無細胞マトリックス接着剤
無細胞マトリックス接着剤及びその作製方法を開示する。具体的には、組織エンジニアリング及びヘルニア修復を含む医療用途のための強化無細胞マトリックスの調製に有用な無細胞マトリックス接着剤である。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
本特許出願は、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｌｕｅ」と題する同一出願人による同日出願の特許出願第ＥＴＨ５４０９ＵＳＮＰ号に関する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概して、天然医用材料分野に関し、より具体的には、バイオグルーのような生体適合性接着剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
長きにわたり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、結合組織の重要な構造成分として認識されてきた。ＥＣＭは、細胞表面に付着している糖タンパク質及びプロテオグリカンの線維状構造であり、細胞の固定物、移動のためのトラクション、及び位置の認識を提供するものとして概して説明される。現在、細胞によって巧妙に作られたＥＣＭがそれら自身と他の細胞を差異化すること、又はそれらの差異化された状態を維持することによって、それら自身及び他の細胞が応答する微小環境を作り出すことを裏付ける、かなりの証拠がある。ＥＣＭは、それに接着している細胞の組織化のための基材を提供する。組織ベースのＥＣＭ医用材料及び機器は、心弁、ブタの小腸粘膜下層（submucusa）（ＳＩＳ）、ヒトの真皮、及びウシの心膜といった様々な医療用途に広く使用されてきた。皮膚、腱、心膜、及びＳＩＳのような同種異系又は異種の結合組織は、無細胞マトリックスと呼ばれる（脱細胞化マトリックスとも呼ばれる場合がある）タイプの細胞外マトリックスを提供するために、既知の従来の方法を使用して脱細胞化（又は失活）される。脱細胞化の間に、組織拒絶反応に至る細胞は取り除かれ、一方、原組織の重要な生化学成分及び構造成分は保持される。
【０００４】
医療機器における特定用途のための無細胞マトリックスの使用は当該技術分野で既知である。一例は、軟組織の付着、補強、又は構築のための人工生体装置である。これらの装置は、天然生成細胞外マトリックスシートと、この天然生成細胞外マトリックスの部分に結合する合成メッシュシートとを有する。移植組織片を減圧下で乾燥させて、ＳＩＳのラミネート間及びメッシュと隣接ＳＩＳラミネート間の物理的な架橋をもたらすことができる。
【０００５】
また、強化された生物学的組織と共に無細胞マトリックスを使用することも知られている。この生物学的要素と非生物学的要素を結び付ける又は組み合わせるための方法としては、非生物学的要素周囲の組織、組織周囲の非生物学的要素、又は、非生物学的要素の編物、織物、編組、若しくは他の繊維製品の内部に埋め込まれた組織若しくはそれらのコーティングが挙げられる。それら２つの要素を一緒にしてもよく、あるいは別個に要素を層にして互いの周囲に緊密に巻き付けてもよい。帯輪の設計に類似した固定ストラップを含めることによって、層状の構築物に圧縮力を付加することもできる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
合成構築物を無細胞マトリックスと組み合わせるための従来のアプローチの既知の短所及び欠点としては、層間剥離、取り扱いにくいこと、及び煩雑な処理手法が挙げられる。したがって、無細胞マトリックスを合成骨格と組み合わせるための新規な方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、無細胞マトリックス接着剤を作製する新規な無細胞マトリックス接着剤及び新規な方法を開示する。また、新規な強化無細胞マトリックスも開示する。
【０００８】
この無細胞マトリックス接着剤は、水溶液中の無細胞マトリックスを有する。
【０００９】
本発明の別の態様は、本発明の無細胞マトリックス接着剤を作製する新規な方法である。この方法は、無細胞マトリックスを提供する工程を含む。無細胞マトリックスを水溶液に添加して、混合物を提供する。無細胞マトリックス接着剤を効果的に形成するために、その混合物を十分な温度範囲で十分な時間にかけて培養する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、新規な強化無細胞マトリックスである。このマトリックスは無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層とを有する。その無細胞マトリックス接着剤層は、本発明の新規な無細胞マトリックス接着剤である。
【００１１】
本発明の更なる態様は、本発明の新規な無細胞マトリックスを使用してヘルニア修復を行う方法である。
【００１２】
本発明のこれらの及び他の態様及び利点は、以下の説明及び添付図面により更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の無細胞マトリックス接着剤及び本発明の強化無細胞マトリックスを調製するために使用する工程。
【図２】本発明の、メッシュで強化された無細胞真皮マトリックスのＳＥＭ画像。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の無細胞マトリックス接着剤は、無細胞マトリックスを提供することと、水溶液中で無細胞マトリックスを混合して無細胞マトリックス混合物を形成することと、無細胞マトリックス混合物を十分な時間にかけて十分に有効な温度で培養して無細胞マトリックス接着剤を提供することとによって調製される。
【００１５】
本明細書では、無細胞マトリックスは、構造的細胞外マトリックスから核及び細胞成分が取り除かれるように脱細胞化された組織として定義される。無細胞マトリックスは、器官又は隔離された器官部分を含む組織から調整される。組織としては、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、血管などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、組織は大網及び真皮を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、組織は真皮である。組織は、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなど（ただし限定せず）様々な哺乳類源から得られる。組織は、組織保存、デキュラリゼーション（decullarization）、洗浄、脱汚染、及び保管のような工程を含む従来の手法によって脱細胞化される。
【００１６】
脱細胞化工程は、一般に、洗剤を含有する食塩水を使用する抽出による細胞成分の除去と、エンドヌクレアーゼによる消化を含む。
【００１７】
次いで、無細胞マトリックスを水溶液に移す。一実施形態では、無細胞マトリックスを水溶液に移す前に加工し、より小さい片にする。鋏、刃、又はナイフでの切断、ボールミリング、低温ミリング、ジェットミリングのようなミリングによる粉砕といった従来の方法によって、無細胞マトリックスをより小さい片に加工することができる。無細胞マトリックスを粉末のようなより小さい片に加工することは、より多くの表面積をもたらし、したがって、水溶液へのより速い溶解を可能にする。一実施形態では、無細胞マトリックスは、水溶液への添加の前に低温ミリングによって粉末化される。
【００１８】
本発明の実践において有用な水溶液としては、水、生理学的緩衝液、及び生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。生理学的緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液、トリス緩衝生理食塩水、及びヘペス緩衝生理食塩水のような緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、水溶液は水である。
【００１９】
一実施形態では、水溶液は所望により十分に有効な量の可塑剤を含む。可塑剤としては、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、可塑剤はグリセロールである。
【００２０】
無細胞マトリックス接着剤は、例えば、無細胞真皮マトリックスのような無細胞マトリックスを提供することによって調製される。次いで、無細胞真皮マトリックスを、所望により低温ミリングで加工して粉末にすることができる。無細胞マトリックス粉末は、約２ｍｍ未満の粒径を有する約１．０ｇの無細胞マトリックス粉末を、水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような水溶液１０ｍＬと混合し、無細胞マトリックス混合物を生成する。無細胞マトリックスは、典型的には水溶液の約２重量％〜約３０重量％、好ましくは約５重量％〜約２０重量％の量で存在する。別の実施形態では、無細胞マトリックスは水溶液の約１０重量％の量で存在する。次いで、無細胞マトリックス混合物を十分に有効な温度及び時間で、典型的には約７０℃〜約１００℃で約１０分間〜約４８時間にかけて、より好ましくは約８０℃〜約９０℃で、典型的には約１時間〜約５時間にかけて培養する。また、より高圧化では、例えば、２大気圧で１２０℃のようなより高い温度を使用することができる。無細胞マトリックス接着剤を約３７℃に冷却させて直ちに使用するか、又は使用する準備ができるまで室温以下に冷却させる。
