節し且つ低下したＩＬ−２Ｒレベルを上昇させることによりＡＺＴを拮抗することは可能である。第３に、慢性ＧＶＨＤ（Ｔｈ２媒介性疾患）を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである（Ｃａｓｓａｎｏ，１９９１，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７：２４７−２４８）。最後に、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者をリバビリンで（１年間）治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球の凝集率が低下し且つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した（Ｄｕｓｈｅｉｋｏら，１９９４，Ｊａｎ；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９（１）：１３−８）。この所見は、Ｃ型肝炎に対する主要免疫応答はＴｈ１型リンホカインにより媒介されるが、Ｔｈ０／Ｔｈ２表現型のＴ細胞はＨＣＶを介して感染し得る（Ｚｉｇｎｅｇｏら，１９９４，未公開データ）ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）として表す。
【００１０】
図２は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２（Ａ及びＣ）及びＩＬ−４（Ｂ及びＤ）の細胞外発現に及ぼす、２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下の２、１０又は５０ｍＭのリバビリンの作用（左側パネル）と、１０ｍＭのリバビリンの存在下の５００、１，０００又は２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの作用（右側パネル）を表すグラフである。
【００１１】
図３は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。
【００１２】
図４は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率（％）として表す。
【００１３】
図５は、休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはＰＭＡ／イオノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はＰＭＡ／イオノマイシン処理を１０ｍＭのリバビリンの存在下（Ｃ及びＧ）若しくは５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下（Ｄ及びＨ）に行った活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（上部パネル）若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞（下部パネル）における細胞内ＩＬ−２の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデータを示し、ＩＬ−２とＣＤ４又はＣＤ８の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。
【００１４】
図６は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
【００１５】
図７は、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。
【００１６】
発明の要旨
本発明の１つの態様によれば、このヌクレオシド、即ちリバビリンを、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。
【００１７】
従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の異常の治療に用いる。そのような異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性アトピー性疾患、蠕虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫不全に付随するものとして見出され得る。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、１種以上のリバビリン類似体を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。
【００１９】
発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して０．２５〜１２．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２．５ｍｇ／ｍｌの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、１日につき体重１ｋｇ当たり約４．５ｍｇであり、都合２００〜１，２００ｍｇの投薬量で投与し得る。１日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい。
【００２０】
リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形や投与経路が公知となっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、１種以上の医薬上許容し得る担体をさらに含み得、該担体は、（長期貯蔵用の）安定剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。
【００２１】
リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。
【００２２】
さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかった（既知又は未知の）数種のビラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するビラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るためにビラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的なＤ型ビラゾールにも、Ｌ型ビラゾールにも適用し得るように企図されている。
【実施例】
【００２３】
細胞系及びＴ細胞の精製
健康なドナー由来の血液６０ｍｌをフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離にかけた後、バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、Ｔ細胞に特異的なＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋリンパ球単離試薬（ＬＫ−２５Ｔ，Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用い、ＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。次いで、平均収量４０〜６０×１０６個のＴ細胞を、２０〜３０ｍｌのＲＰＭＩ−ＡＰ５〔２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、５％の自己由来血漿、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０５％の２−メルカプトエタノールを含むＰＲＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）〕中３７℃で一晩インキュベートして、不純混合付着細胞を除去した。全ての実験において、Ｔ細胞をＲＰＭＩ−ＡＰ５で洗浄し、次いで、９６ウエルマイクロタイタープレート上に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で平板培養した。
