温度応答性クロマトグラフィー担体、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法
【課題】表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィー担体を提供すること。
【解決手段】基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させること。
【解決手段】基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温度という外的信号で、医薬品、生体関連物質（タンパク質、ＤＮＡ、糖脂質等）及び細胞などの有用物を固体表面の相互作用を制御することで実施される液体クロマトグラフィ−用担体、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）は移動相液体と固定相の組合せが多種多様であり、試料に応じて種々選択できるので、近年、種々の物質の分離、精製に利用されている。しかし、従来使用されているクロマトグラフィ−では固定相の表面構造は変化させずに、主に移動相中に含まれている溶質と固定相表面との相互作用を移動相の溶媒を変化させることによって行われている。例えば、多くの分野で使用されているＨＰＬＣにおいては、固定相としてシリカゲル等の担体を用いた順相系のカラムではヘキサン、アセトニトリル、クロロホルムなどの有機溶媒を移動相として使用しており、また水系で分離されるシリカゲル誘導体を担体として用いた逆相系のカラムではメタノ−ル、アセトニトリルなどの有機溶媒が使用されている。
【０００３】
また、陰イオン交換体あるいは陽イオン交換体を固定相とするイオン交換クロマトグラフィ−では外的イオン濃度あるいは種類を変化させて物質分離を行っている。近年遺伝子工学等の急速な進歩により、生理活性ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどが医薬品を含む様々な分野に広範囲にその利用が期待され、その分離・精製は極めて重要な課題となっている。特に、生理活性物質をその活性を損なうことなく分離・精製する技術の必要性が増大している。
【０００４】
しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤は生理活性物質の活性を損なうと同時に夾雑物となるために、そのシステムの改良が期待されている。また、このような物質の環境汚染の回避という面からもこれらの物質を用いない分離・精製システムが必要となっている。
【０００５】
このような背景のもと、これまでに種々の検討がなされてきた。その中で特に特公平０６−１０４０６１号公報で示される技術はそれらの基盤技術にあたる。ここでは、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下又は下限臨界溶解温度以上で培養し、その後、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下にすることにより培養細胞を剥離する技術が記載されている。温度応答性ポリマーが生医学分野の細胞培養材料として初めて利用された例であるが、実は、細胞とは基材表面に付着する際、細胞は自ら接着性蛋白質を分泌しそれを介して付着する。従って、ここでの基材表面から細胞が剥離するという現象は、細胞が分泌した接着性蛋白質も基材表面から剥離することも含まれる。事実、この技術で得られた細胞を再播種したり、生体組織に移植したりするとき、この基材から剥離した細胞は基材や組織と良好に付着する。これは、剥離した細胞が培養時に分泌した接着性蛋白質をそのまま保持していることを意味している。すなわち、ここでの技術が本発明でいう温度変化で吸着した蛋白質を脱離させるという温度応答性クロマトグラフィー技術のコンセプトそのものである。
【０００６】
このような中、特開平０５−１３３９４７号公報ではクロマトグラフィー担体として通常使われるシリカゲルやポリマーゲルへ固定化する検討がなされた。しかしながら、実施例を見る限り、実際にその担体を使ったときの溶質の分離した結果（分離チャート）は示されておらず、この担体を用いてどのような物質を分離できるのか、また具体的な課題についても何ら示されておらず、詳細は不明であった。
【０００７】
一方、特開平０７−３１８５５１号公報では、シリカゲル表面に温度応答性ポリマーを固定化し、その担体を用いての実際に各種ステロイド類、さらにはリンパ球の分離例が示されている。実際にシリカゲル担体表面に固定化された温度応答性ポリマーの特性で各種ステロイド類、さらにはリンパ球を分離させられていることが明確に示されている。しかしながら、ここで例示されている温度応答性ポリマーの固定化法ではポリマーの嵩高さのため基材表面に０．７ｍｇ／ｍ２程度までしか固定化できず、クロマトグラフィー担体の機能が限られていた。基材表面に対する温度応答性ポリマーの固定化を詳細に設計し、従来技術を改善する革新的な技術が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性クロマトグラフィー担体を提供することを目的とする。また、本発明は、そのような担体の製造方法を提供することを目的とする。さらにその担体を利用した温度応答性クロマトグラフィー法も提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィー担体を利用すると従来技術より得たクロマトグラフィー担体に比べ、温度変化に対する変化量が著しく向上していることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規なクロマトグイラフィーシステムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体を提供する。
また、本発明は、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とした上記温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。
さらに、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体を用いた温度応答性クロマトグラフィー法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に記載される温度応答性クロマトグラフィー担体により、新規な分離システムが提案される。このシステムを利用すれば、広範囲のペプチド、蛋白質、細胞を分離させられるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、上記の要望を満足すべく種々検討した結果、固定相の表面構造を、例えば温度などの外的条件を変化させることによって、移動相を変化させることなく移動層に溶解、もしくは分散した特定物と固定相表面との相互作用を変化させることにより分離・精製、濃縮する技術を開発し、本発明を完成したもので、本発明の目的は、外的条件を変化させることによって固定相の表面特性を可逆的に変化させ、これによって単一の水系移動相によって分離、精製、濃縮可能なクロマトグラフィ−方法及び該クロマトグラフィ−に使用する固定相としての充填剤を提供するものである。
【００１３】
本発明の要旨は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の特性を温度によって変化させることが可能である充填剤を用いて特定物の分離を行うことを特徴とするクロマトグラフィ−方法である。また、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。さらに本発明ではそれを用いた温度応答性クロマトグラフィ−法を示す。即ち、本発明を用いることにより、外部温度を臨界温度以上にすることによってペプチドやタンパク質や細胞などの生体要素を分離することが可能となる。従って、この際、有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤等の薬剤を全く用いないので、これらが夾雑物質となることを防ぎ、また、タンパク質や細胞などの機能を維持したままでの分析と同じに分離にも利用することができる。
【００１４】
