炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤および前記疾患の治療または予防方法
本発明は、ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤、前記製剤を用いて炎症性呼吸器疾患を治療または予防する方法、および前記製剤を含むキットに関するもので、前記ペプチドを注射で全身投与する場合に比べて、直接呼吸器に投与することにより呼吸器炎症抑制効果が顕著に向上する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤、前記製剤を用いて炎症性呼吸器疾患を治療または予防する方法、および前記製剤を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器疾患は一般に炎症を随伴し、これは気管支や肺などの状態を悪化させる。これに関連して、炎症性呼吸器疾患としては急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔塩、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、慢性気管支炎、肺気腫、肺炎、気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症、肺繊維症などがある。
【０００３】
よって、呼吸器の炎症を抑えることにより前記炎症性呼吸器疾患を治療または予防することができるが、依然として、満足すべき薬効を持つ、炎症性呼吸器疾患を治療または予防する薬剤の開発が要求されている。
【０００４】
一方、人体は、食細胞、特に好中球(neutrophil)および単球(monocyte)に対する化学誘引物質として、バクテリアから生産されたＮ−ホルミルメチオニルペプチドを用いて、バクテリアの感染に対する防御メカニズムを開発するように進化した。Ｎ−ホルミルペプチドのうち、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰ）が食細胞を補充し、好中球によるリソソーム性酵素の放出を促進するという能力面で最も効能があるものと確認された[Showell et al., J, Exp. Med, 143:1154-1169, 1976]。また、合成テトラペプチド、特にｆ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕおよびｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅは以後に好中球反応を誘発させるものと明らかになった[Rot et al., Proc. Natl, Acad, Scie, USA 84:7967-7971, 1987]。初期に、前記ペプチドの効能は１）Ｎ末端のホルミルグループ、２）メチオニン側鎖、並びに３）ロイシンおよびフェニルアラニン側鎖に起因するものと思われた。
【０００５】
Ｎ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ＝formyl peptide receptor）は細胞外空間または細胞内空間に露出された親水性配列によって連結された原形質膜に置かれた７つの疎水性領域を含む(Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633, 1994)。第１および第３の細胞内ループ(loop)は、相対的に小さく、それぞれ５つおよび６つのアミノ酸から構成される。カルボキシル末端は細胞内空間に露出されるが、Ｎ末端は細胞外空間に露出される。また、細胞内配列はＧ−タンパク質−結合領域（受容体の作用に必須的な領域）および潜在性リン酸化領域を含む。
【０００６】
６つのアミノ酸からなるＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ｄ−Ｍｅｔ（ＷＫＹＭＶｍ；配列番号４）がＦＰＲ(formyl peptide receptor)およびその類似体ＦＰＲＬ１(formyl peptide receptor-like 1)に結合するものと知られており、ＷＫＹＭＶｍは広い範囲の受容体に対して高い親和度を持つ短いペプチドであるから、ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１媒介信号伝達の研究に有用でありうる[国際特許出願公開ＷＯ／２００５／０７７４１２；Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105); Bae YS et al., Journal of Leukocyte Biology 71(2): 329-338 (2002); Christophe T et al., Journal of Biological Chemistry 276(24): 21585-21593 (2001); He R et al., Journal of Immunology 165(8): 4598-4605 (2000); Li BQ et al., Blood 97(10): 2941-2947 (2001); Seo JK et al., Journal of Immunology 158(4): 1895-1901 (1997); Seo JK et al., Clinical Biochemistry 31(3): 137-141 (1998)]。
【０００７】
ところが、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを疾病の治療に用いた例は多くない。ＷＫＹＭＶｍ（配列番号：４）を用いて白血病患者または化学治療を受けた癌患者がバクテリアに対する抵抗力を高めたと報告された[H. Kim et al., Leukemia Research 32(5):717-725 (2008); H. Kim et al., Experimental Hematology 34(4):407-413 (2006)]。ＷＫＹＭＶｍおよびこれとアミノ酸配列が類似したペプチドを用いて免疫反応を調節する方法が報告された［ＷＯ２００５／０７７４１２］。ところが、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するＷＫＹＭＶｍなどのペプチドを呼吸器の炎症抑制に使用した例は知られておらず、特に、他の投与経路に比べて、呼吸器内に投与することにより呼吸器の炎症を顕著に抑制することができることについてはまだ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用する特定のペプチドを呼吸器を通して投与する場合、顕著な呼吸器の炎症抑制効果を示して炎症性呼吸器疾患の治療または予防に顕著な効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
そこで、本発明の技術的課題は、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤、前記製剤を含むキット、および前記製剤を呼吸器内に投与することにより呼吸器の炎症を抑制して炎症性呼吸器疾患を治療または予防することが可能な方法を提供することにある。
【００１０】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は上述した課題に限定されず、言及されていない別の課題は下記の記載から当業者にとって明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のある側面は、呼吸器内投与が可能な薬学的または獣医学的許容担；およびホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面は、前記呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明の別の側面は、前記呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
マウスモデルにおいて、ＦＰＲに作用するペプチドを腹腔に注射して全身投与した場合には呼吸器の炎症抑制効果がなかったが、ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤を吸入によって呼吸器に投与した場合には呼吸器炎症抑制効果が顕著に示された。よって、前記ペプチドを注射で全身投与する場合と比べて、本発明によって直接呼吸器に投与することにより呼吸器炎症抑制効果が顕著に向上する。それ故に、このような本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用する特定のペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤を呼吸器を通して投与する場合、顕著な呼吸器炎症抑制効果を示して炎症性呼吸器疾患の治療または予防に顕著な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｔｈ１＋Ｔｈ１７免疫反応を示す喘息モデルをマウスを用いて作った方法を図式的に示す。
【図２】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に炎症反応を観察したもので、気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数から得た結果を示す。
【図３】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１免疫反応を観察したもので、肺組織および気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの発現結果を示したものである。
【図４】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応を観察したもので、肺組織および気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの発現結果を示したものである。
【図５】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応およびＩＬ−１７によって浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインを気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図６】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した炎症反応を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図７】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目にＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図８】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目に気管支肺胞洗浄液で測定した炎症反応結果を示したものである。
【図９】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１免疫反応を観察したもので、局所リンパ節、肺組織および気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１０】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応を観察したもので、局所リンパ節、肺組織および気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１１】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ２免疫反応などを観察したもので、肺組織で測定した結果を示したものである。
【図１２】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応による炎症細胞の浸潤および浸潤された炎症細胞から分泌される炎症性媒介体の分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１３】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の２４時間後である２３日目に気管支過敏性を測定した結果を示したものである。
