海洋由来のＢａｃｉｌｌｕｓｂａｒｂａｒｉｃｕｓＳＣＳＩＯ０２４２９及びこれを用いたイカオリゴペプチドの調製方法
本発明は海洋由来のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９ ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１０２１３に関する。また、本発明はイカオリゴペプチドの調製方法に関し、その特徴はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９を酵素生産発酵誘導培地に加えて発酵させ、加水分解用粗酵素溶液を得た上で、イカ内臓をスラリー状に破砕して粗酵素溶液に加え、酵素分解を行ってグリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得て、さらにブロメラインを加えて酵素分解を進め、得られた酵素分解物を静置して油層と水層に分離させ、油層を除去して乾燥させてイカオリゴペプチドを得る。本発明のイカオリゴペプチドの収率は４０〜４６％、アミノ酸の収率は１６〜２２％に達する。このイカオリゴペプチドには海洋養殖動物の種苗死亡率を下げ、体重増加率を高める作用があり、飼料中の魚粉など従来のタンパク質源に代わることができるため、海洋養殖配合飼料の機能性タンパク源、添加物などとして使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌に関し、具体的には、海洋由来のバシラス属菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９菌株及びこの菌株を利用したイカオリゴペプチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国の海洋漁業の迅速な発展に伴い、イカの年間生産量は３０万トン前後に達し、我が国の重要な水産加工原料の一つになっている。イカの加工処理過程において、１５％程度の内臓廃棄物が生じ、これら廃棄物にはタンパク質が豊富に含まれているが、極めて腐乱・変質しやすいため、貯蔵が難しい。通常の処理方法ではイカ油を抽出し終わった廃棄物を埋めるが、近頃はイカ内臓に一次加工を行ってイカのスラリーを作製し、魚類の飼料に直接用いるという報告もある。しかし、こうした高度加工を経ていない飼料は生物学的利用能が高くない上、水環境を汚染し、養殖動物の病害流行の機会が増えることになる。このため、イカ内臓の開発利用を進めることは、経済的及び環境保護的に見て重要な意義がある。イカ内臓の酵素分解方法の研究も広い注目を浴びており、バイオ酵素技術を用いて、イカの粗タンパク質を、水産動物に吸収されやすく、一定の生理機能を持つオリゴペプチド類のタンパク質源に分解するのは、一つの効果的な方法であり、かつその研究もいくつか行われている。例えば薛長湖、劉春娥らによる、酵素の種類、用量、反応温度、反応時間などの要素がイカ内臓の粗タンパク質転換率に及ぼす影響についての研究（特許文献１）、袁亜輝らによる、イカ内臓の酵素分解を利用した海の旨み成分の生産、張井らによる、イカ内臓の酵素分解液中の重金属除去方法についての研究などである。
【０００３】
すでに報告されているイカ内臓の酵素分解方法において、使用酵素の種類には、トリプシン、ペプシン、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン及びこれら酵素の混合物がある。しかし現段階のイカ内臓の加水分解方法にはまだ、粗タンパク質の加水分解率が低い、酵素分解生成物の残留粗タンパク質が海洋養殖動物に吸収・利用されにくいといった問題がある。また反応温度の向上、反応時間の延長、触媒使用量の増加などの手段により粗タンパク質の加水分解度を高めると、今度は分解が進み過ぎる現象が起こり、目標とするオリゴペプチドの収率が大幅に下がる。例えば、イカ内臓の加水分解によるアミノ酸の収率が７０％を超えるが、オリゴペプチドの収率は却って非常に低くなるという文献報告がある。粗タンパク質の加水分解効率を高めると同時に、目標とするオリゴペプチドの収率を保証できれば、イカ内臓の利用水準は大きく向上する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】劉春娥、林洪、曹立民、単俊偉、「イカ内臓タンパク質の酵素加水分解技術の研究」、（中国）、食品工業科技、２００４年、第２５巻、第９号、ｐ．８３−８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、海洋中から新しいバシラス属菌を開発することにあり、もう一つの目的は、このバシラス属菌を利用してイカ内臓を酵素分解し、粗タンパク質の加水分解率が高くオリゴペプチドの収率が高い、イカオリゴペプチドの調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
我々は中国南海（南シナ海）の深海堆積物からＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９を分離し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９による発酵で得られた粗酵素溶液で、内臓タンパク質中のペプチド鎖につながったグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖を破壊し、さらにブロメラインを加えてタンパク質ペプチド鎖の加水分解を触媒した。得られたイカオリゴペプチドの収率は４０％〜４６％、アミノ酸の収率は１６％〜２２％で、これにより本発明の目的を実現した。
【０００７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は２０１０年８月３１日に中国典型培養物保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、略称ＣＣＴＣＣ）に保管されており、所在地は武漢市武昌珞珈山、保管番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１０２１３である。
【０００８】
上記のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は２００９年に採取された南シナ海の深海堆積環境（経度：１１９°５７．２６０′、緯度：２０°５９．８７７′、水深２２９ｍ）から分離されたものである。細菌培地を用いて平板希釈法により分離し、画線法で単離した。１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の相似解析により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓと９９％（７２２／７２８ｂｐ）の相似度があることがわかり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ種の菌株の一つＳＣＳＩＯ ０２４２９と鑑別された。この菌株はＩＳＰ２培地（蒸留水１リットル当たり酵母エキス４．０ｇ、麦汁１０．０ｇ、ブドウ糖４．０ｇ、寒天２０．０ｇを加える、ｐＨ ７．０）において２８〜３７℃で良好に生育する。