従来のクロマトグラフィー法では１種類の移動相で種々の化合物が混じっている試料特に極性の大きく異なる複数の試料を分離・分析する場合、分離が困難であり、分離に要する時間が大変長くなってしまう。そのため、このような試料を扱う際には有機溶媒の量や種類を時間と共に連続的に変化させる溶媒グラディエント法或いは段階的に変化させるステップグラディエント法により分離を行っているが、本発明による温度グラディエント法或いはステップグラディエント法では有機溶媒を使用する代わりに単一の移動相でカラム温度を連続的或いは段階的に変化させることにより同様の分離を達成することが可能であり、この方法を採用することによって、上述の夾雑物の混入を防止し、タンパク質や細胞などの機能を維持したままで分離できると共に所望の成分を温度をコントロ−ルすることによって短時間で分離が可能なのである。
【００１５】
以下に本発明を具体的に示す。本発明は基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されている温度応答性クロマトグラフィー担体である。そして、この高密度固定化により担体表面に固定化されたポリマーの特性が顕著に発現する。その理由は、現時点では明確になっていないが、おそらく固定化されたポリマーが担体表面に高密度に存在するため、近傍のポリマー鎖と緊密に関係した結果と考えられるが、この理由は本発明の技術を何ら制約するものではない。
【００１６】
本発明に用いる０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーは下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーが挙げられるが、それらのホモポリマー、コポリマー、或いは混合物のいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、分離される物質が生体物質であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられる親水性ポリマーとしては、ホモポリマー、コポリマーのいずれであっても良い。例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００１８】
本発明では、上記ポリマーが高密度に固定化されている。その固定化程度は、単位面積あたりの分子鎖数にして、０．０８分子鎖／ｎｍ２以上が良く、好ましくは０．１分子鎖／ｎｍ２以上が良く、さらに好ましくは０．１２分子鎖／ｎｍ２以上が良い。基材表面へのポリマーの固定化程度が０．０８分子鎖／ｎｍ２以下であると、従来法による基材表面へのポリマー固定化と同様に個々のポリマー鎖の特性が発現するだけで本発明の担体として好ましくない。固定化程度を示す数値の算出方法は特に限定されるものではないが、例えば同様な反応条件で基材表面に固定化されていないポリマーを作製し、そのポリマー鎖を分析することで求めた分子量とポリマーが固定化された担体の元素分析などから求めたポリマー固定化量から算出できる。
【００１９】
被覆されるポリマーの分子量は０〜８０℃の温度範囲内で水和力の変化が発現するに十分に大きな分子量であれば特に制約されるものではないが、ポリマー分子量は１０００以上が良く、好ましくは２０００以上、さらに好ましくは５０００以上のものが良い。分子量が１０００以下であると、分子量が低すぎるため、水和力の変化を発現できず好ましくない。また、分子量が５０００以上であると、今度はポリマーの分子量が高すぎるため、分子そのものが嵩高くなり温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。
【００２０】
また、本発明で示すところの基材上へのポリマーの固定化量は０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良く、好ましくは０．９〜８．０ｍｇ／ｍ２の範囲、さらに好ましくは１．０〜６．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良い。０．８ｍｇ／ｍ２以下であると温度応答性が認められなくなり、また１０．０ｍｇ／ｍ２より高い値であってもポリマーの嵩高さのため温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。固定化量の測定は常法に従えば良く、例えば元素分析、ＥＳＣＡを量などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。本発明で固定化されるポリマーの状態は特に限定されるものではなく、直鎖状のものでも良く、架橋状態のものでも良いが、温度に対する応答性を高めること、基材表面に高密度に固定化することを達成するには全社の直鎖状のものが好ましい。
【００２１】
本発明では上述したポリマーをシリカゲル担体に固定化したものである。その固定化方法としては、特に制約されるものではないが、例えば基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させる方法があげられる。その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、本発明のように基材がシリカやガラスの場合、例えば、１−トリクロロシリル−２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニル）エタン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、（３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル）ジメチルエトキシシランなどがあげられる。本発明では、この開始剤よりポリマー鎖を成長させる。その際の触媒としては特に限定されるものでないが、水和力が変わるポリマーとしてＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体を選んだ場合、ハロゲン化銅（ＣｕＩＸ）としてＣｕＩＣｌ、ＣｕＩＢｒ等があげられる。また、そのハロゲン化銅に対するリガンド錯体も特に限定されるものではないが、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、１，４，８，１１−テトラメチル １，４，８，１１−アザシクロテトラデカン（Ｍｅ４Ｃｙｃｌａｍ）、ビピリジン等があげられる。重合時に使用する溶媒も特に限定されるものではなく、例えばジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）等があげられる。その他の重合時の開始剤濃度、ハロゲン化銅濃度、リガンド錯体濃度、反応温度、反応時間等は特に限定されるものではなく、目的に応じて変更して良い。さらに反応液の状態は静置させても攪拌しても良いが、担体表面に均一に固定化することを考えると後者の方が好ましい。
【００２２】
本発明で使用する基材の形状は特に限定されるものではなく、例えば粒子状、平板状、管状のものがある。特に本発明の担体をクロマトグラフィー用の担体として用いる場合、担体としてはシリカゲルが良い。その際、細孔径は特に制約されるものではないが、５０〜５０００Åが良く、好ましく１００〜１０００Å、さらに好ましくは１２０〜５００Åである。５０Å以下であると分離できる溶質の分子量のかなり低いものだけが対象となり、また５０００Å以上であると担体表面積が少なくなり分離が著しく悪くなる。
【００２３】
本発明では、こうして得られた温度応答性クロマトグラフィー担体をカラムに充填し、通常の液体クロマトグラフィー装置に取り付けて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、本発明の分離はカラム内に充填された担体の温度に影響される。その際、担体への温度の負荷方法は特に制約されないが、例えば担体を充填したカラムの全部、もしくは一部を所定の温度にしたアルミブロック、水浴、空気層、ジャケットなどに装着すること等が挙げられる。
【００２４】
その分離方法は特に限定されるものではないが、一例として、担体が充填されたカラムを一定の温度下で溶質の分離を行う方法が挙げられる。本発明の担体は温度によってその表面の特性が変わる。分離したい物質によっては、適正な一定温度に設定するだけで分離する場合もある。
【００２５】
別の分離方法の一例としては、あらかじめ担体表面の特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行っても良い。この場合、温度変化だけで担体表面の特性が大きく変わるので、溶質によってはシグナルの出てくる時間（保持時間）に大きな差が生じることが期待される。本発明の場合、この担体表面の特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。
【００２６】
その温度変化をさせる際、温度変化は溶質を流し始めてから１回もしくはそれ以上の回数で断続的に変化させても良く、連続的に変化させても良い。またそれらの方法を組み合わせても良い。その際の温度変化は、手動で行っても良く、プログラムに従って自動的に温度制御できる装置を利用しても構わない。
