添加物含有シリカを用いたマイクロスフェア型光イオン・センサ
【課題】 目的イオンを結合し得るイオノフォアと、前記イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータと、をドープした微粒子状シリカを含む液体試料中の該目的イオンの濃度を決定するセンサを提供する。
【解決手段】 センサは、液体試料中の目的イオンの濃度を決定するセンサであって、目的イオンを結合し得るイオノフォアと、該イオノフォアによる該目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータとをドープした微粒子状シリカを含む。前記検出可能な信号は、前記液体試料中の目的イオンの濃度に関連する。
【解決手段】 センサは、液体試料中の目的イオンの濃度を決定するセンサであって、目的イオンを結合し得るイオノフォアと、該イオノフォアによる該目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータとをドープした微粒子状シリカを含む。前記検出可能な信号は、前記液体試料中の目的イオンの濃度に関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の参照
本出願は、２００５年１月３１日出願の米国特許出願第６０／６４８，５２７号に対する優先権を主張し、その全文をここに参照によって引用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する申し立て
本発明は、国立保健衛生研究所から交付された米国政府による資金援助第ＤＥ１４９５０号に基づいて実施された。米国政府は本発明における然るべき権利を有する。
【０００３】
本発明はマイクロスフェア型化学センサに関し、特に添加物含有シリカ・テンプレートを利用したマイクロスフェア型光イオン・センサに関する。
【背景技術】
【０００４】
センサの小型化に関する集中的な努力の一部として、マイクロスフェア型化学センサ及びバイオセンサの製造への関心がこの１０年間で高まってきた。マイクロスフェアを用いるセンシングのプラットフォームには、幾つかの利点がある。このマイクロメートル・サイズのセンサは、例えば単細胞内の様な、或る特定の局所環境内における被分析物の濃度を問いかけることができる。また、必要な試料体積が非常に少ないことから、感度が向上し、応答時間が短縮され、試薬にかかる付帯費用が減少し、検出下限を改善することができる。さらに、多数の同じマイクロスフェアから読み取りを行うことで、センシング情報の冗長度が増し、精度が向上する。マイクロスフェアを用いたセンシングの原理は、光イメージング・ファイバ及びフロー・サイトメトリーといった或る種の読取形式に適用されて成果を上げている。例えば「イオン検出用マイクロスフェアとその使用方法」と題する米国特許公開第２００４／００５８３８４号公報にその説明がなされており、その全文をここに参照によって引用する。
【０００５】
マイクロスフェアに組み込まれ得る様々な分析手法の中でも、中性担体を用いたマイクロスフェア型オプトードは一般的な解質のイオン活量を信頼性良く測定することができる。イオン又は分子センシング用マイクロスフェアは、これまでに様々な手法で調製されており、例えば、Ｗ．Ｓｅｉｔｚら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４００（１９９９）５５、及びＺ．Ｓｈａｋｈｓｈｅｒら，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１４４（２００４）１４７に記載されるポリマー膨潤法によって調製される。マイクロスフェアはまた、Ｓ．Ｐｅｐｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４４２（２００１）２５に記載される不均一重合、Ｓ．Ｓｈｉｂａｔａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，３７（１９９８）４１に記載される微粒子テンプレートを用いた表面吸着、及びＩ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３（２００１）３１５に記載されるソルベント・キャスト法によっても調製されている。
【０００６】
また、粒径制御可能な光センシング用マイクロスフェアを穏やかな非反応的条件下で大量生産する目的で、米国特許第４，１６２，２８２号に開示されているものと類似した音波散布機を構築した旨が、Ｉ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３（２００１）６０８３に解説されている。ここで作成された光イオン・センシング用マイクロスフェアは古典的なバルク状態でのオプトード理論に従っていることが解っており、Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｃａ２＋，Ｐｂ２＋及びＣｌ−の測定に用いられている。より近年では、可塑剤浸出の問題を回避するための努力の一つとして、メタクリル酸メチル−メタクリル酸デシル（ＭＭＡＤＭＡ）共重合体マトリクスを用いたＫ＋検出用の可塑剤非含有マイクロスフェアが、微粒子散布機を用いて開発され、Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｙ．Ｑｉｎ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５００（２００３）１２７に記載されている。
【０００７】
しかしながら、上述の各方法は以下の欠点の１つ又はそれ以上を抱えている。マイクロスフェアを製造するための装置には、大方の研究室では入手不可能な特殊な機械部品や付属品が必要である。製造されたマイクロスフェアは水中に懸濁されており、あらゆる用途に適しているとは言えない。マイクロスフェアの寿命はこれまでのところ６ヶ月以内、より典型的には２〜６週間である。従前のこれら微粒子は機械的安定性に乏しく、超音波処理により破壊され、測定の妨げとなる微小な破片（断片）を生ずる場合がある。さらに、従前のこれら微粒子は互いに、又は器壁と癒着する場合がある。かかる癒着は微粒子が高い局所濃度で保存された場合に一層生じやすく、微粒子沈降物の保管中にはごく普通に生ずる。
【０００８】
シリカ微粒子は、クロマトグラフィー用カラムを充填する静止相として広く用いられている。シリカの表面はキラル分離の用途に合わせて化学修飾される場合があり、Ｗ．Ｐｉｒｋｌｅら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４（１９７９）１９５７、及びＮ．Ｏｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２９２（１９８４）４２７にその記載がある。また、シリカの表面を適当なポリマーで被覆して最適な分離を可能とする静止相を製造することが、Ｈ．Ｆｉｇｇｅら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３５１（１９８６）３９３に記載されている。
【０００９】
色素を含む添加物含有シリカ微粒子を蒸気のセンシングに用いた例がＫ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｔら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（２０００）１９４７に、また生体分子マーカーとして用いた例がＹ．Ｑｉｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５（２００３）３０３８に記載されている。しかし、添加物含有シリカ微粒子のこれら利用法の多くは単一成分のセンシング・システム用であり、イオン・センシングの目的には適さない。
【００１０】
したがって、イオン・センシング用の改良型マイクロスフェアが要望されている。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願第２００２／０１８３６０８号
【特許文献２】米国特許第第５，３８３，４５４号公報
【特許文献３】米国特許第５，８９１，０３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、目的イオンを結合し得るイオノフォアと、前記イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータと、をドープした微粒子状シリカを含む液体試料中の該目的イオンの濃度を決定するセンサを提供することを目的とする。前記検出可能な信号は前記液体試料中の前記目的イオンの濃度に関連している。前記インジケータは、クロモイオノフォアとすることができる。
【００１３】
前記センサは、自己増塑型(self-plasticizing)ポリマーを有するものであってよい。任意的に、前記センサは支持ポリマーと可塑剤とを含む。前記支持ポリマーはＰＶＣとすることができ、前記可塑剤はセバシン酸ビス（２−エチルヘキシル)（ＤＯＳ）とすることができる。
【００１４】
前記微粒子状シリカは、球状又は他の三次元的形状を有していてよい。任意的に、前記微粒子状シリカはシラン処理される。前記センサは親油性陽イオン交換体を含むこともできる。前記親油性陽イオン交換体は、ホウ酸テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル］ナトリウム（ＮａＴＦＰＢ）とすることができる。
【００１５】
本発明はまた、前記センサを用いて液体試料のイオンを検出する方法を提供することを目的とする。任意的に、水を含むシリカゲル・マイクロスフェアからなるセンサを乾燥させ、使用時までの保存用として乾燥センサを作製することができる。前記乾燥センサは再懸濁させて再懸濁センサを作製し、検出に用いることができる。任意的に、前記センサはフローサイトメーターを通過させ、検出可能な信号の計測に用いることができる。
【００１６】
前記センサは、光ファイバ束の中で用いることもできる。
【００１７】
本発明の上述した特徴、側面及び利点は、以下の記載、添付の特許請求の範囲及び付随する図面によってさらに明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一実施例によれば、本発明は添加物含有(doped)微粒子状シリカ・テンプレートを用いたイオン選択性光学センサと、その製造方法及び使用方法を提供することを目的とする。本発明はまた、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，５３７，２９ Ａｐｒｉｌ ２００５，ｐｐ．１３５〜１４３、題名“Microsphere Optical Ion Sensors Based On Doped Silica Gel Templates（添加物含有シリカゲル・テンプレートを用いたマイクロスフェア型光イオン・センサ）”の論文の内容であり、その全文をここに参照によって引用する。
【００１９】
好ましくは、前記センサは多孔質シリカ基材を有するマイクロスフェアから製造される。本発明の一実施例において、前記シリカ基材は平均粒径約３．５μｍのＥＫＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（スウェーデン）製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００Å球状シリカである。中でも、本発明に用いられる場合がある追加的なシリカ基材は、十分に狭い粒径分布を有する他の球状シリカを含み、例えば粒径５，７，１０，１３又は１６μｍのＫｒｏｍａｓｉｌ １００Åが挙げられる。前記マイクロスフェアの粒径は約０．２μｍ〜約５０μｍの範囲とされる場合があり、好ましくは０．５μｍ〜約２０μｍの範囲とされる場合がある。
【００２０】
前記センサは、液体試料中の目的イオンを結合し得、これに対して高い選択性を示すイオノフォアを有する。前記センサは、色々な目的イオンを検出するための広範なイオノフォアとの関連において用いられる場合がある。この様なイオノフォアの例として、例えば水素、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋、又はＰｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ａｇ＋等の金属イオン、及びＵＯ２２＋等の酸化物に選択性を示すイオノフォアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の一実施例において、前記イオノフォアはｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレン・テトラエチル・エステル(ナトリウム・イオノフォアＸ)であった。また本発明の他の実施例において、前記イオノフォアはポリ(アクリル酸n-ブチル)にグラフトされたＣａ２＋ イオノフォアＡＵ−１であった。イオノフォアの濃度は、約０．１〜約２００ｍｍｏｌｅｓ／ｋｇ、好ましくは約１０〜約５０ｍｍｏｌｅ／ｋｇとすることができる。
【００２２】
本発明に用いられる場合がある他のイオノフォアは、例えばカリウム・イオノフォアＩ（バリノマイシン）、カリウム・イオノフォアＩＩ（ビス［（ベンゾ−１５−クラウン−４）−４’−イルメチル］ピメラート）、カリウム・イオノフォアＩＩＩ（ＢＭＥ４４；［２−ドデシル−２−メチル−１，３−プロパンジイル−ビス［Ｎ−（５’−ニトロ（ベンゾ−１５−クラウン−５）−４’−イル）カルバメート］］、塩化物イオノフォアＩ（５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン・マンガン（ＩＩＩ）塩化物；Ｍｎ（ＩＩＩ）ＴＰＰＣｌ）、塩化物イオノフォアＩＩ（ＥＴＨ９００９；［４，５−ジメチル−３，６−ジオクチルオキシ−１，２−フェニレン］−ビス−（水銀−トリフルオロ酢酸）、ナトリウム・イオノフォアＩ（ＥＴＨ ２２７；Ｎ，Ｎ‘，Ｎ”−トリヘプチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリメチル−４，４’，４−プロピリジントリス（３−オクサブチルアミド））、ナトリウム・イオノフォアＩＩ，（ＥＴＨ １５７；Ｎ，Ｎ‘−ジベンジル−Ｎ，Ｎ‘−ジフェニル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＩＩＩ（ＥＴＨ ２１２０； Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロヘキシル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＩＶ（ＤＤ−１６−Ｃ−５，２，３：１１，１２−ジデカリノ−１６−クラウン−５）、ナトリウム・イオノフォアＶ（ＥＴＨ４１２０；４−オクタデカノイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロヘキシル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＶＩ（ビス［（１２−クラウン−４）メチル］ドデシルメチルマロネート）、ナトリウム・イオノフォアＶＩＩＩ（ビス［（１２−クラウン−４）メチル］２，２−ジドデシルマロネート）、ナトリウム・イオノフォアＸ（４−ｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレン−四酢酸テトラエチル・エステル）、カルシウム・イオノフォアＩ（ＥＴＨ１００１；（−）−（Ｒ，Ｒ）−Ｎ，Ｎ‘−（ビス（１１−エトキシカルボニル）ウンデシル）−Ｎ，Ｎ‘−４，５−テトラメチル−３，６−ジオキサオクタンジアミド；ジエチルＮ，Ｎ‘−［（４Ｒ，５Ｒ）−４，５−ジメチル−１，８−ジオキソ−３，６−ジオキサオクタメチレン］−ビス（１２−メチルアミノ−ドデカノエート）、カルシウム・イオノフォアＩＩ（ＥＴＨ １２９；Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロ−３−オキサペンタンジアミド）、カルシウム・イオノフォアＩＩＩ（Ａ２３１８７；カルシマイシン）、及びカルシウム・イオノフォアＩＶ（ＥＴＨ５２３４；Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ‘，Ｎ‘−ジオクタデシル−３−オキサペンタンアミド）を含み、いずれもＦｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）より入手可能である。
