物質の測定方法ならびに測定用組成物
【課題】蛍光物質等を用いた高感度なプロテインアレイを用いた物質の測定法の提供。
【解決手段】高密度にかつ生物活性を安定に保持できる３次元高分子化合物を有する支持体上に、抗体や抗原・レクチンなどの生理活性物質を固定化したプロテインアレイを用い、光学的検出においてきわめて安定な量子ドット蛍光物質を併用することで、高感度で煩雑な増幅操作ステップを必要としない、簡便かつ実用的な測定系が可能となる。この測定系で得られる検出スポットおよび蛍光シグナルは安定で均一であり、信頼性の高い測定結果をもたらす。このプロテインアレイと量子ドット蛍光利用した検出試薬によって、疾患マーカーあるいは疾患予防マーカーの複数項目同時測定が可能となる。
【解決手段】高密度にかつ生物活性を安定に保持できる３次元高分子化合物を有する支持体上に、抗体や抗原・レクチンなどの生理活性物質を固定化したプロテインアレイを用い、光学的検出においてきわめて安定な量子ドット蛍光物質を併用することで、高感度で煩雑な増幅操作ステップを必要としない、簡便かつ実用的な測定系が可能となる。この測定系で得られる検出スポットおよび蛍光シグナルは安定で均一であり、信頼性の高い測定結果をもたらす。このプロテインアレイと量子ドット蛍光利用した検出試薬によって、疾患マーカーあるいは疾患予防マーカーの複数項目同時測定が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、食品試料、環境試料中などに存在する特定物質の測定法ならびにそれらの方法に使用する試薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体やレセプター、レクチンなどのタンパク質を用いた測定系が、医学・薬学・生物学・環境工学など多岐にわたる分野で現在用いられており、物質の測定系・評価系として欠かすことのできないものとなっている。これらの測定系は単一対象を測定するものであることが多いが、少量の対象サンプルを用いて、同時に複数の対象を測定できる、効率の良い評価方法が望まれている。これらの要求を満たす評価法として、多種類の測定対象を評価するためのプロテインアレイ、抗体アレイ（シェーナら、ニールセンら 及び ワンら）、などが近年報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】 「シェーナ編 プロテインアレイ （２００４年） ジョーンズ＆バートレット パブリッシャー」 （Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙ（２００４）Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。
【非特許文献２】 「カムハームパティ編 プロテイン マイクロアレイ テクノロジー（２００４） ワイリーＶＣＨ ヴェルラグ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧａＡ」（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００４）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ）。
【特許文献１】 ワンら 特表２００５−５０４３０９
【０００４】
プロテインアレイ用途として光学的スライドやポリマー素材からなるメンブレンが使用される場合が多い。 スライドとしては、表面にニトロセルロースがコートされた ＦＡＳＴスライド（Ｓ＆Ｓ バイオサイエンス社製：Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）、疎水性ポリマーがコートされた ＳｕｐｅｒＰｒｏｔｅｉｎ スライド（テレコムインターナショナル社製： ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．）、ブラックポリマーがコートされた Ｍａｘｉｓｏｒｐ スライド（ナルジェヌンク社製：Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ ＩＮＣ．）などがある。またガラススライドをベースとして表面にアミノ基、カルボキシル基、チオール基を導入し、タンパク質と化学的に架橋可能としたものも市販されている。
【０００５】
これらの各種スライドに対して、タンパク溶液を各種のアレイヤー・スポッターを用いて、若しくは用手法で、各種形状のスポットを作製してプロテインアレイが作製されている。
【０００６】
これらのプロテインアレイは、例えばアポトーシスに関わる測定対象、セルシグナルに関する測定対象など研究分野の枠ごとにあるいは、特定の疾患、ウイルス感染症に関する測定対象（マーカー）の集団毎に、あるいはそれらを複数含んだ形で構成されており、また構成が想定されている。
【０００７】
商用化されたプロテインアレイは現在大きく分類して、１）網羅的抗体アレイであってディファレンシャル解析に使用される抗体アレイ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ．）製：ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ５００ など）、２）複数の項目が測定できる抗体アレイ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）製：Ｃａｒｔｅｓｉａｎ ＡｒｒａｙＴＭ ＡＫｉｔ Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ など）があるが研究段階として、ケミカルアレイ（ベッターら）、ペプチドアレイ（チアリら）、Ｐ４５０アレイ（サカイ−カトーら）、レクチンアレイ（ピロベロら）など、種々のものが存在する。
【０００８】
【非特許文献３】ベッターら、ジャーナル セル バイオケム サプル ３９巻 ７９頁−８４頁（２００２）（Ｖｅｔｔｅｒ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．（２００２）Ｖｏｌ．３９，ｐｐ７９−ｐｐ８４）
【非特許文献４】チアリら、プロテオミクス ５巻 ３６００頁−３６０３頁（Ｃｈｉａｒｉ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００５）Ｖｏｌ．５，ｐｐ３６００−ｐｐ３６０３）
【非特許文献５】サカイ−カトーら、アナリテイカル ケミストリー ７７巻 ７０８０頁−７０８３頁（２００５年）（Ｓａｋａｉ−Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）Ｖｏｌ．７７，ｐｐ７０８０−ｐｐ７０８３）
【非特許文献６】ピロベロら、ケムバイオケム ６巻 ９８５頁−９８９頁（２００５年）（Ｐｉｌｏｂｅｌｌｏ ＫＴ．ｅｔ．ａｌ．， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）Ｖｏｌ．６，ｐｐ９８５−ｐｐ９８９）
【０００９】
プロテインアレイに用いられている標識物質としては、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３あるいはアレクサ、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ）（エンペドクレスら）等の蛍光物質、ＦＬＡＧなどのタグペプチド、ビオチン・修飾ビオチンあるいはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素がある。
【００１０】
【特許文献２】エンペドクレスら 特表２００３−５２２９６２
【００１１】
さらにアルカリフォスターゼを標識酵素として用い、検出するアルカリフォスファターゼの領域の周辺にビオチン化チラミドを固定化して蛍光標識ストレプトアビジンにて増感させて検出する方法が報告されている（ゲホら）。
【００１２】
【非特許文献７】 ゲホら バイオコンジュゲート ケム １６巻 ５５９頁−５６６頁（２００５年）（Ｇｅｈｏ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（２００５）Ｖｏｌ．１６，ｐｐ５５９−ｐｐ５６６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
プロテインアレイスライドの主なものは、タンパク質を吸着できる絶対的容量が少なく、また安定剤を使用しないと、抗体などのタンパク質の活性を保持しにくいという難点がある。また表面にアミノ基、カルボキシル基を導入したスライドは、抗体などのタンパク質、リガンドのアミノ基等と２価性架橋基でランダムに結合することが多いが、この結合は抗体・タンパク質・リガンド側のどのアミノ基等を使用するかという点で問題がある。特定部位のアミノ基等は、抗原結合活性などに極めて甚大な影響を直接与える。また直接では結合活性を低減させないとしても、結合部位によっては、立体構造的に、測定対象との結合を低減させる場合があり、制御されていない架橋様式はプロテインアレイの作製に好ましくない。
【００１４】
スライド表面のチオール基・アミノ基を制御してタンパク質との架橋に活用する場合もある。固定化対象のタンパク質においては一般的に利用できるチオール基の数は限られており（特に抗体・（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）等）、タンパク質側のアミノ基をマレイミド試薬などで処理した後、スライド表面上のアミノ基と結合させることが可能である。またタンパク質の遊離（還元型）チオール基とスライド表面の還元型チオール基を酸化縮合させて固定化することも可能である。チオール基を利用した場合は、固定化のステップによって本来のタンパク質などの活性を低減する可能性は少ない。しかしながら抗体分子（ＩｇＧ）から（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）を調製する際の、還元処理の実施、目的標品の回収・精製などの処理過程で抗原結合活性は低下し、また収率が低くなる。これらの煩雑な処理ステップは、特にたくさんの種類の抗体を取り扱ってプロテインアレイを作製する場合、抗体のロット管理・処理ステップの品質管理・全体のアレイ性能の管理等を考慮すると、極めて大きな障害となる。
【００１５】
以上に述べた各種スライドに対して、タンパク溶液を各種のアレイヤー・スポッターを用いて、若しくは用手法で、円形・方形状などのスポットを構築することができる（グレイナー バイオ ワン社製 マニュアルマイクロアレイヤー： Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ Ｍａｎｕａｌ Ｍｉｃｒｏ Ａｒｒａｙｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ あるいはパーキンエルマー社製 ピエゾアレイ バイオチップシステム： ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＮＣ．Ｐｉｅｚｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００１６】
網羅的抗体アレイであってディファレンシャル解析に使用される抗体アレイは、比較するサンプル中に含まれるタンパク質のトータル量を等しくした上で、それぞれのサンプルに含まれるタンパク質の全てを２種以上の蛍光色素で標識する必要がある（前述クローンテック社の製品マニュアル参照）。異なる蛍光色素で標識する場合、タンパク質の結合性の変化を生じる可能性もある。
【００１７】
ニトロセルロース等の疎水性担体（スライド・メンブレン）の表面上に複数の抗体をスポット（固定）したアレイが商用化されている。測定法としてはまず、サンプル溶液（測定対象抗原含む）をアレイ上の固定抗体で結合させた後、さらに２次抗体溶液加え複合体を形成させる。さらにこの２次抗体に対するアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、１次抗体−抗原−２次抗体−酵素標識抗２次抗体複合体と、所定の化学合成基質と反応させ、その発光を写真フィルム等に露光し、最終的にシグナルスポットを得る。測定の模式図を［図１］に示す。あるいは酵素反応で可視性の色素として視覚化する方法も可能である。しかしながら酵素反応で生じたプロダクトの拡散性、酵素反応を一律にコントロールすることの難しさ、スポットの形状を均一にすることの困難性などから、これら標識酵素を用いた方法は、ばらつきの大きな測定系となっている。また最終シグナルの範囲が重なりあったりする場合も多く、定量性に疑問が生じる場合もある。この測定形式では、高密度にスポットされたアレイを使用することは限界があり、一般にはマイクロアレイではなくマクロアレイとして使用されている。ケミカルアレイ、ペプチドアレイ、Ｐ４５０アレイ、レクチンアレイなどが、学術上報告されているが、実用性の高いアレイとするにはコスト・再現性・安定性・測定感度など解決すべき問題が多く残されているのが現状である。