【００２７】
或いは、別の分離方法の一例としては、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に溶質を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させるような、キャッチアンドリリース法に基づいて利用する方法が挙げられる。その際に吸着させる溶質量は担体に吸着しうる量を超えていても良く、超えていなくても良い。いずれにせよ一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させること吸着した溶質を遊離させる利用法である。
【００２８】
さらに、２種類以上の温度応答性液体クロマトグラフィー担体を同一カラム内に充填し担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行っても良い。この場合、例えば２種類の担体を利用した場合、３カ所の担体表面の異なる温度域が生じることとなり、この３カ所の温度を挟むようにして上述したような方法で温度変化させれば良いことになる。このことを２種類以上の温度応答性クロマトグラフィー担体を２本以上のカラム内に充填して行っても良い。
【００２９】
別の分離方法の一例としては、温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内の温度を入口端から出口端まで温度勾配をつけることで溶質の分離を行う方法が挙げられる。その段階的に温度を変える方法は特に限定されないが、例えばカラム入口端温度とカラム出口端温度を十分に監視しカラム全体を保温する方法、複数個の温度の異なるアルミブロックをつなげてカラムに接触させるような方法などが挙げられる。
【００３０】
本発明は以上に示してきたように移動層を固定したまま温度だけで溶質の分離を行えるものである。その際、移動相が１００％水系が好ましいが、本発明の場合、担体表面に固定化されているポリマーの特性によるため移動相の組成には特に制約されるはなく、例えば移動相に溶媒含まれていても、ｐＨを変えても、塩を含んでいても良い。その際、溶媒濃度を変え、溶媒グラジエント法を併用して本発明の担体を利用しても構わない。また、移動相が１００％有機溶媒でも構わない。
【００３１】
以上に示してきた本発明の温度応答性クロマトグラフィー担体、及びそれを用いたクロマトグラフィー法を用いれば、医薬品、及びその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質、細胞を分離することができる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成できる。
【実施例】
【００３２】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤の（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニルエチル）エチルトリクロロシランを導入したシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径３００Å）に、触媒としてＣｕＣｌ、Ｍｅ６ＴＲＥＮ存在下ＤＭＦ中でＡＴＲＰを行い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）ブラシをシリカ粒子表面に構築した。この際、ＡＴＲＰを１〜２０時間の間で実施し、反応時間によりＰＩＰＡＡｍグラフト量を制御した。これを充填したカラム（φ４．６×５０ｍｍ）をＨＰＬＣシステムに接続し、恒温槽でカラム温度を制御しながらステロイドの溶出実験をおこなった。カラムから溶出するステロイドは２５４ｎｍの吸収で検出した。
【００３４】
その結果、ＡＴＲＰ反応時間に伴いＰＩＰＡＡｍグラフト量は増加し、１．９９〜４．４０ｍｇ／ｍ２という従来法で得られた担体と比較して２０〜８０倍のＰＩＰＡＡｍグラフト量が得られた。得られた結果を図１に示す。次に、ＰＩＰＡＡｍグラフト量の異なる三種類のシリカビーズを用いて３０℃でステロイドの溶出実験を行った。グラフト量が大きくなるに従い、ステロイド保持時間は延長することが分かった。結果を図２に示す。これより、ＰＩＰＡＡｍグラフト量をたかめることで、ステロイドとの疎水性相互作用を大きくすることができることが分かった。さらに、ＡＴＲＰ反応時間が３時間の担体をカラムに充填し、１０℃から５０℃までの温度変化を与え、ステロイドの溶出実験を実施した。その結果、図３に示す通りに１０℃では重なっていた各ステロイドのピークが５０℃では分離した。これは、シリカビーズ上に構築されたＰＩＰＡＡｍブラシが高温になるに従い脱水和を起こし、ステロイドと疎水性相互作用をするためであると推測される。また、このカラムを用いて、インスリンチェーンＡとインスリンとの混合液に対し温度を変えながら分離を行った。得られた結果を図４に示す。低温では重なっていたピークが３０℃で分離し始め、４０℃でインスリンチェーンＡとインスリンの分離が達成できた。以上より、本発明のＰＩＰＡＡｍブラシ構造のシリカビーズは、少ない表面積で温度により大きな疎水性相互作用を制御できるクロマトグラフィー担体であると考えられる。
【比較例１】
【００３５】
（ａ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成法
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０．０ｇ、３−メルカプトプロピオン酸０．０９ｇ、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）０．２１ｇをそれぞれ重合管にいれ、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイルポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合管をメタノールに浸しＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を３回繰り返し行った。脱気が完全にできたら７０±１℃のインキュベーターで２０時間反応させた。次に、室温まで下がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエーテル中に滴下させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を沈殿させた。この沈殿物をＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルター（ポアサイズ３．０μｍ）で濾取し、シリカゲルを入れたデシケーター中で減圧乾燥をし、粗生成物１９．０ｇが得られた。これを乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶かした後、乾燥ジエチルエーテル中に滴下し、その沈殿物をテフロンフィルターで濾取した。これをデシケーター中で減圧乾燥をおこない精製ポリ（Ｎ−イソプルピルアクリルアミド）を得た。得られたポリマーはテトラヒドロフランを溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー及び酸−塩基測定によりポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が分子量１５，０００であり、分子末端に約１個のカルボキシル基を有することを確認した。
【００３６】
（ｂ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の活性エステル化
精製ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．３５ｇを乾燥酢酸エチル１００ｍｌ中に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２３ｇ及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６９ｇを加えてよく攪拌しながら０℃で２時間、室温（２０〜２５℃）で１２時間反応させた。次に副生成物であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をＰＴＦＥフィルターで濾取し、その濾液を減圧濃縮した後乾燥ジエチルエーテル中に滴下し沈殿したものをテフロンフィルターで濾取して、常温減圧で溶媒を留去したものについて、活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を得た。