【００２４】
Ｔ細胞活性化及びリバビリン処理
５００ｎｇのイオノマイシン及び１０ｎｇのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を添加してＴ細胞を活性化し、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＴ細胞を、活性化直後に０．５〜５０ｍＭのリバビリン又は２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの対照抗ウイルス剤、インターフェロンα（Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で処理し、２４時間後に再処理した。各プレートからのＴ細胞を免疫蛍光法分析に用い、上清を細胞外サイトカインの測定に用いた。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、免疫蛍光法による細胞内サイトカインレベル及びサイトカイン受容体の発現の分析に用いた。
【００２５】
細胞外サイトカインの分析
各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒトサイトカインの濃度を定量した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いるか、又はＩＬ−２依存性細胞系、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いたバイオアッセイにかけて、活性化により誘発されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）のレベルの変化を定量した。ＥＬＩＳＡキットを用い、活性化により誘発された、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のレベルの変化を定量した。全てのＥＬＩＳＡの結果はｐｇ／ｍｌとして表し、ＣＴＬＬ−２バイオアッセイは、ＣＴＬＬ−２細胞による３Ｈ−チミジン（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）のＩＬ−２依存性細胞取込みを表す１分当たりのカウント数として表した。
【００２６】
直接免疫蛍光法実験（サイトカイン受容体）
蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色するために、細胞を生理食塩液、ｐＨ７．４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で２回洗浄し、５０ｍｌの生理食塩液に再懸濁し、２つの試料に分割した。一方の試料アリコートをＰＥ抗ＣＤ２５／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４又はＰＥ−ラット抗マウスＩｇＧ＋抗ＣＤｗ１２４／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４ ｍＡｂで同時染色し、第２のアリコートをＰＥ／ＦＩＴＣで標識したアイソタイプマッチド対照モノクローナル抗体で染色して、非特異的蛍光を評価した。蛍光標識したモノクローナル抗体は全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手したが、抗ＣＤｗ１２４はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手した。インキュベーションは、飽和ｍＡｂ濃度を用い暗所で４５分間４℃で行った。取り込まれなかった標識をＰＢＳで洗浄して除去した後、ＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００２７】
ゲートをかけた生きているＣＤ４＋Ｔ細胞中で抗原密度を間接定量し、平均蛍光チャンネル（ＭＣＦ）として表した。特異的抗原（ＣＤｗ１２４，ＣＤ２５）の表面発現を、ＦＩＴＣ又はＰＥ標識した抗原特異的ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦからＦＩＴＣ又はＰＥ標識したアイソタイプマッチド（ＩｇＧ１）対照ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦを減算して得られた平均チャンネル変化（ＭＣＳ）として表した。あるいは、ＣＤ２８ｍＡｂで染色された細胞のＣＤ４＋サブセットの表面発現を、ＣＤ２８−ＣＤ４−細胞のＭＣＦからＣＤ２８＋ＣＤ４＋のＭＣＦを減算して測定した。
【００２８】
未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロンα処理細胞の生存能力を、生体染料、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（最終濃度：５ｍｇ／ｍｌ）で染色することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチドを有する各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウムを除去した生存細胞の百分率をフロー・サイトメトリーで測定すると、用いた全ての濃度において、処理した後、＞９０％（９０〜９９％の範囲）であった。
【００２９】
細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２の細胞内発現を分析するために、先ず、４８〜７２時間の活性化の最後の４時間に、Ｔ細胞を１０ｍｇのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理して、新たに合成されるＩＬ−２の細胞外への分泌を最小限にした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。ＦＩＴＣ標識した細胞表面抗原、ＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体で直接染色（３０分間、４℃、暗所）する前に、細胞を生理的食塩液、ｐＨ７．４で２回洗浄し、１００〜１５０ｍｌの染色緩衝液〔１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生食液、ｐＨ７．４〕に再懸濁し、２つの試料に分割した。染色された細胞を１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、上清を吸引した後、細胞ペレットを１００ｍｌの固定緩衝液（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。固定された細胞を２０分間４℃に維持し、次いで、１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを５０ｍｌの透過性化緩衝液〔ＰＢＳ中０．１％サポニン（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）〕に攪拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で３０分間４℃で、ＰＥ標識したＩＬ−２抗体で染色し、次いで、１ｍｌの透過性化緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ分析にかける前に２５０ｍｌの染色緩衝液に再懸濁した。
【００３０】
サイトカインｍＲＮＡの分析
商業用のグラニジウムチオシアネート／フェノール抽出剤〔Ｔｒｉｚｏｌ剤（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）〕を用い、休止Ｔ細胞、リバビリン処理Ｔ細胞及びインターフェロンα処理Ｔ細胞、並びに非処理活性化Ｔ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し、最後に、ＤＥＰＣ処理した水１０μｌに再懸濁した。
【００３１】