【０００９】
「一般細菌鑑別マニュアル」及び「バージィズ鑑別細菌学マニュアル」の基準、方法、種の分類特徴に従い、被験菌株に細菌の形態観察、生理・生化学テストなどの試験を行った。この菌株はＰＹＥＳ培地（０．３％カゼインペプトン、０．３％酵母エキス、０．２３％コハク酸二ナトリウム、ｐＨ７．２）においても同じく良好に生育し、褐色、不透明、平坦な円形コロニーで、最大コロニー径は５ｍｍである。コロニーは生育初期には完全な境界を有するが、それに続く生育過程において境界は徐々に消失する。細胞は桿状を示し、芽胞は楕円形で、細胞はグラム陽性である。ＰＹＥＳ培地において、２８〜３７℃ではいずれも良好に生育し、３週間培養した後は、４〜４７℃で明らかな生育が観察できる。この菌は２％及び５％塩化ナトリウムを含むＰＹＥＳ培地において生育でき、３週間培養した後、１２％ＮａＣｌを含むＰＹＥＳ培地培地で生育が観察できる。菌株はｐＨ６．０で生育を観察でき、ｐＨ７．０、８．０、９．５では迅速に生育できるため、この菌には耐アルカリ性があることがわかる。ＳＣＳＩＯ ０２４２９株菌の生理・生化学テストの結果は表１の通りで、表中の「＋」は陽性又は利用できる、「−」は陰性又は利用できないことを示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】
ＳＣＳＩＯ ０２４２９ 株菌と、最も近い菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ Ｖ２−ＢＩＩＩ−Ａ２（参考文献：Ｔａｕｂｅｌ Ｍ．，Ｋａｍｐｆｅｒ Ｐ，Ｂｕｃｚｏｌｉｔｓ Ｓ，Ｌｕｂｉｔｚ Ｗ，Ｂｕｓｓｅ Ｈ−Ｊ Ｒ． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ｓｐ． ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｗａｌｌ ｐａｉｎｔｉｎｇ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３年，第５３巻、ｐ．７２５−７３０。この菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪにおける登録番号はＡＪ４２２１４５である）とは、生理学的特性において大部分が一致するが、Ｄ−リボース、クエン酸塩、スクロースの利用、最高耐容塩分濃度が５％という特徴において異なる。このため、ＳＣＳＩＯ ０２４２９はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓの菌株の一つと鑑別され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓには現在まだ中国語の訳語はない。
【００１２】
本発明のイカオリゴペプチドの調製方法は、以下の手順を含むことを特徴とする。
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９菌種を菌種活性化培地に接種し、３０〜３７℃で１８〜２４時間培養し、活性化後、酵素生産誘導発酵培地を入れた容器に加え、ｐＨ＝７．０〜８．０、３０〜３７℃の条件で１２〜２４時間発酵させ、発酵液のプロテアーゼ活性が２０００〜３０００ユニット／ｍＬに達し、グリコサミノグリカナーゼ活性が０．９５〜１．１２ユニット／ｍＬに達したときのグリコシル加水分解用粗酵素溶液を得る工程であって、前記酵素生産誘導発酵培地は、イカ内臓スラリー、ペプトン、酵母エキス、複合塩及び水を質量比２０〜３０：５：５：１０：１０００で混合加熱し溶かして作成したものであり、前記複合塩は、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムを質量比５〜８：２：２：３で混合したものである工程、
（２）イカ内臓原料をスラリー状に破砕後、手順（１）に記載した粗酵素溶液と体積比１：１〜２：１で混ぜて酵素分解を行い、反応開始時のｐＨは６．５〜７．０、温度は４０〜５０℃、時間は５〜８時間で、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得る工程、及び、
（３）イカ内臓原料１グラムにつきブロメライン１０００〜１５００ユニット（酵素活性）を加える比率により、ブロメラインを手順（２）で得られた粗タンパク質酵素分解物に加え、ｐＨを６．５〜７．０に調節し、３５〜４０℃で４〜６時間反応させ、得られた酵素分解物を静置し、粗脂肪層と水層に分離し、脂肪層を除去し乾燥させて、イカオリゴペプチドを得る工程。
【００１３】
手順（３）に述べる乾燥は、噴霧乾燥などでよい。本発明に用いるペプトンと酵母エキスは市販のものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の生産する粗酵素の酵素分解により内臓タンパク質中のペプチド鎖につながったグリコサミノグリカン側鎖を破壊し、グリコシル基によるタンパク質ペプチド鎖の加水分解点への保護作用を除去するもので、反応の過度の加水分解が防がれるような温和な条件では、イカオリゴペプチドの収率は４０〜４６％、アミノ酸の収率は１６〜２２％に達する。このイカオリゴペプチドには海洋養殖動物の種苗死亡率を下げ、体重増加率を高める作用があり、飼料中の魚粉など従来のタンパク質源に代えることができる。また一定の生理活性を持ち、水産動物の体重増加率と生存率を有意に高めることができるため、海洋養殖配合飼料の機能性タンパク質源、添加物などとして使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の実施例は本発明についてのさらなる説明であり、本発明に対する制限ではない。
【００１６】
実施例におけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は中国典型培養物保蔵センターに保管され、保管番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１０２１３である。使用したイカは広州市黄沙海産市場で購入し、鑑別によりアカイカ（Ｏｍｍａｓｔｒｅｐｈｅｓ ｂａｒｔｒａｍｉ）と同定され、内臓を採取し、−１８℃で保存し、使用の２４時間前に４℃で解凍した。使用したブロメラインは南寧▲ぱん▼博生物工程有限公司の生産であり、８０万ユニット（酵素活性）／ｇである。ペプトンはＯｘｉｄｅ社の生産で、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）は碧雲天生物技術研究所より購入した。
【実施例１】
【００１７】
１Ｌの水にペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを加え、ｐＨを７．０に調節し、菌種活性化培地を得た。
【００１８】