【図１４】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目に炎症反応を観察したもので、気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１５】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目にＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１６】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目にＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用された用語「約」または「実質的に」とは、一般に正確な数字による限定に余地を提供するためのものである。例えば、ペプチド配列の長さを示す文章に使用される場合、「約」または「実質的に」は記載されたアミノ酸の個数に限定されないことを示す。結合活性などの機能的活性が存在する限り、Ｎ末端またはＣ末端に対して添加されるか或いは除去された若干のアミノ酸が含まれ得る。
【００１７】
本明細書で使用された用語「担体(carriers)」は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤であって、使用された濃度および容量で前記物質に露出された細胞または哺乳類に対して毒性がないものを含む。薬学的に許容可能な水溶性ｐＨバッファ溶液の場合もある。薬学的に許容される担体の例として、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファ；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基以下）；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類またはその他の炭化水素類；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；および／またはＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＲＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳのような非イオン性界面活性剤を含むが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書で使用された用語「効果的な量(effective amount)」または「有効量」は有利または所望の臨床的または生化学的結果を示すのに十分な量を意味する。有効量は１回または２回以上投与され得る。本発明の目的のために、活性化合物の有効量は疾病状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、減速化または遅延させるのに十分な量である。本発明の好適な具体例において、「有効量」はＦＰＲ系受容体およびその作用剤の結合を抑制することが可能な化合物の量として定義される。
【００１９】
本明細書で使用された「ＦＰＲ類似体」として、例えばＦＰＲ１(formyl peptide receptor-like 1)、ＦＰＲＬ２などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書で使用された用語「Ｗペプチド」は、ＦＰＲおよびその類似体に高い親和度を有するリガンドを示すものであって、Ｗペプチドアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質を含み、Ｗペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドのできる限り全ての変異体または断片を含む。
【００２１】
以下、添付の図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の具現例および実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は様々な形態に具現でき、ここで説明する具現例および実施例に限定されない。そして、図面において、本発明を明確に説明するために、説明と関係のない部分は省略し、明細書全体にわたって同様の部分に対しては同様の符号を付した。
【００２２】
本発明の一側面は、呼吸器内投与が可能な薬学的および獣医学的許容担体；ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤を提供する。
【００２３】
前記本発明の一具現例において、前記ペプチドは、Ｗペプチドであって、例えばヘキサペプチド(hexapeptide)が挙げられるが、本発明が前記ヘキサペプチドに限定される意図ではない。前記ペプチドはややもっと長いか、もっと短いこともある。前記ペプチドがホルミルペプチド受容体およびその類似受容体媒介信号伝達を拮抗する限り、前記ペプチドは４乃至１５個のアミノ酸からなるか、好ましくは４乃至１０個のアミノ酸、さらに好ましくは４乃至７個のアミノ酸、または約６個のアミノ酸からなり得る。前記本発明の好適な具現例において、前記ペプチドは下記表１に示した配列番号１乃至２８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列から構成され得るが、これに限定されるものではない。下記表１に記載されたペプチドについて、国際特許出願公開ＷＯ／２００５／０７７４１２を参考にすることができる。下記表１において、標準アミノ酸の略語を下記表１で使用し、小文字はＤ−残基を示す。前記ペプチドの作用性誘導体、前駆体または薬学的に許容可能な塩もまた本発明で使用できる。
【００２４】
【表１】
【００２５】
前記本発明の他の具現例において、前記ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列から構成されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００２６】
前記本発明の別の具現例において、前記担体が気体、液体または固体であることもあり得る。
【００２７】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、鼻腔、吸入、呼吸可能、肺内または気管内投与が可能な製剤であることもある。
【００２８】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体の液体粒子または粉末粒子を含むエアロゾルまたはスプレーであることもある。
【００２９】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む実質的に粒径約１０μｍ以下の粒子を含む、吸入可能または呼吸可能製剤であることもある。
【００３０】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む実質的に粒径約１００μｍ以下の粒子を含む、鼻腔、肺内または気管内投与用製剤であってもよい。
【００３１】
本発明の別の側面は、前記本発明の一側面に係る呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキットを提供する。
【００３２】
前記本発明の一具現例において、前記投与装置がエアロゾルまたはスプレー発生器を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
前記本発明の他の具現例において、前記エアロゾル発生器が吸入器を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
前記本発明の別の具現例において、前記吸入器が、予め計量化された製剤の投薬量を運搬するものであることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
前記本発明の別の具現例において、前記吸入器がネブライザー(nebulizer)またはインサフレーター(insufflator)を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
前記本発明の別の具現例において、前記キットは、前記投与装置が圧縮吸入器を含み、前記製剤が水性または非水性液体の懸濁液または溶液、または、水中油または油中水エマルジョンを含むものであり得る。
【００３７】
前記本発明の別の具現例において、前記キットは、貫通できるかもしくは開放可能なカプセル、カートリッジまたはブリスターでありうる、カプセル、カートリッジまたはブリスターとして提供されるものであり得る。
【００３８】
前記本発明の別の具現例において、前記投与装置は、加圧され、プロペラント(propellant)の助けで作動してもよい。
【００３９】
本願発明において、有効成分である前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド、その作用性誘導体、前駆体または薬学的に許容される塩は、吸入、呼吸、鼻腔投与による呼吸システム内にまたは任意の適切な手段として対象の肺内点滴注射で（肺内に）投与でき、好ましくは粉末化されるか、或いは液体鼻腔、肺内、呼吸可能または吸入可能粒子を含有するエアロゾルまたはスプレーを発生させることにより投与される。前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド有効成分を含有する呼吸可能または吸入可能粒子は、呼吸器または肺自体内部へ対象により、すなわち吸入で或いは鼻腔投与で或いは点滴注射で吸入される。例えば、前記呼吸器内投与用薬学製剤は前記ペプチド有効成分の呼吸可能または吸入可能液体または固体粒子を含有することができ、本発明によって、口腔および喉頭を通して通過し吸入され、肺の気管支および肺胞内に持続されるように十分小さいサイズの呼吸可能または吸入可能粒子を含有する。一般的に、前記呼吸器内投与用薬学製剤に含まれた粒子は粒径約１０μｍ以下、例えば、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２乃至約４、約６、約８、約１０μｍの範囲である。さらに具体的には、粒径約０．５乃至約５μｍ以下の粒子は呼吸可能または吸入可能である。エアロゾルまたはスプレー中に含有され、呼吸不可能なサイズの粒子は、喉に沈着され、そして嚥下される傾向がある。エアロゾル中の呼吸不可能なサイズの粒子の量は好ましくは最小化される。鼻腔投与または肺内点滴注射のために、約８、約１０、約２０、約２５乃至約３５、約５０、約１００、約１５０、約２５０および約５００μｍの範囲の粒子サイズが、鼻腔内に滞留保障、または点滴注射をするために、直接肺内に沈着させるのが好ましい。特に新生児および胎児に投与されたとき、液体製剤が呼吸器（鼻）および肺内に噴出し得る。
【００４０】
例えば、エアロゾルタイプの呼吸器内投与用薬学製剤を製造するために、前記ペプチド有効成分を安定してビヒクル(vehicle)、例えばパイロジェンフリー無菌水と組み合わせることによって製造できる。或いは、微小化された前記ペプチド有効成分の呼吸可能乾燥粒子を含有する固体微粒子組成物は、乾燥活性化合物を臼と杵で粉砕することにより、その後４００メッシュスクリーンを通された組成物を通過させることによって、大きい塊を粉砕または分離させて製造できる。前記ペプチド有効成分を含有する固体微粒子組成物は、選択的にエアロゾルの形成を促進するように提供される分散剤を含み得る。適切な分散剤はラクトースであり、これは任意の適切な比、例えば１：１の重量比で活性化合物と混合できる。前記ペプチド有効成分を含有する液体粒子のエアロゾルは任意の適切な手段、例えばネブライザー(nebulizer)で製造できる［例えば、米国特許４，５０１，７２９参照］。ネブライザーは狭小なベンチュリオルフィス(venture orfice)を通して圧縮気体、典型的に空気または酸素の加速化を手段として或いは超音波振動を手段として、前記ペプチド有効成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾルミストに転換させる、商業上購入することが可能な装置である。ネブライザーに使用するための適切な組成物は液体担体中に前記ペプチド有効成分４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ以下を含有し、典型的に水または薄いアルコール水溶液である担体、好ましくは例えば塩化ナトリウムを追加することによって体液と等張になった担体を含む。選択的追加剤は、もし組成物が無菌で製造されなかったら、保存剤、例えばメチルヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤、芳香剤、揮発性オイル、緩衝剤および界面活性剤を含む。前記ペプチド有効成分を含有する固体粒子のエアロゾルは、同様に任意の固体微粒子薬物エアロゾル発生器として製造できる。固体微粒子薬物を対象に投与するためのエアロゾル発生器は、前述したように呼吸可能な粒子を発生させ、ヒトへの投与に適切な速度で薬物の所定の計量された投薬量を含有するエアロゾル体積で発生させる。そのようなエアロゾル発生器の例としては計量投薬量吸入器およびインサフレーター(insufflator)を含む。
【００４１】
