物質分布制御方法、デバイス、細胞培養方法、細胞分化制御方法
【課題】せん断応力による負荷を低減しながら、マイクロ空間内における物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる物質分布制御方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法を提供する。
【解決手段】液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
【解決手段】液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞（embryonic stem cell）および人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）の研究が広く行われており、その研究成果は再生医療、細胞・組織工学、薬剤スクリーニングなどへの応用が期待されている。しかし現在、多能性幹細胞の分化効率は未だ数パーセントと低い状態であり、その改善が求められている。
最近の研究によって、細胞をとりまく微小環境（たとえば分化に影響する物質（例：分化制御因子等の液性因子）の濃度、細胞間相互作用、細胞外マトリックスとの間の相互作用、細胞への物理的刺激など）が細胞の分化の方向性に影響を与えることがわかってきている。そのため、分化効率の向上には、細胞をとりまく微小環境を精密に設計・制御することが重要と考えられる。
【０００３】
従来、細胞の培養法としては、培養皿、培養プレート等の培養容器を用い、培養液中、静置・閉鎖環境下で培養する静置培養法が一般的である。しかし、静置培養では、栄養成分やその他任意の液性因子等の物質の供給を単調にしか行うことができず、培養環境内における物質分布を精密に制御することはできない。
他の細胞培養法として、培養容器内に、栄養成分や酸素を含んだ培養液を灌流させて培養する灌流培養法がある。灌流培養では、培養液の組成を調整することにより、培養容器内の物質分布の経時的制御が可能である。しかし、灌流下で培養を行うと、せん断応力による悪影響がある。たとえば流れによって生じるせん断応力が、細胞容器に付着している細胞を剥離させ、細胞が失われることがある。
このような問題に対し、内部にコンパートメントを備えた細胞培養チャンバーにおいて、コンパートメント内部を半透膜で上層と下層に区画し、下層に培養液を流通させつつ上層で細胞を培養する方法が提案されている（特許文献１、非特許文献１）。
しかし、上記の方法では、培養環境内に物質濃度勾配を形成するなど、物質分布を空間的に制御することはできない。
【０００４】
一方、マイクロ空間での流体の挙動は、マクロ空間での流体の挙動と大きく異なることが知られている。たとえば流路構造のマイクロ空間（マイクロ流路）に液体を流通させると、レイノルズ数が小さく、層流を形成しやすい。
最近、このマイクロ空間特有の現象を利用して物質濃度勾配を形成し、細胞培養に応用した研究が行われるようになっている。たとえば非特許文献２〜７では、層流を利用して、マイクロ空間内に物質濃度勾配を形成している。また、非特許文献８〜９では、物質の拡散を利用して、マイクロ空間内に物質濃度勾配を形成している。
しかし、層流場で培養を行うと、上記灌流培養と同様、せん断応力による悪影響がある。特に、層流を利用して物質濃度勾配を形成する方法では、濃度勾配を維持するにはある程度流速を速くする必要があるため、せん断応力の影響が大きい。また、多能性幹細胞の場合、該せん断応力により細胞が変質したり、分化の方向性が変わってしまうとの報告もある（たとえば非特許文献１０）。
また、培養細胞が三次元構造体（たとえば胚様体や受精卵）を形成する場合には、該三次元構造体によって層流が乱れてしまうため、マイクロ空間における物質分布の精密な制御が困難となる。
また、物質の拡散を利用する方法では、拡散により物質分布（濃度）が経時的に一様となるため、マイクロ空間内に所定の物質分布を長期に渡って維持することはできない。そのため細胞の分化を精密に制御することもできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２４６７２０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lab Chip, 2007, Vol.7, p.770-776
【非特許文献２】Nature, Vol. 411, 28 JUNE 2001, p.1016
【非特許文献３】Lab Chip, 2009, Vol.9, p.2591-2595
【非特許文献４】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.191-198
【非特許文献５】Lab Chip, 2004, Vol.4, p.164-167
【非特許文献６】Analytical Chemistry, Vol.78, No.10, p3354-3359
【非特許文献７】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.1462-1469
【非特許文献８】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.389-393
【非特許文献９】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.849-856
【非特許文献１０】Measurement Science and Technology, Vol.17, 2006, p.3167-3170
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、せん断応力による負荷を低減しながら、マイクロ空間内における物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる物質分布制御方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、マイクロ空間下に所定の孔径の多孔膜を介してマイクロ流路を配置し、下層のマイクロ流路内に、所定の物質分布を有するように形成された多層流を流通させると、上層のマイクロ空間に、多層流によるせん断応力による負荷を低減しながら、下層のマイクロ空間内と同様の物質分布を形成でき、しかもその物質分布を長期にわたって維持できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の態様を有する。
［１］液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
［２］前記マイクロ流路内においてレイノルズ数が２０００未満となるように前記多層流を流通させる、［１］に記載の物質分布制御方法。
［３］［１］または［２］に記載の物質分布制御方法に用いられるデバイスであって、
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
［４］液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞を培養する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞培養方法。
［５］予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、［４］に記載の細胞培養方法。
［６］前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、［４］に記載の細胞培養方法。
［７］前記細胞が多能性幹細胞である、［４］〜［６］のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
［８］前記細胞が三次元構造体を形成している、［６］に記載の細胞培養方法。
［９］液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞の分化を制御する方法であって、
前記細胞の分化を制御する物質の種類または濃度が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞分化制御方法。
［１０］予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、［９］に記載の細胞分化制御方法。
［１１］前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、［９］に記載の細胞分化制御方法。
［１２］前記細胞が多能性幹細胞である、［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の細胞分化制御方法。
［１３］前記細胞が三次元構造体を形成している、［１１］に記載の細胞分化制御方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、せん断応力による負荷を低減しながら、マイクロ空間内における物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる物質分布制御方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】デバイス１の斜視図である。
【図２】デバイス１の分解斜視図である。
【図３】デバイス１の上面図である。
【図４】デバイス１を用いた物質濃度制御方法の一実施形態を説明するための説明図である。
【図５】試験例１（１）の結果（多孔膜Ｂ（孔径１μｍ）、多孔膜Ｃ（孔径３μｍ）、多孔膜Ｄ（孔径５μｍ）、多孔膜Ｅ（孔径１０μｍ）をそれぞれ用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布）を示す蛍光像である。
【図６】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布の経時変化を示す蛍光像である。
【図７】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の下層流路（多層流流通部）内のＦＩＴＣ分布を示す蛍光像およびグラフである。
【図８】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布を示す蛍光像およびグラフである。
【図９】試験例２の結果（下層流路（多層流流通部）内、上層流路（マイクロ空間部）内それぞれのＦＩＴＣ分布）を示す蛍光像およびグラフである（（ａ）多層流流通部内、（ｂ）マイクロ空間部内）。
【図１０】試験例３の結果（下層流路（多層流流通部）への送液量と、下層流路（多層流流通部）内、上層流路（マイクロ空間部）内それぞれの流路内ビーズの流速との関係）を示すグラフである。
【図１１】試験例４の結果（上層流路（マイクロ空間部）内にて細胞に取り込まれたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光観察結果）を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）培養前、（ｂ）培養１２時間後）である。
【図１２】試験例５の結果のうち、培養前および培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）培養前、（ｂ）培養５日後）である。
【図１３】試験例５の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフである。
【図１４】試験例６の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
【図１５】試験例６の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の物質分布制御方法は、液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする。
上記多層流は、それぞれ組成（物質濃度）が異なるｎ種の層流がマイクロ流路の幅方向に順次積層したものであり、マイクロ流路の幅方向において物質濃度が変化している。このような物質分布を有する多層流をマイクロ流路に流通させると、ｎ種の層流にそれぞれ含まれる物質が拡散により多孔膜を通過して上層のマイクロ空間内に移動する。その結果、各層流の上方のマイクロ空間内に、各層流と同じ物質濃度の領域が、各層流と略同じ幅で形成される。このようにして、上層のマイクロ空間内に多層流と同様の物質分布が形成される。
従来、流体中から膜を透過して流れのない液体中に移行した物質の濃度分布は、拡散により経時的に一様になるものと考えられていた。しかし本発明者らの知見によれば、孔径１μｍ以上の多孔膜を用いることで、意外にも、上層のマイクロ空間内に、下層のマイクロ流路を流通する多層流と同様の物質分布が形成されるとともに、該多層流を流通させている間は該物質分布が維持される。
そのため、本発明においては、ｎ種の液体の組成や流量を調整するだけで、マイクロ空間内の物質分布を時間的にも空間的にも精密に（マイクロスケールレベルで）制御でき、また、２４時間以上にわたるような長期的な制御も可能である。このことは、比較的時間を必要とする細胞の培養や分化の制御を行う上で有用である。たとえばマイクロ空間内で多能性細胞等の細胞を培養するとともに、該マイクロ空間内にて、培養細胞の分化を制御する物質の種類（分化誘導因子、分化抑制因子等）または濃度の分布を空間的および／または時間的に制御することにより、該細胞の分化を精密に制御することが可能である。
また、多層流の流通時、その流れによって生じるせん断応力は多孔膜によって軽減される。たとえばマイクロ空間を、該マイクロ空間内に存在する微粒子のブラウン運動を観察可能な高レベルの静的環境とすることも可能である。そのため、該マイクロ空間内では、接着力の弱い細胞であっても培養することが可能である。また、該せん断応力によって生じる、培養細胞の活性や分化への影響も抑制できる。
さらに、マイクロ空間にて培養する細胞が三次元構造体を形成する場合であっても、下層のマイクロ流路内の流れが乱れることはないので、マイクロ空間内における物質分布制御の精密性が維持される。
【００１２】
前記多層流の形成方法は特に限定されず、公知の方法を利用できる。たとえば、マイクロ流路の上流に、下流側末端で合流するｎ本のマイクロ流路（以下、層流形成用流路という。）を設け、各層流形成用流路にそれぞれ液体を導入することにより形成できる。すなわち、各層流形成用流路では、それぞれ、導入された液体が層流を形成し、下流側末端で合流する。その結果、ｎ個の層流が幅方向に並んだ多層流が形成される。該多層流は、そのまま下流のマイクロ流路に供給され、マイクロ流路内を流通する。
ｎは、２以上の整数であればよく、上限は特に限定されない。好ましくは、多層流を構成する各層流の幅が１０μｍより小さくならない範囲で設定する。各層流の幅は、１０〜１０００μｍが好ましく、５０〜５００μｍがより好ましい。
【００１３】
本発明の物質分布制御方法は、たとえば下記のデバイスを用いて実施できる。
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造（以下、下層流路ということがある。）は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造（以下、上層流路ということがある。）は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
該デバイスにおいては、下層流路の多層流形成部にｎ種の液体をそれぞれ導入することで多層流が形成され、該多層流は、多層流流通部を通過し、多層流排出部からデバイス外部に排出されるようになっている。
該デバイス内には、上層流路のマイクロ空間部と多孔膜とによりマイクロ空間が形成されており、該マイクロ空間の下に、多孔膜を介して多層流流通部が配置されている。マイクロ空間部と多層流流通部とは、略同一のパターンで形成されている。
そのため、前記マイクロ空間に液体を満たした状態で、下層流路の多層流形成部にｎ種の液体を導入すると多層流が形成され、該多層流がマイクロ空間下の多層流流通部を流通することとなる。多層流流通部とマイクロ空間との界面には所定の孔径の多孔膜が配置されているため、該多孔膜を介して、多層流を構成するｎ種の層流中の物質がそれぞれ上方に移動し、結果、マイクロ空間内に、その下を流れる多層流と同様の物質分布が形成される。
該デバイスにおいては、多層流流通部、マイクロ空間部が、それぞれ、本発明の物質分布制御方法におけるマイクロ流路、マイクロ空間に相当する。
【００１４】
以下、図面に基づいて、上記デバイスの一実施形態を説明する。
図１〜３に本実施形態のデバイス１を示す。図１はデバイス１の斜視図であり、図２はデバイス１の分解斜視図であり、図３はデバイス１の上面図である。
デバイス１は、表面に下層流路２１が形成された第一の基板２と、表面に上層流路３１が形成された第二の基板３とが、下層流路２１および上層流路３１が形成された面を内側にして積層された積層体を備え、第一の基板２と第二の基板３との間の所定の位置に、孔径１μｍ以上の多孔膜４が挟持されている。
該積層体において、下層流路２１上の、上層流路３１と重複部分はすべて多孔膜４で被覆されている。これにより、下層流路２１を流通する液体が、上層流路３１に直接流入しないようになっている。
【００１５】
第一の基板２において、下層流路２１は、多層流流通部２１１（図２、３中、位置Ａ−Ａ’と位置Ｂ−Ｂ’との間の部分）と、多層流流通部２１１の上流側に配置された、下流側末端で合流する３つの分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃを有する多層流形成部と、多層流流通部２１１の下流側に配置された多層流排出部２１３とから構成される。