イカ内臓スラリー１００ｇ、ペプトン２５ｇ、酵母エキス２５ｇ、複合塩５０ｇを量って取り、脱イオン水５０００ｍＬを加え、加熱して溶かし、ｐＨを７．０に調節し、発酵槽に移し入れ、蒸気滅菌し、酵素生産発酵培地を得た。この中の複合塩は塩化ナトリウム２０．９ｇ、硫酸カリウム８．３ｇ、塩化マグネシウム８．３ｇ及び塩化アンモニウム１２．５ｇからなる。
【００１９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を菌種活性化培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。活性化後、菌種を酵素生産発酵培地５Ｌの入った発酵槽に加え、ｐＨ＝７．０、３０℃、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎ、換気率０．２の条件において２４時間発酵させ、プロテアーゼ活性２０００ユニット／ｍＬ、グリコサミノグリカナーゼ活性０．９５ユニット／ｍＬになったら発酵完了とし、加水分解用粗酵素溶液４．７Ｌを得た。
【００２０】
プロテアーゼ活性の測定方法：中華人民共和国専門標準「プロテアーゼ活性測定法ＳＢ／Ｔ １０３１７−１９９９」の方法により測定した。
【００２１】
グリコサミノグリカナーゼのユニット（酵素活性）の定義：６０ ℃、ｐＨ ５．２、反応３０分で、グルコサミン１μｍｏｌを形成するのに必要な１分当たりの酵素量。グリコサミノグリカナーゼ活性の測定方法：一定量のグリコサミノグリカンを量って取り、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液に溶かし、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウムでｐＨを５．２に調節し、０．５％のグリコサミノグリカン溶液に調合した。グリコサミノグリカン溶液１．５ｍＬを吸って取り、６０ ℃で２ 分保温した後、酵素液０．５ｍＬを加え、振とうし、３０ｍｉｎ反応させた後、フェリシアン化カリウム試薬３ｍＬを加え、反応を止め、Ｉｍｏｔｏ法でその還元糖量を測定し、グリコサミノグリカンの分解速度を計算した。
【００２２】
イカ内臓の切片５ｋｇを量って取り、均質化装置を用いて２０００ｒ／ｍｉｎで１０分粉砕し、約４．７Ｌのペースト状物を得、酵素生産発酵生成物を入れた発酵槽に移し、２．０ｍｏｌ／Ｌの酢酸で溶液のｐＨを６．５に調節し、温度を４０℃にし、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎで８時間反応させ、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得た。
【００２３】
グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物にブロメライン６．２５ｇを加え、酵素用量をイカ内臓原料１ｇにつき約１０００ユニット（酵素活性）にした。均一になるまで撹拌した後、反応温度を４０℃に設定し、撹拌速度５０回転／分、ｐＨは７．０、反応時間６時間とした。反応が終わったら、撹拌を止め、生成物を静置して油層と水層に分離させ、上層の粗油を除去した後、サンプリングしイカオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定すると、結果はそれぞれ４０％と１６％であった。酵素分解物はただちに噴霧乾燥し、イカオリゴペプチド粉末８５３ｇを得た。
【００２４】
ゲルクロマトグラフィーでオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定した。このとき、オリゴペプチド収率（％）＝Ｎ２／Ｎ１×１００、アミノ酸収率％＝Ｎ３／Ｎ１×１００で、Ｎ１は酵素分解液中に含まれるアミノ酸態窒素の全量、Ｎ２は分子質量３００〜１０００Ｄａのペプチド類流出分に含まれるアミノ酸態窒素量（ｇ）、Ｎ３は分子質量１００〜２５０Ｄａの流出分に含まれるアミノ酸態窒素量（ｇ）である。ケルダール窒素定量法によりＮ１を測定した。酵素分解物は脱脂、遠心分離し不溶物を除去して重量を量り、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液に溶かし、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ ２０ゲルカラムに装填し、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、順にそれぞれの保持容積の流出分を収集し、その後ゲル浸透ＨＰＬＣで各流出分の分子質量分布を測定した。３００〜１０００Ｄａ分子質量範囲内の流出分を合わせたものがオリゴペプチドフラグメントであり、ケルダール窒素定量法でそれに含まれるアミノ酸態窒素量を測定したものがＮ２である。１００〜２５０Ｄａ分子質量範囲内の流出分を合わせたものが遊離アミノ酸フラグメントであり、ケルダール窒素定量法で含まれるアミノ酸態窒素量を測定したものがＮ３である。各流出分の分子質量分布はゲル浸透ＨＰＬＣで測定した。このとき、計算公式はＶｅ＝−ｂ’ｌｇＭｗ＋ｃ’であり、式中のＶｅは保持容積、Ｍｗは分子質量、ｂ’とｃ’は定数である。定数ｂ’とｃ’は、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液を用いて１ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフカラム（ＰＬ ａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ ３０ ８ｕｍ、ＳＥＣ社、英国）を平衡化し、吸光度２１４ｎｍで一定化し、ブルーデキストラン溶液を用いて試料注入しＶ０（死容積）を測定し、グリシン溶液を用いて試料注入しＶｔ（ゲルカラムベッドの全容積）を測定し、標準タンパク質混合液を用いて試料注入し、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで、各種標準タンパク質の溶出容積Ｖｅを記録し、分子量対数―Ｖｅの検量線を作成することで得られる。直接Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムのクロマト分離で得た各流出分を試料とし、試料注入して保持容積Ｖｅを測定し、公式により分子質量分布範囲を計算した。
【実施例２】
【００２５】
１Ｌの水にペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ ｇを加え、ｐＨを７．０に調節して菌種活性化培地を得た。
【００２６】
イカスラリー１５０ｇ、ペプトン２５ｇ、酵母エキス２５ｇ、複合塩５０ｇを量って取り、脱イオン水５０００ｍＬを加え、加熱して溶かし、ｐＨを８．０に調節し、発酵槽に移し、蒸気滅菌し、酵素生産発酵培地を得た。この中の複合塩は塩化ナトリウム２６．６ｇ、硫酸カリウム６．７ｇ、塩化マグネシウム６．７ｇ及び塩化アンモニウム１０．０ｇからなる。