【００３７】
（ｃ）活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とアミノ基担体との結合
活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かし、アミノプロピルシリカゲル６．０ｇを加え、１２時間室温で激しく振とうして反応させた後冷水５００ｍｌで洗浄し、再び活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かした溶液中に加え、１２時間室温で激しく振とうした。この操作を３回繰り返し、冷水５００ｍｌで洗浄した後、メタノール１００ｍｌで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）３．０ｇを６ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、これを表面に一級アミノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液１ｍｌ（直径１．０±０．０３μｍ、原液濃度：５×１０１１個／ｍｌ）を２４ｍｌの純水で希釈した液に１ｍｌづつ３０分間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた後、４℃以下で１６時間転倒混和した。反応終了後、遠心分離による回収と冷純化による洗浄を２回繰り返した後、ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）を用いて希釈した（６×１０９、６×１０１０／ｍｌ）。得られた担体のポリマー固定化量は０．７８ｍｇ／ｍ２であった。本発明の方法がポリマーの高密度固定化に有用であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが高密度に固定化された温度応答性クロマトグラフィー担体が得られる。この担体を利用すると温度変化に対する基材表面の変化量が著しく向上する。そのため分離操作が簡便となり、分離作業の効率性が良くなる。この分離対象としては、例えば広範囲のペプチド、蛋白質、細胞への利用が強く期待される。したがって、本発明は医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】 実施例１に示す反応時間を変えたときのＰＩＰＡＡｍグラフト量を示した図である。
【図２】 実施例１に示す担体の種類を変えながらステロイドの分離をした図である。
【図３】 実施例１に示す分離温度を変えながらステロイドの分離をした図である。
【図４】 実施例１に示す分離温度を変えながらインスリンチェーンＡとインスリンの分離をした図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は温度という外的信号で、医薬品、生体関連物質（タンパク質、ＤＮＡ、糖脂質等）及び細胞などの有用物を固体表面の相互作用を制御することで実施される液体クロマトグラフィ−用担体、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）は移動相液体と固定相の組合せが多種多様であり、試料に応じて種々選択できるので、近年、種々の物質の分離、精製に利用されている。しかし、従来使用されているクロマトグラフィ−では固定相の表面構造は変化させずに、主に移動相中に含まれている溶質と固定相表面との相互作用を移動相の溶媒を変化させることによって行われている。例えば、多くの分野で使用されているＨＰＬＣにおいては、固定相としてシリカゲル等の担体を用いた順相系のカラムではヘキサン、アセトニトリル、クロロホルムなどの有機溶媒を移動相として使用しており、また水系で分離されるシリカゲル誘導体を担体として用いた逆相系のカラムではメタノ−ル、アセトニトリルなどの有機溶媒が使用されている。
【０００３】
また、陰イオン交換体あるいは陽イオン交換体を固定相とするイオン交換クロマトグラフィ−では外的イオン濃度あるいは種類を変化させて物質分離を行っている。近年遺伝子工学等の急速な進歩により、生理活性ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどが医薬品を含む様々な分野に広範囲にその利用が期待され、その分離・精製は極めて重要な課題となっている。特に、生理活性物質をその活性を損なうことなく分離・精製する技術の必要性が増大している。
【０００４】
しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤は生理活性物質の活性を損なうと同時に夾雑物となるために、そのシステムの改良が期待されている。また、このような物質の環境汚染の回避という面からもこれらの物質を用いない分離・精製システムが必要となっている。
【０００５】
このような背景のもと、これまでに種々の検討がなされてきた。その中で特に特公平０６−１０４０６１号公報で示される技術はそれらの基盤技術にあたる。ここでは、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下又は下限臨界溶解温度以上で培養し、その後、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下にすることにより培養細胞を剥離する技術が記載されている。温度応答性ポリマーが生医学分野の細胞培養材料として初めて利用された例であるが、実は、細胞とは基材表面に付着する際、細胞は自ら接着性蛋白質を分泌しそれを介して付着する。従って、ここでの基材表面から細胞が剥離するという現象は、細胞が分泌した接着性蛋白質も基材表面から剥離することも含まれる。事実、この技術で得られた細胞を再播種したり、生体組織に移植したりするとき、この基材から剥離した細胞は基材や組織と良好に付着する。これは、剥離した細胞が培養時に分泌した接着性蛋白質をそのまま保持していることを意味している。すなわち、ここでの技術が本発明でいう温度変化で吸着した蛋白質を脱離させるという温度応答性クロマトグラフィー技術のコンセプトそのものである。
【０００６】
このような中、特開平０５−１３３９４７号公報ではクロマトグラフィー担体として通常使われるシリカゲルやポリマーゲルへ固定化する検討がなされた。しかしながら、実施例を見る限り、実際にその担体を使ったときの溶質の分離した結果（分離チャート）は示されておらず、この担体を用いてどのような物質を分離できるのか、また具体的な課題についても何ら示されておらず、詳細は不明であった。
【０００７】
一方、特開平０７−３１８５５１号公報では、シリカゲル表面に温度応答性ポリマーを固定化し、その担体を用いての実際に各種ステロイド類、さらにはリンパ球の分離例が示されている。実際にシリカゲル担体表面に固定化された温度応答性ポリマーの特性で各種ステロイド類、さらにはリンパ球を分離させられていることが明確に示されている。しかしながら、ここで例示されている温度応答性ポリマーの固定化法ではポリマーの嵩高さのため基材表面に０．７ｍｇ／ｍ２程度までしか固定化できず、クロマトグラフィー担体の機能が限られていた。基材表面に対する温度応答性ポリマーの固定化を詳細に設計し、従来技術を改善する革新的な技術が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性クロマトグラフィー担体を提供することを目的とする。また、本発明は、そのような担体の製造方法を提供することを目的とする。さらにその担体を利用した温度応答性クロマトグラフィー法も提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィー担体を利用すると従来技術より得たクロマトグラフィー担体に比べ、温度変化に対する変化量が著しく向上していることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規なクロマトグイラフィーシステムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体を提供する。
また、本発明は、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とした上記温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。