本発明の別の側面は、前記本発明の一側面に係る呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法を提供する。
【００４２】
前記本発明の一具現例において、前記炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法は、前記製剤を前記哺乳動物の鼻腔内、肺内、吸入で或いは呼吸気道内に投与することを含む。
【００４３】
前記本発明の他の具現例において、前記炎症性呼吸器疾患が急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、肺気腫、肺炎、 気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症および肺繊維症よりなる群から選ばれる１種または２種以上であることがあり得るが、これに限定されるものではない。
【００４４】
前記本発明の別の具現例において、前記急性上気道感染症が風邪、急性咽頭炎、急性鼻炎、急性副鼻腔炎、急性扁桃炎、急性喉頭炎、急性喉頭蓋炎および急性気管炎よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることもあり得る。
【００４５】
前記本発明の別の具現例において、前記慢性下気道感染症が慢性気管支炎、彌慢性汎細気管支炎および気管支拡張症よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であってもよい。
【００４６】
前記本発明の別の具現例において、前記疾患がアレルギー性鼻炎を含み得る。前記本発明の別の具現例において、前記疾患がＴｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患を含み得る。
【００４７】
前記本発明の別の具現例において、前記疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含み得る。
【００４８】
本発明によって、前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤は、呼吸器を通して投与されることにより顕著な呼吸器炎症の抑制効果を示して前記炎症性呼吸器疾患の治療または予防の効果を示す。
【００４９】
本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドは、１回量、多重分割投与量(multiple discrete doses)、または連続注入によって投与できる。
【００５０】
本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドは、前記呼吸器内投与用薬学製剤において広い含量範囲内で提供される。例えば、前記ペプチドは、前記呼吸器内投与用薬学製剤の全体に対して約０．００１％、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約９０％、約９８％、または約９９．９９９％の量で含有できる。そして、もし追加薬剤および添加剤などが含まれた場合、前記ペプチドの含量が調整できる。しかし、前記ペプチドの含量の投薬量は対象の年齢、体重および疾病によって異なる。
【００５１】
本発明の前記呼吸器内投与用薬学製剤内に含有される前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド有効成分は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄに属する投与量の水準が本発明の方法のために有用である。一つの具体例において、前記投与量の水準は約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄである。他の具体例において、前記投与量の水準は約１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄである。ある特別な患者のための特定の投与量水準は、使用される特定の有効成分の活性および可能な毒性；患者の年齢、体重、全般的な健康状態(general health)、性別および食餌(diet)；投与時間；排出速度；薬物の組み合わせ；疾病の深刻性；および投与の形態を含む様々な因子に依存して変更されるであろう。典型的に、試験管内の容量−効果の結果は患者投薬のための適切な投与量に対する有用なガイドラインを提供する。また、動物モデルにおける研究は有用である。適切な投与量の水準を決定するために考慮すべき事項は当該分野でよく知られており、一般的な医者が持つ技術に属する。
【００５２】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、これらの実施例によって本発明の範囲が限定されないということは、本発明の属する分野で通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００５３】
［実施例］
以下、実施例および比較例においてＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応を特徴として炎症を引き起こす喘息動物モデルを通してＷＫＹＭＶｍの効能を評価した。
【００５４】
比較例１：腹腔注射で全身投与したＷＫＹＭＶｍ（配列番号４）の効能評価
ＴＨ１＋ＴＨ１７免疫反応を示す喘息モデルを作るために、ＢＡＬＢ／ｃ（雌、６週）マウスの実験群と陽性対照群の各５匹に０、１、２および７日目にアレルゲンとしてのオボアルブミン(ovalbumin、ＯＶＡ)７５μｇと補強剤としてのＬＰＳ(Lipopolysaccharide)１０μｇを麻酔の後に鼻腔に投与して感作(sensitization)した。１４、１５、２１および２２日目にアレルゲン（ＯＶＡ５０μｇ）を麻酔の後、鼻腔に投与(challenge)する際、実験群に属したマウスにはＷＫＹＭＶｍ４ｍｇ／ｋｇを腹腔に注射して全身投与した。この際、陽性対照群に属したマウスにはリン酸化緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline、ＰＢＳ）を腹腔に同量注射した。陰性対照群は、０、１、２および７日目に感作させる過程と、１４、１５、２１、２２日目のアレルゲン投与の際にアレルゲンの代わりに同量の前記リン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用したことを除いて前記陽性対照群と同様にして作った。図１にマウス喘息モデルを用いて作った方法図式的に示した。
【００５５】
最後のアレルゲン投与２４時間後（２３日目）にメタコリンに対する気道過敏性を測定した。マウスをチャンバー(chamber)に入れて噴霧器(nebulizer)を用い、３分間リン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を吸入させた後、非侵襲体プレシスモグラフィー(non-invasive whole body plethysmography)（Ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を用いて３分間ｐｅｎｈ(enhanced pause)値を測定した。同様の方法で濃度６．２５、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｍｌのメタコリンＰＢＳ溶液を順次マウスに吸入させた後、各濃度に対するｐｅｎｈ値を測定した。３分間測定したｐｅｎｈ値の平均を気道閉塞の指標として使用した。
【００５６】
肺炎症は最後のアレルゲン投与６時間後（２２日目）と４８時間後（２４日目）に測定した。２２、２４日目にケタミン(ketamin)とキシラジン(xylazine)とを混合した麻酔液をマウスの腹腔に注射して麻酔した後、胸部を切開し気管を露出させてカテーテルを気道に挿入し、結紮させた。無菌性リン酸化緩衝生理食塩水を１ｍＬずつ２回注入し、気道を洗浄して気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid、以下「ＢＡＬ液」という）を得た。そして、肺組織内Ｔリンパ球の分析のために肺を摘出し、局所リンパ節から細胞を抽出した。
【００５７】
ＢＡＬ液を摂氏４度で３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、セルペレット(cell pellet)をＰＢＳ溶液に溶かした。前記セルペレットをサイトスピン(cytospin)してスライドに塗抹し、ディフ・クイック(Diff Quick)染色を施行して光学顕微鏡１０００倍視野で３００個以上の炎症細胞を観察し、マクロファージ(Macrophage)、リンパ球(Lymphocyte)、好中球(Neutrophil)、好酸球(Eosinophil)に分類して各炎症細胞数を測定した。また、ＢＡＬ液における、Ｔｈ１炎症反応を反映するサイトカインとしてのγ−インターフェロン、インターフェロン−ｇ−誘導タンパク質１０[interferon-g-inducible protein 10(IP-10)]、ＩＬ−１２、Ｔｈ２炎症反応を反映するインターロイキン（ＩＬ）＿４[interleukin(IL)-4]、ＩＬ−１３、Ｔｈ１７炎症反応を反映するＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、そしてＴｈ２およびＴｈ２７炎症反応を反映するＴＧＦ−βをＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００５８】
摘出した肺組織をコラゲナーゼ(collagenase)タイプＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で処理して細胞を分離した。細胞の表面を蛍光物質が府着されたａｎｔｉ−ＣＤ３、ａｎｔｉ−ＣＤ４、ａｎｔｉ−ＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した後、トリトン(triton)で細胞膜に穿孔を行い、ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ、ａｎｔｉ−ＩＬ−１７、ａｎｔｉ−ＩＬ−１０、およびａｎｔｉ−ＩＬ−４で細胞内サイトカイン染色(intracellular cytokine staining)を行った。発現分析は、蛍光標識細胞スキャナ(fluorescence activated cell scanner)としてのＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、肺に流入したＴリンパ球の種類を決定した。
【００５９】
リンパ節から得た細胞をＯＶＡ１００μｇ／ｍＬ濃度のリン酸化緩衝生理食塩水溶液で７２時間培養した後、溶液に含まれたＴｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２炎症反応を反映するサイトカインとしてのγ−インターフェロン、ＩＬ−１７、ＩＬ−４などをＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００６０】
図２は最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に測定した結果を示す。ＢＡＬ液内の炎症細胞数は、ＯＶＡとＬＰＳで共に感作させた喘息モデルが、腹腔内薬物投与に関係なく、アレルゲン単独で感作させた陰性対照群に比べて増加した（図２）。アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群では偽薬を全身投与した陽性対照群に比べて炎症細胞の数が増加した。これと共に、肺組織から分離した炎症細胞におけるγ−インターフェロンの分泌も増加した（図３ａ）。これはＢＡＬ液内のＩＰ−１０（図３ｂ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図３ｃ）の分泌増加に同伴した。また、肺組織から分離した炎症細胞でＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞も増加し（図４ａ）、ＢＡＬ液内のＩＬ−１７分泌も増加した（図４ｂ）。このような変化はＢＡＬ液内のＩＬ−１７のダウンストリーム分子(downstream molecule)として思われるＩＬ−６（図５ａ）およびＴＮＦ−α（図５ｂ）の分泌増加に同伴した。
【００６１】
図６と図７は最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した結果を示す。図６に示すように、肺炎症の指標であるＢＡＬ液内の炎症細胞数は、アレルゲンと共にＬＰＳで感作させた場合が、アレルゲン単独で投与した陰性対照群に比べて増加したが、アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群と、偽薬を全身投与した陽性対照群とは差異がなかった。また、図７に示すように、ＢＡＬ液でＥＬＩＳＡ方法によって測定したサイトカインＩＬ−１２ｐ４０（図７ａ）、ＴＧＦ−β（図７ｂ）の量も、アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群と、偽薬を全身投与した陽性対照群とは差異がなかった。ＩＬ−１２ｐ４０濃度はＴｈ１免疫反応の度合いを、ＴＧＦ−β濃度はＴｈ１７／Ｔｈ２免疫反応の度合いをそれぞれ示すため、肺炎症に変化がないことが分かる。