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｏｎ，ＷＩ）の指示に従ってｃＤＮＡ合成反応を行った。簡略的に言えば、全ＲＮＡ（１μｇ）を６５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却してから、１０×逆転写緩衝液〔１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５００ｍＭのＫＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍＭのＭｇＣｌ〕（２μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ：１ｍＭ）（２μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（０．５μｌ）、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（０．５μｇ／μｇＲＮＡ）（１μｌ）及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｈ．Ｃ．）（０．６５μｌ）と合わせた。反応混合物を４２℃で１時間次いで９５℃で１０分間次いで氷上で５分間インキュベートした。
【００３２】
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、ＰＣＲ反応を行った。新しい試験管中で、ＲＴ反応混合物（３μｌ）を、１０×ＰＣＲ緩衝液〔５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン〕（５μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（１μｌ）並びにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）と合わせた。用いたプライマーは以下の通りであった：インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターフェロンγ（ヒト）プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びｐＨＥ７リボソーム遺伝子。増幅条件は、９４℃で４５秒間、５７℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３５回、次いで、７２℃で８分間であった。臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分析した。電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を２０×ＳＳＣ中で一晩かけてＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いて固定化した。ブロットをＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中４２℃で１時間、３２Ｐ−γＡＴＰ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。（指示に従って）各サイトカインプライマーミックスを放射線標識プローブとして用いた。ｐＨＥ７センスプライマーから作製したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が等しいことを確認した。次いで、洗浄したブロットをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで分析した。
【００３３】
活性化Ｔ細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンの作用
図１に示されている代表的な実験において、リバビリンを０．５〜５０ｍＭの用量範囲で添加すると、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの活性化レベルが、それぞれ５ｍＭ（３０％）及び２０ｍＭ（３６％）で極大増大を示した。それに対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化Ｔ細胞におけるレベルに比べ、ＩＬ−２及びＴＮＦαの発現が用量依存的に阻害された（２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、極大阻害率はそれぞれ３３％及び３８％）。さらに、リバビリンはＴｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の活性化レベルの同時低下を媒介した（２ｍＭで７４％のピーク阻害率）が、インターフェロンαは細胞外ＩＬ−４を最大で２６％増大させた（１０，０００Ｕ／ｍｌ）。図２は、リバビリンとインターフェロンαを組み合わせて用いると、２，０００Ｕ／ｍｌの定濃度のインターフェロンαは活性化ＩＬ−２レベルのリバビリン用量依存性増大を抑制し（Ａ）、活性化ＩＬ−４レベルの阻害を逆転させた（Ｃ）ことを示している。同様に、１０ｍＭの定濃度のリバビリンは、活性化ＩＬ−２レベルのインターフェロンα媒介性用量依存性阻害を逆転させ（Ｂ）、活性化ＩＬ−４レベルの増大を抑制した（Ｄ）。
【００３４】
活性化Ｔ細胞におけるサイトカインｍＲＮＡレベルに及ぼすリバビリンの作用
活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンとインターフェロンαの上記対立作用は転写レベルにおいても認められた。図３は、ヒトＴ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡレベルが実質的に増大することを示している。Ｔ細胞を活性化した後でリバビリン（２、５及び１０ｍＭ）で処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは低下するが、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルには影響がない。それに対し、１，０００、２，０００及び５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαで処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは低下し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルは低下する。従って、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−４のｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαそれぞれの用量依存性作用はＥＬＩＳＡ分析と一致した。これらのデータは、リバビリンが、活性化ヒトＴ細胞において、Ｔｈ１型サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの合成を促進し、Ｔｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の発現を阻害することを示唆している。
【００３５】
活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体レベルに及ぼすリバビリンの作用
