本明細書において、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（Ｆａｈ）がさらに欠損している免疫不全マウスを用いて、インビボでのヒト肝細胞の増大方法を記載する。該方法は、ヒト肝細胞を該免疫不全のＦａｈ欠損マウスに移植すること、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストを該マウスに投与すること、および該肝細胞を増大させることを含む。あるいはまた、該方法は、ヒト肝細胞を該免疫不全のＦａｈ欠損マウスに移植すること（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒについて欠損型である）、および該肝細胞を増大させることを含む。また、該方法により、二次、三次、四次またはそれ以上の高次のマウスへのヒト肝細胞の累代移植が可能になる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
本願は、２０１０年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９６，７７４号および２００９年５月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１７４，７９１号の利益を主張するものであり、参照することによりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）を増大させる方法、具体的には、免疫不全のＦａｈ欠損マウスを利用して、肝細胞を増大させる方法を目的とする。
【０００３】
政府支援の声明
本発明は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された授与番号ＤＫ０５１５９２に基づいて、政府の支援でもってなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
肝臓は、医薬を含む生体異物化合物を代謝する主要な部位である。多くの肝酵素が種特異的であるため、培養された一次ヒト肝細胞またはそれらのミクロソーム分画を用いて、候補医薬の代謝を評価することが必要である（非特許文献１、非特許文献２）。ミクロソーム肝細胞分画を用いて、一部の代謝機能を解明することができる一方、他の試験は、生きている肝細胞に依存する。例えば、一部の化合物は、肝酵素を誘導し、ひいては、それらの代謝は、経時的に変化する。酵素誘導を分析するために、肝細胞は、生存能力があるだけでなく、十分に分化し、かつ機能的でなければならない。
【０００５】
薬物代謝および他の研究に関しては、肝細胞は、一般に、死体臓器ドナーから単離し、試験が行われる場所に輸送される。死体源からの肝細胞の状態（生存能力および分化の状態）は、極めて変わりやすく、多くの細胞調製物の品質は、あまり良くない。高品質のヒト肝細胞の利用可能性は、組織培養において有意に増大することができないという事実によりさらに妨げられる（非特許文献３、非特許文献４）。播種した後、該細胞は、生存するが、分裂しない。マウス等のすぐに利用できる哺乳類種からの肝細胞は、代謝酵素の異なる相補体を有し、誘導研究において異なって反応するため、ほとんどの薬物試験研究には適さない。不死化ヒト肝細胞（肝細胞腫）または胎児肝芽細胞は、十分に分化した成熟細胞の適切な代用物ではない。ヒト肝細胞はまた、微生物学の分野における研究に必要である。肝炎を生じるウイルス等の多くのヒトウイルスは、任意の他の細胞型で複製することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８９：２３３−２４６，２００３
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：２９２−３１２，２００３
【非特許文献３】Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７４：１−３，２０００
【非特許文献４】Ｃａｓｃｉｏ Ｓ．Ｍ．，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２５：５２９−５３８，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの限界を考えると、一次ヒト肝細胞を増大させる方法が、非常に望ましい。よって、ヒト肝細胞を増大させるための堅牢なシステムを本明細書に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本明細書において、さまざまな目的のため、例えば、他の種（特に、ヒト）に由来する肝細胞の増大のため、ならびにヒト肝臓疾患、例えば、肝硬変、線維症、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）および肝臓感染症の動物モデルとしての有用性を有する免疫不全のＦａｈ欠損マウスを記載する。
【０００９】
本明細書において、インビボでのヒト肝細胞の増大方法を提供する。該方法は、ヒト肝細胞を免疫不全のフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（Ｆａｈ）欠損マウスに移植する工程、該肝細胞を増大させる工程、および任意選択で、ヒト肝細胞を収集する工程を含む。いくつかの実施形態では、移植効率を改善するため、免疫不全のＦａｈ欠損マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与されるか、または該マウスが、さらにＩＬ−１Ｒ欠損型である。
【００１０】
一部の実施形態では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが、ヒト肝細胞の移植中および／または移植後に投与される。
【００１１】
一部の実施形態では、該マウスの免疫不全が遺伝子変異、免疫抑制、またはその組合せによるものである。
【００１２】
また、候補薬剤を免疫不全のＦａｈ欠損マウスに投与すること（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される）、および肝臓疾患に対する該候補薬剤の効果を評価することによる、ヒト肝臓疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。該肝臓疾患の１つ以上の徴候または症状の改善は、該候補薬剤が該肝臓疾患の処置に有効であることを示す。
【００１３】
さらに、ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与すること（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、移植ヒト肝細胞はヒト肝臓病原体に感染させたものである）；および該肝臓感染症に対する候補薬剤の効果を評価することにより、該肝臓病原体による感染の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。
【００１４】
また、ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与すること、および該マウスにおいて、肝硬変の少なくとも１種類の診断用マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価することにより、肝硬変の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。この方法では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスが、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される。さらに、ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与すること（ここで、免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される）、および該マウスにおいて、ＨＣＣに対する候補薬剤の効果を評価することにより、ＨＣＣの処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。
【００１５】
また、ヒト肝細胞に対する外因性因子のインビボでの効果の評価方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、外因性因子を免疫不全のＦａｈ欠損マウスに投与すること（ここで、免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される）；および該マウスにおいて、肝臓機能の少なくとも１種類のマーカーを測定することを含む。
【００１６】
さらに、遺伝子療法プロトコルおよび肝臓用ベクター（遺伝子発現および遺伝子ノックダウン用ベクターを含む）；薬物代謝、薬物動態、有効性、毒物学的特性および安全性；ならびにヒト遺伝性肝臓疾患の評価方法を提供する。かかる方法では、ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスが利用され得、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与されるか、またはかかるマウスにおいて増大させて収集したヒト肝細胞が使用され得る。
【００１７】
本発明の前述ならびに他の目的、特性および利点は、以下の発明を実施するための形態からさらに明らかになり、添付の図を参照して進める。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】ヒト肝細胞により移植および再増殖した後、三重変異体ＦＲＧマウス（＃４７１）および２匹のヘテロ接合同腹子（＃４６９、＃４７０）の相対的重量を示すグラフ。該ＦＲＧマウスは、移植後６週間、その体重を維持したが、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のヘテロ接合同腹子は、継続的に減量した。ＮＴＢＣは、第１週目および第４週目にのみ投与され、陰影で示す。
【図１ｂ】肝細胞受容肝臓からのゲノムＤＮＡにおけるヒトＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。ＦＲＧマウスのみが陽性であった。
【図１ｃ】野生型（Ｃ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ^−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｄ】Ｆａｈ^{（−／−）}（Ｄ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ^−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｅ】ヒト化マウス肝臓（Ｅ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ^−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｆ】８０％を超える肝細胞がＦＡＨに対して陽性であることを示す（暗染および大きな矢印により示される）、再増殖したマウス肝臓におけるＦＡＨ免疫染色のデジタル画像。小さい矢印は、ＦＡＨ陰性細胞を画定する。
【図１ｇ】ヒト肝細胞は、好酸性が低いことを示す（矢印により示される）、同一の肝切片のＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。原拡大率×２００
