無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
【課題】臨床応用可能な胚性幹細胞の分化誘導法、特に胚性幹細胞からの前脳神経細胞の分化誘導法を提供する。
【解決手段】無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法、特に、胚性幹細胞からの、前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、感覚器系細胞の分化誘導法；無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得られる、胚性幹細胞の浮遊凝集体；並びに、胚性幹細胞の浮遊凝集体に由来する細胞、特に前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、網膜前駆細胞等の感覚器系細胞。
【解決手段】無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法、特に、胚性幹細胞からの、前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、感覚器系細胞の分化誘導法；無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得られる、胚性幹細胞の浮遊凝集体；並びに、胚性幹細胞の浮遊凝集体に由来する細胞、特に前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、網膜前駆細胞等の感覚器系細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法、当該方法により得られる細胞培養物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞は、パーキンソン病や糖尿病に対する細胞移植への細胞ソースの有力な候補である。しかし、マウス、ヒトの霊長類に由来する胚性幹細胞も培養および分化誘導にマウス由来の支持細胞（ストローマ細胞）との共存が必要であることが多く、このことが臨床応用へ向けての大きな障壁となっている。
最近、本発明者らは、マウスやサルの胚性幹細胞から高効率で神経細胞へ分化誘導する方法（ＳＤＩＡ法）を開発した（国際公開ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット、国際公開ＷＯ０３／０４２３８４号パンフレット、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２８，ｐ．３１−４０（２０００）、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５８０−１５８５（２００２）、Ｍｉｚｕｓｅｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．１００，ｐ．５８２８−５８３３（２００３）、Ｏｏｔｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４４，ｐ．２６８９−２６９３（２００３）参照）。この方法を用いて、パーキンソン病の移植治療への応用が期待されるドパミン分泌神経細胞、筋萎縮性側索硬化症への治療応用が想定されている運動ニューロンの試験管内産生にマウス、サルの胚性幹細胞から成功している（国際公開ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット、国際公開ＷＯ０３／０４２３８４号パンフレット、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２８，ｐ．３１−４０（２０００）、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５８０−１５８５（２００２）、Ｍｉｚｕｓｅｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．１００，ｐ．５８２８−５８３３（２００３）、Ｏｏｔｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４４，ｐ．２６８９−２６９３（２００３）参照）。また、胚性幹細胞から神経細胞を分化誘導する他の方法としては、多段階分化法が知られている（Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１８，ｐ．６７５−６７９（２０００）参照）。
しかしながら、ＳＤＩＡ法、多段階分化法では、ドパミン神経などの中脳組織は効率良く分化誘導できるが、終脳組織等の前脳組織は低効率でしか誘導できなかった。
以上のような背景から、胚性幹細胞から終脳組織等の前脳組織を効率良く分化誘導できる方法の開発が切望されていた。
【発明の概要】
【０００３】
従って、本発明の目的は、胚性幹細胞の分化誘導、特に終脳組織等の前脳組織への分化誘導を可能とする、実用性の高い方法を開発することである。
本発明者らは、ＳＤＩＡ法、多段階分化法により前脳組織、特に終脳組織が低効率でしか分化誘導できなかった理由として、１）ＳＤＩＡ法におけるフィーダー細胞との共培養、２）多段階法における線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の培地への添加、３）胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の血清及びレチノイン酸（ＲＡ）処理が、前脳を分化誘導し難い環境を作っているとの仮説をもとに、フィーダー細胞、ＦＧＦ、血清、ＲＡの非存在下において胚性幹細胞の分化誘導条件を鋭意検討した。その結果、本発明者らは、無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養により、ＥＳ細胞から神経系細胞を高効率で分化誘導できること、特に、フィーダー細胞、ＦＧＦ、血清及び／又はＲＡの非存在下という条件により、並びに他の種々の培養条件を至適化することにより、８５〜９５％の細胞を神経系細胞に分化誘導できることを見出した。また、同時に、かかる条件下での培養により、終脳組織等の前脳組織及び小脳組織のみならず、感覚器系細胞を効率良く分化誘導することにも成功した。さらに、この方法によれば、誘導源として動物由来細胞を使用することなく胚性幹細胞を分化誘導できるため、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植が同種移植のリスクレベルまで軽減できる。即ち、本発明は下記の通りである：
（１）無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法；
（２）胚性幹細胞の浮遊凝集体がフィーダー細胞の非存在下で培養される、上記（１）の方法；
（３）胚性幹細胞の浮遊凝集体が、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で培養される、上記（１）の方法；
（４）胚性幹細胞の浮遊凝集体が、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で培養される、上記（１）の方法；
（５）Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａである、上記（３）又は（４）の方法；
（６）Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１である、上記（３）又は（４）の方法；
（７）無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない培地である、上記（１）の方法；
（８）無血清培地が、ＦＧＦを実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（９）無血清培地が、レチノイン酸を実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（１０）無血清培地が、ＢＭＰを実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（１１）培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌである、上記（１）の方法；
（１２）胚性幹細胞の培養が、細胞非接着性培養器中で行われる、上記（１）の方法；
（１３）胚性幹細胞の浮遊凝集体が少なくとも５日間培養されることを特徴とする、上記（１）の方法；
（１４）神経系細胞の分化誘導方法である、上記（１）の方法；
（１５）胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養後に、接着培養することをさらに含む、上記（１）の方法；
（１６）前脳神経細胞の分化誘導方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（１７）終脳神経細胞の分化誘導方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（１８）Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（１）又は（１５）の方法；
（１９）Ｓｈｈシグナル促進剤がＳｈｈである、上記（１８）の方法；
（２０）腹側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（２１）Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下で接着培養を行う、上記（１５）の方法；
（２２）Ｗｎｔシグナル促進剤がＷｎｔ３ａである、上記（２１）の方法；
（２３）背側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（２４）Ｗｎｔシグナル促進剤及び／又はＢＭＰシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（１）の方法；
（２５）ＢＭＰシグナル促進剤及び／又はＦＧＦの存在下で培養する、上記（１）の方法；
（２６）小脳神経細胞の分化誘導法である、上記（１）、（２４）又は（２５）の方法；
（２７）小脳顆粒細胞又は小脳プルキンエ細胞の分化誘導法である、上記（１）、（２４）又は（２５）の方法；
（２８）無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養中に血清を添加することを特徴とする、上記（１）の方法；
（２９）Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（２８）の方法；
（３０）Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（２８）又は（２９）の方法；
（３１）Ｗｎｔシグナル阻害剤及び／又はＮｏｄａｌシグナル阻害剤の存在下で培養する、上記（２８）又は（２９）の方法；
（３２）Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｄｋｋ１及びアクチビンの存在下で培養する、上記（２８）の方法；
（３３）感覚器系細胞の分化誘導法である、上記（２８）の方法；
（３４）網膜系細胞の分化誘導法である、上記（３２）の方法；
（３５）無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得られる、胚性幹細胞の浮遊凝集体；
（３６）上記（１）〜（３４）のいずれかの方法により得られうる細胞培養物；
（３７）ＥＳ細胞から分化誘導された小脳神経細胞；
（３８）小脳顆粒細胞である、上記（３７）の細胞；
（３９）小脳プルキンエ細胞である、上記（３７）の細胞；
（４０）ＥＳ細胞から分化誘導された、視細胞への分化能を有する網膜系細胞。
本発明は、神経系細胞、感覚器系細胞を効率的に分化誘導できるため神経変性疾患、感覚器疾患等に対する細胞治療の応用という観点から有用である。本発明はまた、従来の分化法では困難であった前脳組織（特に終脳組織）を効率的に分化誘導でき、また、従来成功し得なかった小脳組織の分化誘導を可能とするとともに、視神経に効率良く分化され得る網膜組織の分化誘導を可能とするため、前脳組織、小脳組織、網膜組織等の組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用という観点から特に有用である。本発明はさらに、誘導源として動物由来細胞を使用することなく胚性幹細胞を分化誘導でき、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減できるため有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明は、無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法を提供する。以下、本発明の詳細を説明する。
（１．胚性幹細胞）
「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。
胚性幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。
具体的には、本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、および胚性幹細胞Ｉ又はＩＩの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩＩ」と省略）が挙げられる。
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、ＲｉｄｅｏｕｔＩＩＩら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、より好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
胚性幹細胞ＩＩＩは、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。胚性幹細胞ＩＩＩの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行なうことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
また、胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
胚性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、胚性幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＳｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
（２．本発明の方法により胚性幹細胞から分化誘導可能な細胞）
本発明の方法により、胚性幹細胞の分化細胞を得ることができる。胚性幹細胞の分化細胞は、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、外胚葉系細胞のいずれであってもよいが、好ましくは外胚葉系細胞である。外胚葉系細胞としては、例えば、神経系細胞、表皮系細胞、感覚器系細胞、色素細胞、神経堤由来間葉細胞が挙げらる。
本発明の方法により得られた細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。例えば、本発明の方法により得られた細胞が内胚葉系細胞又は中胚葉系細胞であるか否かは、内胚葉系細胞マーカー（例えば、Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ）、中胚葉系細胞マーカー（例えば、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｌｋ１、Ｍｏｘ）の発現により確認できる。
本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞であるか否かは、例えば、神経系細胞マーカーの発現により確認できる。神経系細胞マーカーとしては、例えば、ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、セロトニン、ネスチン、ＭＡＰ２、ＭＡＰ２ａｂ、ＮｅｕＮ、ＧＡＢＡ、グルタメート、ＣｈＡＴ、Ｓｏｘ１が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞であるか否かは、表皮系細胞マーカー（例えば、サイトケラチン）、感覚器系細胞マーカー（例えば、ＲＰＥ、ロドプシン）、色素細胞マーカー（例えば、ＴＲＰ−１）、神経堤由来間葉系細胞マーカー（例えば、ＳＭＡ）の発現により確認することもできる。
以下、本発明の方法により分化誘導可能な外胚葉系細胞の例として、神経系細胞、感覚器系細胞について詳述する。
（２．１．神経系細胞）
本発明の方法により得られる神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。
神経幹細胞とは、神経細胞、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）およびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞をいい、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。従って、神経幹細胞であることを確認する方法としては、実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、インビトロで神経幹細胞を神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化誘導させて確認する方法などが挙げられる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８，３８９（１９９７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，５３４（１９９９））。また、このような機能を有した神経幹細胞は、神経前駆細胞での発現が確認されているマーカーである細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン抗体で染色可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））。従って抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。
神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。ドパミン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞を総称してカテコールアミン分泌神経細胞と呼ぶ。
あるいは、本発明の方法により得られる神経幹細胞、神経細胞等の神経系細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる神経系細胞は、高頻度、例えば約８０％以上、好ましくは約８０〜９０％の頻度で、Ｓｏｘ１陽性である。また、本発明の方法により得られる神経系細胞は、後述する前脳神経細胞マーカー、小脳神経細胞マーカーが陽性であることを特徴とする。
別の観点では、神経細胞は、神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。これらの存在部位で分類される神経細胞としては、例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられる。本発明の方法はこれら任意の神経細胞を分化誘導できるが、なかでも、前脳神経細胞、小脳神経細胞を効率的に分化誘導できる。以下、前脳神経細胞、小脳神経細胞について詳述する。
（２．１．１．前脳神経細胞）
本発明の方法によれば、神経細胞として前脳神経細胞、特に終脳神経細胞がより効率的に分化誘導できる。前脳神経細胞とは、前脳組織（即ち、終脳及び間脳から構成される組織）に存在する神経細胞、あるいは前脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。前脳神経細胞は、終脳神経細胞、間脳神経細胞（例えば、視床細胞、視床下部細胞）に分類できる。終脳神経細胞はさらに、背側細胞（例えば、大脳皮質細胞）、腹側細胞（例えば、大脳基底核細胞）に分類できる。
本発明の方法により得られた細胞が前脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、前脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。前脳神経細胞マーカーとしては、Ｏｔｘ１（前脳）、Ｂｆ１（終脳）、Ｅｍｘ１（終脳背側）、Ｇｓｈ２及びＮｋｘ２．１（終脳腹側）などが挙げられる。
本発明の方法によれば、前脳神経細胞のなかでも終脳神経細胞を効率的に分化誘導できる。
一つの局面では、本発明の方法は、終脳神経細胞のなかでも、腹側終脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、腹側前脳神経細胞への分化を抑制することができる。腹側終脳神経細胞とは、腹側終脳組織に存在する神経細胞、あるいは腹側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。腹側終脳組織としては、例えば、大脳基底核が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が腹側終脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、腹側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。腹側終脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳基底核神経細胞マーカー（例えば、Ｇｓｈ２、Ｍａｓｈ１）、視床下部神経細胞マーカー（例えば、Ｎｋｘ２．１、Ｎｋｘ２．２）が挙げられる。
別の局面では、本発明の方法は、終脳神経細胞のなかでも、背側終脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、背側前脳神経細胞への分化を抑制することができる。背側終脳神経細胞とは、背側終脳組織に存在する神経細胞、あるいは背側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。背側終脳組織としては、例えば、大脳皮質が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が背側終脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、背側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。背側終脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳皮質神経細胞マーカー（例えば、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ１）が挙げられる。
あるいは、別の観点では、本発明の方法により得られる前脳神経細胞（特に、終脳神経細胞）は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる前脳神経細胞は、高頻度、例えば約１０％以上、好ましくは約１０〜５０％、より好ましくは約１０％〜３０％の頻度で、Ｂｆ１陽性である。従来のＳＤＩＡ法では、約１％の頻度でしか、胚性幹細胞からＢｆ１＋細胞を分化誘導できなかったが、本発明の方法により、高頻度でＢｆ１＋細胞を得ることが可能となった。