多層流形成部は、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃと、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの合流点と多層流流通部２１１の上流側末端とを連絡する連絡流路部２１２ｄとから構成される。多層流形成部においては、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃのうち、２つまたは３つの上流側末端にそれぞれ組成の異なる液体を導入すると、各液体が層流を形成し、合流して２層または３層の多層流が形成されるようになっている。
多層流流通部２１１と、分岐流路部２１２ｂと、連絡流路部２１２ｄと、多層流排出部２１３とは、略同一直線上に配置されている。
【００１６】
第二の基板３において、上層流路３１は、多層流流通部２１１と略同一パターンのマイクロ空間部３１１（図２、３中、位置Ａ−Ａ’と位置Ｂ−Ｂ’との間の部分）と、マイクロ空間部３１１への液体の導入または導出のための２つの導出入路部３１２，３１３とから構成される。
導出入路部３１２，３１３は、それぞれ、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端（多層流流通部２１１における多層流の流通方向の上流側末端および下流側末端）から、マイクロ空間部３１１の長手方向に対して一定の角度で屈曲させて形成されている。
マイクロ空間部３１１は、多層流流通部２１１と略同一パターンに形成されている。すなわち、多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）および幅と略同一の長さおよび幅で形成されている。
【００１７】
第二の基板３には、第二の基板３を貫通する６つの貫通孔３２〜３７が形成されている。これらのうち、貫通孔３２〜３４は、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの上流側末端に対応する位置に設けられ、貫通孔３５は、多層流排出部２１３の下流側末端に対応する位置に設けられている。これにより、貫通孔３２〜３７を介して、各流路２１２ａ〜２１２ｃへの液体の導入および多層流排出部２１３からの液体（多層流）の排出を行うことができるようになっている。
貫通孔３６，３７はそれぞれ導出入路部３１２，３１３の末端に対応する位置に設けられている。これにより、貫通孔３６，３７を介して、マイクロ空間部３１１への液体の導入または排出を行うことができるようになっている。マイクロ空間部３１１にて細胞の培養または分化の制御を行う場合、該貫通孔３６，３７は、マイクロ空間部３１１への細胞の導入、または細胞の取出しにも利用できる。
【００１８】
以下、上述したデバイス１の構成要素それぞれについてより詳細に説明する。
多層流流通部２１１は、好ましくは、多層流流通部２１１内を流通する液体（多層流）のレイノルズ数が２０００未満となるように、液体の物性（密度および粘性率）や流速を考慮しての幅および高さが設定される。該レイノルズ数が２０００未満であれば、多層流の層流状態が安定で、隣接する層流間での物質移動がほとんど生じない状態でマイクロ流路を流通する。該レイノルズ数は、２０００以下が好ましく、１００以下がより好ましく、１以下がさらに好ましい。該レイノルズ数の下限は特に限定されない。
レイノルズ数は、従来、流体の挙動を説明する上で重要な指標の一つとして知られており、下記式により定義される。
Ｒｅ＝ρ×ｒ×ｌ／μ
［式中、Ｒｅはレイノルズ数であり、ρは液体の密度であり、ｒは流速であり、ｌは代表長さであり、μは液体の粘性率である。］
【００１９】
液体の密度ρ、粘性率μは、それぞれ流通時の温度条件下における密度、粘性率である。
多層流流通部２１１を流通する液体のレイノルズ数については以下の手順で求められる。まず、各層流を構成するｎ種の液体の密度をそれぞれρ１、ρ２…ρｎ、粘性率をそれぞれρ１、ρ２…ρｎ，μ１，μ２，…μｎとし、各液体の密度および粘性率と、多層流流通部２１１における各液体の流量比から、多層流を構成する全液体の混合液の密度ρ’および粘性率μ’をそれぞれ算出する。該密度ρ’および粘性率μ’と、多層流流通部２１１における多層流の流速および代表長さから、多層流流通部２１１を流通する液体のレイノルズ数が求められる。
流速ｒ（単位：μｍ／ｍｉｎ）は、平均的な流速は平均的な流速＝流量/流路の断面積により求められる。
代表長さｌは、その長さを変えたときに流れが最も影響を受けやすい場所の断面積および周囲長さにより決定される。たとえばマイクロ流路の断面形状が高さｈ１と幅（深さ）ｗの矩形である場合、その代表長さｌは下記式により求められる。
ｌ＝４×ｈ１×ｗ／２（ｈ１＋ｗ）
【００２０】
レイノルズ数は、流路を流通する液体の物性（密度および粘性率）、流速、流路のサイズ（幅および高さ）により変動する。
そのため、多層流流通部２１１の幅および高さは、流通させる液体の物性や流速によっても異なり、特に限定されないが、幅広い範囲の密度または粘性率の液体に適用できることから、幅１〜１０００００μｍの範囲内、高さ１〜１００００μｍの範囲内で設定することが好ましい。多層流流通部２１１の幅は、１〜１０００μｍがより好ましく、２０〜１０００μｍがさらに好ましい。また、高さは、１〜１０００μｍがより好ましく、１〜５００μｍがさらに好ましい。幅および高さが上記範囲の上限値以下であるとレイノルズ数が小さく、層流の安定性が良好となる。下限値以上であると、当該流路構造を形成しやすい、細胞実験等への応用に適している、せん断応力を軽減できる等の利点がある。
【００２１】
多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）は、特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。たとえば該長さを短くすると、隣接する層流との界面が明確な状態（層流間の物質濃度のコントラストが明確な状態）で多層流が多層流流通部２１１の上流側末端から下流側末端まで流通するため、その上層のマイクロ空間内の長手方向全体にわたって、コントラストが明確な物質分布を形成できる。また、該長さを長くすると、多層流が多層流流通部２１１内で流通する間に、隣接する層流との間で物質移動が生じてくる。これに伴って、その上層のマイクロ空間内に形成される物質分布が、長手方向下流側に近づくほど濃度勾配の緩やかなものとなる。
【００２２】
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃは、好ましくは、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ内を流通する液体のレイノルズ数が２０００未満となるように、各分岐流路部を流通する液体の物性（密度および粘性率）や流速を考慮しての幅および高さが設定される。該レイノルズ数が２０００未満であれば、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃに導入した液体が層流を形成するとともに、各層流が合流した際、各層流間での物質の移動がほとんど生じることなく安定した多層流が形成される。該レイノルズ数は、２０００以下が好ましく、１００以下がより好ましく、１以下がさらに好ましい。該レイノルズ数の下限は特に限定されない。
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの幅および高さは、幅広い範囲の密度または粘性率の液体に適用できることから、幅０．１〜１０００００μｍの範囲内、高さ０．１〜１０００μｍの範囲内で設定することが好ましい。流路２１２ａ〜２１２ｃの幅は、１〜１０００μｍがより好ましく、２０〜１０００μｍがさらに好ましい。また、流路２１２ａ〜２１２ｃの高さは、１〜１０００μｍがより好ましく、１〜１００μｍがさらに好ましい。幅および高さが上記範囲の上限値以下であるとレイノルズ数が小さくなり、層流が形成されやすい。下限値以上であると、当該流路構造を形成しやすい、少量の流量で層流が形成可能である、使用する試薬などの使用量が減少する等の利点がある。
【００２３】
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃのうち、両端の分岐流路部２１２ａ、２１２ｃの連絡流路部２１２ｄへの合流角度（図３中のθ１、θ２）は、１〜１７９度が好ましく、９０〜１７９度がより好ましい。合流角度が上記範囲内であると、多層流を良好に形成できる。該合流角度の好ましい範囲は、分岐流路部が２つ、または４つ以上の場合においても同様である。
また、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃがそれぞれ隣接する流路との間でなす角度（流路２１２ａと流路２１２ｂとがなす角度と、流路２１２ａと流路２１２ｂとがなす角度）は、同等であることが好ましい。
【００２４】
連絡流路部２１２ｄは、幅方向の断面形状が多層流流通部２１１と同じに形成されている。これにより、連絡流路部２１２ｄ内を通過した多層流がスムーズに多層流流通部２１１に供給されるようになっている。
また、多層流排出部２１３は、幅方向の断面形状が多層流流通部２１１と同じに形成されている。これにより、多層流流通部２１１内を流通する多層流がスムーズに排出されるようになっている。
【００２５】
第一の基板２を構成する材料は特に限定されず、たとえば従来、マイクロ流路構造の形成に用いられている公知の材料のなかから目的に応じてから適宜選択できる。
たとえばマイクロ空間内の観察を行う場合、可視光を透過する透明材料が好ましい。透明材料として、たとえばポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳという）等のシリコーンゴム、アクリル樹脂、ガラス、ゲル等が挙げられる。また、透明材料以外では金属、Ｓｉ等が挙げられる。
また、マイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合は、培養細胞に対して適合性を有する材料を用いることが好ましい。該材料としては、特に、デバイス外の大気中の酸素をマイクロ空間内に供給できる点から、酸素透過性を有する材料が好ましい。該材料としては、既知の任意の酸素透過性材料が使用可能であり、たとえば、酸素透過性コンタクトレンズなどに用いられている生体適合性の酸素透過性材料などを挙げることができる。特に、デバイス外部からマイクロ空間の培養細胞を観察できることから、酸素透過性を有する材料が、透明材料であることが好ましい。
生体適合性の酸素透過性材料として具体的には、シリコーンゴムが挙げられる。特に、生体適合性を有するとともに、透明性および酸素透過性を有し、さらに安価な材料であることから、ＰＤＭＳが好ましい。
【００２６】
マイクロ空間部３１１は、上述したように、多層流流通部２１１と略同一パターンに形成されている。すなわち、多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）および幅と略同一の長さおよび幅で形成されている。
マイクロ空間部３１１の高さ（多孔膜４表面に対して垂直方向における幅）は、マイクロ空間部３１１および多孔膜４により形成されるマイクロ空間内に物質分布が良好に形成できる点から、１００００μｍ以下が好ましく、１０００μｍ以下がより好ましい。
該高さの下限は、物質分布の制御の観点からは特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。たとえばマイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合には、培養細胞のサイズよりも高く設定する。
細胞のサイズは種類や接着状態によって異なる。たとえば哺乳動物の胚性幹細胞の大きさは、通常、接着時においては長径で約１０〜２０μｍ、短径で約５〜１０μｍであり、トリプシン等により剥離して浮遊させた状態では約５〜１０μｍの球体である。受精卵の大きさは、通常、ヒトは約１３０μｍ、マウスは約８０μｍ、ウシやブタは約１２０〜１３０μｍである。胚様体は、人工的に作る細胞塊であり、そのサイズは様々な手法によって変えられるものであり、特に限定されないが、通常、５０μｍ〜１ｍｍ程度である。
【００２７】
導出入路部３１２，３１３は、マイクロ空間部３１１と同じ高さに形成されている。
導出入路部３１２，３１３は、それぞれ、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端（多層流流通部２１１における多層流の流通方向の上流側末端および下流側末端）から、マイクロ空間部３１１の長手方向に対して一定の角度で屈曲させて形成されている。
導出入路部３１２がマイクロ空間部３１１の長手方向となす角度（図３中のθ３）、導出入路部３１３がマイクロ空間部３１１の長手方向となす角度（図３中のθ４）は、それぞれ、０〜１７９度が好ましく、０〜９０度がより好ましい。これらの角度が上記範囲内であると、マイクロ空間部３１１にて細胞の培養や分化の制御を行う場合に、該マイクロ空間部３１１に細胞を一様に播種しやすい。
【００２８】
第二の基板３を構成する材料は特に限定されず、たとえば前記第一の基板２を構成する材料として挙げたものと同様のものが挙げられ、特に透明材料が好ましい。ただしマイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合でも、第二の基板３には、上述した生体適合性や酸素透過性は必ずしも必要ではない。
【００２９】
多孔膜４は、物質分布をマイクロ空間部３１１内に形成するためには、孔径が１μｍ以上である必要がある。ここで、「多孔膜」とは、当該膜を貫通する細孔を多数有する固体の膜である。多孔膜の孔径（細孔の孔径）は 電子顕微鏡（ＳＥＭ）、レーザー顕微鏡等により測定できる。
多孔膜４の孔径は、１μｍ以上が好ましく、５μｍ以上がより好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましい。孔径が大きいほど、マイクロ空間に、マイクロ流路を流通する多層流の物質分布が反映されやすく、コントラストの明確な物質分布が形成されやすい。孔径の上限は、多層流により生じるせん断応力によるマイクロ空間への負荷を低減する観点から、５０μｍ以下が好ましく、２０μｍ以下がより好ましい。
マイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合は、さらに、培養細胞のサイズを考慮することが好ましい。すなわち、多孔膜４が有する細孔が大きすぎると、培養細胞がマイクロ流路に浸潤、流出するおそれがある。そのため、この場合は、多孔膜４として、培養細胞のサイズよりも孔径が小さいものを用いることが好ましい。該多孔膜４の孔径は、培養細胞のサイズの１００％以下が好ましく、５０％以下がより好ましい。ここで、培養細胞のサイズは単一細胞の直径を意味し、顕微鏡観察により測定できる。
たとえば胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞という。）等の多能性幹細胞のサイズは、一般的に、１０〜２０μｍ程度である。そのため、培養細胞が胚性幹細胞である場 合、多孔膜４の孔径は、１５μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましい。
また、胚様体、受精卵等の三次元構造体のサイズは、一般的に、５０μｍ〜１ｍｍ程度である。そのため、培養細胞が三次元構造体を形成する場合、多孔膜４の孔径は、５０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましい。
【００３０】
多孔膜４の空隙率は、１〜１５％が好ましく、５〜１０％がより好ましい。該範囲の下限値以上であるとマイクロ空間に物質分布が形成されやすく、上限値以下であると上層流路３１内への下層流路２１の流速の影響を充分に軽減できる。
多孔膜４の材質としては特に限定されず、従来、多孔膜の材料として用いられているものと同様であってよい。具体的には、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（以下、ＰＴＦＥという）等が挙げられる。
また、多孔膜４の表面に、細胞接着性を高める等の目的で、表面処理が施されていても良い。
多孔膜４の厚さは、物質の透過性の観点から、１００μｍ以下が好ましく、２０μｍ以下がより好ましい。
多孔膜４は、Ｗｈａｔｍａｎ社等から販売されている市販品を利用できる。
【００３１】
デバイス１は、第一の基板２と第二の基板３とを、下層流路２１、３１が形成された面を内側にして、多層流流通部２１１およびマイクロ空間部３１１の位置が一致するように配置し、多孔膜４を挟んで貼り合わせることにより作製できる。
第一の基板２、第二の基板３は、それぞれ、従来、マイクロリアクター等の流路構造を有するマイクロデバイスの製造に用いられている方法など、公知の微細加工法を利用して製造できる。該微細加工法としては、たとえばリソグラフィー法、エッチング法、切削、射出成型等が挙げられる。
リソグラフィー法を用いた製造方法の一例を挙げると、以下の工程（１）〜（５）を行うことにより第一の基板２を作製できる。
（１）まず、基板上に、スピンコーティングによりフォトレジストを塗布してフォトレジスト層を形成する。
（２）フォトレジスト層に対し、下層流路２１に対応したパターンのマスクを介して露光し、現像することにより、フォトレジスト層をパターニングする。
（３）パターニングされたフォトレジスト層（鋳型）上に、ＵＶ硬化型または熱硬化型ポリマーのプレポリマーを塗布してプレポリマー層を形成する。
（４）プレポリマー層にＵＶを照射または加熱して硬化させてポリマー層とする。
（５）ポリマー層を剥離する。