【００２７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を活性化培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。活性化したら、菌種を酵素生産発酵培地５Ｌの入った発酵槽に加え、ｐＨ＝８．０、３７℃、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎ、換気率０．２の条件において１２時間発酵させ、プロテアーゼ活性が３０００ユニット／ｍＬ、グリコサミノグリカナーゼ活性が１．１２ユニット／ｍＬになったら発酵完了とし、加水分解用粗酵素溶液４．７Ｌを得た。プロテアーゼ活性とグリコサミノグリカナーゼ活性は実施例１の方法で測定した。
【００２８】
イカ内臓の切片１０ｋｇを量って取り、均質装置を用いて２０００ｒ／ｍｉｎで１０分粉砕し、約９．４Ｌのペースト状物を得、酵素生産発酵生成物を入れた発酵槽に移し、２．０ｍｏｌ／Ｌの酢酸で溶液のｐＨを７．０に調節し、温度を５０℃にし、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎで５時間反応させ、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得た。
【００２９】
グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物にブロメライン１８．１５ｇを加え、酵素用量をイカ内臓原料１ｇにつき約１５００ユニット（酵素活性）にする。均一になるまで撹拌した後、反応温度を３５℃に設定し、撹拌速度５０ ｒ／ｍｉｎ、ｐＨは６．５、反応時間４時間とした。反応が終わったら、撹拌を止め、生成物を静置して油層と水層に分離させ、上層の粗油を除去してから、サンプリングしイカオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定したところ、結果はそれぞれ４６％と２２％であった。酵素分解物はただちに噴霧乾燥し、イカオリゴペプチド粉末１６３０ｇを得た。オリゴペプチド収率とアミノ酸収率は実施例１の方法で計算した。
【実施例３】
【００３０】
ハイブリッドティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ｘ Ｏ． ａｕｒｅｕｓ）の種苗は広東柏士聯羅非魚苗養殖場の提供で、孵化１日の同一群のハイブリッドティラピア仔魚である。実験前にまず仔魚を５０リットルのプラスチック槽に放して２日馴化させ、馴化期間は給餌しなかった。
【００３１】
ハイブリッドティラピア種苗を１つの対照群と４つの実験群に分けた。このうち対照群に用いる飼料配合は魚粉４６％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群１に用いる飼料配合は魚粉４１％、実施例１で得られたイカオリゴペプチド５％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群２に用いる飼料配合は魚粉４１％、実施例２で得られたイカオリゴペプチド５％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群３に用いる飼料配合は魚粉３６％、実施例１で得られたイカオリゴペプチド１０％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群４に用いる飼料配合は魚粉３６％、実施例２で得られたイカオリゴペプチド１０％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％とした。相応の飼料配合を高水分条件において混ぜてスラリー状にし、５０℃負圧（０．０９７ ｍＰａ）で乾燥、破砕し、篩にかけ、粒子の大きさ６０〜８０μｍとし、得られた飼料は２０℃の冷蔵庫に保管した。
【００３２】
幼魚飼育槽にはエアストーンを置き、２４時間空気を供給し、毎日５０％の水を替え、槽底の廃棄物を吸引し（吸出し）、またサーモスタットで温度を２７℃に制御した。毎日仔魚体重の１０％の配合飼料を３回給餌し、実験周期は２１日で、３回繰り返した。
【００３３】
死亡率と体重増加率は下の方法により計算した。
実験の開始時と終了時にそれぞれハイブリッドティラピアの体重（０．００１ｇまで正確に）及び幼魚の数を測定する。
死亡率＝（実験開始時の幼魚数−実験終了時の幼魚数）／実験開始時の種苗数×１００％
絶対体重増加率＝（実験終了時の幼魚重量（ｇ）−実験開始時の幼魚重量（ｇ））／実験日数
【００３４】
結果は、対照群の幼魚の死亡率は５３％±８％、絶対体重増加率０．００５３±０．００１２ｇ／日、実験群１の幼魚の死亡率は４２％±１０％、絶対体重増加率０．００６２±０．０００５ｇ／日、実験群２の幼魚の死亡率は４５％±１０％、絶対体重増加率０．００６８±０．００１１ｇ／日、実験群３の幼魚の死亡率は３８％±２％、絶対体重増加率０．００７５±０．００１５ｇ／日、実験群４の幼魚の死亡率は３９％±６％、絶対体重増加率０．００６９±０．００１２ｇ／日であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌に関し、具体的には、海洋由来のバシラス属菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９菌株及びこの菌株を利用したイカオリゴペプチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国の海洋漁業の迅速な発展に伴い、イカの年間生産量は３０万トン前後に達し、我が国の重要な水産加工原料の一つになっている。イカの加工処理過程において、１５％程度の内臓廃棄物が生じ、これら廃棄物にはタンパク質が豊富に含まれているが、極めて腐乱・変質しやすいため、貯蔵が難しい。通常の処理方法ではイカ油を抽出し終わった廃棄物を埋めるが、近頃はイカ内臓に一次加工を行ってイカのスラリーを作製し、魚類の飼料に直接用いるという報告もある。しかし、こうした高度加工を経ていない飼料は生物学的利用能が高くない上、水環境を汚染し、養殖動物の病害流行の機会が増えることになる。このため、イカ内臓の開発利用を進めることは、経済的及び環境保護的に見て重要な意義がある。イカ内臓の酵素分解方法の研究も広い注目を浴びており、バイオ酵素技術を用いて、イカの粗タンパク質を、水産動物に吸収されやすく、一定の生理機能を持つオリゴペプチド類のタンパク質源に分解するのは、一つの効果的な方法であり、かつその研究もいくつか行われている。例えば薛長湖、劉春娥らによる、酵素の種類、用量、反応温度、反応時間などの要素がイカ内臓の粗タンパク質転換率に及ぼす影響についての研究（特許文献１）、袁亜輝らによる、イカ内臓の酵素分解を利用した海の旨み成分の生産、張井らによる、イカ内臓の酵素分解液中の重金属除去方法についての研究などである。
【０００３】