【００６２】
実施例１：鼻腔に投与したＷＫＹＭＶｍ（配列番号：４）の効能評価
ＷＫＹＭＶｍを腹腔に注射して全身投与する代わりに、鼻腔に投与して比較例と同様に効能を評価した。１４、１５、２１および２２日目にアレルゲン［ＯＶＡ５０μｇ］をＷＫＹＭＶｍ２００μｇ／ｋｇと共に鼻腔に投与(challenge)した。その他の手続きは前記比較例と同様にした。
【００６３】
図８乃至図１２は最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に測定した結果を示した。ＢＡＬ液内の炎症細胞数は、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群と、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群との間に差異がなかった（図８）。免疫学的指標の変化をみれば、アレルゲンとＬＰＳで感作させた場合、陰性対照群に比べてＴｈ１免疫反応の場合に局所リンパ節から分離した免疫細胞における、体外(in vitro)にてアレルゲンで刺激するときのγ−インターフェロンの分泌は、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群が、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群に比べて増加し（図９ａ）、肺組織から分離した炎症細胞において、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群が、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群に比べて、γ−インターフェロンを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞数も増加した（図９ｂ）。ところが、ＢＡＬ液内のγ−インターフェロンの分泌は、実験群が陽性対照群に比べて減少した（図９ｃ）。Ｔｈ１７面積反応の場合、局所リンパ節から分離した免疫細胞における、体外でアレルゲンで刺激するときのＩＬ−１７の分泌は、実験群が陽性対照群に比べて増加し（図１０ａ）、肺組織から分離した炎症細胞における、ＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実験群が陽性対照群に比べて増加した（図１０ｂ）。ところが、ＢＡＬ液で測定したＩＬ−１７の分泌は、実験群が陽性対照群に比べて減少した（図１０ｃ）。一方、Ｔｈ２サイトカインの場合、実験群では陽性対照群に比べて肺組織内のＴ細胞での発現が減少したが（図１１ａ）、ＩＬ−１０の場合には却って増加した（図１１ｂ）。これと共に、炎症細胞の浸潤後に炎症が増幅する後期炎症反応と関連のある炎症媒介体の分泌様相をみれば、γ−インターフェロンのダウンストリーム分子ＩＰ−１０（図１２ａ）とＩＬ−１２ｐ４０（図１２ｂ）の分泌は実験群が陽性対照群に比べて減少し、ＩＬ−１７のダウンストリーム分子として思われるＴＮＦ−α（図１２ｃ）とＩＬ−１β（図１２ｄ）の分泌も実験群が陽性対照群に比べて減少した。また、Ｔｈ１およびＴｈ１７サイトカインによって誘導される炎症誘発サイトカイン(chemokine)としてのＭＣＰ−１（図１２ｅ）、ＭＩＰ−１ａ（図１２ｆ）の分泌も、実験群が陽性対照群に比べて減少した。
【００６４】
図１３は最後のアレルゲン投与２４時間後である２３日目に測定した気道過敏性の結果である。鼻腔にＷＫＹＭＶｍを投与した実験群では、気道閉塞の指標であるＰｅｎｈが陽性対照群に比べて減少した（図１３）。図１４乃至、図１６は最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した結果である。肺炎症の指標であるＢＡＬ液内の炎症細胞数(BAL cellularity)も実験群が陽性対照群に比べて有意に減少した（図１４）。また、ＢＡＬ液におけるＴｈ１７免疫反応の指標であるＩＬ−１７分泌は、実験群が陽性対照群に比べて増加したが（図１５ａ）、ＩＬ−１７によって浸潤した炎症細胞から分泌されるＴＧＦ−βの分泌は、実験群が陽性対照群に比べて有意に減少した（図１５ｂ）。また、Ｔｈ１免疫反応の結果により浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインＩＬ−１２ｐ４０（図１６ａ）とＩＰ−１０（図１６ｂ）の分泌も、実験群が陽性対照群に比べて減少した。
【００６５】
以上の結果をまとめると、ＷＫＹＭＶｍを鼻腔を通して気道に直接投与した場合は、腹腔注射によって全身投与した場合とは異なり、気道過敏性と肺炎症を抑制する効果に優れた。これは、免疫学的にＴｈ１、Ｔｈ１７免疫反応を亢進させると同時にＴｈ２免疫反応を抑制することで、既存の免疫調節剤が持っている副作用により問題となっている局所的Ｔｈ１およびＴｈ１７免疫反応の抑制による感染などを減らすことができ、また、肺炎症により発生する喘息および慢性閉塞性肺疾患などの病因に関連して、Ｔｈ１およびＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性媒介体分泌を抑制することで、抗炎症効果を示すものと判断することができる。
【００６６】
前述した本発明の説明は例示するためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想または必須的な特徴を変更することなく、様々な具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるはずである。よって、上述した実施例は全ての面において例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一型に説明されている各構成要素は分散して実施されてもよいし、同様に分散したものとして説明されている構成要素も結合して実施されてもよい。
【００６７】
本発明の範囲は前記詳細な説明より後述の特許請求の範囲によって定められるもので、特許請求の範囲の意味および範囲並びにその均等概念から導出される全ての変更または変形形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤は、顕著な呼吸器炎症抑制効果を示すので、炎症性呼吸器疾患の治療または予防に有用であると期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤、前記製剤を用いて炎症性呼吸器疾患を治療または予防する方法、および前記製剤を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器疾患は一般に炎症を随伴し、これは気管支や肺などの状態を悪化させる。これに関連して、炎症性呼吸器疾患としては急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔塩、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、慢性気管支炎、肺気腫、肺炎、気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症、肺繊維症などがある。
【０００３】
よって、呼吸器の炎症を抑えることにより前記炎症性呼吸器疾患を治療または予防することができるが、依然として、満足すべき薬効を持つ、炎症性呼吸器疾患を治療または予防する薬剤の開発が要求されている。
【０００４】
一方、人体は、食細胞、特に好中球(neutrophil)および単球(monocyte)に対する化学誘引物質として、バクテリアから生産されたＮ−ホルミルメチオニルペプチドを用いて、バクテリアの感染に対する防御メカニズムを開発するように進化した。Ｎ−ホルミルペプチドのうち、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰ）が食細胞を補充し、好中球によるリソソーム性酵素の放出を促進するという能力面で最も効能があるものと確認された[Showell et al., J, Exp. Med, 143:1154-1169, 1976]。また、合成テトラペプチド、特にｆ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕおよびｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅは以後に好中球反応を誘発させるものと明らかになった[Rot et al., Proc. Natl, Acad, Scie, USA 84:7967-7971, 1987]。初期に、前記ペプチドの効能は１）Ｎ末端のホルミルグループ、２）メチオニン側鎖、並びに３）ロイシンおよびフェニルアラニン側鎖に起因するものと思われた。
【０００５】
Ｎ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ＝formyl peptide receptor）は細胞外空間または細胞内空間に露出された親水性配列によって連結された原形質膜に置かれた７つの疎水性領域を含む(Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633, 1994)。第１および第３の細胞内ループ(loop)は、相対的に小さく、それぞれ５つおよび６つのアミノ酸から構成される。カルボキシル末端は細胞内空間に露出されるが、Ｎ末端は細胞外空間に露出される。また、細胞内配列はＧ−タンパク質−結合領域（受容体の作用に必須的な領域）および潜在性リン酸化領域を含む。
【０００６】
６つのアミノ酸からなるＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ｄ−Ｍｅｔ（ＷＫＹＭＶｍ；配列番号４）がＦＰＲ(formyl peptide receptor)およびその類似体ＦＰＲＬ１(formyl peptide receptor-like 1)に結合するものと知られており、ＷＫＹＭＶｍは広い範囲の受容体に対して高い親和度を持つ短いペプチドであるから、ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１媒介信号伝達の研究に有用でありうる[国際特許出願公開ＷＯ／２００５／０７７４１２；Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105); Bae YS et al., Journal of Leukocyte Biology 71(2): 329-338 (2002); Christophe T et al., Journal of Biological Chemistry 276(24): 21585-21593 (2001); He R et al., Journal of Immunology 165(8): 4598-4605 (2000); Li BQ et al., Blood 97(10): 2941-2947 (2001); Seo JK et al., Journal of Immunology 158(4): 1895-1901 (1997); Seo JK et al., Clinical Biochemistry 31(3): 137-141 (1998)]。
【０００７】
ところが、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを疾病の治療に用いた例は多くない。ＷＫＹＭＶｍ（配列番号：４）を用いて白血病患者または化学治療を受けた癌患者がバクテリアに対する抵抗力を高めたと報告された[H. Kim et al., Leukemia Research 32(5):717-725 (2008); H. Kim et al., Experimental Hematology 34(4):407-413 (2006)]。ＷＫＹＭＶｍおよびこれとアミノ酸配列が類似したペプチドを用いて免疫反応を調節する方法が報告された［ＷＯ２００５／０７７４１２］。ところが、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するＷＫＹＭＶｍなどのペプチドを呼吸器の炎症抑制に使用した例は知られておらず、特に、他の投与経路に比べて、呼吸器内に投与することにより呼吸器の炎症を顕著に抑制することができることについてはまだ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用する特定のペプチドを呼吸器を通して投与する場合、顕著な呼吸器の炎症抑制効果を示して炎症性呼吸器疾患の治療または予防に顕著な効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
