測定精度を向上させたバイオセンサ
【課題】高い精度で測定ができるバイオセンサを提供することを課題とする。
【解決手段】絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサ。
【解決手段】絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量できるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の特定成分を簡易に定量する方法としては、様々なバイオセンサが提案されているが、代表的なものとしては、絶縁性の基板上に少なくとも作用極および対極からなる電極系を形成し、この電極系上に、電極系に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体を含む反応層を形成したものである。
【０００３】
このようにして作製されたバイオセンサの反応層に、基質を含む試料液を供給すると、反応層が試料液によって溶解することにより、酵素と基質が反応し、これに伴って電子伝達体が還元され、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を定量することができる（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
例えば、グルコースを試料とする場合、以下の方法が知られている。グルコースは、下記式（１）で示されるように、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いることにより定量することができる。すなわち、下記式において、還元型電子伝達体の増加量を電気化学的に測定することにより、グルコースを定量することが可能である。
【０００５】
【化１】
【０００６】
しかしながら、この方法は、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。溶存酸素の影響を受けない方法としては、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＧＤＨ）もしくはＮＡＤＰ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）を用いた下記式（２）に示される方法がある。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかしながら、この反応は、高価なＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰを添加する必要がある。溶存酸素の影響を受けず、且つ、高価な補酵素を添加しなくてもよい方法としては、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）もしくはＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を用いた下記式（３）に示される方法がある。
【０００９】
【化３】
【００１０】
上記反応は、溶存酸素の影響を受けず、且つ、高価な補酵素を添加する必要がないというメリットがある。
【００１１】
また、グリセロールを試料とする場合、以下の方法が知られている。グリセロールは、下記式（４）および式（５）で示されるように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）およびグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）を用いることにより定量することができる。すなわち、下記式において、還元型電子伝達体の増加量を電気化学的に測定することにより、グリセロールを定量することが可能である。
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５】
【００１４】
しかしながら、この方法は高価な２種類の酵素を用いる必要があり、且つ、反応が煩雑であるという問題がある。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【００１５】
溶存酸素の影響を受けず、１種類の酵素を用いる方法としては、下記式（６）で示すようにＮＡＤ＋依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＧＬＤＨ）を用いる方法が知られている。
【００１６】
【化６】
【００１７】
しかしながら、この反応は、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼと同様、高価な
ＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【００１８】
より安価で簡便にグリセロールを定量する方法としては、補欠分子族としてピロロキノ
リンキノンを含むポリオールデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＰＤＨ）を用いる方法がある。
この方法は、下記式（７）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反
応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどの
メリットがある。
【００１９】
【化７】
【００２０】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含む酸化還元酵素（以下「ＰＱＱ依存性酸化還元酵素」とも称する）の特徴としては、親水性のものが一部知られているが、一般的には膜結合型酵素であるため、疎水性が強く、水に対する溶解性が低いことが知られている。そのため、該酵素をセンサに使用する場合、反応層に界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤は、その他、試料の入りをよくするためや、電極表面に気泡を生じさせないためなどの様々な理由から、バイオセンサの構成成分として加えられることがある。
【００２１】
上記疎水性の膜結合型酸化還元酵素である、例えば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含む酸化還元酵素は、使用する際精製する必要があるが、量産化におけるコスト低減の観点から、極力少ないステップで精製をすることが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
しかしながら、少ない精製ステップで補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）含む酸化還元酵素を精製する場合、夾雑物を含んだ状態で精製されてしまう虞があり、さらに、その夾雑物が測定系に影響を及ぼす虞がある。
【００２４】
特に、注意しなければならないのは、他の酸化還元酵素が混入することである。
【００２５】
例えば、ＧＬＤＨ（グリセロールデヒドロゲナーゼ）を精製する際に、同じ酸化還元酵素であるＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）が混入することである。ＧＤＨも、ＧＬＤＨと同様に酸化還元メディエーター（Ｍｅｄ）を利用した電子授受反応を行うため、ＧＤＨが混入すると、血液中のグルコースと反応してしまい、ＧＬＤＨを用いたグリセロールの測定値にグルコース濃度の値が反映されてしまう。例えば、グルコース濃度が高いサンプルは、実際よりも高いグリセロールの測定値になるという現象になる。これは測定値のばらつきを生み、しいては、精度の高い測定ができないという問題になる。
【００２６】
よって、本発明は、高い精度で測定ができるバイオセンサを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ホウ酸またはその誘導体をバイオセンサの反応層にあらかじめ添加しておくことによって、上記問題が解決できることを知得した。
【００２８】
すなわち、本発明の課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサを提供することによって、解決される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、高い精度で測定ができるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサの断面図である。
【図３】本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図４】図３のバイオセンサの断面図である。
【図５】本発明の第３のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図６】図５のバイオセンサの断面図である。
【図７】実施例および比較例のバイオセンサを用いて、全血中の中性脂肪濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図８】実施例および比較例のバイオセンサを用いて、全血中の中性脂肪濃度依存性を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の
寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００３２】
１．本発明の第１
本発明の第１は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサである。
【００３３】
２．本発明の第２
本発明の第２は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有する、バイオセンサである。
【００３４】
３．本発明の第３
本発明の第３は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有する、バイオセンサである。
【００３５】
図１は、本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。
【００３６】
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサを電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
【００３７】
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００３８】
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、少なくとも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素（以下、「本発明の酸化還元酵素」とも称する）と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
【００３９】
第１のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
【００４０】
続いて、図３は、本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。
【００４１】
図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１のバイオセンサと同様であるが、第１のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含むことが好ましい。換言すれば、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれないことが好ましい。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、本発明の酸化還元酵素は含まれず、前記第二の反応層９に、本発明の酸化還元酵素が含まれば、電子伝達体が含まれないことが好ましい。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
【００４２】
第２のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
【００４３】
図５は、本発明の第３のバイオセンサを示す分解斜視図である。図６は、図５のバイオセンサの断面図である。
【００４４】
図５、６に示すとおり、基本的な構造は、図３、４で示す第２のバイオセンサと同様であるが、第２のバイオセンサとの相違点は、第二の反応層が、酸化分解酵素を含む反応層１１と脂質分解酵素を含む反応層１２との２つを有する点である。
【００４５】
上記第２のバイオセンサと同様に、図５、６に示す第３のバイオセンサにおいても、酸化還元酵素および電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれないことが好ましい。具体的には、前記電子伝達体は、第一の反応層８および脂質分解酵素を含む反応層１２の少なくとも一方に含まれることが好ましい。
【００４６】
以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、本発明の第１のバイオセンサの構造と、本発明の第２のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８、第二の反応層９）であるか、である。また、本発明の第２のバイオセンサの構造と、本発明の第３のバイオセンサの構造との相違点は、第二の反応層９が１つだけであるか、第二の反応層９が酸化分解酵素を含む反応層１１と脂質分解酵素を含む反応層１２との２つを有するか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、本発明の第２のバイオセンサにも、本発明の第３のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料が「０．１〜２０μｌ（好ましくは１μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。
【００４７】
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００４８】
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。
【００４９】
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４とを含む。
【００５０】
本発明の電極は、試料（測定対象物）と、本発明の酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。
【００５１】
本発明においては、作用極２および対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
【００５２】
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
【００５３】
＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
【００５４】
＜試料供給部＞
上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、電子伝達体と、本発明の酸化還元酵素と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層１０を有する。
【００５５】