【００２１】
別の実施形態では、グリセロールのような十分に有効な量の可塑剤を所望により加えて、接着剤の可撓性及び濡れ特性を増加させる。その可塑剤の性質に基づく量の可塑剤を加えることができる。グリセロールの場合、無細胞マトリックス接着剤に加えられるグリセロールの量は、典型的にはこの水性接着剤の約０．５重量％〜約１０重量％である。可塑剤は、接着剤を冷却させる前又は後のいずれかに水性接着剤に添加し、均一に混合することができる。好ましくは、接着剤の容易な混合及び一様分布のために、接着剤を冷却させる前にグリセロールを加える。
【００２２】
本明細書に記述されている無細胞マトリックス接着剤は、組織の修復及びエンジニアリングのための強化無細胞マトリックスの調製に有用である。本発明の無細胞マトリックス接着剤を利用する本発明の強化無細胞マトリックスは、無細胞マトリックス層と、強化層と、無細胞マトリックス接着剤層とから成る。好ましくはないが、あり得る可能な短所を受け入れる意志が当業者にあるならば、本発明の無細胞マトリックス接着剤を組織接着剤又は封止剤として使用してもよい。
【００２３】
無細胞マトリックス層は、無細胞マトリックスから調製される。無細胞マトリックスは、器官、又は器官から隔離された部分を含む組織から調整される。組織としては、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、血管などが挙げられるが、これらに限定されない一実施形態では、組織は大網及び真皮を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、組織は真皮である。組織は、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなど（ただし限定せず）様々な哺乳類源から得られる。上述のように、従来のプロセス及び手法を使用して組織を脱細胞化し、無細胞マトリックスを提供する。無細胞マトリックス層は、典型的に約５０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの厚さを有する薄いシートに無細胞マトリックスを分割することによって得られる。無細胞マトリックスは、牛革分割器の使用のような従来の手法によって分割される。
【００２４】
強化層は、好ましくは、織物構造、編物構造、歪んだ編物構造（すなわち、レース状）、不織構造、及び網組構造を含む繊維製品、又は同様若しくは同等の材料である。好ましくはないが、強化層は、繊維製品でない、例えば、ポリマーシートのような材料のシートであってもよい。一実施形態では、強化層はメッシュのような織物繊維製品である。上述の繊維製品及び材料では、繊維製品又は材料の密度又はテクスチャを変更することによって機械特性を調整することができる繊維製品の作製に使用される繊維は、例えば、単繊維、糸、スレッド、網組、又は繊維の束であってよい。ポリマーシートのような材料は、そこに形成された又は開けられた穴を有してもよく、所望により多孔質であってもよい。シートのような繊維及び材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリラクチドを含む）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（ポリグリコリドを含む）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、及びポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）を含む（ただし限定せず）生体適合性の生体吸収性材料で作製され得る。これらの繊維はまた、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、スチレン（アクリロニトリルブタジエンスチレンを含む）、ナイロン、アクリル性材料、熱可塑性ウレタン、熱可塑性エラストマー、熱硬化性プラスチック、ポリアミド、ポリエステル、成形可能なシリコン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらのコポリマー又は配合物を含む（ただし限定せず）生体適合性の非吸収性ポリマーでも作成され得る。好適なポリオレフィンとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びこれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、繊維製品を作る繊維はポリプロピレンで形成される。
【００２５】
一実施形態では、強化無細胞マトリックスは、強化層と、無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤とを提供することによって調製される。細胞マトリックス接着剤は、無細胞マトリックスのコラーゲン成分を変性させるために十分に有効な温度、典型的には約５０℃〜約９０℃で加熱されてから、使用の前に所望の温度まで、典型的には約３０℃〜約５０℃、好ましくは約３７℃まで、冷却されるべきである。次いで、十分な量の無細胞マトリックス接着剤を無細胞マトリックス層と強化層との間に配置し、それらのマトリックス層と強化層とを有効に結合し、従来のやり方で乾燥させて、強化無細胞マトリックスを形成する。例えば、マトリックスは、上側と下側とを有する強化層を提供し、その強化層の上側に無細胞マトリックス接着剤の層を配置し、次いで無細胞マトリックスを接着剤層上に配置することによって、強化層と無細胞マトリックス層とを共に接着して作製することができる。あるいは、マトリックスは、無細胞マトリックス層を提供し、無細胞マトリックス層上に無細胞マトリックス接着剤の層を配置し、次いで強化層を接着剤層上に配置することによって、強化層と無細胞マトリックス層とを共に接着して作製することができる。また、多層の強化無細胞マトリックスは、強化層と無細胞マトリックス接着剤層と無細胞マトリックス層とを繰り返し交互にすることによっても、又は構造物内の層状材料の位置を変化させることによっても、提供され得る。無細胞マトリックス接着剤及び無細胞マトリックス層は、本明細書に上述されているように、同じ組織型から調製されても、異なる組織型から調製されてもよい。一実施形態では、無細胞マトリックス層及び無細胞マトリックス接着剤層は同じ組織型からのものである。
【００２６】
所望により、強化無細胞マトリックスは、ホルムアルデヒド蒸気、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）又は酸化多糖類のような従来の方法を用いて無細胞マトリックス接着剤層と無細胞マトリックス層とを架橋することによって安定化することができる。多糖類としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、ヘパラン、ヘパラン硫酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸塩、アルギン酸塩、及び他の長鎖多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、強化無細胞マトリックスは、好ましくは約４０％〜約７０％の濃度でエタノール、イソプロパノール、プロパノールのようなアルコールを含有する溶液中１％のＥＤＣを含むＥＤＣ架橋によって安定化される。
【００２７】
一実施形態では、１つ以上の生物活性剤を、所望により強化無細胞マトリックスに組み込むこと及び／又は適用することができる。一実施形態では、生物活性剤は、強化構成要素に組み込まれる、又はコーティングされる。別の実施形態では、生物活性剤は無細胞マトリックス接着剤に組み込まれる。更に別の実施形態では、生物活性剤は無細胞マトリックスに組み込まれる。
【００２８】
好適な生物活性剤としては、感染予防剤（例えば、抗菌剤及び抗生物質）、炎症を緩和する製剤（例えば、抗炎症剤）、酸化再生セルロースのような、接着形成を防ぐ又は最低限にする製剤（例えば、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩＮＴＥＲＣＥＥＤ及びＳＵＲＧＩＣＥＬ）及びヒアルロン酸、並びに免疫系を抑制する製剤（例えば、免疫抑制剤）、異種又は自己の増殖因子、タンパク質（マトリックスタンパク質を含む）、ペプチド、抗体、酵素、血小板、血小板の豊富な血漿、糖タンパク質、ホルモン、サイトカイン、グリコサミノグリカン、核酸、鎮痛剤、ウィルス、ウィルス粒子、並びに細胞型、走化性物質、抗生物質、並びにステロイド及び非ステロイド鎮痛剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
生存組織を本発明の強化無細胞マトリックスに含めることもできる。その出所は様々であってよく、組織は様々な形態を有することができるが、一実施形態では、組織は、所望により、組織の再成長の効果を増して、例えば軟骨のような治癒反応を刺激することが可能な微細に砕かれた又は分割された組織破片又は片の形状である。別の実施形態では、生存組織は、所望により、組織の再生及び／又はリモデリングの能力のある生存細胞を含有する健康な組織から収穫された組織スライス又はストリップの形状である場合がある。
【００３０】