【００１８】
標識物質として使用されている、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３は励起光による退色現象が急速に生じるため、解析に必要な時間変化なく蛍光シグナルを維持することは困難である。このことは検出可能となった時点から、できるだけ速やかに測定を完了させることが要求されていることを意味する。また繰り返し同じスライド等を用いて再測定をすることが困難であることも意味する。アレクサ等の蛍光物質は光安定性が改善されてはいるものの、長時間の露光では前述の蛍光色素と同様の問題を生じる
【００１９】
量子ドットによる蛍光物質は光安定性に富み、長時間励起光を照射しても安定である。量子ドット粒子をポリエチレングリコール等でコーテイングし水溶性をあげ、バックグランドを低減させた例もある。しかしながら前述のスライドと水溶性を高めた量子ドットを用いても十分な測定感度が得られないことが多く、必要な感度を得るためには、ペルオキシダーゼなどの標識酵素を用いて、ビオチン化チラミドを標識酵素の周囲に固定化し、シグナル増幅した上でストレプトアビジン標識量子ドットを作用させるという、物理的シグナルの増幅過程が必要となる（前述 ゲホら）。このため酵素反応実施後あらためて、追加の反応ステップを必要とするため、煩雑であり、ばらつきの多い検出方法となる。また抗体反応における非特異的反応だけでなく、ビオチン化チラミドの非特異的反応もあわせて考慮する必要があり、最終的なシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が減少する場合もある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、以上のプロテインアレイによるアッセイ系の問題点を解決すべく鋭意努力を重ねた結果、従来よりも量的に高密度にタンパク質を固定化でき、同時にタンパク質等の活性を保持し、シグナル形成が均一となる手法として、光学的に極めて高い安定性を有する量子ドットによる蛍光物質を検出系として用い、生理活性タンパク質等の固定化を、親水性構造を内包する３次元構造を持った高分子ゲル上で行う方法が極めて適切であることを見出し、またこれによって従来のプロテインアレイの抱える問題点を解決できることを見出し、本発明を完成した。本発明による測定系の例を［図２］に模式図として示す。
【００２１】
すなわち本発明は、
１） 測定対象物質を認識するタンパク質または測定対象物質の全体・一部・類似物から選択される物質を、３次元ゲル化合物内に物理的または化学的に固定化した基板上において、量子ドット蛍光化合物を標識体として、試料中の対象物質を測定することを特徴とするアッセイ方法
に関するものであり、
２） ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子の内、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする１）に記載の方法
に関するものであり、
３） ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上に対して曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする１）に記載の方法
に関するものであり、
４） 測定対象物質が、タンパク質・ペプチド・糖質・脂質・糖脂質・低分子化合物である１）〜３）に記載の方法
に関するものであり、
５） 測定対象物質を認識するタンパク質が、抗体・レセプター・レクチンであることを特徴とする１）−４）の方法
に関するものであり、
６） 固定化した基板が非蛍光性のガラス・プラスチック・金属基板であることもしくは、蛍光検出時に測定を妨害しないガラス・プラスチック・金属基板であることを特徴とする１）−５）の方法
に関するものであり、
７） 測定系において、アビジンもしくはアビジン様物質及びビオチンを使用することを特徴とする１）−６）の方法、
に関するものであり、
８） 測定系において、物理的シグナルの増幅を行うことを特徴とする１）−７）の方法
に関するものであり、
９） 測定系において、チラミド化合物を使用することを特徴とする８）の方法
に関するものであり、
１０） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列を備えた基板を使用することを特徴とする１）−９）の方法
に関するものであり、
１１） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする１）−１０）の方法
に関するものであり、
１２） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に２種類以上の基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする１）−１１）の方法
に関するものであり、
１３） 使用する量子ドット蛍光化合物の粒子の直径が０．１〜２００ｎｍであることを特徴とする１）−１２）の方法
に関するものであり、
１４） 疾患マーカーおよび疾患予防マーカーを測定対象とするものであることを特徴とする１）−１３）の方法
に関するものであり、
１５） １）−１４）の方法に使用するための基板
に関するものであり、
１６） １）−１５）の方法に使用するための試薬組成物
に関するものである。
【００２２】
本発明に使用する固定化の支持基板としてはガラス、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン、金属板等を使用することができ、数センチ×数センチ以下の大きさのものが望ましい。基板の厚みは基板の硬度に応じて設定できるが、取扱いの容易な、０．１〜５ｍｍ程度のものの使用が好ましい。スライド基板は各種の官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオール基等）を有していても良いが、３次元ゲルをそれら基板の上に構築する妨げとなるものを避けるべきである。また３次元ゲルとスライド基板が、反応終了の後、光学的に蛍光を検出できる素材の組み合わせであることが必要である。光学的に透明な基板を使用する場合、蛍光測定は基板の１方向から光を照射し、生じる蛍光を上部で検出すればよいが、金属板のように光学的に不透明な基板を用いる場合は、１方向から光を照射し、生じる蛍光を入射と同じ側で検出する。
【００２３】
本発明に使用する３次元ゲルの構成物としては、ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子の内、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することが可能であり、これらのうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上へ曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することも可能である。ラジカル発生試薬としては、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル、光増感剤であるベンゾフェノン、フォトフィリン、レザフィリン、ポルフィリン系色素、ピロール環等を有する金属錯体、過酸化物等が利用できる。架橋剤としては、ビニルエーテル、アルデヒド化合物、ＥＭＣＳなどのマレイミド化合物等が使用できる。これらの３次元ゲル化合物を担持したスライドを独自の条件にて自作して使用することも出来るが、トラヴィスらあるいはシーら既報に従って作製することができる。また市販品として例えば、グライナー バイオ ワン製 ＨＴＡスライドやパーキンエルマー社製 ハイドロゲルスライド などを使用することも可能である。
【００２４】
【特許文献３】 トラヴィスら 特表２００３−５２４１５０
【特許文献４】 シーら 特表２００４−５１８１３８
【００２５】
３次元ゲルは内部で架橋構造をとることがきるが、その構造はゲル内部の細孔のサイズのコントロールに重要である。抗体やレクチン・レセプター・各種抗原等の活性を保持した状態で固定化後、反応時に固定化物以外の各要素が自由に動きうる孔径（２０〜１０００ｎｍ）となっている必要がある。また３次元ゲルの厚みは１μｍ〜５００μｍの間で選択することができる。蛋白質等はスライド基板の上に、用手あるいはプロテインアレイヤー等の自動機械にてスポットでき、プロテインアレイを作製することができる（グレイナー バイオ ワン社製 マニュアルマイクロアレイヤー： Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ Ｍａｎｕａｌ Ｍｉｃｒｏ Ａｒｒａｙｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ あるいはパーキンエルマー社製 ピエゾアレイバイオチップシステム： ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＮＣ．Ｐｉｅｚｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ、カケンジェネティクス社製 ＤＮＡ／抗体 マイクロアレイヤー など）。用手の場合は数スポット〜数百スポット、アレイヤーの使用により、数スポット〜数千スポットが一度に作製できる。なおアレイの作製は、アレイヤー・スポッターの性能に応じて、コンタクト形式（サンプルを保持したピンが基板と直接接触する形式）あるいはノンコンタクト形式（ピンが基板と接触しない）で実施可能である。数スポット〜千スポットからなるアレイは、目的に応じて基板上に複数設けることができる。
【００２６】
必要な蛋白質をスポット（または塗布）・固定後、ウシ血清アルブミン・ゼラチン等の動物由来の蛋白質、ポリエチレングリコール等の高分子化合物を含む溶液に浸漬または塗布して、３次元ゲルをコーテイングすることができる（この操作はブロッキング操作とも称される）。また糖・アミノ酸・有機酸等の溶液にも浸漬または塗布することができる。糖としてはグルコース・サッカロース・マルトノースの還元糖及び非還元糖、単糖・多糖類を使用でき、アミノ酸としてはグリシン、グルタミン酸等、有機酸としてはマレイン酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸等を使用することができる。さらにはアジ化ナトリウム、プロクリン等の防腐剤を含む溶液を同様に併用することができる。組成物中の各試薬の濃度は、通常免疫血清学分野で使用されている濃度範囲で、適宜選択して設定できる。
各溶液は滅菌フィルター等でろ過し、無菌化したものを使用することが好ましい。
【００２７】
本発明に使用する基板等は真空乾燥機、減圧乾燥機あるいは風乾操作にて乾燥させることができる。作業は、防腐性能等を考慮すると、無菌化されたクリーンベンチやクリーンルーム中で行うことが好ましい。
【００２８】
本発明に使用する量子ドット蛍光物質は、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム等の半導体粒子をそのまま使用することができるが、非特異的反応の抑制のため、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子で粒子表面をコーテイングしておくことが好ましい。量子ドットはその粒子径により、発する蛍光の波長が異なるが、０．１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲のものを目的に応じて使用することができる。なお粒子径１．５ｎｍ以下ではいわゆるホールトラッピング現象の割合が高くなり、蛍光ではなく、白色のりん光を呈することが知られている（バウアーら）。粒子径は基板上の高分子ゲルのポアサイズより小さいだけでなく、各種のタンパク質と連結した場合の全体の大きさもポアサイズより小さいことが、ゲル内での諸反応のために必要である。量子ドットは、クウォンタムドット社（ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ Ｃｏｒｐ．）やエビデントテクノロジー社（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の市販品などを利用できる。
【００２９】
【非特許文献８】 バウアーら ジャーナル アメリカン ケミカル ソサエテイ１２７巻 １５３７８頁−１５３７９頁（２００５）（Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５）Ｖｏｌ．１２７，ｐｐ１５３７８−１５３７９）。
【００３０】