【００２３】
前記センサはまた、イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータを含む。一実施例において、前記インジケータはクロモイオノフォアである。前記クロモイオノフォアは、前記試料中の目的イオンの定量及び／又は検出を行うことができる。前記イオノフォアに結合する目的イオンによってプロトンが交換されるとクロモイオノフォアが脱プロトン化され、クロモイオノフォアのプロトン化に生ずる変化が光学的挙動の測定可能な変化となって現れる。
【００２４】
前記クロモイオノフォアは、例えば９−（ジエチルアミノ）−５−オクタデカノイルイミノ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン（クロモイオノフォアＩ，ＥＴＨ５２９４）とすることができる。本発明で用いられる場合がある他のインジケータは、例えばクロモイオノフォアＩＩ；ＥＴＨ２４３９；９−ジメチルアミノ−５−［４−（１６−ブチル−２，１４−ジオキソ−３，１５−ジオキサエイコシル）フェニルイミノ］ベンゾ［ａ］フェノキサジン；クロモイオノフォア ＶＩ；ＥＴＨ ７０７５； ４’，５’−ジブロモフルオレセイン・オクタデシル・エステル及びクロモイオノフォアＩＩＩ；ＥＴＨ５３５０；９−（ジエチルアミノ）−５−［（２−オクチルデシル）イミノ］ベンゾ［ａ］フェノキサジンを含む。
【００２５】
前記センサは、その全文をここに参照によって引用する２００２年１２月５日出願の米国特許出願第１０／３１３，０９０号に記載されるポリアクリル酸（ｎ−ブチル）、又はメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）とメタクリル酸デシルの各モノマーの共重合体の様な自己増塑型(self-plasticizing)ポリマーを含むことができる。
【００２６】
さらに、前記センサは支持ポリマー及び可塑剤を含むことができる。前記支持ポリマーは、例えば高分子量ポリ(塩化ビニル)（ＰＶＣ）とすることができる。前記可塑剤は、例えばＦｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製のセバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）（ＤＯＳ）とすることができる。別の可塑剤は、フタル酸ビス(2-エチルヘキシル)及び２−ニトロフェニルオクチル・エーテルを含む。
【００２７】
本発明のセンサは、試料からの目的イオンの抽出及び目的イオンのイオノフォアへの移動を促進する目的で、イオン交換体の様な他の添加剤を含む場合もある。好ましくは、前記イオン交換体は親油性陽イオン交換体である。前記親油性陽イオン交換体は、例えば、米国Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル］硼酸ナトリウム（ＮａＴＦＰＢ）とすることができる。
【００２８】
他の有用な陽イオン交換体は、カルバ−クロソ−ドデカホウ酸、特にハロゲ化カルボラン陰イオンを含む。ハロゲン化ドデカカルボラン陽イオン交換体の例は、トリメチルアンモニウム−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２十一臭化カルボラン（ＴＭＡＵＢＣ）（米国特許第１０／３１３，０９０を参照）、及び十一塩素化カルボラン（ＵＣＣ），六臭素化カルボラン（ＨＢＣ）及び十一ヨウ素化カルボラン（ＵＩＣ）の各陰イオンの塩（例、トリメチルメチルアンモニウム塩）を含む。
【００２９】
本発明の一実施例にかかるマイクロスフェアの調製について述べる。シリカ微粒子の疎水性を高めるために、ドーピングに先立ち、その全文をここに参照によって引用するＫ．Ｗｙｇｌａｄａｃｚら，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ， Ｂ８３（２００２）１０９及びＭ．Ｅ．ＭｃＧｏｖｅｒｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９４）３６０に基づいてシラン化処理を行うことができる。好ましくは、前記シリカ・テンプレートはボトル、又は他の容器内に注意深く封入され、細孔を脱気するために真空中で保管される。前記シリカ微粒子はその後、適当なセンシング成分でドーピングされる。
【００３０】
前記イオノフォアと前記インジケータとを含む前記センシング成分は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の様な適当な溶媒に溶解し、シリカ・テンプレートと共に穏やかに混合する。この混合物を例えばアルミ箔で覆い、前記溶媒の蒸発と共に多孔質シリカ・テンプレートにセンシング成分が導入されるまで、好ましくは暗所に保存する。好ましくは、作製されたマイクロスフェアは使用するまでの期間、暗所で保存する。
【００３１】
好ましくは、前記マイクロスフェア型光学センサには、陽イオン交換体（“Ｒ−”）と、イオノフォア（“Ｌ”）と、Ｈ＋選択性クロモイオノフォア（“Ｉｎｄ”）とがドープされる。かかるバルク型のオプトードを作製するには、電荷（“ｚ＋”）を持つ用イオン性の被分析物（“Ｉｚ＋”）を水溶液から有機センシング相に抽出し、下記のイオン交換機構にしたがって水素を追い出す。
Ｉｚ＋（ａｑ）＋ｎＬ（ｏｒｇ）＋ｚＩｎｄＨ＋（ｏｒｇ）＋ｚＲ−（ｏｒｇ） ＝ Ｌｎｚ＋（ｏｒｇ）＋ｚＩｎｄ（ｏｒｇ）＋ｚＲ−（ｏｒｇ）＋ｚＨ＋（ａｑ） （１）
【００３２】
電荷と質量バランスをひとまとめにし(combining)、プロトン化された“Ｉｎｄ”のモル分率を（“１−α”）と定義すると、被分析物の活量は次の様に表される。
【００３３】
ｐＨが既知の緩衝液中では、被分析イオンの活量はクロモイオノフォア （“１−α”）のプロトン化度で決まり、これはクロモイオノフォアのプロトン化体（“Ｒｐｒｏ”）と非プロトン化体（“Ｒｄｅｐ”）の発光強度の観測値から算出される。
【００３４】
実施例に関連して後述するように、蛍光顕微鏡観察及びフロー・サイトメトリー測定は、本発明のマイクロスフェア型光学センサの応答が古典的なバルク状態でのオプトード理論に従っていることを示している。測定範囲は生理学的な電解質の濃度に匹敵し、得られる選択性のデータはシリカを含まないセンシング用微粒子のそれに匹敵する。さらに、本発明のマイクロスフェア型光学センサは、乾燥状態で保存した場合、６ヶ月以上の貯蔵期限がある。
【００３５】
実施例
Ｃａ２＋イオノフォアＡＵ−１の調製
Ｃａ２＋イオノフォアＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ’−フェニル−Ｎ’−３−（２−プロペノイル）オキシフェニル−３−オキサペンタンジアミド（ＡＵ−１）を、その全文をここに参照によって引用するＹ．Ｑｉｎ，Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｒａｄｕ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５（２００３）３０３８にしたがって合成し、以下に述べるように２％（ｗ／ｗ）及び５％（ｗ／ｗ）の割合でポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトした。アクリル酸ｎ−ブチルはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ペンシルバニア州ウォリントン）より入手した。
【００３６】
概要を述べると、ＡＵ−１は下記の方法により合成した。工程１：無水ジグリコール酸（１．１６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解した溶液を攪拌しながら、ジシクロヘキシルアミン（３．６２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で３時間攪拌した。続いて、この反応混合物に６Ｎ ＨＣｌを２０ｍＬ加えた。固体を濾別し、濾液の有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンをロータリーエヴァポレータを用いて除去した。３−オキサペンタン酸−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルアミド（Ｉ）の白色結晶を酢酸エチルから収率９２％（２．７４ｇ）で再結晶化した。工程２：Ｎ２保護下で、２５ｍＬの乾燥ＴＨＦに３−ヒドロキシルジフェニルアミン（３．３３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を溶解した。続いて、この溶液にトリエチルアミン（１．９８ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、Ｎ２保護下、−５ｏＣでこの反応混合物に塩化アクリロイル（１．６２ｇ，１８ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて滴下した。２５分後、飽和ＮａＨＣＯ３溶液３０ｍＬを添加して反応を停止させた。有機層を分取し、水洗した。溶媒を蒸発除去した後、粗製物をフラッシュ・クロマトグラフィー(１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)により精製した。淡黄色固体のアクリル酸ｍ−アニリノフェニル（ＩＩ） が収率６０％（２．８８ｇ）で得られた。工程３：３０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２にＩ（０．７３６ｇ）及びＩＩ（０．５２９ｇ）を溶解した溶液を攪拌しながら、Ｅｔ３Ｎ（０．８ｇ）を室温で添加した。続いて、０．６１２ｇのＢＯＰ−Ｃｌを添加した。この混合物を２４時間環流した。この反応混合物を１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び水で洗浄した。有機相を分取し、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（１：５ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製した。淡黄色固体（Ｃ３１Ｈ３８Ｎ２Ｏ５，分子量５１８．６５）が収率５０％で得られた。
【００３７】
ＡＵ−１を導入したポリマーは、熱開始フリーラジカル溶液重合により合成した。アクリル酸ｎ−ブチル（１ｇ）と適量のイオノフォアＡＵ−１（２ 又は５ｗｔ％）を含む酢酸エチル溶液をＮ２で１０分間パージし、その後、重合開始剤としてＡｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製、純度９８％のアゾビス−（イソブチロニトリル）を５．１ｍｇ添加した。この均一溶液を攪拌し続け、温度を９０ｏＣまで上げ、この温度に１６時間保った。
【００３８】
反応終了後、溶媒を蒸発させ、ポリマーを１０ｍＬのジオキサンに再溶解した。ポリマー溶液の一部（２ｍＬ）を１００ｍＬの蒸留水に勢いよく攪拌しながら添加した。白色沈殿を集めて２５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過した。溶媒を蒸発させ、得られた透明ポリマーを室内環境で乾燥させた。ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にイオノフォアＡＵ−１を異なる濃度でグラフトさせた２種類のバッチを合成した：（１）ＡＵ−１の２ｗｔ％標品（３８．６ｍｍｏｌ／ｋｇ）、及び（２）ＡＵ−１の５ｗｔ％標品（９６．５ｍｍｏｌ／ｋｇ）。
【００３９】
マイクロスフェアの調製
下記の方法で、異なる数種類のマイクロスフェアを作製した。ドーピングに先立ち、シラン化処理を行った。平均粒径約３．５μｍのＫｒｏｍａｓｉｌ １００Å球状シリカ微粒子をトルエンで洗浄して不純物を除去し、真空装置に接続して脱気し、平底の反応容器内でメタクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピル（１０％，ｖ／ｖ，トルエン中）と混合した。水で環流させながら、温度６０〜７０ｏＣに３〜４時間保った。その後、余分な試薬と溶媒を除去し、シラン化処理されたマイクロスフェアを洗浄し、引き続き真空装置に接続した。
【００４０】
シラン化処理されたシリカ・テンプレートに適当なセンシング成分を全量２０ｍｇ（ドーピング成分＋シリカ・テンプレート）にてドープした。シリカ・テンプレートを注意深くボトルに密封し、秤量の前後で真空下に保ち、細孔から空気を除去した。センシング成分をTHFに溶解し、シリカ・テンプレートと静かに混合した。この混合物を１５５アルミ箔で覆い、暗所に７２時間保った。センシング成分は、この時、溶媒の蒸発に伴って多孔質シリカ・テンプレート中に導入された。このようにして製造されたマイクロスフェアは、キャラクタリゼーションを行うまで暗所に保存した。
【００４１】
ナトリウム選択性マイクロスフェア
４０ｍｍｏｌ／ｋｇのナトリウム・イオノフォア（Ｘ）、１０ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ及び種々の分量のＤＯＳ（１０，２０，３０，４０，５０％，ｗ／ｗ）からなるタイプＮａ−Ａ〜Ｎａ−Ｅに、適量のシリカ・テンプレート（１７．１，１５．１，１３．１，１１．１又は９．１ｍｇ）をそれぞれ混合した。変形例である組成物は、ナトリウム・イオノフォア（Ｘ）と、ＥＴＨ５２９４と、ＮａＴＦＰＢとについては上記と同じ濃度を有し、ＤＯＳは５又は１０％ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（タイプＮａ−Ｆ及びＮａ−Ｇ）のいずれか、又は５ｗｔ％ＰＶＣ（タイプＮａ−Ｈ）又は（５ｗｔ％ＰＶＣ＋１０ｗｔ％ＤＯＳ）（タイプＮａ−Ｉ）のいずれかにそれぞれ置き換えられている。タイプＮａ−Ｊは３９．３ｍｍｏｌ／ｋｇのナトリウム・イオノフォア（Ｘ）、９．７ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、１９．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、２ｗｔ％のＰＶＣ及び１７．６ｍｇのシリカ・テンプレートにドープした１０ｗｔ％のＤＯＳを含む（総重量２０ｍｇ）。