【図２ａ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、マウス肝臓組織に統合したが、受容者の肝臓微細構造を阻害しなかったことを示すデジタル画像。
【図２ｂ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。高度に再増殖したキメラ肝臓はまた、正常構造を持つことを示すデジタル画像。
【図２ｃ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｄ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｅ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｆ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＨｅｐＰａｒの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｇ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。移植してから４ヶ月後でさえ、管状または糸球体の破壊がないことを示す、高度に再増殖したマウスからの腎臓切片のデジタル画像。
【図２ｈ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。脾臓におけるＦＡＨ陽性ヒト肝細胞を示すデジタル画像。原拡大率×１００（図２ｃ）、×２００（図２ａ、２ｂ、２ｅ、２ｆ、および２ｇ）、×４００（図２ｄおよび２ｈ）。
【図３ａ】キメラマウス肝臓からのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す、一連のゲル切片。ヒトＡＬＢ、ＦＡＨ、ＴＡＴ、ＴＦ、ＴＴＲ、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子を、キメラマウス肝臓（＃６９７および＃７８５）において発現させた。ヒト肝細胞およびマウス肝細胞はそれぞれ、陽性および陰性対照として用いた。
【図３ｂ】図３ｂ（正常プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｃ】図３ｃ（対数プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｄ】図３ｄ（正常プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図３ｅ】図３ｅ（対数プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図４ａ】一次細胞（極左の暗ボックス）を始めとして連続移植スキームを示す概略図。暗ボックスは、再増殖した連続受容者を示し、白ボックスは、非移植マウスを示す。一次受容者の１／４のみが、再増殖されたが、６匹すべての二次受容者が、移植された。
【図４ｂ】連続的に移植された受容者の肝臓からのＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。
【図４ｃ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｄ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｅ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｆ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。一次（Ｆ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｇ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。二次（Ｇ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｈ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。三次（Ｈ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図５ａ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｂ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｃ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｄ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｅ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｆ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｇ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｇ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｈ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（Ｈ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｉ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｉ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｊ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（Ｊ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｋ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（Ｋ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｌ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（Ｌ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図６ａ】エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＣＹＰ１Ａ１依存）の代謝（Ａ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｂ】６−β−ヒドロキシルテストステロン（ＣＹＰ３Ａ４媒介）へのテストステロンの転換（Ｂ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｃ】定量的ＲＴ−ＰＣＲにより判定される、薬物代謝、薬物移送、および薬物抱合に関する、ヒト特異遺伝子のｍＲＮＡレベルを示すグラフ。ヒト薬物代謝遺伝子の比率は、成熟ヒト肝細胞に特有である。
【図７ａ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。マウスアクチンｍＲＮＡに対して正規化した、３つの試料における肝臓特異的遺伝子の基底発現の棒グラフ。
【図７ｂ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ３Ａ４（Ｂ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｃ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ２Ｂ６（Ｃ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｄ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＡＲ（核ホルモン受容体）（Ｄ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｅ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＤＲ１（輸送体）（Ｅ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｆ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＲＰ（Ｆ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｇ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＢＳＥＰ（輸送体）（Ｇ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｈ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＰＸＲ（核ホルモン受容体）（Ｈ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図８】図８は、ヒト化ＦＲＧマウスから単離された肝細胞のＦＡＣＳプロットである。細胞は、抗ヒトＣＤ４６と抗マウス肝細胞（ＨＣ）表面マーカーで共染色した。肝細胞の大部分（＞８５％）はヒト系であった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列表
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語、およびアミノ酸の三文字コードを示す。各核酸配列の１本鎖のみを示すが、該相補鎖は、表示された該鎖に言及するときは常にそれに含まれるものとして理解する。
【００２０】
配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイルであるＡｎｎｅｘ Ｃ／Ｓｔ．２５テキストファイルとして提出したものである（２０１０年４月１６日に作成，１７ＫＢ，引用により本明細書に組み込まれる）。
【００２１】
添付の配列表において、
配列番号１および２は、ヒトＡｌｕ配列を増幅するためのＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、ヒトＡＬＢ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２３】
配列番号４は、ヒトＡＬＢ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２４】
配列番号５は、マウスＡｌｂ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２５】
配列番号６は、マウスＡｌｂ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２６】
配列番号７は、ヒトＴＡＴ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２７】
配列番号８は、ヒトＴＡＴ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２８】
配列番号９は、ヒトＴＦ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００２９】