タンパク質と量子ドットの間は、２価性架橋基など種々のリンカー介して連結することができる。またタンパク質とそのタンパク質に対して特異的な結合力を持つタンパク質あるいはリガンドとそのリガンドに対して特異的な結合力を持つタンパク質の関係を利用して連結することも可能である。これらの例として、ビオチン化マウスモノクロナル抗体と量子ドット標識ストレプトアビジンの複合体、ウサギポリクロナル抗体と量子ドット標識プロテインＧの複合体、などが挙げられる。
【００３１】
量子ドットを検出するための光源としては、蛍光発生に必要な励起が可能であればよいが、レーザー光源、紫外線ランプなどが一般に使用できる。励起光を照射するのに必要な時間は、量子ドットが光照射に対して安定であるため特に制限はなく、数時間連続照射も可能である。また測定完了後改めて再測定することも可能である。
【００３２】
本発明に使用する抗体は、研究用試薬、臨床診断薬として市販されているものを使用できる他、免疫原を調製してマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒツジなどに免疫して作製することができる。免疫原としては天然蛋白、人為的に加工したタンパクやペプチドを使用することができる。低分子ペプチドや糖鎖・脂質等の天然低分子、合成化学物質に対する抗体を作製する場合は、それらをハプテンとして血清アルブミンやヘモシアニン等に結合させた蛋白質を免疫原として使用することができる。糖化蛋白などの様に、修飾が天然に生じたものを用いても良い。抗体は、ハーローらの方法に従って作製すればよい。また抗体は完全な形態だけでなく、（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）等のフラグメントの形態をも使用できるし、組換えＤＮＡ技術によって調製された抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ等）も使用可能である。
【００３３】
【非特許文献７】 ハーローら 「抗体の使用法：ラボラトリーマニュアル」（１９９８年）コールドスプリング・ハーバー（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。
【００３４】
本発明に使用する抗体以外のタンパク質は、市販品及び血清等の各種生体試料や組換えＤＮＡ技術によって調製した生体より採取・精製したものを使用することができる。それらの取扱いは相互作用や結合に必要な活性を保つ工夫をして調製されたものが好ましい。またタンパク質は、目的に応じて、完全なものだけでなく、糖鎖や脂質等が脱落した不完全なものも使用することができる。さらに完全長のタンパク質だけでなく一部の断片、ペプチドを使用することも、場合に応じて可能である。
【００３５】
本発明で、抗体等のタンパク質にビオチンやジゴキシゲニンなどの低分子化学物質、タグペプチド等を導入し、検出時に利用することができる。例えばビオチンを導入したタンパク質は、量子ドット標識アビジンあるいは量子ドット標識ストレプトアビジン等で検出可能である。アビジン、ストレプトアビジンは天然由来、組換えタンパク質いずれも使用できる。タンパク質に低分子化学物質、タグペプチドを導入した場合は、それらに対する量子ドット標識抗体を用いて検出することができる。
【００３６】
本発明では、量子ドットシグナルを増幅することなく測定できるが、アルカリフォスファターゼ標識体とチラミド化合物により、ビオチン化チラミドを生成させる増幅系を併用することも可能である。この系は極めて高感度であるため、より短時間の測定が可能である。ビオチン化チラミドの増幅試薬としてダコ社（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ）の製品などが利用できる。
【００３７】
本発明で使用するプロテインアレイ上のスポット数は、目的により２〜数千個の範囲で複数設けることができる。このスポット数は疾患対象の同時評価で必要とするマーカーの種類、各測定対象の予測される濃度範囲などで要求される個数を設定することができるが、プロテインアレイのパフォーマンスと製造コストに大きな影響を与えるため、最適なアレイデザインを実施すべきである。
【００３８】
本発明でいう基準スポットとは、陽性スポット、陰性スポットあるいはアレイスポットの位置確認目的のスポットのことをいう。これらのスポットは測定対象数、測定目的に応じて適宜設定し作製することができるが、それらすべての種類の基準スポットが本発明において不可欠ではなく、取捨選択が可能である。１種以上の基準スポットは測定の規格化、管理のために設置が好ましい。
【００３９】
本発明では種々の測定対象物質を評価・測定することができるが、特に疾患マーカー群の測定および疾患予防マーカーの測定は重要である。疾患関連マーカーとは、例えば糖尿病、腎疾患、癌、高血圧、肝臓疾患、心筋梗塞、リウマチ、アレルギー、アトピー、ストレス、痴呆症、感染症などで特異的に量が増減するマーカー（タンパク質その他）をいい、複数のマーカー（マルチマーカー）を評価することでより、疾患の症状・程度あるいは疾患であることの確度を知ることができる。例えば酸化ストレスを受けた場合、酸化還元に関わる酵素・タンパク質である、スーパーオキサイドデイスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、８−ヒドロキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、ヘキサノイルリジン等の量が変動する。これらのタンパク質は酸化ストレスを受けた場合や糖尿病などの疾患時に変動する。それらのマーカーは疾患者と健常人由来の生体試料中のタンパク質をそれぞれ、例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステム（サイファージェン・バイオシステムズ社：Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ．）や２次元電気泳動システム（ヴィタ社：ＷＩＴＡ ＧｍｂＨ）等を用いて比較することで、発見することが可能である。これらのマーカーは同時に複数活用される場合もある。各マーカーは量的に確保可能であれば、アミノ酸配列・構造決定などをすることなく、定量を目的とした特異的抗体の作製が原則可能である。
【００４０】
病気になった患者の生体試料中において疾患マーカーの存在量が変動するのに対して、疾患予防マーカーは健常時においても変動が認められるものであり、疾患発症前段階としてのリスクを示すものである。疾患予防マーカーとは、例えば糖尿病予防マーカー、高血圧予防マーカー、酸化ストレス傷害予防マーカーなどのことをいう。疾患予防マーカーの変動を適宜知ることができれば、例えば生活習慣を変更・改善したり、あるいは運動療法などを早期に取り入れることで、疾患発症に進むことを防いだり、遅らせたりすることが可能である。これは治療法ではなく、予防法を健常者に提起するよい指標となりうると考えられている。疾患に対して社会全体が費やしている膨大なコストを考えれば、疾患に陥る人の数を予防マーカーの活用で減らすことは、予防マーカー測定に費やすコストに対して、十分見合ったものとなる。
【００４１】
本発明で構成する試薬組成物は、プロテインアレイとして構成された、抗体等のタンパク質を固定化した基板を主体として、例えばサンプル希釈溶液、２次抗体溶液、量子ドット標識抗（２次抗体）抗体溶液、洗浄溶液、測定標準溶液などで構成される。各試薬は一般に免疫血清分野やバイオテクノロジー分野にて知られている研究用試薬、臨床診断薬調製の技術を活用することができる。
【００４２】
本発明で使用するスライド基板等上の蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡、蛍光スライドスキャナーなどで適宜測定が可能であり、所望のデータを取得することができる。なお量子ドットはＵＶ光励起・レーザー光励起が可能であるが、励起光の検出には量子ドットの種類に応じて適宜必要な光学フィルターを選択して使用できる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、複数の測定対象物質量に対応した安定したシグナル変化を同時に捉えることができ、それぞれ感度よく測定することができ、実用的なアッセイ系を供することが可能である。また多種類のシグナルを色調の変化として捉えることも可能となり、多種蛍光マルチプレックスアッセイが可能となる
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下本発明の実施の態様を説明するが、本発明は実施例の記述、方法等によって限定されるものではなく、本発明の開示は、本質的に同一の方法、試薬組成物に対して等しく影響をもたらすものである。
【００４５】
本発明で実施するステップを、抗体をアレイした場合を例としてつぎに示す。 １）３次元高分子ゲルを表面に担持した基板（スライドグラス）をまず抗体をスポットする前に、純水・バッファーによる膨潤、洗浄、加温等の操作を実施し、固定化に好適な状態とする。 ２）この状態の基板を先述のアレイヤー・スポッターを用いて所定のアレイデザインに従って、必要な濃度・組成に調製された、特定抗原に対するマウスモノクロナル抗体（１次抗体）溶液をそれぞれスポットする。 ３）スポット後、一定時間保持し、ブロッキング剤、保護剤、安定化剤の溶液とアレイを接触させ、そのままもしくは乾燥させて測定に供する。 ４）所定の容積が確保できる様に構成された、中抜きのフレームシールをアレイの周辺に貼り付ける。 ５）測定開始前にブロッキング溶液とアレイを接触させる（フレームシール内。以下のステップは全てこのフレームシール内で実施する）。場合によってはこのステップは省略可能である。 ６）希釈した生体試料を含む溶液とアレイを所定時間接触させる。 ７）生体試料を含む溶液を取り除き、所定容量の洗浄液を加え数１０秒〜数分経過後取り除く（洗浄操作）。この操作を所定回数繰り返す。 ８）特定抗原に対するラビット抗体（２次抗体）溶液をアレイと所定時間接触させる。 ９）洗浄操作を所定回数繰り返す。
１０）量子ドット標識された抗（２次抗体）溶液をアレイと接触させる。 １１）洗浄操作を所定回数繰り返す。 １２）基板（スライド）を蛍光スキャナーもしくは蛍光顕微鏡で読み取り、各スポットで生じた蛍光シグナル（蛍光強度）を測定する。露光時間等、測定条件は全て揃えておくことが好ましい。
【００４６】
以上の一連の操作に対する変更・追加は適宜可能であり、それらは本発明のバリエーションのひとつとして考慮される。例えば２次抗体と、量子ドット標識抗（２次抗体）抗体の組み合わせは、２次抗体に対して量子ドットを直接標識したものに置き換えて使用が可能であるし、２次抗体にビオチンを導入し、量子ドット標識ストレプトアビジンを使用することも可能である。
【実施例１】
【００４７】
パーキンエルマー社製ハイドロゲルスライドを、メーカーのマニュアルに従い前処理した後、コンタクトスポッテイング法により、［図３］のアレイデザインの様に、抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体（ラボフロンテイア社製：ＬａｂＦｒｏｎｔｅｉｅｒ：韓国）を各濃度で約８ｎＬずつスポットし、その後終夜で静置した。基準スポットとしてヒトＳＯＤとは結合性のない、マウスポリクロ抗体（マウス血清由来ＩｇＧ：シグマ社製）及び抗ヒトＧＳＴマウスモノクロナル抗体を陰性コントロールとして配置した。また陽性コントロールとしてラビット抗体（ラビット血清由来ＩｇＧ：シグマ社製）を配置している。１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下ＢＳＡ−ＰＢＳと略）１００μＬを、フレームシール（ＭＪリサーチ社：ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＮＣ．米国）で囲まれた１つのアレイ上に添加し、ブロッキングを室温で１時間行った。溶液をピペットで除去後ＢＳＡ−ＰＢＳをベースとしたヒトＳＯＤ（ヒト赤血球由来精製品；シグマ社製）の標準溶液または ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍希釈したヒトプール血清（ケミコンインターナショナル社製：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：米国）溶液１００μＬを、フレームシールで囲まれた１つのアレイ上に添加した。スライドを保湿状態としたチャンバーの中で、２時間室温で保持させた後、溶液を取り除き、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下ＰＢＳと略）１００μＬで３回洗浄した。ついで抗ヒトＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ）ラビット抗体（ストレスジェン バイオテクノロジー社製：Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：カナダ）溶液（約０．２ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、先と同様にチャンバー内で２時間室温にて静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、量子ドット標識（６５５）抗ラビットＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製：Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐ．：米国）をＢＳＡ−ＰＢＳで２００分の１希釈した溶液を加え、チャンバー内で１時間室温静置した。再度ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡（ニコン社研究用倒立顕微鏡 ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００Ｅ−Ｕ）で観察し、測定画像を転送し、画像解析ソフト Ａｑｕａ−Ｌｉｔｅ Ｖｅｒ．１．２．０．０（浜松ホトニクス社製）にて解析した。取得した画像を［図４］（ヒトＳＯＤ標準溶液の測定）、［図５］（ヒトプール血清の測定）に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００４８】