そこで、本発明の技術的課題は、ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤、前記製剤を含むキット、および前記製剤を呼吸器内に投与することにより呼吸器の炎症を抑制して炎症性呼吸器疾患を治療または予防することが可能な方法を提供することにある。
【００１０】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は上述した課題に限定されず、言及されていない別の課題は下記の記載から当業者にとって明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のある側面は、呼吸器内投与が可能な薬学的または獣医学的許容担；およびホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面は、前記呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明の別の側面は、前記呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
マウスモデルにおいて、ＦＰＲに作用するペプチドを腹腔に注射して全身投与した場合には呼吸器の炎症抑制効果がなかったが、ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤を吸入によって呼吸器に投与した場合には呼吸器炎症抑制効果が顕著に示された。よって、前記ペプチドを注射で全身投与する場合と比べて、本発明によって直接呼吸器に投与することにより呼吸器炎症抑制効果が顕著に向上する。それ故に、このような本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用する特定のペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤を呼吸器を通して投与する場合、顕著な呼吸器炎症抑制効果を示して炎症性呼吸器疾患の治療または予防に顕著な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｔｈ１＋Ｔｈ１７免疫反応を示す喘息モデルをマウスを用いて作った方法を図式的に示す。
【図２】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に炎症反応を観察したもので、気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数から得た結果を示す。
【図３】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１免疫反応を観察したもので、肺組織および気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの発現結果を示したものである。
【図４】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応を観察したもので、肺組織および気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの発現結果を示したものである。
【図５】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応およびＩＬ−１７によって浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインを気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図６】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した炎症反応を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図７】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの腹腔に注射して全身投与し、最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目にＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図８】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目に気管支肺胞洗浄液で測定した炎症反応結果を示したものである。
【図９】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１免疫反応を観察したもので、局所リンパ節、肺組織および気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１０】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１７免疫反応を観察したもので、局所リンパ節、肺組織および気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１１】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ２免疫反応などを観察したもので、肺組織で測定した結果を示したものである。
【図１２】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２１日目のアレルゲン投与の６時間後である２２日目にＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応による炎症細胞の浸潤および浸潤された炎症細胞から分泌される炎症性媒介体の分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１３】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の２４時間後である２３日目に気管支過敏性を測定した結果を示したものである。
【図１４】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目に炎症反応を観察したもので、気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１５】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目にＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【図１６】ＦＰＲに作用するペプチドをマウス喘息モデルの鼻腔に吸入させて投与し、２２日目のアレルゲン投与の４８時間後である２４日目にＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用された用語「約」または「実質的に」とは、一般に正確な数字による限定に余地を提供するためのものである。例えば、ペプチド配列の長さを示す文章に使用される場合、「約」または「実質的に」は記載されたアミノ酸の個数に限定されないことを示す。結合活性などの機能的活性が存在する限り、Ｎ末端またはＣ末端に対して添加されるか或いは除去された若干のアミノ酸が含まれ得る。
【００１７】
本明細書で使用された用語「担体(carriers)」は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤であって、使用された濃度および容量で前記物質に露出された細胞または哺乳類に対して毒性がないものを含む。薬学的に許容可能な水溶性ｐＨバッファ溶液の場合もある。薬学的に許容される担体の例として、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファ；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基以下）；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類またはその他の炭化水素類；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；および／またはＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＲＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳのような非イオン性界面活性剤を含むが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書で使用された用語「効果的な量(effective amount)」または「有効量」は有利または所望の臨床的または生化学的結果を示すのに十分な量を意味する。有効量は１回または２回以上投与され得る。本発明の目的のために、活性化合物の有効量は疾病状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、減速化または遅延させるのに十分な量である。本発明の好適な具体例において、「有効量」はＦＰＲ系受容体およびその作用剤の結合を抑制することが可能な化合物の量として定義される。
【００１９】
本明細書で使用された「ＦＰＲ類似体」として、例えばＦＰＲ１(formyl peptide receptor-like 1)、ＦＰＲＬ２などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書で使用された用語「Ｗペプチド」は、ＦＰＲおよびその類似体に高い親和度を有するリガンドを示すものであって、Ｗペプチドアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質を含み、Ｗペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドのできる限り全ての変異体または断片を含む。
【００２１】
以下、添付の図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の具現例および実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は様々な形態に具現でき、ここで説明する具現例および実施例に限定されない。そして、図面において、本発明を明確に説明するために、説明と関係のない部分は省略し、明細書全体にわたって同様の部分に対しては同様の符号を付した。
【００２２】
本発明の一側面は、呼吸器内投与が可能な薬学的および獣医学的許容担体；ホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤を提供する。
【００２３】
前記本発明の一具現例において、前記ペプチドは、Ｗペプチドであって、例えばヘキサペプチド(hexapeptide)が挙げられるが、本発明が前記ヘキサペプチドに限定される意図ではない。前記ペプチドはややもっと長いか、もっと短いこともある。前記ペプチドがホルミルペプチド受容体およびその類似受容体媒介信号伝達を拮抗する限り、前記ペプチドは４乃至１５個のアミノ酸からなるか、好ましくは４乃至１０個のアミノ酸、さらに好ましくは４乃至７個のアミノ酸、または約６個のアミノ酸からなり得る。前記本発明の好適な具現例において、前記ペプチドは下記表１に示した配列番号１乃至２８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列から構成され得るが、これに限定されるものではない。下記表１に記載されたペプチドについて、国際特許出願公開ＷＯ／２００５／０７７４１２を参考にすることができる。下記表１において、標準アミノ酸の略語を下記表１で使用し、小文字はＤ−残基を示す。前記ペプチドの作用性誘導体、前駆体または薬学的に許容可能な塩もまた本発明で使用できる。
【００２４】
【表１】
【００２５】
前記本発明の他の具現例において、前記ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列から構成されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００２６】
前記本発明の別の具現例において、前記担体が気体、液体または固体であることもあり得る。
【００２７】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、鼻腔、吸入、呼吸可能、肺内または気管内投与が可能な製剤であることもある。
【００２８】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体の液体粒子または粉末粒子を含むエアロゾルまたはスプレーであることもある。
【００２９】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む実質的に粒径約１０μｍ以下の粒子を含む、吸入可能または呼吸可能製剤であることもある。