配列番号１０は、ヒトＴＦ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３０】
配列番号１１は、ヒトＦＡＨ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３１】
配列番号１２は、ヒトＦＡＨ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３２】
配列番号１３は、ヒトＴＴＲ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３３】
配列番号１４は、ヒトＴＴＲ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３４】
配列番号１５は、ヒトＵＧＴ１Ａ１順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３５】
配列番号１６は、ヒトＵＧＴ１Ａ１逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００３６】
配列番号１７および１８は、それぞれ、ヒトＩＬ−１ＲＡ（２００３年１月２４日にＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５７７．３で寄託）の核酸配列およびアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１９および２０は、それぞれ、マウス ＩＬ−１ＲＡ（２００７年４月６日にＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７０１で寄託）の核酸配列およびアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２１は、アナキンラのアミノ酸配列である。
【００３９】
詳細説明
Ｉ． 略号
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルス
ＡＬＢ アルブミン
ＡＬＴ アラニンアミノトランスフェラーゼ
ＡＳＴ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＢＮＦ β−ナフトフラボン
ＣＭＶ サイトメガロウイルス
ＤＡＢ ジアミノベンジジン
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＥＲＯＤ エトキシレゾルフィン−Ｏ−デエチラーゼ
ＥＳ 胚性幹
ＦＡＣＳ 蛍光標示式細胞分取
ＦＡＨ フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ
ＦＩＳＨ 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
ＦＩＴＣ イソチオシアン酸フルオレセイン
ＦＲＧ Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−三重変異型マウス
Ｈ＆Ｅ ヘマトキシリンおよびエオシン
ＨＢＶ Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＬＡ ヒト白血球抗原
ＨＴ１ 遺伝性チロシン血症１型
ＩＬ−１ インターロイキン−１
ＩＬ−１Ｒ インターロイキン−１受容体
ＩＬ−１ＲＡ インターロイキン−１受容体拮抗薬
ＩＬ−１ＲＡＰ インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質
ＩＬ−２Ｒγ インターロイキン−２受容体γ
ｉＰＳ 人工多能性幹
ＩＰＳＣ 人工多能性幹細胞
ＭＨＣ 主要組織適合性複合体
ｍＴＯＲ 哺乳類ラパマイシン標的
ＮＯＤ 非肥満糖尿病性
ＮＴＢＣ ２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン
ＰＢ フェノバルビタール
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ フィコエリトリン
ＰＦＵ プラーク形成単位
ＲＡＧ リコンビナーゼ活性化遺伝子
Ｒｉｆ リファンピシン
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡ スクシニルアセトン
ＳＣＩＤ 重症複合型免疫不全症
ＴＡＴ チロシンアミノトランスフェラーゼ
ＴＦ トランスフェリン
ＴＴＲ トランスサイレチン
ＵＧＴ１Ａ１ ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー，ポリペプチドＡ１
ｕＰＡ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子。
【００４０】
ＩＩ． 用語および方法
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより出版、１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より出版、１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）において見出すことができる。
【００４１】
本発明の種々の実施形態の概説を容易にするために、具体的な用語の以下の説明を提供する。
【００４２】
投与：被験体に、治療用薬剤などの薬剤を任意の有効な経路によって供給すること、または与えること。例示的な投与経路としては、限定されないが、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内など）、経口、管内、舌下、経直腸、経皮、鼻腔内、経膣ならびに吸入経路が挙げられる。
【００４３】
肝臓疾患の発症を阻害するまたは予防する薬剤：ＦＲＧマウス， またはＦ^ｐｍＲＧマウス、または任意の他の型のＦａｈ欠損マウスに投与される場合、マウスにおける肝臓疾患の発症を予防、または遅延、または阻害する化合物または組成物。肝臓疾患または肝機能障害は、肝組織像の変化（壊死、炎症、線維症、異形成、または肝臓癌等）、肝臓特異的酵素および他のタンパク質（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミン等）のレベルの変化、または全身性肝不全が挙げられるが、これらに限定されない、兆候または症状のうちのいずれか１つにより特徴付けられる。一実施形態において、肝臓疾患を阻害する薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。
【００４４】
羊膜細胞：胚の周囲の羊水中に見られる細胞。
【００４５】
アナキンラ：インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体拮抗薬。アナキンラは、天然に存在するＩＬ−１の生物学的活性を、多くの組織および器官で発現されるＩＬ−１受容体へのＩＬ−１の結合を競合的に阻害することによりブロックする。ＩＬ−１は、炎症刺激に応答して生成され、種々の生理学的応答、例えば、炎症反応および免疫学的反応を媒介する。アナキンラは、遺伝子操作した大腸菌の培養物から調製されるヒトＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１受容体拮抗薬）の組換え型の非グリコシル化形態である。アナキンラタンパク質は１５３個のアミノ酸のものであり、およそ１７．３ｋＤの分子量を有し、アミノ末端に１つのメチオニン残基を有する点で天然ヒトＩＬ−１ＲＡ（配列番号１８）と異なる（アナキンラのアミノ酸配列を本明細書において配列番号２１として示す）。また、アナキンラはＫＩＮＥＲＥＴＴＭとしても知られている。
【００４６】
アンタゴニスト：別の化合物の効果を打ち消す化合物（薬物、タンパク質または小分子など）。一部の場合では、アンタゴニストは特定の細胞受容体に結合するが、生物学的応答を誘起しないものである。
【００４７】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコード化された１つもしくは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、またはミュー、またはアルファ、またはデルタ、またはイプシロンに分類され、同様に、各々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの免疫グロブリンを表す。
【００４８】
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、通常、テトラマーである。各々のテトラマーは、２つの同一のペアのポリペプチド鎖から成り、各々のペアは、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。「可変軽鎖」（Ｖ_Ｌ）および「可変重鎖」（Ｖ_Ｈ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００４９】
本明細書に使用される、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン、ならびによく特徴付けられたフラグメントをいくつか含む。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質または融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、そのタンパク質（またはエピトープ）のための特異的結合剤でもある。これらの抗体フラグメントは、以下のように定義される。（１）Ｆａｂ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、酵素パパインによる全抗体の消化により生成された抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメント、（２）Ｆａｂ’、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、ペプチンで全抗体を処理し、次いで、還元することにより得られる、抗体分子のフラグメント、（３）（Ｆａｂ’）_２、後続の還元を伴わずに酵素ペプチンで全抗体を処理することにより得られる、抗体のフラグメント、（４）Ｆ（ａｂ’）_２、２個のジスルフィド結合により２つのＦａｂ’フラグメントが一緒にされた二量体、（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現された軽鎖の可変域および重鎖の可変域を含む遺伝子組み換えフラグメント、および（６）１本鎖抗体、遺伝子融合１本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変域、重鎖の可変域を含む遺伝子組み換え分子， として定義される。これらのフラグメントを作製する方法は、日常的である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。
【００５０】
本開示の方法に用いられる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。単に一例として、モノクローナル担体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその誘導的な方法に従って、ネズミハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成のための詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００５１】