【００４２】
カルシウム選択性マイクロスフェア
イオノフォアＣａ（ＩＶ）をドープしたマイクロスフェア
タイプＣａ−Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤに、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ’，Ｎ’−ジオクタデシル−３−オキサペンタンアミド（ＣａイオノフォアＩＶ，ＥＴＨ５２３４）（１０．９，２１．５，３９．０又は４８．９ｍｍｏｌ／ｋｇ），ＥＴＨ５２９４（２．０，４．１，５．０又は６．２ｍｍｏｌ／ｋｇ），ＮａＴＦＰＢ（３．４，６．０，７．５又は９．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）及び１０％（ｗ／ｗ）ＤＯＳをドープした１６．０，１５．５，１５．１及び１４．７ｍｇのシリカ・テンプレートをそれぞれ含む。
【００４３】
タイプＣａ−Ｅ〜Ｃａ−Ｇは、５又は１０ｗｔ％のいずれかのポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）と組み合わせる（タイプＣａ−Ｅ及びＣａ−Ｆの場合）か、又は５ｗｔ％ＰＶＣとの組み合わせる（タイプＣａ−Ｇの場合）形で、３９．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ（ＩＶ）イオノフォア、５．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、及び７．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢをドープした。
【００４４】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされたＡＵ−１イオノフォアをドープしたマイクロスフェア
タイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされた２ｗｔ％のＡＵ−１を含む。タイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋは、総質量に対して１５，３０，４０又は５０％（ｗ／ｗ）のポリマーを含み、これは５．８，１１．６，１５．４及び１９．３ｍｍｏｌ／ｋｇのＡＵ−１、０．６，１．２，３．０又は３．６ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、１．１，２．３，４．６又は５．８ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、１７．４，１４．３，９．７又は８．０ｍｇのシリカ・テンプレートにドープされた１０ｗｔ％ＤＯＳに、それぞれ相当する。
【００４５】
タイプＣａ−Ｌは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされた５ｗｔ％のＡＵ−１を含む。ＡＵ−１は最近、イオン選択膜及びオプトード薄膜の様な可塑剤を含まないイオン・センシング・システムを製造するためのＭＭＡ−ＤＭＡ共重合体マトリクス中にグラフトされている。Ｙ．Ｑｉｎ，Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｒａｄｕ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３）３０３８を参照のこと。ポリ(アクリル酸ｎ−ブチル)は、Ｈｅｎｇ及びＨａｌｌにより、有用な内分可塑化ポリマーとして既に報告されている（Ｌ．Ｈｅｎｇ，Ｅ．Ｈａｌｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（２０００）４２）。タイプＣａ−Ｌは、１６ｗｔ％のポリマー（３０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋イオノフォアＡＵ−１），４．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４，８．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、及び１１．９ｍｇのシラン化シリカ・テンプレートにドープされた１０ｗｔ％ＤＯＳを含む。
【００４６】
試験例
イメージング分光器ＰＡＲＩＳＳ(Ｌｉｇｈｔ Ｆｏｒｍ社、ニュージャージー州ベルミード)と顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ４００（ニコン社製）とを組合せ、蛍光顕微鏡観察を行った。このシステムは、Ｐａｒｉｓｓ分光イメージング・ソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｆｏｒｍ社）で操作されるモータ駆動式ステージ（Ｐｒｉｏｒ Ｏｐｔｉｓｃａｎ社製ＥＳ９，英国ケンブリッジ、ファルボーン）に加え、２台のＣＣＤカメラＥＤＣ １０００Ｌ（Ｅｌｅｃｔｒｉｍ Ｃｏｒｐ社、ニュージャージー州プリンストン）と、エピ蛍光水銀ランプ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ジョージア州）とを備える。製造されたマイクロスフェアのキャラクタリゼーション及びスペクトル分離を行うために、Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ４０×０．７５対物レンズ（ニコン社製）とＥＸ５１０−５６０ｎｍフィルタを組み合わせて用いた。十分な蛍光強度を得るために、露光時間は２００〜６００ｍｓの範囲で選択した。
【００４７】
マイクロスフェアを衝試化試料溶液中で平衡化し、２０から４０分間、暗所に保管する。１０ｍＭのＨＣｌ又は１０ｍＭのＮａＯＨを、完全プロトン化状態又は脱プロトン化状態におけるスペクトルをそれぞれ記録するために用いた。６〜１０個のマイクロスフェアをランダムに選択し、スペクトルを記録した。プロトン化度は、ＥＴＨ５２９４の６４５及び６７５ｎｍにおける２つの蛍光ピーク強度の比を計算することにより求めた。
【００４８】
標準装備のレーザーを６３５ｎｍのダイオード・レーザーに交換し、６５０−６７５ｎｍの波長域の蛍光測定用に選択したフィルタと検出器とを備えた改造Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメーター（ベックマン社製）を用い、フロー・サイトメトリー実験を行った。６５０〜６７５ｎｍの波長域で発光する蛍光を、６５０ｎｍロングパス発光フィルタと、６６０（±１５）ｎｍバンドパス・フィルタとを用いて集光した。シリカゲル・ベースのマイクロスフェアは、緩衝化試料溶液中に２０〜３０分間浸漬し、平衡化させた。
【００４９】
ＤＳＭ ９４０走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）を５ｋＶで用い、その全文をここに参照によって引用するＩ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，７３（２００１）６０８３に詳述されている方法にしたがって、シリカ・テンプレート及び添加物含有マイクロスフェア・センサのＳＥＭ画像を得た。測定前に、乾燥マイクロスフェアをアルミナ片上に析出させ、約６０秒間のスパッタリングを行うことにより１０〜２０ｎｍのＡｕ／Ｐｄ膜で被覆した。
【００５０】
緩衝化試料液
緩衝液はいずれも、Ｎａｎｏｐｕｒｅで製造した脱イオン水（１８．２ＭΩｃｍ）を用いて調製した。１０−３Ｍトリス（Ｆｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製、トリス［ヒドロメチル］アミノ−メタン）又は１０−２Ｍ ＭＥＳを用いて濃度１０−５〜１ＭのＮａＣｌ又はＣａＣｌ２の緩衝液をそれぞれ調製し、トリス緩衝液についてはｐＨを７．４（ＭＥＳ緩衝液については５．５）に調節した。選択性の測定には、その全文をここに参照によって引用するＭ．Ｌｅｒｃｈｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１５３４及びＥ．Ｂａｋｋｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１８０５に詳述されている様に、分離溶液法を適用した。
【００５１】
バルク状態のオプトードの選択性を決定するには、関与するイオン種の各々について完全な較正曲線が必要である。これらの曲線は、全てのイオン種について同じｐＨで同じ膜組成を用いた場合に理想的な形で得られる。較正を別々に行うことにより、熱力学的交換及び共抽出定数に関するすべての被分析イオンの挙動に関する最も正確な情報が得られる。
【００５２】
他のいかなる妨害イオンにも勝る選択係数を与えるイオンの各応答曲線は、Ｅ．Ｂａｋｋｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１８０５の式２７及び式３６を用いてグラフィックにプロットし、計算することができる。
【００５３】
応答は、１種類の妨害イオンの塩１モルを含むｐＨ７．４の１０−３Ｍトリス緩衝液中で記録した。シリカ・テンプレートを用いたＮａ＋選択性マイクロスフェアでは、妨害陽イオンとしてＫ＋，Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を測定し、Ｃａ２＋選択性マイクロスフェアではＫ＋，Ｎａ＋及びＭｇ２＋を測定した。
【００５４】
試験結果
Ｎａ＋選択性マイクロスフェア
可塑剤ＤＯＳを用いて作製したタイプＮａ−Ａマイクロスフェアは、Ｎａ＋ 活量の変化に対して定量的に応答した。しかし、微粒子間の偏差及び理論的に予測される応答挙動からのずれは極めて大きく、２４時間後には可塑剤成分の浸出が顕微鏡下で検出された。いずれも可塑剤ＤＯＳを異なる濃度で使用している代替的な組成物Ｎａ−Ｂ〜Ｎａ−Ｅでは、実際、可塑剤含量の増加につれて浸出レベルが増大した。
【００５５】
また、可塑剤ＤＯＳに替えてポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）が用いられているか、又はカクテル処方にＰＶＣが添加されているタイプＮａ−Ｆ〜Ｎａ−Ｊの結果は、タイプＮａ−Ｊの様にＰＶＣを添加することにより、作製されたマイクロスフェアの応答特性が最も良く改善されることを示した。図２にタイプＮａ−Ｊすなわちシリカ・ベースのＮａ＋−センシング用マイクロスフェアにおいて、その色素が完全プロトン化体（１０−２Ｍ ＮａＯＨ）である場合と脱プロトン体（１０−２Ｍ ＨＣｌ）である場合の三次元応答スペクトルを示す。いずれもＰＶＣベースのマイクロスフェアのそれらと類似したピーク形状を示した。
【００５６】
これは、シリカ・テンプレートにドープされた後のクロモイオノフォアの基本的な機能性を確認するものであった。色素ＥＴＨ５２９４（クロモイオノフォアＩ）は、添加物含有シリカ・テンプレートにおいて６４５ｎｍ（脱プロトン化）及び６７５ｎｍ（プロトン化）の２ヶ所の蛍光発光極大を示すＨ＋選択性クロモイオノフォアである。これら２つのピークの強度比をとることにより、クロモイオノフォアのプロトン化度を、式（２）を用いて算出した。このレシオ測定には、光退色のリスクを低減しながら信頼性の高い信号を得、光源の不安定性やマイクロスフェアの寸法ばらつきの影響が少ないという利点がある。
【００５７】
図３Ａに、対応するＮａ＋応答曲線を、蛍光顕微鏡でキャラクタライズされた、これに付随するタイプＮａ−Ｊミクロ微粒子のｐＨ７．４における選択性と共に示す。プロットされた各データ点は平均実験値であり、誤差は５〜１０個体の測定から得られた標準偏差を示す。
【００５８】
理論曲線は、実験的な組成物を用いた式（２）より導出した。理論曲線用の適切なイオン交換定数(式（２）のＫｅｘ)と、共通の妨害イオンに対する種々のセンシング・システムの選択性係数を、図４の表にまとめ、音波微粒子散布装置を用いて作製されたシリカを含まないＰＶＣ−ＤＯＳ微粒子のデータと比較した。
【００５９】
本発明のマイクロスフェアは、Ｋ＋，Ｃａ２＋及びＭｇ２＋に対し、音波微粒子散布装置を用いて作製されたシリカを含まないＰＶＣ−ＤＯＳ微粒子とほぼ同様の選択性を有する。シリカ・テンプレートから作製された マイクロスフェアについては、その測定範囲はヒト唾液（刺激分泌，ｐＨ ７．０〜７．５、典型的なＮａ＋濃度は４．３〜２８ｍＭ）の直接測定に適する。シリカ・テンプレートを用いて作製されたマイクロスフェアも、１０倍希釈したヒト血漿（ｐＨ ７．４においてＮａ＋１３５〜１５０ｍＭ）の測定に用いることができる。
【００６０】
Ｃａ２＋選択性マイクロスフェア
イオノフォアＣａ（ＩＶ），ＥＴＨ５２９４，ＮａＴＦＰＢ及びＤＯＳを様々な組成で含むタイプＣａ−Ａ〜Ｃａ−Ｄには、適切なカルシウム応答が観測されなかった。ポリ(アクリル酸n-ブチル)を含むか、又はＰＶＣを添加した代替的なマトリクスを用いたタイプＣａ−Ｅ〜Ｃａ−Ｇでも、観測されるカルシウム応答はまだ満足できるものではなかった。
【００６１】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にＡＵ−１をグラフト（２％，ｗ／ｗ）したタイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋのマイクロスフェアでは、得られたクロモフォアの機能濃度が信頼性の高い蛍光顕微鏡観察を行うには低すぎた。グラフトするイオノフォアの濃度をさらに高めると、マイクロスフェアが強く凝集する結果となった。
【００６２】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）ポリマー中ＡＵ−１濃度を５％（ｗ／ｗ）としたタイプＣａ−Ｌのマイクロスフェアでは，Ｃａ２＋に対する優れた選択性が観測された。図３ＢにｐＨ７．４にて観測されたタイプＣａ−ＬのＣａ２＋の応答を、式（２）により求めた理論的な較正曲線と共に示す。
【００６３】
生理学的サンプル中に普通にみられる妨害陽イオンに対するタイプＣａ−Ｌのマイクロスフェアについて観測された選択性は、オプトード薄膜について得られたデータと一致していた（図４参照）。その量の多さ故に重要な妨害因子であるＮａ＋に対する選択性は、３桁以上であった。
【００６４】
クロモイオノフォアのプロトン化度が半分（α＝０．５）の時、ｐＨ７．４における対応するＣａ２＋の活量は約１ｍＭであり、その測定範囲がｐＨ ７．４におけるヒト血漿中のＣａ２＋（１〜１．２ｍＭ）、又はｐＨ７．０〜７．５における刺激分泌されたヒト唾液中のＣａ２＋（０．８〜２．８ｍＭ）の直接決定に適することを示している。