強化無細胞マトリックスはまた、そこに組み込まれた生存細胞を有することもできる。好適な細胞型としては、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、多能性細胞、軟骨細胞前駆細胞、軟骨細胞、内皮細胞、マクロファージ、白血球、脂肪細胞、単核細胞、血漿細胞、マスト細胞、臍帯細胞、間質細胞、間葉幹細胞、上皮細胞、筋芽細胞、腱細胞、靭帯線維芽細胞、ニューロン、骨髄細胞、滑膜細胞、胚幹細胞；脂肪組織由来の前駆細胞；末梢血前駆細胞；成人組織から隔離した幹細胞；遺伝子形質転換細胞；軟骨細胞と他の細胞との組み合わせ；骨細胞と他の細胞との組み合わせ；滑膜細胞と他の細胞との組み合わせ；骨髄細胞と他の細胞との組み合わせ；間葉細胞と他の細胞との組み合わせ；間質細胞と他の細胞との組み合わせ；幹細胞と他の細胞との組み合わせ；胚幹細胞と他の細胞との組み合わせ；成人組織から隔離した前駆細胞と他の細胞との組み合わせ；末梢血前駆細胞と他の細胞との組み合わせ；成人組織から隔離した幹細胞と他の細胞との組み合わせ；遺伝子形質転換細胞と他の細胞との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の強化無細胞マトリックスはまた、核酸、ウィルス、又はウィルス粒子が関心対象の遺伝子を送達する遺伝子療法でも使用することができ、これは、少なくとも１つの関心対象の遺伝子産物を特定の細胞又は細胞型にエンコードする。したがって、生物活性剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチド）、ウイルス、ウイルス粒子、又は非ウイルスベクターであることができる。ウイルス及びウイルス粒子は、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであってもよく、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルス由来であってもよい。関心対象の遺伝子産物は、タンパク質、ポリペプチド、干渉リボ核酸（ｉＲＮＡ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３２】
適用可能な核酸及び／又はウィルス性因子（すなわち、ウィルス又はウィルス粒子）の十分に有効な量が強化無細胞マトリックスに組み込まれたら、装置を特定の部位に移植して、望ましいタイプの生物学的反応を引き出すことができる。次に、核酸又はウイルス性因子は細胞に取り込まれることでき、この核酸又はウイルス性因子がコード化する任意のタンパク質が、この細胞によって局所的に生成され得る。一実施形態では、核酸又はウイルス性因子は、細分化組織懸濁液の組織片内の細胞に取り込まれることでき、又は、代替実施形態では、核酸又はウイルス性因子は、傷害組織部位を取り囲む組織の中の細胞に取り込まれることできる。生成されるタンパク質は、上記の種類のタンパク質であることができ、又は、損傷若しくは疾患を治癒する、感染と闘う、若しくは炎症反応を軽減する組織の能力を向上させるのを容易にする同様のタンパク質であることができることを、当業者は認識されよう。組織修復過程又はその他の通常の生物学的過程に悪影響を与える可能性がある不必要な遺伝子産物の発現を阻止するために、核酸を使用することも可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びウイルス性因子は、従来、遺伝子発現ノックアウトとしても知られるこのような発現阻止機能を達成するために使用される。
【００３３】
当業者は、生物活性剤の識別が外科医、医療従事者、又は他の生命科学従事者によって、医療科学の原則及び適用され得る治療目的に基づいて決定され得ることを理解するであろう。また、強化無細胞マトリックスの製造の前、間若しくは後に、又は外科的配置の前、間若しくは後に、生物活性剤を強化無細胞マトリックスに組み込むことができることも理解するであろう。
【００３４】
本発明の強化無細胞マトリックスは、ヘルニア修復及び骨盤底修復のような腹部手術、胸部リフティング及びフェースリフティングのような美容整形手術、並びに回旋腱板修復のような他の組織修復手術を含む（ただし限定せず）、組織の強化が望まれる外科処置に用いることができる。無細胞マトリックスは、接着剤、縫合、ステープル、タックなど、従来の組織付着装置を用いて組織に取り付けることができる。
【００３５】
下記の実施例は本発明の原理及び実践の説明のためであり、これらに限定されるものではない。本発明の範囲及び趣旨内の多くの追加の実施形態は、ひとたびこの開示の利益を得ると、当業者に明らかになるであろう。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
無細胞マトリックス接着剤の製剤プロセス
６８００ Ｆｒｅｅｚｅｒ Ｍｉｌｌ（ＳＰＥＸ ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ、ニュージャージー州Ｍｅｔｕｃｈｅｎ所在）を用いて、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＵｒｏＳｃｉｅｎｃｅ（ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ所在）が商品名ＤｅｒｍＭａｔｒｉｘで市販する無細胞ブタ真皮マトリックスをミリングして微粉末にした。無細胞真皮マトリックス粉末１．０グラムを、ポリプロピレン試験管内の水溶液１０ｍＬ（グリセロール７％及び酢酸１．３％含有）に加えた。この試験管を８０℃の水槽に入れ、磁気攪拌した。８０℃で３時間培養した後、接着剤は不透明になった。接着剤を水槽から取り出し、３７℃まで冷却させてから使用した。このプロセスは、図１に図示されている。
【００３７】
（実施例２）
無細胞ブタ真皮マトリックスの薄層の調製
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＵｒｏＳｃｉｅｎｃｅ（ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ所在）が商品名ＤｅｒｍＭａｔｒｉｘで市販する無細胞ブタ真皮マトリックスを、革分割機を使用して薄層に分割（ペンシルベニア州Ｃｏｌｕｍｂｉａ所在のＣｏｌｕｍｂｉａ Ｏｒｇａｎ Ｌｅａｔｈｅｒが実施）し、プロトタイプ製剤とした。この無細胞ブタ真皮マトリックスは、ＩＰＡに２４時間浸してから分割された。８ｃｍ×８ｃｍ四方の無細胞ブタ真皮マトリックスを分割機に供給し、０．１９ｍｍ〜０．１０ｍｍの範囲の最終厚に分割した。分割後、無細胞ブタ真皮マトリックスシートをＩＰＡに保管し、使用のための準備ができるまで更に処理した。このプロセスを、全ての無細胞ブタ真皮マトリックスの試料に繰り返した。
【００３８】
（実施例３）
強化無細胞ブタ真皮マトリックスの調製
メッシュ強化無細胞真皮マトリックスの調製プロセスは、図１に示されている。実施例２で調製された分割された無細胞真皮マトリックスの試料を、脱イオン水で洗浄してから２０℃で凍結乾燥した。Ｕｌｔｒａｐｒｏメッシュ（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ所在）を５０℃で１０日間、脱イオン水中で培養して吸収性成分を取り除き、軽量のポリプロピレンメッシュを調整した。この軽量のポリプロピレンメッシュを３×５ｃｍの分割された無細胞真皮マトリックスの２層の間に配置し、３７℃に維持された実施例１で調整された無細胞マトリックス接着剤３ｍＬを用いて共に接着した。この構築物全体を室温に冷却し、細胞培養フッド内で空気乾燥した。
【００３９】
（実施例４）
メッシュ強化無細胞ブタ真皮マトリックスの安定化処理
実施例３に記述されているように調整された強化無細胞ブタ真皮マトリックスを、１００ｍＬのエタノールリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（エタノール４０％）で３０分間洗浄した。次いで、洗浄された強化無細胞真皮マトリックスを、（調製された新鮮な）エタノールＰＢＳ中で、１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）５０ｍＬに移し入れた。室温で４時間培養後、架橋された強化無細胞マトリックスを、水中６重量％のグリセロールで２度洗浄した。架橋された強化無細胞マトリックスを空気乾燥した。
【００４０】
（実施例５）
ＳＥＭによるメッシュ強化無細胞真皮マトリックスの評価
実施例４で調製した試料を顕微鏡のスタッドに装着し、ＥＭＳ ５５０スパッタコーター（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州Ｈａｔｆｉｅｌｄ所在））を用いて金の薄層をコーティングした。ＳＥＭ解析は、ＪＥＯＬ ＪＳＭ−５９００ＬＶ ＳＥＭ（ＪＥＯＬ、東京、日本所在）を用いて行った。各試料に関して、表面及び断面を調べた。ＳＥＭ画像（図２を参照）は、無細胞真皮マトリックスの２つの薄層の中央にメッシュが埋め込まれているのを示している。
【００４１】
（実施例６）
動物のヘルニア修復モデル
ブタのモデルを使用し、被検体に従来の方法で麻酔を施して手術の準備をする。正中切開は臍孔に対して上／頭及び／又は下／尾に入れる。腹側正中切開は皮膚から皮下の組織にかけて入れて、正中／白線の腹壁筋膜を露出する。長さ約３ｃｍの臍孔の頭及び尾の２つの中央値の欠陥を白線に作り、前腹膜脂肪組織及び腹膜を露出する。メッシュ強化無細胞マトリックスをおよそのサイズにトリムし、ＰＲＯＬＥＮＥ定着縫合糸サイズ３−０（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ所在）と共に腹壁筋膜上に平らに配備する。皮下組織及び皮膚をＭｏｎｏｃｒｙｌ縫合糸サイズＵＳＰ３−０単糸で閉じる。更に、早期の創傷汚染を防ぐために局所皮膚接着剤で接着する。
【００４２】
（実施例７）
強化無細胞マトリックスを用いた切開式ヒトヘルニア修復