本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約２０％以上、好ましくは約２０〜８０％、より好ましくは約２０〜５０％の細胞が、Ｇｓｈ陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５％以上、好ましくは約５〜５０％、より好ましくは約５〜２０％の細胞が、Ｎｋｘ２．１陽性であり得る。さらに、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約１０％以上、好ましくは約１０〜９０％、より好ましくは約１０〜５０％の細胞が、Ｐａｘ陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５％以上、好ましくは約５〜５０％、より好ましくは約５〜２０％、最も好ましくは約１０〜２０％の細胞が、Ｅｍｘ１陽性であり得る。
（２．１．２．小脳神経細胞）
本発明の方法によれば、神経細胞として小脳神経細胞が効率的に分化誘導できる。小脳神経細胞とは、小脳組織に存在する神経細胞、あるいは小脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。小脳神経細胞としては、例えば、小脳顆粒細胞、プルキンエ細胞、これら細胞の前駆細胞が挙げられる。小脳神経細胞の分化誘導に成功したという報告はこれまでになされていなかったが、本発明の方法により、小脳神経細胞を得ることが可能となった。
本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、小脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。小脳神経細胞マーカーとしては、例えば、小脳顆粒細胞マーカー（例えば、Ｍａｔｈ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１）、プルキンエ細胞マーカー（例えば、Ｌ７）が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞であるか否かは、その表現型により確認できる。例えば、得られた細胞が小脳顆粒細胞であるか否かは、平行線維軸索に接着して移動可能であること、及び／又はＴ型の軸索が伸長していることを識別することで確認できる。
あるいは、本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、高頻度、例えば３０％以上、好ましくは約３０〜６０％、より好ましくは約４０％〜５０％の頻度で、Ｍａｔｈ１陽性である。
本発明の方法により得られるＭａｔｈ１＋細胞のうち、例えば約４０％以上、好ましくは約４０〜６０％、より好ましくは約５０％の細胞が、Ｐａｘ６及び／又はＺｉｃ１陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＭａｔｈ１＋細胞のうち、例えば約４０％以上、好ましくは約４０〜８０％、より好ましくは約５０〜６０％の細胞が、Ｋｉ６７陽性であり得る。
（２．２．感覚器系細胞）
本発明の方法によれば、胚性幹細胞から感覚器系細胞が効率的に分化誘導できる。感覚器系細胞とは、感覚器に存在する神経細胞、あるいは感覚器に存在する細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。本発明の方法により得られる感覚器系細胞としては、網膜細胞、嗅上皮細胞、内耳有毛細胞が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が感覚器系細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、感覚器系細胞マーカーの発現により確認できる。感覚器系細胞マーカーとしては、例えば、Ｒｘ（網膜前駆細胞）、Ｃｒｘ（視細胞）、ロドプシン（視細胞）が挙げられる。
本発明の方法によれば、感覚器系細胞のなかでも網膜系細胞（即ち、網膜細胞又はその前駆細胞）を効率的に分化誘導できる。
あるいは、本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは約５〜２０％、より好ましくは約１０％〜１５％の頻度で、Ｒｘ陽性である。
本発明の方法により得られるＲｘ＋細胞のうち、例えば約１％以上、好ましくは約１〜１０％、より好ましくは約１〜５％の細胞が、Ｃｒｘ及び／又はロドプシン陽性であり得る。
本発明の方法により得られる網膜系細胞は、網膜組織との組織培養により、視細胞に効率良く分化し、例えば約１０％以上、好ましくは約１０％〜３０％（例、約２０％）のロドプシン陽性率を示し得る。本発明の方法により得られる網膜系細胞はまた、視細胞層内への侵入能を有し、視細胞内に侵入した細胞の約３０％以上、例えば約３０％〜５０％（例、約４０％）がロドプシン陽性であり得、さらに、外節構造などの視細胞特異的な形態を示し得る。
（３．無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養方法）
胚性幹細胞を「浮遊凝集体として培養する」とは、集合し塊を形成した胚性幹細胞群を、培養培地中において、細胞培養器に対し非接着性の条件下で培養することをいう。以下、このような培養を、必要に応じて浮遊培養と省略する。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、浮遊凝集体の形成をより容易にするため、並びに／あるいは、効率的な分化誘導（例えば、神経系細胞、感覚器系細胞等の外胚葉系細胞への分化誘導）のために、フィーダー細胞の非存在下で培養を行うのが好ましい。
浮遊培養で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培地としては無血清培地が用いられる。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。
浮遊培養で用いられる無血清培地は、例えば、血清代替物を含有するものであり得る。血清代替物は、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
また、本発明の方法で用いられる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。例えば、２−メルカプトエタノールは、胚性幹細胞の培養に適する濃度で使用される限り限定されないが、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭ、より好ましくは約０．２ｍＭの濃度で使用できる。
浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）を使用できる。
浮遊培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。
培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体をより効率的に形成させるように適宜設定できる。培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば、約１×１０４〜約５×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約３×１０４〜約１×１０５細胞／ｍｌであり得る。
浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。
具体的には、浮遊培養としては、例えば、胚性幹細胞の維持培養後、分散処理した胚性幹細胞を適切な培地（例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地５００ｍｌに５％のＫＳＲ、１００×非必須アミノ酸溶液５ｍｌ、１００×ピルビン酸５ｍｌおよび１×１０−１Ｍ ２−メルカプトエタノール０．５ｍｌを添加した培地。必要に応じて後述する因子などを適量含んでいてもよい。）に懸濁し、細胞非接着性の培養器に、１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で播種し、例えば、少なくとも５日間３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法が挙げられる。
浮遊培養後、凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、次いで細胞を接着条件下でさらに培養できる（以下、必要に応じて接着培養と省略）。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は、当業者であれば容易に決定できる。
浮遊培養及び接着培養では、既知の分化誘導物質を併用できる。例えば、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する場合には、既知の神経系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＮＧＦ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，５５２（１９９４））、レチノイン酸（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８，３４２（１９９５）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１０５６（１９９６））、ＢＭＰ阻害因子（Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３３３−３３６（１９９５））、ＩＧＦ（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，３０２３−８（２００３））が挙げられる。また、胚性幹細胞から感覚器系細胞を分化誘導する場合には、既知の感覚器系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＦＧＦ、Ｓｈｈ、血清などが挙げられる。
上述した浮遊培養法、及び浮遊培養と接着培養との組合せ法によれば、培養期間等を適宜設定することで、胚性幹細胞から外胚葉系細胞等の分化細胞を得ることができる。しかしながら、後述する方法論を適宜さらに組合せることで、神経系細胞、感覚器系細胞をより効率的に分化誘導できる。
（３．１．神経系細胞の分化誘導）
神経系細胞として前脳神経細胞、小脳神経細胞の分化誘導を例に挙げ、より好適な浮遊培養を行うために組合せるべき方法論を以下詳述する
（３．１．１．前脳神経細胞の分化誘導）
前脳神経細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、前脳神経細胞の分化効率の向上・安定化等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。
ＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。ＢＭＰシグナル促進剤としては、例えば、ＢＭＰファミリーに属する蛋白（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＧＤＦ）、ＢＭＰ受容体、Ｓｍａｄ蛋白が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰ４である。
ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地とは、ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを全く含有しない無血清培地、あるいは胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量でこれら因子を含有する無血清培地をいう。かかる無血清培地は、例えば、培地成分としての上記因子の未添加、または上記因子を含有する培地からの上記因子の除去処理（例えば、抗ＦＧＦ抗体、抗ＲＡ抗体、抗ＢＭＰ抗体の使用）により調製できる。
ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地とは、上記因子を含有する無血清培地に対する阻害剤の添加により、胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまでＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。かかる無血清培地は、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤に対する阻害剤を適量培地に添加することで適宜調製できる。ＦＧＦ阻害剤としては、例えば、抗ＦＧＦ抗体、可溶型ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、Ｓｕ５４０２）が挙げられる。ＲＡ阻害剤としては、例えば、抗ＲＡ抗体、可溶型ＲＡ受容体、ＲＡ受容体阻害剤が挙げられる。ＢＭＰシグナル阻害剤としては、例えば、抗ＢＭＰ抗体、可溶型ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体阻害剤が挙げられる。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養において、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤を含有する無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤が不活化されていない無血清培地を使用することも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
別の方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化効率を向上・安定化させる場合に有用である。また、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤の併用により、さらに著しい効果が期待できる。
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｌｅｆｔｙ−Ｂ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、Ｌｅｆｔｙ−Ａが好ましい。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙについては約０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１．０〜１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５μｇ／ｍｌであり得る。
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白が挙げられるが、なかでも、Ｄｋｋ１又はＣｅｒｂｅｒｕｓ蛋白が好ましい。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０５〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜５．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地、あるいはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を全く含有しない無血清培地、あるいは胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量のＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を含有する無血清培地をいう。Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地は、例えば、培地成分としてのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の未添加、またはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有培地からのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の除去処理により調製できる。
また、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有無血清培地に対するＮｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の添加により、胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまでＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル促進剤としては、例えば、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβファミリーに属する蛋白（例えば、アクチビン）、Ｓｍａｄ蛋白、活性型Ｎｏｄａｌ受容体が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＮｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌである。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ１〜１６）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンが挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＷｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔ３ａである。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、前脳神経細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
さらに別の方法論は、Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、腹側終脳神経細胞への分化を促進する場合、背側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈが好ましい。
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約１．０〜１０００ｎＭ、好ましくは約５．０〜５００ｎＭ、より好ましくは約１０〜５００ｎＭ、最も好ましくは約３０〜３００ｎＭであり得る。
Ｓｈｈシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、例えば浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降に培地に添加できる。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。Ｓｈｈシグナル促進剤の添加により、胚性幹細胞の腹側前脳神経細胞への分化が促進されること、胚性幹細胞の背側前脳神経細胞への分化が抑制されること等が予想される。従って、Ｓｈｈシグナル阻害剤を用いれば、腹側前脳神経細胞分化の抑制、背側前脳神経細胞分化の促進等の効果が期待できると考えられる。
Ｓｈｈシグナル阻害剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル阻害剤としては、例えば、Ｓｈｈシグナル促進剤に対する抗体、Ｓｈｈシグナル促進剤のドミナントネガティブ変異体、可溶型Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アンタゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈ抗体、Ｓｈｈドミナントネガティブ変異体が好ましい。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、細胞を接着培養に供することができる。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養は、例えば１日以上、好ましくは１〜１４日、より好ましくは２〜５日行うことができる。
さらに別の方法論は、浮遊培養後の接着培養を、Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下で行うことである。かかる方法論は、例えば、背側終脳神経細胞への分化を促進する場合、腹側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
浮遊培養後の接着培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ３ａ）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンなどが挙げられるが、なかでもＷｎｔ３ａが好ましい。
浮遊培養後の接着培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度である限り限定されないが、例えば、Ｗｎｔ３ａについては約０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５．０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、接着培養開始時に既に培地に添加されてもよく、接着培養直後から数日後（例えば、接着培養開始４日以降、または接着培養１０日以内の期間）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル促進剤は、接着培養５日以内の時期に培地に添加される。
上述した各種方法論は、前脳神経細胞、あるいは特定の前脳神経細胞（例えば、終脳神経細胞、腹側終脳神経細胞、背側終脳神経細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
（３．１．２．小脳神経細胞の分化誘導）
小脳神経細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、小脳神経細胞の分化効率の向上等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、ＦＧＦ及び／又はＲＡを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ及び／又はＲＡが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、本方法論の詳細は上述した通りである。
別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、小脳神経細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
また別の方法論は、Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞、及び特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｗｎｔシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＷｎｔ３ａについては約０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２．０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０〜５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、Ｗｎｔシグナル促進剤は、培養５〜１０日、好ましくは５〜８日の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｗｎｔシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
さらに別の方法論は、ＢＭＰシグナル促進剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、小脳神経細胞、及び特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、ＢＭＰシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＢＭＰシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＢＭＰ４については約０．０１〜１００ｎＭ、好ましくは約０．０５〜１０ｎＭ、より好ましくは約０．１〜１．０ｎＭ、最も好ましくは約０．５〜１．０ｎＭであり得る。
ＢＭＰシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、ＢＭＰシグナル促進剤は、培養５〜１０日、好ましくは５〜８日の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、ＢＭＰシグナル促進剤の非存在下で行うことも可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また、小脳神経細胞、特に小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞への効率的な分化を可能とするため、上記２つの方法論を組合せることができる。即ち、Ｗｎｔシグナル促進剤及びＢＭＰシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
また別の方法論は、ＦＧＦの存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。ＦＧＦは、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、ＦＧＦは、培養４〜１２日、好ましくは５〜１０日の時期に培地に添加される。なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、ＦＧＦの非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
浮遊培養に用いられるＦＧＦの濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＦＧＦ８ｂについては約０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり得る。
なお、小脳神経細胞、特に小脳プルキンエ細胞への効率的な分化を可能とするため、上記方法論を組合せることができる。即ち、ＢＭＰシグナル促進剤及びＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ８ｂ等のＦＧＦ８）における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
さらに別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、接着培養に供することができる。例えば、小脳プルキンエ細胞の分化を促進する場合には、凝集塊のまま接着培養に供してもよい。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養は、例えば１日以上、好ましくは１〜２０日間、より好ましくは５〜２０日間、最も好ましくは１０〜１５日間行うことができる。
上述した各種方法論は、小脳神経細胞、あるいは特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
また、得られた小脳神経細胞をさらに分化させることもできる。例えば、実施例９記載のようにＭａｔｈ１＋細胞を分離した後、哺乳動物の胎児又は新生児小脳の分散細胞と凝集させ、共培養することでさらなる分化を誘導できる（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６，４４１−４４７（１９８９）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８，３１３３−３１４４（２００１））。例えば、かかる方法により、平行線維軸索に接着して移動可能であるという特徴、及び／又はＴ型の軸索の伸長という特徴を示す小脳顆粒細胞が得られる（これらは、小脳顆粒細胞の特徴である）。
以上の通り、本発明の方法は、種々の神経系細胞の分化誘導を可能とするため極めて有用である。
（３．２．感覚器系細胞の分化誘導）
感覚器系細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、感覚器系細胞の分化効率の向上等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、本方法論の詳細は上述した通りである。
別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、感覚器系細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊凝集体（数日培養したもの）を含む無血清培地への血清の添加である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。
血清は、任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来する血清を使用できる。血清が由来する哺乳動物は、胚性幹細胞が由来する哺乳動物（上述）と同様である。血清の濃度は、感覚器系細胞を効率的に分化可能であるような濃度である限り限定されないが、例えば約０．５〜３０％、好ましくは約１．０〜２０％、より好ましくは約３〜１０％、最も好ましくは約５％であり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地に血清を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から３〜７日以内である。なお、感覚器系細胞への分化は、血清の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、血清の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
さらに別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊凝集体（数日培養したもの）を含む無血清培地へのＳｈｈシグナル促進剤の添加である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｓｈｈシグナル促進剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、感覚器系細胞への分化を促進可能である限り限定されないが、例えば約０．１〜５００ｎＭ、好ましくは約０．５〜１００ｎＭ、より好ましくは約１．０〜５０ｎＭ、最も好ましくは約３．０〜３０ｎＭであり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地にＳｈｈシグナル促進剤を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から７日以内（例えば、３〜７日）である。なお、感覚器系細胞への分化は、Ｓｈｈシグナル促進剤の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｎｏｄａｌ、アクチビン等のＮｏｄａｌシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル促進剤の濃度は、感覚器系細胞をより効率的に産生できる濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎＭ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０〜５００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０〜２００ｎｇ／ｍｌであり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地にＮｏｄａｌシグナル促進剤を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から７日以内（例えば、３〜７日後）である。なお、感覚器系細胞への分化は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
また、感覚器系細胞への効率的な分化を可能とするため、上記３つの方法論を組合せることができる。即ち、血清とＳｈｈシグナル促進剤の併用、血清とＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用、Ｓｈｈシグナル促進剤とＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用、血清とＳｈｈシグナル促進剤及びＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用もまた好ましい。
さらに別の方法論は、Ｄｋｋ１等のＷｎｔシグナル阻害剤及び／又はＬｅｆｔｙ−Ａ等のＮｏｄａｌシグナル阻害剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。かかる方法論の併用もまた好ましい。なお、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜５．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１．０μｇ／ｍｌであり得る。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙ−Ａについては約０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．５μｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル阻害剤及びＮｏｄａｌシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の浮遊培養開始時に既に培地に添加されていてもよく、また、例えば、培養開始から５日以内の時期に培地に添加されてもよい。勿論、異なる時期にそれぞれ培地に添加されてもよい。
また、感覚器細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を特に効率良く行うために、所定の因子の組合せ、例えば、Ｌｅｆｔｙ（例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ）、Ｄｋｋ１、血清およびアクチビンの存在下における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｗｎｔシグナル阻害剤及び／又はＮｏｄａｌシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、接着培養に供することができる。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養の期間は、例えば１日以上であり得る。
さらに別の方法論は、浮遊培養後に、接着条件下で長期培養することである。かかる方法論は、感覚器系細胞、特に視細胞への分化を促進する場合に有用である。長期培養のための培養期間は、感覚器系細胞への分化を可能とする期間である限り特に限定されないが、例えば、例えば３日以上、好ましくは５〜２５日間、より好ましくは７〜２０日間、最も好ましくは７〜１８日間であり得る。
上述した各種方法論は、感覚器系細胞、あるいは特定の感覚器系細胞（例えば、網膜系細胞、視細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
以上の通り、本発明の方法は、種々の感覚器系細胞の分化誘導を可能とするため極めて有用である。
（４．細胞培養物、及び医薬としての使用）
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞培養物を提供する。本発明の細胞培養物は、例えば、胚性幹細胞の浮遊凝集体、浮遊凝集体を分散処理した細胞、分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。また、本発明は、かかる細胞培養物より被験体に投与し得る程度に単離・精製された均質な細胞、例えば、終脳神経細胞等の前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、網膜前駆細胞等の感覚器系神経細胞を提供する。
本発明の方法により得られた細胞は、神経系細胞、例えば前脳神経細胞、感覚器系細胞の障害に基づく疾患の治療薬、又はその他の原因による細胞損傷状態において当該細胞を補充するためなどに用いることができる。神経系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。具体的には、前脳神経細胞、特に終脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、脳外傷が挙げられる。また、小脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、脊髄小脳変性症、アルコール性小脳変性症、小脳部の外傷が挙げられる。また、感覚器系細胞の障害に基づく疾患としては、網膜色素変性症、黄班変性症、緑内障、糖尿病性網膜症が挙げられる。さらに、これら細胞の補充が所望される状態としては、脳外科手術後（例えば、脳腫瘍摘出後）が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を、当該細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、当該細胞の純度を高めた後に被験体に移植することが好ましい。
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）参照）、パニング法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、上述のような胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。
ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどが挙げられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述した培養方法に準じて、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法を挙げることできる。
ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の培地等を挙げることができる。
また、移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
また、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を得ることができる。このような個体の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。
胚性幹細胞から分化誘導された細胞、例えば神経系細胞は、自体公知の方法により、患者の疾患部位に移植できる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）参照）。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００５】
実施例−１：ＥＳ細胞の浮遊培養物は、血清の非存在下で凝集する
１．１．ＥＢ５細胞の浮遊培養による解析
初めに、無血清浮遊凝集（ＳＦＥＢ：Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｆｌｏａｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法を用いて、マウスＥＳ細胞（Ｅ１４由来）であるＥＢ５細胞（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２４：３７２（２０００））を培養した。
具体的には、ＥＳ細胞としては、１％ウシ胎児血清、１０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による通常の培養法により維持培養されたものをＳＦＥＢ法に用いた（Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．２８：３１−４０（２０００）参照）。次いで、ＥＳ細胞コロニーをトリプシン・ＥＤＴＡ処理で単細胞にした後、細胞非接着性の培養プラスチックシャーレ（１０ｃｍ径）に６×１０４細胞／ｍｌ １０ｍｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。このとき、培地としては、ＧＭＥＭ ５００ｍｌ、１００×ＮＥＡＡ ５ｍｌ、１００×ｐｙｒｕｖａｔｅ ５ｍｌ、１×１０−１Ｍ ２−メルカプトエタノール０．５ｍｌ、５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）からなる分化培地を用いた。また、ゼラチンコート培養ディッシュを用いること以外はＳＦＥＢ法と同様の条件で、ＥＢ５細胞を接着下で培養し、コントロールとした。
その結果、ＳＦＥＢ法によりＥＳ細胞を浮遊凝集培養したとき、ＥＳ細胞は十分に増殖し、多数のＮＣＡＭ＋細胞（＞６０％）を生じた（免疫染色法により解析）。一方、接着培養したコントロールでは、単一のＥＳ細胞は少数の小さなコロニーしか形成せず、また、このコロニーには、僅かなＮＣＡＭ＋細胞（＜２０％）しか含まれていなかった。
１．２．レポーター遺伝子導入マウスＥＳ細胞の浮遊培養による解析
次いで、定量的な解析のため、ＥＳ細胞として、神経マーカーＳｏｘ１遺伝子にＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を相同組換えにてノックインしたマウスＥＳ細胞（以下、必要に応じて、Ｓｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ細胞と省略。Ｎａｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２１：１８３−１８６（２００３）参照）を用いて、ＳＦＥＢ法により培養した。なお、培養条件は、ＥＳ細胞としてＳｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ細胞を用いた以外は、上記１．１．のＳＦＥＢ法と同様であった。
その結果、ＦＡＣＳにより解析したところ、Ｓｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ＋細胞は３〜５日間増加したが、Ｅ−カドヘリン＋細胞は最初の５日間除々に減少した。また、同様の結果が、免疫染色試験により得られた。さらに、ＳＦＥＢ法の５日後には、６０−８５％の細胞がＳｏｘ１−ＧＦＰ陽性であり、培養を３×１０４〜１×１０５初期細胞／ｍｌの範囲で開始した場合に、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団の割合が高かった（＞６０％）。
以上１．１．及び１．２．より、適切な培養条件下で培養したとき、ＥＳ細胞は効率的に凝集し、血清及びフィーダー細胞の非存在下で神経系細胞を速やかに生じることが示された。
実施例２：内因性Ｎｏｄａｌ、Ｗｎｔシグナルの阻害は、ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率をさらに向上させる
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢ法による神経系細胞への分化効率をより向上させるため、中胚葉系細胞への分化促進剤であるＮｏｄａｌ、Ｗｎｔ、ＢＭＰの阻害により、神経系細胞への分化効率が向上するか否かを検討することとした。抗Ｎｏｄａｌ試薬としてはＬｅｆｔｙ−Ａ（Ｒ＆Ｄ社製）、抗Ｗｎｔ試薬としてはＤｋｋ１（Ｒ＆Ｄ社製）、抗ＢＭＰ試薬としてはＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて、ＳＦＥＢ法による培養０日目に分化培地に添加した。なお、用いた濃度は、それぞれＬｅｆｔｙ−Ａ；５μｇ／ｍｌ、Ｄｋｋ１；１μｇ／ｍｌ、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙ；１．５μｇ／ｍｌであった。
その結果、Ｌｅｆｔｙ−Ａ又はＤｋｋ１の添加により、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度が上昇することが明らかとなった。また、上記１．２．の方法では、最適な初期細胞密度５×１０４細胞／ｍｌの条件下でさえも、ＧＦＰ発現の絶対値が実験毎に１０〜１５％程度変動していたが、予想外にも、Ｌｅｆｔｙ−Ａ又はＤｋｋ１の添加によりＧＦＰ発現の値が安定化した。さらに、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｄｋｋ１の併用により、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度が約９０％と著しく増加した。また興味深いことに、初期の細胞密度が高い場合（２×１０５細胞／ｍｌ）であっても、この併用によりＳｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞が高い頻度（約８０％）で保たれた。一方、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙの添加は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度に有意に影響しなかった。
次いで、本発明者らは、Ｎｏｄａｌ及びＷｎｔの効果を、Ｎｏｄａｌ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社製）及びＷｎｔ３ａ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社製）をＳＦＥＢ培養物に添加することで試験した。その結果、ＳＦＥＢ法における０〜５日目、２〜５日目でのＮｏｄａｌ蛋白質（５μｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ蛋白質（５０ｎｇ／ｍｌ）の添加は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度を有意に抑制することが確認された。
以上より、Ｎｏｄａｌ又はＷｎｔシグナルの阻害により、ＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率が向上し、且つその分化効率が安定化すること、並びにＮｏｄａｌ、Ｗｎｔシグナル双方の阻害により、ＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率が著しく向上することが示唆された。
実施例３：ＳＦＥＢ法による神経分化メカニズムの解析
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢ法による神経系細胞への優先的分化が、培養中の幾つかの選択バイアスによって引き起こされているのか、又は神経運命への直接的な分化によって引き起こされているのかを検討することとした。
先ず、本発明者らは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の割合が増加している培養３日目及び４日目に、非神経集団で細胞死が増加しているか否かをＴＵＮＥＬアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１，６３９−６４８（１９９２））により試験した。
その結果、ＴＵＮＥＬ＋アポトーシス細胞の割合は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−（３日目では５．５±０．７％、４日目では４．８±１．４％、ｎ＝３）と、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋（３日目では４．８±０．９％、４日目では４．６±１．５％、ｎ＝３）集団との間で有意差を示さなかった。このことは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ細胞が、ＳＦＥＢ法による培養中、アポトーシスにより能動的に排除されていないことを示す。