【００６５】
添加物含有シリカゲル・テンプレートを用いて作製されたマイクロスフェアについて観測された典型的な平衡化時間は約１０分間であり、通常の可塑化ＰＶＣ微粒子を用いた場合よりはわずかに長かったが、ＭＭＡ−ＤＭＡベースの微粒子を用いた場合よりは短かった。グラフトＡＵ−１がドープされたカルシウム選択性光学センシング用マイクロスフェアは、自由溶解イオノフォアを用いたナトリウム選択性マイクロスフェアに比べてより長い平衡化時間（約２５分）を示した。
【００６６】
マイクロスフェアのフロー・サイトメトリー分析
フロー・サイトメトリーは、可塑化ＰＶＣを用いた蛍光マイクロスフェア光学センサのキャラクタリゼーションに適し、ここではクロモイオノフォアＥＴＨ５２９４の脱プロトン体の単一パラメータ・ヒストグラムを記録して蛍光変化を決定した。作製したマイクロスフェアのキャラクタリゼーションには、フロー・サイトメトリーと蛍光顕微鏡観察の両方を適用した。フロー・サイトメトリーは、蛍光顕微鏡観察の様に個々の微粒子の蛍光を空間的あるいは分光的に分離することはできないが、多数の微粒子の統計的挙動に関する情報を提供する場合がある。
【００６７】
６６０ｎｍバンドパス・フィルタ（±１５ｎｍ）を次段に控えた６５０ｎｍロングパス・フィルターを備えたＦＬ１チャネルから得られるヒストグラムでは、観測されたカウントをピーク・チャネル蛍光の対数値に対してプロットし、累積微粒子カウントからガウス型分布曲線を生成した。試料中のイオン濃度が増大するにしたがって、脱プロトン体のＥＴＨ５２９４に由来する蛍光強度が増大すると共に、そのイオン応答を反映してガウス曲線のピーク・シフトが生ずることがわかった。約１万個のマイクロスフェアによるヒストグラム全体の変動係数（ＣＶ）は７．１３〜２９．３３であった。この値は、音波散布法による通常のＰＶＣ微粒子で観測される値よりも大きく、元々のシリカゲル・テンプレートの寸法分布の限界に起因して寸法再現性が乏しいことが示唆された。
【００６８】
図５Ａ及び図５Ｂは、フロー・サイトメトリー測定で得られた較正曲線と、それに付随するナトリウム選択性（タイプＮａ−Ｈ）又はカルシウム選択性（タイプＣａ−Ｌ）マイクロスフェアの選択性データを示す。製造されたマイクロスフェアのオプトード挙動を仮定すると、プロトン化度（“１−α”）はＦＬ１チャネルの単一パラメータ・ヒストグラムにおける蛍光ピーク位置（Ｐ）を用い、次式（４）で表された。
【００６９】
図５Ａのナトリウム応答に関する理論曲線（式（２））についてはｌｏｇＫｅｘは−５．６であり、カルシウムについてはｌｏｇＫｅｘ＝−９．１であった。これらのデータは、各微粒子の蛍光顕微鏡観察で得られたデータと同様である（Ｎａ＋についてはｌｏｇＫｅｘ＝−５．０、Ｃａ２＋については−９．０、図４参照）。強力な妨害種について実験的に求めた選択係数（ｌｏｇｋＯｓｅｌＩ，Ｊ値）も図４に示す。測定範囲も、蛍光顕微鏡観察で得られた範囲と近かった。フロー・サイトメトリーと顕微鏡観察による応答性及び選択性のデータは概してよく互いに一致しており、どちらの手法も本発明のマイクロスフェアのキャラクタリゼーションには適していた。
【００７０】
シリカ・ベースのマイクロスフェアのファイバ型光学センサ・アレイへの応用
通常のＰＶＣ光学イオン・センシング用マイクロスフェアは、何万本ものセンサの応答について並列検討を可能とする光ファイバ束に好適に応用されている。光ファイバ束はかかる目的のプラットホームとして開発されてきており、その主な理由は、製造されたマイクロスフェア・センサに寸法に合わせて高度に均一な「ウェル」をエッチングで簡単に作れるからである。光ファイバ束のセンシング端を濃度の異なる被分析物の緩衝液に浸すと、クロモイオノフォアの蛍光スペクトルを光ファイバ束の他端から捉え、蛍光顕微鏡でキャラクタライズすることができる。直径２ｍｍの光ファイバ束上に、コア径約４．６μｍのファイバ・スレッド糸が約３５００本存在する。
【００７１】
異なるイオンに選択性を有する可塑化ＰＶＣマイクロスフェアが同じ光ファイバ束上にランダムに被着され、多重光学センシングがこれまでに達成されている。可塑化ＰＶＣマイクロスフェアの代替として、添加物含有シリカゲル微粒子を利用した本発明のイオン・センシング用マイクロスフェアを、光ファイバ束のエッチングされた遠位端に被着させることができる。
【００７２】
五角形光ファイバ束を、その全文をここに参照によって引用する例えばＪ．Ｒ．Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１８（２００３）５４１に説明されている公知の方法で研磨、洗浄、エッチング、超音波処理した。作製した例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアを脱イオン水と混合し、この懸濁混合物の１μＬを分取し、ファイバ束の末端のエッチング形成ウェルに入れた。マイクロスフェアをウェルに入れた後、脱イオン水を用いて余剰な微粒子を洗浄除去する。その後、光ファイバ束のエッチング端を１０−２Ｍ ＨＣｌに２０分間浸し、スペクトル応答を取得した。
【００７３】
図６に示すように、光ファイバ束上で微粒子による９０％の被覆率が蛍光モードにより観察された。製造したマイクロスフェアの直径（約３．５μｍ）は、 エッチング形成ウェル（約４．６μｍ）の寸法に適合している。図７は、光ファイバ束のエッチング形成ウェル内で１列に並んだ５個のＮａ＋選択性マイクロスフェア（例Ｎａ−Ｈ）の三次元蛍光スペクトルを観測結果を示す。これらの同様な形状と互いに近い強度値は、近接するマイクロスフェア同士の間で蛍光スペクトルの再現性が高いことを示している。
【００７４】
本発明のマイクロスフェアは、信頼性の高いイオン応答及び一般的な妨害イオンに対する選択性など、生理学的試料への多くの適用基準を満たしている。シリカ・テンプレートの存在はセンシングの化学現象に何ら影響を及ぼさないことが明らかとなり、マイクロスフェアの応答はバルク状態におけるオプトードの原理を反映している。検出された応答は、オプトード薄膜や音波散布ポリマー型マイクロスフェアにより得られる応答と匹敵する。
【００７５】
さらに、本発明のマイクロスフェアは通常のＰＶＣベースのマイクロスフェアと同様、硬化プロセスを必要としない。本発明のマイクロスフェアは、ドーピング後すぐに使用することができる場合がある。本発明のマイクロスフェアは密度が高く、遠心して乾燥物又は水溶液として容易に取り扱うことができる。
【００７６】
密封して暗所に保管すれば、本発明のマイクロスフェアは６ヶ月以上保存できる。マイクロスフェアはその後再懸濁させて、再懸濁組成物とすることができる。タイプＮａ−Ｈ及びＣａ−Ｌのミクロスフェアについて、ドーピングから６ヶ月後にフロー・サイトメトリー測定を再び行ったところ、得られた応答は最初の測定時の応答を再現していることがわかった。
【００７７】
以上、本発明を説明したが、本発明は上記の本文及び後記の特許請求の範囲で述べるその範囲と正当な解釈から逸脱することなく様々な変形や適応に委ねることができることは明らかである。
【００７８】
本発明を或る好ましい態様を参照しながら詳細に述べてきたが、他の態様も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神と範囲はここで述べた好ましい態様に限定されてはならない。特許請求の範囲、要約書及び図面を含む本明細書で開示された全ての特徴、及びいかなる方法又はプロセスの工程も、それらの特徴及び／又は工程が互いに相容れない場合を除き、どのように組み合わせてもよい。特許請求の範囲、要約書及び図面を含む本明細書で開示する各特徴は, 特に断らない限り、同一の、同等の、又は類似の目的を持つ代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、特に断らない限り、開示される個々の特徴は、総体的な一連の同等又は類似の特徴の一つに過ぎない。
【００７９】
また、或る請求項において、特定の機能を発揮するための「手段」、又は特定の機能を実施する「工程」と明示されていない要素については、いずれも米国特許法第１１２条(35U.S.C.§112)に規定される「手段」又は「工程」条項と解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】センシング成分をドープする前の、本発明において有用なシラン処理シリカ微粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】例Ｎａ−Ｊのセンシング成分をドープした後の図１Ａの微粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】例Ｎａ−Ｊの単一シリカ・ベースＮａ＋選択性マイクロスフェア型光学センサを（Ａ）１０−２Ｍ ＨＣｌ及び（Ｂ）１０−２Ｍ ＮａＯＨに接触させた場合の空間分解蛍光スペクトルの３次元プロットである。
【図３Ａ】蛍光電子顕微鏡写真からキャラクタライズされた、例Ｎａ−Ｊ のマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図３Ｂ】蛍光電子顕微鏡写真からキャラクタライズされた、例Ｃａ−ＬのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図４】ｐＨ７．４で正規化した種々のイオノフォアを含むオプトードの選択係数の実験値を示す表である。
【図５Ａ】分析用フロー・サイトメトリーからキャラクタライズされた、例Ｎａ−ＪのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図５Ｂ】分析用フロー・サイトメトリーからキャラクタライズされた、例Ｃａ−ＬのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図６】例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアによる光ファイバ束のエッチング・ウェルの空間被覆性を観察した光学顕微鏡写真である。
【図７】光ファイバ束のエッチング・ウェル上における隣接する５個の例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアの蛍光スペクトルを示す三次元プロットである。
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の参照
本出願は、２００５年１月３１日出願の米国特許出願第６０／６４８，５２７号に対する優先権を主張し、その全文をここに参照によって引用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する申し立て
本発明は、国立保健衛生研究所から交付された米国政府による資金援助第ＤＥ１４９５０号に基づいて実施された。米国政府は本発明における然るべき権利を有する。
【０００３】
本発明はマイクロスフェア型化学センサに関し、特に添加物含有シリカ・テンプレートを利用したマイクロスフェア型光イオン・センサに関する。
【背景技術】
【０００４】
センサの小型化に関する集中的な努力の一部として、マイクロスフェア型化学センサ及びバイオセンサの製造への関心がこの１０年間で高まってきた。マイクロスフェアを用いるセンシングのプラットフォームには、幾つかの利点がある。このマイクロメートル・サイズのセンサは、例えば単細胞内の様な、或る特定の局所環境内における被分析物の濃度を問いかけることができる。また、必要な試料体積が非常に少ないことから、感度が向上し、応答時間が短縮され、試薬にかかる付帯費用が減少し、検出下限を改善することができる。さらに、多数の同じマイクロスフェアから読み取りを行うことで、センシング情報の冗長度が増し、精度が向上する。マイクロスフェアを用いたセンシングの原理は、光イメージング・ファイバ及びフロー・サイトメトリーといった或る種の読取形式に適用されて成果を上げている。例えば「イオン検出用マイクロスフェアとその使用方法」と題する米国特許公開第２００４／００５８３８４号公報にその説明がなされており、その全文をここに参照によって引用する。
【０００５】
マイクロスフェアに組み込まれ得る様々な分析手法の中でも、中性担体を用いたマイクロスフェア型オプトードは一般的な解質のイオン活量を信頼性良く測定することができる。イオン又は分子センシング用マイクロスフェアは、これまでに様々な手法で調製されており、例えば、Ｗ．Ｓｅｉｔｚら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４００（１９９９）５５、及びＺ．Ｓｈａｋｈｓｈｅｒら，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１４４（２００４）１４７に記載されるポリマー膨潤法によって調製される。マイクロスフェアはまた、Ｓ．Ｐｅｐｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４４２（２００１）２５に記載される不均一重合、Ｓ．Ｓｈｉｂａｔａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，３７（１９９８）４１に記載される微粒子テンプレートを用いた表面吸着、及びＩ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３（２００１）３１５に記載されるソルベント・キャスト法によっても調製されている。
【０００６】
また、粒径制御可能な光センシング用マイクロスフェアを穏やかな非反応的条件下で大量生産する目的で、米国特許第４，１６２，２８２号に開示されているものと類似した音波散布機を構築した旨が、Ｉ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３（２００１）６０８３に解説されている。ここで作成された光イオン・センシング用マイクロスフェアは古典的なバルク状態でのオプトード理論に従っていることが解っており、Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｃａ２＋，Ｐｂ２＋及びＣｌ−の測定に用いられている。より近年では、可塑剤浸出の問題を回避するための努力の一つとして、メタクリル酸メチル−メタクリル酸デシル（ＭＭＡＤＭＡ）共重合体マトリクスを用いたＫ＋検出用の可塑剤非含有マイクロスフェアが、微粒子散布機を用いて開発され、Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｙ．Ｑｉｎ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５００（２００３）１２７に記載されている。
【０００７】
しかしながら、上述の各方法は以下の欠点の１つ又はそれ以上を抱えている。マイクロスフェアを製造するための装置には、大方の研究室では入手不可能な特殊な機械部品や付属品が必要である。製造されたマイクロスフェアは水中に懸濁されており、あらゆる用途に適しているとは言えない。マイクロスフェアの寿命はこれまでのところ６ヶ月以内、より典型的には２〜６週間である。従前のこれら微粒子は機械的安定性に乏しく、超音波処理により破壊され、測定の妨げとなる微小な破片（断片）を生ずる場合がある。さらに、従前のこれら微粒子は互いに、又は器壁と癒着する場合がある。かかる癒着は微粒子が高い局所濃度で保存された場合に一層生じやすく、微粒子沈降物の保管中にはごく普通に生ずる。