本発明の第１のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。
【００５６】
反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、特に好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００５７】
一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有する。そして、前記第一の反応層８が、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含むことが好ましい。
【００５８】
本発明の第２のバイオセンサのような反応層を２つにする形態においては、本発明の酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。
【００５９】
また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層および第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と第二の反応層９との離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７〜１．２５ｍｍ、特に好ましくは０．０９〜１ｍｍである。上記範囲であれば、保存中に本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体とがほとんど接触せず、また、毛細管現象が起こりやすく、試料が反応層に吸引されやすい。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
【００６０】
さらに、本発明の第３のバイオセンサは、第二の反応層９が、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の２つを有する。該酸化還元酵素を含む反応層１１および該脂質分解酵素を含む反応層１２のそれぞれの厚さにも特に制限はなく、通常の反応層の厚みとなるように適宜選択できる。酸化還元酵素を含む反応層１１の厚みは、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍである。また、脂質分解酵素を含む反応層１２の厚みは、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍである。さらに、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の合計厚みは、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、特に好ましくは０．１〜１６μｍである。ここで、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００６１】
（酸化還元酵素）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１）は、補欠分子族（「補酵素」とも称する）としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む。特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素が好ましい。なお、本発明においては、本発明の酸化還元酵素を単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
【００６２】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、試料の種類に依存するが、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなどが挙げられる。補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。
【００６３】
中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましい（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）。
【００６４】
上記の本発明の酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８−２２０３６７号公報参照）。
【００６５】
具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・アルビダス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＮＢＲＣ ３２５０、３２７３、１０３５０９、１０３５１０、１０３５１６、１０３５２０、１０３５２１、１０３５２４；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６７、３２７４、３２７５、３２７６；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５１、３２５３、３２６２、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２８５、３２８６、３２９０、１６６６９、１０３４１３、１０３４２１、１０３４２７、１０３４２８、１０３４２９、１０３４３７、１０３４３８、１０３４３９、１０３４４０、１０３４４１、１０３４４６、１０３４５３、１０３４５４、１０３４５６、１０３４５７、１０３４５８、１０３４５９、１０３４６１、１０３４６２、１０３４６５、１０３４６６、１０３４６７、１０３４６８、１０３４６９、１０３４７０、１０３４７１、１０３４７２、１０３４７３、１０３４７４、１０３４７５、１０３４７６、１０３４７７、１０３４８２、１０３４８７、１０３４８８、１０３４９０、１０３４９１、１０３４９３、１０３４９４、１０３４９９、１０３５００、１０３５０１、１０３５０２、１０３５０３、１０３５０４、１０３５０６、１０３５０７、１０３５１５、１０３５１７、１０３５１８、１０３５１９、１０３５２３；グルコノバクター・ジャポニカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６０、３２６３、３２６９、３２７１、３２７２；グルコノバクター・カンチャナブリエンシス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋａｎｃｈａｎａｂｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １０３５８７，１０３５８８；グルコノバクター・コンドニ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｎｄｏｎｉｉ）ＮＢＲＣ ３２６６；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１８９、３２４４、３２８７、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、１２５２８、１４８１９；グルコノバクター・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ）ＮＢＲＣ ３９９０；グルコノバクター・エスピー（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）ＮＢＲＣ ３２５９、１０３５０８；グルコノバクター・スファエリカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ １２４６７；グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３１７２、３２５４、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８９、３２９１、１００６００、１００６０１等が好ましく用いられる。
【００６６】
上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は好ましくは２０℃〜５０℃、より好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００６８】
次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００６９】
なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００７０】
本発明の酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、好ましくは０．０１〜１００Ｕ、より好ましくは０．０５〜５０Ｕ、特に好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。また、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含む酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７１】
（脂質分解酵素）
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、脂質を構成するエステル結合を加水分解する脂質分解酵素をさらに含むことが好ましい。かような脂質分解酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。
【００７２】
ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、より好ましくは１〜５００Ｕ、特に好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、国際公開第２００６／１０４０７７号パンフレットに記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７３】
前記酸化還元酵素と前記脂質分解酵素とは、一つの反応層中に共存してもよいし、別の層に分かれて存在してもよいが、別の層に分かれて存在することが好ましい。よって、前記反応層が、酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有することが好ましい。すなわち、本発明の第３のバイオセンサのような反応層の構成がより好ましい。かような形態であれば、脂質分解酵素による加水分解反応が効率よく進行する。
【００７４】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明の酸化還元酵素は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に本発明の酸化還元酵素を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含有させる。それは、本発明においては、本発明の酸化還元酵素が電極に固着することが有意に防止されているからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。
【００７５】
同様に、電極近傍での酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなるという観点から、本発明の第３のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素は、電極と接する酸化還元酵素を含む反応層１１に含有させることが好ましい。
【００７６】
（電子伝達体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。
【００７７】
電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。
【００７８】
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００７９】
電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物などのルテニウム錯体などを好適に使用することができる。
【００８０】
電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、好ましくは１〜２０００μｇ、より好ましくは５〜１０００μｇ、特に好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００８１】
本発明の第２のバイオセンサにおいては、電子伝達体は、本発明の酸化還元酵素と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、上記のように、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含ませることが好ましいからである。また、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれることが好ましい。
【００８２】
上記と同様の理由で、本発明の第３のバイオセンサにおいては、前記電子伝達体は、酸化分解酵素を含まずかつ電極と接しない脂質分解酵素を含む反応層１２に含まれることが好ましい。
【００８３】
（界面活性剤）
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が、界面活性剤を有する。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の溶解が促進されうる。
【００８４】
本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する本発明の酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００８５】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００８６】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製））などが好ましい。中でも、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製））が好ましい。
【００８７】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含有されると、試料溶液を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシドよりもアルキルチオグリコシドが非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
【００８８】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標））などが挙げられる。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
【００８９】
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９０】
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９１】
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９２】