次に、本発明者らは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団における細胞増殖のパラメータをＢｒｄＵ取り込みアッセイ、及びホスホヒストンＨ３免疫染色アッセイにより比較した。
その結果、ＢｒｄＵ標識細胞の割合（３０分間の暴露）は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−（３日目では４５．３±０．４％、４日目では４０．９±１．２％、ｎ＝３）とＳｏｘ１−ＧＦＰ＋（３日目では４９．６±２．６％、４日目では４２．４±１．１％、ｎ＝３）集団との間で１０％未満の差異を示した。同様の状況が、ホスホーヒストンＨ３＋細胞の比率で観察された（Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−集団において、３日目では１．２±０．５％、４日目では１．０±０．７％；Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団において、３日目では１．５±０．７％、４日目では１．３±０．６％、ｎ＝３）。これらの結果は、ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞の神経系細胞への高い分化効率に、増幅の偏りが主要な役割を果たさないことを示す。
以上より、ＳＦＥＢ法による優先的な神経分化が、選択的な細胞死又は増殖ではなく、直接的な神経分化に起因することが示唆された。
実施例４：ＳＦＥＢ法は、ＥＳ細胞が終脳神経細胞に高効率で分化することを可能とする
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５細胞）を、実施例１と同様にＳＦＥＢ法により５日間無血清浮遊培養した後、トリプシン・ＥＤＴＡ処理により分散し、ポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種して、分化培地（上記の通り）で２日間、ＧＭＥＭ＋Ｎ２培地（組成：ＧＭＥＭ＋１ｘＮ−２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ製、ｘ１００濃度のものを希釈して使用）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で３日間培養した。最終的に得られた分化細胞を、抗Ｂｆ１抗体を用いて蛍光抗体法により解析した。なお、比較のため、ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞の神経分化を行い、蛍光抗体法により同様に解析した。
その結果、ＳＦＥＢ法による分化細胞のうち約１５％の細胞が、終脳神経細胞に特異的な核蛋白質であるＢｆ１陽性であった。一方、ＳＤＩＡ法により得られた分化細胞では、Ｂｆ１＋細胞の割合は僅かであった（約１％）。
次いで、Ｂｆ１以外のマーカーの発現について検討することとした。なお、マーカーに対する抗体としては、抗Ｐａｘ６抗体（ＤＳＨＢ製）、抗Ｇｓｈ２抗体、抗Ｎｋｘ２．１抗体を用いた。なお、抗Ｇｓｈ２抗体、抗Ｎｋｘ２．１抗体としては、合成ペプチドをウサギに免疫して自ら作製したものを用いた。
その結果、Ｂｆ１＋細胞のうち、約４０％の細胞が大脳背側部（大脳皮質などが発生）のマーカー（Ｐａｘ６陽性）を発現し、２５％の細胞が大脳腹側中間部（大脳基底核などが発生）のマーカー（Ｇｓｈ２陽性）を発現した。また、１０％程度の細胞が終脳最腹側部（視床下部などが発生）のＮｋｘ２．１を発現していた。
以上より、ＳＦＥＢ法は、ＥＳ細胞から終脳神経細胞への分化を効率的に誘導できること、並びに終脳神経細胞として大脳皮質、大脳基底核、視床下部等の細胞を分化誘導できることが明らかとなった。
実施例５：ＥＳ細胞から終脳神経細胞への分化は、培養後初めの５日間が重要である
ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞のＢｆ１＋細胞への高効率の分化は、極めて興味深い。そこで、ＳＦＥＢ法、ＳＤＩＡ法によるＢｆ１＋細胞への分化率の差異につき、タイムウインドウ（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）の観点から、詳細に検討することとした。
その結果、Ｂｆ１＋細胞は、ＳＦＥＢ法により５日間培養し、次いでＳＤＩＡ法によりさらに５日間培養したとき高頻度に生じた（１１％）。反対に、ＳＤＩＡ法により初めの５日間培養し、ラミニン・ポリ−Ｄ−リジン・フィブロネクチンコートしたディッシュでさらに５日間培養したとき僅かなＢｆ１＋細胞のみが観察された（＜２％）。
以上より、ＥＳ細胞からＢｆ１＋細胞への効率的な分化には、分化誘導期の初めの５日間が決定的な役割を果たすことが示唆された。
実施例６：ＳＦＥＢ法は、レチノイン酸処理の併用により尾側（ｃａｕｄａｌ）組織の前駆細胞を誘導する
次いで、ＳＥＦＡ法と尾側化（ｃａｕｄａｌｉｚｉｎｇ）因子との併用の効果を検討するため、レチノイン酸（ＲＡ）を用いて試験した。なお、ＳＥＦＡ法は、実施例１と同様に行い、ＲＡ（Ｓｉｇｍａ製）は培養３−５日後に０．２μＭとなるように培地に添加した。
その結果、尾側化因子は、Ｂｆ１＋細胞をほぼ完全に排除した（＜１％以下）。また、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、吻側マーカーであるＢｆ１、Ｏｔｘ２がＲＡによるＳＦＥＢ誘導神経細胞において完全に抑制されたのに対し、尾側マーカーＨｏｘｂ４が誘導された。
以上より、ＳＥＦＡ法と尾側化因子とを併用した場合、尾側組織に対応する細胞を分化誘導し得ることが示された。
実施例７：パターン形成因子による亜領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎａｌ）マーカーの変動
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢにおける部分領域マーカーの発現が、外因性のパターン形成（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）因子により変動するか否かを検討することとした。なお、パターン形成因子としては、Ｓｈｈ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。
その結果、ＳＦＥＢ法による培養４日目から、Ｓｈｈを３−３００ｎＭ培地に添加すると、用量依存的様式で、Ｂｆ１＋細胞のうちＰａｘ６＋細胞の割合が著しく減少し、Ｎｋｘ２．１＋細胞、Ｇｓｈ＋細胞などの腹側細胞の割合が約２倍に増加した。また、総細胞数中のＢｆ１＋細胞の占める割合は、Ｓｈｈ処理により影響されなかった。さらに、Ｓｈｈ処理は、ＳＦＥＢ誘導神経組織の長期培養において、腹側終脳の特徴を呈する神経細胞（Ｂｆ１＋／Ｉｓｌｅｔ１／２＋、ＣｈＡＴ＋）を増加させたが、ＧｌｕＴ１＋グルタミン産生神経細胞（典型的には背側）の分化を抑制した。このことは、ＳＦＥＢにより誘導される終脳神経細胞は、胚と同様の様式でＳｈｈシグナリングに応答することを示す。
以上より、ＳＦＥＢ法をＳｈｈ処理と組合せることで、腹側終脳神経細胞を効率的に分化誘導できること、及びＳＦＥＢにより誘導される終脳神経細胞は、胚と同様の様式でＳｈｈシグナリングに応答することが明らかとなった。
実施例８：Ｗｎｔシグナル因子による背側終脳組織の分化誘導
実施例４、６と同様にＥＳ細胞をＳＦＥＢ法で５日間培養し神経分化誘導を行い、引き続き、トリプシン・ＥＤＴＡ処理で分散しポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種して、培養した。Ｗｎｔ３ａを５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で６日目より添加し合計１０日間培養したところ、腹側終脳マーカーであるＮｋｘ２．１、Ｂｆ１両陽性の細胞数は著しく低下し、逆に背側終脳マーカーであるＰａｘ６、Ｂｆ１両陽性の細胞数は増加した。Ｗｎｔ３ａ ５０ｎｇ／ｍｌの場合、Ｂｆ１陽性細胞のうち約７５％が背側マーカーであるＰａｘ６を発現しており、また約１割が大脳皮質前駆細胞のマーカーの一つであるＥｍｘ１を発現した。
以上より、ＳＦＥＢ法においてＷｎｔシグナルを培養後期に作用させることで、背側終脳細胞を効率的に分化誘導できることが示唆された。
実施例９：ＢＭＰとＷｎｔの組合せによる小脳神経前駆細胞の分化誘導
無血清浮遊培養を７日間継続したこと以外は、実施例４と同様にＳＦＥＢ法でＥＳ細胞を神経分化誘導した。培養７日目から１日間の培養にはＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ製）添加のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ製）培地を用いて、浮遊培養を継続した。５日後より培養８日まで０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ製）、１０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ製）、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８ｂ（Ｒ＆Ｄ製）を培地に添加した。培養開始８日後には細胞塊をそのままあるいはトリプシン・ＥＤＴＡ処理による分散後に、ポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種し、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を用いて、接着培養を行った。９日で免疫染色を行ったところ、小脳顆粒細胞の前駆細胞に特異的なマーカーＭａｔｈ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１を発現している細胞を多数認めた。４０−５０％の細胞がＭａｔｈ１陽性であり、そのうち５０％以上がＰａｘ６やＺｉｃ１陽性であった。さらに小脳顆粒細胞の前駆細胞には分裂が盛んな細胞が含まれていることが知られているが、Ｍａｔｈ１陽性細胞の半分程度が分裂可能な細胞に特異的なマーカーＫｉ６７を発現していた。なお、このような顆粒細胞マーカーの誘導にはＢＭＰおよびＷｎｔの処理が必須であったが、ＦＧＦの処理は必須ではなかった。
さらに培養８日目に細胞塊のままで接着培養を開始したものを合計２０日間培養したところ、約５０％の細胞塊の中に小脳プルキンエ細胞特異的なマーカーＬ７に陽性の大型ニューロンが複数（１０個程度）存在していることが確認された。この分化誘導効率はＢＭＰ４とＷｎｔの組み合わせであるが、ＦＧＦ８ｂとの組み合わせを検討したところ、顆粒細胞の分化と異なり、小脳プルキンエ細胞分化には、ＢＭＰ４とＦＧＦ８ｂとの組み合わせも有効であり、陽性細胞数はＢＭＰ４とＷｎｔの組み合わせに比して４倍に増加した。
小脳顆粒細胞前駆細胞を分離するために、ＥＢ５細胞にＭａｔｈ１プロモーター（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７，１２７，１１８５−１１９６（２０００））下流にＧＦＰを結合したマーカー遺伝子を通常の方法で遺伝子導入した株を樹立した。上記の要領で培養した８−１０日の細胞から蛍光細胞ソーターを用いて、ＧＦＰ陽性分画を分離したところ、約９割の細胞がＭａｔｈ１−ＧＦＰ陽性の細胞に純化された。これらの細胞はＰａｘ６、Ｚｉｃ１などを発現していた。またこれらの細胞を、マウス胎児小脳や新生仔小脳の分散した細胞と凝集させ、共培養することでニューロンへの分化を誘導した（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６，４４１−４４７（１９８９）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８，３１３３−３１４４（２００１））。すると、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞は２日目にはマウス小脳由来の小脳細胞が伸展させた平衡線維軸索に接着した移動をすることが観察され（小脳顆粒細胞の特徴の一つ）、さらに共培養開始後２−３日目からは自ら小脳顆粒細胞の特徴であるＴ型の軸索を伸ばしていることが確認された。
以上より、本発明の方法をＢＭＰ、Ｗｎｔと組合せて用いることにより、小脳組織の神経細胞を分化誘導できることが示唆された。
実施例１０：ＢＭＰとＷｎｔの組合せによる小脳神経前駆細胞の分化誘導
ＥＳ細胞からの小脳組織の分化誘導はこれまで報告がないが、ＳＤＩＡ法で分化させた神経細胞をＢＭＰ４で処理することでＭａｔｈ１が誘導されることは本発明者らが既に報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，５８２８−５８３３参照）。しかし、Ｍａｔｈ１は小脳以外にも橋、延髄、脊髄の背側中枢神経系の神経細胞にも発現しており、Ｍａｔｈ１の発現だけでは小脳組織であるとは云えない。そこで、ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞をＰＡ６細胞上に播種して０．５−１ｎＭのＢＭＰ４を４日ないしは５日目から添加し、９日間培養したところ、１−２割程度の細胞がＭａｔｈ１陽性になった。しかしながら、その殆どの細胞は他の小脳顆粒細胞のマーカーであるＰａｘ６、Ｚｉｃ１などを発現しておらず、またＫｉ６７（分裂可能な細胞のマーカー）も陰性であった。従って、ＳＤＩＡ法で誘導されたＭａｔｈ１陽性細胞は小脳の顆粒細胞ではなく、橋、延髄、脊髄等のＭａｔｈ１陽性細胞であると想定された。
以上より、本発明の方法が、ＥＳ細胞からの小脳神経細胞の分化誘導に初めて成功したことが確認された。
実施例１１：ＳＦＥＢ法による網膜前駆細胞の分化誘導
ＥＢ５細胞をＳＦＥＢ法によって５日間無血清浮遊培養を行い、その後細胞塊をそのまま、ポリＤリジン・ラミニン・フィブロネクチンコートした細胞培養用スライドに播種し、ＫＳＲを含むＳＦＥＢの分化培地のまま、合計８日間培養した。網膜前駆細胞特異的なマーカーＲｘに対する自ら作成した抗体を用いて免疫染色を行ったところ、１５−３０％程度の細胞塊（コロニー）にＲｘ陽性の細胞集団が確認された。培養開始後３〜５日の間に５％牛胎児血清、または１００ｎｇ／ｍｌアクチビン（Ｒ＆Ｄ製）処理、または３−３０ｎＭ Ｓｈｈ処理をすることで、Ｒｘのコロニー陽性率が５０％（約２倍）に増加した。さらに、別途培養０−５日に１μｇ／ｍｌ Ｄｋｋ１、０．５μｇ／ｍｌ Ｌｅｆｔｙ−Ａを添加することで、約７割のコロニーがＲｘ陽性となり、細胞レベルでも１０−１５％程度の細胞が陽性となった。Ｄｋｋ１、Ｎｏｄａｌ処理と同時に、さらに血清、又はＳｈｈ、またはアクチビン処理を行うことも可能であり、コロニー陽性率がさらに５−１０％程度上昇した。また、これらの細胞を長期（計１４〜１８日）接着培養することで、１−５％のコロニーに複数の視細胞マーカーＣｒｘやロドプシン陽性の細胞を確認した。ＥＳ細胞よりＳＦＥＢ法でＬｅｆｔｙＡ（０−５日目に添加）、Ｄｋｋ１（０−５日目に添加）、血清（３−５日目のみに添加）、アクチビン（４−６日目のみに添加）存在下に培養した場合、全体の２−３割の細胞が網膜前駆細胞に分化したが、これらの細胞を蛍光標識後、胎生１７．５日のマウス網膜組織と１２日間共培養することで、２割の細胞が視細胞マーカーロドプシン陽性になった。特に網膜組織の視細胞層内に侵入した細胞については、その４割はマーカーロドプシン陽性であり、外節構造など視細胞に特異的な形態を示した。
実施例１２：ヒトＥＳ細胞を用いた神経分化誘導
ヒトＥＳ細胞は京都大学再生医科学研究所中辻憲夫研究室で樹立したヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞をヒトＥＳ細胞に関する指針に従い、分与を受け、中辻憲夫研究室の方法に従い、３７℃にて５％ＣＯ２下に、マウス胎児線維芽細胞（マイトマイシン処理で不活性化；ＭＥＦ）を蒔いたプラスチック培養皿の上で維持培養した。用いた培養液はＤ−ＭＥＭ−Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１）をベースに、最終２０％のＫＳＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１Ｘ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加したものである。植え継ぎは３−４日毎におこない、解離液（リン酸バッファー緩衝生理的食塩水に０．２５％トリプシン、１ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼＩＶ液、１ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したもの；すべてｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、ＥＳ細胞をフィーダー細胞から解離し、ピペット操作で１００個程度の小塊にしたのち、前日に播種したＭＥＦのフィーダー層のうえに蒔いた。
神経分化誘導には、上記の解離させたＥＳ細胞小塊を、３５ｍｍの培養皿に３５００塊の割合で播種し、１５日間無血清浮遊凝集塊培養を行った。培養液は２ｍｌの分化誘導培地（マウスを同様のＧ−ＭＥＭ、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノールを添加したもの；ただし、ＫＳＲは５％、１０％または２０％の添加を試した）を用いた。さらに分化誘導培養開始後最初の１０日間はＮｏｄａｌ阻害剤のＬｅｆｔｙ Ａ（１μｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ阻害剤のＤｋｋ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ阻害剤の可溶性ＢＭＰＲ１Ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍｌ；すべてＲ＆Ｄ社製）を添加した。１５日間の無血清浮遊培養後、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／フィブロネクチンでコートした培養皿上に播種し、接着培養（培養液は同じ分化誘導培地）を５日間行い、固定し免疫染色を行った。
その結果、ヒトＥＳ細胞はＫＳＲが１０％および２０％存在下に無血清浮遊凝集塊培養が可能であった。５％ＫＳＲでは増殖が悪く、１５日間の浮遊培養により多くが死滅した。５日間の接着培養後の免疫染色では、ほぼすべての細胞コロニーで神経前駆細胞マーカーのネスチンが陽性で、未分化ＥＳ細胞マーカーのＯｃｔ３／４は陰性であった。大脳前駆細胞のマーカーＢｆ１は５０％のコロニーで陽性であった。
（考察）
ＳＦＥＢにおける選択的神経分化
本発明者らは、インビトロにおいて、ＥＳ細胞の選択的神経分化を可能にする浮遊凝集塊体の培養法の開発に成功した。この手順の効率、速度、扱いやすさは、ＳＤＩＡ法に匹敵する。ＳＦＥＢ法は、フィーダー細胞、血清、神経パターン形成活性を有する増殖因子（例えば、ＦＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ）の存在を必要としない。むしろ、神経分化の効率は、内因性Ｗｎｔ及びＮｏｄａｌシグナルが拮抗される場合に、さらにより増強される。これらの知見は、ＥＳ細胞の浮遊凝集体が、阻害因子の非存在下で神経分化プログラムを自律的に開始することを示す。原始内胚葉、中胚葉を効率的に生じる、血清含有培地中で培養された胚様体（ＥＢ）と対照的に、４％未満のＳＦＥＢ凝集体のみが、原始内胚葉マーカーＡＦＰ及びＨｎｆ４、又は中胚葉マーカーＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ陽性の細胞をごく一部含んでいた。
興味深いことに、ＥＳ細胞凝集体の浮遊培養物自体は、接着培養物とは、細胞運命の規定に対して異なる効果を有するようである。例えば、コラーゲンコートしたディッシュ上で培養され、ＢＭＰ（５ｎＭ）処理されたＥＳ細胞は、ｆｌｋ１＋外側板に効率的に分化誘導される。一方、ＳＦＥＢ法により培養され、ＢＭＰ処理されたＥＳ細胞は、Ｅ−ｃａｄ＋／Ｏｃｔ３／４−細胞（典型的には非外胚葉）を効率的に生成するが、神経分化を完全に抑制しつつｆｌｋ１＋細胞を生成しなかった。これらのＲＮＡプロフィールの解析により、この差異を調節しているシグナリングの種類を解明することは興味深い。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明の方法によれば、神経系細胞、感覚器系細胞を効率的に分化誘導できるため、神経変性疾患、感覚器疾患等に対する細胞治療の応用が可能となる。また、本発明の方法によれば、従来の分化法では困難であった前脳組織（特に終脳組織）を効率的に分化誘導でき、また、従来成功し得なかった小脳組織の分化誘導を可能とするため、前脳組織、小脳組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用が可能となる。さらに、本発明によれば、誘導源として動物由来細胞を使用していないため、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減することが可能となる。
本出願は、２００４年６月１８日に日本で出願された特願２００４−１８１７７０を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法、当該方法により得られる細胞培養物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞は、パーキンソン病や糖尿病に対する細胞移植への細胞ソースの有力な候補である。しかし、マウス、ヒトの霊長類に由来する胚性幹細胞も培養および分化誘導にマウス由来の支持細胞（ストローマ細胞）との共存が必要であることが多く、このことが臨床応用へ向けての大きな障壁となっている。
最近、本発明者らは、マウスやサルの胚性幹細胞から高効率で神経細胞へ分化誘導する方法（ＳＤＩＡ法）を開発した（国際公開ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット、国際公開ＷＯ０３／０４２３８４号パンフレット、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２８，ｐ．３１−４０（２０００）、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５８０−１５８５（２００２）、Ｍｉｚｕｓｅｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．１００，ｐ．５８２８−５８３３（２００３）、Ｏｏｔｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４４，ｐ．２６８９−２６９３（２００３）参照）。この方法を用いて、パーキンソン病の移植治療への応用が期待されるドパミン分泌神経細胞、筋萎縮性側索硬化症への治療応用が想定されている運動ニューロンの試験管内産生にマウス、サルの胚性幹細胞から成功している（国際公開ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット、国際公開ＷＯ０３／０４２３８４号パンフレット、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２８，ｐ．３１−４０（２０００）、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５８０−１５８５（２００２）、Ｍｉｚｕｓｅｋｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．１００，ｐ．５８２８−５８３３（２００３）、Ｏｏｔｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４４，ｐ．２６８９−２６９３（２００３）参照）。また、胚性幹細胞から神経細胞を分化誘導する他の方法としては、多段階分化法が知られている（Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１８，ｐ．６７５−６７９（２０００）参照）。