【００３０】
前記本発明の別の具現例において、前記呼吸器内投与用薬学製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む実質的に粒径約１００μｍ以下の粒子を含む、鼻腔、肺内または気管内投与用製剤であってもよい。
【００３１】
本発明の別の側面は、前記本発明の一側面に係る呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキットを提供する。
【００３２】
前記本発明の一具現例において、前記投与装置がエアロゾルまたはスプレー発生器を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
前記本発明の他の具現例において、前記エアロゾル発生器が吸入器を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
前記本発明の別の具現例において、前記吸入器が、予め計量化された製剤の投薬量を運搬するものであることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
前記本発明の別の具現例において、前記吸入器がネブライザー(nebulizer)またはインサフレーター(insufflator)を含んでいることもあるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
前記本発明の別の具現例において、前記キットは、前記投与装置が圧縮吸入器を含み、前記製剤が水性または非水性液体の懸濁液または溶液、または、水中油または油中水エマルジョンを含むものであり得る。
【００３７】
前記本発明の別の具現例において、前記キットは、貫通できるかもしくは開放可能なカプセル、カートリッジまたはブリスターでありうる、カプセル、カートリッジまたはブリスターとして提供されるものであり得る。
【００３８】
前記本発明の別の具現例において、前記投与装置は、加圧され、プロペラント(propellant)の助けで作動してもよい。
【００３９】
本願発明において、有効成分である前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド、その作用性誘導体、前駆体または薬学的に許容される塩は、吸入、呼吸、鼻腔投与による呼吸システム内にまたは任意の適切な手段として対象の肺内点滴注射で（肺内に）投与でき、好ましくは粉末化されるか、或いは液体鼻腔、肺内、呼吸可能または吸入可能粒子を含有するエアロゾルまたはスプレーを発生させることにより投与される。前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド有効成分を含有する呼吸可能または吸入可能粒子は、呼吸器または肺自体内部へ対象により、すなわち吸入で或いは鼻腔投与で或いは点滴注射で吸入される。例えば、前記呼吸器内投与用薬学製剤は前記ペプチド有効成分の呼吸可能または吸入可能液体または固体粒子を含有することができ、本発明によって、口腔および喉頭を通して通過し吸入され、肺の気管支および肺胞内に持続されるように十分小さいサイズの呼吸可能または吸入可能粒子を含有する。一般的に、前記呼吸器内投与用薬学製剤に含まれた粒子は粒径約１０μｍ以下、例えば、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２乃至約４、約６、約８、約１０μｍの範囲である。さらに具体的には、粒径約０．５乃至約５μｍ以下の粒子は呼吸可能または吸入可能である。エアロゾルまたはスプレー中に含有され、呼吸不可能なサイズの粒子は、喉に沈着され、そして嚥下される傾向がある。エアロゾル中の呼吸不可能なサイズの粒子の量は好ましくは最小化される。鼻腔投与または肺内点滴注射のために、約８、約１０、約２０、約２５乃至約３５、約５０、約１００、約１５０、約２５０および約５００μｍの範囲の粒子サイズが、鼻腔内に滞留保障、または点滴注射をするために、直接肺内に沈着させるのが好ましい。特に新生児および胎児に投与されたとき、液体製剤が呼吸器（鼻）および肺内に噴出し得る。
【００４０】
例えば、エアロゾルタイプの呼吸器内投与用薬学製剤を製造するために、前記ペプチド有効成分を安定してビヒクル(vehicle)、例えばパイロジェンフリー無菌水と組み合わせることによって製造できる。或いは、微小化された前記ペプチド有効成分の呼吸可能乾燥粒子を含有する固体微粒子組成物は、乾燥活性化合物を臼と杵で粉砕することにより、その後４００メッシュスクリーンを通された組成物を通過させることによって、大きい塊を粉砕または分離させて製造できる。前記ペプチド有効成分を含有する固体微粒子組成物は、選択的にエアロゾルの形成を促進するように提供される分散剤を含み得る。適切な分散剤はラクトースであり、これは任意の適切な比、例えば１：１の重量比で活性化合物と混合できる。前記ペプチド有効成分を含有する液体粒子のエアロゾルは任意の適切な手段、例えばネブライザー(nebulizer)で製造できる［例えば、米国特許４，５０１，７２９参照］。ネブライザーは狭小なベンチュリオルフィス(venture orfice)を通して圧縮気体、典型的に空気または酸素の加速化を手段として或いは超音波振動を手段として、前記ペプチド有効成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾルミストに転換させる、商業上購入することが可能な装置である。ネブライザーに使用するための適切な組成物は液体担体中に前記ペプチド有効成分４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ以下を含有し、典型的に水または薄いアルコール水溶液である担体、好ましくは例えば塩化ナトリウムを追加することによって体液と等張になった担体を含む。選択的追加剤は、もし組成物が無菌で製造されなかったら、保存剤、例えばメチルヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤、芳香剤、揮発性オイル、緩衝剤および界面活性剤を含む。前記ペプチド有効成分を含有する固体粒子のエアロゾルは、同様に任意の固体微粒子薬物エアロゾル発生器として製造できる。固体微粒子薬物を対象に投与するためのエアロゾル発生器は、前述したように呼吸可能な粒子を発生させ、ヒトへの投与に適切な速度で薬物の所定の計量された投薬量を含有するエアロゾル体積で発生させる。そのようなエアロゾル発生器の例としては計量投薬量吸入器およびインサフレーター(insufflator)を含む。
【００４１】
本発明の別の側面は、前記本発明の一側面に係る呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法を提供する。
【００４２】
前記本発明の一具現例において、前記炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法は、前記製剤を前記哺乳動物の鼻腔内、肺内、吸入で或いは呼吸気道内に投与することを含む。
【００４３】
前記本発明の他の具現例において、前記炎症性呼吸器疾患が急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、肺気腫、肺炎、 気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症および肺繊維症よりなる群から選ばれる１種または２種以上であることがあり得るが、これに限定されるものではない。
【００４４】
前記本発明の別の具現例において、前記急性上気道感染症が風邪、急性咽頭炎、急性鼻炎、急性副鼻腔炎、急性扁桃炎、急性喉頭炎、急性喉頭蓋炎および急性気管炎よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることもあり得る。
【００４５】
前記本発明の別の具現例において、前記慢性下気道感染症が慢性気管支炎、彌慢性汎細気管支炎および気管支拡張症よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であってもよい。
【００４６】
前記本発明の別の具現例において、前記疾患がアレルギー性鼻炎を含み得る。前記本発明の別の具現例において、前記疾患がＴｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患を含み得る。
【００４７】
前記本発明の別の具現例において、前記疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含み得る。
【００４８】
本発明によって、前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤は、呼吸器を通して投与されることにより顕著な呼吸器炎症の抑制効果を示して前記炎症性呼吸器疾患の治療または予防の効果を示す。
【００４９】
本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドは、１回量、多重分割投与量(multiple discrete doses)、または連続注入によって投与できる。
【００５０】
本発明の前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチドは、前記呼吸器内投与用薬学製剤において広い含量範囲内で提供される。例えば、前記ペプチドは、前記呼吸器内投与用薬学製剤の全体に対して約０．００１％、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約９０％、約９８％、または約９９．９９９％の量で含有できる。そして、もし追加薬剤および添加剤などが含まれた場合、前記ペプチドの含量が調整できる。しかし、前記ペプチドの含量の投薬量は対象の年齢、体重および疾病によって異なる。
【００５１】
本発明の前記呼吸器内投与用薬学製剤内に含有される前記ＦＰＲまたはその類似受容体に作用するペプチド有効成分は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄに属する投与量の水準が本発明の方法のために有用である。一つの具体例において、前記投与量の水準は約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄである。他の具体例において、前記投与量の水準は約１ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄである。ある特別な患者のための特定の投与量水準は、使用される特定の有効成分の活性および可能な毒性；患者の年齢、体重、全般的な健康状態(general health)、性別および食餌(diet)；投与時間；排出速度；薬物の組み合わせ；疾病の深刻性；および投与の形態を含む様々な因子に依存して変更されるであろう。典型的に、試験管内の容量−効果の結果は患者投薬のための適切な投与量に対する有用なガイドラインを提供する。また、動物モデルにおける研究は有用である。適切な投与量の水準を決定するために考慮すべき事項は当該分野でよく知られており、一般的な医者が持つ技術に属する。
【００５２】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、これらの実施例によって本発明の範囲が限定されないということは、本発明の属する分野で通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００５３】
［実施例］
以下、実施例および比較例においてＴｈ１およびＴｈ１７免疫反応を特徴として炎症を引き起こす喘息動物モデルを通してＷＫＹＭＶｍの効能を評価した。
【００５４】
比較例１：腹腔注射で全身投与したＷＫＹＭＶｍ（配列番号４）の効能評価
ＴＨ１＋ＴＨ１７免疫反応を示す喘息モデルを作るために、ＢＡＬＢ／ｃ（雌、６週）マウスの実験群と陽性対照群の各５匹に０、１、２および７日目にアレルゲンとしてのオボアルブミン(ovalbumin、ＯＶＡ)７５μｇと補強剤としてのＬＰＳ(Lipopolysaccharide)１０μｇを麻酔の後に鼻腔に投与して感作(sensitization)した。１４、１５、２１および２２日目にアレルゲン（ＯＶＡ５０μｇ）を麻酔の後、鼻腔に投与(challenge)する際、実験群に属したマウスにはＷＫＹＭＶｍ４ｍｇ／ｋｇを腹腔に注射して全身投与した。この際、陽性対照群に属したマウスにはリン酸化緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline、ＰＢＳ）を腹腔に同量注射した。陰性対照群は、０、１、２および７日目に感作させる過程と、１４、１５、２１、２２日目のアレルゲン投与の際にアレルゲンの代わりに同量の前記リン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用したことを除いて前記陽性対照群と同様にして作った。図１にマウス喘息モデルを用いて作った方法図式的に示した。