このようにして得られるポリマー層の表面には、フォトレジスト層のパターンが反転したパターン（たとえばフォトレジスト層のパターンがラインパターンの場合はスペースパターン）で、フォトレジスト層の厚さと同じ高さ（深さ）の下層流路２１が形成されている。このポリマー層を第一の基板２として使用できる。
第二の基板３は、マスクとして上層流路３１に対応したパターンのマスクを用いる以外は上記（１）〜（５）と同様にしてポリマー層を得た後、さらに、該ポリマー層に貫通孔３２〜３７を開けることにより作製できる。
【００３２】
次に、上記デバイス１のマイクロ空間部３１１内の物質分布制御方法の一実施形態を、図４を用いて説明する。図４は、２個の層流Ｌ１、Ｌ２が多層流流通部２１１の幅方向に隣接した多層流（２層流）が多層流流通部２１１を流通している状態における、デバイス１の位置Ａ−Ａ’の部分縦断面図である。
本実施形態では、分岐流路部２１２ｂを封鎖した状態で、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにそれぞれ液体Ｌ１、Ｌ２を導入することにより２層流を形成し、多層流流通部２１１に流通させている。すなわち、液体Ｌ１、Ｌ２をそれぞれ貫通孔３２、３４から分岐流路部２１２ａ、２１２ｃに導入すると、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにて各液体の層流が形成され、流路２１２ａ、２１２ｃの下流側末端で合流し、２個の層流が幅方向に並んだ多層流（２層流）が形成される。該２層流は、連絡流路部２１２ｄを通って多層流流通部２１１に供給され、多層流流通部２１１を流通し、多層流排出部２１３の下流側末端から貫通孔３５を介してデバイス１外に排出される。
上記のようにして２層流を多層流流通部２１１に流通させると、多層流流通部２１１の上層のマイクロ空間部３１１内に、該２層流と同様の物質分布が形成される。
該液体Ｌ１、Ｌ２の組成や流量を調整するだけで、マイクロ空間部３１１内の物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる。たとえば、液体Ｌ１として物質Ａを濃度ａ１で含有する液体、液体Ｌ２として物質Ａを濃度ａ２（ａ１＜ａ２）で含有する液体を用いると、マイクロ空間部３１１内に、物質Ａの濃度勾配が生じる。つまり、液体Ｌ１の層流の上方の部分は物質Ａを比較的低濃度に含有する領域（低濃度領域）となり、液体Ｌ２の層流の上方の部分は物質Ａを比較的高濃度に含有する領域（高濃度領域）となり、マイクロ空間部３１１内の幅方向に、物質Ａの濃度勾配が生じる。
濃度ａ１、ａ２のいずれか一方または両方を変化させると、該濃度勾配を変化させることができる。
また、層流Ｌ１、Ｌ２それぞれの幅ｗ１、ｗ２を変化させると、マイクロ空間部３１１内における高濃度領域の幅と低濃度領域の幅も変化する。
層流Ｌ１、Ｌ２それぞれの幅ｗ１、ｗ２は、液体Ｌ１、Ｌ２の流量の比率を調節することで調節できる。たとえば液体Ｌ１の流量の比率を高めると、層流Ｌ１の幅ｗ１が広くなる。各液体の流量の制御は、シリンジポンプ、電気浸透流ポンプ、その他機械的動作によるポンプ等の公知の液体供給装置を用いて実施できる。
また、液体Ｌ１、Ｌ２にそれぞれ配合する物質の種類を変更する、複数種の物質を組み合わせる、該複数種の物質の比率を変更する等により、マイクロ空間部３１１内に複雑な物質分布を形成できる。
また、液体Ｌ１、Ｌ２の組成を経時的に変化させることで、マイクロ空間部３１１内における物質分布を経時的に変化させることができる。一方、液体Ｌ１、Ｌ２の組成を変更しない場合は、当初の物質分布をそのまま維持できる。
【００３３】
本発明においては、上述したように、レイノルズ数が２０００未満となるように２層流を多層流流通部２１１内に流通させることが好ましい。
レイノルズ数は、上述したように、多層流流通部２１１のサイズ（幅および高さ）のほか、液体の物性（密度ρ、粘性率μ）や流速ｒによっても調節できる。特に流速ｒは、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにそれぞれ導入する液体Ｌ１、Ｌ２の流量を変更する簡便な方法で調節でき、好ましい。
【００３４】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
たとえば上記実施形態では、デバイス１の第一の基板２に、連絡流路部２１２ｄに合流する分岐流路部（多層流を形成する各層流を形成するための流路）を３つ設けた例を示したが、分岐流路部の数は２であってもよく、４以上であってもよい。分岐流路部の数の上限は特に限定されず、使用する液体の数（ｎ）に応じて適宜設定すればよい。デバイスの操作性を考慮すると５以下が好ましい。
また、連絡流路部２１２ｄ、多層流流通部２１１および多層流排出部２１３が同一直線上に形成されている例を示したが本発明はこれに限定されない。たとえば。連絡流路部２１２ｄ、多層流流通部２１１、多層流排出部２１３のうち、少なくとも１つが曲線状に形成されていてもよい。
また、連絡流路部２１２ｄと多層流流通部２１１と多層流排出部２１３との幅方向の断面形状が同一である例を示したが本発明はこれに限定されず、各流路の断面形状が異なっていてもよい。ただし層流の安定性の観点からは、同一であることが好ましい。
また、第二の基板３において、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端にそれぞれ導出入路部３１２，３１３を設けているが、導出入路部３１２，３１３のいずれか一方のみであってもよい。
また、図４においては２層流を形成して物質濃度分布を制御する例を示したが本発明はこれに限定されない。たとえば分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ全てに液体を導入すると、３層流を形成できる。この場合、２層流の場合よりも複雑な物質分布制御が可能である。たとえば多層流流通部２１１内に、高濃度領域−低濃度領域−高濃度領域の濃度勾配の物質分布、低濃度領域−高濃度領域−低濃度領域の濃度勾配の物質分布、物質Ａ含有領域−物質Ｂ含有領域−物質Ｃ含有領域といった物質分布を形成できる。
【００３５】
本発明の物質分布制御方法に用いる液体は、層流を形成可能なものであれば特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。
たとえば前記液体として培養液を用いることにより、本発明の物質分布制御方法を、細胞の培養に利用することができる。
すなわち、マイクロ空間内に培養しようとする細胞（以下、培養細胞という。）を導入し、マイクロ流路に複数の培養液からなる層流から構成される多層流を流通させると、各層流を構成する培養液に含まれる栄養成分や酸素が多孔膜を介して上層のマイクロ空間内の培養細胞に供給される。また、マイクロ空間内にて培養細胞から排出された老廃物は、多孔膜を介して多層流内に拡散し、排出される。
このとき、多層流を構成する複数の培養液の組成（栄養成分の種類や濃度、酸素濃度等）を調整することにより、マイクロ空間内の物質分布を、実際の生体内にて培養細胞を取り巻く環境における物質分布と類似したものとすることができる。そのため、本発明によれば、従来に比べて、より生体内に近い環境で細胞を培養することができる。たとえば生体内においては複数の細胞がそれぞれ、隣接しつつも異なる環境下に存在している（たとえば肝臓細胞と膵臓細胞）が、本発明によれば、マイクロ空間内にこれに類似した環境を形成できる。
また、上述したように、多層流により生じるせん断応力のマイクロ空間への影響は多孔膜によって軽減されるため、該マイクロ空間内では、接着力の弱い細胞であっても培養することができる。また、培養細胞の活性等に対するせん断応力による影響も生じない。
さらに、該マイクロ空間にて培養する細胞が三次元構造体を形成する場合であっても、下層のマイクロ流路内の流れが乱れることはないので、マイクロ空間内における物質分布制御の精密性が維持される。
【００３６】
マイクロ空間にて培養する培養細胞としては、ヒト、マウス、ウシ、ブタ等の哺乳動物に由来する細胞が挙げられる。
特に、生命科学、再生医療、細胞・組織工学、発生工学など様々な分野において有用であるため、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の胚性幹細胞が好ましい。また、胚様体、受精卵等の三次元構造体を形成している細胞も好ましい。
本発明は、これら未分化の細胞だけでなく、肝細胞、小腸細胞等の各種臓器細胞、植物細胞、大腸菌、酵母等の培養にも利用できる。
培養細胞のマイクロ空間への導入は、たとえば前記デバイスを用いる場合は、マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部を使用することにより実施できる。
【００３７】
使用する培養液の組成およびその他の培養条件（培養温度、培養時間等）は、培養細胞に応じて適宜設定できる。
特に、培養液として、細胞の分化を制御する物質（以下、分化制御因子という。）の種類または濃度が異なる培養液を用いると、培養細胞の分化の制御を行うことができる。たとえば、マイクロ空間内で多能性細胞等の細胞を培養するとともに、該マイクロ空間内にて培養する細胞の分化制御因子の種類（たとえば分化誘導因子または分化抑制因子）や濃度を変えることにより、該マイクロ空間内の細胞の分化の程度を局所的に変えることができる。また、このとき、上述したように、多層流により生じるせん断応力のマイクロ空間への影響は多孔膜によって軽減されるため、細胞の分化に対するせん断応力による影響も生じない。
分化制御因子は、培養細胞の種類に応じて公知の分化制御因子のなかから適宜選択すればよい。
【００３８】
上記のように細胞の培養または分化の制御を行う場合、マイクロ流路に多層流を流通させる前に、マイクロ空間内にて予備培養を行ってもよい。
特に、多孔膜に培養細胞を付着させた状態にて細胞の培養または分化の制御を行う場合は、予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始することが好ましい。
このとき、培養細胞が多孔膜に対して接着性を有さないものである場合は、予備培養を行う前に、細胞が接着する足場となるマトリックスの溶液をマイクロ空間内に導入し、該マトリックスを多孔膜表面に付着させておくことが好ましい。該マトリックスとしては、たとえばゼラチン、フィブロネクチン、コラーゲン，ゲル等が挙げられる。
培養細胞が多孔膜に対して接着性を有するものである場合は、培養細胞をそのまま培養液とともにマイクロ空間内に導入して予備培養を行えばよい。
胚様体、受精卵等の三次元構造を形成している細胞の場合は、通常、多孔膜に付着していない状態で培養または分化の制御が行われる。このように、培養細胞が多孔膜に付着していない状態で培養または分化の制御を行う場合は、予備培養を行ってもよく、行わなくてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし本発明は該実施例に限定されるものではない。
なお、後述する試験例において、蛍光観察および蛍光強度の測定は、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行った。
【００４０】
＜製造例１＞
図１〜３に示す構成のデバイスを以下の手順で製造した。
まず、シリコン基板を用意し、該基板上に、スピンコーティングによりフォトレジスト（商品名「ＳＵ−８ ２１００」；マイクロケム社製）を塗布し、ベークしてフォトレジスト層を形成した。次いで、下層流路２１のパターンのマスクを介して露光、現像を行い、フォトレジスト層にマスクのパターンを転写した。該フォトレジスト層（鋳型）上に、未硬化のＰＤＭＳを塗布してポリマー層を形成し、ＵＶ照射により硬化させた。硬化後、ポリマー層を剥離して第一の基板２（外径：長径５０ｍｍ×短径２０ｍｍ×厚さ５０００μｍ、多層流流通部２１１：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ×長さ１００００μｍ、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ：幅５００μｍ×高さ２００μｍ、分岐流路部２１２ａの合流角度θ１：１３５度、分岐流路部２１２ｃの合流角度θ２：１３５度）を得た。
マスクを上層流路３１のパターンのものに変更した以外は同じ操作を行い、剥離したポリマー層に貫通孔３２〜３７を開けて第二の基板３（外径：長径５０ｍｍ×短径５０ｍｍ×厚さ５０００μｍ、マイクロ空間部３１１：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ×長さ１５０００μｍ、導出入路部３１２，３１３：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ、導出入路部３１２とマイクロ空間部３１１との角度θ３：６０度、導出入路部３１３とマイクロ空間部３１１との角度θ４：６０度）を得た。
【００４１】
別途、多孔膜４として、以下に示す５種（いずれもｗｈａｔｍａｎ社製「ｔｒａｃｋ ｅｔｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ」（空隙率１５％未満のポリカーボネート製の多孔膜））を用意し、各多孔膜にＳｉＯ２をスパッタリングによりコーティングした。
多孔膜Ａ：孔径０．４μｍの多孔膜。
多孔膜Ｂ：孔径１μｍの多孔膜。
多孔膜Ｃ：孔径３μｍの多孔膜。
多孔膜Ｄ：孔径５μｍの多孔膜。
多孔膜Ｅ：孔径１０μｍの多孔膜。
第一の基板２、第二の基板３および多孔膜をＯ２プラズマ処理した後、第一の基板２と第二の基板３とを、下層流路２１、３１が形成された面を内側にして、多層流流通部２１１およびマイクロ空間部３１１の位置が一致するように配置し、多孔膜４を挟んで接着することによりデバイスを得た。
【００４２】
＜製造例２＞
下層流路２１のパターンのうち、多層流流通部２１１を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍ×長さ１００００μｍ、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃを幅１５０μｍ×高さ１５０μｍに変更した以外は製造例１と同様の手順で第一の基板２を得た。
また、上層流路３１のパターンのうち、マイクロ空間部３１１を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍ×長さ１５０００μｍ、導出入路部３１２，３１３を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍに変更した以外は製造例１と同様の手順で第二の基板３を得た。
得られた第一の基板および第二の基板、ならびに多孔膜Ｅを用いた以外は製造例１と同様にしてデバイスを得た。
【００４３】
＜試験例１＞
（１）
製造例１で製造した、多孔膜４の孔径がそれぞれ異なる５種のデバイスを用いて、以下の手順で、多孔膜４の孔径がマイクロ空間部３１１内の物質分布の形成に与える影響を評価した。
シリンジポンプを用いて、水および蛍光物質であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の２５μＭ水溶液をそれぞれ貫通孔３２、３４から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した。このとき、分岐流路部２１２ａ、分岐流路部２１２ｃ、多層流流通部２１１内における液体の流速はそれぞれ 約２００００μｍ／ｍｉｎ、約２００００μｍ／ｍｉｎ、約２００００μｍ／ｍｉｎであり、レイノルズ数はそれぞれ約０．０９５、約０．０９５、約０．１１であった。
水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液の送液を開始した時点から１８０ｓ後に、上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内の蛍光観察と蛍光強度の測定を行い、各流路内のＦＩＴＣ分布を確認した。
多孔膜４として前記多孔膜Ｂ（孔径１μｍ）、多孔膜Ｃ（孔径３μｍ）、多孔膜Ｄ（孔径５μｍ）、多孔膜Ｅ（孔径１０μｍ）をそれぞれ用いた場合の１８０ｓ経過時点の上層流路３１内の蛍光像をそれぞれ図５に示す。
これらの結果に示すとおり、多孔膜Ｂ〜Ｅを用いた例では、上層流路３１のマイクロ空間部３１１にＦＩＴＣ分布が形成された。一方、孔径０．４μｍの多孔膜Ａを用いた例では、ＦＩＴＣはマイクロ空間部３１１内に拡散しなかった。
【００４４】
（２）
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて以下の評価を行った。
まず、ＦＩＴＣの２５μＭ水溶液を貫通孔３４から導入し、デバイス内（上層流路３１および下層流路２１内）を満たした。
次に、シリンジポンプを用いて、水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液をそれぞれ貫通孔３２、３４から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した。
水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液の送液を開始した時点から一定時間毎（０ｓ、３０ｓ、６０ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓ、１８０ｓおよび３０ｍｉｎ経過時点）に、下層流路２１（多層流流通部２１１）内および上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内の蛍光観察と蛍光強度の測定を行い、各流路内のＦＩＴＣ分布を確認した。