すでに報告されているイカ内臓の酵素分解方法において、使用酵素の種類には、トリプシン、ペプシン、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン及びこれら酵素の混合物がある。しかし現段階のイカ内臓の加水分解方法にはまだ、粗タンパク質の加水分解率が低い、酵素分解生成物の残留粗タンパク質が海洋養殖動物に吸収・利用されにくいといった問題がある。また反応温度の向上、反応時間の延長、触媒使用量の増加などの手段により粗タンパク質の加水分解度を高めると、今度は分解が進み過ぎる現象が起こり、目標とするオリゴペプチドの収率が大幅に下がる。例えば、イカ内臓の加水分解によるアミノ酸の収率が７０％を超えるが、オリゴペプチドの収率は却って非常に低くなるという文献報告がある。粗タンパク質の加水分解効率を高めると同時に、目標とするオリゴペプチドの収率を保証できれば、イカ内臓の利用水準は大きく向上する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】劉春娥、林洪、曹立民、単俊偉、「イカ内臓タンパク質の酵素加水分解技術の研究」、（中国）、食品工業科技、２００４年、第２５巻、第９号、ｐ．８３−８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、海洋中から新しいバシラス属菌を開発することにあり、もう一つの目的は、このバシラス属菌を利用してイカ内臓を酵素分解し、粗タンパク質の加水分解率が高くオリゴペプチドの収率が高い、イカオリゴペプチドの調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
我々は中国南海（南シナ海）の深海堆積物からＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９を分離し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９による発酵で得られた粗酵素溶液で、内臓タンパク質中のペプチド鎖につながったグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖を破壊し、さらにブロメラインを加えてタンパク質ペプチド鎖の加水分解を触媒した。得られたイカオリゴペプチドの収率は４０％〜４６％、アミノ酸の収率は１６％〜２２％で、これにより本発明の目的を実現した。
【０００７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は２０１０年８月３１日に中国典型培養物保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、略称ＣＣＴＣＣ）に保管されており、所在地は武漢市武昌珞珈山、保管番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１０２１３である。
【０００８】
上記のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は２００９年に採取された南シナ海の深海堆積環境（経度：１１９°５７．２６０′、緯度：２０°５９．８７７′、水深２２９ｍ）から分離されたものである。細菌培地を用いて平板希釈法により分離し、画線法で単離した。１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の相似解析により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓと９９％（７２２／７２８ｂｐ）の相似度があることがわかり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ種の菌株の一つＳＣＳＩＯ ０２４２９と鑑別された。この菌株はＩＳＰ２培地（蒸留水１リットル当たり酵母エキス４．０ｇ、麦汁１０．０ｇ、ブドウ糖４．０ｇ、寒天２０．０ｇを加える、ｐＨ ７．０）において２８〜３７℃で良好に生育する。
【０００９】
「一般細菌鑑別マニュアル」及び「バージィズ鑑別細菌学マニュアル」の基準、方法、種の分類特徴に従い、被験菌株に細菌の形態観察、生理・生化学テストなどの試験を行った。この菌株はＰＹＥＳ培地（０．３％カゼインペプトン、０．３％酵母エキス、０．２３％コハク酸二ナトリウム、ｐＨ７．２）においても同じく良好に生育し、褐色、不透明、平坦な円形コロニーで、最大コロニー径は５ｍｍである。コロニーは生育初期には完全な境界を有するが、それに続く生育過程において境界は徐々に消失する。細胞は桿状を示し、芽胞は楕円形で、細胞はグラム陽性である。ＰＹＥＳ培地において、２８〜３７℃ではいずれも良好に生育し、３週間培養した後は、４〜４７℃で明らかな生育が観察できる。この菌は２％及び５％塩化ナトリウムを含むＰＹＥＳ培地において生育でき、３週間培養した後、１２％ＮａＣｌを含むＰＹＥＳ培地培地で生育が観察できる。菌株はｐＨ６．０で生育を観察でき、ｐＨ７．０、８．０、９．５では迅速に生育できるため、この菌には耐アルカリ性があることがわかる。ＳＣＳＩＯ ０２４２９株菌の生理・生化学テストの結果は表１の通りで、表中の「＋」は陽性又は利用できる、「−」は陰性又は利用できないことを示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】
ＳＣＳＩＯ ０２４２９ 株菌と、最も近い菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ Ｖ２−ＢＩＩＩ−Ａ２（参考文献：Ｔａｕｂｅｌ Ｍ．，Ｋａｍｐｆｅｒ Ｐ，Ｂｕｃｚｏｌｉｔｓ Ｓ，Ｌｕｂｉｔｚ Ｗ，Ｂｕｓｓｅ Ｈ−Ｊ Ｒ． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ｓｐ． ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｗａｌｌ ｐａｉｎｔｉｎｇ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３年，第５３巻、ｐ．７２５−７３０。この菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪにおける登録番号はＡＪ４２２１４５である）とは、生理学的特性において大部分が一致するが、Ｄ−リボース、クエン酸塩、スクロースの利用、最高耐容塩分濃度が５％という特徴において異なる。このため、ＳＣＳＩＯ ０２４２９はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓの菌株の一つと鑑別され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓには現在まだ中国語の訳語はない。
【００１２】
本発明のイカオリゴペプチドの調製方法は、以下の手順を含むことを特徴とする。