ヒト患者を、切開式ヘルニア修復手術のために従来の方法で準備する。従来の方法で全身麻酔を与えるが、ヘルニアの位置及び修復の複雑さによっては、所望により、患者は従来の局所又は部分麻酔を受ける場合がある。所望により、カテーテルを膀胱に挿入して尿を取り除き、膀胱を収縮させる。
【００４３】
ヘルニアの近くの腹壁から脂肪及び瘢痕組織を取り除くために、ぎりぎりの大きさの切開を入れる。弱まったヘルニアエリアの外縁を画定し、そのエリアから余分な組織を取り除く。次いで、本発明の強化無細胞マトリックスを、その弱まったエリアの周囲全方向に数センチメートル（インチ）外側まで重なるように適用し、非吸収性縫合糸で固定する。次いで、腹壁を近寄せ、非吸収性縫合糸で閉じる。縫合糸を結び、ノットにする。
【００４４】
合成構築物と無細胞マトリックスとを組み合わせる従来のアプローチと比較して、本発明に開示されている構築物の合成構築物と無細胞マトリックスはよく一体化され、層間剥離を回避する。結果として、これらの構築物はフレキシブルである。この無細胞マトリックス接着剤は、複合構築物に生理活性材料を組み込むための送達媒体を提供する。
【００４５】
本発明は、その詳細な実施態様に関して図示及び説明が行われたが、当業者には、当該形態及び詳細におけるさまざまな変更が、請求される発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解されるであろう。
【００４６】
〔実施の態様〕
（１） 無細胞マトリックス及び水溶液を含む、無細胞マトリックス接着剤。
（２） 前記無細胞マトリックスが、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（３） 前記脱細胞化組織が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される、実施態様２に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（４） 前記水溶液が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（５） グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を更に含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（６） 前記接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（７） 無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、強化無細胞マトリックス。
（８） 前記無細胞マトリックス接着剤が、無細胞マトリックスと水溶液とを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（９） 前記無細胞マトリックス接着剤が、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、実施態様８に記載のマトリックス。
（１０） 前記無細胞マトリックス接着剤が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される脱細胞化組織を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
【００４７】
（１１） 前記無細胞マトリックス接着剤が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される水溶液を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１２） 前記無細胞マトリックス接着剤が、追加的に、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１３） 前記無細胞マトリックス接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１４） 前記強化層が繊維製品を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１５） 前記強化層が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、並びにこれらのコポリマー及び配合物からなる群から選択される材料を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１６） 前記強化層がポリマーシートを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１７） 前記無細胞マトリックス接着剤層と前記無細胞マトリックス層とが架橋されている、実施態様７に記載のマトリックス。
（１８） 外科手順において組織を強化する方法であって、
強化無細胞マトリックスを提供することにおいて、前記マトリックスが、
無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤から作製される無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、提供することと、
前記マトリックスを組織に取り付けることと、を含む、方法。
（１９） 前記無細胞マトリックス接着剤が無細胞マトリックスと水溶液とを含む、実施態様１８に記載の方法。
【開示の内容】
【０００１】
本特許出願は、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｌｕｅ」と題する同一出願人による同日出願の特許出願第ＥＴＨ５４０９ＵＳＮＰ号に関する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概して、天然医用材料分野に関し、より具体的には、バイオグルーのような生体適合性接着剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
長きにわたり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、結合組織の重要な構造成分として認識されてきた。ＥＣＭは、細胞表面に付着している糖タンパク質及びプロテオグリカンの線維状構造であり、細胞の固定物、移動のためのトラクション、及び位置の認識を提供するものとして概して説明される。現在、細胞によって巧妙に作られたＥＣＭがそれら自身と他の細胞を差異化すること、又はそれらの差異化された状態を維持することによって、それら自身及び他の細胞が応答する微小環境を作り出すことを裏付ける、かなりの証拠がある。ＥＣＭは、それに接着している細胞の組織化のための基材を提供する。組織ベースのＥＣＭ医用材料及び機器は、心弁、ブタの小腸粘膜下層（submucusa）（ＳＩＳ）、ヒトの真皮、及びウシの心膜といった様々な医療用途に広く使用されてきた。皮膚、腱、心膜、及びＳＩＳのような同種異系又は異種の結合組織は、無細胞マトリックスと呼ばれる（脱細胞化マトリックスとも呼ばれる場合がある）タイプの細胞外マトリックスを提供するために、既知の従来の方法を使用して脱細胞化（又は失活）される。脱細胞化の間に、組織拒絶反応に至る細胞は取り除かれ、一方、原組織の重要な生化学成分及び構造成分は保持される。
【０００４】
医療機器における特定用途のための無細胞マトリックスの使用は当該技術分野で既知である。一例は、軟組織の付着、補強、又は構築のための人工生体装置である。これらの装置は、天然生成細胞外マトリックスシートと、この天然生成細胞外マトリックスの部分に結合する合成メッシュシートとを有する。移植組織片を減圧下で乾燥させて、ＳＩＳのラミネート間及びメッシュと隣接ＳＩＳラミネート間の物理的な架橋をもたらすことができる。
【０００５】
また、強化された生物学的組織と共に無細胞マトリックスを使用することも知られている。この生物学的要素と非生物学的要素を結び付ける又は組み合わせるための方法としては、非生物学的要素周囲の組織、組織周囲の非生物学的要素、又は、非生物学的要素の編物、織物、編組、若しくは他の繊維製品の内部に埋め込まれた組織若しくはそれらのコーティングが挙げられる。それら２つの要素を一緒にしてもよく、あるいは別個に要素を層にして互いの周囲に緊密に巻き付けてもよい。帯輪の設計に類似した固定ストラップを含めることによって、層状の構築物に圧縮力を付加することもできる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
合成構築物を無細胞マトリックスと組み合わせるための従来のアプローチの既知の短所及び欠点としては、層間剥離、取り扱いにくいこと、及び煩雑な処理手法が挙げられる。したがって、無細胞マトリックスを合成骨格と組み合わせるための新規な方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、無細胞マトリックス接着剤を作製する新規な無細胞マトリックス接着剤及び新規な方法を開示する。また、新規な強化無細胞マトリックスも開示する。
【０００８】
この無細胞マトリックス接着剤は、水溶液中の無細胞マトリックスを有する。
【０００９】
本発明の別の態様は、本発明の無細胞マトリックス接着剤を作製する新規な方法である。この方法は、無細胞マトリックスを提供する工程を含む。無細胞マトリックスを水溶液に添加して、混合物を提供する。無細胞マトリックス接着剤を効果的に形成するために、その混合物を十分な温度範囲で十分な時間にかけて培養する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、新規な強化無細胞マトリックスである。このマトリックスは無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層とを有する。その無細胞マトリックス接着剤層は、本発明の新規な無細胞マトリックス接着剤である。