【００５５】
最後のアレルゲン投与２４時間後（２３日目）にメタコリンに対する気道過敏性を測定した。マウスをチャンバー(chamber)に入れて噴霧器(nebulizer)を用い、３分間リン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を吸入させた後、非侵襲体プレシスモグラフィー(non-invasive whole body plethysmography)（Ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を用いて３分間ｐｅｎｈ(enhanced pause)値を測定した。同様の方法で濃度６．２５、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｍｌのメタコリンＰＢＳ溶液を順次マウスに吸入させた後、各濃度に対するｐｅｎｈ値を測定した。３分間測定したｐｅｎｈ値の平均を気道閉塞の指標として使用した。
【００５６】
肺炎症は最後のアレルゲン投与６時間後（２２日目）と４８時間後（２４日目）に測定した。２２、２４日目にケタミン(ketamin)とキシラジン(xylazine)とを混合した麻酔液をマウスの腹腔に注射して麻酔した後、胸部を切開し気管を露出させてカテーテルを気道に挿入し、結紮させた。無菌性リン酸化緩衝生理食塩水を１ｍＬずつ２回注入し、気道を洗浄して気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid、以下「ＢＡＬ液」という）を得た。そして、肺組織内Ｔリンパ球の分析のために肺を摘出し、局所リンパ節から細胞を抽出した。
【００５７】
ＢＡＬ液を摂氏４度で３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、セルペレット(cell pellet)をＰＢＳ溶液に溶かした。前記セルペレットをサイトスピン(cytospin)してスライドに塗抹し、ディフ・クイック(Diff Quick)染色を施行して光学顕微鏡１０００倍視野で３００個以上の炎症細胞を観察し、マクロファージ(Macrophage)、リンパ球(Lymphocyte)、好中球(Neutrophil)、好酸球(Eosinophil)に分類して各炎症細胞数を測定した。また、ＢＡＬ液における、Ｔｈ１炎症反応を反映するサイトカインとしてのγ−インターフェロン、インターフェロン−ｇ−誘導タンパク質１０[interferon-g-inducible protein 10(IP-10)]、ＩＬ−１２、Ｔｈ２炎症反応を反映するインターロイキン（ＩＬ）＿４[interleukin(IL)-4]、ＩＬ−１３、Ｔｈ１７炎症反応を反映するＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、そしてＴｈ２およびＴｈ２７炎症反応を反映するＴＧＦ−βをＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００５８】
摘出した肺組織をコラゲナーゼ(collagenase)タイプＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で処理して細胞を分離した。細胞の表面を蛍光物質が府着されたａｎｔｉ−ＣＤ３、ａｎｔｉ−ＣＤ４、ａｎｔｉ−ＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した後、トリトン(triton)で細胞膜に穿孔を行い、ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ、ａｎｔｉ−ＩＬ−１７、ａｎｔｉ−ＩＬ−１０、およびａｎｔｉ−ＩＬ−４で細胞内サイトカイン染色(intracellular cytokine staining)を行った。発現分析は、蛍光標識細胞スキャナ(fluorescence activated cell scanner)としてのＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、肺に流入したＴリンパ球の種類を決定した。
【００５９】
リンパ節から得た細胞をＯＶＡ１００μｇ／ｍＬ濃度のリン酸化緩衝生理食塩水溶液で７２時間培養した後、溶液に含まれたＴｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２炎症反応を反映するサイトカインとしてのγ−インターフェロン、ＩＬ−１７、ＩＬ−４などをＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００６０】
図２は最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に測定した結果を示す。ＢＡＬ液内の炎症細胞数は、ＯＶＡとＬＰＳで共に感作させた喘息モデルが、腹腔内薬物投与に関係なく、アレルゲン単独で感作させた陰性対照群に比べて増加した（図２）。アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群では偽薬を全身投与した陽性対照群に比べて炎症細胞の数が増加した。これと共に、肺組織から分離した炎症細胞におけるγ−インターフェロンの分泌も増加した（図３ａ）。これはＢＡＬ液内のＩＰ−１０（図３ｂ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図３ｃ）の分泌増加に同伴した。また、肺組織から分離した炎症細胞でＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞も増加し（図４ａ）、ＢＡＬ液内のＩＬ−１７分泌も増加した（図４ｂ）。このような変化はＢＡＬ液内のＩＬ−１７のダウンストリーム分子(downstream molecule)として思われるＩＬ−６（図５ａ）およびＴＮＦ−α（図５ｂ）の分泌増加に同伴した。
【００６１】
図６と図７は最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した結果を示す。図６に示すように、肺炎症の指標であるＢＡＬ液内の炎症細胞数は、アレルゲンと共にＬＰＳで感作させた場合が、アレルゲン単独で投与した陰性対照群に比べて増加したが、アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群と、偽薬を全身投与した陽性対照群とは差異がなかった。また、図７に示すように、ＢＡＬ液でＥＬＩＳＡ方法によって測定したサイトカインＩＬ−１２ｐ４０（図７ａ）、ＴＧＦ−β（図７ｂ）の量も、アレルゲンとＬＰＳで感作させたマウスにおいて、Ｗペプチドを全身投与した実験群と、偽薬を全身投与した陽性対照群とは差異がなかった。ＩＬ−１２ｐ４０濃度はＴｈ１免疫反応の度合いを、ＴＧＦ−β濃度はＴｈ１７／Ｔｈ２免疫反応の度合いをそれぞれ示すため、肺炎症に変化がないことが分かる。
【００６２】
実施例１：鼻腔に投与したＷＫＹＭＶｍ（配列番号：４）の効能評価
ＷＫＹＭＶｍを腹腔に注射して全身投与する代わりに、鼻腔に投与して比較例と同様に効能を評価した。１４、１５、２１および２２日目にアレルゲン［ＯＶＡ５０μｇ］をＷＫＹＭＶｍ２００μｇ／ｋｇと共に鼻腔に投与(challenge)した。その他の手続きは前記比較例と同様にした。
【００６３】
図８乃至図１２は最後のアレルゲン投与６時間後である２２日目に測定した結果を示した。ＢＡＬ液内の炎症細胞数は、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群と、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群との間に差異がなかった（図８）。免疫学的指標の変化をみれば、アレルゲンとＬＰＳで感作させた場合、陰性対照群に比べてＴｈ１免疫反応の場合に局所リンパ節から分離した免疫細胞における、体外(in vitro)にてアレルゲンで刺激するときのγ−インターフェロンの分泌は、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群が、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群に比べて増加し（図９ａ）、肺組織から分離した炎症細胞において、Ｗペプチドを鼻腔投与した実験群が、偽薬を鼻腔投与した陽性対照群に比べて、γ−インターフェロンを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞数も増加した（図９ｂ）。ところが、ＢＡＬ液内のγ−インターフェロンの分泌は、実験群が陽性対照群に比べて減少した（図９ｃ）。Ｔｈ１７面積反応の場合、局所リンパ節から分離した免疫細胞における、体外でアレルゲンで刺激するときのＩＬ−１７の分泌は、実験群が陽性対照群に比べて増加し（図１０ａ）、肺組織から分離した炎症細胞における、ＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実験群が陽性対照群に比べて増加した（図１０ｂ）。ところが、ＢＡＬ液で測定したＩＬ−１７の分泌は、実験群が陽性対照群に比べて減少した（図１０ｃ）。一方、Ｔｈ２サイトカインの場合、実験群では陽性対照群に比べて肺組織内のＴ細胞での発現が減少したが（図１１ａ）、ＩＬ−１０の場合には却って増加した（図１１ｂ）。これと共に、炎症細胞の浸潤後に炎症が増幅する後期炎症反応と関連のある炎症媒介体の分泌様相をみれば、γ−インターフェロンのダウンストリーム分子ＩＰ−１０（図１２ａ）とＩＬ−１２ｐ４０（図１２ｂ）の分泌は実験群が陽性対照群に比べて減少し、ＩＬ−１７のダウンストリーム分子として思われるＴＮＦ−α（図１２ｃ）とＩＬ−１β（図１２ｄ）の分泌も実験群が陽性対照群に比べて減少した。また、Ｔｈ１およびＴｈ１７サイトカインによって誘導される炎症誘発サイトカイン(chemokine)としてのＭＣＰ−１（図１２ｅ）、ＭＩＰ−１ａ（図１２ｆ）の分泌も、実験群が陽性対照群に比べて減少した。
【００６４】
図１３は最後のアレルゲン投与２４時間後である２３日目に測定した気道過敏性の結果である。鼻腔にＷＫＹＭＶｍを投与した実験群では、気道閉塞の指標であるＰｅｎｈが陽性対照群に比べて減少した（図１３）。図１４乃至、図１６は最後のアレルゲン投与４８時間後である２４日目に測定した結果である。肺炎症の指標であるＢＡＬ液内の炎症細胞数(BAL cellularity)も実験群が陽性対照群に比べて有意に減少した（図１４）。また、ＢＡＬ液におけるＴｈ１７免疫反応の指標であるＩＬ−１７分泌は、実験群が陽性対照群に比べて増加したが（図１５ａ）、ＩＬ−１７によって浸潤した炎症細胞から分泌されるＴＧＦ−βの分泌は、実験群が陽性対照群に比べて有意に減少した（図１５ｂ）。また、Ｔｈ１免疫反応の結果により浸潤した炎症細胞から分泌されるサイトカインＩＬ−１２ｐ４０（図１６ａ）とＩＰ−１０（図１６ｂ）の分泌も、実験群が陽性対照群に比べて減少した。
【００６５】
以上の結果をまとめると、ＷＫＹＭＶｍを鼻腔を通して気道に直接投与した場合は、腹腔注射によって全身投与した場合とは異なり、気道過敏性と肺炎症を抑制する効果に優れた。これは、免疫学的にＴｈ１、Ｔｈ１７免疫反応を亢進させると同時にＴｈ２免疫反応を抑制することで、既存の免疫調節剤が持っている副作用により問題となっている局所的Ｔｈ１およびＴｈ１７免疫反応の抑制による感染などを減らすことができ、また、肺炎症により発生する喘息および慢性閉塞性肺疾患などの病因に関連して、Ｔｈ１およびＴｈ１７免疫反応によって浸潤した炎症細胞から分泌される炎症性媒介体分泌を抑制することで、抗炎症効果を示すものと判断することができる。
【００６６】
前述した本発明の説明は例示するためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想または必須的な特徴を変更することなく、様々な具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるはずである。よって、上述した実施例は全ての面において例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一型に説明されている各構成要素は分散して実施されてもよいし、同様に分散したものとして説明されている構成要素も結合して実施されてもよい。
【００６７】
本発明の範囲は前記詳細な説明より後述の特許請求の範囲によって定められるもので、特許請求の範囲の意味および範囲並びにその均等概念から導出される全ての変更または変形形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドを含有する呼吸器内投与用薬学製剤は、顕著な呼吸器炎症抑制効果を示すので、炎症性呼吸器疾患の治療または予防に有用であると期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器内投与が可能な薬学的または獣医学的許容担体；およびホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１乃至２８よりなる群から選ばれるアミノ酸の配列から構成されることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列から構成されることを特徴とする、請求項２に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項４】