しかしながら、ＳＤＩＡ法、多段階分化法では、ドパミン神経などの中脳組織は効率良く分化誘導できるが、終脳組織等の前脳組織は低効率でしか誘導できなかった。
以上のような背景から、胚性幹細胞から終脳組織等の前脳組織を効率良く分化誘導できる方法の開発が切望されていた。
【発明の概要】
【０００３】
従って、本発明の目的は、胚性幹細胞の分化誘導、特に終脳組織等の前脳組織への分化誘導を可能とする、実用性の高い方法を開発することである。
本発明者らは、ＳＤＩＡ法、多段階分化法により前脳組織、特に終脳組織が低効率でしか分化誘導できなかった理由として、１）ＳＤＩＡ法におけるフィーダー細胞との共培養、２）多段階法における線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の培地への添加、３）胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の血清及びレチノイン酸（ＲＡ）処理が、前脳を分化誘導し難い環境を作っているとの仮説をもとに、フィーダー細胞、ＦＧＦ、血清、ＲＡの非存在下において胚性幹細胞の分化誘導条件を鋭意検討した。その結果、本発明者らは、無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養により、ＥＳ細胞から神経系細胞を高効率で分化誘導できること、特に、フィーダー細胞、ＦＧＦ、血清及び／又はＲＡの非存在下という条件により、並びに他の種々の培養条件を至適化することにより、８５〜９５％の細胞を神経系細胞に分化誘導できることを見出した。また、同時に、かかる条件下での培養により、終脳組織等の前脳組織及び小脳組織のみならず、感覚器系細胞を効率良く分化誘導することにも成功した。さらに、この方法によれば、誘導源として動物由来細胞を使用することなく胚性幹細胞を分化誘導できるため、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植が同種移植のリスクレベルまで軽減できる。即ち、本発明は下記の通りである：
（１）無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法；
（２）胚性幹細胞の浮遊凝集体がフィーダー細胞の非存在下で培養される、上記（１）の方法；
（３）胚性幹細胞の浮遊凝集体が、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で培養される、上記（１）の方法；
（４）胚性幹細胞の浮遊凝集体が、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で培養される、上記（１）の方法；
（５）Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａである、上記（３）又は（４）の方法；
（６）Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１である、上記（３）又は（４）の方法；
（７）無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない培地である、上記（１）の方法；
（８）無血清培地が、ＦＧＦを実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（９）無血清培地が、レチノイン酸を実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（１０）無血清培地が、ＢＭＰを実質的に含有しない培地である、上記（１）又は（２）の方法；
（１１）培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌである、上記（１）の方法；
（１２）胚性幹細胞の培養が、細胞非接着性培養器中で行われる、上記（１）の方法；
（１３）胚性幹細胞の浮遊凝集体が少なくとも５日間培養されることを特徴とする、上記（１）の方法；
（１４）神経系細胞の分化誘導方法である、上記（１）の方法；
（１５）胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養後に、接着培養することをさらに含む、上記（１）の方法；
（１６）前脳神経細胞の分化誘導方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（１７）終脳神経細胞の分化誘導方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（１８）Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（１）又は（１５）の方法；
（１９）Ｓｈｈシグナル促進剤がＳｈｈである、上記（１８）の方法；
（２０）腹側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（２１）Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下で接着培養を行う、上記（１５）の方法；
（２２）Ｗｎｔシグナル促進剤がＷｎｔ３ａである、上記（２１）の方法；
（２３）背側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、上記（１）又は（１５）の方法；
（２４）Ｗｎｔシグナル促進剤及び／又はＢＭＰシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（１）の方法；
（２５）ＢＭＰシグナル促進剤及び／又はＦＧＦの存在下で培養する、上記（１）の方法；
（２６）小脳神経細胞の分化誘導法である、上記（１）、（２４）又は（２５）の方法；
（２７）小脳顆粒細胞又は小脳プルキンエ細胞の分化誘導法である、上記（１）、（２４）又は（２５）の方法；
（２８）無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養中に血清を添加することを特徴とする、上記（１）の方法；
（２９）Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（２８）の方法；
（３０）Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の存在下で培養する、上記（２８）又は（２９）の方法；
（３１）Ｗｎｔシグナル阻害剤及び／又はＮｏｄａｌシグナル阻害剤の存在下で培養する、上記（２８）又は（２９）の方法；
（３２）Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｄｋｋ１及びアクチビンの存在下で培養する、上記（２８）の方法；
（３３）感覚器系細胞の分化誘導法である、上記（２８）の方法；
（３４）網膜系細胞の分化誘導法である、上記（３２）の方法；
（３５）無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得られる、胚性幹細胞の浮遊凝集体；
（３６）上記（１）〜（３４）のいずれかの方法により得られうる細胞培養物；
（３７）ＥＳ細胞から分化誘導された小脳神経細胞；
（３８）小脳顆粒細胞である、上記（３７）の細胞；
（３９）小脳プルキンエ細胞である、上記（３７）の細胞；
（４０）ＥＳ細胞から分化誘導された、視細胞への分化能を有する網膜系細胞。
本発明は、神経系細胞、感覚器系細胞を効率的に分化誘導できるため神経変性疾患、感覚器疾患等に対する細胞治療の応用という観点から有用である。本発明はまた、従来の分化法では困難であった前脳組織（特に終脳組織）を効率的に分化誘導でき、また、従来成功し得なかった小脳組織の分化誘導を可能とするとともに、視神経に効率良く分化され得る網膜組織の分化誘導を可能とするため、前脳組織、小脳組織、網膜組織等の組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用という観点から特に有用である。本発明はさらに、誘導源として動物由来細胞を使用することなく胚性幹細胞を分化誘導でき、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減できるため有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明は、無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法を提供する。以下、本発明の詳細を説明する。
（１．胚性幹細胞）
「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。
胚性幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。
具体的には、本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、および胚性幹細胞Ｉ又はＩＩの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩＩ」と省略）が挙げられる。
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、ＲｉｄｅｏｕｔＩＩＩら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、より好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
胚性幹細胞ＩＩＩは、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。胚性幹細胞ＩＩＩの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行なうことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
また、胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
胚性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、胚性幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＳｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
（２．本発明の方法により胚性幹細胞から分化誘導可能な細胞）
本発明の方法により、胚性幹細胞の分化細胞を得ることができる。胚性幹細胞の分化細胞は、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、外胚葉系細胞のいずれであってもよいが、好ましくは外胚葉系細胞である。外胚葉系細胞としては、例えば、神経系細胞、表皮系細胞、感覚器系細胞、色素細胞、神経堤由来間葉細胞が挙げらる。
本発明の方法により得られた細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。例えば、本発明の方法により得られた細胞が内胚葉系細胞又は中胚葉系細胞であるか否かは、内胚葉系細胞マーカー（例えば、Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ）、中胚葉系細胞マーカー（例えば、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｌｋ１、Ｍｏｘ）の発現により確認できる。
本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞であるか否かは、例えば、神経系細胞マーカーの発現により確認できる。神経系細胞マーカーとしては、例えば、ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、セロトニン、ネスチン、ＭＡＰ２、ＭＡＰ２ａｂ、ＮｅｕＮ、ＧＡＢＡ、グルタメート、ＣｈＡＴ、Ｓｏｘ１が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞であるか否かは、表皮系細胞マーカー（例えば、サイトケラチン）、感覚器系細胞マーカー（例えば、ＲＰＥ、ロドプシン）、色素細胞マーカー（例えば、ＴＲＰ−１）、神経堤由来間葉系細胞マーカー（例えば、ＳＭＡ）の発現により確認することもできる。
以下、本発明の方法により分化誘導可能な外胚葉系細胞の例として、神経系細胞、感覚器系細胞について詳述する。
（２．１．神経系細胞）
本発明の方法により得られる神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。
神経幹細胞とは、神経細胞、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）およびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞をいい、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。従って、神経幹細胞であることを確認する方法としては、実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、インビトロで神経幹細胞を神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化誘導させて確認する方法などが挙げられる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８，３８９（１９９７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，５３４（１９９９））。また、このような機能を有した神経幹細胞は、神経前駆細胞での発現が確認されているマーカーである細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン抗体で染色可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））。従って抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。
神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。ドパミン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞を総称してカテコールアミン分泌神経細胞と呼ぶ。
あるいは、本発明の方法により得られる神経幹細胞、神経細胞等の神経系細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる神経系細胞は、高頻度、例えば約８０％以上、好ましくは約８０〜９０％の頻度で、Ｓｏｘ１陽性である。また、本発明の方法により得られる神経系細胞は、後述する前脳神経細胞マーカー、小脳神経細胞マーカーが陽性であることを特徴とする。
別の観点では、神経細胞は、神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。これらの存在部位で分類される神経細胞としては、例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられる。本発明の方法はこれら任意の神経細胞を分化誘導できるが、なかでも、前脳神経細胞、小脳神経細胞を効率的に分化誘導できる。以下、前脳神経細胞、小脳神経細胞について詳述する。
（２．１．１．前脳神経細胞）
本発明の方法によれば、神経細胞として前脳神経細胞、特に終脳神経細胞がより効率的に分化誘導できる。前脳神経細胞とは、前脳組織（即ち、終脳及び間脳から構成される組織）に存在する神経細胞、あるいは前脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。前脳神経細胞は、終脳神経細胞、間脳神経細胞（例えば、視床細胞、視床下部細胞）に分類できる。終脳神経細胞はさらに、背側細胞（例えば、大脳皮質細胞）、腹側細胞（例えば、大脳基底核細胞）に分類できる。
本発明の方法により得られた細胞が前脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、前脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。前脳神経細胞マーカーとしては、Ｏｔｘ１（前脳）、Ｂｆ１（終脳）、Ｅｍｘ１（終脳背側）、Ｇｓｈ２及びＮｋｘ２．１（終脳腹側）などが挙げられる。
本発明の方法によれば、前脳神経細胞のなかでも終脳神経細胞を効率的に分化誘導できる。
一つの局面では、本発明の方法は、終脳神経細胞のなかでも、腹側終脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、腹側前脳神経細胞への分化を抑制することができる。腹側終脳神経細胞とは、腹側終脳組織に存在する神経細胞、あるいは腹側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。腹側終脳組織としては、例えば、大脳基底核が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が腹側終脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、腹側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。腹側終脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳基底核神経細胞マーカー（例えば、Ｇｓｈ２、Ｍａｓｈ１）、視床下部神経細胞マーカー（例えば、Ｎｋｘ２．１、Ｎｋｘ２．２）が挙げられる。
別の局面では、本発明の方法は、終脳神経細胞のなかでも、背側終脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、背側前脳神経細胞への分化を抑制することができる。背側終脳神経細胞とは、背側終脳組織に存在する神経細胞、あるいは背側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。背側終脳組織としては、例えば、大脳皮質が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が背側終脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、背側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。背側終脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳皮質神経細胞マーカー（例えば、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ１）が挙げられる。
あるいは、別の観点では、本発明の方法により得られる前脳神経細胞（特に、終脳神経細胞）は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる前脳神経細胞は、高頻度、例えば約１０％以上、好ましくは約１０〜５０％、より好ましくは約１０％〜３０％の頻度で、Ｂｆ１陽性である。従来のＳＤＩＡ法では、約１％の頻度でしか、胚性幹細胞からＢｆ１＋細胞を分化誘導できなかったが、本発明の方法により、高頻度でＢｆ１＋細胞を得ることが可能となった。
本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約２０％以上、好ましくは約２０〜８０％、より好ましくは約２０〜５０％の細胞が、Ｇｓｈ陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５％以上、好ましくは約５〜５０％、より好ましくは約５〜２０％の細胞が、Ｎｋｘ２．１陽性であり得る。さらに、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約１０％以上、好ましくは約１０〜９０％、より好ましくは約１０〜５０％の細胞が、Ｐａｘ陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５％以上、好ましくは約５〜５０％、より好ましくは約５〜２０％、最も好ましくは約１０〜２０％の細胞が、Ｅｍｘ１陽性であり得る。
（２．１．２．小脳神経細胞）
本発明の方法によれば、神経細胞として小脳神経細胞が効率的に分化誘導できる。小脳神経細胞とは、小脳組織に存在する神経細胞、あるいは小脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。小脳神経細胞としては、例えば、小脳顆粒細胞、プルキンエ細胞、これら細胞の前駆細胞が挙げられる。小脳神経細胞の分化誘導に成功したという報告はこれまでになされていなかったが、本発明の方法により、小脳神経細胞を得ることが可能となった。
本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、小脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。小脳神経細胞マーカーとしては、例えば、小脳顆粒細胞マーカー（例えば、Ｍａｔｈ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１）、プルキンエ細胞マーカー（例えば、Ｌ７）が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞であるか否かは、その表現型により確認できる。例えば、得られた細胞が小脳顆粒細胞であるか否かは、平行線維軸索に接着して移動可能であること、及び／又はＴ型の軸索が伸長していることを識別することで確認できる。
あるいは、本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、高頻度、例えば３０％以上、好ましくは約３０〜６０％、より好ましくは約４０％〜５０％の頻度で、Ｍａｔｈ１陽性である。
本発明の方法により得られるＭａｔｈ１＋細胞のうち、例えば約４０％以上、好ましくは約４０〜６０％、より好ましくは約５０％の細胞が、Ｐａｘ６及び／又はＺｉｃ１陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＭａｔｈ１＋細胞のうち、例えば約４０％以上、好ましくは約４０〜８０％、より好ましくは約５０〜６０％の細胞が、Ｋｉ６７陽性であり得る。
（２．２．感覚器系細胞）
本発明の方法によれば、胚性幹細胞から感覚器系細胞が効率的に分化誘導できる。感覚器系細胞とは、感覚器に存在する神経細胞、あるいは感覚器に存在する細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。本発明の方法により得られる感覚器系細胞としては、網膜細胞、嗅上皮細胞、内耳有毛細胞が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が感覚器系細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、感覚器系細胞マーカーの発現により確認できる。感覚器系細胞マーカーとしては、例えば、Ｒｘ（網膜前駆細胞）、Ｃｒｘ（視細胞）、ロドプシン（視細胞）が挙げられる。
本発明の方法によれば、感覚器系細胞のなかでも網膜系細胞（即ち、網膜細胞又はその前駆細胞）を効率的に分化誘導できる。
あるいは、本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは約５〜２０％、より好ましくは約１０％〜１５％の頻度で、Ｒｘ陽性である。
本発明の方法により得られるＲｘ＋細胞のうち、例えば約１％以上、好ましくは約１〜１０％、より好ましくは約１〜５％の細胞が、Ｃｒｘ及び／又はロドプシン陽性であり得る。
本発明の方法により得られる網膜系細胞は、網膜組織との組織培養により、視細胞に効率良く分化し、例えば約１０％以上、好ましくは約１０％〜３０％（例、約２０％）のロドプシン陽性率を示し得る。本発明の方法により得られる網膜系細胞はまた、視細胞層内への侵入能を有し、視細胞内に侵入した細胞の約３０％以上、例えば約３０％〜５０％（例、約４０％）がロドプシン陽性であり得、さらに、外節構造などの視細胞特異的な形態を示し得る。