【００１１】
本発明の更なる態様は、本発明の新規な無細胞マトリックスを使用してヘルニア修復を行う方法である。
【００１２】
本発明のこれらの及び他の態様及び利点は、以下の説明及び添付図面により更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の無細胞マトリックス接着剤及び本発明の強化無細胞マトリックスを調製するために使用する工程。
【図２】本発明の、メッシュで強化された無細胞真皮マトリックスのＳＥＭ画像。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の無細胞マトリックス接着剤は、無細胞マトリックスを提供することと、水溶液中で無細胞マトリックスを混合して無細胞マトリックス混合物を形成することと、無細胞マトリックス混合物を十分な時間にかけて十分に有効な温度で培養して無細胞マトリックス接着剤を提供することとによって調製される。
【００１５】
本明細書では、無細胞マトリックスは、構造的細胞外マトリックスから核及び細胞成分が取り除かれるように脱細胞化された組織として定義される。無細胞マトリックスは、器官又は隔離された器官部分を含む組織から調整される。組織としては、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、血管などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、組織は大網及び真皮を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、組織は真皮である。組織は、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなど（ただし限定せず）様々な哺乳類源から得られる。組織は、組織保存、デキュラリゼーション（decullarization）、洗浄、脱汚染、及び保管のような工程を含む従来の手法によって脱細胞化される。
【００１６】
脱細胞化工程は、一般に、洗剤を含有する食塩水を使用する抽出による細胞成分の除去と、エンドヌクレアーゼによる消化を含む。
【００１７】
次いで、無細胞マトリックスを水溶液に移す。一実施形態では、無細胞マトリックスを水溶液に移す前に加工し、より小さい片にする。鋏、刃、又はナイフでの切断、ボールミリング、低温ミリング、ジェットミリングのようなミリングによる粉砕といった従来の方法によって、無細胞マトリックスをより小さい片に加工することができる。無細胞マトリックスを粉末のようなより小さい片に加工することは、より多くの表面積をもたらし、したがって、水溶液へのより速い溶解を可能にする。一実施形態では、無細胞マトリックスは、水溶液への添加の前に低温ミリングによって粉末化される。
【００１８】
本発明の実践において有用な水溶液としては、水、生理学的緩衝液、及び生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。生理学的緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液、トリス緩衝生理食塩水、及びヘペス緩衝生理食塩水のような緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、水溶液は水である。
【００１９】
一実施形態では、水溶液は所望により十分に有効な量の可塑剤を含む。可塑剤としては、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、可塑剤はグリセロールである。
【００２０】
無細胞マトリックス接着剤は、例えば、無細胞真皮マトリックスのような無細胞マトリックスを提供することによって調製される。次いで、無細胞真皮マトリックスを、所望により低温ミリングで加工して粉末にすることができる。無細胞マトリックス粉末は、約２ｍｍ未満の粒径を有する約１．０ｇの無細胞マトリックス粉末を、水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような水溶液１０ｍＬと混合し、無細胞マトリックス混合物を生成する。無細胞マトリックスは、典型的には水溶液の約２重量％〜約３０重量％、好ましくは約５重量％〜約２０重量％の量で存在する。別の実施形態では、無細胞マトリックスは水溶液の約１０重量％の量で存在する。次いで、無細胞マトリックス混合物を十分に有効な温度及び時間で、典型的には約７０℃〜約１００℃で約１０分間〜約４８時間にかけて、より好ましくは約８０℃〜約９０℃で、典型的には約１時間〜約５時間にかけて培養する。また、より高圧化では、例えば、２大気圧で１２０℃のようなより高い温度を使用することができる。無細胞マトリックス接着剤を約３７℃に冷却させて直ちに使用するか、又は使用する準備ができるまで室温以下に冷却させる。
【００２１】
別の実施形態では、グリセロールのような十分に有効な量の可塑剤を所望により加えて、接着剤の可撓性及び濡れ特性を増加させる。その可塑剤の性質に基づく量の可塑剤を加えることができる。グリセロールの場合、無細胞マトリックス接着剤に加えられるグリセロールの量は、典型的にはこの水性接着剤の約０．５重量％〜約１０重量％である。可塑剤は、接着剤を冷却させる前又は後のいずれかに水性接着剤に添加し、均一に混合することができる。好ましくは、接着剤の容易な混合及び一様分布のために、接着剤を冷却させる前にグリセロールを加える。
【００２２】
本明細書に記述されている無細胞マトリックス接着剤は、組織の修復及びエンジニアリングのための強化無細胞マトリックスの調製に有用である。本発明の無細胞マトリックス接着剤を利用する本発明の強化無細胞マトリックスは、無細胞マトリックス層と、強化層と、無細胞マトリックス接着剤層とから成る。好ましくはないが、あり得る可能な短所を受け入れる意志が当業者にあるならば、本発明の無細胞マトリックス接着剤を組織接着剤又は封止剤として使用してもよい。
【００２３】
無細胞マトリックス層は、無細胞マトリックスから調製される。無細胞マトリックスは、器官、又は器官から隔離された部分を含む組織から調整される。組織としては、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、血管などが挙げられるが、これらに限定されない一実施形態では、組織は大網及び真皮を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、組織は真皮である。組織は、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなど（ただし限定せず）様々な哺乳類源から得られる。上述のように、従来のプロセス及び手法を使用して組織を脱細胞化し、無細胞マトリックスを提供する。無細胞マトリックス層は、典型的に約５０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの厚さを有する薄いシートに無細胞マトリックスを分割することによって得られる。無細胞マトリックスは、牛革分割器の使用のような従来の手法によって分割される。
【００２４】
強化層は、好ましくは、織物構造、編物構造、歪んだ編物構造（すなわち、レース状）、不織構造、及び網組構造を含む繊維製品、又は同様若しくは同等の材料である。好ましくはないが、強化層は、繊維製品でない、例えば、ポリマーシートのような材料のシートであってもよい。一実施形態では、強化層はメッシュのような織物繊維製品である。上述の繊維製品及び材料では、繊維製品又は材料の密度又はテクスチャを変更することによって機械特性を調整することができる繊維製品の作製に使用される繊維は、例えば、単繊維、糸、スレッド、網組、又は繊維の束であってよい。ポリマーシートのような材料は、そこに形成された又は開けられた穴を有してもよく、所望により多孔質であってもよい。シートのような繊維及び材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリラクチドを含む）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（ポリグリコリドを含む）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、及びポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）を含む（ただし限定せず）生体適合性の生体吸収性材料で作製され得る。これらの繊維はまた、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、スチレン（アクリロニトリルブタジエンスチレンを含む）、ナイロン、アクリル性材料、熱可塑性ウレタン、熱可塑性エラストマー、熱硬化性プラスチック、ポリアミド、ポリエステル、成形可能なシリコン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらのコポリマー又は配合物を含む（ただし限定せず）生体適合性の非吸収性ポリマーでも作成され得る。好適なポリオレフィンとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びこれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、繊維製品を作る繊維はポリプロピレンで形成される。
【００２５】