上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。
【００９３】
また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００９４】
より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、本発明の酸化還元酵素が含有されることが好ましいが、例えば、本発明の酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることがより好ましい。この場合にもまた、広がりや濡れ性の観点で考えると、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００９５】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、および脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８または酸化分解酵素を含む反応層１１、より好ましくは第一の反応層８および酸化分解酵素を含む反応層１１が界面活性剤を含む。これにより、酸化還元酵素や電子伝達体の溶解が促進されうる。また、上記３つの反応層の２以上の反応層に界面活性剤を存在させる場合には、これらの反応層に含める各界面活性剤の種類や配合量は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００９６】
より具体的には、まず、上記の通り、本発明の第３のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素を含む反応層１１に酸化還元酵素が含有されるが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも酸化還元酵素を含む反応層１１には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。この際、毛細管現象により試料供給部に血液をより吸入しやすくするという観点から、第１の反応層８にも界面活性剤が含まれることが好ましい。
【００９７】
さらに、上記述べた通り、本発明の第２のバイオセンサでは、第１の反応層８は電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）を含有するが、この際、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第１の反応層８にも界面活性剤が含有されることがより好ましい。この場合にもまた、広がりや濡れ性の観点で考えると、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００９８】
界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。
【００９９】
界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇ、より好ましくは０．０５〜５０μｇ、特に好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。
【０１００】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇ、より好ましくは０．０５〜５０μｇ、特に好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１０１】
（ホウ酸またはその誘導体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、ホウ酸またはその誘導体を含む。これにより、測定値に対する血液中のグルコースの影響をほとんど無くすかまたはまったく無くすことができ、どのような血糖値であっても、所定の測定値が得られ、測定値のばらつきがほとんど生じない。
【０１０２】
測定値に対する血液中のグルコースの影響を低減できるメカニズムについては、詳細なことは不明であるが、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がホウ酸またはその誘導体を含むことによって、ホウ酸またはその誘導体と血中のグルコースとが結合し、ＧＬＤＨの精製中に混入するＧＤＨとグルコースとの反応を阻害するためであると考えられる。もちろん、本発明の効果が発現するメカニズムは、これに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明で用いられるホウ酸またはその誘導体の具体的な例としては、例えば、オルトホウ酸、メタホウ酸、次ホウ酸、ホウ酸カルシウム、ホウ酸コバルト、ホウ酸亜鉛（四ホウ酸亜鉛，メタホウ酸亜鉛など）、ホウ酸アルミニウム・カリウム、ホウ酸アンモニウム（メタホウ酸アンモニウム、四ホウ酸アンモニウム、五ホウ酸アンモニウム、八ホウ酸アンモニウムなど）、ホウ酸カドミウム（オルトホウ酸カドミウム、四ホウ酸カドミウムなど）、ホウ酸カリウム（メタホウ酸カリウム、四ホウ酸カリウム、五ホウ酸カリウム、六ホウ酸カリウム、八ホウ酸カリウムなど）、ホウ酸銀（メタホウ酸銀、四ホウ酸銀など）、ホウ酸銅（ホウ酸第２銅、メタホウ酸銅、四ホウ酸銅など）、ホウ酸ナトリウム（メタホウ酸ナトリウム、二ホウ酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、五ホウ酸ナトリウム、六ホウ酸ナトリウム、八ホウ酸ナトリウムなど）、ホウ酸鉛（メタホウ酸鉛、六ホウ酸鉛など）、ホウ酸ニッケル（オルトホウ酸ニッケル、二ホウ酸ニッケル、四ホウ酸ニッケル、八ホウ酸ニッケルなど）、ホウ酸バリウム（オルトホウ酸バリウム、メタホウ酸バリウム、二ホウ酸バリウム、四ホウ酸バリウムなど）、ホウ酸ビスマス、ホウ酸マグネシウム（オルトホウ酸マグネシウム、二ホウ酸マグネシウム、メタホウ酸マグネシウム、四ホウ酸三マグネシウム、四ホウ酸五マグネシウムなど）、ホウ酸マンガン（ホウ酸第１マンガン、メタホウ酸マンガン、四ホウ酸マンガンなど）、ホウ酸リチウム（メタホウ酸リチウム、四ホウ酸リチウム、五ホウ酸リチウムなど）、ボロン酸、フェニルボロン酸、２−アセトアミドフェニルボロン酸、３−アセチルフェニルボロン酸、3-アミノカルボニルフェニルボロン酸、４−アミノ−３−ニトロフェニルボロン酸、ｐ−ブロモフェニルボロン酸、ｐ−クロロフェニルボロン酸、ｍ−アミノフェニルボロン酸、２,４−ジクロロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−ビフェニルボロン酸、２，４−ジメトキシフェニルボロン酸、３−カルボキシフェニルボロン酸、（ｐ−ヒドロキシフェニル）ボロン酸、ｐ−（メタンスルホニル）ベンゼンボロン酸、ベンゼンボロン酸、３−カルボキシベンゼンボロン酸、ベンゼンジボロン酸、２，３−ジメトキシベンゼンボロン酸、トルエンボロン酸、２−フランボロン酸、５−インドールボロン酸、ナフタレンボロン酸、ブタンボロン酸、ピリジンボロン酸、キノリンボロン酸、テトラヒドロキシボロン、メチルボロン酸、エチルボロン酸、ブチルボロン酸、チオアニソールボロン酸、チオフェンボロン酸、シクロヘキシルボロン酸、ｍ−フェニレンジボロン酸などが挙げられる。これらは、単独でもまたは２種以上組み合わせても用いることができる。
【０１０４】
これらホウ酸またはその誘導体の中でも、ホウ酸、四ホウ酸ナトリウム、フェニルボロン酸、ｍ−アミノフェニルボロン酸が好ましく、四ホウ酸ナトリウムがより好ましい。
【０１０５】
ホウ酸またはその誘導体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、好ましくは０．１〜３００μｇ、より好ましくは５〜２００μｇ、特に好ましくは１０〜１００μｇが含まれるとよい。より詳しくは、供給される試料が全血であった場合、全血が１ｍｌに対して、好ましくは０．１〜３００ｍｇ、より好ましくは５〜２００ｍｇ、特に好ましくは１０〜１００ｍｇ含有されるとよい。この範囲であれば、ホウ酸またはその誘導体と血中のグルコースとを効率良く結合させることができ、ＧＬＤＨの精製中に混入するＧＤＨとグルコースとの反応を効率良く阻害することができる。
【０１０６】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、ホウ酸またはその誘導体は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれか一方の反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよい。しかしながら、ＧＬＤＨ中に含まれるＧＤＨとグルコースとの反応阻害効果の観点から、前記ホウ酸またはその誘導体は電極と接する第二の反応層９に含まれることが好ましい。
【０１０７】
さらに、本発明の第３のバイオセンサにおいては、前記ホウ酸またはその誘導体は、上記第２のバイオセンサにおける理由と同様の理由から、少なくとも電極と接する酸化分解酵素を含む反応層１１に含まれることが好ましい。
【０１０８】
上記ホウ酸またはその誘導体は、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１０９】
（親水性高分子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、さらに、親水性高分子を含んでもよい。
【０１１０】
親水性高分子は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上に親水性高分子層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１１１】
本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、本発明の酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１２】
なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１１３】
親水性高分子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。
【０１１４】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、酸化分解酵素を含む反応層１１に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素を含む反応層１１に親水性高分子を含有させることが好ましい。
【０１１５】
（非還元糖）
本発明の反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化するための固定化剤としてさらに非還元糖を含んでもよい。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が非還元糖を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、非還元糖は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が非還元糖を含む場合、反応層内に非還元糖が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うように非還元糖を含む非還元糖層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上に非還元糖層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１１６】
本明細書において、上記「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような非還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士が結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ポリオール脱水素酵素の基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。
【０１１７】
これらの非還元糖は、単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【０１１８】
なお、このような非還元糖の配合量は、酵素や電子伝達体を固定化でき、かつ反応層の溶解性を下げないという観点から、１センサあたり、好ましくは０．１〜５００μｇであり、より好ましくは０．５〜４００μｇであり、特に好ましくは１〜３００μｇである。非還元糖が２種以上の混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。非還元糖は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１１９】
非還元糖は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に非還元糖を含有させることが好ましい。
【０１２０】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、酸化還元酵素を含む反応層１１に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素を含む反応層１１に非還元糖を含有させることが好ましい。
【０１２１】
（タンパク質）
本発明の反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化するための固定化剤としてさらにタンパク質を含んでもよい。タンパク質は測定に関わる酵素反応に関与せず、また、自身が反応することもない、生理活性を示さないものを適宜選択して使用することができ、各層の固定化や安定化に寄与し得る。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がタンパク質を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、タンパク質は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がタンパク質を含む場合、反応層内にタンパク質が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うようにタンパク質を含むタンパク質層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上にタンパク質層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１２２】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含み得るタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、セリシン、およびそれらの加水分解物が挙げられる。これらのタンパク質は単独でも２種以上の混合物の形態で用いてもよい。このうち、入手し易くコストも安いことからＢＳＡが好ましい。好ましいタンパク質の分子量は、１０〜１０００ｋＤａ、より好ましくは２５〜５００ｋＤａ、さらに好ましくは５０〜１００ｋＤａである。この際、分子量はゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて測定した値を採用する。