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９菌種を菌種活性化培地に接種し、３０〜３７℃で１８〜２４時間培養し、活性化後、酵素生産誘導発酵培地を入れた容器に加え、ｐＨ＝７．０〜８．０、３０〜３７℃の条件で１２〜２４時間発酵させ、発酵液のプロテアーゼ活性が２０００〜３０００ユニット／ｍＬに達し、グリコサミノグリカナーゼ活性が０．９５〜１．１２ユニット／ｍＬに達したときのグリコシル加水分解用粗酵素溶液を得る工程であって、前記酵素生産誘導発酵培地は、イカ内臓スラリー、ペプトン、酵母エキス、複合塩及び水を質量比２０〜３０：５：５：１０：１０００で混合加熱し溶かして作成したものであり、前記複合塩は、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムを質量比５〜８：２：２：３で混合したものである工程、
（２）イカ内臓原料をスラリー状に破砕後、手順（１）に記載した粗酵素溶液と体積比１：１〜２：１で混ぜて酵素分解を行い、反応開始時のｐＨは６．５〜７．０、温度は４０〜５０℃、時間は５〜８時間で、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得る工程、及び、
（３）イカ内臓原料１グラムにつきブロメライン１０００〜１５００ユニット（酵素活性）を加える比率により、ブロメラインを手順（２）で得られた粗タンパク質酵素分解物に加え、ｐＨを６．５〜７．０に調節し、３５〜４０℃で４〜６時間反応させ、得られた酵素分解物を静置し、粗脂肪層と水層に分離し、脂肪層を除去し乾燥させて、イカオリゴペプチドを得る工程。
【００１３】
手順（３）に述べる乾燥は、噴霧乾燥などでよい。本発明に用いるペプトンと酵母エキスは市販のものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の生産する粗酵素の酵素分解により内臓タンパク質中のペプチド鎖につながったグリコサミノグリカン側鎖を破壊し、グリコシル基によるタンパク質ペプチド鎖の加水分解点への保護作用を除去するもので、反応の過度の加水分解が防がれるような温和な条件では、イカオリゴペプチドの収率は４０〜４６％、アミノ酸の収率は１６〜２２％に達する。このイカオリゴペプチドには海洋養殖動物の種苗死亡率を下げ、体重増加率を高める作用があり、飼料中の魚粉など従来のタンパク質源に代えることができる。また一定の生理活性を持ち、水産動物の体重増加率と生存率を有意に高めることができるため、海洋養殖配合飼料の機能性タンパク質源、添加物などとして使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の実施例は本発明についてのさらなる説明であり、本発明に対する制限ではない。
【００１６】
実施例におけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９は中国典型培養物保蔵センターに保管され、保管番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１０２１３である。使用したイカは広州市黄沙海産市場で購入し、鑑別によりアカイカ（Ｏｍｍａｓｔｒｅｐｈｅｓ ｂａｒｔｒａｍｉ）と同定され、内臓を採取し、−１８℃で保存し、使用の２４時間前に４℃で解凍した。使用したブロメラインは南寧▲ぱん▼博生物工程有限公司の生産であり、８０万ユニット（酵素活性）／ｇである。ペプトンはＯｘｉｄｅ社の生産で、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）は碧雲天生物技術研究所より購入した。
【実施例１】
【００１７】
１Ｌの水にペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを加え、ｐＨを７．０に調節し、菌種活性化培地を得た。
【００１８】
イカ内臓スラリー１００ｇ、ペプトン２５ｇ、酵母エキス２５ｇ、複合塩５０ｇを量って取り、脱イオン水５０００ｍＬを加え、加熱して溶かし、ｐＨを７．０に調節し、発酵槽に移し入れ、蒸気滅菌し、酵素生産発酵培地を得た。この中の複合塩は塩化ナトリウム２０．９ｇ、硫酸カリウム８．３ｇ、塩化マグネシウム８．３ｇ及び塩化アンモニウム１２．５ｇからなる。
【００１９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を菌種活性化培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。活性化後、菌種を酵素生産発酵培地５Ｌの入った発酵槽に加え、ｐＨ＝７．０、３０℃、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎ、換気率０．２の条件において２４時間発酵させ、プロテアーゼ活性２０００ユニット／ｍＬ、グリコサミノグリカナーゼ活性０．９５ユニット／ｍＬになったら発酵完了とし、加水分解用粗酵素溶液４．７Ｌを得た。
【００２０】
プロテアーゼ活性の測定方法：中華人民共和国専門標準「プロテアーゼ活性測定法ＳＢ／Ｔ １０３１７−１９９９」の方法により測定した。
【００２１】
グリコサミノグリカナーゼのユニット（酵素活性）の定義：６０ ℃、ｐＨ ５．２、反応３０分で、グルコサミン１μｍｏｌを形成するのに必要な１分当たりの酵素量。グリコサミノグリカナーゼ活性の測定方法：一定量のグリコサミノグリカンを量って取り、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液に溶かし、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウムでｐＨを５．２に調節し、０．５％のグリコサミノグリカン溶液に調合した。グリコサミノグリカン溶液１．５ｍＬを吸って取り、６０ ℃で２ 分保温した後、酵素液０．５ｍＬを加え、振とうし、３０ｍｉｎ反応させた後、フェリシアン化カリウム試薬３ｍＬを加え、反応を止め、Ｉｍｏｔｏ法でその還元糖量を測定し、グリコサミノグリカンの分解速度を計算した。
【００２２】
イカ内臓の切片５ｋｇを量って取り、均質化装置を用いて２０００ｒ／ｍｉｎで１０分粉砕し、約４．７Ｌのペースト状物を得、酵素生産発酵生成物を入れた発酵槽に移し、２．０ｍｏｌ／Ｌの酢酸で溶液のｐＨを６．５に調節し、温度を４０℃にし、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎで８時間反応させ、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得た。
【００２３】
グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物にブロメライン６．２５ｇを加え、酵素用量をイカ内臓原料１ｇにつき約１０００ユニット（酵素活性）にした。均一になるまで撹拌した後、反応温度を４０℃に設定し、撹拌速度５０回転／分、ｐＨは７．０、反応時間６時間とした。反応が終わったら、撹拌を止め、生成物を静置して油層と水層に分離させ、上層の粗油を除去した後、サンプリングしイカオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定すると、結果はそれぞれ４０％と１６％であった。酵素分解物はただちに噴霧乾燥し、イカオリゴペプチド粉末８５３ｇを得た。