一実施形態では、強化無細胞マトリックスは、強化層と、無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤とを提供することによって調製される。細胞マトリックス接着剤は、無細胞マトリックスのコラーゲン成分を変性させるために十分に有効な温度、典型的には約５０℃〜約９０℃で加熱されてから、使用の前に所望の温度まで、典型的には約３０℃〜約５０℃、好ましくは約３７℃まで、冷却されるべきである。次いで、十分な量の無細胞マトリックス接着剤を無細胞マトリックス層と強化層との間に配置し、それらのマトリックス層と強化層とを有効に結合し、従来のやり方で乾燥させて、強化無細胞マトリックスを形成する。例えば、マトリックスは、上側と下側とを有する強化層を提供し、その強化層の上側に無細胞マトリックス接着剤の層を配置し、次いで無細胞マトリックスを接着剤層上に配置することによって、強化層と無細胞マトリックス層とを共に接着して作製することができる。あるいは、マトリックスは、無細胞マトリックス層を提供し、無細胞マトリックス層上に無細胞マトリックス接着剤の層を配置し、次いで強化層を接着剤層上に配置することによって、強化層と無細胞マトリックス層とを共に接着して作製することができる。また、多層の強化無細胞マトリックスは、強化層と無細胞マトリックス接着剤層と無細胞マトリックス層とを繰り返し交互にすることによっても、又は構造物内の層状材料の位置を変化させることによっても、提供され得る。無細胞マトリックス接着剤及び無細胞マトリックス層は、本明細書に上述されているように、同じ組織型から調製されても、異なる組織型から調製されてもよい。一実施形態では、無細胞マトリックス層及び無細胞マトリックス接着剤層は同じ組織型からのものである。
【００２６】
所望により、強化無細胞マトリックスは、ホルムアルデヒド蒸気、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）又は酸化多糖類のような従来の方法を用いて無細胞マトリックス接着剤層と無細胞マトリックス層とを架橋することによって安定化することができる。多糖類としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、ヘパラン、ヘパラン硫酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸塩、アルギン酸塩、及び他の長鎖多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、強化無細胞マトリックスは、好ましくは約４０％〜約７０％の濃度でエタノール、イソプロパノール、プロパノールのようなアルコールを含有する溶液中１％のＥＤＣを含むＥＤＣ架橋によって安定化される。
【００２７】
一実施形態では、１つ以上の生物活性剤を、所望により強化無細胞マトリックスに組み込むこと及び／又は適用することができる。一実施形態では、生物活性剤は、強化構成要素に組み込まれる、又はコーティングされる。別の実施形態では、生物活性剤は無細胞マトリックス接着剤に組み込まれる。更に別の実施形態では、生物活性剤は無細胞マトリックスに組み込まれる。
【００２８】
好適な生物活性剤としては、感染予防剤（例えば、抗菌剤及び抗生物質）、炎症を緩和する製剤（例えば、抗炎症剤）、酸化再生セルロースのような、接着形成を防ぐ又は最低限にする製剤（例えば、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩＮＴＥＲＣＥＥＤ及びＳＵＲＧＩＣＥＬ）及びヒアルロン酸、並びに免疫系を抑制する製剤（例えば、免疫抑制剤）、異種又は自己の増殖因子、タンパク質（マトリックスタンパク質を含む）、ペプチド、抗体、酵素、血小板、血小板の豊富な血漿、糖タンパク質、ホルモン、サイトカイン、グリコサミノグリカン、核酸、鎮痛剤、ウィルス、ウィルス粒子、並びに細胞型、走化性物質、抗生物質、並びにステロイド及び非ステロイド鎮痛剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
生存組織を本発明の強化無細胞マトリックスに含めることもできる。その出所は様々であってよく、組織は様々な形態を有することができるが、一実施形態では、組織は、所望により、組織の再成長の効果を増して、例えば軟骨のような治癒反応を刺激することが可能な微細に砕かれた又は分割された組織破片又は片の形状である。別の実施形態では、生存組織は、所望により、組織の再生及び／又はリモデリングの能力のある生存細胞を含有する健康な組織から収穫された組織スライス又はストリップの形状である場合がある。
【００３０】
強化無細胞マトリックスはまた、そこに組み込まれた生存細胞を有することもできる。好適な細胞型としては、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、多能性細胞、軟骨細胞前駆細胞、軟骨細胞、内皮細胞、マクロファージ、白血球、脂肪細胞、単核細胞、血漿細胞、マスト細胞、臍帯細胞、間質細胞、間葉幹細胞、上皮細胞、筋芽細胞、腱細胞、靭帯線維芽細胞、ニューロン、骨髄細胞、滑膜細胞、胚幹細胞；脂肪組織由来の前駆細胞；末梢血前駆細胞；成人組織から隔離した幹細胞；遺伝子形質転換細胞；軟骨細胞と他の細胞との組み合わせ；骨細胞と他の細胞との組み合わせ；滑膜細胞と他の細胞との組み合わせ；骨髄細胞と他の細胞との組み合わせ；間葉細胞と他の細胞との組み合わせ；間質細胞と他の細胞との組み合わせ；幹細胞と他の細胞との組み合わせ；胚幹細胞と他の細胞との組み合わせ；成人組織から隔離した前駆細胞と他の細胞との組み合わせ；末梢血前駆細胞と他の細胞との組み合わせ；成人組織から隔離した幹細胞と他の細胞との組み合わせ；遺伝子形質転換細胞と他の細胞との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の強化無細胞マトリックスはまた、核酸、ウィルス、又はウィルス粒子が関心対象の遺伝子を送達する遺伝子療法でも使用することができ、これは、少なくとも１つの関心対象の遺伝子産物を特定の細胞又は細胞型にエンコードする。したがって、生物活性剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチド）、ウイルス、ウイルス粒子、又は非ウイルスベクターであることができる。ウイルス及びウイルス粒子は、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであってもよく、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルス由来であってもよい。関心対象の遺伝子産物は、タンパク質、ポリペプチド、干渉リボ核酸（ｉＲＮＡ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３２】
適用可能な核酸及び／又はウィルス性因子（すなわち、ウィルス又はウィルス粒子）の十分に有効な量が強化無細胞マトリックスに組み込まれたら、装置を特定の部位に移植して、望ましいタイプの生物学的反応を引き出すことができる。次に、核酸又はウイルス性因子は細胞に取り込まれることでき、この核酸又はウイルス性因子がコード化する任意のタンパク質が、この細胞によって局所的に生成され得る。一実施形態では、核酸又はウイルス性因子は、細分化組織懸濁液の組織片内の細胞に取り込まれることでき、又は、代替実施形態では、核酸又はウイルス性因子は、傷害組織部位を取り囲む組織の中の細胞に取り込まれることできる。生成されるタンパク質は、上記の種類のタンパク質であることができ、又は、損傷若しくは疾患を治癒する、感染と闘う、若しくは炎症反応を軽減する組織の能力を向上させるのを容易にする同様のタンパク質であることができることを、当業者は認識されよう。組織修復過程又はその他の通常の生物学的過程に悪影響を与える可能性がある不必要な遺伝子産物の発現を阻止するために、核酸を使用することも可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びウイルス性因子は、従来、遺伝子発現ノックアウトとしても知られるこのような発現阻止機能を達成するために使用される。
【００３３】
当業者は、生物活性剤の識別が外科医、医療従事者、又は他の生命科学従事者によって、医療科学の原則及び適用され得る治療目的に基づいて決定され得ることを理解するであろう。また、強化無細胞マトリックスの製造の前、間若しくは後に、又は外科的配置の前、間若しくは後に、生物活性剤を強化無細胞マトリックスに組み込むことができることも理解するであろう。
【００３４】
本発明の強化無細胞マトリックスは、ヘルニア修復及び骨盤底修復のような腹部手術、胸部リフティング及びフェースリフティングのような美容整形手術、並びに回旋腱板修復のような他の組織修復手術を含む（ただし限定せず）、組織の強化が望まれる外科処置に用いることができる。無細胞マトリックスは、接着剤、縫合、ステープル、タックなど、従来の組織付着装置を用いて組織に取り付けることができる。
【００３５】
下記の実施例は本発明の原理及び実践の説明のためであり、これらに限定されるものではない。本発明の範囲及び趣旨内の多くの追加の実施形態は、ひとたびこの開示の利益を得ると、当業者に明らかになるであろう。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
無細胞マトリックス接着剤の製剤プロセス