［図３］［図４］及び［図３］［図５］より、陰性コントロールである、測定抗原とは結合性の無いマウス抗体を固定化したスポット部分では、シグナルが全く認められず、反応性のある１次抗体のスポット部分では明瞭なシグナルを確認できた。
【実施例２】
【００４９】
実施例１で使用した抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体を固定化したスライドと同一のスライドを用い、フレームシールで囲まれた１つのアレイを、実施例１と同様にブロッキンングした。ブロッキング後、量子ドット標識（６５５）抗マウスＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）を、ＢＳＡ−ＰＢＳにて２００分の１に希釈した溶液１００μＬを加え、チャンバー内で１時間室温静置した。さらにＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、画像解析を行った。この時の画像を［図６］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５０】
［図６］より、１次抗体が全て、濃度に応じてスライド上にスポットされていることが判明し、実施例１で陰性コントロールとしてマウス抗体を固定化した部分も全て検出できていることから、実施例１の結果と併せて、プロテインアレイ上でヒトＳＯＤのサンドイッチアッセイが成立していることが判断できた。
【実施例３】
【００５１】
実施例１の１次抗体である抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体に換えて、抗ヒトＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体（医学生物学研究所（ＭＢＬ）社製）を用いてプロテインアレイを同様に作製した。基準スポットとして実施例１のマウス抗体を陰性コントロールとして配置した。アレイデザインを［図７］に示す。ついで実施例１同様にブロッキングを行った後、ＢＳＡ−ＰＢＳをベースとしたヒトＩＬ−１８（組換えヒトＩＬ−１８；ＭＢＬ社製）の標準溶液１００μＬを、フレームシールで囲まれた１つのアレイ上に添加した。スライドを保湿状態としたチャンバーの中で保持し、２時間室温で反応させた後、ＰＢＳ１００μＬで３回洗浄した。ついで抗ヒトＩＬ−１８ラットモノクロナル抗体（ＭＢＬ社製）溶液（約０．３ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、チャンバー内で２時間室温静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、量子ドット（６５５）標識抗ラットＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで２００分の１に希釈した溶液を加え、チャンバー内で１時間室温静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、測定画像を転送し、画像解析ソフトにて解析した。取得した画像を［図８］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５２】
［図７］［図８］より、陰性コントロールである、結合性の無いマウス抗体を固定化したスポット部分はシグナルが全く認められず、反応性のある１次抗体のスポットで明瞭なシグナルを確認できた。
【実施例４】
【００５３】
実施例３で使用した抗ヒトＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体を固定化したスライドと同一のスライドを用い、フレームシールで囲まれた１つのアレイを、実施例１と同様にブロッキンングした。ブロッキング後、量子ドット標識（６５５）抗マウスＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）を、ＢＳＡ−ＰＢＳにて２００分の１に希釈した溶液１００μＬを加え、チャンバー内で１時間室温静置した。さらにＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、画像解析を行った。この時の画像を［図９］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５４】
［図９］より、１次抗体が全て、濃度に応じてスライド上にスポットされていることが判明し、実施例３で陰性コントロールとしてマウス抗体を固定化した部分も全て検出できていることから、実施例３の結果と併せて、プロテインアレイ上でヒトＩＬ−１８のサンドイッチアッセイが成立していることが判断できた。
【実施例５】
【００５５】
実施例１のアッセイのうち、ヒトＳＯＤ標準溶液の濃度を１０〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲で変えてそれぞれ１アレイずつ用いてアッセイを実施した。得られたそれぞれの濃度における蛍光強度（ｎ＝９）とＳＯＤ濃度との関係を［図１０］に示す。なお１次抗体をスポットした時の濃度は４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬである。
【００５６】
［図１０］より、２水準の１次抗体濃度何れにおいても、ＳＯＤ濃度と蛍光強度は相関した。バラツキを考慮しても、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＯＤを検出できることが判明した。
【実施例６】
【００５７】
実施例３のアッセイのうち、ヒトＩＬ−１８標準溶液の濃度を１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で変えてそれぞれ１アレイずつ用いて実施した。得られたそれぞれの濃度における蛍光強度（ｎ＝９）ＩＬ−１８濃度との関係を［図１１］に示す。なお１次抗体をスポットした時の濃度は４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬである。
【００５８】
［図１１］より、２水準の１次抗体濃度何れにおいても、ＩＬ−１８濃度と蛍光強度は相関した。バラツキを考慮しても、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ−１８を検出できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、生体液、食品、環境試料中などに存在するさまざまな物質を単独であるいは複数同時に評価・定量するために、研究者、一般消費者が利用することができる。本発明は医学・薬学・理学・工学分野など広範囲において応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】 従来のプロテインアレイにおける測定系の模式図。
【図２】 本発明によるプロテインアレイにおける測定系の模式図（例）。
【図３】 本発明で作製したヒトＳＯＤ測定のためのプロテインアレイの１次抗体のアレイデザイン。
【図４】 本発明によって標準溶液中のヒトＳＯＤの存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図５】 本発明によってヒトプール血清中のヒトＳＯＤの存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図６】 プロテインアレイに固定化された抗ＳＯＤマウスモノクロナル抗体（１次抗体）の存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図７】 本発明で作製したヒトＩＬ−１８測定のためのプロテインアレイの１次抗体のアレイデザイン。
【図８】 本発明によって標準溶液中のヒトＩＬ−１８を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図９】 プロテインアレイに固定化された抗ＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体（１次抗体）の存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図１０】 本発明による測定系で評価した場合の、ＳＯＤ濃度と各濃度での蛍光シグナルとの関係図
【図１１】 本発明による測定系で評価した場合の、ＩＬ−１８濃度と各濃度での蛍光シグナルとの関係図
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、食品試料、環境試料中などに存在する特定物質の測定法ならびにそれらの方法に使用する試薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体やレセプター、レクチンなどのタンパク質を用いた測定系が、医学・薬学・生物学・環境工学など多岐にわたる分野で現在用いられており、物質の測定系・評価系として欠かすことのできないものとなっている。これらの測定系は単一対象を測定するものであることが多いが、少量の対象サンプルを用いて、同時に複数の対象を測定できる、効率の良い評価方法が望まれている。これらの要求を満たす評価法として、多種類の測定対象を評価するためのプロテインアレイ、抗体アレイ（シェーナら、ニールセンら 及び ワンら）、などが近年報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】 「シェーナ編 プロテインアレイ （２００４年） ジョーンズ＆バートレット パブリッシャー」 （Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙ（２００４）Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。
【非特許文献２】 「カムハームパティ編 プロテイン マイクロアレイ テクノロジー（２００４） ワイリーＶＣＨ ヴェルラグ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧａＡ」（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００４）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ）。
【特許文献１】 ワンら 特表２００５−５０４３０９
【０００４】
プロテインアレイ用途として光学的スライドやポリマー素材からなるメンブレンが使用される場合が多い。 スライドとしては、表面にニトロセルロースがコートされた ＦＡＳＴスライド（Ｓ＆Ｓ バイオサイエンス社製：Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）、疎水性ポリマーがコートされた ＳｕｐｅｒＰｒｏｔｅｉｎ スライド（テレコムインターナショナル社製： ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．）、ブラックポリマーがコートされた Ｍａｘｉｓｏｒｐ スライド（ナルジェヌンク社製：Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ ＩＮＣ．）などがある。またガラススライドをベースとして表面にアミノ基、カルボキシル基、チオール基を導入し、タンパク質と化学的に架橋可能としたものも市販されている。