抗原：動物において抗体の生成またはＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物または物質（動物に注入される、または吸収される組成物を含む）。抗原は、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「病原体特異的抗原」は、病原体（ウイルス、細菌または寄生虫など）によって発現され、被験体において免疫応答を惹起するタンパク質などの抗原である。
【００５２】
アザチオプリン：プリン合成阻害薬であり、細胞、特に白血球の増殖を阻害する免疫抑制薬。この免疫抑制薬は、多くの場合、自己免疫疾患または臓器移植拒絶の処置に使用される。これはプロドラッグであり、体内で、活性な代謝産物６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）および６−チオイノシン酸に変換される。アザチオプリンは、いくつかのジェネリックの製造業者によって、ブランド名（Ａｚａｓａｎ^ＴＭ（Ｓａｌｉｘ）；Ｉｍｕｒａｎ^ＴＭ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ａｚａｍｕｎ^ＴＭ；およびＩｍｕｒｅｌ^ＴＭ）として製造されている。
【００５３】
Ｂ細胞：体液性免疫応答に大きな役割を果しているリンパ球の型。Ｂ細胞の主な機能は、可溶性の抗原に対する抗体を作製することである。Ｂ細胞は、適応免疫機構の必須成分である。
【００５４】
生物学的試料または試料：被験体の細胞、組織または体液から採取された試料、例えば、末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄、尿、唾液、組織生検材料、外科標本、および剖検物質。
【００５５】
肝硬変：正常な微視的小葉構成の減損および結合組織の線維帯の壊死性実質組織での再生的置換（これにより、最終的には該臓器が収縮し、不規則な結節に分かれる）を特徴とする一群の慢性肝臓疾患をいう。肝硬変は、長い潜伏期間の後、通常、突然の腹痛および吐血、就下性水腫または黄疸を伴う腫脹が起こる。進行期では、腹水、顕著な黄疸、門脈圧亢進、拡張蛇行静脈（ｖａｒｉｃｏｓｅ ｖｅｉｎ）および中枢神経系障害（肝性昏睡に至ることがあり得る）がみられることがあり得る。
【００５６】
採取：本明細書に使用される増大されたヒト肝細胞を「採取する（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ）」とは、単離されたヒト肝細胞を注入されているマウス（またはレシピエントマウスとも称される）から増大された肝細胞を除去するプロセスをさす。採取は、任意に、肝細胞を他の細胞型から分離することを含む。一実施形態において、その増大されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損マウスの肝臓から採取される。一部の例において、その増大されたヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦ^ｐｍＲＧマウスの肝臓から採取される。
【００５７】
インターロイキン受容体の一般的なγ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）：インターロイキン受容体の一般的なガンマ鎖をコード化する遺伝子。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含む、いくつかのインターロイキンに対する受容体の構成要素である（Ｄｉ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７−３８１，１９９５）。Ｉｌ２ｒｇの欠損した動物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞が欠如する。Ｉｌ２ｒｇはまた、インターロイキン−２受容体γ鎖として公知である。
【００５８】
凍結保存：本明細書に使用される「凍結保存」とは、７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）等の低い氷点下の温度まで冷却することにより保存または維持されている細胞または組織を指す。これらの低温度で、細胞死をもたらす生化学的反応を含む、いかなる生物学的活性も、効果的に停止する。
【００５９】
シクロスポリンＡ：土壌真菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｎｉｖｅａによって生成される１１個のアミノ酸の非リボソーム環状ペプチドである免疫抑制化合物。シクロスポリンＡは、器官および組織の移植における移植片拒絶の予防に使用されている。シクロスポリン“ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ”Ａは、“ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ”および“ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ”としても知られている。
【００６０】
肝機能の低下：肝臓の健康または機能を測定する多くのパラメータのうちのいずれか１つの異常変化。肝機能の低下はまた、本明細書では、「肝機能障害」と称される。肝機能は、肝組織像の検査および肝臓酵素または他のタンパク質の測定等に限定されない、当技術分野で周知のような多くの手段のうちのいずれか１つにより評価することができる。例えば、肝機能障害は、肝臓の壊死、炎症、線維症、酸化的損傷、または異形成で示され得る。一部の例において、肝機能障害は、肝細胞癌等の肝臓癌で示される。肝機能障害を評価するために試験され得る肝臓酵素およびタンパク質の例としては、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。肝機能障害はまた、全身性肝不全をもたらし得る。肝機能を試験するための手順は、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）およびＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１９２８−１１９３３，１９９９）により教示されるもの等、当技術分野で周知である。
【００６１】
欠損：本明細書で用いる場合、「Ｆａｈ欠損」または「Ｆａｈについて欠損型（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｆａｈ）」は、Ｆａｈに、Ｆａｈ ｍＲＮＡの発現および／または機能性ＦＡＨタンパク質の実質的な減少または非存在をもたらす変異を含むマウスなどの動物をいう。本明細書で用いる場合、機能性ＦＡＨタンパク質の「発現低下」という用語は、完全な発現低下をいうだけでなく、機能性ＦＡＨタンパク質の発現の実質的な減少（約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の減少など）も含む。一実施形態において、Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子にホモ接合型欠失などのホモ接合型破壊を含むものである。破壊としては、例えば、挿入、欠失、１つ以上の点変異、またはその任意の組合せが挙げられる。一例として、ホモ接合型欠失は、Ｆａｈのエキソン５におけるものである。別の実施形態では、Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子に１つ以上の点変異を含むものである。適当なＦａｈ点変異の例は、当該技術分野において知られている（例えば、Ａｐｏｎｔｅら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１を参照のこと）。同様に、「ＩＬ−１Ｒ欠損」または「ＩＬ−１Ｒについて欠損型」は、ＩＬ−１Ｒに、ＩＬ−１Ｒ ｍＲＮＡの発現および／または機能性ＩＬ−１Ｒタンパク質の実質的な減少または非存在をもたらす変異を含むマウスなどの動物をいう。ＩＬ−１Ｒノックアウトマウスはこれまでに報告されており（例えば、Ｎｏｒｍａｎら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２３（２）：１６３−１６９，１９９６；Ｇｌａｃｃｕｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３３６４−３３７１，１９９７を参照のこと）、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）などから市販されている。また、Ｒａｇ１欠損、Ｒａｇ２欠損、およびＩｌ２ｒｇ欠損は、それぞれ、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇに、ｍＲＮＡの発現または機能性のタンパク質の産生の実質的な減少または非存在をもたらす変異を含む動物をいう。Ｒａｇ１、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇノックアウトマウスはこれまでに報告されており、市販されている。
【００６２】
減損する：減じるまたは除去すること。本明細書に使用される「マクロファージ減損」とは、動物におけるマクロファージを消去する、または除去する、または減じる、または殺滅するプロセスを指す。マクロファージが減損している動物は、必ずしもマクロファージが完全に欠如しているとは限らないが、少なくともマクロファージの数または活性の減少を示す。一実施形態において、マクロファージ減損は、機能的マクロファージの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％の減少をもたらす。
【００６３】
破壊：本明細書で用いる場合、遺伝子の「破壊」は、任意の挿入、欠失もしくは点変異またはその任意の組合せをいう。一部の実施形態では、破壊は、ｍＲＮＡおよび／または機能性のタンパク質の一部または完全な発現低下をもたらすものである。
【００６４】
胚性幹（ＥＳ）細胞：発生中の胚盤胞の内細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は多能性細胞である（体内に存在するあらゆる細胞（骨、筋肉、脳の細胞など）になり得ることを意味する）。マウスＥＳ細胞の作製方法は、米国特許第５，６７０，３７２号をみるとよい。ヒトＥＳ細胞の作製方法は、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／７００２１およびＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／２７９９５をみるとよい。また、本明細書では人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）も想定され、これは、非多能性細胞（成人の体細胞など）から、特定の遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｋｌｆ４、および／またはｃ−Ｍｙｃ）の発現を誘導することにより、人工的に誘導された型の多能性幹細胞である（Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１−８７２，２００７）。これまでに、マウス（Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ４４８（７１５１）：３１３−３１７，２００７）、ヒト（Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１−８７２，２００７）、ラット（Ｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（１）：１６−１９，２００９）、サル（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３（６）：５８７−５９０，２００８）およびブタ（Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ ２１，２００９）のｉＰＳ細胞が報告されている。