６８００ Ｆｒｅｅｚｅｒ Ｍｉｌｌ（ＳＰＥＸ ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ、ニュージャージー州Ｍｅｔｕｃｈｅｎ所在）を用いて、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＵｒｏＳｃｉｅｎｃｅ（ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ所在）が商品名ＤｅｒｍＭａｔｒｉｘで市販する無細胞ブタ真皮マトリックスをミリングして微粉末にした。無細胞真皮マトリックス粉末１．０グラムを、ポリプロピレン試験管内の水溶液１０ｍＬ（グリセロール７％及び酢酸１．３％含有）に加えた。この試験管を８０℃の水槽に入れ、磁気攪拌した。８０℃で３時間培養した後、接着剤は不透明になった。接着剤を水槽から取り出し、３７℃まで冷却させてから使用した。このプロセスは、図１に図示されている。
【００３７】
（実施例２）
無細胞ブタ真皮マトリックスの薄層の調製
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＵｒｏＳｃｉｅｎｃｅ（ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ所在）が商品名ＤｅｒｍＭａｔｒｉｘで市販する無細胞ブタ真皮マトリックスを、革分割機を使用して薄層に分割（ペンシルベニア州Ｃｏｌｕｍｂｉａ所在のＣｏｌｕｍｂｉａ Ｏｒｇａｎ Ｌｅａｔｈｅｒが実施）し、プロトタイプ製剤とした。この無細胞ブタ真皮マトリックスは、ＩＰＡに２４時間浸してから分割された。８ｃｍ×８ｃｍ四方の無細胞ブタ真皮マトリックスを分割機に供給し、０．１９ｍｍ〜０．１０ｍｍの範囲の最終厚に分割した。分割後、無細胞ブタ真皮マトリックスシートをＩＰＡに保管し、使用のための準備ができるまで更に処理した。このプロセスを、全ての無細胞ブタ真皮マトリックスの試料に繰り返した。
【００３８】
（実施例３）
強化無細胞ブタ真皮マトリックスの調製
メッシュ強化無細胞真皮マトリックスの調製プロセスは、図１に示されている。実施例２で調製された分割された無細胞真皮マトリックスの試料を、脱イオン水で洗浄してから２０℃で凍結乾燥した。Ｕｌｔｒａｐｒｏメッシュ（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ所在）を５０℃で１０日間、脱イオン水中で培養して吸収性成分を取り除き、軽量のポリプロピレンメッシュを調整した。この軽量のポリプロピレンメッシュを３×５ｃｍの分割された無細胞真皮マトリックスの２層の間に配置し、３７℃に維持された実施例１で調整された無細胞マトリックス接着剤３ｍＬを用いて共に接着した。この構築物全体を室温に冷却し、細胞培養フッド内で空気乾燥した。
【００３９】
（実施例４）
メッシュ強化無細胞ブタ真皮マトリックスの安定化処理
実施例３に記述されているように調整された強化無細胞ブタ真皮マトリックスを、１００ｍＬのエタノールリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（エタノール４０％）で３０分間洗浄した。次いで、洗浄された強化無細胞真皮マトリックスを、（調製された新鮮な）エタノールＰＢＳ中で、１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）５０ｍＬに移し入れた。室温で４時間培養後、架橋された強化無細胞マトリックスを、水中６重量％のグリセロールで２度洗浄した。架橋された強化無細胞マトリックスを空気乾燥した。
【００４０】
（実施例５）
ＳＥＭによるメッシュ強化無細胞真皮マトリックスの評価
実施例４で調製した試料を顕微鏡のスタッドに装着し、ＥＭＳ ５５０スパッタコーター（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州Ｈａｔｆｉｅｌｄ所在））を用いて金の薄層をコーティングした。ＳＥＭ解析は、ＪＥＯＬ ＪＳＭ−５９００ＬＶ ＳＥＭ（ＪＥＯＬ、東京、日本所在）を用いて行った。各試料に関して、表面及び断面を調べた。ＳＥＭ画像（図２を参照）は、無細胞真皮マトリックスの２つの薄層の中央にメッシュが埋め込まれているのを示している。
【００４１】
（実施例６）
動物のヘルニア修復モデル
ブタのモデルを使用し、被検体に従来の方法で麻酔を施して手術の準備をする。正中切開は臍孔に対して上／頭及び／又は下／尾に入れる。腹側正中切開は皮膚から皮下の組織にかけて入れて、正中／白線の腹壁筋膜を露出する。長さ約３ｃｍの臍孔の頭及び尾の２つの中央値の欠陥を白線に作り、前腹膜脂肪組織及び腹膜を露出する。メッシュ強化無細胞マトリックスをおよそのサイズにトリムし、ＰＲＯＬＥＮＥ定着縫合糸サイズ３−０（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ所在）と共に腹壁筋膜上に平らに配備する。皮下組織及び皮膚をＭｏｎｏｃｒｙｌ縫合糸サイズＵＳＰ３−０単糸で閉じる。更に、早期の創傷汚染を防ぐために局所皮膚接着剤で接着する。
【００４２】
（実施例７）
強化無細胞マトリックスを用いた切開式ヒトヘルニア修復
ヒト患者を、切開式ヘルニア修復手術のために従来の方法で準備する。従来の方法で全身麻酔を与えるが、ヘルニアの位置及び修復の複雑さによっては、所望により、患者は従来の局所又は部分麻酔を受ける場合がある。所望により、カテーテルを膀胱に挿入して尿を取り除き、膀胱を収縮させる。
【００４３】
ヘルニアの近くの腹壁から脂肪及び瘢痕組織を取り除くために、ぎりぎりの大きさの切開を入れる。弱まったヘルニアエリアの外縁を画定し、そのエリアから余分な組織を取り除く。次いで、本発明の強化無細胞マトリックスを、その弱まったエリアの周囲全方向に数センチメートル（インチ）外側まで重なるように適用し、非吸収性縫合糸で固定する。次いで、腹壁を近寄せ、非吸収性縫合糸で閉じる。縫合糸を結び、ノットにする。
【００４４】
合成構築物と無細胞マトリックスとを組み合わせる従来のアプローチと比較して、本発明に開示されている構築物の合成構築物と無細胞マトリックスはよく一体化され、層間剥離を回避する。結果として、これらの構築物はフレキシブルである。この無細胞マトリックス接着剤は、複合構築物に生理活性材料を組み込むための送達媒体を提供する。
【００４５】
本発明は、その詳細な実施態様に関して図示及び説明が行われたが、当業者には、当該形態及び詳細におけるさまざまな変更が、請求される発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解されるであろう。
【００４６】
〔実施の態様〕
（１） 無細胞マトリックス及び水溶液を含む、無細胞マトリックス接着剤。
（２） 前記無細胞マトリックスが、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（３） 前記脱細胞化組織が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される、実施態様２に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（４） 前記水溶液が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（５） グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を更に含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（６） 前記接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、実施態様１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
（７） 無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、強化無細胞マトリックス。
（８） 前記無細胞マトリックス接着剤が、無細胞マトリックスと水溶液とを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（９） 前記無細胞マトリックス接着剤が、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、実施態様８に記載のマトリックス。
（１０） 前記無細胞マトリックス接着剤が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される脱細胞化組織を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
【００４７】
（１１） 前記無細胞マトリックス接着剤が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される水溶液を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１２） 前記無細胞マトリックス接着剤が、追加的に、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１３） 前記無細胞マトリックス接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１４） 前記強化層が繊維製品を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１５） 前記強化層が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、並びにこれらのコポリマー及び配合物からなる群から選択される材料を含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１６） 前記強化層がポリマーシートを含む、実施態様７に記載のマトリックス。