【００２４】
ゲルクロマトグラフィーでオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定した。このとき、オリゴペプチド収率（％）＝Ｎ２／Ｎ１×１００、アミノ酸収率％＝Ｎ３／Ｎ１×１００で、Ｎ１は酵素分解液中に含まれるアミノ酸態窒素の全量、Ｎ２は分子質量３００〜１０００Ｄａのペプチド類流出分に含まれるアミノ酸態窒素量（ｇ）、Ｎ３は分子質量１００〜２５０Ｄａの流出分に含まれるアミノ酸態窒素量（ｇ）である。ケルダール窒素定量法によりＮ１を測定した。酵素分解物は脱脂、遠心分離し不溶物を除去して重量を量り、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液に溶かし、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ ２０ゲルカラムに装填し、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、順にそれぞれの保持容積の流出分を収集し、その後ゲル浸透ＨＰＬＣで各流出分の分子質量分布を測定した。３００〜１０００Ｄａ分子質量範囲内の流出分を合わせたものがオリゴペプチドフラグメントであり、ケルダール窒素定量法でそれに含まれるアミノ酸態窒素量を測定したものがＮ２である。１００〜２５０Ｄａ分子質量範囲内の流出分を合わせたものが遊離アミノ酸フラグメントであり、ケルダール窒素定量法で含まれるアミノ酸態窒素量を測定したものがＮ３である。各流出分の分子質量分布はゲル浸透ＨＰＬＣで測定した。このとき、計算公式はＶｅ＝−ｂ’ｌｇＭｗ＋ｃ’であり、式中のＶｅは保持容積、Ｍｗは分子質量、ｂ’とｃ’は定数である。定数ｂ’とｃ’は、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液を用いて１ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフカラム（ＰＬ ａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ ３０ ８ｕｍ、ＳＥＣ社、英国）を平衡化し、吸光度２１４ｎｍで一定化し、ブルーデキストラン溶液を用いて試料注入しＶ０（死容積）を測定し、グリシン溶液を用いて試料注入しＶｔ（ゲルカラムベッドの全容積）を測定し、標準タンパク質混合液を用いて試料注入し、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで、各種標準タンパク質の溶出容積Ｖｅを記録し、分子量対数―Ｖｅの検量線を作成することで得られる。直接Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムのクロマト分離で得た各流出分を試料とし、試料注入して保持容積Ｖｅを測定し、公式により分子質量分布範囲を計算した。
【実施例２】
【００２５】
１Ｌの水にペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ ｇを加え、ｐＨを７．０に調節して菌種活性化培地を得た。
【００２６】
イカスラリー１５０ｇ、ペプトン２５ｇ、酵母エキス２５ｇ、複合塩５０ｇを量って取り、脱イオン水５０００ｍＬを加え、加熱して溶かし、ｐＨを８．０に調節し、発酵槽に移し、蒸気滅菌し、酵素生産発酵培地を得た。この中の複合塩は塩化ナトリウム２６．６ｇ、硫酸カリウム６．７ｇ、塩化マグネシウム６．７ｇ及び塩化アンモニウム１０．０ｇからなる。
【００２７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を活性化培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。活性化したら、菌種を酵素生産発酵培地５Ｌの入った発酵槽に加え、ｐＨ＝８．０、３７℃、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎ、換気率０．２の条件において１２時間発酵させ、プロテアーゼ活性が３０００ユニット／ｍＬ、グリコサミノグリカナーゼ活性が１．１２ユニット／ｍＬになったら発酵完了とし、加水分解用粗酵素溶液４．７Ｌを得た。プロテアーゼ活性とグリコサミノグリカナーゼ活性は実施例１の方法で測定した。
【００２８】
イカ内臓の切片１０ｋｇを量って取り、均質装置を用いて２０００ｒ／ｍｉｎで１０分粉砕し、約９．４Ｌのペースト状物を得、酵素生産発酵生成物を入れた発酵槽に移し、２．０ｍｏｌ／Ｌの酢酸で溶液のｐＨを７．０に調節し、温度を５０℃にし、撹拌速度１００ｒ／ｍｉｎで５時間反応させ、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得た。
【００２９】
グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物にブロメライン１８．１５ｇを加え、酵素用量をイカ内臓原料１ｇにつき約１５００ユニット（酵素活性）にする。均一になるまで撹拌した後、反応温度を３５℃に設定し、撹拌速度５０ ｒ／ｍｉｎ、ｐＨは６．５、反応時間４時間とした。反応が終わったら、撹拌を止め、生成物を静置して油層と水層に分離させ、上層の粗油を除去してから、サンプリングしイカオリゴペプチドの収率とアミノ酸収率を測定したところ、結果はそれぞれ４６％と２２％であった。酵素分解物はただちに噴霧乾燥し、イカオリゴペプチド粉末１６３０ｇを得た。オリゴペプチド収率とアミノ酸収率は実施例１の方法で計算した。
【実施例３】
【００３０】
ハイブリッドティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ｘ Ｏ． ａｕｒｅｕｓ）の種苗は広東柏士聯羅非魚苗養殖場の提供で、孵化１日の同一群のハイブリッドティラピア仔魚である。実験前にまず仔魚を５０リットルのプラスチック槽に放して２日馴化させ、馴化期間は給餌しなかった。
【００３１】
ハイブリッドティラピア種苗を１つの対照群と４つの実験群に分けた。このうち対照群に用いる飼料配合は魚粉４６％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群１に用いる飼料配合は魚粉４１％、実施例１で得られたイカオリゴペプチド５％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群２に用いる飼料配合は魚粉４１％、実施例２で得られたイカオリゴペプチド５％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群３に用いる飼料配合は魚粉３６％、実施例１で得られたイカオリゴペプチド１０％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％、実験群４に用いる飼料配合は魚粉３６％、実施例２で得られたイカオリゴペプチド１０％、麦芽根１５％、タピオカでん粉１９％、酵母３％、大豆レシチン１％、コリン０．５％、リン酸水素カルシウム０．５％、調合ビタミン０．４％、調合ミネラル塩０．６％、セルロース８％、大豆油１％、アルギン酸ナトリウム１％、ゼラチン４％とした。相応の飼料配合を高水分条件において混ぜてスラリー状にし、５０℃負圧（０．０９７ ｍＰａ）で乾燥、破砕し、篩にかけ、粒子の大きさ６０〜８０μｍとし、得られた飼料は２０℃の冷蔵庫に保管した。