【００６５】
移植する：動物に細胞または組織を移植すること。本明細書に使用される、レシピエントマウスにおいて、ヒト肝細胞の移植とは、注入後、ヒト肝細胞がレシピエントマウスに移植されるプロセスを指す。移植されたヒト肝細胞は、レシピエントマウスにおいて、増大することができる。本明細書に記載される、「実質的な移植」とは、肝臓において、少なくとも約１％の肝細胞がヒト肝細胞である、レシピエントマウスを指す。「高度に移植された」マウスは、肝細胞の少なくとも約６０％がヒト肝細胞である、肝臓を有するマウスである。しかしながら、移植効率はさらに高くなり得、マウス肝臓において、例えば、肝細胞の少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がヒト肝細胞である。
【００６６】
増大させる：量を増加させること。本明細書に使用される、ヒト肝細胞を「増大させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」とは、ヒト肝細胞の数が増加するような、細胞分裂を生じることが可能なプロセスを指す。本明細書に記載される、ヒト肝細胞は、レシピエントマウスにおいて、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、または少なくとも約８週間、または少なくとも約１２週間、または少なくとも約１６週間、または少なくとも約２０週間、または少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間、増大可能である。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長約６ヶ月まで増大可能である。他の実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長約８ヶ月、約１０ヶ月、または約１２ヶ月まで増大可能である。増大から結果として生じるヒト肝細胞の数は、変化し得る。一実施形態において、増大は、少なくとも１，０００万、または少なくとも２，０００万、または少なくとも３，０００万、または少なくとも４，０００万、または少なくとも５，０００万の肝細胞をもたらす。１００万の肝細胞が最初に注入され、約１０％移植されると仮定すると、肝細胞の増大は、約１０倍〜約５００倍の範囲であり得る。一部の実施形態において、レシピエントマウスにおいて、ヒト肝細胞の増大は、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１５０倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも２５０倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍の増加をもたらす。
【００６７】
ＦＫ５０６：ＦＫ５０６は、タクロリムスまたはフジマイシンとしても知られている免疫抑制薬である。ＦＫ５０６は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓを含む日本の土壌試料の醗酵ブロス中で最初に見出された２３員マクロライドラクトンである。この化合物は、多くの場合、患者の免疫機構の活性を低減させるため、および臓器拒絶のリスクを低下させるために、同種異系臓器移植後に使用される。ＦＫ５０６は、Ｔ細胞およびインターロイキン−２の活性を低下させる。また、これは、重度のアトピー性皮膚炎（湿疹）、骨髄移植後の重度の難治性ブドウ膜炎、および皮膚の白斑状態の処置における局所用調製物においても使用される。
【００６８】
フルダラビン：ＤＮＡ合成を阻害するプリン類似体。フルダラビンは、多くの場合、種々の血液系の悪性疾患の処置のための化学療法薬として使用される。
【００６９】
ＦＲＧマウス：フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子において、ホモ接合体欠失を有する、変異体マウス。また、本明細書では、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−と称される。本明細書に使用される、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子においてホモ接合体欠失は、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。
【００７０】
Ｆ^ｐｍＲＧマウス：リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子のホモ接合体欠失、ならびにフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）のホモ接合体点変異を有する、変異体マウス。Ｆ^ｐｍＲＧマウスのＦａｈ遺伝子の点変異は、ｍＲＮＡにおいて、エクソン７のミススプライシングおよび喪失をもたらす（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１）。また、本明細書では、Ｆａｈ^ｐｍ／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−と称される。本明細書に使用される、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇ遺伝子のホモ接合体欠失は、機能的ＲＡＧ−２およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、該突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。さらに、Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体の点変異を有するマウスは、機能的ＦＡＨタンパク質を発現しない。
【００７１】
フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）：チロシン異化の最終ステップに触媒作用を及ぼす代謝酵素。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）。該Ｆａｈ遺伝子の点変異はまた、肝不全および出生後の致死を生じることも示している（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１）。Ｆａｈについて欠損型であるヒトは、遺伝性チロシン血症１型（ＨＴ１）の肝臓疾患を発症し、肝不全を発症する。Ｆａｈ欠損により、強力な酸化剤であるフマリルアセト酢酸の蓄積がもたらされ、これにより、最終的に、Ｆａｈについて欠損型である肝細胞の細胞死がもたらされる。したがって、Ｆａｈ欠損動物では、ヒトなどの他の種に由来する肝細胞で再生息が行なわれ得る。
【００７２】
漸減させる：本明細書に使用される、ＮＴＢＣの用量を「漸減する」とは、数日にわたるような時間とともに、Ｆａｈ欠損マウスに投与されるＮＴＢＣの用量を漸減するプロセスを指す。一実施形態において、該ＮＴＢＣ用量は、約６日間にわたり、漸減し、該用量は、約１週間後、ＮＴＢＣがもはや投与されなくなるように、約１または２日間間隔で減少する。ＮＴＢＣの漸減は、短期間または長期間にわたり行うことができ、用量の減少の間の時間間隔もまた、短くする、または長くすることができる。
【００７３】
肝臓病原体：細菌性、ウイルス性または寄生虫性の病原体などの、肝臓の細胞に感染する任意の病原体をいう。一部の実施形態では、肝臓病原体は、ＨＢＶまたはＨＣＶなどの「肝指向性ウイルス」（肝臓を標的とするウイルス）である。
【００７４】
肝細胞癌腫（ＨＣＣ）：ＨＣＣは、ウイルス性肝炎、肝臓毒または肝硬変に起因する肝臓の炎症を有する患者において典型的に発生する肝臓の原発性悪性腫瘍である。
【００７５】
肝細胞：肝臓の細胞質塊のうちの７０〜８０％まで構成する細胞型。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質保存、および炭水化物の形質転換、コレステロール、胆汁塩、およびホスホリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾、および排出に関与する。該肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌も引き起こす。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子のプロトロンビン基を製造し、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、相補体、および糖タンパク質の合成のための主部位である。さらに、肝細胞は、薬物および殺虫剤のような外因性化合物、およびステロイドのような内因性化合物を代謝する、解毒する、および不活性化する能力を有する。
【００７６】
遺伝性チロシン血症１型（ＨＴ１）：チロシン血症は、体内でアミノ酸チロシンが有効に分解され得ない代謝異常であり、通常、先天性である。ＨＴ１は、この障害の最も重度の形態であり、ヒト染色体番号１５にみられる遺伝子Ｆａｈにコードされた酵素フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）の不足によって引き起こされる。ＦＡＨは、チロシンの分解に必要な一連の５つの酵素の最後のものである。ＨＴ１の症状は、通常、寿命の最初の数ヶ月に現れ、期待される速度で体重が増加しない、および身長が伸びない（成長障害）、下痢、嘔吐、皮膚および白眼の黄色化（黄疸）、キャベツ様臭、ならびに出血傾向（特に、鼻血）の増大が挙げられる。ＨＴ１により、肝不全および腎不全、神経系に影響を及ぼす問題、ならびに肝臓癌のリスクの増大がもたらされることがあり得る。
【００７７】
ヘテロ接合型：対応する染色体の遺伝子座に相違する対立遺伝子を有すること。例えば、特定の遺伝子変異についてヘテロ接合型の動物は、遺伝子の一方の対立遺伝子に変異を有するが他方には有しない。
【００７８】
ホモ接合型：１つ以上の遺伝子座に同一の対立遺伝子を有すること。本明細書で用いる場合、「破壊についてホモ接合型」は、遺伝子の両方の対立遺伝子に同一の破壊（挿入、欠失または点変異など）を有する生物体をいう。
【００７９】
免疫不全：免疫系のうちの少なくとも１つの不可欠な機能を欠如すること。本明細書に使用される、「免疫不全」マウスとは、免疫系の特異成分を欠如する、または免疫系の特異成分の機能を欠如するマウスである。一実施形態において、免疫不全マウスは、機能的Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞を欠如する。別の実施形態において、免疫不全マウスは、さらに、マクロファージを欠如する。一部の実施形態では、「免疫不全マウス」は、以下の遺伝子改変：Ｒａｇ１^−／−、Ｒａｇ２^−／−、Ｉｌ２ｒｇ^−／−、ＳＣＩＤ、ＮＯＤおよびヌードの１つ以上を含むものである。免疫不全マウス系統は、当該技術分野においてよく知られており、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）またはＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）などから市販されている。一部の実施形態では、免疫不全マウスは、１種類以上の免疫抑制薬が投与されたマウスである。