ＦＡＣＳ分析を用い、活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）及びＩＬ−４受容体（ＣＤｗ１２４）の発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαの作用を比較した。ＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＣＤ２５とＣＤｗ１２４の発現が、それぞれ５０．１６±０．４５及び６２．３１±１．４６の休止レベルから１６２．４８±２．８９及び８７．５３±３．９８の活性化レベルに増大する（ｎ＝４）。図４は、３回の実験のうち代表的なものでは、リバビリン（１〜５０ｍＭ）はＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の活性化レベルには殆ど作用しないが、インターフェロンαは、２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの用量範囲で、対照活性化Ｔ細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にＩＬ−２受容体の発現を低下させ且つＩＬ−４受容体の発現を増大させたことを示している。従って、これらのデータは、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サイトカイン受容体の発現とは独立に作用することを示している。それに対し、ＩＬ−２及びＩＬ−４受容体に及ぼすインターフェロンα処理の作用は、活性化ＩＬ−２及びＩＬ−４発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係にある。
【００３６】
活性化Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおける細胞内ＩＬ−２レベルに及ぼすリバビリンの作用
ＩＬ−２発現に及ぼすリバビリンの作用がＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞のどちらかに特異的であるかを調べた。固定され且つ透過性化された活性化Ｔ細胞における細胞内ＩＬ−２の発現を、蛍光標識したＣＤ４又はＣＤ８抗体及びＩＬ−２抗体を用い、２色フロー・サイトメトリーにより定量した。図５は、１０ｍＭのリバビリンで処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞は８２％から９１％に増大し、ＩＬ−２を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞は８１％から９１％に増大したことを示している。対照的に、インターフェロンα（５，０００Ｕ／ｍｌ）で処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ８１％と７１％であった。これらのデータは、リバビリンが、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットとを区別せずに細胞内ＩＬ−２発現に作用を及ぼすことを示している。それに対し、インターフェロンαによる処理は、ＣＤ４＋Ｔ細胞には殆どを作用を及ぼさず、しかも、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットではＩＬ−２の発現を低下させさえする。
【００３７】
リバビリン類似体
臨床的にＴｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の調節に有効であると考えられるリバビリン類似体は数種存在する。該類似体には、図６の一般式〔式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ又はＮ−ＣＯ−Ｒ１１であり；Ａ、Ｂ及びＣは独立に、Ｎ、Ｐ、ＣＨ、Ｃ−ＯＨ、Ｃ−ＣＨ３、Ｃ−アルキル、Ｃ−アルケニル、Ｃ−ＣＨ２、−ＣＮ、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−ＣＯＯＣＨ３、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＳＮＨ２、Ｃ−ＳＯ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＯＮＨ２、Ｃ−ＣＳ−ＮＨ２、Ｃ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＰＯ２−ＮＨ２又はＣ−複素環系であり；Ｄは、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＰＨ、ＮＨ又はＮＲ１２であり；Ｒ１は、Ｈ、（ＣＨ２）ｐ（ＯＨ）、ハロゲン、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＯＮＨ２、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＰＨ又は（ＣＨ２）−複素環であり；Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＣＨ３、（ＣＨ２）ＯＨ、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３又はＣＯＯＭｅであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＣＨ３、（ＣＨ２）ＯＨ、（ＣＨ２）ｐＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＯＭｅ又はフェニルであり；Ｒ９は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ２、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＰＯ２ＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ、（ＣＨ２）ｐ−複素環系又は（ＣＨ２）ｐ−グルコースであり；Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ２、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＰＯ２ＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ、（ＣＨ２）ｐ−複素環系、（ＣＨ２）ｐ−グルコース、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３又はアミノ酸であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ・ＨＣｌ、ＮＯＨ、ＮＯＣＨ３又はＮＯＣＨ２ＰＨであり；Ｒ１０とＹは一緒になると、チアゾール、イミダゾールなどのような複素環系を形成し；Ｒ１１は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｐＮＨ２、（ＣＨ２）ｐ−複素環、（ＣＨ２）ｐ−アミノ酸又は（ＣＨ２）ｐ−糖（グルコースなど）であり；ｐは０〜８の整数である〕を有する分子が含まれ、該分子には、ＬヌクレオシドもＤヌクレオシドも包含される。
【００３８】
そのような分子は、以下に例示する図式の１つ以上に従って製造し得る。
【００３９】
１． ＩＣＮ１３６９（ピラゾマイシン）の合成：該化合物の合成法は、以下の参考文献に記載されている：（ａ）Ｊ．Ｆａｒｋａｓ，Ｚ．Ｆｌｅｇｅｌｏｖａ及びＦ．Ｓｏｒｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２，２２７９（１９７２）；（ｂ）Ｓ．Ｄｅ Ｂｅｒｎａｒｄｏ及びＭ．Ｗｅｉｇｅｌｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４１，２８７（１９７６）；（ｃ）Ｊ．Ｇ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ａ．Ｓｔｏｂｉｅ及びＲ．Ｈ．Ｗｉｇｈｔｒｎａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９１６（１９８０）；Ｎ．Ｋａｒａｇｉｒｉ，Ｋ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｈａｎｅｄａ及びＴ．Ｋａｔｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓｄ．，５５３（１９８４）。
【００４０】
２． ＩＣＮ３４３８（１−β−Ｄ−キシロフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２（１）、１（１９７５）に記載の手順に従って行った。
【００４１】