【０００８】
シリカ微粒子は、クロマトグラフィー用カラムを充填する静止相として広く用いられている。シリカの表面はキラル分離の用途に合わせて化学修飾される場合があり、Ｗ．Ｐｉｒｋｌｅら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４（１９７９）１９５７、及びＮ．Ｏｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２９２（１９８４）４２７にその記載がある。また、シリカの表面を適当なポリマーで被覆して最適な分離を可能とする静止相を製造することが、Ｈ．Ｆｉｇｇｅら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３５１（１９８６）３９３に記載されている。
【０００９】
色素を含む添加物含有シリカ微粒子を蒸気のセンシングに用いた例がＫ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｔら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（２０００）１９４７に、また生体分子マーカーとして用いた例がＹ．Ｑｉｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５（２００３）３０３８に記載されている。しかし、添加物含有シリカ微粒子のこれら利用法の多くは単一成分のセンシング・システム用であり、イオン・センシングの目的には適さない。
【００１０】
したがって、イオン・センシング用の改良型マイクロスフェアが要望されている。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願第２００２／０１８３６０８号
【特許文献２】米国特許第第５，３８３，４５４号公報
【特許文献３】米国特許第５，８９１，０３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、目的イオンを結合し得るイオノフォアと、前記イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータと、をドープした微粒子状シリカを含む液体試料中の該目的イオンの濃度を決定するセンサを提供することを目的とする。前記検出可能な信号は前記液体試料中の前記目的イオンの濃度に関連している。前記インジケータは、クロモイオノフォアとすることができる。
【００１３】
前記センサは、自己増塑型(self-plasticizing)ポリマーを有するものであってよい。任意的に、前記センサは支持ポリマーと可塑剤とを含む。前記支持ポリマーはＰＶＣとすることができ、前記可塑剤はセバシン酸ビス（２−エチルヘキシル)（ＤＯＳ）とすることができる。
【００１４】
前記微粒子状シリカは、球状又は他の三次元的形状を有していてよい。任意的に、前記微粒子状シリカはシラン処理される。前記センサは親油性陽イオン交換体を含むこともできる。前記親油性陽イオン交換体は、ホウ酸テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル］ナトリウム（ＮａＴＦＰＢ）とすることができる。
【００１５】
本発明はまた、前記センサを用いて液体試料のイオンを検出する方法を提供することを目的とする。任意的に、水を含むシリカゲル・マイクロスフェアからなるセンサを乾燥させ、使用時までの保存用として乾燥センサを作製することができる。前記乾燥センサは再懸濁させて再懸濁センサを作製し、検出に用いることができる。任意的に、前記センサはフローサイトメーターを通過させ、検出可能な信号の計測に用いることができる。
【００１６】
前記センサは、光ファイバ束の中で用いることもできる。
【００１７】
本発明の上述した特徴、側面及び利点は、以下の記載、添付の特許請求の範囲及び付随する図面によってさらに明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一実施例によれば、本発明は添加物含有(doped)微粒子状シリカ・テンプレートを用いたイオン選択性光学センサと、その製造方法及び使用方法を提供することを目的とする。本発明はまた、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，５３７，２９ Ａｐｒｉｌ ２００５，ｐｐ．１３５〜１４３、題名“Microsphere Optical Ion Sensors Based On Doped Silica Gel Templates（添加物含有シリカゲル・テンプレートを用いたマイクロスフェア型光イオン・センサ）”の論文の内容であり、その全文をここに参照によって引用する。
【００１９】
好ましくは、前記センサは多孔質シリカ基材を有するマイクロスフェアから製造される。本発明の一実施例において、前記シリカ基材は平均粒径約３．５μｍのＥＫＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（スウェーデン）製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００Å球状シリカである。中でも、本発明に用いられる場合がある追加的なシリカ基材は、十分に狭い粒径分布を有する他の球状シリカを含み、例えば粒径５，７，１０，１３又は１６μｍのＫｒｏｍａｓｉｌ １００Åが挙げられる。前記マイクロスフェアの粒径は約０．２μｍ〜約５０μｍの範囲とされる場合があり、好ましくは０．５μｍ〜約２０μｍの範囲とされる場合がある。
【００２０】
前記センサは、液体試料中の目的イオンを結合し得、これに対して高い選択性を示すイオノフォアを有する。前記センサは、色々な目的イオンを検出するための広範なイオノフォアとの関連において用いられる場合がある。この様なイオノフォアの例として、例えば水素、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋、又はＰｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ａｇ＋等の金属イオン、及びＵＯ２２＋等の酸化物に選択性を示すイオノフォアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の一実施例において、前記イオノフォアはｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレン・テトラエチル・エステル(ナトリウム・イオノフォアＸ)であった。また本発明の他の実施例において、前記イオノフォアはポリ(アクリル酸n-ブチル)にグラフトされたＣａ２＋ イオノフォアＡＵ−１であった。イオノフォアの濃度は、約０．１〜約２００ｍｍｏｌｅｓ／ｋｇ、好ましくは約１０〜約５０ｍｍｏｌｅ／ｋｇとすることができる。
【００２２】
本発明に用いられる場合がある他のイオノフォアは、例えばカリウム・イオノフォアＩ（バリノマイシン）、カリウム・イオノフォアＩＩ（ビス［（ベンゾ−１５−クラウン−４）−４’−イルメチル］ピメラート）、カリウム・イオノフォアＩＩＩ（ＢＭＥ４４；［２−ドデシル−２−メチル−１，３−プロパンジイル−ビス［Ｎ−（５’−ニトロ（ベンゾ−１５−クラウン−５）−４’−イル）カルバメート］］、塩化物イオノフォアＩ（５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン・マンガン（ＩＩＩ）塩化物；Ｍｎ（ＩＩＩ）ＴＰＰＣｌ）、塩化物イオノフォアＩＩ（ＥＴＨ９００９；［４，５−ジメチル−３，６−ジオクチルオキシ−１，２−フェニレン］−ビス−（水銀−トリフルオロ酢酸）、ナトリウム・イオノフォアＩ（ＥＴＨ ２２７；Ｎ，Ｎ‘，Ｎ”−トリヘプチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリメチル−４，４’，４−プロピリジントリス（３−オクサブチルアミド））、ナトリウム・イオノフォアＩＩ，（ＥＴＨ １５７；Ｎ，Ｎ‘−ジベンジル−Ｎ，Ｎ‘−ジフェニル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＩＩＩ（ＥＴＨ ２１２０； Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロヘキシル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＩＶ（ＤＤ−１６−Ｃ−５，２，３：１１，１２−ジデカリノ−１６−クラウン−５）、ナトリウム・イオノフォアＶ（ＥＴＨ４１２０；４−オクタデカノイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロヘキシル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド）、ナトリウム・イオノフォアＶＩ（ビス［（１２−クラウン−４）メチル］ドデシルメチルマロネート）、ナトリウム・イオノフォアＶＩＩＩ（ビス［（１２−クラウン−４）メチル］２，２−ジドデシルマロネート）、ナトリウム・イオノフォアＸ（４−ｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレン−四酢酸テトラエチル・エステル）、カルシウム・イオノフォアＩ（ＥＴＨ１００１；（−）−（Ｒ，Ｒ）−Ｎ，Ｎ‘−（ビス（１１−エトキシカルボニル）ウンデシル）−Ｎ，Ｎ‘−４，５−テトラメチル−３，６−ジオキサオクタンジアミド；ジエチルＮ，Ｎ‘−［（４Ｒ，５Ｒ）−４，５−ジメチル−１，８−ジオキソ−３，６−ジオキサオクタメチレン］−ビス（１２−メチルアミノ−ドデカノエート）、カルシウム・イオノフォアＩＩ（ＥＴＨ １２９；Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−テトラシクロ−３−オキサペンタンジアミド）、カルシウム・イオノフォアＩＩＩ（Ａ２３１８７；カルシマイシン）、及びカルシウム・イオノフォアＩＶ（ＥＴＨ５２３４；Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ‘，Ｎ‘−ジオクタデシル−３−オキサペンタンアミド）を含み、いずれもＦｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）より入手可能である。
【００２３】
前記センサはまた、イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成し得るインジケータを含む。一実施例において、前記インジケータはクロモイオノフォアである。前記クロモイオノフォアは、前記試料中の目的イオンの定量及び／又は検出を行うことができる。前記イオノフォアに結合する目的イオンによってプロトンが交換されるとクロモイオノフォアが脱プロトン化され、クロモイオノフォアのプロトン化に生ずる変化が光学的挙動の測定可能な変化となって現れる。
【００２４】
前記クロモイオノフォアは、例えば９−（ジエチルアミノ）−５−オクタデカノイルイミノ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン（クロモイオノフォアＩ，ＥＴＨ５２９４）とすることができる。本発明で用いられる場合がある他のインジケータは、例えばクロモイオノフォアＩＩ；ＥＴＨ２４３９；９−ジメチルアミノ−５−［４−（１６−ブチル−２，１４−ジオキソ−３，１５−ジオキサエイコシル）フェニルイミノ］ベンゾ［ａ］フェノキサジン；クロモイオノフォア ＶＩ；ＥＴＨ ７０７５； ４’，５’−ジブロモフルオレセイン・オクタデシル・エステル及びクロモイオノフォアＩＩＩ；ＥＴＨ５３５０；９−（ジエチルアミノ）−５−［（２−オクチルデシル）イミノ］ベンゾ［ａ］フェノキサジンを含む。
【００２５】
前記センサは、その全文をここに参照によって引用する２００２年１２月５日出願の米国特許出願第１０／３１３，０９０号に記載されるポリアクリル酸（ｎ−ブチル）、又はメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）とメタクリル酸デシルの各モノマーの共重合体の様な自己増塑型(self-plasticizing)ポリマーを含むことができる。
【００２６】
さらに、前記センサは支持ポリマー及び可塑剤を含むことができる。前記支持ポリマーは、例えば高分子量ポリ(塩化ビニル)（ＰＶＣ）とすることができる。前記可塑剤は、例えばＦｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製のセバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）（ＤＯＳ）とすることができる。別の可塑剤は、フタル酸ビス(2-エチルヘキシル)及び２−ニトロフェニルオクチル・エーテルを含む。
【００２７】
本発明のセンサは、試料からの目的イオンの抽出及び目的イオンのイオノフォアへの移動を促進する目的で、イオン交換体の様な他の添加剤を含む場合もある。好ましくは、前記イオン交換体は親油性陽イオン交換体である。前記親油性陽イオン交換体は、例えば、米国Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル］硼酸ナトリウム（ＮａＴＦＰＢ）とすることができる。
【００２８】
他の有用な陽イオン交換体は、カルバ−クロソ−ドデカホウ酸、特にハロゲ化カルボラン陰イオンを含む。ハロゲン化ドデカカルボラン陽イオン交換体の例は、トリメチルアンモニウム−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２十一臭化カルボラン（ＴＭＡＵＢＣ）（米国特許第１０／３１３，０９０を参照）、及び十一塩素化カルボラン（ＵＣＣ），六臭素化カルボラン（ＨＢＣ）及び十一ヨウ素化カルボラン（ＵＩＣ）の各陰イオンの塩（例、トリメチルメチルアンモニウム塩）を含む。
【００２９】
本発明の一実施例にかかるマイクロスフェアの調製について述べる。シリカ微粒子の疎水性を高めるために、ドーピングに先立ち、その全文をここに参照によって引用するＫ．Ｗｙｇｌａｄａｃｚら，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ， Ｂ８３（２００２）１０９及びＭ．Ｅ．ＭｃＧｏｖｅｒｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９４）３６０に基づいてシラン化処理を行うことができる。好ましくは、前記シリカ・テンプレートはボトル、又は他の容器内に注意深く封入され、細孔を脱気するために真空中で保管される。前記シリカ微粒子はその後、適当なセンシング成分でドーピングされる。
【００３０】