さらに、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体を用いた温度応答性クロマトグラフィー法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に記載される温度応答性クロマトグラフィー担体により、新規な分離システムが提案される。このシステムを利用すれば、広範囲のペプチド、蛋白質、細胞を分離させられるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、上記の要望を満足すべく種々検討した結果、固定相の表面構造を、例えば温度などの外的条件を変化させることによって、移動相を変化させることなく移動層に溶解、もしくは分散した特定物と固定相表面との相互作用を変化させることにより分離・精製、濃縮する技術を開発し、本発明を完成したもので、本発明の目的は、外的条件を変化させることによって固定相の表面特性を可逆的に変化させ、これによって単一の水系移動相によって分離、精製、濃縮可能なクロマトグラフィ−方法及び該クロマトグラフィ−に使用する固定相としての充填剤を提供するものである。
【００１３】
本発明の要旨は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の特性を温度によって変化させることが可能である充填剤を用いて特定物の分離を行うことを特徴とするクロマトグラフィ−方法である。また、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。さらに本発明ではそれを用いた温度応答性クロマトグラフィ−法を示す。即ち、本発明を用いることにより、外部温度を臨界温度以上にすることによってペプチドやタンパク質や細胞などの生体要素を分離することが可能となる。従って、この際、有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤等の薬剤を全く用いないので、これらが夾雑物質となることを防ぎ、また、タンパク質や細胞などの機能を維持したままでの分析と同じに分離にも利用することができる。
【００１４】
従来のクロマトグラフィー法では１種類の移動相で種々の化合物が混じっている試料特に極性の大きく異なる複数の試料を分離・分析する場合、分離が困難であり、分離に要する時間が大変長くなってしまう。そのため、このような試料を扱う際には有機溶媒の量や種類を時間と共に連続的に変化させる溶媒グラディエント法或いは段階的に変化させるステップグラディエント法により分離を行っているが、本発明による温度グラディエント法或いはステップグラディエント法では有機溶媒を使用する代わりに単一の移動相でカラム温度を連続的或いは段階的に変化させることにより同様の分離を達成することが可能であり、この方法を採用することによって、上述の夾雑物の混入を防止し、タンパク質や細胞などの機能を維持したままで分離できると共に所望の成分を温度をコントロ−ルすることによって短時間で分離が可能なのである。
【００１５】
以下に本発明を具体的に示す。本発明は基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されている温度応答性クロマトグラフィー担体である。そして、この高密度固定化により担体表面に固定化されたポリマーの特性が顕著に発現する。その理由は、現時点では明確になっていないが、おそらく固定化されたポリマーが担体表面に高密度に存在するため、近傍のポリマー鎖と緊密に関係した結果と考えられるが、この理由は本発明の技術を何ら制約するものではない。
【００１６】
本発明に用いる０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーは下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーが挙げられるが、それらのホモポリマー、コポリマー、或いは混合物のいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、分離される物質が生体物質であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられる親水性ポリマーとしては、ホモポリマー、コポリマーのいずれであっても良い。例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００１８】
本発明では、上記ポリマーが高密度に固定化されている。その固定化程度は、単位面積あたりの分子鎖数にして、０．０８分子鎖／ｎｍ２以上が良く、好ましくは０．１分子鎖／ｎｍ２以上が良く、さらに好ましくは０．１２分子鎖／ｎｍ２以上が良い。基材表面へのポリマーの固定化程度が０．０８分子鎖／ｎｍ２以下であると、従来法による基材表面へのポリマー固定化と同様に個々のポリマー鎖の特性が発現するだけで本発明の担体として好ましくない。固定化程度を示す数値の算出方法は特に限定されるものではないが、例えば同様な反応条件で基材表面に固定化されていないポリマーを作製し、そのポリマー鎖を分析することで求めた分子量とポリマーが固定化された担体の元素分析などから求めたポリマー固定化量から算出できる。
【００１９】
被覆されるポリマーの分子量は０〜８０℃の温度範囲内で水和力の変化が発現するに十分に大きな分子量であれば特に制約されるものではないが、ポリマー分子量は１０００以上が良く、好ましくは２０００以上、さらに好ましくは５０００以上のものが良い。分子量が１０００以下であると、分子量が低すぎるため、水和力の変化を発現できず好ましくない。また、分子量が５０００以上であると、今度はポリマーの分子量が高すぎるため、分子そのものが嵩高くなり温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。
【００２０】
また、本発明で示すところの基材上へのポリマーの固定化量は０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良く、好ましくは０．９〜８．０ｍｇ／ｍ２の範囲、さらに好ましくは１．０〜６．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良い。０．８ｍｇ／ｍ２以下であると温度応答性が認められなくなり、また１０．０ｍｇ／ｍ２より高い値であってもポリマーの嵩高さのため温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。固定化量の測定は常法に従えば良く、例えば元素分析、ＥＳＣＡを量などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。本発明で固定化されるポリマーの状態は特に限定されるものではなく、直鎖状のものでも良く、架橋状態のものでも良いが、温度に対する応答性を高めること、基材表面に高密度に固定化することを達成するには全社の直鎖状のものが好ましい。
【００２１】
本発明では上述したポリマーをシリカゲル担体に固定化したものである。その固定化方法としては、特に制約されるものではないが、例えば基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させる方法があげられる。その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、本発明のように基材がシリカやガラスの場合、例えば、１−トリクロロシリル−２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニル）エタン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、（３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル）ジメチルエトキシシランなどがあげられる。本発明では、この開始剤よりポリマー鎖を成長させる。その際の触媒としては特に限定されるものでないが、水和力が変わるポリマーとしてＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体を選んだ場合、ハロゲン化銅（ＣｕＩＸ）としてＣｕＩＣｌ、ＣｕＩＢｒ等があげられる。また、そのハロゲン化銅に対するリガンド錯体も特に限定されるものではないが、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、１，４，８，１１−テトラメチル １，４，８，１１−アザシクロテトラデカン（Ｍｅ４Ｃｙｃｌａｍ）、ビピリジン等があげられる。重合時に使用する溶媒も特に限定されるものではなく、例えばジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）等があげられる。その他の重合時の開始剤濃度、ハロゲン化銅濃度、リガンド錯体濃度、反応温度、反応時間等は特に限定されるものではなく、目的に応じて変更して良い。さらに反応液の状態は静置させても攪拌しても良いが、担体表面に均一に固定化することを考えると後者の方が好ましい。