３． ＩＣＮ３８４４（１（５−Ｏ−スルファモイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ、Ｂ．Ｍ．Ｈｅｎｒｙ、Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｒ，Ｒ．Ｌ．Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｃｈｉ，Ｈ．Ｃ．Ｎａｔｈａｎ及びＢ．Ｓ．Ｋｅｉｔｈｌｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，４４（１９９０）に開示されている手順に従って製造した。
【００４２】
４． ＩＣＮ４６２５（１（３−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下の合成法を用いて製造した。
【００４３】
【化１】
【００４４】
５． ＩＣＮ５５３１（５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシルピラゾール−４−カルボキサミド）の合成：標記化合物は、Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，２１，７９５（１９９０）に記載の合成法に従って製造した。
【００４５】
６． ＩＣＮ５６７６（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｆｌｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２（１），１（１９７５）に記載の手順に従って行った。
【００４６】
７． ＩＣＮ５８３９（１−β−Ｄ−エリスロフラノシル−１，２，４−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下に記載の合成順序を用いて製造した：
【００４７】
【化２】
【００４８】
８． ＩＣＮ６２４２（２−ブロモ−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）の合成：ＩＣＮ６２４２は、以下に示されている方法に従って製造した。
【００４９】
【化３】
【００５０】
９． ＩＣＮ１１８０８（１−β−Ｄ−リボフラノシル−ピラゾール−３，４−ジカルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ，Ｓ．Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．Ｊｏｌｌｅｙ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，３３６（１９９０）に記載されている方法に従って行った。
【００５１】
１０． ＩＣＮ１２２０４（２−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−５−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｉｇｏｌｅｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄｉｎｈ，Ａ．Ｋｅｉｂ及びＣ．Ｐｅｒｒｅｕｒ，Ｃｈｉｍｉｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，２０７（１９７２）に記載の手順に従って行った。
【００５２】
リバビリン類似体の炭素環式４′−チオ糖及び４′−アザ糖誘導体を得るには、以下の糖を適切な複素環式化合物と縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方法で誘導体化し得る。
【００５３】
【化４】
【００５４】
１． 炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製造し得る：Ｍ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ及びＮ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，９９６１（１９９４）；Ｌ．Ａｇｒｏｆｏｇｌｉｏ，Ｅ．Ｓｕｈａｓ，Ａ．Ｐａｒｅｓｅ，Ｒ．Ｃｏｎｄｏｍ，Ｓ．Ｒ．Ｃｈａｌｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．Ｅａｒｌ及びＲ．Ｇｕｅｄｊ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，１０６１１（１９９４）。
【００５５】
２． ４−アザ糖は、Ｅ．Ｊ．Ｒｅｉｓｔ，Ｄ．Ｅ．Ｇｕｅｆｆｒｏｙ及びＬ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７，６７７（１９６５）に記載の手順に従って製造した。
【００５６】
３． ４−チオ−Ｄ−リボフラノースは、Ｍ．Ｈｏｂｅｋ及びＲ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第１巻，２９２（１９６２）に記載の手順に従って製造した。
【００５７】
Ｔｈ１型及びＴｈ２型サイトカインの調節にリバビリンが有効であるという証拠が図７及び以下の表に示されている。該図及び表に示されているアッセイは、テストした３５種のリバビリン類似体のうち注目すべきもののリストを含み、アッセイは全て３回実施した。一般に、テストした化合物は主要な３種：（１）ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−Ｓ及びＴＮＦαを抑制したＩＣＮ１３６９及びＩＣＮ３８４４などの化合物；（２）ＩＬ−２及びＴＮＦαを促進し、ＩＬＡ及びＩＬ−５を抑制したリバビリンなどの化合物；及び（３）ＩＬ−２及びＩＦＮγを促進し、ＩＬ−４及びＩＬ−５を抑制したＩＣＮ６２４２，ＩＣＮ３８３９及びＩＣＮ３５３１などの化合物に分類されることがわかるであろう。上記にリストしたような活性は、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を与えるであろうという見通しのために潜在的に有用であると考えられる。
【００５８】
【表１】
【００５９】
このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞においてリンホカインの発現の調節に有効であることが証明された。特定の実施態様及び用途を記載したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに多くの変更を実施し得ることが明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲の精神においてのみ制限されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）として表す。
【図２】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２（Ａ及びＣ）及びＩＬ−４（Ｂ及びＤ）の細胞外発現に及ぼす、２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下の２、１０又は５０ｍＭのリバビリンの作用（左側パネル）と、１０ｍＭのリバビリンの存在下の５００、１，０００又は２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの作用（右側パネル）を表すグラフである。
【図３】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。
【図４】ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率（％）として表す。
【図５】休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはＰＭＡ／イオノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はＰＭＡ／イオノマイシン処理を１０ｍＭのリバビリンの存在下（Ｃ及びＧ）若しくは５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下（Ｄ及びＨ）に行った活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（上部パネル）若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞（下部パネル）における細胞内ＩＬ−２の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデータを示し、ＩＬ−２とＣＤ４又はＣＤ８の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。