前記イオノフォアと前記インジケータとを含む前記センシング成分は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の様な適当な溶媒に溶解し、シリカ・テンプレートと共に穏やかに混合する。この混合物を例えばアルミ箔で覆い、前記溶媒の蒸発と共に多孔質シリカ・テンプレートにセンシング成分が導入されるまで、好ましくは暗所に保存する。好ましくは、作製されたマイクロスフェアは使用するまでの期間、暗所で保存する。
【００３１】
好ましくは、前記マイクロスフェア型光学センサには、陽イオン交換体（“Ｒ−”）と、イオノフォア（“Ｌ”）と、Ｈ＋選択性クロモイオノフォア（“Ｉｎｄ”）とがドープされる。かかるバルク型のオプトードを作製するには、電荷（“ｚ＋”）を持つ用イオン性の被分析物（“Ｉｚ＋”）を水溶液から有機センシング相に抽出し、下記のイオン交換機構にしたがって水素を追い出す。
Ｉｚ＋（ａｑ）＋ｎＬ（ｏｒｇ）＋ｚＩｎｄＨ＋（ｏｒｇ）＋ｚＲ−（ｏｒｇ） ＝ Ｌｎｚ＋（ｏｒｇ）＋ｚＩｎｄ（ｏｒｇ）＋ｚＲ−（ｏｒｇ）＋ｚＨ＋（ａｑ） （１）
【００３２】
電荷と質量バランスをひとまとめにし(combining)、プロトン化された“Ｉｎｄ”のモル分率を（“１−α”）と定義すると、被分析物の活量は次の様に表される。
【００３３】
ｐＨが既知の緩衝液中では、被分析イオンの活量はクロモイオノフォア （“１−α”）のプロトン化度で決まり、これはクロモイオノフォアのプロトン化体（“Ｒｐｒｏ”）と非プロトン化体（“Ｒｄｅｐ”）の発光強度の観測値から算出される。
【００３４】
実施例に関連して後述するように、蛍光顕微鏡観察及びフロー・サイトメトリー測定は、本発明のマイクロスフェア型光学センサの応答が古典的なバルク状態でのオプトード理論に従っていることを示している。測定範囲は生理学的な電解質の濃度に匹敵し、得られる選択性のデータはシリカを含まないセンシング用微粒子のそれに匹敵する。さらに、本発明のマイクロスフェア型光学センサは、乾燥状態で保存した場合、６ヶ月以上の貯蔵期限がある。
【００３５】
実施例
Ｃａ２＋イオノフォアＡＵ−１の調製
Ｃａ２＋イオノフォアＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ’−フェニル−Ｎ’−３−（２−プロペノイル）オキシフェニル−３−オキサペンタンジアミド（ＡＵ−１）を、その全文をここに参照によって引用するＹ．Ｑｉｎ，Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｒａｄｕ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５（２００３）３０３８にしたがって合成し、以下に述べるように２％（ｗ／ｗ）及び５％（ｗ／ｗ）の割合でポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトした。アクリル酸ｎ−ブチルはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ペンシルバニア州ウォリントン）より入手した。
【００３６】
概要を述べると、ＡＵ−１は下記の方法により合成した。工程１：無水ジグリコール酸（１．１６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解した溶液を攪拌しながら、ジシクロヘキシルアミン（３．６２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で３時間攪拌した。続いて、この反応混合物に６Ｎ ＨＣｌを２０ｍＬ加えた。固体を濾別し、濾液の有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンをロータリーエヴァポレータを用いて除去した。３−オキサペンタン酸−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルアミド（Ｉ）の白色結晶を酢酸エチルから収率９２％（２．７４ｇ）で再結晶化した。工程２：Ｎ２保護下で、２５ｍＬの乾燥ＴＨＦに３−ヒドロキシルジフェニルアミン（３．３３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を溶解した。続いて、この溶液にトリエチルアミン（１．９８ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、Ｎ２保護下、−５ｏＣでこの反応混合物に塩化アクリロイル（１．６２ｇ，１８ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて滴下した。２５分後、飽和ＮａＨＣＯ３溶液３０ｍＬを添加して反応を停止させた。有機層を分取し、水洗した。溶媒を蒸発除去した後、粗製物をフラッシュ・クロマトグラフィー(１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)により精製した。淡黄色固体のアクリル酸ｍ−アニリノフェニル（ＩＩ） が収率６０％（２．８８ｇ）で得られた。工程３：３０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２にＩ（０．７３６ｇ）及びＩＩ（０．５２９ｇ）を溶解した溶液を攪拌しながら、Ｅｔ３Ｎ（０．８ｇ）を室温で添加した。続いて、０．６１２ｇのＢＯＰ−Ｃｌを添加した。この混合物を２４時間環流した。この反応混合物を１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び水で洗浄した。有機相を分取し、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（１：５ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製した。淡黄色固体（Ｃ３１Ｈ３８Ｎ２Ｏ５，分子量５１８．６５）が収率５０％で得られた。
【００３７】
ＡＵ−１を導入したポリマーは、熱開始フリーラジカル溶液重合により合成した。アクリル酸ｎ−ブチル（１ｇ）と適量のイオノフォアＡＵ−１（２ 又は５ｗｔ％）を含む酢酸エチル溶液をＮ２で１０分間パージし、その後、重合開始剤としてＡｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製、純度９８％のアゾビス−（イソブチロニトリル）を５．１ｍｇ添加した。この均一溶液を攪拌し続け、温度を９０ｏＣまで上げ、この温度に１６時間保った。
【００３８】
反応終了後、溶媒を蒸発させ、ポリマーを１０ｍＬのジオキサンに再溶解した。ポリマー溶液の一部（２ｍＬ）を１００ｍＬの蒸留水に勢いよく攪拌しながら添加した。白色沈殿を集めて２５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過した。溶媒を蒸発させ、得られた透明ポリマーを室内環境で乾燥させた。ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にイオノフォアＡＵ−１を異なる濃度でグラフトさせた２種類のバッチを合成した：（１）ＡＵ−１の２ｗｔ％標品（３８．６ｍｍｏｌ／ｋｇ）、及び（２）ＡＵ−１の５ｗｔ％標品（９６．５ｍｍｏｌ／ｋｇ）。
【００３９】
マイクロスフェアの調製
下記の方法で、異なる数種類のマイクロスフェアを作製した。ドーピングに先立ち、シラン化処理を行った。平均粒径約３．５μｍのＫｒｏｍａｓｉｌ １００Å球状シリカ微粒子をトルエンで洗浄して不純物を除去し、真空装置に接続して脱気し、平底の反応容器内でメタクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピル（１０％，ｖ／ｖ，トルエン中）と混合した。水で環流させながら、温度６０〜７０ｏＣに３〜４時間保った。その後、余分な試薬と溶媒を除去し、シラン化処理されたマイクロスフェアを洗浄し、引き続き真空装置に接続した。
【００４０】
シラン化処理されたシリカ・テンプレートに適当なセンシング成分を全量２０ｍｇ（ドーピング成分＋シリカ・テンプレート）にてドープした。シリカ・テンプレートを注意深くボトルに密封し、秤量の前後で真空下に保ち、細孔から空気を除去した。センシング成分をTHFに溶解し、シリカ・テンプレートと静かに混合した。この混合物を１５５アルミ箔で覆い、暗所に７２時間保った。センシング成分は、この時、溶媒の蒸発に伴って多孔質シリカ・テンプレート中に導入された。このようにして製造されたマイクロスフェアは、キャラクタリゼーションを行うまで暗所に保存した。
【００４１】
ナトリウム選択性マイクロスフェア
４０ｍｍｏｌ／ｋｇのナトリウム・イオノフォア（Ｘ）、１０ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ及び種々の分量のＤＯＳ（１０，２０，３０，４０，５０％，ｗ／ｗ）からなるタイプＮａ−Ａ〜Ｎａ−Ｅに、適量のシリカ・テンプレート（１７．１，１５．１，１３．１，１１．１又は９．１ｍｇ）をそれぞれ混合した。変形例である組成物は、ナトリウム・イオノフォア（Ｘ）と、ＥＴＨ５２９４と、ＮａＴＦＰＢとについては上記と同じ濃度を有し、ＤＯＳは５又は１０％ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（タイプＮａ−Ｆ及びＮａ−Ｇ）のいずれか、又は５ｗｔ％ＰＶＣ（タイプＮａ−Ｈ）又は（５ｗｔ％ＰＶＣ＋１０ｗｔ％ＤＯＳ）（タイプＮａ−Ｉ）のいずれかにそれぞれ置き換えられている。タイプＮａ−Ｊは３９．３ｍｍｏｌ／ｋｇのナトリウム・イオノフォア（Ｘ）、９．７ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、１９．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、２ｗｔ％のＰＶＣ及び１７．６ｍｇのシリカ・テンプレートにドープした１０ｗｔ％のＤＯＳを含む（総重量２０ｍｇ）。
【００４２】
カルシウム選択性マイクロスフェア
イオノフォアＣａ（ＩＶ）をドープしたマイクロスフェア
タイプＣａ−Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤに、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ’，Ｎ’−ジオクタデシル−３−オキサペンタンアミド（ＣａイオノフォアＩＶ，ＥＴＨ５２３４）（１０．９，２１．５，３９．０又は４８．９ｍｍｏｌ／ｋｇ），ＥＴＨ５２９４（２．０，４．１，５．０又は６．２ｍｍｏｌ／ｋｇ），ＮａＴＦＰＢ（３．４，６．０，７．５又は９．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）及び１０％（ｗ／ｗ）ＤＯＳをドープした１６．０，１５．５，１５．１及び１４．７ｍｇのシリカ・テンプレートをそれぞれ含む。
【００４３】
タイプＣａ−Ｅ〜Ｃａ−Ｇは、５又は１０ｗｔ％のいずれかのポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）と組み合わせる（タイプＣａ−Ｅ及びＣａ−Ｆの場合）か、又は５ｗｔ％ＰＶＣとの組み合わせる（タイプＣａ−Ｇの場合）形で、３９．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ（ＩＶ）イオノフォア、５．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、及び７．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢをドープした。
【００４４】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされたＡＵ−１イオノフォアをドープしたマイクロスフェア
タイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされた２ｗｔ％のＡＵ−１を含む。タイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋは、総質量に対して１５，３０，４０又は５０％（ｗ／ｗ）のポリマーを含み、これは５．８，１１．６，１５．４及び１９．３ｍｍｏｌ／ｋｇのＡＵ−１、０．６，１．２，３．０又は３．６ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４、１．１，２．３，４．６又は５．８ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、１７．４，１４．３，９．７又は８．０ｍｇのシリカ・テンプレートにドープされた１０ｗｔ％ＤＯＳに、それぞれ相当する。
【００４５】
タイプＣａ−Ｌは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にグラフトされた５ｗｔ％のＡＵ−１を含む。ＡＵ−１は最近、イオン選択膜及びオプトード薄膜の様な可塑剤を含まないイオン・センシング・システムを製造するためのＭＭＡ−ＤＭＡ共重合体マトリクス中にグラフトされている。Ｙ．Ｑｉｎ，Ｓ．Ｐｅｐｅｒ，Ａ．Ｒａｄｕ，Ａ．Ｃｅｒｅｓａ，Ｅ．Ｂａｋｋｅｒ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３）３０３８を参照のこと。ポリ(アクリル酸ｎ−ブチル)は、Ｈｅｎｇ及びＨａｌｌにより、有用な内分可塑化ポリマーとして既に報告されている（Ｌ．Ｈｅｎｇ，Ｅ．Ｈａｌｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（２０００）４２）。タイプＣａ−Ｌは、１６ｗｔ％のポリマー（３０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋イオノフォアＡＵ−１），４．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＥＴＨ５２９４，８．０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、及び１１．９ｍｇのシラン化シリカ・テンプレートにドープされた１０ｗｔ％ＤＯＳを含む。
【００４６】
試験例
イメージング分光器ＰＡＲＩＳＳ(Ｌｉｇｈｔ Ｆｏｒｍ社、ニュージャージー州ベルミード)と顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ４００（ニコン社製）とを組合せ、蛍光顕微鏡観察を行った。このシステムは、Ｐａｒｉｓｓ分光イメージング・ソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｆｏｒｍ社）で操作されるモータ駆動式ステージ（Ｐｒｉｏｒ Ｏｐｔｉｓｃａｎ社製ＥＳ９，英国ケンブリッジ、ファルボーン）に加え、２台のＣＣＤカメラＥＤＣ １０００Ｌ（Ｅｌｅｃｔｒｉｍ Ｃｏｒｐ社、ニュージャージー州プリンストン）と、エピ蛍光水銀ランプ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ジョージア州）とを備える。製造されたマイクロスフェアのキャラクタリゼーション及びスペクトル分離を行うために、Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ４０×０．７５対物レンズ（ニコン社製）とＥＸ５１０−５６０ｎｍフィルタを組み合わせて用いた。十分な蛍光強度を得るために、露光時間は２００〜６００ｍｓの範囲で選択した。