【００２２】
本発明で使用する基材の形状は特に限定されるものではなく、例えば粒子状、平板状、管状のものがある。特に本発明の担体をクロマトグラフィー用の担体として用いる場合、担体としてはシリカゲルが良い。その際、細孔径は特に制約されるものではないが、５０〜５０００Åが良く、好ましく１００〜１０００Å、さらに好ましくは１２０〜５００Åである。５０Å以下であると分離できる溶質の分子量のかなり低いものだけが対象となり、また５０００Å以上であると担体表面積が少なくなり分離が著しく悪くなる。
【００２３】
本発明では、こうして得られた温度応答性クロマトグラフィー担体をカラムに充填し、通常の液体クロマトグラフィー装置に取り付けて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、本発明の分離はカラム内に充填された担体の温度に影響される。その際、担体への温度の負荷方法は特に制約されないが、例えば担体を充填したカラムの全部、もしくは一部を所定の温度にしたアルミブロック、水浴、空気層、ジャケットなどに装着すること等が挙げられる。
【００２４】
その分離方法は特に限定されるものではないが、一例として、担体が充填されたカラムを一定の温度下で溶質の分離を行う方法が挙げられる。本発明の担体は温度によってその表面の特性が変わる。分離したい物質によっては、適正な一定温度に設定するだけで分離する場合もある。
【００２５】
別の分離方法の一例としては、あらかじめ担体表面の特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行っても良い。この場合、温度変化だけで担体表面の特性が大きく変わるので、溶質によってはシグナルの出てくる時間（保持時間）に大きな差が生じることが期待される。本発明の場合、この担体表面の特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。
【００２６】
その温度変化をさせる際、温度変化は溶質を流し始めてから１回もしくはそれ以上の回数で断続的に変化させても良く、連続的に変化させても良い。またそれらの方法を組み合わせても良い。その際の温度変化は、手動で行っても良く、プログラムに従って自動的に温度制御できる装置を利用しても構わない。
【００２７】
或いは、別の分離方法の一例としては、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に溶質を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させるような、キャッチアンドリリース法に基づいて利用する方法が挙げられる。その際に吸着させる溶質量は担体に吸着しうる量を超えていても良く、超えていなくても良い。いずれにせよ一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させること吸着した溶質を遊離させる利用法である。
【００２８】
さらに、２種類以上の温度応答性液体クロマトグラフィー担体を同一カラム内に充填し担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行っても良い。この場合、例えば２種類の担体を利用した場合、３カ所の担体表面の異なる温度域が生じることとなり、この３カ所の温度を挟むようにして上述したような方法で温度変化させれば良いことになる。このことを２種類以上の温度応答性クロマトグラフィー担体を２本以上のカラム内に充填して行っても良い。
【００２９】
別の分離方法の一例としては、温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内の温度を入口端から出口端まで温度勾配をつけることで溶質の分離を行う方法が挙げられる。その段階的に温度を変える方法は特に限定されないが、例えばカラム入口端温度とカラム出口端温度を十分に監視しカラム全体を保温する方法、複数個の温度の異なるアルミブロックをつなげてカラムに接触させるような方法などが挙げられる。
【００３０】
本発明は以上に示してきたように移動層を固定したまま温度だけで溶質の分離を行えるものである。その際、移動相が１００％水系が好ましいが、本発明の場合、担体表面に固定化されているポリマーの特性によるため移動相の組成には特に制約されるはなく、例えば移動相に溶媒含まれていても、ｐＨを変えても、塩を含んでいても良い。その際、溶媒濃度を変え、溶媒グラジエント法を併用して本発明の担体を利用しても構わない。また、移動相が１００％有機溶媒でも構わない。
【００３１】
以上に示してきた本発明の温度応答性クロマトグラフィー担体、及びそれを用いたクロマトグラフィー法を用いれば、医薬品、及びその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質、細胞を分離することができる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成できる。
【実施例】
【００３２】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤の（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニルエチル）エチルトリクロロシランを導入したシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径３００Å）に、触媒としてＣｕＣｌ、Ｍｅ６ＴＲＥＮ存在下ＤＭＦ中でＡＴＲＰを行い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）ブラシをシリカ粒子表面に構築した。この際、ＡＴＲＰを１〜２０時間の間で実施し、反応時間によりＰＩＰＡＡｍグラフト量を制御した。これを充填したカラム（φ４．６×５０ｍｍ）をＨＰＬＣシステムに接続し、恒温槽でカラム温度を制御しながらステロイドの溶出実験をおこなった。カラムから溶出するステロイドは２５４ｎｍの吸収で検出した。
【００３４】
その結果、ＡＴＲＰ反応時間に伴いＰＩＰＡＡｍグラフト量は増加し、１．９９〜４．４０ｍｇ／ｍ２という従来法で得られた担体と比較して２０〜８０倍のＰＩＰＡＡｍグラフト量が得られた。得られた結果を図１に示す。次に、ＰＩＰＡＡｍグラフト量の異なる三種類のシリカビーズを用いて３０℃でステロイドの溶出実験を行った。グラフト量が大きくなるに従い、ステロイド保持時間は延長することが分かった。結果を図２に示す。これより、ＰＩＰＡＡｍグラフト量をたかめることで、ステロイドとの疎水性相互作用を大きくすることができることが分かった。さらに、ＡＴＲＰ反応時間が３時間の担体をカラムに充填し、１０℃から５０℃までの温度変化を与え、ステロイドの溶出実験を実施した。その結果、図３に示す通りに１０℃では重なっていた各ステロイドのピークが５０℃では分離した。これは、シリカビーズ上に構築されたＰＩＰＡＡｍブラシが高温になるに従い脱水和を起こし、ステロイドと疎水性相互作用をするためであると推測される。また、このカラムを用いて、インスリンチェーンＡとインスリンとの混合液に対し温度を変えながら分離を行った。得られた結果を図４に示す。低温では重なっていたピークが３０℃で分離し始め、４０℃でインスリンチェーンＡとインスリンの分離が達成できた。以上より、本発明のＰＩＰＡＡｍブラシ構造のシリカビーズは、少ない表面積で温度により大きな疎水性相互作用を制御できるクロマトグラフィー担体であると考えられる。
【比較例１】
【００３５】
（ａ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成法