（３．無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養方法）
胚性幹細胞を「浮遊凝集体として培養する」とは、集合し塊を形成した胚性幹細胞群を、培養培地中において、細胞培養器に対し非接着性の条件下で培養することをいう。以下、このような培養を、必要に応じて浮遊培養と省略する。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、浮遊凝集体の形成をより容易にするため、並びに／あるいは、効率的な分化誘導（例えば、神経系細胞、感覚器系細胞等の外胚葉系細胞への分化誘導）のために、フィーダー細胞の非存在下で培養を行うのが好ましい。
浮遊培養で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培地としては無血清培地が用いられる。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。
浮遊培養で用いられる無血清培地は、例えば、血清代替物を含有するものであり得る。血清代替物は、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
また、本発明の方法で用いられる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。例えば、２−メルカプトエタノールは、胚性幹細胞の培養に適する濃度で使用される限り限定されないが、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭ、より好ましくは約０．２ｍＭの濃度で使用できる。
浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）を使用できる。
浮遊培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。
培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体をより効率的に形成させるように適宜設定できる。培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば、約１×１０４〜約５×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約３×１０４〜約１×１０５細胞／ｍｌであり得る。
浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。
具体的には、浮遊培養としては、例えば、胚性幹細胞の維持培養後、分散処理した胚性幹細胞を適切な培地（例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地５００ｍｌに５％のＫＳＲ、１００×非必須アミノ酸溶液５ｍｌ、１００×ピルビン酸５ｍｌおよび１×１０−１Ｍ ２−メルカプトエタノール０．５ｍｌを添加した培地。必要に応じて後述する因子などを適量含んでいてもよい。）に懸濁し、細胞非接着性の培養器に、１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で播種し、例えば、少なくとも５日間３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法が挙げられる。
浮遊培養後、凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、次いで細胞を接着条件下でさらに培養できる（以下、必要に応じて接着培養と省略）。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は、当業者であれば容易に決定できる。
浮遊培養及び接着培養では、既知の分化誘導物質を併用できる。例えば、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する場合には、既知の神経系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＮＧＦ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，５５２（１９９４））、レチノイン酸（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８，３４２（１９９５）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１０５６（１９９６））、ＢＭＰ阻害因子（Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３３３−３３６（１９９５））、ＩＧＦ（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，３０２３−８（２００３））が挙げられる。また、胚性幹細胞から感覚器系細胞を分化誘導する場合には、既知の感覚器系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＦＧＦ、Ｓｈｈ、血清などが挙げられる。
上述した浮遊培養法、及び浮遊培養と接着培養との組合せ法によれば、培養期間等を適宜設定することで、胚性幹細胞から外胚葉系細胞等の分化細胞を得ることができる。しかしながら、後述する方法論を適宜さらに組合せることで、神経系細胞、感覚器系細胞をより効率的に分化誘導できる。
（３．１．神経系細胞の分化誘導）
神経系細胞として前脳神経細胞、小脳神経細胞の分化誘導を例に挙げ、より好適な浮遊培養を行うために組合せるべき方法論を以下詳述する
（３．１．１．前脳神経細胞の分化誘導）
前脳神経細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、前脳神経細胞の分化効率の向上・安定化等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。
ＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。ＢＭＰシグナル促進剤としては、例えば、ＢＭＰファミリーに属する蛋白（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＧＤＦ）、ＢＭＰ受容体、Ｓｍａｄ蛋白が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰ４である。
ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地とは、ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを全く含有しない無血清培地、あるいは胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量でこれら因子を含有する無血清培地をいう。かかる無血清培地は、例えば、培地成分としての上記因子の未添加、または上記因子を含有する培地からの上記因子の除去処理（例えば、抗ＦＧＦ抗体、抗ＲＡ抗体、抗ＢＭＰ抗体の使用）により調製できる。
ＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地とは、上記因子を含有する無血清培地に対する阻害剤の添加により、胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまでＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。かかる無血清培地は、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤に対する阻害剤を適量培地に添加することで適宜調製できる。ＦＧＦ阻害剤としては、例えば、抗ＦＧＦ抗体、可溶型ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、Ｓｕ５４０２）が挙げられる。ＲＡ阻害剤としては、例えば、抗ＲＡ抗体、可溶型ＲＡ受容体、ＲＡ受容体阻害剤が挙げられる。ＢＭＰシグナル阻害剤としては、例えば、抗ＢＭＰ抗体、可溶型ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体阻害剤が挙げられる。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養において、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤を含有する無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤が不活化されていない無血清培地を使用することも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
別の方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化効率を向上・安定化させる場合に有用である。また、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤の併用により、さらに著しい効果が期待できる。
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｌｅｆｔｙ−Ｂ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、Ｌｅｆｔｙ−Ａが好ましい。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙについては約０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１．０〜１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５μｇ／ｍｌであり得る。
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白が挙げられるが、なかでも、Ｄｋｋ１又はＣｅｒｂｅｒｕｓ蛋白が好ましい。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０５〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜５．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地、あるいはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を全く含有しない無血清培地、あるいは胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量のＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を含有する無血清培地をいう。Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地は、例えば、培地成分としてのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の未添加、またはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有培地からのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の除去処理により調製できる。
また、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有無血清培地に対するＮｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の添加により、胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまでＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル促進剤としては、例えば、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβファミリーに属する蛋白（例えば、アクチビン）、Ｓｍａｄ蛋白、活性型Ｎｏｄａｌ受容体が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＮｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌである。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ１〜１６）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンが挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＷｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔ３ａである。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に終脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、前脳神経細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
さらに別の方法論は、Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、腹側終脳神経細胞への分化を促進する場合、背側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈが好ましい。
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約１．０〜１０００ｎＭ、好ましくは約５．０〜５００ｎＭ、より好ましくは約１０〜５００ｎＭ、最も好ましくは約３０〜３００ｎＭであり得る。
Ｓｈｈシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、例えば浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降に培地に添加できる。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。Ｓｈｈシグナル促進剤の添加により、胚性幹細胞の腹側前脳神経細胞への分化が促進されること、胚性幹細胞の背側前脳神経細胞への分化が抑制されること等が予想される。従って、Ｓｈｈシグナル阻害剤を用いれば、腹側前脳神経細胞分化の抑制、背側前脳神経細胞分化の促進等の効果が期待できると考えられる。
Ｓｈｈシグナル阻害剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル阻害剤としては、例えば、Ｓｈｈシグナル促進剤に対する抗体、Ｓｈｈシグナル促進剤のドミナントネガティブ変異体、可溶型Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アンタゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈ抗体、Ｓｈｈドミナントネガティブ変異体が好ましい。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、細胞を接着培養に供することができる。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養は、例えば１日以上、好ましくは１〜１４日、より好ましくは２〜５日行うことができる。
さらに別の方法論は、浮遊培養後の接着培養を、Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下で行うことである。かかる方法論は、例えば、背側終脳神経細胞への分化を促進する場合、腹側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
浮遊培養後の接着培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ３ａ）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンなどが挙げられるが、なかでもＷｎｔ３ａが好ましい。
浮遊培養後の接着培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度である限り限定されないが、例えば、Ｗｎｔ３ａについては約０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５．０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、接着培養開始時に既に培地に添加されてもよく、接着培養直後から数日後（例えば、接着培養開始４日以降、または接着培養１０日以内の期間）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル促進剤は、接着培養５日以内の時期に培地に添加される。
上述した各種方法論は、前脳神経細胞、あるいは特定の前脳神経細胞（例えば、終脳神経細胞、腹側終脳神経細胞、背側終脳神経細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
（３．１．２．小脳神経細胞の分化誘導）
小脳神経細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、小脳神経細胞の分化効率の向上等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、ＦＧＦ及び／又はＲＡを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ及び／又はＲＡが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、本方法論の詳細は上述した通りである。
別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、小脳神経細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
また別の方法論は、Ｗｎｔシグナル促進剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、小脳神経細胞、及び特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｗｎｔシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＷｎｔ３ａについては約０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２．０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０〜５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、Ｗｎｔシグナル促進剤は、培養５〜１０日、好ましくは５〜８日の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｗｎｔシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。
さらに別の方法論は、ＢＭＰシグナル促進剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、小脳神経細胞、及び特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、ＢＭＰシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＢＭＰシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＢＭＰ４については約０．０１〜１００ｎＭ、好ましくは約０．０５〜１０ｎＭ、より好ましくは約０．１〜１．０ｎＭ、最も好ましくは約０．５〜１．０ｎＭであり得る。
ＢＭＰシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、ＢＭＰシグナル促進剤は、培養５〜１０日、好ましくは５〜８日の時期に培地に添加される。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、ＢＭＰシグナル促進剤の非存在下で行うことも可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また、小脳神経細胞、特に小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞への効率的な分化を可能とするため、上記２つの方法論を組合せることができる。即ち、Ｗｎｔシグナル促進剤及びＢＭＰシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
また別の方法論は、ＦＧＦの存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。ＦＧＦは、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後に培地に添加してもよい。例えば、ＦＧＦは、培養４〜１２日、好ましくは５〜１０日の時期に培地に添加される。なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、ＦＧＦの非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
浮遊培養に用いられるＦＧＦの濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＦＧＦ８ｂについては約０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり得る。
なお、小脳神経細胞、特に小脳プルキンエ細胞への効率的な分化を可能とするため、上記方法論を組合せることができる。即ち、ＢＭＰシグナル促進剤及びＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ８ｂ等のＦＧＦ８）における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
さらに別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、接着培養に供することができる。例えば、小脳プルキンエ細胞の分化を促進する場合には、凝集塊のまま接着培養に供してもよい。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養は、例えば１日以上、好ましくは１〜２０日間、より好ましくは５〜２０日間、最も好ましくは１０〜１５日間行うことができる。
上述した各種方法論は、小脳神経細胞、あるいは特定の小脳神経細胞（例えば、小脳顆粒細胞、小脳プルキンエ細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
また、得られた小脳神経細胞をさらに分化させることもできる。例えば、実施例９記載のようにＭａｔｈ１＋細胞を分離した後、哺乳動物の胎児又は新生児小脳の分散細胞と凝集させ、共培養することでさらなる分化を誘導できる（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６，４４１−４４７（１９８９）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８，３１３３−３１４４（２００１））。例えば、かかる方法により、平行線維軸索に接着して移動可能であるという特徴、及び／又はＴ型の軸索の伸長という特徴を示す小脳顆粒細胞が得られる（これらは、小脳顆粒細胞の特徴である）。
以上の通り、本発明の方法は、種々の神経系細胞の分化誘導を可能とするため極めて有用である。