【０１２３】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含まれるタンパク質の配合量は、１センサあたり、好ましくは０．１〜２００μｇ、より好ましくは０．５〜１００μｇ、さらに好ましくは１〜５０μｇである。タンパク質が２種以上の混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。上記の範囲であれば、センサの性能を低下させることなく各層の固定化や安定化に寄与できる。
【０１２４】
＜バイオセンサの製造方法＞
（本発明の第１のバイオセンサ）
本発明の第１のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１２５】
本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、必要に応じて脂質分解酵素と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、親水性高分子など）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。
【０１２６】
（本発明の第２のバイオセンサ）
本発明の第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１２７】
第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）と、必要に応じて界面活性剤と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じて、エタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。
【０１２８】
一方で、第二の反応層９については、例えば本発明の酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、界面活性剤（例えば、エマルゲン）と、ホウ酸またはその誘導体と、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）と、必要に応じて親水性高分子と、を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。
【０１２９】
（本発明の第３のバイオセンサ）
本発明の第３のバイオセンサにおける第一の反応層８、酸化還元酵素を有する反応層１１、）を形成する方法にも特に制限はないが、例えば、以下の方法が考えられる。
【０１３０】
第一の反応層８については、界面活性剤と、必要に応じて電子伝達体と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下し、上記と同様の方法で第一の反応層８を作製する。一方、本発明の酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、界面活性剤（例えば、エマルゲン）と、ホウ酸またはその誘導体と、必要に応じて親水性高分子と、を含む原料をグリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した液を電極に所定量滴下して乾燥して酸化還元酵素を含む反応層１１（ＧＬＤＨ層）を形成する。その後、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、必要に応じて電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）、必要に応じてホウ酸またはその誘導体、および必要に応じて親水性高分子をグリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した液を、酸化還元酵素を含む反応層１１の上部に所定量滴下し乾燥して脂質還元酵素を含む反応層１２を形成する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、電極作用部分の上に界面活性剤含有層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素と界面活性剤とホウ酸またはその誘導体とを含む層を形成させた形態を有しても良い。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。
【０１３１】
最後に、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第３のバイオセンサを製造することができる。
【０１３２】
＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、好ましくは、溶液形態である。溶液形態における溶媒としても特に制限されず、従来公知の溶媒を適宜参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。
【０１３３】
試料としても、特に制限はされないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄などの生体試料；ジュースなどの飲料水、醤油、ソースなどの食品類；排水、雨水、プール用水などが挙げられる。好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。
【０１３４】
なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料に含まれる基質についても特に制限はなく、本発明の酸化還元酵素と反応しうる物質であればよい。
【０１３５】
試料中の所望の成分（基質）としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトールなどの多価アルコール、中性脂肪、コレステロールなどの脂質、グルタミン酸や乳酸などの有機酸類、クレアチン、クレアチニンなどが挙げられる。上記と同様の理由から、中性脂肪やコレステロールなどの脂質が基質として選択されることが好ましい。
【０１３６】
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
【０１３７】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
【０１３８】
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。
【０１３９】
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【０１４０】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【０１４１】
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【０１４２】
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用できる。
【０１４３】
本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。
【０１４４】
本発明の効果を以下に纏める。
【０１４５】
本発明のバイオセンサにおいては、特定の酸化還元酵素が含まれる反応層に、ホウ酸またはその誘導体が含有されるため、測定値に対するグルコース濃度の影響をほとんど無くすかまったく無くす。よって、どのような血糖値であっても、所定の測定値が得られ、測定値のばらつきがほとんど生じず、バイオセンサの測定精度がより向上する。
【実施例】
【０１４６】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【０１４７】
＜全血中のグルコース濃度の影響＞
（実施例）
電極としては、独自に設計・製造した３電極系の電極を使用した。この電極は、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１が形成されている（図５および図６参照）。
【０１４８】
酸化還元酵素を含む反応層および脂質分解酵素を含む反応層は、以下の手順で形成した。
【０１４９】
１センサ（供給される試料「全血」の量１μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を１Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を１０ｍＭ（１．３μｇ）、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）を０．０５質量％（０．５μｇ）、トレハロース（和光純薬工業株式会社製）を４質量％（４０μｇ）、四ホウ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（１９μｇ）にそれぞれなるように混合し溶液（ＧＬＤＨ溶液）を得た。得られたＧＬＤＨ溶液を、電極の作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、ＧＬＤＨ層を形成させた。
【０１５０】
形成させたＧＬＤＨ層の上に重層して、１センサ（試料液量１μｌ）あたり、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ、旭化成株式会社製）を８０Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（和光純薬工業株式会社製）を２００ｍＭ（１２４μｇ）、四ホウ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（１９μｇ）になるように混合し溶液（ＬＰＬ溶液）を得た。得られたＬＰＬ溶液を、電極の作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、ＬＰＬ層を形成させた。
【０１５１】
このようにして、ＧＬＤＨ層にＬＰＬ層を重層した酵素層を得た。
【０１５２】
第一の反応層（界面活性剤層）は以下の手順で形成した。１センサ（供給される試料「全血」の量１μｌ）あたり、終濃度で、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）を０．１％（４μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（７．５μｇ）になるように混合し、界面活性剤溶液を得た。得られた界面活性剤溶液を、ＰＥＴからなるカバーに接着剤（両面テープ）を貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層（メディエーター層）を形成した。
【０１５３】
酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素とを含む反応層とが形成されている基板と、第一の反応層が形成されているカバーに接着した接着剤（両面テープ）とを互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層、酸化還元酵素を含む反応層、および脂質分解酵素を含む反応層の厚みはそれぞれ５μｍであり、第一の反応層と、酸化還元酵素を含む反応層および脂質分解酵素を含む反応層との離隔距離は０．１ｍｍであった。
【０１５４】
試料液（全血）１μｌを吸入させてから４５秒後に、参照極を基準にして作用極と対極の間に＋２００ｍＶの電位を印加し、１秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち全血中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。
（比較例）
ＧＬＤＨ層およびＬＰＬ層に四ホウ酸ナトリウムを添加しないこと以外は、実施例と同様に中性脂肪センサを作製した。
【０１５５】
表１に示すような、同じ中性脂肪濃度であってかつ様々なグルコース濃度を有する全血を、試料液として測定した結果を表２および図７に示す。図７では、実施例の測定値を白抜きの三角印で（図７中の△）、比較例の測定値を塗りつぶしの三角印で（図７中の▲）、それぞれ示している。
【０１５６】
【表１】
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
図７から明らかなように、実施例では全血中のグルコース濃度が増加しても測定値には変化が認められなかったが、比較例では、グルコース濃度の増加とともに測定値が大きく上昇する傾向が認められた。
【０１５９】
＜全血中の中性脂肪濃度依存性の確認＞
上記実施例および比較例と同様に中性脂肪センサを作製した。表３に示す中性脂肪濃度およびグルコース濃度が異なる８つの全血を試料液とし測定を行った。結果を表４および図８に示す。図８では、表３中のＮｏ．１〜４までの各中性脂肪濃度サンプルのグルコース０ｍｇ／ｄｌについて、実施例の測定値を白抜きの丸印で（図８中の○）、比較例の測定値を白抜きの四角印で（図８中の□）、表３中のＮｏ．５〜８までの各中性脂肪濃度サンプルのグルコース３６０ｍｇ／ｄｌについて、実施例の測定値を塗りつぶしの丸印で（図８中の●）、比較例の測定値を塗りつぶしの四角印で（図８中の■）、それぞれ示している。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
図８から明らかなように、実施例ではグルコースの有無に関わらずほぼ同じ測定値を示し、良好な中性脂肪濃度依存性が得られた。しかしながら、比較例では、良好な中性脂肪濃度依存性は得られているものの、グルコースの存在により測定値が大きく上昇する。このことは、全血中のグルコースの濃度のばらつきが、そのまま測定値のばらつきへと反映されてしまうことを示唆している。
【符号の説明】
【０１６３】
１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
１１ 酸化還元酵素を含む反応層、
１２ 脂質分解酵素を含む反応層、
Ｓ 空間部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量できるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の特定成分を簡易に定量する方法としては、様々なバイオセンサが提案されているが、代表的なものとしては、絶縁性の基板上に少なくとも作用極および対極からなる電極系を形成し、この電極系上に、電極系に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体を含む反応層を形成したものである。
【０００３】
このようにして作製されたバイオセンサの反応層に、基質を含む試料液を供給すると、反応層が試料液によって溶解することにより、酵素と基質が反応し、これに伴って電子伝達体が還元され、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を定量することができる（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
例えば、グルコースを試料とする場合、以下の方法が知られている。グルコースは、下記式（１）で示されるように、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いることにより定量することができる。すなわち、下記式において、還元型電子伝達体の増加量を電気化学的に測定することにより、グルコースを定量することが可能である。
【０００５】
【化１】
【０００６】