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０．０ｇ、３−メルカプトプロピオン酸０．０９ｇ、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）０．２１ｇをそれぞれ重合管にいれ、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイルポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合管をメタノールに浸しＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を３回繰り返し行った。脱気が完全にできたら７０±１℃のインキュベーターで２０時間反応させた。次に、室温まで下がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエーテル中に滴下させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を沈殿させた。この沈殿物をＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルター（ポアサイズ３．０μｍ）で濾取し、シリカゲルを入れたデシケーター中で減圧乾燥をし、粗生成物１９．０ｇが得られた。これを乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶かした後、乾燥ジエチルエーテル中に滴下し、その沈殿物をテフロンフィルターで濾取した。これをデシケーター中で減圧乾燥をおこない精製ポリ（Ｎ−イソプルピルアクリルアミド）を得た。得られたポリマーはテトラヒドロフランを溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー及び酸−塩基測定によりポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が分子量１５，０００であり、分子末端に約１個のカルボキシル基を有することを確認した。
【００３６】
（ｂ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の活性エステル化
精製ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．３５ｇを乾燥酢酸エチル１００ｍｌ中に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２３ｇ及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６９ｇを加えてよく攪拌しながら０℃で２時間、室温（２０〜２５℃）で１２時間反応させた。次に副生成物であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をＰＴＦＥフィルターで濾取し、その濾液を減圧濃縮した後乾燥ジエチルエーテル中に滴下し沈殿したものをテフロンフィルターで濾取して、常温減圧で溶媒を留去したものについて、活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を得た。
【００３７】
（ｃ）活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とアミノ基担体との結合
活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かし、アミノプロピルシリカゲル６．０ｇを加え、１２時間室温で激しく振とうして反応させた後冷水５００ｍｌで洗浄し、再び活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かした溶液中に加え、１２時間室温で激しく振とうした。この操作を３回繰り返し、冷水５００ｍｌで洗浄した後、メタノール１００ｍｌで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）３．０ｇを６ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、これを表面に一級アミノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液１ｍｌ（直径１．０±０．０３μｍ、原液濃度：５×１０１１個／ｍｌ）を２４ｍｌの純水で希釈した液に１ｍｌづつ３０分間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた後、４℃以下で１６時間転倒混和した。反応終了後、遠心分離による回収と冷純化による洗浄を２回繰り返した後、ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）を用いて希釈した（６×１０９、６×１０１０／ｍｌ）。得られた担体のポリマー固定化量は０．７８ｍｇ／ｍ２であった。本発明の方法がポリマーの高密度固定化に有用であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが高密度に固定化された温度応答性クロマトグラフィー担体が得られる。この担体を利用すると温度変化に対する基材表面の変化量が著しく向上する。そのため分離操作が簡便となり、分離作業の効率性が良くなる。この分離対象としては、例えば広範囲のペプチド、蛋白質、細胞への利用が強く期待される。したがって、本発明は医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】 実施例１に示す反応時間を変えたときのＰＩＰＡＡｍグラフト量を示した図である。
【図２】 実施例１に示す担体の種類を変えながらステロイドの分離をした図である。
【図３】 実施例１に示す分離温度を変えながらステロイドの分離をした図である。
【図４】 実施例１に示す分離温度を変えながらインスリンチェーンＡとインスリンの分離をした図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
基材表面のポリマー固定化量が０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２である、請求項１記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項３】
ポリマー分子鎖が非架橋である、請求項１、２いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタアクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物のいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項１〜３いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１〜４いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
ポリマーが、ポリマー分子鎖内に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する性質が失われない範囲で親水性分子、疎水性分子、イオン性分子が含まれた共重合物である、請求項４、５記載いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
基材形状が粒子状、平板状、管状である、請求項１〜６いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項９】
原子移動ラジカル重合開始剤が、２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニルエチル）エチルトリクロロシランである、請求項８記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１０】
原子移動ラジカル重合開始剤が０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする請求項８、９いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１１】
重合触媒が、ハロゲン化銅として塩化銅、リガンド錯体としてトリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミンである、請求項８〜１０いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１２】
基材表面のポリマー固定化量が０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２となる、請求項８〜１１いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１３】
ポリマー分子鎖が非架橋である、請求項８〜１２いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１４】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタアクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物のいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項８〜１３いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１５】