【図６】企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
【図７】ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現異常を治療するための医薬組成物の製造におけるリバビリンの使用であって、該医薬組成物はインターフェロンα含有組成物と併用されることを特徴とする前記使用。
【請求項２】
リバビリンを、Ｔｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
リバビリンを、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項４】
リバビリンの血清レベルが約０．２５μｇ／ｍｌである請求項３に記載の使用。
【請求項５】
リバビリンを、その血清レベルが４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記投与量を１日あたり各回少量の投与量に分けることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
リバビリンとインターフェロンαとの組合せであって、リバビリンの量がヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記組合せ。
【請求項８】
リバビリンがＴｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量である請求項７に記載の組合せ。
【請求項９】
リバビリンを、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
リバビリンをその血清レベルが約０．２５μｇ／ｍｌとなるようにヒトに経口投与する請求項９に記載の組合せ。
【請求項１１】
リバビリンの量がその血清レベルが４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるような量である請求項７に記載の組合せ。
【請求項１２】
インターフェロンαの第２医薬と組合されたリバビリンの医薬組成物であって、前記リバビリンの量がヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１３】
リバビリンがＴｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
リバビリンの量が、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
リバビリンの量が、その血清レベルが０．２５μｇ／ｍｇとなるのに有効な量である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
リバビリンを、その血清レベルが１日あたり４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるような量で投与する請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
リバビリンを１日につき数回に分けて経口投与する請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
インターフェロンαとリバビリンとの組合せ。
【請求項１】
ヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現異常を治療するための医薬組成物の製造におけるリバビリンの使用であって、該医薬組成物はインターフェロンα含有組成物と併用されることを特徴とする前記使用。
【請求項２】
リバビリンを、Ｔｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
リバビリンを、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項４】
リバビリンの血清レベルが約０．２５μｇ／ｍｌである請求項３に記載の使用。
【請求項５】
リバビリンを、その血清レベルが４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記投与量を１日あたり各回少量の投与量に分けることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
リバビリンとインターフェロンαとの組合せであって、リバビリンの量がヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記組合せ。
【請求項８】
リバビリンがＴｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量である請求項７に記載の組合せ。
【請求項９】
リバビリンを、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
リバビリンをその血清レベルが約０．２５μｇ／ｍｌとなるようにヒトに経口投与する請求項９に記載の組合せ。
【請求項１１】
リバビリンの量がその血清レベルが４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるような量である請求項７に記載の組合せ。
【請求項１２】
インターフェロンαの第２医薬と組合されたリバビリンの医薬組成物であって、前記リバビリンの量がヒト患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１３】
リバビリンがＴｈ１レベルを亢進し且つＴｈ２レベルを抑制するのに有効な量である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
リバビリンの量が、その血清レベルが平均して０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌとなるのに有効な量である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
リバビリンの量が、その血清レベルが０．２５μｇ／ｍｇとなるのに有効な量である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
リバビリンを、その血清レベルが１日あたり４．５ｍｇ／体重ｋｇとなるような量で投与する請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
リバビリンを１日につき数回に分けて経口投与する請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
インターフェロンαとリバビリンとの組合せ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−１３３２９３（Ｐ２００８−１３３２９３Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３６９（Ｐ２００８−２３６９）
【出願日】平成２０年１月９日（２００８．１．９）
【分割の表示】特願２００３−３３６７７（Ｐ２００３−３３６７７）の分割
【原出願日】平成９年１月２１日（１９９７．１．２１）
【出願人】（５００３０３５０４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月９日（２００８．１．９）
【分割の表示】特願２００３−３３６７７（Ｐ２００３−３３６７７）の分割
【原出願日】平成９年１月２１日（１９９７．１．２１）
【出願人】（５００３０３５０４）
【Ｆターム（参考）】
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