（１７） 前記無細胞マトリックス接着剤層と前記無細胞マトリックス層とが架橋されている、実施態様７に記載のマトリックス。
（１８） 外科手順において組織を強化する方法であって、
強化無細胞マトリックスを提供することにおいて、前記マトリックスが、
無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤から作製される無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、提供することと、
前記マトリックスを組織に取り付けることと、を含む、方法。
（１９） 前記無細胞マトリックス接着剤が無細胞マトリックスと水溶液とを含む、実施態様１８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞マトリックス及び水溶液を含む、無細胞マトリックス接着剤。
【請求項２】
前記無細胞マトリックスが、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項３】
前記脱細胞化組織が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される、請求項２に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項４】
前記水溶液が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項５】
グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を更に含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項６】
前記接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項７】
無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、強化無細胞マトリックス。
【請求項８】
前記無細胞マトリックス接着剤が、無細胞マトリックスと水溶液とを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項９】
前記無細胞マトリックス接着剤が、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、請求項８に記載のマトリックス。
【請求項１０】
前記無細胞マトリックス接着剤が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される脱細胞化組織を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１１】
前記無細胞マトリックス接着剤が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される水溶液を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１２】
前記無細胞マトリックス接着剤が、追加的に、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１３】
前記無細胞マトリックス接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記強化層が繊維製品を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記強化層が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、並びにこれらのコポリマー及び配合物からなる群から選択される材料を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１６】
前記強化層がポリマーシートを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１７】
前記無細胞マトリックス接着剤層と前記無細胞マトリックス層とが架橋されている、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１】
無細胞マトリックス及び水溶液を含む、無細胞マトリックス接着剤。
【請求項２】
前記無細胞マトリックスが、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項３】
前記脱細胞化組織が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される、請求項２に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項４】
前記水溶液が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項５】
グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を更に含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項６】
前記接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、請求項１に記載の無細胞マトリックス接着剤。
【請求項７】
無細胞マトリックス層と、無細胞マトリックス接着剤層と、強化層と、を備える、強化無細胞マトリックス。
【請求項８】
前記無細胞マトリックス接着剤が、無細胞マトリックスと水溶液とを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項９】
前記無細胞マトリックス接着剤が、ヒト、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される哺乳類源から得られる脱細胞化組織を含む、請求項８に記載のマトリックス。
【請求項１０】
前記無細胞マトリックス接着剤が、心弁、小腸粘膜下層、真皮、羊膜、膀胱、大網、心膜、靭帯、及び血管からなる群から選択される脱細胞化組織を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１１】
前記無細胞マトリックス接着剤が、水、生理緩衝液、及び生理食塩水からなる群から選択される水溶液を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１２】
前記無細胞マトリックス接着剤が、追加的に、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される可塑剤を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１３】
前記無細胞マトリックス接着剤が、約２ｗ／ｖ％の無細胞マトリックスと、約３０ｗ／ｖ％の水溶液とを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記強化層が繊維製品を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記強化層が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、並びにこれらのコポリマー及び配合物からなる群から選択される材料を含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１６】
前記強化層がポリマーシートを含む、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項１７】
前記無細胞マトリックス接着剤層と前記無細胞マトリックス層とが架橋されている、請求項７に記載のマトリックス。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５０１７３１（Ｐ２０１２−５０１７３１Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６０８４（Ｐ２０１１−５２６０８４）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３５０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７６１２
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５９１２８６５７９）エシコン・インコーポレイテッド (170)
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨＩＣＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３５０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７６１２
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５９１２８６５７９）エシコン・インコーポレイテッド (170)
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨＩＣＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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