基材がシリカゲル粒子、ガラス板、ガラス粒子である、請求項８〜１４いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら特定物を分離、又は濃縮することを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１７】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体に特定物を吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した特定物を遊離させることを特徴とする請求項１６記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１８】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体２種以上を同一カラム内に充填し担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら特定物の分離を行うことを特徴とする請求項１６、１７いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１９】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内は入口端から出口端まで温度勾配をつけることで特定物の分離を行うことを特徴とする請求項１６〜１８いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項２０】
移動相が水系である、請求項１６〜１９いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項２１】
特定物が医薬品、もしくはその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質、細胞である、請求項１６〜２０記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１】
基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
基材表面のポリマー固定化量が０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２である、請求項１記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項３】
ポリマー分子鎖が非架橋である、請求項１、２いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタアクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物のいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項１〜３いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１〜４いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
ポリマーが、ポリマー分子鎖内に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する性質が失われない範囲で親水性分子、疎水性分子、イオン性分子が含まれた共重合物である、請求項４、５記載いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
基材形状が粒子状、平板状、管状である、請求項１〜６いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項９】
原子移動ラジカル重合開始剤が、２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニルエチル）エチルトリクロロシランである、請求項８記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１０】
原子移動ラジカル重合開始剤が０．０８分子鎖／ｎｍ２以上の割合で高密度に固定化されていることを特徴とする請求項８、９いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１１】
重合触媒が、ハロゲン化銅として塩化銅、リガンド錯体としてトリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミンである、請求項８〜１０いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１２】
基材表面のポリマー固定化量が０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２となる、請求項８〜１１いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１３】
ポリマー分子鎖が非架橋である、請求項８〜１２いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１４】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタアクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物のいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項８〜１３いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１５】
基材がシリカゲル粒子、ガラス板、ガラス粒子である、請求項８〜１４いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら特定物を分離、又は濃縮することを特徴とする温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１７】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体に特定物を吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した特定物を遊離させることを特徴とする請求項１６記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１８】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体２種以上を同一カラム内に充填し担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら特定物の分離を行うことを特徴とする請求項１６、１７いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項１９】
請求項１〜７記載の温度応答性クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内は入口端から出口端まで温度勾配をつけることで特定物の分離を行うことを特徴とする請求項１６〜１８いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項２０】
移動相が水系である、請求項１６〜１９いずれか１項記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【請求項２１】
特定物が医薬品、もしくはその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質、細胞である、請求項１６〜２０記載の温度応答性クロマトグラフィー法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−６９１９３（Ｐ２００７−６９１９３Ａ）
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９１７１９（Ｐ２００５−２９１７１９）
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９３０６４６３０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９３０６４６３０）
【Ｆターム（参考）】
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