しかしながら、この方法は、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。溶存酸素の影響を受けない方法としては、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＧＤＨ）もしくはＮＡＤＰ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）を用いた下記式（２）に示される方法がある。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかしながら、この反応は、高価なＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰを添加する必要がある。溶存酸素の影響を受けず、且つ、高価な補酵素を添加しなくてもよい方法としては、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）もしくはＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を用いた下記式（３）に示される方法がある。
【０００９】
【化３】
【００１０】
上記反応は、溶存酸素の影響を受けず、且つ、高価な補酵素を添加する必要がないというメリットがある。
【００１１】
また、グリセロールを試料とする場合、以下の方法が知られている。グリセロールは、下記式（４）および式（５）で示されるように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）およびグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）を用いることにより定量することができる。すなわち、下記式において、還元型電子伝達体の増加量を電気化学的に測定することにより、グリセロールを定量することが可能である。
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５】
【００１４】
しかしながら、この方法は高価な２種類の酵素を用いる必要があり、且つ、反応が煩雑であるという問題がある。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【００１５】
溶存酸素の影響を受けず、１種類の酵素を用いる方法としては、下記式（６）で示すようにＮＡＤ＋依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＧＬＤＨ）を用いる方法が知られている。
【００１６】
【化６】
【００１７】
しかしながら、この反応は、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼと同様、高価な
ＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【００１８】
より安価で簡便にグリセロールを定量する方法としては、補欠分子族としてピロロキノ
リンキノンを含むポリオールデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＰＤＨ）を用いる方法がある。
この方法は、下記式（７）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反
応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどの
メリットがある。
【００１９】
【化７】
【００２０】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含む酸化還元酵素（以下「ＰＱＱ依存性酸化還元酵素」とも称する）の特徴としては、親水性のものが一部知られているが、一般的には膜結合型酵素であるため、疎水性が強く、水に対する溶解性が低いことが知られている。そのため、該酵素をセンサに使用する場合、反応層に界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤は、その他、試料の入りをよくするためや、電極表面に気泡を生じさせないためなどの様々な理由から、バイオセンサの構成成分として加えられることがある。
【００２１】
上記疎水性の膜結合型酸化還元酵素である、例えば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含む酸化還元酵素は、使用する際精製する必要があるが、量産化におけるコスト低減の観点から、極力少ないステップで精製をすることが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
しかしながら、少ない精製ステップで補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）含む酸化還元酵素を精製する場合、夾雑物を含んだ状態で精製されてしまう虞があり、さらに、その夾雑物が測定系に影響を及ぼす虞がある。
【００２４】
特に、注意しなければならないのは、他の酸化還元酵素が混入することである。
【００２５】
例えば、ＧＬＤＨ（グリセロールデヒドロゲナーゼ）を精製する際に、同じ酸化還元酵素であるＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）が混入することである。ＧＤＨも、ＧＬＤＨと同様に酸化還元メディエーター（Ｍｅｄ）を利用した電子授受反応を行うため、ＧＤＨが混入すると、血液中のグルコースと反応してしまい、ＧＬＤＨを用いたグリセロールの測定値にグルコース濃度の値が反映されてしまう。例えば、グルコース濃度が高いサンプルは、実際よりも高いグリセロールの測定値になるという現象になる。これは測定値のばらつきを生み、しいては、精度の高い測定ができないという問題になる。
【００２６】
よって、本発明は、高い精度で測定ができるバイオセンサを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ホウ酸またはその誘導体をバイオセンサの反応層にあらかじめ添加しておくことによって、上記問題が解決できることを知得した。
【００２８】
すなわち、本発明の課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサを提供することによって、解決される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、高い精度で測定ができるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサの断面図である。
【図３】本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図４】図３のバイオセンサの断面図である。
【図５】本発明の第３のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図６】図５のバイオセンサの断面図である。
【図７】実施例および比較例のバイオセンサを用いて、全血中の中性脂肪濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図８】実施例および比較例のバイオセンサを用いて、全血中の中性脂肪濃度依存性を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の
寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００３２】
１．本発明の第１
本発明の第１は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有する、バイオセンサである。
【００３３】
２．本発明の第２
本発明の第２は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有する、バイオセンサである。
【００３４】
３．本発明の第３
本発明の第３は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有する、バイオセンサである。
【００３５】
図１は、本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。
【００３６】
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサを電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
【００３７】
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００３８】
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、少なくとも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素（以下、「本発明の酸化還元酵素」とも称する）と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
【００３９】
第１のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
【００４０】
続いて、図３は、本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。
【００４１】
図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１のバイオセンサと同様であるが、第１のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含むことが好ましい。換言すれば、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれないことが好ましい。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、本発明の酸化還元酵素は含まれず、前記第二の反応層９に、本発明の酸化還元酵素が含まれば、電子伝達体が含まれないことが好ましい。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
【００４２】
第２のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
【００４３】
図５は、本発明の第３のバイオセンサを示す分解斜視図である。図６は、図５のバイオセンサの断面図である。
【００４４】
図５、６に示すとおり、基本的な構造は、図３、４で示す第２のバイオセンサと同様であるが、第２のバイオセンサとの相違点は、第二の反応層が、酸化分解酵素を含む反応層１１と脂質分解酵素を含む反応層１２との２つを有する点である。
【００４５】
上記第２のバイオセンサと同様に、図５、６に示す第３のバイオセンサにおいても、酸化還元酵素および電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれないことが好ましい。具体的には、前記電子伝達体は、第一の反応層８および脂質分解酵素を含む反応層１２の少なくとも一方に含まれることが好ましい。
【００４６】
以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、本発明の第１のバイオセンサの構造と、本発明の第２のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８、第二の反応層９）であるか、である。また、本発明の第２のバイオセンサの構造と、本発明の第３のバイオセンサの構造との相違点は、第二の反応層９が１つだけであるか、第二の反応層９が酸化分解酵素を含む反応層１１と脂質分解酵素を含む反応層１２との２つを有するか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、本発明の第２のバイオセンサにも、本発明の第３のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料が「０．１〜２０μｌ（好ましくは１μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。
【００４７】
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００４８】
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。
【００４９】
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４とを含む。
【００５０】
本発明の電極は、試料（測定対象物）と、本発明の酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。
【００５１】
本発明においては、作用極２および対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
【００５２】
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
【００５３】
＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
【００５４】
＜試料供給部＞
上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、電子伝達体と、本発明の酸化還元酵素と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層１０を有する。
【００５５】
本発明の第１のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。
【００５６】
反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、特に好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００５７】
一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有する。そして、前記第一の反応層８が、本発明の酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含むことが好ましい。
【００５８】
本発明の第２のバイオセンサのような反応層を２つにする形態においては、本発明の酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。
【００５９】
また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層および第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と第二の反応層９との離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７〜１．２５ｍｍ、特に好ましくは０．０９〜１ｍｍである。上記範囲であれば、保存中に本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体とがほとんど接触せず、また、毛細管現象が起こりやすく、試料が反応層に吸引されやすい。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
【００６０】