０ｓ、３０ｓ、６０ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓおよび１８０ｓ経過時点の上層流路３１内の蛍光像をそれぞれ図６に示す。
また、下層流路２１内、上層流路３１内それぞれの蛍光強度の測定結果から、縦軸に３０ｍｉｎ経過時点の蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該グラフをそれぞれ蛍光像とともに図７、８に示す。図７が下層流路２１内の蛍光像およびグラフであり、図８が上層流路３１内の蛍光像およびグラフである。
なお、「流路の幅方向の位置」は、流路の縦断面を下流側から見て、該流路の左端の位置を０とした場合の幅方向の距離（μｍ）を示す。
これらの結果に示すとおり、上層流路３１をＦＩＴＣ水溶液で満たした後に、下層流路２１に水とＦＩＴＣ水溶液との２層流を流通させると、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内のＦＩＴＣ分布は、一様な状態から、下層流路２１内のＦＩＴＣ分布に対応したものに変化した。また、該ＦＩＴＣ分布はそのまま維持されていた。
【００４５】
＜試験例２＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用い、水を貫通孔３３から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液し、ＦＩＴＣの２５μＭ水溶液を貫通孔３２、３４からそれぞれ流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した以外は、試験例１の（２）と同様の操作を行った。結果を図９に示す。図９（ａ）が多層流流通部２１１内の蛍光像およびグラフであり、図９（ｂ）がマイクロ空間部３１１内の蛍光像およびグラフである。
該結果に示すとおり、下層流路２１の多層流流通部２１１内には３層の多層流が形成され、その上層のマイクロ空間部３１１内には、多層流流通部２１１内のＦＩＴＣ分布に対応したＦＩＴＣ分布が形成された。
【００４６】
＜試験例３＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順で、下層流路２１（多層流流通部２１１）を流通する流れが上層流路３１（マイクロ空間部３１１）に与える影響を評価した。
該デバイスの上層流路３１内に、蛍光ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ製「Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ＹＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」）を配合した水を満たした。
次に、シリンジポンプを用いて、蛍光ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ製「Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ＹＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」）を配合した水を、貫通孔３３から流量を変えて（０．２、０．４、１．０、２．０または４．０μＬ／ｍｉｎ）にて送液し、下層流路２１を流通させた。
送液を開始した時点から一定時間毎に、下層流路２１の多層流流通部２１１内および上層流路３１のマイクロ空間部３１１内の蛍光ビーズの画像をカメラ付き位相差顕微鏡により撮影し、その画像から、下層流路２１内および上層流路３１内の蛍光ビーズ（以下、まとめて流路内ビーズという。）の平均流速（μｍ／ｍｉｎ）を求めた。その結果を図１０のグラフに示す。該グラフの横軸は、下層流路２１に送液した流量（μＬ／ｍｉｎ）であり、縦軸は流路内ビーズの平均流速（μｍ／ｍｉｎ）である。
該結果に示すとおり、上層流路３１の流路内ビーズの平均流速は、下層流路２１の流路内ビーズの平均流速に比べて大幅に小さく、特に下層流路２１の流速が０．５μＬ／ｍｉｎ以下の場合は０であった。該結果から、上層流路３１においては、多孔膜により、下層流路２１の流れの影響が大幅に軽減されることが確認できた。
【００４７】
＜試験例４＞
製造例２で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順でＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝ガン由来細胞株；独立行政法人理化学研究所 ｃｅｌｌ ｂａｎｋより入手。）の培養を行った。
試験例４で用いたのと同じデバイスにＵＶを３０分間照射して滅菌した後、上層流路３１にフィブロネクチン溶液（２５μｇ／ｍＬ）を満たし、１時間静置した。
次に、デバイス内をＰＢＳおよび培養液で洗浄した。培養液としてはＦＢＳ含有Ｋｎｏｃｋ ｏｕｔＤＭＥＭを用いた。
次に、細胞を接着させるために、上層流路３１内を細胞懸濁液（１．０×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）で満たし、一晩インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、前記培養液に蛍光物質であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を添加してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液を調製した。該ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液を貫通孔３４から、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを添加していない培養液（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（−）培養液）を貫通孔３２から、シリンジポンプを用い、流量２μＬ／ｍｉｎでの送液（灌流）を開始し、培養（培養温度：３７℃）を行った。
【００４８】
培養開始から１２時間後、上層流路（マイクロ空間部）内にて細胞に取り込まれたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光観察および蛍光強度の測定を行った。測定結果から、縦軸にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該グラフを蛍光像とともに図１１に示す。図１１（ａ）が、培養前であり、図１１（ｂ）が培養１２時間後である。
該結果に示すとおり、下層の多層流流通部２１１内において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は、灌流前に比べて蛍光強度が増大していた。該結果から、該領域の細胞は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに曝露され、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを取り込んだことが確認できた。一方、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（−）培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は、蛍光強度がほとんど変化しておらず、ほとんどＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに曝露されなかったことが確認できた。
このように、本発明によれば、マイクロ空間内の物質分布を空間的に制御し、同じマイクロ空間内に存在する細胞に対し、局所的な物質曝露を行うことができる。
【００４９】
＜試験例５＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順でマウスｉＰＳ細胞（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７細胞株；国立大学法人京都大学より入手。）の培養を行った。ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７細胞株は、未分化マーカーであるＮａｎｏｇ遺伝子のレポーター遺伝子として緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）が発現しており、蛍光発色している細胞は未分化状態であると判断できる。
試験例４と同様にしてデバイスを滅菌した後、上層流路３１にフィブロネクチン溶液（濃度２５μｇ／ｍＬ）を満たし、１時間インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、デバイス内を培養液で満たした。培養液としてはＦＢＳ含有Ｋｎｏｃｋ ｏｕｔＤＭＥＭを用いた。
次に、細胞を接着させるために、上層流路３１内に細胞懸濁液（１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を導入し、一晩インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、前記培養液に、マウスｉＰＳ細胞の未分化維持因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）を配合したＬＩＦ含有培養液（未分化維持培養液）と、前記培養液に、マウスｉＰＳ細胞の分化誘導因子であるレチノイン酸（ＲＡ）を配合したＲＡ含有培養液（分化誘導培養液）とを調製した。該ＬＩＦ含有培養液を貫通孔３４から、ＲＡ含有培養液を貫通孔３２から、シリンジポンプを用い、流量２μＬ／ｍｉｎでの送液（灌流）を開始し、培養（培養温度：３７℃）を行った。
【００５０】
培養前および培養開始から５日後、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内について、ＧＦＰ発現による蛍光（ＧＦＰ蛍光）の観察および蛍光強度の測定を行い、縦軸にＧＦＰの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。培養前および培養５日後のＧＦＰ蛍光像およびグラフをそれぞれ図１２に示す。図１２（ａ）が培養前であり、図１２（ｂ）が培養５日後である。
また、培養５日後、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内の細胞に対して４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）染色を行い、蛍光の観察および蛍光強度の測定を行い、縦軸にＤＡＰＩの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該蛍光像およびグラフを図１３に示す。このＤＡＰＩ染色では生存している細胞の核が染色されるため、ＤＡＰＩの蛍光を測定することにより、上層流路３１内の生細胞を確認できる。該結果から、培養５日後、上層流路３１内の生細胞密度はほぼ一定であることが確認できた。
これらの結果から、ＲＡ含有培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は分化が誘導され、一方、ＬＩＦ含有培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は未分化の状態が維持されていることが確認できた。
このように、本発明によれば、マイクロ空間内の物質分布を空間的に制御し、同じマイクロ空間内に存在する多能性幹細胞に対して局所的な未分化維持および分化誘導を行うことが可能である。
なお、下層流路２１内に細胞懸濁液（１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を導入した以外は上記と同様の操作を行ったところ、培養５日後、下層流路２１内の細胞の大半が死滅していた（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（死細胞染色）により確認）。これは、流れのせん断応力の影響によるものと考えられる。
【００５１】
＜試験例６＞
ＬＩＦ含有培養液を貫通孔３３から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液し、ＲＡ含有培養液を貫通孔３２、３４からそれぞれ流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した以外は、試験例５と同様の操作を行った。
結果を図１４〜１５に示す。図１４は、培養５日後の上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）であり、図１５は、培養５日後の上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
これらの結果から、ＲＡ含有培養液の層流（３層のうち両端の層流）が流通した部分に対応する領域の細胞は分化が誘導され、一方、ＬＩＦ含有培養液の層流（３層のうち中央の層流）が流通した部分に対応する領域の細胞は未分化の状態が維持されていることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
近年、再生医療や生命科学への応用として、多能性幹細胞をはじめとする細胞組織の培養研究が盛んに行われているものの、実用可能な分化誘導法は確立されていない。特に従来の実験手法で扱える静的で一様な培養環境では、分化誘導を時空間的に精密に制御することができない。本発明は、このような問題に対し、細胞組織の微小環境を精密に制御する技術を与えるものであり、再生医療分野や動物細胞を用いる薬物動態・毒性試験分野において有用である。
【符号の説明】
【００５３】
１…デバイス、２…第一の基板、３…第二の基板、４…多孔膜、２１…下層流路、３１…上層流路、３２〜３７…貫通孔、２１１…多層流流通部、２１２ａ〜２１２ｃ…分岐流路部、２１２ｄ…連絡流路部、２１３…多層流排出部、３１１…マイクロ空間部、３１２〜３１３…導出入路部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞（embryonic stem cell）および人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）の研究が広く行われており、その研究成果は再生医療、細胞・組織工学、薬剤スクリーニングなどへの応用が期待されている。しかし現在、多能性幹細胞の分化効率は未だ数パーセントと低い状態であり、その改善が求められている。
最近の研究によって、細胞をとりまく微小環境（たとえば分化に影響する物質（例：分化制御因子等の液性因子）の濃度、細胞間相互作用、細胞外マトリックスとの間の相互作用、細胞への物理的刺激など）が細胞の分化の方向性に影響を与えることがわかってきている。そのため、分化効率の向上には、細胞をとりまく微小環境を精密に設計・制御することが重要と考えられる。
【０００３】
従来、細胞の培養法としては、培養皿、培養プレート等の培養容器を用い、培養液中、静置・閉鎖環境下で培養する静置培養法が一般的である。しかし、静置培養では、栄養成分やその他任意の液性因子等の物質の供給を単調にしか行うことができず、培養環境内における物質分布を精密に制御することはできない。
他の細胞培養法として、培養容器内に、栄養成分や酸素を含んだ培養液を灌流させて培養する灌流培養法がある。灌流培養では、培養液の組成を調整することにより、培養容器内の物質分布の経時的制御が可能である。しかし、灌流下で培養を行うと、せん断応力による悪影響がある。たとえば流れによって生じるせん断応力が、細胞容器に付着している細胞を剥離させ、細胞が失われることがある。
このような問題に対し、内部にコンパートメントを備えた細胞培養チャンバーにおいて、コンパートメント内部を半透膜で上層と下層に区画し、下層に培養液を流通させつつ上層で細胞を培養する方法が提案されている（特許文献１、非特許文献１）。
しかし、上記の方法では、培養環境内に物質濃度勾配を形成するなど、物質分布を空間的に制御することはできない。
【０００４】
一方、マイクロ空間での流体の挙動は、マクロ空間での流体の挙動と大きく異なることが知られている。たとえば流路構造のマイクロ空間（マイクロ流路）に液体を流通させると、レイノルズ数が小さく、層流を形成しやすい。
最近、このマイクロ空間特有の現象を利用して物質濃度勾配を形成し、細胞培養に応用した研究が行われるようになっている。たとえば非特許文献２〜７では、層流を利用して、マイクロ空間内に物質濃度勾配を形成している。また、非特許文献８〜９では、物質の拡散を利用して、マイクロ空間内に物質濃度勾配を形成している。
しかし、層流場で培養を行うと、上記灌流培養と同様、せん断応力による悪影響がある。特に、層流を利用して物質濃度勾配を形成する方法では、濃度勾配を維持するにはある程度流速を速くする必要があるため、せん断応力の影響が大きい。また、多能性幹細胞の場合、該せん断応力により細胞が変質したり、分化の方向性が変わってしまうとの報告もある（たとえば非特許文献１０）。
また、培養細胞が三次元構造体（たとえば胚様体や受精卵）を形成する場合には、該三次元構造体によって層流が乱れてしまうため、マイクロ空間における物質分布の精密な制御が困難となる。
また、物質の拡散を利用する方法では、拡散により物質分布（濃度）が経時的に一様となるため、マイクロ空間内に所定の物質分布を長期に渡って維持することはできない。そのため細胞の分化を精密に制御することもできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２４６７２０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lab Chip, 2007, Vol.7, p.770-776