【００８０】
免疫抑制薬：免疫機構の１つ以上の態様（体液性もしくは細胞性の免疫機構の成分、または補体系など）の機能または活性を低下させる任意の化合物。本開示の具体的な実施形態では、免疫抑制薬は、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンもしくはアザチオプリン、またはその組合せである。
【００８１】
既知の免疫抑制薬としては、限定されないが：（１）代謝拮抗薬、例えば、プリン合成阻害薬（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、ピリミジン合成阻害薬（例えば、レフルノミドおよびテリフルノミド）および葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキサート）；（２）マクロライド系、例えば、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡおよびピメクロリムス；（３）ＴＮＦ−α阻害薬、例えば、サリドマイドおよびレナリドマイド；（４）ＩＬ−１受容体拮抗薬、例えば、アナキンラ；（５）哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬、例えば、ラパマイシン（シロリムス）、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスＡ９；（６）コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン；ならびに（７）いくつかの細胞標的または血清標的の任意の１つに対する抗体が挙げられる。
【００８２】
例示的な細胞標的およびそのそれぞれの阻害薬化合物としては、限定されないが、補体成分５（例えば、エクリズマブ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、アフェリモマブおよびゴリムマブ）；ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ）；ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）；ＢＡＹＸ（例えば、ネレリモマブ）；インターフェロン（例えば、ファラリモマブ）；ＩＬ−６（例えば、エルシリモマブ）；ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（例えば、レブリキズマブおよびウステキヌマブ）；ＣＤ３（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ）；ＣＤ４（例えば、クレノリキシマブ、ケリキシマブおよびザノリムマブ）；ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ）；ＣＤ１８（例えば、エルリズマブ）；ＣＤ２０（例えば、アフツズマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ）；ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）；ＣＤ４０（例えば、テネリキシマブ、トラリズマブ）；ＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチン（例えば、アセリズマブ）；ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ）；ＣＤ１４７／バシジン（例えば、ガビリモマブ）；ＣＤ１５４（例えば、ルプリズマブ）；ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）；ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）；ＣＡＴ（例えば、ベルチリムマブ、レルデリムマブ、メテリムマブ）；インテグリン（例えば、ナタリズマブ）；ＩＬ−６受容体（例えば、トシリズマブ）；ＬＦＡ−１（例えば、オジュリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ））；ならびにＩＬ−２受容体／ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ）が挙げられる。
【００８３】
他の免疫抑制（ｉｍｍｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）剤としては、ゾリモマブアリトックス、アトロリムマブ（ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、セデリズマブ、ドルリキシズマブ（ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、マスリモマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトックス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベパリモマブ（ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン；ＣＴＬＡ−４阻害薬（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）；アフリベルセプト；アレファセプト；リロナセプト；ならびにＴＮＦ阻害薬（例えば、エタネルセプト）が挙げられる。
【００８４】
免疫抑制：免疫機構の活性または機能を低下させる作用をいう。免疫抑制は、免疫抑制化合物の投与によってなされるものであってもよく、疾患または障害の効果（例えば、ＨＩＶ感染に起因する、または遺伝的欠陥による免疫抑制）であってもよい。
【００８５】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）：用語「ＩＬ−１」は、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方を含む。ＩＬ−１αは、種々の免疫応答、炎症プロセスおよび造血に関与している多面性サイトカインである。ＩＬ−１αは、単球およびマクロファージによってプロタンパク質として産生され、該プロタンパク質は、細胞の損傷に応答してタンパク質分解的にプロセッシングされ、放出され、したがって、アポトーシスを誘導する。ＩＬ−１βは、活性化型マクロファージによってプロタンパク質として産生され、該プロタンパク質は、カスパーゼ１により、その活性形態にタンパク質分解的にプロセッシングされる。ＩＬ−１βは、炎症応答の重要なメディエータであり、さまざまな細胞活動（例えば、細胞増殖、分化およびアポトーシス）に関与している。
【００８６】
人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）：非多能性細胞、典型的には成人の体細胞から、特定の遺伝子の発現を誘導することにより、人工的に誘導された型の多能性幹細胞。ＩＰＳＣは、哺乳動物などの任意の生物体から誘導され得る。一部の実施形態では、ＩＰＳＣは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類またはヒトから作製される。ヒト由来ＩＰＳＣは例示である。
【００８７】
ＩＰＳＣは、ＥＳ細胞と、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍化時間、胚様体の形成、奇形腫の形成、生存可能なキメラの形成、ならびに潜在能力および分化可能性などの多くの点で類似している。ＩＰＳＣの作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ＩＰＳＣは、典型的には、非多能性細胞（成人の線維芽細胞など）への特定の幹細胞関連遺伝子（Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２など）のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスベクターによってなされ得る。例えば、細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃで、レトロウイルス系を用いて、またはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で、レンチウイルス系を用いてトランスフェクトさせることができる。３〜４週間後、少数のトランスフェクト細胞が、形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似した状態になり始め、典型的には、形態学的選択、倍化時間によって、またはレポーター遺伝子および抗生物質での選択によって単離される。一例では、成人ヒト細胞由来のＩＰＳＣを、Ｙｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５４）：１２２４，２００７）またはＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１−７２，２００７）の方法によって作製する。ＩＰＳＣは、ｉＰＳ細胞としても知られている。
【００８８】
感染量（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌｏａｄ）：被験体における、または被験体由来の試料中の特定の病原体の量をいう。感染量は、当該技術分野において知られたいくつかの方法の任意の１つを用いて測定され得る。選択される方法は、検出対象の病原体の型および病原体の検出に利用可能な試薬に応じて異なる。また、感染量は、例えば、病原体の力価を測定することによっても測定され得、その方法は検出対象の病原体に応じて異なる。例えば、一部のウイルスの力価は、プラークアッセイを行なうことにより定量され得る。一部の例では、感染量は、試料中の病原体特異的抗原の量を定量することにより測定される。他の例では、感染量は、試料中の病原体特異的核酸分子の量を定量することにより測定される。定量は、数値を決定することを含むものであるか、相対値であってもよい。
【００８９】
インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）：インターロイキン１受容体ファミリーに属するサイトカイン受容体。このタンパク質は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびインターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）の受容体である。これは、多くのサイトカイン誘導性の免疫応答および炎症応答に関与している重要なメディエータである。用語「ＩＬ−１Ｒ」は、一般的には、Ｉ型ＩＬ−１ＲとＩＩ型ＩＬ−１Ｒの両方を含む。本発明の開示との関連において、「ＩＬ−１Ｒ」はＩ型ＩＬ−１Ｒをいう。