さらに、本発明の第３のバイオセンサは、第二の反応層９が、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の２つを有する。該酸化還元酵素を含む反応層１１および該脂質分解酵素を含む反応層１２のそれぞれの厚さにも特に制限はなく、通常の反応層の厚みとなるように適宜選択できる。酸化還元酵素を含む反応層１１の厚みは、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍである。また、脂質分解酵素を含む反応層１２の厚みは、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、特に好ましくは０．０５〜８μｍである。さらに、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の合計厚みは、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、特に好ましくは０．１〜１６μｍである。ここで、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００６１】
（酸化還元酵素）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１）は、補欠分子族（「補酵素」とも称する）としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む。特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素が好ましい。なお、本発明においては、本発明の酸化還元酵素を単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
【００６２】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、試料の種類に依存するが、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなどが挙げられる。補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。
【００６３】
中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましい（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）。
【００６４】
上記の本発明の酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８−２２０３６７号公報参照）。
【００６５】
具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・アルビダス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＮＢＲＣ ３２５０、３２７３、１０３５０９、１０３５１０、１０３５１６、１０３５２０、１０３５２１、１０３５２４；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６７、３２７４、３２７５、３２７６；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５１、３２５３、３２６２、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２８５、３２８６、３２９０、１６６６９、１０３４１３、１０３４２１、１０３４２７、１０３４２８、１０３４２９、１０３４３７、１０３４３８、１０３４３９、１０３４４０、１０３４４１、１０３４４６、１０３４５３、１０３４５４、１０３４５６、１０３４５７、１０３４５８、１０３４５９、１０３４６１、１０３４６２、１０３４６５、１０３４６６、１０３４６７、１０３４６８、１０３４６９、１０３４７０、１０３４７１、１０３４７２、１０３４７３、１０３４７４、１０３４７５、１０３４７６、１０３４７７、１０３４８２、１０３４８７、１０３４８８、１０３４９０、１０３４９１、１０３４９３、１０３４９４、１０３４９９、１０３５００、１０３５０１、１０３５０２、１０３５０３、１０３５０４、１０３５０６、１０３５０７、１０３５１５、１０３５１７、１０３５１８、１０３５１９、１０３５２３；グルコノバクター・ジャポニカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６０、３２６３、３２６９、３２７１、３２７２；グルコノバクター・カンチャナブリエンシス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋａｎｃｈａｎａｂｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １０３５８７，１０３５８８；グルコノバクター・コンドニ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｎｄｏｎｉｉ）ＮＢＲＣ ３２６６；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１８９、３２４４、３２８７、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、１２５２８、１４８１９；グルコノバクター・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ）ＮＢＲＣ ３９９０；グルコノバクター・エスピー（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）ＮＢＲＣ ３２５９、１０３５０８；グルコノバクター・スファエリカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ １２４６７；グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３１７２、３２５４、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８９、３２９１、１００６００、１００６０１等が好ましく用いられる。
【００６６】
上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は好ましくは２０℃〜５０℃、より好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００６８】
次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００６９】
なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００７０】
本発明の酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、好ましくは０．０１〜１００Ｕ、より好ましくは０．０５〜５０Ｕ、特に好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。また、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含む酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７１】
（脂質分解酵素）
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、脂質を構成するエステル結合を加水分解する脂質分解酵素をさらに含むことが好ましい。かような脂質分解酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。
【００７２】
ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、より好ましくは１〜５００Ｕ、特に好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、国際公開第２００６／１０４０７７号パンフレットに記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７３】
前記酸化還元酵素と前記脂質分解酵素とは、一つの反応層中に共存してもよいし、別の層に分かれて存在してもよいが、別の層に分かれて存在することが好ましい。よって、前記反応層が、酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有することが好ましい。すなわち、本発明の第３のバイオセンサのような反応層の構成がより好ましい。かような形態であれば、脂質分解酵素による加水分解反応が効率よく進行する。
【００７４】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明の酸化還元酵素は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に本発明の酸化還元酵素を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含有させる。それは、本発明においては、本発明の酸化還元酵素が電極に固着することが有意に防止されているからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。
【００７５】
同様に、電極近傍での酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなるという観点から、本発明の第３のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素は、電極と接する酸化還元酵素を含む反応層１１に含有させることが好ましい。
【００７６】
（電子伝達体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。
【００７７】
電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。
【００７８】
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００７９】
電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物などのルテニウム錯体などを好適に使用することができる。
【００８０】
電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、好ましくは１〜２０００μｇ、より好ましくは５〜１０００μｇ、特に好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００８１】
本発明の第２のバイオセンサにおいては、電子伝達体は、本発明の酸化還元酵素と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、上記のように、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素を含ませることが好ましいからである。また、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれることが好ましい。
【００８２】
上記と同様の理由で、本発明の第３のバイオセンサにおいては、前記電子伝達体は、酸化分解酵素を含まずかつ電極と接しない脂質分解酵素を含む反応層１２に含まれることが好ましい。
【００８３】
（界面活性剤）
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が、界面活性剤を有する。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の溶解が促進されうる。
【００８４】
本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する本発明の酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００８５】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００８６】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製））などが好ましい。中でも、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製））が好ましい。
【００８７】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含有されると、試料溶液を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシドよりもアルキルチオグリコシドが非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
【００８８】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標））などが挙げられる。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
【００８９】
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９０】
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９１】
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９２】
上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。
【００９３】
また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００９４】
より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、本発明の酸化還元酵素が含有されることが好ましいが、例えば、本発明の酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることがより好ましい。この場合にもまた、広がりや濡れ性の観点で考えると、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００９５】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、および脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８または酸化分解酵素を含む反応層１１、より好ましくは第一の反応層８および酸化分解酵素を含む反応層１１が界面活性剤を含む。これにより、酸化還元酵素や電子伝達体の溶解が促進されうる。また、上記３つの反応層の２以上の反応層に界面活性剤を存在させる場合には、これらの反応層に含める各界面活性剤の種類や配合量は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００９６】
より具体的には、まず、上記の通り、本発明の第３のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素を含む反応層１１に酸化還元酵素が含有されるが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも酸化還元酵素を含む反応層１１には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。この際、毛細管現象により試料供給部に血液をより吸入しやすくするという観点から、第１の反応層８にも界面活性剤が含まれることが好ましい。