前記担体が気体、液体または微細粒子粉末である、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項５】
前記製剤は鼻腔投与、吸入可能、呼吸可能、肺内投与または気管内投与が可能な製剤である、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項６】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体の液体または微細粒子粉末を含むエアロゾルまたはスプレーである、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項７】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む粒径１０μｍ以下の粒子を含む吸入可能または呼吸可能製剤である、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項８】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む粒径１００μｍ以下の粒子を含む、鼻腔投与、肺内投与または気管内投与用製剤である、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項９】
請求項１の呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキット。
【請求項１０】
前記投与装置がエアロゾルまたはスプレー発生器を含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記エアロゾル発生器が吸入器を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記吸入器が、予め計量化された製剤の投薬量を運搬することを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記吸入器がネブライザー(nebulizer)またはインサフレーター(insufflator)を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記投与装置が圧縮吸入器を含み、前記製剤が水性または非水性液体の懸濁液または溶液、または、水中油または油中水エマルジョンを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットは、貫通または開放することが可能なカプセル、カートリッジまたはブリスターでありうる、カプセル、カートリッジまたはブリスターとして提供されることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１６】
前記投与装置が加圧され、プロペラント(propellant)の助けで作動することを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１の呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１８】
前記製剤を前記哺乳動物の鼻腔内、肺内、吸入で、または呼吸気道内に投与することを含む、請求項１７に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１９】
前記炎症性呼吸器疾患が、急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔塩、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、肺気腫、肺炎、気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症および肺繊維症よりなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項２０】
前記急性上気道感染症が、風邪、急性咽頭炎、急性鼻炎、急性副鼻腔炎、急性扁桃炎、急性喉頭炎、急性喉頭蓋炎および急性気管炎よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることを特徴とする、請求項１９に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項２１】
前記慢性下気道感染症が、慢性気管支炎、彌慢性汎細気管支炎および気管支拡張症よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることを特徴とする、請求項２０に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１】
呼吸器内投与が可能な薬学的または獣医学的許容担体；およびホルミルペプチド受容体（forymyl peptide receptor、ＦＰＲ）またはその類似受容体に作用するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、呼吸器の炎症を抑制する上で効果的な量で含有する、炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１乃至２８よりなる群から選ばれるアミノ酸の配列から構成されることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列から構成されることを特徴とする、請求項２に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項４】
前記担体が気体、液体または微細粒子粉末である、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項５】
前記製剤は鼻腔投与、吸入可能、呼吸可能、肺内投与または気管内投与が可能な製剤である、請求項１に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項６】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体の液体または微細粒子粉末を含むエアロゾルまたはスプレーである、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項７】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む粒径１０μｍ以下の粒子を含む吸入可能または呼吸可能製剤である、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項８】
前記製剤は、前記ペプチドが担持された担体を含む粒径１００μｍ以下の粒子を含む、鼻腔投与、肺内投与または気管内投与用製剤である、請求項５に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防のための呼吸器内投与用薬学製剤。
【請求項９】
請求項１の呼吸器内投与用薬学製剤および投与装置を含むキット。
【請求項１０】
前記投与装置がエアロゾルまたはスプレー発生器を含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記エアロゾル発生器が吸入器を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記吸入器が、予め計量化された製剤の投薬量を運搬することを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記吸入器がネブライザー(nebulizer)またはインサフレーター(insufflator)を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記投与装置が圧縮吸入器を含み、前記製剤が水性または非水性液体の懸濁液または溶液、または、水中油または油中水エマルジョンを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットは、貫通または開放することが可能なカプセル、カートリッジまたはブリスターでありうる、カプセル、カートリッジまたはブリスターとして提供されることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１６】
前記投与装置が加圧され、プロペラント(propellant)の助けで作動することを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１の呼吸器内投与用薬学製剤を哺乳動物の呼吸器内に投与することを含む、炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１８】
前記製剤を前記哺乳動物の鼻腔内、肺内、吸入で、または呼吸気道内に投与することを含む、請求項１７に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１９】
前記炎症性呼吸器疾患が、急性上気道感染症、Ｔｈ１或いはＴｈ１７免疫反応による炎症性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性副鼻腔塩、アレルギー性鼻炎、慢性下気道感染症、肺気腫、肺炎、気管支喘息、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症および肺繊維症よりなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項２０】
前記急性上気道感染症が、風邪、急性咽頭炎、急性鼻炎、急性副鼻腔炎、急性扁桃炎、急性喉頭炎、急性喉頭蓋炎および急性気管炎よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることを特徴とする、請求項１９に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項２１】
前記慢性下気道感染症が、慢性気管支炎、彌慢性汎細気管支炎および気管支拡張症よりなる群から選ばれる１種または２種以上の疾患であることを特徴とする、請求項２０に記載の炎症性呼吸器疾患の治療または予防方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１２−５２６８００（Ｐ２０１２−５２６８００Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１０７４７（Ｐ２０１２−５１０７４７）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３０１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１９０９
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５１１２７６４１５）ポハン工科大学校 産学協力団 (3)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｓａｎ ３１ｂｅｎｊｉ， Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ， Ｎａｍ−ｇｕ， Ｐｏｈａｎｇ−ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｂｕｋ−ｄｏ ７９０−７８４ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３０１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１９０９
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５１１２７６４１５）ポハン工科大学校 産学協力団 (3)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｓａｎ ３１ｂｅｎｊｉ， Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ， Ｎａｍ−ｇｕ， Ｐｏｈａｎｇ−ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｂｕｋ−ｄｏ ７９０−７８４ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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