【非特許文献２】Nature, Vol. 411, 28 JUNE 2001, p.1016
【非特許文献３】Lab Chip, 2009, Vol.9, p.2591-2595
【非特許文献４】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.191-198
【非特許文献５】Lab Chip, 2004, Vol.4, p.164-167
【非特許文献６】Analytical Chemistry, Vol.78, No.10, p3354-3359
【非特許文献７】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.1462-1469
【非特許文献８】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.389-393
【非特許文献９】Lab Chip, 2006, Vol.6, p.849-856
【非特許文献１０】Measurement Science and Technology, Vol.17, 2006, p.3167-3170
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、せん断応力による負荷を低減しながら、マイクロ空間内における物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる物質分布制御方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、マイクロ空間下に所定の孔径の多孔膜を介してマイクロ流路を配置し、下層のマイクロ流路内に、所定の物質分布を有するように形成された多層流を流通させると、上層のマイクロ空間に、多層流によるせん断応力による負荷を低減しながら、下層のマイクロ空間内と同様の物質分布を形成でき、しかもその物質分布を長期にわたって維持できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の態様を有する。
［１］液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
［２］前記マイクロ流路内においてレイノルズ数が２０００未満となるように前記多層流を流通させる、［１］に記載の物質分布制御方法。
［３］［１］または［２］に記載の物質分布制御方法に用いられるデバイスであって、
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
［４］液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞を培養する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞培養方法。
［５］予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、［４］に記載の細胞培養方法。
［６］前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、［４］に記載の細胞培養方法。
［７］前記細胞が多能性幹細胞である、［４］〜［６］のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
［８］前記細胞が三次元構造体を形成している、［６］に記載の細胞培養方法。
［９］液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞の分化を制御する方法であって、
前記細胞の分化を制御する物質の種類または濃度が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞分化制御方法。
［１０］予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、［９］に記載の細胞分化制御方法。
［１１］前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、［９］に記載の細胞分化制御方法。
［１２］前記細胞が多能性幹細胞である、［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の細胞分化制御方法。
［１３］前記細胞が三次元構造体を形成している、［１１］に記載の細胞分化制御方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、せん断応力による負荷を低減しながら、マイクロ空間内における物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる物質分布制御方法、該方法に用いられるデバイス、該方法を利用した細胞培養方法および細胞分化制御方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】デバイス１の斜視図である。
【図２】デバイス１の分解斜視図である。
【図３】デバイス１の上面図である。
【図４】デバイス１を用いた物質濃度制御方法の一実施形態を説明するための説明図である。
【図５】試験例１（１）の結果（多孔膜Ｂ（孔径１μｍ）、多孔膜Ｃ（孔径３μｍ）、多孔膜Ｄ（孔径５μｍ）、多孔膜Ｅ（孔径１０μｍ）をそれぞれ用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布）を示す蛍光像である。
【図６】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布の経時変化を示す蛍光像である。
【図７】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の下層流路（多層流流通部）内のＦＩＴＣ分布を示す蛍光像およびグラフである。
【図８】試験例１（２）の結果のうち、多孔膜Ｅを用いた場合の上層流路（マイクロ空間部）内のＦＩＴＣ分布を示す蛍光像およびグラフである。
【図９】試験例２の結果（下層流路（多層流流通部）内、上層流路（マイクロ空間部）内それぞれのＦＩＴＣ分布）を示す蛍光像およびグラフである（（ａ）多層流流通部内、（ｂ）マイクロ空間部内）。
【図１０】試験例３の結果（下層流路（多層流流通部）への送液量と、下層流路（多層流流通部）内、上層流路（マイクロ空間部）内それぞれの流路内ビーズの流速との関係）を示すグラフである。
【図１１】試験例４の結果（上層流路（マイクロ空間部）内にて細胞に取り込まれたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光観察結果）を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）培養前、（ｂ）培養１２時間後）である。
【図１２】試験例５の結果のうち、培養前および培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）培養前、（ｂ）培養５日後）である。
【図１３】試験例５の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフである。
【図１４】試験例６の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
【図１５】試験例６の結果のうち、培養５日後の上層流路（マイクロ空間部）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の物質分布制御方法は、液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする。
上記多層流は、それぞれ組成（物質濃度）が異なるｎ種の層流がマイクロ流路の幅方向に順次積層したものであり、マイクロ流路の幅方向において物質濃度が変化している。このような物質分布を有する多層流をマイクロ流路に流通させると、ｎ種の層流にそれぞれ含まれる物質が拡散により多孔膜を通過して上層のマイクロ空間内に移動する。その結果、各層流の上方のマイクロ空間内に、各層流と同じ物質濃度の領域が、各層流と略同じ幅で形成される。このようにして、上層のマイクロ空間内に多層流と同様の物質分布が形成される。
従来、流体中から膜を透過して流れのない液体中に移行した物質の濃度分布は、拡散により経時的に一様になるものと考えられていた。しかし本発明者らの知見によれば、孔径１μｍ以上の多孔膜を用いることで、意外にも、上層のマイクロ空間内に、下層のマイクロ流路を流通する多層流と同様の物質分布が形成されるとともに、該多層流を流通させている間は該物質分布が維持される。
そのため、本発明においては、ｎ種の液体の組成や流量を調整するだけで、マイクロ空間内の物質分布を時間的にも空間的にも精密に（マイクロスケールレベルで）制御でき、また、２４時間以上にわたるような長期的な制御も可能である。このことは、比較的時間を必要とする細胞の培養や分化の制御を行う上で有用である。たとえばマイクロ空間内で多能性細胞等の細胞を培養するとともに、該マイクロ空間内にて、培養細胞の分化を制御する物質の種類（分化誘導因子、分化抑制因子等）または濃度の分布を空間的および／または時間的に制御することにより、該細胞の分化を精密に制御することが可能である。
また、多層流の流通時、その流れによって生じるせん断応力は多孔膜によって軽減される。たとえばマイクロ空間を、該マイクロ空間内に存在する微粒子のブラウン運動を観察可能な高レベルの静的環境とすることも可能である。そのため、該マイクロ空間内では、接着力の弱い細胞であっても培養することが可能である。また、該せん断応力によって生じる、培養細胞の活性や分化への影響も抑制できる。
さらに、マイクロ空間にて培養する細胞が三次元構造体を形成する場合であっても、下層のマイクロ流路内の流れが乱れることはないので、マイクロ空間内における物質分布制御の精密性が維持される。
【００１２】
前記多層流の形成方法は特に限定されず、公知の方法を利用できる。たとえば、マイクロ流路の上流に、下流側末端で合流するｎ本のマイクロ流路（以下、層流形成用流路という。）を設け、各層流形成用流路にそれぞれ液体を導入することにより形成できる。すなわち、各層流形成用流路では、それぞれ、導入された液体が層流を形成し、下流側末端で合流する。その結果、ｎ個の層流が幅方向に並んだ多層流が形成される。該多層流は、そのまま下流のマイクロ流路に供給され、マイクロ流路内を流通する。
ｎは、２以上の整数であればよく、上限は特に限定されない。好ましくは、多層流を構成する各層流の幅が１０μｍより小さくならない範囲で設定する。各層流の幅は、１０〜１０００μｍが好ましく、５０〜５００μｍがより好ましい。
【００１３】
本発明の物質分布制御方法は、たとえば下記のデバイスを用いて実施できる。
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造（以下、下層流路ということがある。）は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造（以下、上層流路ということがある。）は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
該デバイスにおいては、下層流路の多層流形成部にｎ種の液体をそれぞれ導入することで多層流が形成され、該多層流は、多層流流通部を通過し、多層流排出部からデバイス外部に排出されるようになっている。
該デバイス内には、上層流路のマイクロ空間部と多孔膜とによりマイクロ空間が形成されており、該マイクロ空間の下に、多孔膜を介して多層流流通部が配置されている。マイクロ空間部と多層流流通部とは、略同一のパターンで形成されている。
そのため、前記マイクロ空間に液体を満たした状態で、下層流路の多層流形成部にｎ種の液体を導入すると多層流が形成され、該多層流がマイクロ空間下の多層流流通部を流通することとなる。多層流流通部とマイクロ空間との界面には所定の孔径の多孔膜が配置されているため、該多孔膜を介して、多層流を構成するｎ種の層流中の物質がそれぞれ上方に移動し、結果、マイクロ空間内に、その下を流れる多層流と同様の物質分布が形成される。
該デバイスにおいては、多層流流通部、マイクロ空間部が、それぞれ、本発明の物質分布制御方法におけるマイクロ流路、マイクロ空間に相当する。
【００１４】
以下、図面に基づいて、上記デバイスの一実施形態を説明する。
図１〜３に本実施形態のデバイス１を示す。図１はデバイス１の斜視図であり、図２はデバイス１の分解斜視図であり、図３はデバイス１の上面図である。
デバイス１は、表面に下層流路２１が形成された第一の基板２と、表面に上層流路３１が形成された第二の基板３とが、下層流路２１および上層流路３１が形成された面を内側にして積層された積層体を備え、第一の基板２と第二の基板３との間の所定の位置に、孔径１μｍ以上の多孔膜４が挟持されている。
該積層体において、下層流路２１上の、上層流路３１と重複部分はすべて多孔膜４で被覆されている。これにより、下層流路２１を流通する液体が、上層流路３１に直接流入しないようになっている。
【００１５】
第一の基板２において、下層流路２１は、多層流流通部２１１（図２、３中、位置Ａ−Ａ’と位置Ｂ−Ｂ’との間の部分）と、多層流流通部２１１の上流側に配置された、下流側末端で合流する３つの分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃを有する多層流形成部と、多層流流通部２１１の下流側に配置された多層流排出部２１３とから構成される。
多層流形成部は、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃと、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの合流点と多層流流通部２１１の上流側末端とを連絡する連絡流路部２１２ｄとから構成される。多層流形成部においては、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃのうち、２つまたは３つの上流側末端にそれぞれ組成の異なる液体を導入すると、各液体が層流を形成し、合流して２層または３層の多層流が形成されるようになっている。
多層流流通部２１１と、分岐流路部２１２ｂと、連絡流路部２１２ｄと、多層流排出部２１３とは、略同一直線上に配置されている。
【００１６】
第二の基板３において、上層流路３１は、多層流流通部２１１と略同一パターンのマイクロ空間部３１１（図２、３中、位置Ａ−Ａ’と位置Ｂ−Ｂ’との間の部分）と、マイクロ空間部３１１への液体の導入または導出のための２つの導出入路部３１２，３１３とから構成される。
導出入路部３１２，３１３は、それぞれ、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端（多層流流通部２１１における多層流の流通方向の上流側末端および下流側末端）から、マイクロ空間部３１１の長手方向に対して一定の角度で屈曲させて形成されている。
マイクロ空間部３１１は、多層流流通部２１１と略同一パターンに形成されている。すなわち、多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）および幅と略同一の長さおよび幅で形成されている。
【００１７】
第二の基板３には、第二の基板３を貫通する６つの貫通孔３２〜３７が形成されている。これらのうち、貫通孔３２〜３４は、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの上流側末端に対応する位置に設けられ、貫通孔３５は、多層流排出部２１３の下流側末端に対応する位置に設けられている。これにより、貫通孔３２〜３７を介して、各流路２１２ａ〜２１２ｃへの液体の導入および多層流排出部２１３からの液体（多層流）の排出を行うことができるようになっている。
貫通孔３６，３７はそれぞれ導出入路部３１２，３１３の末端に対応する位置に設けられている。これにより、貫通孔３６，３７を介して、マイクロ空間部３１１への液体の導入または排出を行うことができるようになっている。マイクロ空間部３１１にて細胞の培養または分化の制御を行う場合、該貫通孔３６，３７は、マイクロ空間部３１１への細胞の導入、または細胞の取出しにも利用できる。
【００１８】
以下、上述したデバイス１の構成要素それぞれについてより詳細に説明する。
多層流流通部２１１は、好ましくは、多層流流通部２１１内を流通する液体（多層流）のレイノルズ数が２０００未満となるように、液体の物性（密度および粘性率）や流速を考慮しての幅および高さが設定される。該レイノルズ数が２０００未満であれば、多層流の層流状態が安定で、隣接する層流間での物質移動がほとんど生じない状態でマイクロ流路を流通する。該レイノルズ数は、２０００以下が好ましく、１００以下がより好ましく、１以下がさらに好ましい。該レイノルズ数の下限は特に限定されない。
レイノルズ数は、従来、流体の挙動を説明する上で重要な指標の一つとして知られており、下記式により定義される。
Ｒｅ＝ρ×ｒ×ｌ／μ
［式中、Ｒｅはレイノルズ数であり、ρは液体の密度であり、ｒは流速であり、ｌは代表長さであり、μは液体の粘性率である。］
【００１９】
液体の密度ρ、粘性率μは、それぞれ流通時の温度条件下における密度、粘性率である。
多層流流通部２１１を流通する液体のレイノルズ数については以下の手順で求められる。まず、各層流を構成するｎ種の液体の密度をそれぞれρ１、ρ２…ρｎ、粘性率をそれぞれρ１、ρ２…ρｎ，μ１，μ２，…μｎとし、各液体の密度および粘性率と、多層流流通部２１１における各液体の流量比から、多層流を構成する全液体の混合液の密度ρ’および粘性率μ’をそれぞれ算出する。該密度ρ’および粘性率μ’と、多層流流通部２１１における多層流の流速および代表長さから、多層流流通部２１１を流通する液体のレイノルズ数が求められる。