【００９７】
さらに、上記述べた通り、本発明の第２のバイオセンサでは、第１の反応層８は電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）を含有するが、この際、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第１の反応層８にも界面活性剤が含有されることがより好ましい。この場合にもまた、広がりや濡れ性の観点で考えると、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ−２９０など）を使用することが好ましい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００９８】
界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。
【００９９】
界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇ、より好ましくは０．０５〜５０μｇ、特に好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。
【０１００】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇ、より好ましくは０．０５〜５０μｇ、特に好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１０１】
（ホウ酸またはその誘導体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、ホウ酸またはその誘導体を含む。これにより、測定値に対する血液中のグルコースの影響をほとんど無くすかまたはまったく無くすことができ、どのような血糖値であっても、所定の測定値が得られ、測定値のばらつきがほとんど生じない。
【０１０２】
測定値に対する血液中のグルコースの影響を低減できるメカニズムについては、詳細なことは不明であるが、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がホウ酸またはその誘導体を含むことによって、ホウ酸またはその誘導体と血中のグルコースとが結合し、ＧＬＤＨの精製中に混入するＧＤＨとグルコースとの反応を阻害するためであると考えられる。もちろん、本発明の効果が発現するメカニズムは、これに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明で用いられるホウ酸またはその誘導体の具体的な例としては、例えば、オルトホウ酸、メタホウ酸、次ホウ酸、ホウ酸カルシウム、ホウ酸コバルト、ホウ酸亜鉛（四ホウ酸亜鉛，メタホウ酸亜鉛など）、ホウ酸アルミニウム・カリウム、ホウ酸アンモニウム（メタホウ酸アンモニウム、四ホウ酸アンモニウム、五ホウ酸アンモニウム、八ホウ酸アンモニウムなど）、ホウ酸カドミウム（オルトホウ酸カドミウム、四ホウ酸カドミウムなど）、ホウ酸カリウム（メタホウ酸カリウム、四ホウ酸カリウム、五ホウ酸カリウム、六ホウ酸カリウム、八ホウ酸カリウムなど）、ホウ酸銀（メタホウ酸銀、四ホウ酸銀など）、ホウ酸銅（ホウ酸第２銅、メタホウ酸銅、四ホウ酸銅など）、ホウ酸ナトリウム（メタホウ酸ナトリウム、二ホウ酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、五ホウ酸ナトリウム、六ホウ酸ナトリウム、八ホウ酸ナトリウムなど）、ホウ酸鉛（メタホウ酸鉛、六ホウ酸鉛など）、ホウ酸ニッケル（オルトホウ酸ニッケル、二ホウ酸ニッケル、四ホウ酸ニッケル、八ホウ酸ニッケルなど）、ホウ酸バリウム（オルトホウ酸バリウム、メタホウ酸バリウム、二ホウ酸バリウム、四ホウ酸バリウムなど）、ホウ酸ビスマス、ホウ酸マグネシウム（オルトホウ酸マグネシウム、二ホウ酸マグネシウム、メタホウ酸マグネシウム、四ホウ酸三マグネシウム、四ホウ酸五マグネシウムなど）、ホウ酸マンガン（ホウ酸第１マンガン、メタホウ酸マンガン、四ホウ酸マンガンなど）、ホウ酸リチウム（メタホウ酸リチウム、四ホウ酸リチウム、五ホウ酸リチウムなど）、ボロン酸、フェニルボロン酸、２−アセトアミドフェニルボロン酸、３−アセチルフェニルボロン酸、3-アミノカルボニルフェニルボロン酸、４−アミノ−３−ニトロフェニルボロン酸、ｐ−ブロモフェニルボロン酸、ｐ−クロロフェニルボロン酸、ｍ−アミノフェニルボロン酸、２,４−ジクロロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−ビフェニルボロン酸、２，４−ジメトキシフェニルボロン酸、３−カルボキシフェニルボロン酸、（ｐ−ヒドロキシフェニル）ボロン酸、ｐ−（メタンスルホニル）ベンゼンボロン酸、ベンゼンボロン酸、３−カルボキシベンゼンボロン酸、ベンゼンジボロン酸、２，３−ジメトキシベンゼンボロン酸、トルエンボロン酸、２−フランボロン酸、５−インドールボロン酸、ナフタレンボロン酸、ブタンボロン酸、ピリジンボロン酸、キノリンボロン酸、テトラヒドロキシボロン、メチルボロン酸、エチルボロン酸、ブチルボロン酸、チオアニソールボロン酸、チオフェンボロン酸、シクロヘキシルボロン酸、ｍ−フェニレンジボロン酸などが挙げられる。これらは、単独でもまたは２種以上組み合わせても用いることができる。
【０１０４】
これらホウ酸またはその誘導体の中でも、ホウ酸、四ホウ酸ナトリウム、フェニルボロン酸、ｍ−アミノフェニルボロン酸が好ましく、四ホウ酸ナトリウムがより好ましい。
【０１０５】
ホウ酸またはその誘導体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、好ましくは０．１〜３００μｇ、より好ましくは５〜２００μｇ、特に好ましくは１０〜１００μｇが含まれるとよい。より詳しくは、供給される試料が全血であった場合、全血が１ｍｌに対して、好ましくは０．１〜３００ｍｇ、より好ましくは５〜２００ｍｇ、特に好ましくは１０〜１００ｍｇ含有されるとよい。この範囲であれば、ホウ酸またはその誘導体と血中のグルコースとを効率良く結合させることができ、ＧＬＤＨの精製中に混入するＧＤＨとグルコースとの反応を効率良く阻害することができる。
【０１０６】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、ホウ酸またはその誘導体は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれか一方の反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよい。しかしながら、ＧＬＤＨ中に含まれるＧＤＨとグルコースとの反応阻害効果の観点から、前記ホウ酸またはその誘導体は電極と接する第二の反応層９に含まれることが好ましい。
【０１０７】
さらに、本発明の第３のバイオセンサにおいては、前記ホウ酸またはその誘導体は、上記第２のバイオセンサにおける理由と同様の理由から、少なくとも電極と接する酸化分解酵素を含む反応層１１に含まれることが好ましい。
【０１０８】
上記ホウ酸またはその誘導体は、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１０９】
（親水性高分子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、さらに、親水性高分子を含んでもよい。
【０１１０】
親水性高分子は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上に親水性高分子層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１１１】
本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、本発明の酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１２】
なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１１３】
親水性高分子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。
【０１１４】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、酸化分解酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、酸化分解酵素を含む反応層１１に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素を含む反応層１１に親水性高分子を含有させることが好ましい。
【０１１５】
（非還元糖）
本発明の反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化するための固定化剤としてさらに非還元糖を含んでもよい。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が非還元糖を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、非還元糖は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）が非還元糖を含む場合、反応層内に非還元糖が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うように非還元糖を含む非還元糖層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上に非還元糖層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１１６】
本明細書において、上記「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような非還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士が結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ポリオール脱水素酵素の基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。
【０１１７】
これらの非還元糖は、単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【０１１８】
なお、このような非還元糖の配合量は、酵素や電子伝達体を固定化でき、かつ反応層の溶解性を下げないという観点から、１センサあたり、好ましくは０．１〜５００μｇであり、より好ましくは０．５〜４００μｇであり、特に好ましくは１〜３００μｇである。非還元糖が２種以上の混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。非還元糖は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１１９】
非還元糖は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、第二の反応層９に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に非還元糖を含有させることが好ましい。
【０１２０】
また、本発明の第３のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、酸化還元酵素を含む反応層１１に本発明の酸化還元酵素が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素を含む反応層１１に非還元糖を含有させることが好ましい。
【０１２１】
（タンパク質）
本発明の反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化するための固定化剤としてさらにタンパク質を含んでもよい。タンパク質は測定に関わる酵素反応に関与せず、また、自身が反応することもない、生理活性を示さないものを適宜選択して使用することができ、各層の固定化や安定化に寄与し得る。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がタンパク質を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）の剥離が防止されうる。また、タンパク質は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）がタンパク質を含む場合、反応層内にタンパク質が含まれる形態を有していてもよく、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）を覆うようにタンパク質を含むタンパク質層を形成させた形態を有してもよい。また、電極の作用部分の上にタンパク質層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素を含む反応層や電子伝達体を含む反応層を形成させた形態を有しても良い。
【０１２２】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含み得るタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、セリシン、およびそれらの加水分解物が挙げられる。これらのタンパク質は単独でも２種以上の混合物の形態で用いてもよい。このうち、入手し易くコストも安いことからＢＳＡが好ましい。好ましいタンパク質の分子量は、１０〜１０００ｋＤａ、より好ましくは２５〜５００ｋＤａ、さらに好ましくは５０〜１００ｋＤａである。この際、分子量はゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて測定した値を採用する。
【０１２３】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に含まれるタンパク質の配合量は、１センサあたり、好ましくは０．１〜２００μｇ、より好ましくは０．５〜１００μｇ、さらに好ましくは１〜５０μｇである。タンパク質が２種以上の混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。上記の範囲であれば、センサの性能を低下させることなく各層の固定化や安定化に寄与できる。
【０１２４】
＜バイオセンサの製造方法＞
（本発明の第１のバイオセンサ）
本発明の第１のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１２５】
本発明の酸化還元酵素と、電子伝達体と、界面活性剤と、ホウ酸またはその誘導体と、必要に応じて脂質分解酵素と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、親水性高分子など）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。
【０１２６】
（本発明の第２のバイオセンサ）
本発明の第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１２７】