【００９０】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）：ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質に結合し、ＩＬ−１Ｒによって媒介される活性化を阻害する分子。また、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）は、ＩＬ−１と同じ細胞表面上の受容体に結合するＩＬ−１サイトカインファミリーの構成員である特定のタンパク質の名称である。ＩＬ−１ＲＡタンパク質は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの活性を阻害し、さまざまなＩＬ−１関連免疫応答および炎症応答をモジュレートする。また、ＩＬ−１ＲＡは、ＩＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ−１ｒａ３およびＩＬ１ＲＮとしても知られている。
【００９１】
インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡＰ）：この遺伝子は、ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質をコードしている。ＩＬ−１は、感染、組織損傷またはストレスのときに、細胞膜でＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１ＲＡＰと複合体を形成することにより、急性期の炎症性促進性タンパク質の合成を誘導する。ＩＬ−１ＲＡＰの選択的スプライシングにより、２種類の異なるアイソフォーム（一方は膜結合型、一方は可溶性）をコードする２種類の転写物バリアントがもたらされる。また、ＩＬ−１ＲＡＰは、ＩＬ１Ｒ３、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ１ＲＡＰとしても知られている。
【００９２】
単離された：「単離された」生物学的成分、例えば、核酸、タンパク質（抗体を含む）または小器官は、該成分が天然に存在している環境中（細胞など）の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに小器官から実質的に分離された、または精製されたものである。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を包含する。該用語は、宿主細胞内での組換え発現ならびに化学合成された核酸によって調製される核酸およびタンパク質も包含する。
【００９３】
「単離された肝細胞」は、臓器ドナーなどの特定の供給源から得られた肝細胞をいう。一部の実施形態では、「単離された肝細胞」は、ドナーの身体から取り出された肝細胞である。一部の実施形態では、「単離された肝細胞」は、懸濁状態の肝細胞、または組織片に含まれた肝細胞である。具体的な例では、単離された肝細胞は、他の細胞型から実質的に分離もしくは精製されたもの、または他の組織型（脂肪組織もしくは線維性組織など）から精製されたものである。
【００９４】
マクロファージ：単球と呼ばれる特定の白血球から由来する組織内の細胞。単球およびマクロファージは、食細胞であり、脊椎動物の非特異的防御（または先天性免疫）、ならびに特異的防御（または細胞性免疫）の両方において作用する。これらの役割は、細胞残屑、および固定細胞あるいは移動細胞としての病原体を食菌する（飲み込んだ後、消化する）こと、および病原体に対して反応するために、リンパ球および他の免疫細胞を刺激することである。
【００９５】
哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬：ｍＴＯＲの発現または活性を阻害する分子。ｍＴＯＲ阻害薬としては、限定されないが、小分子、抗体、ペプチドおよび核酸阻害薬が挙げられる。例えば、ｍＴＯＲ阻害薬は、ｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害する分子、またはリガンドへのｍＴＯＲの結合を阻害する分子であり得る。また、ｍＴＯＲ阻害薬には、ｍＴＯＲの発現を下方調節する分子も含まれる。いくつかのｍＴＯＲ阻害薬が当該技術分野において知られている（例えば、ラパマイシン（シロリムス））。
【００９６】
ミコフェノレート：同種異系移植片の拒絶を抑制するために典型的に使用される免疫抑制薬。この薬物は、一般的に、経口または静脈内で投与される。ミコフェノレートは、真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍ由来のものである。そのプロドラッグ形態であるミコフェノレートモフェチルは、肝臓で、活性部分のミコフェノール酸に代謝される。これは、Ｂリンパ球とＴリンパ球の増殖に使用されるプリン合成のデノボ経路においてグアニン一リン酸（ｇｕａｎｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の合成速度を制御する酵素であるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ミコフェノール酸は、商標名ＣｅｌｌＣｅｐｔ^ＴＭ（ミコフェノレートモフェチル；Ｒｏｃｈｅ）およびＭｙｆｏｒｔｉｃ^ＴＭ（ミコフェノール酸ナトリウム；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）で一般に市販されている。
【００９７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：内因性免疫系の主成分を構成する細胞傷害性リンパ球型。ＮＫ細胞は、腫瘍およびウイルス感染した細胞の両方の宿主の拒絶反応において大きな役割を果たす。
【００９８】
非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）マウス：自己免疫性のインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の偶発的発症に対する遺伝的素因を有するマウスをいう。ＩＤＤＭに対する易罹患性は多遺伝子性であり、環境が遺伝子浸透度に対して強く影響する。ＮＯＤ系統は、塩野義製薬の油日ラボラトリーズ（日本）で開発された（Ｍａｋｉｎｏら，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ）ｍｏｕｓｅ，” Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，第２５〜３２頁，１９８５；Ｍａｋｉｎｏら，Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．２９：１−８，１９８０）。
【００９９】
ＮＴＢＣ（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン）：４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の阻害薬。ＨＰＰＤは、チロシンの異化の第２段階である４−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸体への変換を触媒する。ＮＴＢＣでの処理により、この段階でチロシン異化経路がブロックされ、Ｆａｈ欠損ヒトおよび動物において蓄積される特徴的代謝産物であるスクシニルアセトンの蓄積が抑制される。
【０１００】
ヌードマウス：胸腺の衰退または非存在を引き起こし、Ｔ細胞の数が大きく減少することによる免疫機構の抑止をもたらす遺伝子変異を有するマウス系統をいう。該マウスの表現型の外観は体毛がないことである。ヌードマウスは、フォークヘッドボックスＮ１（Ｆｏｘｎ１）遺伝子に偶発欠失を有する。
【０１０１】
プレドニゾン：有効な免疫抑制薬である合成コルチコステロイド。これは、多くの場合、特定の炎症性疾患、自己免疫疾患および癌を処置するため、ならびに臓器移植拒絶を処置または予防するために使用される。プレドニゾンは、通常、経口摂取されるが、筋肉内注射または静脈内注射によって送達してもよい。これは、肝臓でプレドニゾロンに変換されるプロドラッグであり、プレドニゾロンは活性薬物であり、かつステロイドでもある。
【０１０２】
ラパマイシン：免疫抑制特性および抗増殖特性を有することが知られている化合物。ラパマイシンは、シロリムスとしても知られており、最初に、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの産生物として見出されたマクロライドである。ラパマイシンはｍＴＯＲに結合してその活性を阻害する。
【０１０３】
レシピエント：本明細書に使用される、「レシピエントマウス」とは、本明細書に記載される単離されたヒト肝細胞を注入されているマウスである。一般に、ヒト肝細胞の一部（割合は異なり得る）は、レシピエントマウスに移植する。一実施形態において、該レシピエントマウスは、Ｆａｈがさらに欠損している免疫不全マウスである。別の実施形態において、該レシピエントマウスは、Ｆａｈがさらに欠損しているＲａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。別の実施形態において、該レシピエントマウスはＦＲＧマウスである。別の実施形態において、該レシピエントマウスは、Ｆ^ｐｍＲＧマウスである。他の実施形態では、レシピエントマウスは、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストで処置されたＦＲＧマウス、またはＩＬ−１Ｒについてさらに欠損型であるＦＲＧマウスである。
【０１０４】
リコンビナーゼ活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）：免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性化に関与している遺伝子。ＲＡＧ１タンパク質はＤＮＡ基質の認識に関与しているが、安定な結合および切断活性にはＲＡＧ２も必要とされる。
【０１０５】
リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座とＴ細胞受容体遺伝子座の組み換えに関与する遺伝子。Ｒａｇ２遺伝子が欠損する動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えを行うことができず、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の完全喪失をもたらす（Ｓｈｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７，１９９２）。
【０１０６】
連続移植：一次マウスにおいて増大された肝細胞が、採取され、さらなる増大のために二次マウスに注入等により移植される、生体内でヒト肝細胞を増大させるためのプロセス。連続移植は、三次、または四次、または追加次のマウスをさらに含むことができる（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５１： １０７８−９１０７， １９９７）。
【０１０７】
重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス：Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えが行なわれ得ず、したがって、機能性のＴ細胞およびＢ細胞が欠如しているマウス系統をいう。また、ＳＣＩＤマウスは、補体系のいくつかの成分を活性化させる能力が障害されている。ＳＣＩＤマウスは、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ変異についてホモ接合型である。
【０１０８】