流速ｒ（単位：μｍ／ｍｉｎ）は、平均的な流速は平均的な流速＝流量/流路の断面積により求められる。
代表長さｌは、その長さを変えたときに流れが最も影響を受けやすい場所の断面積および周囲長さにより決定される。たとえばマイクロ流路の断面形状が高さｈ１と幅（深さ）ｗの矩形である場合、その代表長さｌは下記式により求められる。
ｌ＝４×ｈ１×ｗ／２（ｈ１＋ｗ）
【００２０】
レイノルズ数は、流路を流通する液体の物性（密度および粘性率）、流速、流路のサイズ（幅および高さ）により変動する。
そのため、多層流流通部２１１の幅および高さは、流通させる液体の物性や流速によっても異なり、特に限定されないが、幅広い範囲の密度または粘性率の液体に適用できることから、幅１〜１０００００μｍの範囲内、高さ１〜１００００μｍの範囲内で設定することが好ましい。多層流流通部２１１の幅は、１〜１０００μｍがより好ましく、２０〜１０００μｍがさらに好ましい。また、高さは、１〜１０００μｍがより好ましく、１〜５００μｍがさらに好ましい。幅および高さが上記範囲の上限値以下であるとレイノルズ数が小さく、層流の安定性が良好となる。下限値以上であると、当該流路構造を形成しやすい、細胞実験等への応用に適している、せん断応力を軽減できる等の利点がある。
【００２１】
多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）は、特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。たとえば該長さを短くすると、隣接する層流との界面が明確な状態（層流間の物質濃度のコントラストが明確な状態）で多層流が多層流流通部２１１の上流側末端から下流側末端まで流通するため、その上層のマイクロ空間内の長手方向全体にわたって、コントラストが明確な物質分布を形成できる。また、該長さを長くすると、多層流が多層流流通部２１１内で流通する間に、隣接する層流との間で物質移動が生じてくる。これに伴って、その上層のマイクロ空間内に形成される物質分布が、長手方向下流側に近づくほど濃度勾配の緩やかなものとなる。
【００２２】
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃは、好ましくは、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ内を流通する液体のレイノルズ数が２０００未満となるように、各分岐流路部を流通する液体の物性（密度および粘性率）や流速を考慮しての幅および高さが設定される。該レイノルズ数が２０００未満であれば、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃに導入した液体が層流を形成するとともに、各層流が合流した際、各層流間での物質の移動がほとんど生じることなく安定した多層流が形成される。該レイノルズ数は、２０００以下が好ましく、１００以下がより好ましく、１以下がさらに好ましい。該レイノルズ数の下限は特に限定されない。
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃの幅および高さは、幅広い範囲の密度または粘性率の液体に適用できることから、幅０．１〜１０００００μｍの範囲内、高さ０．１〜１０００μｍの範囲内で設定することが好ましい。流路２１２ａ〜２１２ｃの幅は、１〜１０００μｍがより好ましく、２０〜１０００μｍがさらに好ましい。また、流路２１２ａ〜２１２ｃの高さは、１〜１０００μｍがより好ましく、１〜１００μｍがさらに好ましい。幅および高さが上記範囲の上限値以下であるとレイノルズ数が小さくなり、層流が形成されやすい。下限値以上であると、当該流路構造を形成しやすい、少量の流量で層流が形成可能である、使用する試薬などの使用量が減少する等の利点がある。
【００２３】
分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃのうち、両端の分岐流路部２１２ａ、２１２ｃの連絡流路部２１２ｄへの合流角度（図３中のθ１、θ２）は、１〜１７９度が好ましく、９０〜１７９度がより好ましい。合流角度が上記範囲内であると、多層流を良好に形成できる。該合流角度の好ましい範囲は、分岐流路部が２つ、または４つ以上の場合においても同様である。
また、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃがそれぞれ隣接する流路との間でなす角度（流路２１２ａと流路２１２ｂとがなす角度と、流路２１２ａと流路２１２ｂとがなす角度）は、同等であることが好ましい。
【００２４】
連絡流路部２１２ｄは、幅方向の断面形状が多層流流通部２１１と同じに形成されている。これにより、連絡流路部２１２ｄ内を通過した多層流がスムーズに多層流流通部２１１に供給されるようになっている。
また、多層流排出部２１３は、幅方向の断面形状が多層流流通部２１１と同じに形成されている。これにより、多層流流通部２１１内を流通する多層流がスムーズに排出されるようになっている。
【００２５】
第一の基板２を構成する材料は特に限定されず、たとえば従来、マイクロ流路構造の形成に用いられている公知の材料のなかから目的に応じてから適宜選択できる。
たとえばマイクロ空間内の観察を行う場合、可視光を透過する透明材料が好ましい。透明材料として、たとえばポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳという）等のシリコーンゴム、アクリル樹脂、ガラス、ゲル等が挙げられる。また、透明材料以外では金属、Ｓｉ等が挙げられる。
また、マイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合は、培養細胞に対して適合性を有する材料を用いることが好ましい。該材料としては、特に、デバイス外の大気中の酸素をマイクロ空間内に供給できる点から、酸素透過性を有する材料が好ましい。該材料としては、既知の任意の酸素透過性材料が使用可能であり、たとえば、酸素透過性コンタクトレンズなどに用いられている生体適合性の酸素透過性材料などを挙げることができる。特に、デバイス外部からマイクロ空間の培養細胞を観察できることから、酸素透過性を有する材料が、透明材料であることが好ましい。
生体適合性の酸素透過性材料として具体的には、シリコーンゴムが挙げられる。特に、生体適合性を有するとともに、透明性および酸素透過性を有し、さらに安価な材料であることから、ＰＤＭＳが好ましい。
【００２６】
マイクロ空間部３１１は、上述したように、多層流流通部２１１と略同一パターンに形成されている。すなわち、多層流流通部２１１の長さ（多層流の流通方向の長さ）および幅と略同一の長さおよび幅で形成されている。
マイクロ空間部３１１の高さ（多孔膜４表面に対して垂直方向における幅）は、マイクロ空間部３１１および多孔膜４により形成されるマイクロ空間内に物質分布が良好に形成できる点から、１００００μｍ以下が好ましく、１０００μｍ以下がより好ましい。
該高さの下限は、物質分布の制御の観点からは特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。たとえばマイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合には、培養細胞のサイズよりも高く設定する。
細胞のサイズは種類や接着状態によって異なる。たとえば哺乳動物の胚性幹細胞の大きさは、通常、接着時においては長径で約１０〜２０μｍ、短径で約５〜１０μｍであり、トリプシン等により剥離して浮遊させた状態では約５〜１０μｍの球体である。受精卵の大きさは、通常、ヒトは約１３０μｍ、マウスは約８０μｍ、ウシやブタは約１２０〜１３０μｍである。胚様体は、人工的に作る細胞塊であり、そのサイズは様々な手法によって変えられるものであり、特に限定されないが、通常、５０μｍ〜１ｍｍ程度である。
【００２７】
導出入路部３１２，３１３は、マイクロ空間部３１１と同じ高さに形成されている。
導出入路部３１２，３１３は、それぞれ、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端（多層流流通部２１１における多層流の流通方向の上流側末端および下流側末端）から、マイクロ空間部３１１の長手方向に対して一定の角度で屈曲させて形成されている。
導出入路部３１２がマイクロ空間部３１１の長手方向となす角度（図３中のθ３）、導出入路部３１３がマイクロ空間部３１１の長手方向となす角度（図３中のθ４）は、それぞれ、０〜１７９度が好ましく、０〜９０度がより好ましい。これらの角度が上記範囲内であると、マイクロ空間部３１１にて細胞の培養や分化の制御を行う場合に、該マイクロ空間部３１１に細胞を一様に播種しやすい。
【００２８】
第二の基板３を構成する材料は特に限定されず、たとえば前記第一の基板２を構成する材料として挙げたものと同様のものが挙げられ、特に透明材料が好ましい。ただしマイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合でも、第二の基板３には、上述した生体適合性や酸素透過性は必ずしも必要ではない。
【００２９】
多孔膜４は、物質分布をマイクロ空間部３１１内に形成するためには、孔径が１μｍ以上である必要がある。ここで、「多孔膜」とは、当該膜を貫通する細孔を多数有する固体の膜である。多孔膜の孔径（細孔の孔径）は 電子顕微鏡（ＳＥＭ）、レーザー顕微鏡等により測定できる。
多孔膜４の孔径は、１μｍ以上が好ましく、５μｍ以上がより好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましい。孔径が大きいほど、マイクロ空間に、マイクロ流路を流通する多層流の物質分布が反映されやすく、コントラストの明確な物質分布が形成されやすい。孔径の上限は、多層流により生じるせん断応力によるマイクロ空間への負荷を低減する観点から、５０μｍ以下が好ましく、２０μｍ以下がより好ましい。
マイクロ空間内にて細胞の培養または分化制御を行う場合は、さらに、培養細胞のサイズを考慮することが好ましい。すなわち、多孔膜４が有する細孔が大きすぎると、培養細胞がマイクロ流路に浸潤、流出するおそれがある。そのため、この場合は、多孔膜４として、培養細胞のサイズよりも孔径が小さいものを用いることが好ましい。該多孔膜４の孔径は、培養細胞のサイズの１００％以下が好ましく、５０％以下がより好ましい。ここで、培養細胞のサイズは単一細胞の直径を意味し、顕微鏡観察により測定できる。
たとえば胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞という。）等の多能性幹細胞のサイズは、一般的に、１０〜２０μｍ程度である。そのため、培養細胞が胚性幹細胞である場 合、多孔膜４の孔径は、１５μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましい。
また、胚様体、受精卵等の三次元構造体のサイズは、一般的に、５０μｍ〜１ｍｍ程度である。そのため、培養細胞が三次元構造体を形成する場合、多孔膜４の孔径は、５０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましい。
【００３０】
多孔膜４の空隙率は、１〜１５％が好ましく、５〜１０％がより好ましい。該範囲の下限値以上であるとマイクロ空間に物質分布が形成されやすく、上限値以下であると上層流路３１内への下層流路２１の流速の影響を充分に軽減できる。
多孔膜４の材質としては特に限定されず、従来、多孔膜の材料として用いられているものと同様であってよい。具体的には、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（以下、ＰＴＦＥという）等が挙げられる。
また、多孔膜４の表面に、細胞接着性を高める等の目的で、表面処理が施されていても良い。
多孔膜４の厚さは、物質の透過性の観点から、１００μｍ以下が好ましく、２０μｍ以下がより好ましい。
多孔膜４は、Ｗｈａｔｍａｎ社等から販売されている市販品を利用できる。
【００３１】
デバイス１は、第一の基板２と第二の基板３とを、下層流路２１、３１が形成された面を内側にして、多層流流通部２１１およびマイクロ空間部３１１の位置が一致するように配置し、多孔膜４を挟んで貼り合わせることにより作製できる。
第一の基板２、第二の基板３は、それぞれ、従来、マイクロリアクター等の流路構造を有するマイクロデバイスの製造に用いられている方法など、公知の微細加工法を利用して製造できる。該微細加工法としては、たとえばリソグラフィー法、エッチング法、切削、射出成型等が挙げられる。
リソグラフィー法を用いた製造方法の一例を挙げると、以下の工程（１）〜（５）を行うことにより第一の基板２を作製できる。
（１）まず、基板上に、スピンコーティングによりフォトレジストを塗布してフォトレジスト層を形成する。
（２）フォトレジスト層に対し、下層流路２１に対応したパターンのマスクを介して露光し、現像することにより、フォトレジスト層をパターニングする。
（３）パターニングされたフォトレジスト層（鋳型）上に、ＵＶ硬化型または熱硬化型ポリマーのプレポリマーを塗布してプレポリマー層を形成する。
（４）プレポリマー層にＵＶを照射または加熱して硬化させてポリマー層とする。
（５）ポリマー層を剥離する。
このようにして得られるポリマー層の表面には、フォトレジスト層のパターンが反転したパターン（たとえばフォトレジスト層のパターンがラインパターンの場合はスペースパターン）で、フォトレジスト層の厚さと同じ高さ（深さ）の下層流路２１が形成されている。このポリマー層を第一の基板２として使用できる。
第二の基板３は、マスクとして上層流路３１に対応したパターンのマスクを用いる以外は上記（１）〜（５）と同様にしてポリマー層を得た後、さらに、該ポリマー層に貫通孔３２〜３７を開けることにより作製できる。
【００３２】
次に、上記デバイス１のマイクロ空間部３１１内の物質分布制御方法の一実施形態を、図４を用いて説明する。図４は、２個の層流Ｌ１、Ｌ２が多層流流通部２１１の幅方向に隣接した多層流（２層流）が多層流流通部２１１を流通している状態における、デバイス１の位置Ａ−Ａ’の部分縦断面図である。
本実施形態では、分岐流路部２１２ｂを封鎖した状態で、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにそれぞれ液体Ｌ１、Ｌ２を導入することにより２層流を形成し、多層流流通部２１１に流通させている。すなわち、液体Ｌ１、Ｌ２をそれぞれ貫通孔３２、３４から分岐流路部２１２ａ、２１２ｃに導入すると、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにて各液体の層流が形成され、流路２１２ａ、２１２ｃの下流側末端で合流し、２個の層流が幅方向に並んだ多層流（２層流）が形成される。該２層流は、連絡流路部２１２ｄを通って多層流流通部２１１に供給され、多層流流通部２１１を流通し、多層流排出部２１３の下流側末端から貫通孔３５を介してデバイス１外に排出される。
上記のようにして２層流を多層流流通部２１１に流通させると、多層流流通部２１１の上層のマイクロ空間部３１１内に、該２層流と同様の物質分布が形成される。
該液体Ｌ１、Ｌ２の組成や流量を調整するだけで、マイクロ空間部３１１内の物質分布を時間的にも空間的にも精密に制御できる。たとえば、液体Ｌ１として物質Ａを濃度ａ１で含有する液体、液体Ｌ２として物質Ａを濃度ａ２（ａ１＜ａ２）で含有する液体を用いると、マイクロ空間部３１１内に、物質Ａの濃度勾配が生じる。つまり、液体Ｌ１の層流の上方の部分は物質Ａを比較的低濃度に含有する領域（低濃度領域）となり、液体Ｌ２の層流の上方の部分は物質Ａを比較的高濃度に含有する領域（高濃度領域）となり、マイクロ空間部３１１内の幅方向に、物質Ａの濃度勾配が生じる。
濃度ａ１、ａ２のいずれか一方または両方を変化させると、該濃度勾配を変化させることができる。
また、層流Ｌ１、Ｌ２それぞれの幅ｗ１、ｗ２を変化させると、マイクロ空間部３１１内における高濃度領域の幅と低濃度領域の幅も変化する。
層流Ｌ１、Ｌ２それぞれの幅ｗ１、ｗ２は、液体Ｌ１、Ｌ２の流量の比率を調節することで調節できる。たとえば液体Ｌ１の流量の比率を高めると、層流Ｌ１の幅ｗ１が広くなる。各液体の流量の制御は、シリンジポンプ、電気浸透流ポンプ、その他機械的動作によるポンプ等の公知の液体供給装置を用いて実施できる。
また、液体Ｌ１、Ｌ２にそれぞれ配合する物質の種類を変更する、複数種の物質を組み合わせる、該複数種の物質の比率を変更する等により、マイクロ空間部３１１内に複雑な物質分布を形成できる。
また、液体Ｌ１、Ｌ２の組成を経時的に変化させることで、マイクロ空間部３１１内における物質分布を経時的に変化させることができる。一方、液体Ｌ１、Ｌ２の組成を変更しない場合は、当初の物質分布をそのまま維持できる。
【００３３】
本発明においては、上述したように、レイノルズ数が２０００未満となるように２層流を多層流流通部２１１内に流通させることが好ましい。
レイノルズ数は、上述したように、多層流流通部２１１のサイズ（幅および高さ）のほか、液体の物性（密度ρ、粘性率μ）や流速ｒによっても調節できる。特に流速ｒは、分岐流路部２１２ａ、２１２ｃにそれぞれ導入する液体Ｌ１、Ｌ２の流量を変更する簡便な方法で調節でき、好ましい。
【００３４】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