第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）と、必要に応じて界面活性剤と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じて、エタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。
【０１２８】
一方で、第二の反応層９については、例えば本発明の酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、界面活性剤（例えば、エマルゲン）と、ホウ酸またはその誘導体と、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）と、必要に応じて親水性高分子と、を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。
【０１２９】
（本発明の第３のバイオセンサ）
本発明の第３のバイオセンサにおける第一の反応層８、酸化還元酵素を有する反応層１１、）を形成する方法にも特に制限はないが、例えば、以下の方法が考えられる。
【０１３０】
第一の反応層８については、界面活性剤と、必要に応じて電子伝達体と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下し、上記と同様の方法で第一の反応層８を作製する。一方、本発明の酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、界面活性剤（例えば、エマルゲン）と、ホウ酸またはその誘導体と、必要に応じて親水性高分子と、を含む原料をグリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した液を電極に所定量滴下して乾燥して酸化還元酵素を含む反応層１１（ＧＬＤＨ層）を形成する。その後、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、必要に応じて電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）、必要に応じてホウ酸またはその誘導体、および必要に応じて親水性高分子をグリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した液を、酸化還元酵素を含む反応層１１の上部に所定量滴下し乾燥して脂質還元酵素を含む反応層１２を形成する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、電極作用部分の上に界面活性剤含有層を形成させ、さらにその上に酸化還元酵素と界面活性剤とホウ酸またはその誘導体とを含む層を形成させた形態を有しても良い。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。
【０１３１】
最後に、酸化還元酵素を含む反応層１１および脂質分解酵素を含む反応層１２が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第３のバイオセンサを製造することができる。
【０１３２】
＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、好ましくは、溶液形態である。溶液形態における溶媒としても特に制限されず、従来公知の溶媒を適宜参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。
【０１３３】
試料としても、特に制限はされないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄などの生体試料；ジュースなどの飲料水、醤油、ソースなどの食品類；排水、雨水、プール用水などが挙げられる。好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。
【０１３４】
なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料に含まれる基質についても特に制限はなく、本発明の酸化還元酵素と反応しうる物質であればよい。
【０１３５】
試料中の所望の成分（基質）としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトールなどの多価アルコール、中性脂肪、コレステロールなどの脂質、グルタミン酸や乳酸などの有機酸類、クレアチン、クレアチニンなどが挙げられる。上記と同様の理由から、中性脂肪やコレステロールなどの脂質が基質として選択されることが好ましい。
【０１３６】
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
【０１３７】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９、酸化還元酵素を含む反応層１１、脂質分解酵素を含む反応層１２）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
【０１３８】
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。
【０１３９】
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【０１４０】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【０１４１】
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【０１４２】
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用できる。
【０１４３】
本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。
【０１４４】
本発明の効果を以下に纏める。
【０１４５】
本発明のバイオセンサにおいては、特定の酸化還元酵素が含まれる反応層に、ホウ酸またはその誘導体が含有されるため、測定値に対するグルコース濃度の影響をほとんど無くすかまったく無くす。よって、どのような血糖値であっても、所定の測定値が得られ、測定値のばらつきがほとんど生じず、バイオセンサの測定精度がより向上する。
【実施例】
【０１４６】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【０１４７】
＜全血中のグルコース濃度の影響＞
（実施例）
電極としては、独自に設計・製造した３電極系の電極を使用した。この電極は、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１が形成されている（図５および図６参照）。
【０１４８】
酸化還元酵素を含む反応層および脂質分解酵素を含む反応層は、以下の手順で形成した。
【０１４９】
１センサ（供給される試料「全血」の量１μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を１Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を１０ｍＭ（１．３μｇ）、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）を０．０５質量％（０．５μｇ）、トレハロース（和光純薬工業株式会社製）を４質量％（４０μｇ）、四ホウ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（１９μｇ）にそれぞれなるように混合し溶液（ＧＬＤＨ溶液）を得た。得られたＧＬＤＨ溶液を、電極の作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、ＧＬＤＨ層を形成させた。
【０１５０】
形成させたＧＬＤＨ層の上に重層して、１センサ（試料液量１μｌ）あたり、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ、旭化成株式会社製）を８０Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（和光純薬工業株式会社製）を２００ｍＭ（１２４μｇ）、四ホウ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（１９μｇ）になるように混合し溶液（ＬＰＬ溶液）を得た。得られたＬＰＬ溶液を、電極の作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、ＬＰＬ層を形成させた。
【０１５１】
このようにして、ＧＬＤＨ層にＬＰＬ層を重層した酵素層を得た。
【０１５２】
第一の反応層（界面活性剤層）は以下の手順で形成した。１センサ（供給される試料「全血」の量１μｌ）あたり、終濃度で、エマルゲンＰＰ−２９０（花王株式会社製）を０．１％（４μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を５０ｍＭ（７．５μｇ）になるように混合し、界面活性剤溶液を得た。得られた界面活性剤溶液を、ＰＥＴからなるカバーに接着剤（両面テープ）を貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層（メディエーター層）を形成した。
【０１５３】
酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素とを含む反応層とが形成されている基板と、第一の反応層が形成されているカバーに接着した接着剤（両面テープ）とを互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層、酸化還元酵素を含む反応層、および脂質分解酵素を含む反応層の厚みはそれぞれ５μｍであり、第一の反応層と、酸化還元酵素を含む反応層および脂質分解酵素を含む反応層との離隔距離は０．１ｍｍであった。
【０１５４】
試料液（全血）１μｌを吸入させてから４５秒後に、参照極を基準にして作用極と対極の間に＋２００ｍＶの電位を印加し、１秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち全血中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。
（比較例）
ＧＬＤＨ層およびＬＰＬ層に四ホウ酸ナトリウムを添加しないこと以外は、実施例と同様に中性脂肪センサを作製した。
【０１５５】
表１に示すような、同じ中性脂肪濃度であってかつ様々なグルコース濃度を有する全血を、試料液として測定した結果を表２および図７に示す。図７では、実施例の測定値を白抜きの三角印で（図７中の△）、比較例の測定値を塗りつぶしの三角印で（図７中の▲）、それぞれ示している。
【０１５６】
【表１】
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
図７から明らかなように、実施例では全血中のグルコース濃度が増加しても測定値には変化が認められなかったが、比較例では、グルコース濃度の増加とともに測定値が大きく上昇する傾向が認められた。
【０１５９】
＜全血中の中性脂肪濃度依存性の確認＞
上記実施例および比較例と同様に中性脂肪センサを作製した。表３に示す中性脂肪濃度およびグルコース濃度が異なる８つの全血を試料液とし測定を行った。結果を表４および図８に示す。図８では、表３中のＮｏ．１〜４までの各中性脂肪濃度サンプルのグルコース０ｍｇ／ｄｌについて、実施例の測定値を白抜きの丸印で（図８中の○）、比較例の測定値を白抜きの四角印で（図８中の□）、表３中のＮｏ．５〜８までの各中性脂肪濃度サンプルのグルコース３６０ｍｇ／ｄｌについて、実施例の測定値を塗りつぶしの丸印で（図８中の●）、比較例の測定値を塗りつぶしの四角印で（図８中の■）、それぞれ示している。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
図８から明らかなように、実施例ではグルコースの有無に関わらずほぼ同じ測定値を示し、良好な中性脂肪濃度依存性が得られた。しかしながら、比較例では、良好な中性脂肪濃度依存性は得られているものの、グルコースの存在により測定値が大きく上昇する。このことは、全血中のグルコースの濃度のばらつきが、そのまま測定値のばらつきへと反映されてしまうことを示唆している。
【符号の説明】
【０１６３】
１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
１１ 酸化還元酵素を含む反応層、
１２ 脂質分解酵素を含む反応層、
Ｓ 空間部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、 前記試料供給部が、
少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、
電子伝達体と、
界面活性剤と、
ホウ酸またはその誘導体と、
を含む反応層を有する、バイオセンサ。
【請求項２】
前記反応層が、さらに脂質分解酵素を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記ホウ酸またはその誘導体が、１センサあたり１０〜１００μｇ含まれる、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記酸化還元酵素が、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記第一の反応層が、酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有する、請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層が、さらに親水性高分子、非還元糖、およびタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、 前記試料供給部が、
少なくとも補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素と、
電子伝達体と、
界面活性剤と、
ホウ酸またはその誘導体と、
を含む反応層を有する、バイオセンサ。
【請求項２】
前記反応層が、さらに脂質分解酵素を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記ホウ酸またはその誘導体が、１センサあたり１０〜１００μｇ含まれる、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記酸化還元酵素が、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記第一の反応層が、酸化還元酵素を含む反応層と脂質分解酵素を含む反応層とを有する、請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層が、さらに親水性高分子、非還元糖、およびタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２１１８１０（Ｐ２０１２−２１１８１０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７７２８６（Ｐ２０１１−７７２８６）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
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