（３．２．感覚器系細胞の分化誘導）
感覚器系細胞は、上述した浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。好ましくは、感覚器系細胞の分化効率の向上等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。
一つの方法論は、ＦＧＦ、ＲＡ、ＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地、あるいはＦＧＦ、ＲＡ及びＢＭＰシグナル促進剤からなる群より選ばれる１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地における、胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、本方法論の詳細は上述した通りである。
別の方法論は、浮遊培養を少なくとも５日間継続することである。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞への分化を促進する場合に有用である。なお、５日未満の培養であっても勿論、感覚器系細胞を、従来法に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもない。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊凝集体（数日培養したもの）を含む無血清培地への血清の添加である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。
血清は、任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来する血清を使用できる。血清が由来する哺乳動物は、胚性幹細胞が由来する哺乳動物（上述）と同様である。血清の濃度は、感覚器系細胞を効率的に分化可能であるような濃度である限り限定されないが、例えば約０．５〜３０％、好ましくは約１．０〜２０％、より好ましくは約３〜１０％、最も好ましくは約５％であり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地に血清を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から３〜７日以内である。なお、感覚器系細胞への分化は、血清の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、血清の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
さらに別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊凝集体（数日培養したもの）を含む無血清培地へのＳｈｈシグナル促進剤の添加である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｓｈｈシグナル促進剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、感覚器系細胞への分化を促進可能である限り限定されないが、例えば約０．１〜５００ｎＭ、好ましくは約０．５〜１００ｎＭ、より好ましくは約１．０〜５０ｎＭ、最も好ましくは約３．０〜３０ｎＭであり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地にＳｈｈシグナル促進剤を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から７日以内（例えば、３〜７日）である。なお、感覚器系細胞への分化は、Ｓｈｈシグナル促進剤の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、Ｎｏｄａｌ、アクチビン等のＮｏｄａｌシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。なお、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル促進剤の濃度は、感覚器系細胞をより効率的に産生できる濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎＭ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０〜５００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０〜２００ｎｇ／ｍｌであり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地にＮｏｄａｌシグナル促進剤を添加する時期は、感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から７日以内（例えば、３〜７日後）である。なお、感覚器系細胞への分化は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の非存在下でも可能である。また、浮遊培養の途中に、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも可能である。
また、感覚器系細胞への効率的な分化を可能とするため、上記３つの方法論を組合せることができる。即ち、血清とＳｈｈシグナル促進剤の併用、血清とＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用、Ｓｈｈシグナル促進剤とＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用、血清とＳｈｈシグナル促進剤及びＮｏｄａｌシグナル促進剤の併用もまた好ましい。
さらに別の方法論は、Ｄｋｋ１等のＷｎｔシグナル阻害剤及び／又はＬｅｆｔｙ−Ａ等のＮｏｄａｌシグナル阻害剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、感覚器系細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を促進する場合に有用である。かかる方法論の併用もまた好ましい。なお、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、上記と同様である。
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜５．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１．０μｇ／ｍｌであり得る。
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙ−Ａについては約０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．５μｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル阻害剤及びＮｏｄａｌシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の浮遊培養開始時に既に培地に添加されていてもよく、また、例えば、培養開始から５日以内の時期に培地に添加されてもよい。勿論、異なる時期にそれぞれ培地に添加されてもよい。
また、感覚器細胞（例えば、網膜細胞、視細胞）への分化を特に効率良く行うために、所定の因子の組合せ、例えば、Ｌｅｆｔｙ（例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ）、Ｄｋｋ１、血清およびアクチビンの存在下における胚性幹細胞の浮遊培養もまた好ましい。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｗｎｔシグナル阻害剤及び／又はＮｏｄａｌシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、接着培養に供することができる。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養の期間は、例えば１日以上であり得る。
さらに別の方法論は、浮遊培養後に、接着条件下で長期培養することである。かかる方法論は、感覚器系細胞、特に視細胞への分化を促進する場合に有用である。長期培養のための培養期間は、感覚器系細胞への分化を可能とする期間である限り特に限定されないが、例えば、例えば３日以上、好ましくは５〜２５日間、より好ましくは７〜２０日間、最も好ましくは７〜１８日間であり得る。
上述した各種方法論は、感覚器系細胞、あるいは特定の感覚器系細胞（例えば、網膜系細胞、視細胞）を効率的に得るために適宜組合せることができる。例えば、同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。
以上の通り、本発明の方法は、種々の感覚器系細胞の分化誘導を可能とするため極めて有用である。
（４．細胞培養物、及び医薬としての使用）
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞培養物を提供する。本発明の細胞培養物は、例えば、胚性幹細胞の浮遊凝集体、浮遊凝集体を分散処理した細胞、分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。また、本発明は、かかる細胞培養物より被験体に投与し得る程度に単離・精製された均質な細胞、例えば、終脳神経細胞等の前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、網膜前駆細胞等の感覚器系神経細胞を提供する。
本発明の方法により得られた細胞は、神経系細胞、例えば前脳神経細胞、感覚器系細胞の障害に基づく疾患の治療薬、又はその他の原因による細胞損傷状態において当該細胞を補充するためなどに用いることができる。神経系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。具体的には、前脳神経細胞、特に終脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、脳外傷が挙げられる。また、小脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、脊髄小脳変性症、アルコール性小脳変性症、小脳部の外傷が挙げられる。また、感覚器系細胞の障害に基づく疾患としては、網膜色素変性症、黄班変性症、緑内障、糖尿病性網膜症が挙げられる。さらに、これら細胞の補充が所望される状態としては、脳外科手術後（例えば、脳腫瘍摘出後）が挙げられる。
また、本発明の方法により得られた細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を、当該細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、当該細胞の純度を高めた後に被験体に移植することが好ましい。
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）参照）、パニング法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、上述のような胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。
ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどが挙げられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述した培養方法に準じて、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法を挙げることできる。
ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の培地等を挙げることができる。
また、移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
また、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を得ることができる。このような個体の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。
胚性幹細胞から分化誘導された細胞、例えば神経系細胞は、自体公知の方法により、患者の疾患部位に移植できる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）参照）。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００５】
実施例−１：ＥＳ細胞の浮遊培養物は、血清の非存在下で凝集する
１．１．ＥＢ５細胞の浮遊培養による解析
初めに、無血清浮遊凝集（ＳＦＥＢ：Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｆｌｏａｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法を用いて、マウスＥＳ細胞（Ｅ１４由来）であるＥＢ５細胞（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２４：３７２（２０００））を培養した。
具体的には、ＥＳ細胞としては、１％ウシ胎児血清、１０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による通常の培養法により維持培養されたものをＳＦＥＢ法に用いた（Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．２８：３１−４０（２０００）参照）。次いで、ＥＳ細胞コロニーをトリプシン・ＥＤＴＡ処理で単細胞にした後、細胞非接着性の培養プラスチックシャーレ（１０ｃｍ径）に６×１０４細胞／ｍｌ １０ｍｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。このとき、培地としては、ＧＭＥＭ ５００ｍｌ、１００×ＮＥＡＡ ５ｍｌ、１００×ｐｙｒｕｖａｔｅ ５ｍｌ、１×１０−１Ｍ ２−メルカプトエタノール０．５ｍｌ、５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）からなる分化培地を用いた。また、ゼラチンコート培養ディッシュを用いること以外はＳＦＥＢ法と同様の条件で、ＥＢ５細胞を接着下で培養し、コントロールとした。
その結果、ＳＦＥＢ法によりＥＳ細胞を浮遊凝集培養したとき、ＥＳ細胞は十分に増殖し、多数のＮＣＡＭ＋細胞（＞６０％）を生じた（免疫染色法により解析）。一方、接着培養したコントロールでは、単一のＥＳ細胞は少数の小さなコロニーしか形成せず、また、このコロニーには、僅かなＮＣＡＭ＋細胞（＜２０％）しか含まれていなかった。
１．２．レポーター遺伝子導入マウスＥＳ細胞の浮遊培養による解析
次いで、定量的な解析のため、ＥＳ細胞として、神経マーカーＳｏｘ１遺伝子にＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を相同組換えにてノックインしたマウスＥＳ細胞（以下、必要に応じて、Ｓｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ細胞と省略。Ｎａｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２１：１８３−１８６（２００３）参照）を用いて、ＳＦＥＢ法により培養した。なお、培養条件は、ＥＳ細胞としてＳｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ細胞を用いた以外は、上記１．１．のＳＦＥＢ法と同様であった。
その結果、ＦＡＣＳにより解析したところ、Ｓｏｘ１／ＧＦＰ−ｍＥＳ＋細胞は３〜５日間増加したが、Ｅ−カドヘリン＋細胞は最初の５日間除々に減少した。また、同様の結果が、免疫染色試験により得られた。さらに、ＳＦＥＢ法の５日後には、６０−８５％の細胞がＳｏｘ１−ＧＦＰ陽性であり、培養を３×１０４〜１×１０５初期細胞／ｍｌの範囲で開始した場合に、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団の割合が高かった（＞６０％）。
以上１．１．及び１．２．より、適切な培養条件下で培養したとき、ＥＳ細胞は効率的に凝集し、血清及びフィーダー細胞の非存在下で神経系細胞を速やかに生じることが示された。
実施例２：内因性Ｎｏｄａｌ、Ｗｎｔシグナルの阻害は、ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率をさらに向上させる
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢ法による神経系細胞への分化効率をより向上させるため、中胚葉系細胞への分化促進剤であるＮｏｄａｌ、Ｗｎｔ、ＢＭＰの阻害により、神経系細胞への分化効率が向上するか否かを検討することとした。抗Ｎｏｄａｌ試薬としてはＬｅｆｔｙ−Ａ（Ｒ＆Ｄ社製）、抗Ｗｎｔ試薬としてはＤｋｋ１（Ｒ＆Ｄ社製）、抗ＢＭＰ試薬としてはＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて、ＳＦＥＢ法による培養０日目に分化培地に添加した。なお、用いた濃度は、それぞれＬｅｆｔｙ−Ａ；５μｇ／ｍｌ、Ｄｋｋ１；１μｇ／ｍｌ、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙ；１．５μｇ／ｍｌであった。
その結果、Ｌｅｆｔｙ−Ａ又はＤｋｋ１の添加により、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度が上昇することが明らかとなった。また、上記１．２．の方法では、最適な初期細胞密度５×１０４細胞／ｍｌの条件下でさえも、ＧＦＰ発現の絶対値が実験毎に１０〜１５％程度変動していたが、予想外にも、Ｌｅｆｔｙ−Ａ又はＤｋｋ１の添加によりＧＦＰ発現の値が安定化した。さらに、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｄｋｋ１の併用により、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度が約９０％と著しく増加した。また興味深いことに、初期の細胞密度が高い場合（２×１０５細胞／ｍｌ）であっても、この併用によりＳｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞が高い頻度（約８０％）で保たれた。一方、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｂｏｄｙの添加は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度に有意に影響しなかった。
次いで、本発明者らは、Ｎｏｄａｌ及びＷｎｔの効果を、Ｎｏｄａｌ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社製）及びＷｎｔ３ａ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社製）をＳＦＥＢ培養物に添加することで試験した。その結果、ＳＦＥＢ法における０〜５日目、２〜５日目でのＮｏｄａｌ蛋白質（５μｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ蛋白質（５０ｎｇ／ｍｌ）の添加は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の頻度を有意に抑制することが確認された。
以上より、Ｎｏｄａｌ又はＷｎｔシグナルの阻害により、ＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率が向上し、且つその分化効率が安定化すること、並びにＮｏｄａｌ、Ｗｎｔシグナル双方の阻害により、ＥＳ細胞の神経系細胞への分化効率が著しく向上することが示唆された。
実施例３：ＳＦＥＢ法による神経分化メカニズムの解析
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢ法による神経系細胞への優先的分化が、培養中の幾つかの選択バイアスによって引き起こされているのか、又は神経運命への直接的な分化によって引き起こされているのかを検討することとした。
先ず、本発明者らは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋細胞の割合が増加している培養３日目及び４日目に、非神経集団で細胞死が増加しているか否かをＴＵＮＥＬアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１，６３９−６４８（１９９２））により試験した。
その結果、ＴＵＮＥＬ＋アポトーシス細胞の割合は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−（３日目では５．５±０．７％、４日目では４．８±１．４％、ｎ＝３）と、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋（３日目では４．８±０．９％、４日目では４．６±１．５％、ｎ＝３）集団との間で有意差を示さなかった。このことは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ細胞が、ＳＦＥＢ法による培養中、アポトーシスにより能動的に排除されていないことを示す。
次に、本発明者らは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団における細胞増殖のパラメータをＢｒｄＵ取り込みアッセイ、及びホスホヒストンＨ３免疫染色アッセイにより比較した。
その結果、ＢｒｄＵ標識細胞の割合（３０分間の暴露）は、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−（３日目では４５．３±０．４％、４日目では４０．９±１．２％、ｎ＝３）とＳｏｘ１−ＧＦＰ＋（３日目では４９．６±２．６％、４日目では４２．４±１．１％、ｎ＝３）集団との間で１０％未満の差異を示した。同様の状況が、ホスホーヒストンＨ３＋細胞の比率で観察された（Ｓｏｘ１−ＧＦＰ−集団において、３日目では１．２±０．５％、４日目では１．０±０．７％；Ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋集団において、３日目では１．５±０．７％、４日目では１．３±０．６％、ｎ＝３）。これらの結果は、ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞の神経系細胞への高い分化効率に、増幅の偏りが主要な役割を果たさないことを示す。
以上より、ＳＦＥＢ法による優先的な神経分化が、選択的な細胞死又は増殖ではなく、直接的な神経分化に起因することが示唆された。
実施例４：ＳＦＥＢ法は、ＥＳ細胞が終脳神経細胞に高効率で分化することを可能とする
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５細胞）を、実施例１と同様にＳＦＥＢ法により５日間無血清浮遊培養した後、トリプシン・ＥＤＴＡ処理により分散し、ポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種して、分化培地（上記の通り）で２日間、ＧＭＥＭ＋Ｎ２培地（組成：ＧＭＥＭ＋１ｘＮ−２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ製、ｘ１００濃度のものを希釈して使用）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で３日間培養した。最終的に得られた分化細胞を、抗Ｂｆ１抗体を用いて蛍光抗体法により解析した。なお、比較のため、ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞の神経分化を行い、蛍光抗体法により同様に解析した。