たとえば上記実施形態では、デバイス１の第一の基板２に、連絡流路部２１２ｄに合流する分岐流路部（多層流を形成する各層流を形成するための流路）を３つ設けた例を示したが、分岐流路部の数は２であってもよく、４以上であってもよい。分岐流路部の数の上限は特に限定されず、使用する液体の数（ｎ）に応じて適宜設定すればよい。デバイスの操作性を考慮すると５以下が好ましい。
また、連絡流路部２１２ｄ、多層流流通部２１１および多層流排出部２１３が同一直線上に形成されている例を示したが本発明はこれに限定されない。たとえば。連絡流路部２１２ｄ、多層流流通部２１１、多層流排出部２１３のうち、少なくとも１つが曲線状に形成されていてもよい。
また、連絡流路部２１２ｄと多層流流通部２１１と多層流排出部２１３との幅方向の断面形状が同一である例を示したが本発明はこれに限定されず、各流路の断面形状が異なっていてもよい。ただし層流の安定性の観点からは、同一であることが好ましい。
また、第二の基板３において、マイクロ空間部３１１の長手方向の両端にそれぞれ導出入路部３１２，３１３を設けているが、導出入路部３１２，３１３のいずれか一方のみであってもよい。
また、図４においては２層流を形成して物質濃度分布を制御する例を示したが本発明はこれに限定されない。たとえば分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ全てに液体を導入すると、３層流を形成できる。この場合、２層流の場合よりも複雑な物質分布制御が可能である。たとえば多層流流通部２１１内に、高濃度領域−低濃度領域−高濃度領域の濃度勾配の物質分布、低濃度領域−高濃度領域−低濃度領域の濃度勾配の物質分布、物質Ａ含有領域−物質Ｂ含有領域−物質Ｃ含有領域といった物質分布を形成できる。
【００３５】
本発明の物質分布制御方法に用いる液体は、層流を形成可能なものであれば特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。
たとえば前記液体として培養液を用いることにより、本発明の物質分布制御方法を、細胞の培養に利用することができる。
すなわち、マイクロ空間内に培養しようとする細胞（以下、培養細胞という。）を導入し、マイクロ流路に複数の培養液からなる層流から構成される多層流を流通させると、各層流を構成する培養液に含まれる栄養成分や酸素が多孔膜を介して上層のマイクロ空間内の培養細胞に供給される。また、マイクロ空間内にて培養細胞から排出された老廃物は、多孔膜を介して多層流内に拡散し、排出される。
このとき、多層流を構成する複数の培養液の組成（栄養成分の種類や濃度、酸素濃度等）を調整することにより、マイクロ空間内の物質分布を、実際の生体内にて培養細胞を取り巻く環境における物質分布と類似したものとすることができる。そのため、本発明によれば、従来に比べて、より生体内に近い環境で細胞を培養することができる。たとえば生体内においては複数の細胞がそれぞれ、隣接しつつも異なる環境下に存在している（たとえば肝臓細胞と膵臓細胞）が、本発明によれば、マイクロ空間内にこれに類似した環境を形成できる。
また、上述したように、多層流により生じるせん断応力のマイクロ空間への影響は多孔膜によって軽減されるため、該マイクロ空間内では、接着力の弱い細胞であっても培養することができる。また、培養細胞の活性等に対するせん断応力による影響も生じない。
さらに、該マイクロ空間にて培養する細胞が三次元構造体を形成する場合であっても、下層のマイクロ流路内の流れが乱れることはないので、マイクロ空間内における物質分布制御の精密性が維持される。
【００３６】
マイクロ空間にて培養する培養細胞としては、ヒト、マウス、ウシ、ブタ等の哺乳動物に由来する細胞が挙げられる。
特に、生命科学、再生医療、細胞・組織工学、発生工学など様々な分野において有用であるため、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の胚性幹細胞が好ましい。また、胚様体、受精卵等の三次元構造体を形成している細胞も好ましい。
本発明は、これら未分化の細胞だけでなく、肝細胞、小腸細胞等の各種臓器細胞、植物細胞、大腸菌、酵母等の培養にも利用できる。
培養細胞のマイクロ空間への導入は、たとえば前記デバイスを用いる場合は、マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部を使用することにより実施できる。
【００３７】
使用する培養液の組成およびその他の培養条件（培養温度、培養時間等）は、培養細胞に応じて適宜設定できる。
特に、培養液として、細胞の分化を制御する物質（以下、分化制御因子という。）の種類または濃度が異なる培養液を用いると、培養細胞の分化の制御を行うことができる。たとえば、マイクロ空間内で多能性細胞等の細胞を培養するとともに、該マイクロ空間内にて培養する細胞の分化制御因子の種類（たとえば分化誘導因子または分化抑制因子）や濃度を変えることにより、該マイクロ空間内の細胞の分化の程度を局所的に変えることができる。また、このとき、上述したように、多層流により生じるせん断応力のマイクロ空間への影響は多孔膜によって軽減されるため、細胞の分化に対するせん断応力による影響も生じない。
分化制御因子は、培養細胞の種類に応じて公知の分化制御因子のなかから適宜選択すればよい。
【００３８】
上記のように細胞の培養または分化の制御を行う場合、マイクロ流路に多層流を流通させる前に、マイクロ空間内にて予備培養を行ってもよい。
特に、多孔膜に培養細胞を付着させた状態にて細胞の培養または分化の制御を行う場合は、予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始することが好ましい。
このとき、培養細胞が多孔膜に対して接着性を有さないものである場合は、予備培養を行う前に、細胞が接着する足場となるマトリックスの溶液をマイクロ空間内に導入し、該マトリックスを多孔膜表面に付着させておくことが好ましい。該マトリックスとしては、たとえばゼラチン、フィブロネクチン、コラーゲン，ゲル等が挙げられる。
培養細胞が多孔膜に対して接着性を有するものである場合は、培養細胞をそのまま培養液とともにマイクロ空間内に導入して予備培養を行えばよい。
胚様体、受精卵等の三次元構造を形成している細胞の場合は、通常、多孔膜に付着していない状態で培養または分化の制御が行われる。このように、培養細胞が多孔膜に付着していない状態で培養または分化の制御を行う場合は、予備培養を行ってもよく、行わなくてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし本発明は該実施例に限定されるものではない。
なお、後述する試験例において、蛍光観察および蛍光強度の測定は、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行った。
【００４０】
＜製造例１＞
図１〜３に示す構成のデバイスを以下の手順で製造した。
まず、シリコン基板を用意し、該基板上に、スピンコーティングによりフォトレジスト（商品名「ＳＵ−８ ２１００」；マイクロケム社製）を塗布し、ベークしてフォトレジスト層を形成した。次いで、下層流路２１のパターンのマスクを介して露光、現像を行い、フォトレジスト層にマスクのパターンを転写した。該フォトレジスト層（鋳型）上に、未硬化のＰＤＭＳを塗布してポリマー層を形成し、ＵＶ照射により硬化させた。硬化後、ポリマー層を剥離して第一の基板２（外径：長径５０ｍｍ×短径２０ｍｍ×厚さ５０００μｍ、多層流流通部２１１：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ×長さ１００００μｍ、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃ：幅５００μｍ×高さ２００μｍ、分岐流路部２１２ａの合流角度θ１：１３５度、分岐流路部２１２ｃの合流角度θ２：１３５度）を得た。
マスクを上層流路３１のパターンのものに変更した以外は同じ操作を行い、剥離したポリマー層に貫通孔３２〜３７を開けて第二の基板３（外径：長径５０ｍｍ×短径５０ｍｍ×厚さ５０００μｍ、マイクロ空間部３１１：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ×長さ１５０００μｍ、導出入路部３１２，３１３：幅１ｍｍ×高さ２００μｍ、導出入路部３１２とマイクロ空間部３１１との角度θ３：６０度、導出入路部３１３とマイクロ空間部３１１との角度θ４：６０度）を得た。
【００４１】
別途、多孔膜４として、以下に示す５種（いずれもｗｈａｔｍａｎ社製「ｔｒａｃｋ ｅｔｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ」（空隙率１５％未満のポリカーボネート製の多孔膜））を用意し、各多孔膜にＳｉＯ２をスパッタリングによりコーティングした。
多孔膜Ａ：孔径０．４μｍの多孔膜。
多孔膜Ｂ：孔径１μｍの多孔膜。
多孔膜Ｃ：孔径３μｍの多孔膜。
多孔膜Ｄ：孔径５μｍの多孔膜。
多孔膜Ｅ：孔径１０μｍの多孔膜。
第一の基板２、第二の基板３および多孔膜をＯ２プラズマ処理した後、第一の基板２と第二の基板３とを、下層流路２１、３１が形成された面を内側にして、多層流流通部２１１およびマイクロ空間部３１１の位置が一致するように配置し、多孔膜４を挟んで接着することによりデバイスを得た。
【００４２】
＜製造例２＞
下層流路２１のパターンのうち、多層流流通部２１１を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍ×長さ１００００μｍ、分岐流路部２１２ａ〜２１２ｃを幅１５０μｍ×高さ１５０μｍに変更した以外は製造例１と同様の手順で第一の基板２を得た。
また、上層流路３１のパターンのうち、マイクロ空間部３１１を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍ×長さ１５０００μｍ、導出入路部３１２，３１３を幅１５０μｍ×高さ１５０μｍに変更した以外は製造例１と同様の手順で第二の基板３を得た。
得られた第一の基板および第二の基板、ならびに多孔膜Ｅを用いた以外は製造例１と同様にしてデバイスを得た。
【００４３】
＜試験例１＞
（１）
製造例１で製造した、多孔膜４の孔径がそれぞれ異なる５種のデバイスを用いて、以下の手順で、多孔膜４の孔径がマイクロ空間部３１１内の物質分布の形成に与える影響を評価した。
シリンジポンプを用いて、水および蛍光物質であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の２５μＭ水溶液をそれぞれ貫通孔３２、３４から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した。このとき、分岐流路部２１２ａ、分岐流路部２１２ｃ、多層流流通部２１１内における液体の流速はそれぞれ 約２００００μｍ／ｍｉｎ、約２００００μｍ／ｍｉｎ、約２００００μｍ／ｍｉｎであり、レイノルズ数はそれぞれ約０．０９５、約０．０９５、約０．１１であった。
水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液の送液を開始した時点から１８０ｓ後に、上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内の蛍光観察と蛍光強度の測定を行い、各流路内のＦＩＴＣ分布を確認した。
多孔膜４として前記多孔膜Ｂ（孔径１μｍ）、多孔膜Ｃ（孔径３μｍ）、多孔膜Ｄ（孔径５μｍ）、多孔膜Ｅ（孔径１０μｍ）をそれぞれ用いた場合の１８０ｓ経過時点の上層流路３１内の蛍光像をそれぞれ図５に示す。
これらの結果に示すとおり、多孔膜Ｂ〜Ｅを用いた例では、上層流路３１のマイクロ空間部３１１にＦＩＴＣ分布が形成された。一方、孔径０．４μｍの多孔膜Ａを用いた例では、ＦＩＴＣはマイクロ空間部３１１内に拡散しなかった。
【００４４】
（２）
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて以下の評価を行った。
まず、ＦＩＴＣの２５μＭ水溶液を貫通孔３４から導入し、デバイス内（上層流路３１および下層流路２１内）を満たした。
次に、シリンジポンプを用いて、水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液をそれぞれ貫通孔３２、３４から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した。
水およびＦＩＴＣの２５μＭ水溶液の送液を開始した時点から一定時間毎（０ｓ、３０ｓ、６０ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓ、１８０ｓおよび３０ｍｉｎ経過時点）に、下層流路２１（多層流流通部２１１）内および上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内の蛍光観察と蛍光強度の測定を行い、各流路内のＦＩＴＣ分布を確認した。
０ｓ、３０ｓ、６０ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓおよび１８０ｓ経過時点の上層流路３１内の蛍光像をそれぞれ図６に示す。
また、下層流路２１内、上層流路３１内それぞれの蛍光強度の測定結果から、縦軸に３０ｍｉｎ経過時点の蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該グラフをそれぞれ蛍光像とともに図７、８に示す。図７が下層流路２１内の蛍光像およびグラフであり、図８が上層流路３１内の蛍光像およびグラフである。
なお、「流路の幅方向の位置」は、流路の縦断面を下流側から見て、該流路の左端の位置を０とした場合の幅方向の距離（μｍ）を示す。
これらの結果に示すとおり、上層流路３１をＦＩＴＣ水溶液で満たした後に、下層流路２１に水とＦＩＴＣ水溶液との２層流を流通させると、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内のＦＩＴＣ分布は、一様な状態から、下層流路２１内のＦＩＴＣ分布に対応したものに変化した。また、該ＦＩＴＣ分布はそのまま維持されていた。
【００４５】
＜試験例２＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用い、水を貫通孔３３から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液し、ＦＩＴＣの２５μＭ水溶液を貫通孔３２、３４からそれぞれ流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した以外は、試験例１の（２）と同様の操作を行った。結果を図９に示す。図９（ａ）が多層流流通部２１１内の蛍光像およびグラフであり、図９（ｂ）がマイクロ空間部３１１内の蛍光像およびグラフである。
該結果に示すとおり、下層流路２１の多層流流通部２１１内には３層の多層流が形成され、その上層のマイクロ空間部３１１内には、多層流流通部２１１内のＦＩＴＣ分布に対応したＦＩＴＣ分布が形成された。
【００４６】
＜試験例３＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順で、下層流路２１（多層流流通部２１１）を流通する流れが上層流路３１（マイクロ空間部３１１）に与える影響を評価した。
該デバイスの上層流路３１内に、蛍光ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ製「Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ＹＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」）を配合した水を満たした。
次に、シリンジポンプを用いて、蛍光ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ製「Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ＹＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」）を配合した水を、貫通孔３３から流量を変えて（０．２、０．４、１．０、２．０または４．０μＬ／ｍｉｎ）にて送液し、下層流路２１を流通させた。
送液を開始した時点から一定時間毎に、下層流路２１の多層流流通部２１１内および上層流路３１のマイクロ空間部３１１内の蛍光ビーズの画像をカメラ付き位相差顕微鏡により撮影し、その画像から、下層流路２１内および上層流路３１内の蛍光ビーズ（以下、まとめて流路内ビーズという。）の平均流速（μｍ／ｍｉｎ）を求めた。その結果を図１０のグラフに示す。該グラフの横軸は、下層流路２１に送液した流量（μＬ／ｍｉｎ）であり、縦軸は流路内ビーズの平均流速（μｍ／ｍｉｎ）である。
該結果に示すとおり、上層流路３１の流路内ビーズの平均流速は、下層流路２１の流路内ビーズの平均流速に比べて大幅に小さく、特に下層流路２１の流速が０．５μＬ／ｍｉｎ以下の場合は０であった。該結果から、上層流路３１においては、多孔膜により、下層流路２１の流れの影響が大幅に軽減されることが確認できた。
【００４７】
＜試験例４＞
製造例２で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順でＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝ガン由来細胞株；独立行政法人理化学研究所 ｃｅｌｌ ｂａｎｋより入手。）の培養を行った。
試験例４で用いたのと同じデバイスにＵＶを３０分間照射して滅菌した後、上層流路３１にフィブロネクチン溶液（２５μｇ／ｍＬ）を満たし、１時間静置した。
次に、デバイス内をＰＢＳおよび培養液で洗浄した。培養液としてはＦＢＳ含有Ｋｎｏｃｋ ｏｕｔＤＭＥＭを用いた。