【００４７】
マイクロスフェアを衝試化試料溶液中で平衡化し、２０から４０分間、暗所に保管する。１０ｍＭのＨＣｌ又は１０ｍＭのＮａＯＨを、完全プロトン化状態又は脱プロトン化状態におけるスペクトルをそれぞれ記録するために用いた。６〜１０個のマイクロスフェアをランダムに選択し、スペクトルを記録した。プロトン化度は、ＥＴＨ５２９４の６４５及び６７５ｎｍにおける２つの蛍光ピーク強度の比を計算することにより求めた。
【００４８】
標準装備のレーザーを６３５ｎｍのダイオード・レーザーに交換し、６５０−６７５ｎｍの波長域の蛍光測定用に選択したフィルタと検出器とを備えた改造Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメーター（ベックマン社製）を用い、フロー・サイトメトリー実験を行った。６５０〜６７５ｎｍの波長域で発光する蛍光を、６５０ｎｍロングパス発光フィルタと、６６０（±１５）ｎｍバンドパス・フィルタとを用いて集光した。シリカゲル・ベースのマイクロスフェアは、緩衝化試料溶液中に２０〜３０分間浸漬し、平衡化させた。
【００４９】
ＤＳＭ ９４０走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）を５ｋＶで用い、その全文をここに参照によって引用するＩ．Ｔｓａｇｋａｔａｋｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，７３（２００１）６０８３に詳述されている方法にしたがって、シリカ・テンプレート及び添加物含有マイクロスフェア・センサのＳＥＭ画像を得た。測定前に、乾燥マイクロスフェアをアルミナ片上に析出させ、約６０秒間のスパッタリングを行うことにより１０〜２０ｎｍのＡｕ／Ｐｄ膜で被覆した。
【００５０】
緩衝化試料液
緩衝液はいずれも、Ｎａｎｏｐｕｒｅで製造した脱イオン水（１８．２ＭΩｃｍ）を用いて調製した。１０−３Ｍトリス（Ｆｌｕｋａ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）製、トリス［ヒドロメチル］アミノ−メタン）又は１０−２Ｍ ＭＥＳを用いて濃度１０−５〜１ＭのＮａＣｌ又はＣａＣｌ２の緩衝液をそれぞれ調製し、トリス緩衝液についてはｐＨを７．４（ＭＥＳ緩衝液については５．５）に調節した。選択性の測定には、その全文をここに参照によって引用するＭ．Ｌｅｒｃｈｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１５３４及びＥ．Ｂａｋｋｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１８０５に詳述されている様に、分離溶液法を適用した。
【００５１】
バルク状態のオプトードの選択性を決定するには、関与するイオン種の各々について完全な較正曲線が必要である。これらの曲線は、全てのイオン種について同じｐＨで同じ膜組成を用いた場合に理想的な形で得られる。較正を別々に行うことにより、熱力学的交換及び共抽出定数に関するすべての被分析イオンの挙動に関する最も正確な情報が得られる。
【００５２】
他のいかなる妨害イオンにも勝る選択係数を与えるイオンの各応答曲線は、Ｅ．Ｂａｋｋｅｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１９９２）１８０５の式２７及び式３６を用いてグラフィックにプロットし、計算することができる。
【００５３】
応答は、１種類の妨害イオンの塩１モルを含むｐＨ７．４の１０−３Ｍトリス緩衝液中で記録した。シリカ・テンプレートを用いたＮａ＋選択性マイクロスフェアでは、妨害陽イオンとしてＫ＋，Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を測定し、Ｃａ２＋選択性マイクロスフェアではＫ＋，Ｎａ＋及びＭｇ２＋を測定した。
【００５４】
試験結果
Ｎａ＋選択性マイクロスフェア
可塑剤ＤＯＳを用いて作製したタイプＮａ−Ａマイクロスフェアは、Ｎａ＋ 活量の変化に対して定量的に応答した。しかし、微粒子間の偏差及び理論的に予測される応答挙動からのずれは極めて大きく、２４時間後には可塑剤成分の浸出が顕微鏡下で検出された。いずれも可塑剤ＤＯＳを異なる濃度で使用している代替的な組成物Ｎａ−Ｂ〜Ｎａ−Ｅでは、実際、可塑剤含量の増加につれて浸出レベルが増大した。
【００５５】
また、可塑剤ＤＯＳに替えてポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）が用いられているか、又はカクテル処方にＰＶＣが添加されているタイプＮａ−Ｆ〜Ｎａ−Ｊの結果は、タイプＮａ−Ｊの様にＰＶＣを添加することにより、作製されたマイクロスフェアの応答特性が最も良く改善されることを示した。図２にタイプＮａ−Ｊすなわちシリカ・ベースのＮａ＋−センシング用マイクロスフェアにおいて、その色素が完全プロトン化体（１０−２Ｍ ＮａＯＨ）である場合と脱プロトン体（１０−２Ｍ ＨＣｌ）である場合の三次元応答スペクトルを示す。いずれもＰＶＣベースのマイクロスフェアのそれらと類似したピーク形状を示した。
【００５６】
これは、シリカ・テンプレートにドープされた後のクロモイオノフォアの基本的な機能性を確認するものであった。色素ＥＴＨ５２９４（クロモイオノフォアＩ）は、添加物含有シリカ・テンプレートにおいて６４５ｎｍ（脱プロトン化）及び６７５ｎｍ（プロトン化）の２ヶ所の蛍光発光極大を示すＨ＋選択性クロモイオノフォアである。これら２つのピークの強度比をとることにより、クロモイオノフォアのプロトン化度を、式（２）を用いて算出した。このレシオ測定には、光退色のリスクを低減しながら信頼性の高い信号を得、光源の不安定性やマイクロスフェアの寸法ばらつきの影響が少ないという利点がある。
【００５７】
図３Ａに、対応するＮａ＋応答曲線を、蛍光顕微鏡でキャラクタライズされた、これに付随するタイプＮａ−Ｊミクロ微粒子のｐＨ７．４における選択性と共に示す。プロットされた各データ点は平均実験値であり、誤差は５〜１０個体の測定から得られた標準偏差を示す。
【００５８】
理論曲線は、実験的な組成物を用いた式（２）より導出した。理論曲線用の適切なイオン交換定数(式（２）のＫｅｘ)と、共通の妨害イオンに対する種々のセンシング・システムの選択性係数を、図４の表にまとめ、音波微粒子散布装置を用いて作製されたシリカを含まないＰＶＣ−ＤＯＳ微粒子のデータと比較した。
【００５９】
本発明のマイクロスフェアは、Ｋ＋，Ｃａ２＋及びＭｇ２＋に対し、音波微粒子散布装置を用いて作製されたシリカを含まないＰＶＣ−ＤＯＳ微粒子とほぼ同様の選択性を有する。シリカ・テンプレートから作製された マイクロスフェアについては、その測定範囲はヒト唾液（刺激分泌，ｐＨ ７．０〜７．５、典型的なＮａ＋濃度は４．３〜２８ｍＭ）の直接測定に適する。シリカ・テンプレートを用いて作製されたマイクロスフェアも、１０倍希釈したヒト血漿（ｐＨ ７．４においてＮａ＋１３５〜１５０ｍＭ）の測定に用いることができる。
【００６０】
Ｃａ２＋選択性マイクロスフェア
イオノフォアＣａ（ＩＶ），ＥＴＨ５２９４，ＮａＴＦＰＢ及びＤＯＳを様々な組成で含むタイプＣａ−Ａ〜Ｃａ−Ｄには、適切なカルシウム応答が観測されなかった。ポリ(アクリル酸n-ブチル)を含むか、又はＰＶＣを添加した代替的なマトリクスを用いたタイプＣａ−Ｅ〜Ｃａ−Ｇでも、観測されるカルシウム応答はまだ満足できるものではなかった。
【００６１】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）にＡＵ−１をグラフト（２％，ｗ／ｗ）したタイプＣａ−Ｈ〜Ｃａ−Ｋのマイクロスフェアでは、得られたクロモフォアの機能濃度が信頼性の高い蛍光顕微鏡観察を行うには低すぎた。グラフトするイオノフォアの濃度をさらに高めると、マイクロスフェアが強く凝集する結果となった。
【００６２】
ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）ポリマー中ＡＵ−１濃度を５％（ｗ／ｗ）としたタイプＣａ−Ｌのマイクロスフェアでは，Ｃａ２＋に対する優れた選択性が観測された。図３ＢにｐＨ７．４にて観測されたタイプＣａ−ＬのＣａ２＋の応答を、式（２）により求めた理論的な較正曲線と共に示す。
【００６３】
生理学的サンプル中に普通にみられる妨害陽イオンに対するタイプＣａ−Ｌのマイクロスフェアについて観測された選択性は、オプトード薄膜について得られたデータと一致していた（図４参照）。その量の多さ故に重要な妨害因子であるＮａ＋に対する選択性は、３桁以上であった。
【００６４】
クロモイオノフォアのプロトン化度が半分（α＝０．５）の時、ｐＨ７．４における対応するＣａ２＋の活量は約１ｍＭであり、その測定範囲がｐＨ ７．４におけるヒト血漿中のＣａ２＋（１〜１．２ｍＭ）、又はｐＨ７．０〜７．５における刺激分泌されたヒト唾液中のＣａ２＋（０．８〜２．８ｍＭ）の直接決定に適することを示している。
【００６５】
添加物含有シリカゲル・テンプレートを用いて作製されたマイクロスフェアについて観測された典型的な平衡化時間は約１０分間であり、通常の可塑化ＰＶＣ微粒子を用いた場合よりはわずかに長かったが、ＭＭＡ−ＤＭＡベースの微粒子を用いた場合よりは短かった。グラフトＡＵ−１がドープされたカルシウム選択性光学センシング用マイクロスフェアは、自由溶解イオノフォアを用いたナトリウム選択性マイクロスフェアに比べてより長い平衡化時間（約２５分）を示した。
【００６６】
マイクロスフェアのフロー・サイトメトリー分析
フロー・サイトメトリーは、可塑化ＰＶＣを用いた蛍光マイクロスフェア光学センサのキャラクタリゼーションに適し、ここではクロモイオノフォアＥＴＨ５２９４の脱プロトン体の単一パラメータ・ヒストグラムを記録して蛍光変化を決定した。作製したマイクロスフェアのキャラクタリゼーションには、フロー・サイトメトリーと蛍光顕微鏡観察の両方を適用した。フロー・サイトメトリーは、蛍光顕微鏡観察の様に個々の微粒子の蛍光を空間的あるいは分光的に分離することはできないが、多数の微粒子の統計的挙動に関する情報を提供する場合がある。
【００６７】
６６０ｎｍバンドパス・フィルタ（±１５ｎｍ）を次段に控えた６５０ｎｍロングパス・フィルターを備えたＦＬ１チャネルから得られるヒストグラムでは、観測されたカウントをピーク・チャネル蛍光の対数値に対してプロットし、累積微粒子カウントからガウス型分布曲線を生成した。試料中のイオン濃度が増大するにしたがって、脱プロトン体のＥＴＨ５２９４に由来する蛍光強度が増大すると共に、そのイオン応答を反映してガウス曲線のピーク・シフトが生ずることがわかった。約１万個のマイクロスフェアによるヒストグラム全体の変動係数（ＣＶ）は７．１３〜２９．３３であった。この値は、音波散布法による通常のＰＶＣ微粒子で観測される値よりも大きく、元々のシリカゲル・テンプレートの寸法分布の限界に起因して寸法再現性が乏しいことが示唆された。
【００６８】
図５Ａ及び図５Ｂは、フロー・サイトメトリー測定で得られた較正曲線と、それに付随するナトリウム選択性（タイプＮａ−Ｈ）又はカルシウム選択性（タイプＣａ−Ｌ）マイクロスフェアの選択性データを示す。製造されたマイクロスフェアのオプトード挙動を仮定すると、プロトン化度（“１−α”）はＦＬ１チャネルの単一パラメータ・ヒストグラムにおける蛍光ピーク位置（Ｐ）を用い、次式（４）で表された。
【００６９】
図５Ａのナトリウム応答に関する理論曲線（式（２））についてはｌｏｇＫｅｘは−５．６であり、カルシウムについてはｌｏｇＫｅｘ＝−９．１であった。これらのデータは、各微粒子の蛍光顕微鏡観察で得られたデータと同様である（Ｎａ＋についてはｌｏｇＫｅｘ＝−５．０、Ｃａ２＋については−９．０、図４参照）。強力な妨害種について実験的に求めた選択係数（ｌｏｇｋＯｓｅｌＩ，Ｊ値）も図４に示す。測定範囲も、蛍光顕微鏡観察で得られた範囲と近かった。フロー・サイトメトリーと顕微鏡観察による応答性及び選択性のデータは概してよく互いに一致しており、どちらの手法も本発明のマイクロスフェアのキャラクタリゼーションには適していた。
【００７０】
シリカ・ベースのマイクロスフェアのファイバ型光学センサ・アレイへの応用
通常のＰＶＣ光学イオン・センシング用マイクロスフェアは、何万本ものセンサの応答について並列検討を可能とする光ファイバ束に好適に応用されている。光ファイバ束はかかる目的のプラットホームとして開発されてきており、その主な理由は、製造されたマイクロスフェア・センサに寸法に合わせて高度に均一な「ウェル」をエッチングで簡単に作れるからである。光ファイバ束のセンシング端を濃度の異なる被分析物の緩衝液に浸すと、クロモイオノフォアの蛍光スペクトルを光ファイバ束の他端から捉え、蛍光顕微鏡でキャラクタライズすることができる。直径２ｍｍの光ファイバ束上に、コア径約４．６μｍのファイバ・スレッド糸が約３５００本存在する。
【００７１】
異なるイオンに選択性を有する可塑化ＰＶＣマイクロスフェアが同じ光ファイバ束上にランダムに被着され、多重光学センシングがこれまでに達成されている。可塑化ＰＶＣマイクロスフェアの代替として、添加物含有シリカゲル微粒子を利用した本発明のイオン・センシング用マイクロスフェアを、光ファイバ束のエッチングされた遠位端に被着させることができる。
【００７２】
五角形光ファイバ束を、その全文をここに参照によって引用する例えばＪ．Ｒ．Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１８（２００３）５４１に説明されている公知の方法で研磨、洗浄、エッチング、超音波処理した。作製した例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアを脱イオン水と混合し、この懸濁混合物の１μＬを分取し、ファイバ束の末端のエッチング形成ウェルに入れた。マイクロスフェアをウェルに入れた後、脱イオン水を用いて余剰な微粒子を洗浄除去する。その後、光ファイバ束のエッチング端を１０−２Ｍ ＨＣｌに２０分間浸し、スペクトル応答を取得した。
【００７３】
図６に示すように、光ファイバ束上で微粒子による９０％の被覆率が蛍光モードにより観察された。製造したマイクロスフェアの直径（約３．５μｍ）は、 エッチング形成ウェル（約４．６μｍ）の寸法に適合している。図７は、光ファイバ束のエッチング形成ウェル内で１列に並んだ５個のＮａ＋選択性マイクロスフェア（例Ｎａ−Ｈ）の三次元蛍光スペクトルを観測結果を示す。これらの同様な形状と互いに近い強度値は、近接するマイクロスフェア同士の間で蛍光スペクトルの再現性が高いことを示している。
【００７４】
本発明のマイクロスフェアは、信頼性の高いイオン応答及び一般的な妨害イオンに対する選択性など、生理学的試料への多くの適用基準を満たしている。シリカ・テンプレートの存在はセンシングの化学現象に何ら影響を及ぼさないことが明らかとなり、マイクロスフェアの応答はバルク状態におけるオプトードの原理を反映している。検出された応答は、オプトード薄膜や音波散布ポリマー型マイクロスフェアにより得られる応答と匹敵する。