【０００５】
これらの各種スライドに対して、タンパク溶液を各種のアレイヤー・スポッターを用いて、若しくは用手法で、各種形状のスポットを作製してプロテインアレイが作製されている。
【０００６】
これらのプロテインアレイは、例えばアポトーシスに関わる測定対象、セルシグナルに関する測定対象など研究分野の枠ごとにあるいは、特定の疾患、ウイルス感染症に関する測定対象（マーカー）の集団毎に、あるいはそれらを複数含んだ形で構成されており、また構成が想定されている。
【０００７】
商用化されたプロテインアレイは現在大きく分類して、１）網羅的抗体アレイであってディファレンシャル解析に使用される抗体アレイ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ．）製：ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ５００ など）、２）複数の項目が測定できる抗体アレイ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）製：Ｃａｒｔｅｓｉａｎ ＡｒｒａｙＴＭ ＡＫｉｔ Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ など）があるが研究段階として、ケミカルアレイ（ベッターら）、ペプチドアレイ（チアリら）、Ｐ４５０アレイ（サカイ−カトーら）、レクチンアレイ（ピロベロら）など、種々のものが存在する。
【０００８】
【非特許文献３】ベッターら、ジャーナル セル バイオケム サプル ３９巻 ７９頁−８４頁（２００２）（Ｖｅｔｔｅｒ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．（２００２）Ｖｏｌ．３９，ｐｐ７９−ｐｐ８４）
【非特許文献４】チアリら、プロテオミクス ５巻 ３６００頁−３６０３頁（Ｃｈｉａｒｉ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００５）Ｖｏｌ．５，ｐｐ３６００−ｐｐ３６０３）
【非特許文献５】サカイ−カトーら、アナリテイカル ケミストリー ７７巻 ７０８０頁−７０８３頁（２００５年）（Ｓａｋａｉ−Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）Ｖｏｌ．７７，ｐｐ７０８０−ｐｐ７０８３）
【非特許文献６】ピロベロら、ケムバイオケム ６巻 ９８５頁−９８９頁（２００５年）（Ｐｉｌｏｂｅｌｌｏ ＫＴ．ｅｔ．ａｌ．， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）Ｖｏｌ．６，ｐｐ９８５−ｐｐ９８９）
【０００９】
プロテインアレイに用いられている標識物質としては、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３あるいはアレクサ、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ）（エンペドクレスら）等の蛍光物質、ＦＬＡＧなどのタグペプチド、ビオチン・修飾ビオチンあるいはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素がある。
【００１０】
【特許文献２】エンペドクレスら 特表２００３−５２２９６２
【００１１】
さらにアルカリフォスターゼを標識酵素として用い、検出するアルカリフォスファターゼの領域の周辺にビオチン化チラミドを固定化して蛍光標識ストレプトアビジンにて増感させて検出する方法が報告されている（ゲホら）。
【００１２】
【非特許文献７】 ゲホら バイオコンジュゲート ケム １６巻 ５５９頁−５６６頁（２００５年）（Ｇｅｈｏ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（２００５）Ｖｏｌ．１６，ｐｐ５５９−ｐｐ５６６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
プロテインアレイスライドの主なものは、タンパク質を吸着できる絶対的容量が少なく、また安定剤を使用しないと、抗体などのタンパク質の活性を保持しにくいという難点がある。また表面にアミノ基、カルボキシル基を導入したスライドは、抗体などのタンパク質、リガンドのアミノ基等と２価性架橋基でランダムに結合することが多いが、この結合は抗体・タンパク質・リガンド側のどのアミノ基等を使用するかという点で問題がある。特定部位のアミノ基等は、抗原結合活性などに極めて甚大な影響を直接与える。また直接では結合活性を低減させないとしても、結合部位によっては、立体構造的に、測定対象との結合を低減させる場合があり、制御されていない架橋様式はプロテインアレイの作製に好ましくない。
【００１４】
スライド表面のチオール基・アミノ基を制御してタンパク質との架橋に活用する場合もある。固定化対象のタンパク質においては一般的に利用できるチオール基の数は限られており（特に抗体・（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）等）、タンパク質側のアミノ基をマレイミド試薬などで処理した後、スライド表面上のアミノ基と結合させることが可能である。またタンパク質の遊離（還元型）チオール基とスライド表面の還元型チオール基を酸化縮合させて固定化することも可能である。チオール基を利用した場合は、固定化のステップによって本来のタンパク質などの活性を低減する可能性は少ない。しかしながら抗体分子（ＩｇＧ）から（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）を調製する際の、還元処理の実施、目的標品の回収・精製などの処理過程で抗原結合活性は低下し、また収率が低くなる。これらの煩雑な処理ステップは、特にたくさんの種類の抗体を取り扱ってプロテインアレイを作製する場合、抗体のロット管理・処理ステップの品質管理・全体のアレイ性能の管理等を考慮すると、極めて大きな障害となる。
【００１５】
以上に述べた各種スライドに対して、タンパク溶液を各種のアレイヤー・スポッターを用いて、若しくは用手法で、円形・方形状などのスポットを構築することができる（グレイナー バイオ ワン社製 マニュアルマイクロアレイヤー： Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ Ｍａｎｕａｌ Ｍｉｃｒｏ Ａｒｒａｙｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ あるいはパーキンエルマー社製 ピエゾアレイ バイオチップシステム： ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＮＣ．Ｐｉｅｚｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００１６】
網羅的抗体アレイであってディファレンシャル解析に使用される抗体アレイは、比較するサンプル中に含まれるタンパク質のトータル量を等しくした上で、それぞれのサンプルに含まれるタンパク質の全てを２種以上の蛍光色素で標識する必要がある（前述クローンテック社の製品マニュアル参照）。異なる蛍光色素で標識する場合、タンパク質の結合性の変化を生じる可能性もある。
【００１７】
ニトロセルロース等の疎水性担体（スライド・メンブレン）の表面上に複数の抗体をスポット（固定）したアレイが商用化されている。測定法としてはまず、サンプル溶液（測定対象抗原含む）をアレイ上の固定抗体で結合させた後、さらに２次抗体溶液加え複合体を形成させる。さらにこの２次抗体に対するアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、１次抗体−抗原−２次抗体−酵素標識抗２次抗体複合体と、所定の化学合成基質と反応させ、その発光を写真フィルム等に露光し、最終的にシグナルスポットを得る。測定の模式図を［図１］に示す。あるいは酵素反応で可視性の色素として視覚化する方法も可能である。しかしながら酵素反応で生じたプロダクトの拡散性、酵素反応を一律にコントロールすることの難しさ、スポットの形状を均一にすることの困難性などから、これら標識酵素を用いた方法は、ばらつきの大きな測定系となっている。また最終シグナルの範囲が重なりあったりする場合も多く、定量性に疑問が生じる場合もある。この測定形式では、高密度にスポットされたアレイを使用することは限界があり、一般にはマイクロアレイではなくマクロアレイとして使用されている。ケミカルアレイ、ペプチドアレイ、Ｐ４５０アレイ、レクチンアレイなどが、学術上報告されているが、実用性の高いアレイとするにはコスト・再現性・安定性・測定感度など解決すべき問題が多く残されているのが現状である。
【００１８】
標識物質として使用されている、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３は励起光による退色現象が急速に生じるため、解析に必要な時間変化なく蛍光シグナルを維持することは困難である。このことは検出可能となった時点から、できるだけ速やかに測定を完了させることが要求されていることを意味する。また繰り返し同じスライド等を用いて再測定をすることが困難であることも意味する。アレクサ等の蛍光物質は光安定性が改善されてはいるものの、長時間の露光では前述の蛍光色素と同様の問題を生じる
【００１９】
量子ドットによる蛍光物質は光安定性に富み、長時間励起光を照射しても安定である。量子ドット粒子をポリエチレングリコール等でコーテイングし水溶性をあげ、バックグランドを低減させた例もある。しかしながら前述のスライドと水溶性を高めた量子ドットを用いても十分な測定感度が得られないことが多く、必要な感度を得るためには、ペルオキシダーゼなどの標識酵素を用いて、ビオチン化チラミドを標識酵素の周囲に固定化し、シグナル増幅した上でストレプトアビジン標識量子ドットを作用させるという、物理的シグナルの増幅過程が必要となる（前述 ゲホら）。このため酵素反応実施後あらためて、追加の反応ステップを必要とするため、煩雑であり、ばらつきの多い検出方法となる。また抗体反応における非特異的反応だけでなく、ビオチン化チラミドの非特異的反応もあわせて考慮する必要があり、最終的なシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が減少する場合もある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、以上のプロテインアレイによるアッセイ系の問題点を解決すべく鋭意努力を重ねた結果、従来よりも量的に高密度にタンパク質を固定化でき、同時にタンパク質等の活性を保持し、シグナル形成が均一となる手法として、光学的に極めて高い安定性を有する量子ドットによる蛍光物質を検出系として用い、生理活性タンパク質等の固定化を、親水性構造を内包する３次元構造を持った高分子ゲル上で行う方法が極めて適切であることを見出し、またこれによって従来のプロテインアレイの抱える問題点を解決できることを見出し、本発明を完成した。本発明による測定系の例を［図２］に模式図として示す。
【００２１】
すなわち本発明は、
１） 測定対象物質を認識するタンパク質または測定対象物質の全体・一部・類似物から選択される物質を、３次元ゲル化合物内に物理的または化学的に固定化した基板上において、量子ドット蛍光化合物を標識体として、試料中の対象物質を測定することを特徴とするアッセイ方法
に関するものであり、
２） ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子の内、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする１）に記載の方法
に関するものであり、
３） ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上に対して曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする１）に記載の方法
に関するものであり、
４） 測定対象物質が、タンパク質・ペプチド・糖質・脂質・糖脂質・低分子化合物である１）〜３）に記載の方法
に関するものであり、
５） 測定対象物質を認識するタンパク質が、抗体・レセプター・レクチンであることを特徴とする１）−４）の方法
に関するものであり、
６） 固定化した基板が非蛍光性のガラス・プラスチック・金属基板であることもしくは、蛍光検出時に測定を妨害しないガラス・プラスチック・金属基板であることを特徴とする１）−５）の方法
に関するものであり、
７） 測定系において、アビジンもしくはアビジン様物質及びビオチンを使用することを特徴とする１）−６）の方法、
に関するものであり、
８） 測定系において、物理的シグナルの増幅を行うことを特徴とする１）−７）の方法
に関するものであり、