次に、細胞を接着させるために、上層流路３１内を細胞懸濁液（１．０×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）で満たし、一晩インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、前記培養液に蛍光物質であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を添加してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液を調製した。該ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液を貫通孔３４から、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを添加していない培養液（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（−）培養液）を貫通孔３２から、シリンジポンプを用い、流量２μＬ／ｍｉｎでの送液（灌流）を開始し、培養（培養温度：３７℃）を行った。
【００４８】
培養開始から１２時間後、上層流路（マイクロ空間部）内にて細胞に取り込まれたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光観察および蛍光強度の測定を行った。測定結果から、縦軸にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該グラフを蛍光像とともに図１１に示す。図１１（ａ）が、培養前であり、図１１（ｂ）が培養１２時間後である。
該結果に示すとおり、下層の多層流流通部２１１内において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（＋）培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は、灌流前に比べて蛍光強度が増大していた。該結果から、該領域の細胞は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに曝露され、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを取り込んだことが確認できた。一方、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（−）培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は、蛍光強度がほとんど変化しておらず、ほとんどＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに曝露されなかったことが確認できた。
このように、本発明によれば、マイクロ空間内の物質分布を空間的に制御し、同じマイクロ空間内に存在する細胞に対し、局所的な物質曝露を行うことができる。
【００４９】
＜試験例５＞
製造例１で製造したデバイスのうち、多孔膜Ｅを用いたデバイスを用いて、以下の手順でマウスｉＰＳ細胞（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７細胞株；国立大学法人京都大学より入手。）の培養を行った。ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７細胞株は、未分化マーカーであるＮａｎｏｇ遺伝子のレポーター遺伝子として緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）が発現しており、蛍光発色している細胞は未分化状態であると判断できる。
試験例４と同様にしてデバイスを滅菌した後、上層流路３１にフィブロネクチン溶液（濃度２５μｇ／ｍＬ）を満たし、１時間インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、デバイス内を培養液で満たした。培養液としてはＦＢＳ含有Ｋｎｏｃｋ ｏｕｔＤＭＥＭを用いた。
次に、細胞を接着させるために、上層流路３１内に細胞懸濁液（１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を導入し、一晩インキュベーター内（温度：３７℃）で静置した。
次に、前記培養液に、マウスｉＰＳ細胞の未分化維持因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）を配合したＬＩＦ含有培養液（未分化維持培養液）と、前記培養液に、マウスｉＰＳ細胞の分化誘導因子であるレチノイン酸（ＲＡ）を配合したＲＡ含有培養液（分化誘導培養液）とを調製した。該ＬＩＦ含有培養液を貫通孔３４から、ＲＡ含有培養液を貫通孔３２から、シリンジポンプを用い、流量２μＬ／ｍｉｎでの送液（灌流）を開始し、培養（培養温度：３７℃）を行った。
【００５０】
培養前および培養開始から５日後、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内について、ＧＦＰ発現による蛍光（ＧＦＰ蛍光）の観察および蛍光強度の測定を行い、縦軸にＧＦＰの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。培養前および培養５日後のＧＦＰ蛍光像およびグラフをそれぞれ図１２に示す。図１２（ａ）が培養前であり、図１２（ｂ）が培養５日後である。
また、培養５日後、上層流路３１のマイクロ空間部３１１内の細胞に対して４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）染色を行い、蛍光の観察および蛍光強度の測定を行い、縦軸にＤＡＰＩの蛍光強度、横軸に流路の幅方向の位置をとったグラフを作成した。該蛍光像およびグラフを図１３に示す。このＤＡＰＩ染色では生存している細胞の核が染色されるため、ＤＡＰＩの蛍光を測定することにより、上層流路３１内の生細胞を確認できる。該結果から、培養５日後、上層流路３１内の生細胞密度はほぼ一定であることが確認できた。
これらの結果から、ＲＡ含有培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は分化が誘導され、一方、ＬＩＦ含有培養液の層流が流通した部分に対応する領域の細胞は未分化の状態が維持されていることが確認できた。
このように、本発明によれば、マイクロ空間内の物質分布を空間的に制御し、同じマイクロ空間内に存在する多能性幹細胞に対して局所的な未分化維持および分化誘導を行うことが可能である。
なお、下層流路２１内に細胞懸濁液（１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を導入した以外は上記と同様の操作を行ったところ、培養５日後、下層流路２１内の細胞の大半が死滅していた（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（死細胞染色）により確認）。これは、流れのせん断応力の影響によるものと考えられる。
【００５１】
＜試験例６＞
ＬＩＦ含有培養液を貫通孔３３から流量２μＬ／ｍｉｎにて送液し、ＲＡ含有培養液を貫通孔３２、３４からそれぞれ流量２μＬ／ｍｉｎにて送液した以外は、試験例５と同様の操作を行った。
結果を図１４〜１５に示す。図１４は、培養５日後の上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内のＧＦＰ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）であり、図１５は、培養５日後の上層流路３１（マイクロ空間部３１１）内のＤＡＰＩ蛍光観察結果を示す蛍光像およびグラフ（（ａ）蛍光像、（ｂ）グラフ）である。
これらの結果から、ＲＡ含有培養液の層流（３層のうち両端の層流）が流通した部分に対応する領域の細胞は分化が誘導され、一方、ＬＩＦ含有培養液の層流（３層のうち中央の層流）が流通した部分に対応する領域の細胞は未分化の状態が維持されていることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
近年、再生医療や生命科学への応用として、多能性幹細胞をはじめとする細胞組織の培養研究が盛んに行われているものの、実用可能な分化誘導法は確立されていない。特に従来の実験手法で扱える静的で一様な培養環境では、分化誘導を時空間的に精密に制御することができない。本発明は、このような問題に対し、細胞組織の微小環境を精密に制御する技術を与えるものであり、再生医療分野や動物細胞を用いる薬物動態・毒性試験分野において有用である。
【符号の説明】
【００５３】
１…デバイス、２…第一の基板、３…第二の基板、４…多孔膜、２１…下層流路、３１…上層流路、３２〜３７…貫通孔、２１１…多層流流通部、２１２ａ〜２１２ｃ…分岐流路部、２１２ｄ…連絡流路部、２１３…多層流排出部、３１１…マイクロ空間部、３１２〜３１３…導出入路部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
【請求項２】
前記マイクロ流路内においてレイノルズ数が２０００未満となるように前記多層流を流通させる、請求項１に記載の物質分布制御方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の物質分布制御方法に用いられるデバイスであって、
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
【請求項４】
液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞を培養する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項５】
予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記細胞が三次元構造体を形成している、請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞の分化を制御する方法であって、
前記細胞の分化を制御する物質の種類または濃度が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞分化制御方法。
【請求項１０】
予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、請求項９に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１１】
前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、請求項９に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１２】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１３】
前記細胞が三次元構造体を形成している、請求項１１に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１】
液体で満たされたマイクロ空間内の物質分布を制御する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の液体をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする物質分布制御方法。
【請求項２】
前記マイクロ流路内においてレイノルズ数が２０００未満となるように前記多層流を流通させる、請求項１に記載の物質分布制御方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の物質分布制御方法に用いられるデバイスであって、
表面にそれぞれマイクロ流路構造が設けられた第一の基板および第二の基板を備え、
前記第一の基板表面のマイクロ流路構造は、多層流が流通する多層流流通部と、該多層流流通部の上流側に配置された多層流形成部と、該多層流流通部の下流側に配置された多層流排出部とを有し、
前記第二の基板表面のマイクロ流路構造は、前記多層流流通部と略同一パターンのマイクロ空間部と、該マイクロ空間部への液体の導入または導出のための導出入路部とを有し、
前記第一の基板と第二の基板とが、前記マイクロ流路構造が設けられた面を内側にして、前記多層流流通部および前記マイクロ空間部の位置が一致するように積層され、
前記多層流流通部と前記マイクロ空間部との間に孔径１μｍ以上の多孔膜が挟持されているデバイス。
【請求項４】
液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞を培養する方法であって、
組成が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項５】
予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記細胞が三次元構造体を形成している、請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
液体で満たされたマイクロ空間内にて細胞の分化を制御する方法であって、
前記細胞の分化を制御する物質の種類または濃度が異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の培養液をそれぞれ層流として合流させて幅方向にｎ個の層流が隣接する多層流を形成し、
該多層流を、前記マイクロ空間下に孔径１μｍ以上の多孔膜を介して配置されたマイクロ流路に流通させることを特徴とする細胞分化制御方法。
【請求項１０】
予備培養を行って前記多孔膜の前記マイクロ空間側に前記細胞を付着させた後、前記多層流の流通を開始する、請求項９に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１１】
前記細胞が前記多孔膜に付着していない状態で前記多層流の流通を行う、請求項９に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１２】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞分化制御方法。
【請求項１３】
前記細胞が三次元構造体を形成している、請求項１１に記載の細胞分化制御方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１４７３８７（Ｐ２０１１−１４７３８７Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１１７８（Ｐ２０１０−１１１７８）
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００９，Ｖｏｌｕｍｅ １０８，Ｉｓｓｕｅ Ｓ１（記事：Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００９（第９回アジア太平洋生物化学工学会議）の講演要旨集）、第Ｓ１６０頁、発行者：（社）日本生物工学会、発行日：平成２１年１１月１日 〔刊行物等〕Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００９、開催者名：（社）日本化学工学会および（社）日本生物工学会を含む９団体、開催日：２００９年１１月２４日〜２８日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会講演会講演概要集、第２９２頁、発行者：（社）計測自動制御学会、発行日：平成２１年１２月２４日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会講演会論文集、第１６５９〜１６６２頁、発行者：（社）計測自動制御学会、発行日：平成２１年１２月２４日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会、開催者名：（社）計測自動制御学会、開催日：２００９年１２月２４日〜２６日
【出願人】（８０１００００４９）財団法人生産技術研究奨励会 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００９，Ｖｏｌｕｍｅ １０８，Ｉｓｓｕｅ Ｓ１（記事：Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００９（第９回アジア太平洋生物化学工学会議）の講演要旨集）、第Ｓ１６０頁、発行者：（社）日本生物工学会、発行日：平成２１年１１月１日 〔刊行物等〕Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００９、開催者名：（社）日本化学工学会および（社）日本生物工学会を含む９団体、開催日：２００９年１１月２４日〜２８日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会講演会講演概要集、第２９２頁、発行者：（社）計測自動制御学会、発行日：平成２１年１２月２４日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会講演会論文集、第１６５９〜１６６２頁、発行者：（社）計測自動制御学会、発行日：平成２１年１２月２４日 〔刊行物等〕第１０回 （社）計測自動制御学会 システムインテグレーション部門講演会、開催者名：（社）計測自動制御学会、開催日：２００９年１２月２４日〜２６日
【出願人】（８０１００００４９）財団法人生産技術研究奨励会 (72)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]