【００７５】
さらに、本発明のマイクロスフェアは通常のＰＶＣベースのマイクロスフェアと同様、硬化プロセスを必要としない。本発明のマイクロスフェアは、ドーピング後すぐに使用することができる場合がある。本発明のマイクロスフェアは密度が高く、遠心して乾燥物又は水溶液として容易に取り扱うことができる。
【００７６】
密封して暗所に保管すれば、本発明のマイクロスフェアは６ヶ月以上保存できる。マイクロスフェアはその後再懸濁させて、再懸濁組成物とすることができる。タイプＮａ−Ｈ及びＣａ−Ｌのミクロスフェアについて、ドーピングから６ヶ月後にフロー・サイトメトリー測定を再び行ったところ、得られた応答は最初の測定時の応答を再現していることがわかった。
【００７７】
以上、本発明を説明したが、本発明は上記の本文及び後記の特許請求の範囲で述べるその範囲と正当な解釈から逸脱することなく様々な変形や適応に委ねることができることは明らかである。
【００７８】
本発明を或る好ましい態様を参照しながら詳細に述べてきたが、他の態様も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神と範囲はここで述べた好ましい態様に限定されてはならない。特許請求の範囲、要約書及び図面を含む本明細書で開示された全ての特徴、及びいかなる方法又はプロセスの工程も、それらの特徴及び／又は工程が互いに相容れない場合を除き、どのように組み合わせてもよい。特許請求の範囲、要約書及び図面を含む本明細書で開示する各特徴は, 特に断らない限り、同一の、同等の、又は類似の目的を持つ代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、特に断らない限り、開示される個々の特徴は、総体的な一連の同等又は類似の特徴の一つに過ぎない。
【００７９】
また、或る請求項において、特定の機能を発揮するための「手段」、又は特定の機能を実施する「工程」と明示されていない要素については、いずれも米国特許法第１１２条(35U.S.C.§112)に規定される「手段」又は「工程」条項と解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】センシング成分をドープする前の、本発明において有用なシラン処理シリカ微粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】例Ｎａ−Ｊのセンシング成分をドープした後の図１Ａの微粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】例Ｎａ−Ｊの単一シリカ・ベースＮａ＋選択性マイクロスフェア型光学センサを（Ａ）１０−２Ｍ ＨＣｌ及び（Ｂ）１０−２Ｍ ＮａＯＨに接触させた場合の空間分解蛍光スペクトルの３次元プロットである。
【図３Ａ】蛍光電子顕微鏡写真からキャラクタライズされた、例Ｎａ−Ｊ のマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図３Ｂ】蛍光電子顕微鏡写真からキャラクタライズされた、例Ｃａ−ＬのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図４】ｐＨ７．４で正規化した種々のイオノフォアを含むオプトードの選択係数の実験値を示す表である。
【図５Ａ】分析用フロー・サイトメトリーからキャラクタライズされた、例Ｎａ−ＪのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図５Ｂ】分析用フロー・サイトメトリーからキャラクタライズされた、例Ｃａ−ＬのマイクロスフェアのｐＨ７．４における応答を示すプロットである。
【図６】例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアによる光ファイバ束のエッチング・ウェルの空間被覆性を観察した光学顕微鏡写真である。
【図７】光ファイバ束のエッチング・ウェル上における隣接する５個の例Ｎａ−ＨのＮａ＋選択性マイクロスフェアの蛍光スペクトルを示す三次元プロットである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的イオンを結合できるイオノフォアと、
前記イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとによってドープされた微粒子状シリカを含み、
前記検出可能な信号は液体試料中の目的イオンの濃度に関連する、液体試料中の目的イオンの濃度を決定するセンサ。
【請求項２】
前記インジケータはクロモイオノフォアである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記イオノフォアはｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレンテトラエチルエステルである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
自己増塑型ポリマーを含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記自己増塑型ポリマーはポリ(アクリル酸ｎ−ブチル)である、請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記イオノフォアは前記自己増塑型ポリマーにグラフトされたＡＵ−１である、請求項４に記載のセンサ。
【請求項７】
支持ポリマーと可塑剤とを含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項８】
前記支持ポリマーがＰＶＣであり、前記可塑剤がＤＯＳである、請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記粒子状シリカは球状微粒子である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記微粒子状シリカはシラン処理を施されている、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
親油性陽イオン交換体を含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記親油性陽イオン交換体はＮａＴＦＰＢである、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
ａ）複数の請求項１記載のセンサを液体試料に接触させ、イオノフォアを前記液体試料中の目的イオンに結合させる工程と、
ｂ）前記検出可能な信号を測定する工程とを含む、液体試料中の目的イオンを検出する方法。
【請求項１４】
前記検出可能な信号を測定する工程はフローサイトメーターに前記センサを通過させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）水を含むシリカゲル・マイクロスフェアを複数準備する工程と、
ｂ）センサの懸濁液を作成するために、液体試料中のイオンを結合できるイオノフォアと、前記イオノフォアによるイオン結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとを前記シリカゲル・マイクロスフェアにドープする工程と、
ｃ）実質的に全量の水を除去するために前記センサを乾燥する工程とを含む、センサに液体試料中のイオン濃度を決定させる方法。
【請求項１６】
乾燥した前記センサを再懸濁して再懸濁センサを調製する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）複数のファイバを有する光ファイバ束と、
ｂ）複数のミクロ微粒子とを含み、
各ファイバはウェルを備えた試料端を有し、
各ミクロ微粒子は液体試料中のイオンを結合できるイオノフォアと、前記イオノフォアによるイオン結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとによってドープされたシリカ基材を含み、
前記検出可能な信号は前記液体試料中のイオン濃度に関連し、
前記複数のミクロ微粒子は前記ファイバの前記ウェル内に配置される、液体試料中のイオン濃度を決定する装置。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法によって調製される、液体試料のイオン濃度を決定するセンサ。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法によって調製される、液体試料のイオン濃度を決定するセンサ。
【請求項１】
目的イオンを結合できるイオノフォアと、
前記イオノフォアによる目的イオンの結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとによってドープされた微粒子状シリカを含み、
前記検出可能な信号は液体試料中の目的イオンの濃度に関連する、液体試料中の目的イオンの濃度を決定するセンサ。
【請求項２】
前記インジケータはクロモイオノフォアである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記イオノフォアはｔｅｒｔ−ブチルカリックス［４］アレンテトラエチルエステルである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
自己増塑型ポリマーを含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記自己増塑型ポリマーはポリ(アクリル酸ｎ−ブチル)である、請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記イオノフォアは前記自己増塑型ポリマーにグラフトされたＡＵ−１である、請求項４に記載のセンサ。
【請求項７】
支持ポリマーと可塑剤とを含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項８】
前記支持ポリマーがＰＶＣであり、前記可塑剤がＤＯＳである、請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記粒子状シリカは球状微粒子である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記微粒子状シリカはシラン処理を施されている、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
親油性陽イオン交換体を含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記親油性陽イオン交換体はＮａＴＦＰＢである、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
ａ）複数の請求項１記載のセンサを液体試料に接触させ、イオノフォアを前記液体試料中の目的イオンに結合させる工程と、
ｂ）前記検出可能な信号を測定する工程とを含む、液体試料中の目的イオンを検出する方法。
【請求項１４】
前記検出可能な信号を測定する工程はフローサイトメーターに前記センサを通過させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）水を含むシリカゲル・マイクロスフェアを複数準備する工程と、
ｂ）センサの懸濁液を作成するために、液体試料中のイオンを結合できるイオノフォアと、前記イオノフォアによるイオン結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとを前記シリカゲル・マイクロスフェアにドープする工程と、
ｃ）実質的に全量の水を除去するために前記センサを乾燥する工程とを含む、センサに液体試料中のイオン濃度を決定させる方法。
【請求項１６】
乾燥した前記センサを再懸濁して再懸濁センサを調製する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）複数のファイバを有する光ファイバ束と、
ｂ）複数のミクロ微粒子とを含み、
各ファイバはウェルを備えた試料端を有し、
各ミクロ微粒子は液体試料中のイオンを結合できるイオノフォアと、前記イオノフォアによるイオン結合に応答して検出可能な信号を生成できるインジケータとによってドープされたシリカ基材を含み、
前記検出可能な信号は前記液体試料中のイオン濃度に関連し、
前記複数のミクロ微粒子は前記ファイバの前記ウェル内に配置される、液体試料中のイオン濃度を決定する装置。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法によって調製される、液体試料のイオン濃度を決定するセンサ。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法によって調製される、液体試料のイオン濃度を決定するセンサ。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５２９０１４（Ｐ２００８−５２９０１４Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３３７５（Ｐ２００７−５５３３７５）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３５４６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３９６０
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５９１０２８２５６）ベックマン コールター インコーポレイテッド (24)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】４３００Ｎ．Ｈａｒｂｏｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２８３４−３１００ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３５４６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３９６０
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５９１０２８２５６）ベックマン コールター インコーポレイテッド (24)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】４３００Ｎ．Ｈａｒｂｏｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２８３４−３１００ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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