【００３２】
幼魚飼育槽にはエアストーンを置き、２４時間空気を供給し、毎日５０％の水を替え、槽底の廃棄物を吸引し（吸出し）、またサーモスタットで温度を２７℃に制御した。毎日仔魚体重の１０％の配合飼料を３回給餌し、実験周期は２１日で、３回繰り返した。
【００３３】
死亡率と体重増加率は下の方法により計算した。
実験の開始時と終了時にそれぞれハイブリッドティラピアの体重（０．００１ｇまで正確に）及び幼魚の数を測定する。
死亡率＝（実験開始時の幼魚数−実験終了時の幼魚数）／実験開始時の種苗数×１００％
絶対体重増加率＝（実験終了時の幼魚重量（ｇ）−実験開始時の幼魚重量（ｇ））／実験日数
【００３４】
結果は、対照群の幼魚の死亡率は５３％±８％、絶対体重増加率０．００５３±０．００１２ｇ／日、実験群１の幼魚の死亡率は４２％±１０％、絶対体重増加率０．００６２±０．０００５ｇ／日、実験群２の幼魚の死亡率は４５％±１０％、絶対体重増加率０．００６８±０．００１１ｇ／日、実験群３の幼魚の死亡率は３８％±２％、絶対体重増加率０．００７５±０．００１５ｇ／日、実験群４の幼魚の死亡率は３９％±６％、絶対体重増加率０．００６９±０．００１２ｇ／日であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９、中国典型培養物保蔵センター管理番号Ｍ ２０１０２１３の菌株。
【請求項２】
イカオリゴペプチドの調製方法であって、
（１）請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を菌種活性化培地に移し入れ、３０〜３７℃で１８〜２４時間培養し、活性化後に、酵素生産誘導発酵培地を入れた容器に加え、ｐＨ＝７．０〜８．０、３０〜３７℃の条件で１２〜２４時間発酵させ、発酵液のプロテアーゼ活性が２０００〜３０００ユニット／ｍＬに達し、グリコサミノグリカナーゼ活性が０．９５〜１．１２ユニット／ｍＬに達したときのグリコシル基加水分解用粗酵素溶液を得る工程であって、前記酵素生産誘導発酵培地は、イカ内臓スラリー、ペプトン、酵母エキス、複合塩及び水を質量比２０〜３０：５：５：１０：１０００で混合・加熱して溶かして作成され、前記複合塩は、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムを質量比５〜８：２：２：３で混合したものである工程、
（２）イカ内臓原料をスラリー状に破砕後、手順（１）に記載の粗酵素溶液と体積比１：１〜２：１で混ぜて酵素分解を行い、反応開始時のｐＨが６．５〜７．０、温度が４０〜５０℃、時間が５〜８時間で、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得る工程、及び、
（３）イカ内臓原料１グラムにつきブロメライン１０００〜１５００ユニット（酵素活性）の比率で、ブロメラインを手順（２）で得られた粗タンパク質酵素分解物に加え、ｐＨを６．５〜７．０に調節し、３５〜４０℃で４〜６時間反応させ、得られた酵素分解物を静置して粗脂肪層と水層に分離し、脂肪層を除去し乾燥させてイカオリゴペプチドを得る工程を含む方法。
【請求項３】
手順（３）に記載の乾燥が噴霧乾燥である、請求項２に記載のイカオリゴペプチドの調製方法。
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９、中国典型培養物保蔵センター管理番号Ｍ ２０１０２１３の菌株。
【請求項２】
イカオリゴペプチドの調製方法であって、
（１）請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ ＳＣＳＩＯ ０２４２９の菌種を菌種活性化培地に移し入れ、３０〜３７℃で１８〜２４時間培養し、活性化後に、酵素生産誘導発酵培地を入れた容器に加え、ｐＨ＝７．０〜８．０、３０〜３７℃の条件で１２〜２４時間発酵させ、発酵液のプロテアーゼ活性が２０００〜３０００ユニット／ｍＬに達し、グリコサミノグリカナーゼ活性が０．９５〜１．１２ユニット／ｍＬに達したときのグリコシル基加水分解用粗酵素溶液を得る工程であって、前記酵素生産誘導発酵培地は、イカ内臓スラリー、ペプトン、酵母エキス、複合塩及び水を質量比２０〜３０：５：５：１０：１０００で混合・加熱して溶かして作成され、前記複合塩は、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムを質量比５〜８：２：２：３で混合したものである工程、
（２）イカ内臓原料をスラリー状に破砕後、手順（１）に記載の粗酵素溶液と体積比１：１〜２：１で混ぜて酵素分解を行い、反応開始時のｐＨが６．５〜７．０、温度が４０〜５０℃、時間が５〜８時間で、グリコシル側鎖が破壊された粗タンパク質酵素分解物を得る工程、及び、
（３）イカ内臓原料１グラムにつきブロメライン１０００〜１５００ユニット（酵素活性）の比率で、ブロメラインを手順（２）で得られた粗タンパク質酵素分解物に加え、ｐＨを６．５〜７．０に調節し、３５〜４０℃で４〜６時間反応させ、得られた酵素分解物を静置して粗脂肪層と水層に分離し、脂肪層を除去し乾燥させてイカオリゴペプチドを得る工程を含む方法。
【請求項３】
手順（３）に記載の乾燥が噴霧乾燥である、請求項２に記載のイカオリゴペプチドの調製方法。
【公表番号】特表２０１２−５３２６２９（Ｐ２０１２−５３２６２９Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５６２０（Ｐ２０１２−５３５６２０）
【出願日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７９６２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１２／０４０９８０
【国際公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【出願人】（５１１２８２０７０）中国科学院南海海洋研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７９６２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１２／０４０９８０
【国際公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【出願人】（５１１２８２０７０）中国科学院南海海洋研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
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