９） 測定系において、チラミド化合物を使用することを特徴とする８）の方法
に関するものであり、
１０） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列を備えた基板を使用することを特徴とする１）−９）の方法
に関するものであり、
１１） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする１）−１０）の方法
に関するものであり、
１２） ２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に２種類以上の基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする１）−１１）の方法
に関するものであり、
１３） 使用する量子ドット蛍光化合物の粒子の直径が０．１〜２００ｎｍであることを特徴とする１）−１２）の方法
に関するものであり、
１４） 疾患マーカーおよび疾患予防マーカーを測定対象とするものであることを特徴とする１）−１３）の方法
に関するものであり、
１５） １）−１４）の方法に使用するための基板
に関するものであり、
１６） １）−１５）の方法に使用するための試薬組成物
に関するものである。
【００２２】
本発明に使用する固定化の支持基板としてはガラス、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン、金属板等を使用することができ、数センチ×数センチ以下の大きさのものが望ましい。基板の厚みは基板の硬度に応じて設定できるが、取扱いの容易な、０．１〜５ｍｍ程度のものの使用が好ましい。スライド基板は各種の官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオール基等）を有していても良いが、３次元ゲルをそれら基板の上に構築する妨げとなるものを避けるべきである。また３次元ゲルとスライド基板が、反応終了の後、光学的に蛍光を検出できる素材の組み合わせであることが必要である。光学的に透明な基板を使用する場合、蛍光測定は基板の１方向から光を照射し、生じる蛍光を上部で検出すればよいが、金属板のように光学的に不透明な基板を用いる場合は、１方向から光を照射し、生じる蛍光を入射と同じ側で検出する。
【００２３】
本発明に使用する３次元ゲルの構成物としては、ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・核酸・ペプチド・複合高分子の内、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することが可能であり、これらのうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上へ曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することも可能である。ラジカル発生試薬としては、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル、光増感剤であるベンゾフェノン、フォトフィリン、レザフィリン、ポルフィリン系色素、ピロール環等を有する金属錯体、過酸化物等が利用できる。架橋剤としては、ビニルエーテル、アルデヒド化合物、ＥＭＣＳなどのマレイミド化合物等が使用できる。これらの３次元ゲル化合物を担持したスライドを独自の条件にて自作して使用することも出来るが、トラヴィスらあるいはシーら既報に従って作製することができる。また市販品として例えば、グライナー バイオ ワン製 ＨＴＡスライドやパーキンエルマー社製 ハイドロゲルスライド などを使用することも可能である。
【００２４】
【特許文献３】 トラヴィスら 特表２００３−５２４１５０
【特許文献４】 シーら 特表２００４−５１８１３８
【００２５】
３次元ゲルは内部で架橋構造をとることがきるが、その構造はゲル内部の細孔のサイズのコントロールに重要である。抗体やレクチン・レセプター・各種抗原等の活性を保持した状態で固定化後、反応時に固定化物以外の各要素が自由に動きうる孔径（２０〜１０００ｎｍ）となっている必要がある。また３次元ゲルの厚みは１μｍ〜５００μｍの間で選択することができる。蛋白質等はスライド基板の上に、用手あるいはプロテインアレイヤー等の自動機械にてスポットでき、プロテインアレイを作製することができる（グレイナー バイオ ワン社製 マニュアルマイクロアレイヤー： Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ Ｍａｎｕａｌ Ｍｉｃｒｏ Ａｒｒａｙｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ あるいはパーキンエルマー社製 ピエゾアレイバイオチップシステム： ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＮＣ．Ｐｉｅｚｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ、カケンジェネティクス社製 ＤＮＡ／抗体 マイクロアレイヤー など）。用手の場合は数スポット〜数百スポット、アレイヤーの使用により、数スポット〜数千スポットが一度に作製できる。なおアレイの作製は、アレイヤー・スポッターの性能に応じて、コンタクト形式（サンプルを保持したピンが基板と直接接触する形式）あるいはノンコンタクト形式（ピンが基板と接触しない）で実施可能である。数スポット〜千スポットからなるアレイは、目的に応じて基板上に複数設けることができる。
【００２６】
必要な蛋白質をスポット（または塗布）・固定後、ウシ血清アルブミン・ゼラチン等の動物由来の蛋白質、ポリエチレングリコール等の高分子化合物を含む溶液に浸漬または塗布して、３次元ゲルをコーテイングすることができる（この操作はブロッキング操作とも称される）。また糖・アミノ酸・有機酸等の溶液にも浸漬または塗布することができる。糖としてはグルコース・サッカロース・マルトノースの還元糖及び非還元糖、単糖・多糖類を使用でき、アミノ酸としてはグリシン、グルタミン酸等、有機酸としてはマレイン酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸等を使用することができる。さらにはアジ化ナトリウム、プロクリン等の防腐剤を含む溶液を同様に併用することができる。組成物中の各試薬の濃度は、通常免疫血清学分野で使用されている濃度範囲で、適宜選択して設定できる。
各溶液は滅菌フィルター等でろ過し、無菌化したものを使用することが好ましい。
【００２７】
本発明に使用する基板等は真空乾燥機、減圧乾燥機あるいは風乾操作にて乾燥させることができる。作業は、防腐性能等を考慮すると、無菌化されたクリーンベンチやクリーンルーム中で行うことが好ましい。
【００２８】
本発明に使用する量子ドット蛍光物質は、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム等の半導体粒子をそのまま使用することができるが、非特異的反応の抑制のため、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子で粒子表面をコーテイングしておくことが好ましい。量子ドットはその粒子径により、発する蛍光の波長が異なるが、０．１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲のものを目的に応じて使用することができる。なお粒子径１．５ｎｍ以下ではいわゆるホールトラッピング現象の割合が高くなり、蛍光ではなく、白色のりん光を呈することが知られている（バウアーら）。粒子径は基板上の高分子ゲルのポアサイズより小さいだけでなく、各種のタンパク質と連結した場合の全体の大きさもポアサイズより小さいことが、ゲル内での諸反応のために必要である。量子ドットは、クウォンタムドット社（ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ Ｃｏｒｐ．）やエビデントテクノロジー社（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の市販品などを利用できる。
【００２９】
【非特許文献８】 バウアーら ジャーナル アメリカン ケミカル ソサエテイ１２７巻 １５３７８頁−１５３７９頁（２００５）（Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５）Ｖｏｌ．１２７，ｐｐ１５３７８−１５３７９）。
【００３０】
タンパク質と量子ドットの間は、２価性架橋基など種々のリンカー介して連結することができる。またタンパク質とそのタンパク質に対して特異的な結合力を持つタンパク質あるいはリガンドとそのリガンドに対して特異的な結合力を持つタンパク質の関係を利用して連結することも可能である。これらの例として、ビオチン化マウスモノクロナル抗体と量子ドット標識ストレプトアビジンの複合体、ウサギポリクロナル抗体と量子ドット標識プロテインＧの複合体、などが挙げられる。
【００３１】
量子ドットを検出するための光源としては、蛍光発生に必要な励起が可能であればよいが、レーザー光源、紫外線ランプなどが一般に使用できる。励起光を照射するのに必要な時間は、量子ドットが光照射に対して安定であるため特に制限はなく、数時間連続照射も可能である。また測定完了後改めて再測定することも可能である。
【００３２】
本発明に使用する抗体は、研究用試薬、臨床診断薬として市販されているものを使用できる他、免疫原を調製してマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒツジなどに免疫して作製することができる。免疫原としては天然蛋白、人為的に加工したタンパクやペプチドを使用することができる。低分子ペプチドや糖鎖・脂質等の天然低分子、合成化学物質に対する抗体を作製する場合は、それらをハプテンとして血清アルブミンやヘモシアニン等に結合させた蛋白質を免疫原として使用することができる。糖化蛋白などの様に、修飾が天然に生じたものを用いても良い。抗体は、ハーローらの方法に従って作製すればよい。また抗体は完全な形態だけでなく、（Ｆａｂ）２・（Ｆａｂ）・（Ｆａｂ’）２・（Ｆａｂ’）等のフラグメントの形態をも使用できるし、組換えＤＮＡ技術によって調製された抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ等）も使用可能である。
【００３３】
【非特許文献７】 ハーローら 「抗体の使用法：ラボラトリーマニュアル」（１９９８年）コールドスプリング・ハーバー（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。
【００３４】
本発明に使用する抗体以外のタンパク質は、市販品及び血清等の各種生体試料や組換えＤＮＡ技術によって調製した生体より採取・精製したものを使用することができる。それらの取扱いは相互作用や結合に必要な活性を保つ工夫をして調製されたものが好ましい。またタンパク質は、目的に応じて、完全なものだけでなく、糖鎖や脂質等が脱落した不完全なものも使用することができる。さらに完全長のタンパク質だけでなく一部の断片、ペプチドを使用することも、場合に応じて可能である。
【００３５】
本発明で、抗体等のタンパク質にビオチンやジゴキシゲニンなどの低分子化学物質、タグペプチド等を導入し、検出時に利用することができる。例えばビオチンを導入したタンパク質は、量子ドット標識アビジンあるいは量子ドット標識ストレプトアビジン等で検出可能である。アビジン、ストレプトアビジンは天然由来、組換えタンパク質いずれも使用できる。タンパク質に低分子化学物質、タグペプチドを導入した場合は、それらに対する量子ドット標識抗体を用いて検出することができる。
【００３６】
本発明では、量子ドットシグナルを増幅することなく測定できるが、アルカリフォスファターゼ標識体とチラミド化合物により、ビオチン化チラミドを生成させる増幅系を併用することも可能である。この系は極めて高感度であるため、より短時間の測定が可能である。ビオチン化チラミドの増幅試薬としてダコ社（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ）の製品などが利用できる。
【００３７】
本発明で使用するプロテインアレイ上のスポット数は、目的により２〜数千個の範囲で複数設けることができる。このスポット数は疾患対象の同時評価で必要とするマーカーの種類、各測定対象の予測される濃度範囲などで要求される個数を設定することができるが、プロテインアレイのパフォーマンスと製造コストに大きな影響を与えるため、最適なアレイデザインを実施すべきである。
【００３８】
本発明でいう基準スポットとは、陽性スポット、陰性スポットあるいはアレイスポットの位置確認目的のスポットのことをいう。これらのスポットは測定対象数、測定目的に応じて適宜設定し作製することができるが、それらすべての種類の基準スポットが本発明において不可欠ではなく、取捨選択が可能である。１種以上の基準スポットは測定の規格化、管理のために設置が好ましい。