その結果、ＳＦＥＢ法による分化細胞のうち約１５％の細胞が、終脳神経細胞に特異的な核蛋白質であるＢｆ１陽性であった。一方、ＳＤＩＡ法により得られた分化細胞では、Ｂｆ１＋細胞の割合は僅かであった（約１％）。
次いで、Ｂｆ１以外のマーカーの発現について検討することとした。なお、マーカーに対する抗体としては、抗Ｐａｘ６抗体（ＤＳＨＢ製）、抗Ｇｓｈ２抗体、抗Ｎｋｘ２．１抗体を用いた。なお、抗Ｇｓｈ２抗体、抗Ｎｋｘ２．１抗体としては、合成ペプチドをウサギに免疫して自ら作製したものを用いた。
その結果、Ｂｆ１＋細胞のうち、約４０％の細胞が大脳背側部（大脳皮質などが発生）のマーカー（Ｐａｘ６陽性）を発現し、２５％の細胞が大脳腹側中間部（大脳基底核などが発生）のマーカー（Ｇｓｈ２陽性）を発現した。また、１０％程度の細胞が終脳最腹側部（視床下部などが発生）のＮｋｘ２．１を発現していた。
以上より、ＳＦＥＢ法は、ＥＳ細胞から終脳神経細胞への分化を効率的に誘導できること、並びに終脳神経細胞として大脳皮質、大脳基底核、視床下部等の細胞を分化誘導できることが明らかとなった。
実施例５：ＥＳ細胞から終脳神経細胞への分化は、培養後初めの５日間が重要である
ＳＦＥＢ法によるＥＳ細胞のＢｆ１＋細胞への高効率の分化は、極めて興味深い。そこで、ＳＦＥＢ法、ＳＤＩＡ法によるＢｆ１＋細胞への分化率の差異につき、タイムウインドウ（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）の観点から、詳細に検討することとした。
その結果、Ｂｆ１＋細胞は、ＳＦＥＢ法により５日間培養し、次いでＳＤＩＡ法によりさらに５日間培養したとき高頻度に生じた（１１％）。反対に、ＳＤＩＡ法により初めの５日間培養し、ラミニン・ポリ−Ｄ−リジン・フィブロネクチンコートしたディッシュでさらに５日間培養したとき僅かなＢｆ１＋細胞のみが観察された（＜２％）。
以上より、ＥＳ細胞からＢｆ１＋細胞への効率的な分化には、分化誘導期の初めの５日間が決定的な役割を果たすことが示唆された。
実施例６：ＳＦＥＢ法は、レチノイン酸処理の併用により尾側（ｃａｕｄａｌ）組織の前駆細胞を誘導する
次いで、ＳＥＦＡ法と尾側化（ｃａｕｄａｌｉｚｉｎｇ）因子との併用の効果を検討するため、レチノイン酸（ＲＡ）を用いて試験した。なお、ＳＥＦＡ法は、実施例１と同様に行い、ＲＡ（Ｓｉｇｍａ製）は培養３−５日後に０．２μＭとなるように培地に添加した。
その結果、尾側化因子は、Ｂｆ１＋細胞をほぼ完全に排除した（＜１％以下）。また、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、吻側マーカーであるＢｆ１、Ｏｔｘ２がＲＡによるＳＦＥＢ誘導神経細胞において完全に抑制されたのに対し、尾側マーカーＨｏｘｂ４が誘導された。
以上より、ＳＥＦＡ法と尾側化因子とを併用した場合、尾側組織に対応する細胞を分化誘導し得ることが示された。
実施例７：パターン形成因子による亜領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎａｌ）マーカーの変動
次いで、本発明者らは、ＳＦＥＢにおける部分領域マーカーの発現が、外因性のパターン形成（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）因子により変動するか否かを検討することとした。なお、パターン形成因子としては、Ｓｈｈ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。
その結果、ＳＦＥＢ法による培養４日目から、Ｓｈｈを３−３００ｎＭ培地に添加すると、用量依存的様式で、Ｂｆ１＋細胞のうちＰａｘ６＋細胞の割合が著しく減少し、Ｎｋｘ２．１＋細胞、Ｇｓｈ＋細胞などの腹側細胞の割合が約２倍に増加した。また、総細胞数中のＢｆ１＋細胞の占める割合は、Ｓｈｈ処理により影響されなかった。さらに、Ｓｈｈ処理は、ＳＦＥＢ誘導神経組織の長期培養において、腹側終脳の特徴を呈する神経細胞（Ｂｆ１＋／Ｉｓｌｅｔ１／２＋、ＣｈＡＴ＋）を増加させたが、ＧｌｕＴ１＋グルタミン産生神経細胞（典型的には背側）の分化を抑制した。このことは、ＳＦＥＢにより誘導される終脳神経細胞は、胚と同様の様式でＳｈｈシグナリングに応答することを示す。
以上より、ＳＦＥＢ法をＳｈｈ処理と組合せることで、腹側終脳神経細胞を効率的に分化誘導できること、及びＳＦＥＢにより誘導される終脳神経細胞は、胚と同様の様式でＳｈｈシグナリングに応答することが明らかとなった。
実施例８：Ｗｎｔシグナル因子による背側終脳組織の分化誘導
実施例４、６と同様にＥＳ細胞をＳＦＥＢ法で５日間培養し神経分化誘導を行い、引き続き、トリプシン・ＥＤＴＡ処理で分散しポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種して、培養した。Ｗｎｔ３ａを５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で６日目より添加し合計１０日間培養したところ、腹側終脳マーカーであるＮｋｘ２．１、Ｂｆ１両陽性の細胞数は著しく低下し、逆に背側終脳マーカーであるＰａｘ６、Ｂｆ１両陽性の細胞数は増加した。Ｗｎｔ３ａ ５０ｎｇ／ｍｌの場合、Ｂｆ１陽性細胞のうち約７５％が背側マーカーであるＰａｘ６を発現しており、また約１割が大脳皮質前駆細胞のマーカーの一つであるＥｍｘ１を発現した。
以上より、ＳＦＥＢ法においてＷｎｔシグナルを培養後期に作用させることで、背側終脳細胞を効率的に分化誘導できることが示唆された。
実施例９：ＢＭＰとＷｎｔの組合せによる小脳神経前駆細胞の分化誘導
無血清浮遊培養を７日間継続したこと以外は、実施例４と同様にＳＦＥＢ法でＥＳ細胞を神経分化誘導した。培養７日目から１日間の培養にはＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ製）添加のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ製）培地を用いて、浮遊培養を継続した。５日後より培養８日まで０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ製）、１０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ製）、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８ｂ（Ｒ＆Ｄ製）を培地に添加した。培養開始８日後には細胞塊をそのままあるいはトリプシン・ＥＤＴＡ処理による分散後に、ポリＤリジン・ラミニンコートした細胞培養用スライドに播種し、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を用いて、接着培養を行った。９日で免疫染色を行ったところ、小脳顆粒細胞の前駆細胞に特異的なマーカーＭａｔｈ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１を発現している細胞を多数認めた。４０−５０％の細胞がＭａｔｈ１陽性であり、そのうち５０％以上がＰａｘ６やＺｉｃ１陽性であった。さらに小脳顆粒細胞の前駆細胞には分裂が盛んな細胞が含まれていることが知られているが、Ｍａｔｈ１陽性細胞の半分程度が分裂可能な細胞に特異的なマーカーＫｉ６７を発現していた。なお、このような顆粒細胞マーカーの誘導にはＢＭＰおよびＷｎｔの処理が必須であったが、ＦＧＦの処理は必須ではなかった。
さらに培養８日目に細胞塊のままで接着培養を開始したものを合計２０日間培養したところ、約５０％の細胞塊の中に小脳プルキンエ細胞特異的なマーカーＬ７に陽性の大型ニューロンが複数（１０個程度）存在していることが確認された。この分化誘導効率はＢＭＰ４とＷｎｔの組み合わせであるが、ＦＧＦ８ｂとの組み合わせを検討したところ、顆粒細胞の分化と異なり、小脳プルキンエ細胞分化には、ＢＭＰ４とＦＧＦ８ｂとの組み合わせも有効であり、陽性細胞数はＢＭＰ４とＷｎｔの組み合わせに比して４倍に増加した。
小脳顆粒細胞前駆細胞を分離するために、ＥＢ５細胞にＭａｔｈ１プロモーター（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７，１２７，１１８５−１１９６（２０００））下流にＧＦＰを結合したマーカー遺伝子を通常の方法で遺伝子導入した株を樹立した。上記の要領で培養した８−１０日の細胞から蛍光細胞ソーターを用いて、ＧＦＰ陽性分画を分離したところ、約９割の細胞がＭａｔｈ１−ＧＦＰ陽性の細胞に純化された。これらの細胞はＰａｘ６、Ｚｉｃ１などを発現していた。またこれらの細胞を、マウス胎児小脳や新生仔小脳の分散した細胞と凝集させ、共培養することでニューロンへの分化を誘導した（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６，４４１−４４７（１９８９）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８，３１３３−３１４４（２００１））。すると、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞は２日目にはマウス小脳由来の小脳細胞が伸展させた平衡線維軸索に接着した移動をすることが観察され（小脳顆粒細胞の特徴の一つ）、さらに共培養開始後２−３日目からは自ら小脳顆粒細胞の特徴であるＴ型の軸索を伸ばしていることが確認された。
以上より、本発明の方法をＢＭＰ、Ｗｎｔと組合せて用いることにより、小脳組織の神経細胞を分化誘導できることが示唆された。
実施例１０：ＢＭＰとＷｎｔの組合せによる小脳神経前駆細胞の分化誘導
ＥＳ細胞からの小脳組織の分化誘導はこれまで報告がないが、ＳＤＩＡ法で分化させた神経細胞をＢＭＰ４で処理することでＭａｔｈ１が誘導されることは本発明者らが既に報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，５８２８−５８３３参照）。しかし、Ｍａｔｈ１は小脳以外にも橋、延髄、脊髄の背側中枢神経系の神経細胞にも発現しており、Ｍａｔｈ１の発現だけでは小脳組織であるとは云えない。そこで、ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞をＰＡ６細胞上に播種して０．５−１ｎＭのＢＭＰ４を４日ないしは５日目から添加し、９日間培養したところ、１−２割程度の細胞がＭａｔｈ１陽性になった。しかしながら、その殆どの細胞は他の小脳顆粒細胞のマーカーであるＰａｘ６、Ｚｉｃ１などを発現しておらず、またＫｉ６７（分裂可能な細胞のマーカー）も陰性であった。従って、ＳＤＩＡ法で誘導されたＭａｔｈ１陽性細胞は小脳の顆粒細胞ではなく、橋、延髄、脊髄等のＭａｔｈ１陽性細胞であると想定された。
以上より、本発明の方法が、ＥＳ細胞からの小脳神経細胞の分化誘導に初めて成功したことが確認された。
実施例１１：ＳＦＥＢ法による網膜前駆細胞の分化誘導
ＥＢ５細胞をＳＦＥＢ法によって５日間無血清浮遊培養を行い、その後細胞塊をそのまま、ポリＤリジン・ラミニン・フィブロネクチンコートした細胞培養用スライドに播種し、ＫＳＲを含むＳＦＥＢの分化培地のまま、合計８日間培養した。網膜前駆細胞特異的なマーカーＲｘに対する自ら作成した抗体を用いて免疫染色を行ったところ、１５−３０％程度の細胞塊（コロニー）にＲｘ陽性の細胞集団が確認された。培養開始後３〜５日の間に５％牛胎児血清、または１００ｎｇ／ｍｌアクチビン（Ｒ＆Ｄ製）処理、または３−３０ｎＭ Ｓｈｈ処理をすることで、Ｒｘのコロニー陽性率が５０％（約２倍）に増加した。さらに、別途培養０−５日に１μｇ／ｍｌ Ｄｋｋ１、０．５μｇ／ｍｌ Ｌｅｆｔｙ−Ａを添加することで、約７割のコロニーがＲｘ陽性となり、細胞レベルでも１０−１５％程度の細胞が陽性となった。Ｄｋｋ１、Ｎｏｄａｌ処理と同時に、さらに血清、又はＳｈｈ、またはアクチビン処理を行うことも可能であり、コロニー陽性率がさらに５−１０％程度上昇した。また、これらの細胞を長期（計１４〜１８日）接着培養することで、１−５％のコロニーに複数の視細胞マーカーＣｒｘやロドプシン陽性の細胞を確認した。ＥＳ細胞よりＳＦＥＢ法でＬｅｆｔｙＡ（０−５日目に添加）、Ｄｋｋ１（０−５日目に添加）、血清（３−５日目のみに添加）、アクチビン（４−６日目のみに添加）存在下に培養した場合、全体の２−３割の細胞が網膜前駆細胞に分化したが、これらの細胞を蛍光標識後、胎生１７．５日のマウス網膜組織と１２日間共培養することで、２割の細胞が視細胞マーカーロドプシン陽性になった。特に網膜組織の視細胞層内に侵入した細胞については、その４割はマーカーロドプシン陽性であり、外節構造など視細胞に特異的な形態を示した。
実施例１２：ヒトＥＳ細胞を用いた神経分化誘導
ヒトＥＳ細胞は京都大学再生医科学研究所中辻憲夫研究室で樹立したヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞をヒトＥＳ細胞に関する指針に従い、分与を受け、中辻憲夫研究室の方法に従い、３７℃にて５％ＣＯ２下に、マウス胎児線維芽細胞（マイトマイシン処理で不活性化；ＭＥＦ）を蒔いたプラスチック培養皿の上で維持培養した。用いた培養液はＤ−ＭＥＭ−Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１）をベースに、最終２０％のＫＳＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１Ｘ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加したものである。植え継ぎは３−４日毎におこない、解離液（リン酸バッファー緩衝生理的食塩水に０．２５％トリプシン、１ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼＩＶ液、１ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したもの；すべてｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、ＥＳ細胞をフィーダー細胞から解離し、ピペット操作で１００個程度の小塊にしたのち、前日に播種したＭＥＦのフィーダー層のうえに蒔いた。
神経分化誘導には、上記の解離させたＥＳ細胞小塊を、３５ｍｍの培養皿に３５００塊の割合で播種し、１５日間無血清浮遊凝集塊培養を行った。培養液は２ｍｌの分化誘導培地（マウスを同様のＧ−ＭＥＭ、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノールを添加したもの；ただし、ＫＳＲは５％、１０％または２０％の添加を試した）を用いた。さらに分化誘導培養開始後最初の１０日間はＮｏｄａｌ阻害剤のＬｅｆｔｙ Ａ（１μｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ阻害剤のＤｋｋ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ阻害剤の可溶性ＢＭＰＲ１Ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍｌ；すべてＲ＆Ｄ社製）を添加した。１５日間の無血清浮遊培養後、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／フィブロネクチンでコートした培養皿上に播種し、接着培養（培養液は同じ分化誘導培地）を５日間行い、固定し免疫染色を行った。
その結果、ヒトＥＳ細胞はＫＳＲが１０％および２０％存在下に無血清浮遊凝集塊培養が可能であった。５％ＫＳＲでは増殖が悪く、１５日間の浮遊培養により多くが死滅した。５日間の接着培養後の免疫染色では、ほぼすべての細胞コロニーで神経前駆細胞マーカーのネスチンが陽性で、未分化ＥＳ細胞マーカーのＯｃｔ３／４は陰性であった。大脳前駆細胞のマーカーＢｆ１は５０％のコロニーで陽性であった。
（考察）
ＳＦＥＢにおける選択的神経分化
本発明者らは、インビトロにおいて、ＥＳ細胞の選択的神経分化を可能にする浮遊凝集塊体の培養法の開発に成功した。この手順の効率、速度、扱いやすさは、ＳＤＩＡ法に匹敵する。ＳＦＥＢ法は、フィーダー細胞、血清、神経パターン形成活性を有する増殖因子（例えば、ＦＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ）の存在を必要としない。むしろ、神経分化の効率は、内因性Ｗｎｔ及びＮｏｄａｌシグナルが拮抗される場合に、さらにより増強される。これらの知見は、ＥＳ細胞の浮遊凝集体が、阻害因子の非存在下で神経分化プログラムを自律的に開始することを示す。原始内胚葉、中胚葉を効率的に生じる、血清含有培地中で培養された胚様体（ＥＢ）と対照的に、４％未満のＳＦＥＢ凝集体のみが、原始内胚葉マーカーＡＦＰ及びＨｎｆ４、又は中胚葉マーカーＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ陽性の細胞をごく一部含んでいた。
興味深いことに、ＥＳ細胞凝集体の浮遊培養物自体は、接着培養物とは、細胞運命の規定に対して異なる効果を有するようである。例えば、コラーゲンコートしたディッシュ上で培養され、ＢＭＰ（５ｎＭ）処理されたＥＳ細胞は、ｆｌｋ１＋外側板に効率的に分化誘導される。一方、ＳＦＥＢ法により培養され、ＢＭＰ処理されたＥＳ細胞は、Ｅ−ｃａｄ＋／Ｏｃｔ３／４−細胞（典型的には非外胚葉）を効率的に生成するが、神経分化を完全に抑制しつつｆｌｋ１＋細胞を生成しなかった。これらのＲＮＡプロフィールの解析により、この差異を調節しているシグナリングの種類を解明することは興味深い。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明の方法によれば、神経系細胞、感覚器系細胞を効率的に分化誘導できるため、神経変性疾患、感覚器疾患等に対する細胞治療の応用が可能となる。また、本発明の方法によれば、従来の分化法では困難であった前脳組織（特に終脳組織）を効率的に分化誘導でき、また、従来成功し得なかった小脳組織の分化誘導を可能とするため、前脳組織、小脳組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用が可能となる。さらに、本発明によれば、誘導源として動物由来細胞を使用していないため、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減することが可能となる。
本出願は、２００４年６月１８日に日本で出願された特願２００４−１８１７７０を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィーダー細胞の非存在下、無血清培地において、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で、胚性幹細胞の浮遊培養を行い、浮遊凝集体を形成させる工程を含むことを特徴とする、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を含有しない無血清培地である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
胚性幹細胞の浮遊培養が、細胞非接着性培養器中で行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
浮遊培養を少なくとも５日間継続することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
神経系細胞が神経幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
胚性幹細胞の浮遊培養後に、接着培養することをさらに含む、請求項１〜７記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
神経系細胞が終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
神経系細胞が背側終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
神経系細胞が腹側終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
接着培養をＷｎｔシグナル促進剤の存在下で行う、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
Ｗｎｔシグナル促進剤がＷｎｔ３ａである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
神経系細胞が背側終脳神経細胞である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で胚性幹細胞の浮遊培養を行なう、請求項１〜７記載の方法。
【請求項１７】
神経系細胞が腹側終脳神経細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜８、１６及び１７のいずれか１項記載の方法により得られる、浮遊凝集体。
【請求項１】
フィーダー細胞の非存在下、無血清培地において、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で、胚性幹細胞の浮遊培養を行い、浮遊凝集体を形成させる工程を含むことを特徴とする、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を含有しない無血清培地である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
胚性幹細胞の浮遊培養が、細胞非接着性培養器中で行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
浮遊培養を少なくとも５日間継続することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
神経系細胞が神経幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
胚性幹細胞の浮遊培養後に、接着培養することをさらに含む、請求項１〜７記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
神経系細胞が終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
神経系細胞が背側終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
神経系細胞が腹側終脳神経細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
接着培養をＷｎｔシグナル促進剤の存在下で行う、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
Ｗｎｔシグナル促進剤がＷｎｔ３ａである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
神経系細胞が背側終脳神経細胞である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で胚性幹細胞の浮遊培養を行なう、請求項１〜７記載の方法。
【請求項１７】
神経系細胞が腹側終脳神経細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜８、１６及び１７のいずれか１項記載の方法により得られる、浮遊凝集体。
【公開番号】特開２０１２−２４５００７（Ｐ２０１２−２４５００７Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１８３５０８（Ｐ２０１２−１８３５０８）
【出願日】平成２４年８月２２日（２０１２．８．２２）
【分割の表示】特願２００６−５１４８５８（Ｐ２００６−５１４８５８）の分割
【原出願日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月２２日（２０１２．８．２２）
【分割の表示】特願２００６−５１４８５８（Ｐ２００６−５１４８５８）の分割
【原出願日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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