【００３９】
本発明では種々の測定対象物質を評価・測定することができるが、特に疾患マーカー群の測定および疾患予防マーカーの測定は重要である。疾患関連マーカーとは、例えば糖尿病、腎疾患、癌、高血圧、肝臓疾患、心筋梗塞、リウマチ、アレルギー、アトピー、ストレス、痴呆症、感染症などで特異的に量が増減するマーカー（タンパク質その他）をいい、複数のマーカー（マルチマーカー）を評価することでより、疾患の症状・程度あるいは疾患であることの確度を知ることができる。例えば酸化ストレスを受けた場合、酸化還元に関わる酵素・タンパク質である、スーパーオキサイドデイスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、８−ヒドロキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、ヘキサノイルリジン等の量が変動する。これらのタンパク質は酸化ストレスを受けた場合や糖尿病などの疾患時に変動する。それらのマーカーは疾患者と健常人由来の生体試料中のタンパク質をそれぞれ、例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステム（サイファージェン・バイオシステムズ社：Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ．）や２次元電気泳動システム（ヴィタ社：ＷＩＴＡ ＧｍｂＨ）等を用いて比較することで、発見することが可能である。これらのマーカーは同時に複数活用される場合もある。各マーカーは量的に確保可能であれば、アミノ酸配列・構造決定などをすることなく、定量を目的とした特異的抗体の作製が原則可能である。
【００４０】
病気になった患者の生体試料中において疾患マーカーの存在量が変動するのに対して、疾患予防マーカーは健常時においても変動が認められるものであり、疾患発症前段階としてのリスクを示すものである。疾患予防マーカーとは、例えば糖尿病予防マーカー、高血圧予防マーカー、酸化ストレス傷害予防マーカーなどのことをいう。疾患予防マーカーの変動を適宜知ることができれば、例えば生活習慣を変更・改善したり、あるいは運動療法などを早期に取り入れることで、疾患発症に進むことを防いだり、遅らせたりすることが可能である。これは治療法ではなく、予防法を健常者に提起するよい指標となりうると考えられている。疾患に対して社会全体が費やしている膨大なコストを考えれば、疾患に陥る人の数を予防マーカーの活用で減らすことは、予防マーカー測定に費やすコストに対して、十分見合ったものとなる。
【００４１】
本発明で構成する試薬組成物は、プロテインアレイとして構成された、抗体等のタンパク質を固定化した基板を主体として、例えばサンプル希釈溶液、２次抗体溶液、量子ドット標識抗（２次抗体）抗体溶液、洗浄溶液、測定標準溶液などで構成される。各試薬は一般に免疫血清分野やバイオテクノロジー分野にて知られている研究用試薬、臨床診断薬調製の技術を活用することができる。
【００４２】
本発明で使用するスライド基板等上の蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡、蛍光スライドスキャナーなどで適宜測定が可能であり、所望のデータを取得することができる。なお量子ドットはＵＶ光励起・レーザー光励起が可能であるが、励起光の検出には量子ドットの種類に応じて適宜必要な光学フィルターを選択して使用できる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、複数の測定対象物質量に対応した安定したシグナル変化を同時に捉えることができ、それぞれ感度よく測定することができ、実用的なアッセイ系を供することが可能である。また多種類のシグナルを色調の変化として捉えることも可能となり、多種蛍光マルチプレックスアッセイが可能となる
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下本発明の実施の態様を説明するが、本発明は実施例の記述、方法等によって限定されるものではなく、本発明の開示は、本質的に同一の方法、試薬組成物に対して等しく影響をもたらすものである。
【００４５】
本発明で実施するステップを、抗体をアレイした場合を例としてつぎに示す。 １）３次元高分子ゲルを表面に担持した基板（スライドグラス）をまず抗体をスポットする前に、純水・バッファーによる膨潤、洗浄、加温等の操作を実施し、固定化に好適な状態とする。 ２）この状態の基板を先述のアレイヤー・スポッターを用いて所定のアレイデザインに従って、必要な濃度・組成に調製された、特定抗原に対するマウスモノクロナル抗体（１次抗体）溶液をそれぞれスポットする。 ３）スポット後、一定時間保持し、ブロッキング剤、保護剤、安定化剤の溶液とアレイを接触させ、そのままもしくは乾燥させて測定に供する。 ４）所定の容積が確保できる様に構成された、中抜きのフレームシールをアレイの周辺に貼り付ける。 ５）測定開始前にブロッキング溶液とアレイを接触させる（フレームシール内。以下のステップは全てこのフレームシール内で実施する）。場合によってはこのステップは省略可能である。 ６）希釈した生体試料を含む溶液とアレイを所定時間接触させる。 ７）生体試料を含む溶液を取り除き、所定容量の洗浄液を加え数１０秒〜数分経過後取り除く（洗浄操作）。この操作を所定回数繰り返す。 ８）特定抗原に対するラビット抗体（２次抗体）溶液をアレイと所定時間接触させる。 ９）洗浄操作を所定回数繰り返す。
１０）量子ドット標識された抗（２次抗体）溶液をアレイと接触させる。 １１）洗浄操作を所定回数繰り返す。 １２）基板（スライド）を蛍光スキャナーもしくは蛍光顕微鏡で読み取り、各スポットで生じた蛍光シグナル（蛍光強度）を測定する。露光時間等、測定条件は全て揃えておくことが好ましい。
【００４６】
以上の一連の操作に対する変更・追加は適宜可能であり、それらは本発明のバリエーションのひとつとして考慮される。例えば２次抗体と、量子ドット標識抗（２次抗体）抗体の組み合わせは、２次抗体に対して量子ドットを直接標識したものに置き換えて使用が可能であるし、２次抗体にビオチンを導入し、量子ドット標識ストレプトアビジンを使用することも可能である。
【実施例１】
【００４７】
パーキンエルマー社製ハイドロゲルスライドを、メーカーのマニュアルに従い前処理した後、コンタクトスポッテイング法により、［図３］のアレイデザインの様に、抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体（ラボフロンテイア社製：ＬａｂＦｒｏｎｔｅｉｅｒ：韓国）を各濃度で約８ｎＬずつスポットし、その後終夜で静置した。基準スポットとしてヒトＳＯＤとは結合性のない、マウスポリクロ抗体（マウス血清由来ＩｇＧ：シグマ社製）及び抗ヒトＧＳＴマウスモノクロナル抗体を陰性コントロールとして配置した。また陽性コントロールとしてラビット抗体（ラビット血清由来ＩｇＧ：シグマ社製）を配置している。１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下ＢＳＡ−ＰＢＳと略）１００μＬを、フレームシール（ＭＪリサーチ社：ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＮＣ．米国）で囲まれた１つのアレイ上に添加し、ブロッキングを室温で１時間行った。溶液をピペットで除去後ＢＳＡ−ＰＢＳをベースとしたヒトＳＯＤ（ヒト赤血球由来精製品；シグマ社製）の標準溶液または ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍希釈したヒトプール血清（ケミコンインターナショナル社製：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：米国）溶液１００μＬを、フレームシールで囲まれた１つのアレイ上に添加した。スライドを保湿状態としたチャンバーの中で、２時間室温で保持させた後、溶液を取り除き、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下ＰＢＳと略）１００μＬで３回洗浄した。ついで抗ヒトＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ）ラビット抗体（ストレスジェン バイオテクノロジー社製：Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：カナダ）溶液（約０．２ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、先と同様にチャンバー内で２時間室温にて静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、量子ドット標識（６５５）抗ラビットＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製：Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐ．：米国）をＢＳＡ−ＰＢＳで２００分の１希釈した溶液を加え、チャンバー内で１時間室温静置した。再度ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡（ニコン社研究用倒立顕微鏡 ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００Ｅ−Ｕ）で観察し、測定画像を転送し、画像解析ソフト Ａｑｕａ−Ｌｉｔｅ Ｖｅｒ．１．２．０．０（浜松ホトニクス社製）にて解析した。取得した画像を［図４］（ヒトＳＯＤ標準溶液の測定）、［図５］（ヒトプール血清の測定）に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００４８】
［図３］［図４］及び［図３］［図５］より、陰性コントロールである、測定抗原とは結合性の無いマウス抗体を固定化したスポット部分では、シグナルが全く認められず、反応性のある１次抗体のスポット部分では明瞭なシグナルを確認できた。
【実施例２】
【００４９】
実施例１で使用した抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体を固定化したスライドと同一のスライドを用い、フレームシールで囲まれた１つのアレイを、実施例１と同様にブロッキンングした。ブロッキング後、量子ドット標識（６５５）抗マウスＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）を、ＢＳＡ−ＰＢＳにて２００分の１に希釈した溶液１００μＬを加え、チャンバー内で１時間室温静置した。さらにＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、画像解析を行った。この時の画像を［図６］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５０】
［図６］より、１次抗体が全て、濃度に応じてスライド上にスポットされていることが判明し、実施例１で陰性コントロールとしてマウス抗体を固定化した部分も全て検出できていることから、実施例１の結果と併せて、プロテインアレイ上でヒトＳＯＤのサンドイッチアッセイが成立していることが判断できた。
【実施例３】
【００５１】
実施例１の１次抗体である抗ヒトＳＯＤマウスモノクロナル抗体に換えて、抗ヒトＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体（医学生物学研究所（ＭＢＬ）社製）を用いてプロテインアレイを同様に作製した。基準スポットとして実施例１のマウス抗体を陰性コントロールとして配置した。アレイデザインを［図７］に示す。ついで実施例１同様にブロッキングを行った後、ＢＳＡ−ＰＢＳをベースとしたヒトＩＬ−１８（組換えヒトＩＬ−１８；ＭＢＬ社製）の標準溶液１００μＬを、フレームシールで囲まれた１つのアレイ上に添加した。スライドを保湿状態としたチャンバーの中で保持し、２時間室温で反応させた後、ＰＢＳ１００μＬで３回洗浄した。ついで抗ヒトＩＬ−１８ラットモノクロナル抗体（ＭＢＬ社製）溶液（約０．３ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、チャンバー内で２時間室温静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、量子ドット（６５５）標識抗ラットＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで２００分の１に希釈した溶液を加え、チャンバー内で１時間室温静置した。ＰＢＳ １００μＬで３回洗浄した後、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、測定画像を転送し、画像解析ソフトにて解析した。取得した画像を［図８］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５２】
［図７］［図８］より、陰性コントロールである、結合性の無いマウス抗体を固定化したスポット部分はシグナルが全く認められず、反応性のある１次抗体のスポットで明瞭なシグナルを確認できた。
【実施例４】
【００５３】
実施例３で使用した抗ヒトＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体を固定化したスライドと同一のスライドを用い、フレームシールで囲まれた１つのアレイを、実施例１と同様にブロッキンングした。ブロッキング後、量子ドット標識（６５５）抗マウスＩｇＧ抗体（クウォンタムドット社製）を、ＢＳＡ−ＰＢＳにて２００分の１に希釈した溶液１００μＬを加え、チャンバー内で１時間室温静置した。さらにＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、実施例１と同様に蛍光顕微鏡で観察し、画像解析を行った。この時の画像を［図９］に示す。なお画像のバックグランドは黒色であり、シグナルの生じた各スポットはグレイで表示されている。
【００５４】
［図９］より、１次抗体が全て、濃度に応じてスライド上にスポットされていることが判明し、実施例３で陰性コントロールとしてマウス抗体を固定化した部分も全て検出できていることから、実施例３の結果と併せて、プロテインアレイ上でヒトＩＬ−１８のサンドイッチアッセイが成立していることが判断できた。
【実施例５】
【００５５】
実施例１のアッセイのうち、ヒトＳＯＤ標準溶液の濃度を１０〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲で変えてそれぞれ１アレイずつ用いてアッセイを実施した。得られたそれぞれの濃度における蛍光強度（ｎ＝９）とＳＯＤ濃度との関係を［図１０］に示す。なお１次抗体をスポットした時の濃度は４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬである。
【００５６】
［図１０］より、２水準の１次抗体濃度何れにおいても、ＳＯＤ濃度と蛍光強度は相関した。バラツキを考慮しても、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＯＤを検出できることが判明した。
【実施例６】
【００５７】
実施例３のアッセイのうち、ヒトＩＬ−１８標準溶液の濃度を１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で変えてそれぞれ１アレイずつ用いて実施した。得られたそれぞれの濃度における蛍光強度（ｎ＝９）ＩＬ−１８濃度との関係を［図１１］に示す。なお１次抗体をスポットした時の濃度は４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬである。
【００５８】
［図１１］より、２水準の１次抗体濃度何れにおいても、ＩＬ−１８濃度と蛍光強度は相関した。バラツキを考慮しても、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ−１８を検出できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、生体液、食品、環境試料中などに存在するさまざまな物質を単独であるいは複数同時に評価・定量するために、研究者、一般消費者が利用することができる。本発明は医学・薬学・理学・工学分野など広範囲において応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】 従来のプロテインアレイにおける測定系の模式図。
【図２】 本発明によるプロテインアレイにおける測定系の模式図（例）。
【図３】 本発明で作製したヒトＳＯＤ測定のためのプロテインアレイの１次抗体のアレイデザイン。
【図４】 本発明によって標準溶液中のヒトＳＯＤの存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図５】 本発明によってヒトプール血清中のヒトＳＯＤの存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図６】 プロテインアレイに固定化された抗ＳＯＤマウスモノクロナル抗体（１次抗体）の存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図７】 本発明で作製したヒトＩＬ−１８測定のためのプロテインアレイの１次抗体のアレイデザイン。
【図８】 本発明によって標準溶液中のヒトＩＬ−１８を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図９】 プロテインアレイに固定化された抗ＩＬ−１８マウスモノクロナル抗体（１次抗体）の存在を視覚化した画像。（バックグランドは黒色であり、シグナルはグレイで表示）。
【図１０】 本発明による測定系で評価した場合の、ＳＯＤ濃度と各濃度での蛍光シグナルとの関係図
【図１１】 本発明による測定系で評価した場合の、ＩＬ−１８濃度と各濃度での蛍光シグナルとの関係図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質を認識するタンパク質または測定対象物質の全体・一部・類似物から選択される物質を、３次元ゲル化合物内に物理的または化学的に固定化した基板上において、量子ドット蛍光化合物を標識体として、試料中の対象物質を測定することを特徴とするアッセイ方法。
【請求項２】
ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上に対して曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
測定対象物質が、タンパク質・ペプチド・糖質・脂質・糖脂質・低分子化合物である請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
測定対象物質を認識するタンパク質が、抗体・レセプター・レクチンであることを特徴とする請求項１−４の方法。
【請求項６】
固定化した基板が非蛍光性のガラス・プラスチック・金属基板であることもしくは、蛍光検出時に測定を妨害しないガラス・プラスチック・金属基板であることを特徴とする請求項１−５の方法。
【請求項７】
測定系において、アビジンもしくはアビジン様物質及びビオチンを使用することを特徴とする請求項１−６の方法。
【請求項８】
測定系において、物理的シグナルの増幅を行うことを特徴とする請求項１−７の方法。
【請求項９】
測定系において、チラミド化合物を使用することを特徴とする請求項８の方法。
【請求項１０】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列を備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−９の方法。
【請求項１１】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−１０の方法。
【請求項１２】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に２種類以上の基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−１１の方法。
【請求項１３】
使用する量子ドット蛍光化合物の粒子の直径が０．１〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１−１２の方法。
【請求項１４】
疾患マーカーおよび疾患予防マーカーを測定対象とするものであることを特徴とする１）−１３）の方法。
【請求項１５】
請求項１−１４の方法に使用するための基板。
【請求項１６】
請求項１−１５の方法に使用するための試薬組成物。
【請求項１】
測定対象物質を認識するタンパク質または測定対象物質の全体・一部・類似物から選択される物質を、３次元ゲル化合物内に物理的または化学的に固定化した基板上において、量子ドット蛍光化合物を標識体として、試料中の対象物質を測定することを特徴とするアッセイ方法。
【請求項２】
ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの粉末あるいは水溶液を用いて製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリビニルピロリドン・ポリエチレングリコール・ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド・ポリアクリル酸・ポリメタクリル酸・ポリカーボネート・ポリ乳酸・多糖類・アミノ多糖類・複合糖類・ペプチド・複合高分子のうち、１種以上を含有する水溶性ポリマーの水溶液を、放射線・電子ビーム・ガンマ線・ラジカル発生試薬・架橋試薬 の内１種以上に対して曝露することにより、架橋して製造された３次元ゲル化合物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
測定対象物質が、タンパク質・ペプチド・糖質・脂質・糖脂質・低分子化合物である請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
測定対象物質を認識するタンパク質が、抗体・レセプター・レクチンであることを特徴とする請求項１−４の方法。
【請求項６】
固定化した基板が非蛍光性のガラス・プラスチック・金属基板であることもしくは、蛍光検出時に測定を妨害しないガラス・プラスチック・金属基板であることを特徴とする請求項１−５の方法。
【請求項７】
測定系において、アビジンもしくはアビジン様物質及びビオチンを使用することを特徴とする請求項１−６の方法。
【請求項８】
測定系において、物理的シグナルの増幅を行うことを特徴とする請求項１−７の方法。
【請求項９】
測定系において、チラミド化合物を使用することを特徴とする請求項８の方法。
【請求項１０】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列を備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−９の方法。
【請求項１１】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−１０の方法。
【請求項１２】
２以上のスポットからなる１以上のアレイ配列内に２種類以上の基準スポットを備えた基板を使用することを特徴とする請求項１−１１の方法。
【請求項１３】
使用する量子ドット蛍光化合物の粒子の直径が０．１〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１−１２の方法。
【請求項１４】
疾患マーカーおよび疾患予防マーカーを測定対象とするものであることを特徴とする１）−１３）の方法。
【請求項１５】
請求項１−１４の方法に使用するための基板。
【請求項１６】
請求項１−１５の方法に使用するための試薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−１５５６９１（Ｐ２００７−１５５６９１Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３８０８３９（Ｐ２００５−３８０８３９）
【出願日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第２８回日本分子生物学会年会 講演要旨集 発行日 平成１７年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会 開催期日 平成１７年１２月７日〜１０日 発表日 平成１７年１２月８日 日本分子生物学会 主催
【出願人】（５０６１３３７９２）住商ファーマインターナショナル株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第２８回日本分子生物学会年会 講演要旨集 発行日 平成１７年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会 開催期日 平成１７年１２月７日〜１０日 発表日 平成１７年１２月８日 日本分子生物学会 主催
【出願人】（５０６１３３７９２）住商ファーマインターナショナル株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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