幹細胞：不変の娘細胞を生成する（自己再増殖；親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を生成する細胞分裂）、および特殊化細胞型を形成する（潜在力）ための特異な能力を有する細胞。幹細胞としては、胚幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）、および非制限体幹細胞（ＵＳＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。生体内の幹細胞の役割は、動物の正常な生活中、破壊される細胞を置換することである。通常、幹細胞は、無制限に分裂することができる。分裂後、該幹細胞は、幹細胞として残る、または前駆細胞になる、または末端分化に移り得る。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の十分に分化した機能細胞を作製することができる細胞である。通常、前駆細胞は、分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞のままであり得る、または末端分化に移り得る。一実施形態において、該幹細胞は、肝細胞を形成する。
【０１０９】
Ｔ細胞：細胞性免疫において中心的役割を果たす白血球型、またはリンパ球型。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるＢ細胞およびＮＫ細胞の細胞表面上にある特別受容体の存在により、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のようなリンパ球の他型と区別される。胸腺は、通常、Ｔ細胞発達のための主要臓器であると考えられる。
【０１１０】
治療用薬剤：被験体に適正に投与された場合、所望の治療効果または予防効果を誘導し得る化合物、小分子または他の組成物（アンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害薬、ホルモン、ケモカインまたはサイトカインなど）。本明細書で用いる場合、「候補薬剤」は、特定の疾患または障害に対する治療用薬剤として機能を果し得るかどうかを調べるためのスクリーニングに選択される化合物である。
【０１１１】
力価：本発明の開示との関連において、力価は、試料中の特定の病原体量をいう。
【０１１２】
毒素：本発明の開示との関連において、「毒素」は、任意の有毒な物質、例えば、任意の化学物質系毒素または生物系毒素をいう。
【０１１３】
導入遺伝子：細胞または生命体のゲノムに導入される外因性核酸配列。
【０１１４】
トランスジェニック動物：動物の細胞の一部において染色体外要素として存在するか、または動物の生殖細胞系ＤＮＡに（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列に）安定的に組み込まれている、非内因性（異種）核酸配列を有する、通常、哺乳類である、ヒト以外の動物。異種核酸は、当技術分野で周知のような方法に従って、例えば、宿主動物の胚または胚幹細胞の遺伝子操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。「導入遺伝子」は、このような異種核酸、例えば、（例えば「ノックイン」トランスジェニック動物の作製用の）発現コンストラクトの形状をした異種核酸、または標的遺伝子内またはその近傍に挿入されて、（例えば「ノックアウト」トランスジェニック動物の作製用の）標的遺伝子の発現低下を生じる異種核酸を意味する。遺伝子の「ノックアウト」とは、標的遺伝子の機能低下を生じる遺伝子の配列の変化を意味し、好ましくは、このような標的遺伝子の発現は検出されないか、または有意ではない。トランスジェニックのノックアウト動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合のノックアウト、または標的遺伝子についてホモ接合のノックアウトを含むことができる。「ノックアウト」はまた、条件的なノックアウトも含み、標的遺伝子の変化が、例えば、標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を曝露した際、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）を導入した際、または標的遺伝子の変化を出生後に指令する他の方法で生じる場合がある。
【０１１５】
移植する、または移植すること：ある被験体の臓器、組織もしくは細胞を別の被験体に、または同じ被験体の別の領域に移植するプロセスをいう。
【０１１６】
ウロキナーゼ：また、ウロキナーゼ型プラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）と呼ばれる、ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼである。ウロキナーゼは、本来、人尿から分離されたが、血流および細胞外マトリックスのような、いくつかの生理学的位置に存在する。主要な生理学的基質は、プラスミノーゲンであり、これはセリンプロテアーゼプラスミンの不活性な酵素前駆体である。プラスミンの活性化は、生理学的環境によって、血栓溶解または細胞外マトリックスの分解に関与するタンパク質分解カスケードを誘発する。本明細書に提供される方法の一実施形態において、ウロキナーゼは、肝細胞注入前、レシピエントマウスに投与される。一部の実施形態において、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照）。
【０１１７】
ベクター：宿主細胞内でのベクターの複製能力および／または組込み能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターには、複製起点などの、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列が含まれ得る。また、ベクターには、１種類以上の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝要素が含まれ得る。組込みベクターは、それ自体が宿主の核酸内に組み込まれ得るものである。発現ベクターは、挿入される遺伝子（１つまたは複数）の転写および翻訳を可能にするのに必要な調節配列を含むベクターである。本明細書に記載の一実施形態において、ベクターは、ウロキナーゼ（ヒトウロキナーゼなど）をコードする配列を含むものである。一実施形態において、ベクターはプラスミドベクターである。別の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターである。
【０１１８】
別途説明されない限り、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味を持つ。文脈で特に指定しない限り、単数形、「一つの（ａ）」「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数形の指示物を含む。同様に、文脈で特に指定しない限り、「または（ｏｒ）」という語は、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」とは、ＡまたはＢ、あるいはＡおよびＢの両方を含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して規定したすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量値は概算値であり、説明のために提供するものであることがさらに理解されるべきである。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料は以下に説明する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。
【０１１９】
ＩＩＩ． いくつかの実施形態の概論
本明細書において、インビボでの肝細胞のロバストな増大方法を提供する。本明細書ではヒト肝細胞を例示しているが、他の種に由来する肝細胞、例えば、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタならびに非ヒト霊長類（ヒヒ、チンパンジーおよびアカゲザルなど）に由来する肝細胞も増大させることができる。該方法は、単離されたヒト肝細胞を、チロシン異化酵素であるフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（Ｆａｈ）の発現について欠損型である免疫不全マウスに移植する工程であって、ここで、（ｉ）該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または（ｉｉ）該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される工程を含む（本明細書において「レシピエントマウス」という）。
【０１２０】
ヒト肝細胞は、レシピエントマウスにおいて、ヒト肝細胞の増大が可能であるのに充分な期間増大する。増大の厳密な期間は、常套的な実験手法を用いて経験的に決定され得る。一部の実施形態では、ヒト肝細胞を６ヶ月間まで、８ヶ月間まで、１０ヶ月間までまたは１２ヶ月間まで増大させる。他の実施形態では、ヒト肝細胞を少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２４週間または少なくとも約２８週間増大させる。肝細胞の増大の程度は異なり得る。一部の実施形態では、レシピエントマウスでのヒト肝細胞の増大により、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍の増加がもたらされる。
【０１２１】
一部の実施形態では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスがＦａｈ遺伝子にホモ接合型破壊を含み、該破壊は、機能性ＦＡＨタンパク質の発現低下をもたらす。機能性ＦＡＨタンパク質の発現低下は完全な発現低下である必要はない。一部の例では、機能性ＦＡＨタンパク質の発現低下は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の発現低下である。Ｆａｈ遺伝子の破壊としては、例えば、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失もしくは点変異、または任意のその複数の存在またはその組合せが挙げられる。具体的な例では、該破壊は、Ｆａｈ遺伝子に欠失を含むものである。
【０１２２】
一部の実施形態では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、機能性のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が欠乏している。該マウスの免疫不全は、遺伝子改変、免疫抑制、またはその組合せによるものであり得る。
【０１２３】
遺伝子改変により免疫不全である免疫不全マウスは、該マウスが体液性免疫または細胞性免疫の少なくとも一方の態様において障害されるような任意の遺伝子改変または遺伝子改変の組合せを含むものであり得る。例えば、免疫不全マウスは、例えば、Ｒａｇ１欠損、Ｒａｇ２欠損、Ｉｌ２ｒｇ欠損、ＳＣＩＤ変異、ＮＯＤ遺伝子型またはヌード変異から選択される１つ以上の遺伝子改変を有するものであり得る。
【０１２４】
一部の実施形態では、免疫不全マウスはＲａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。他の実施形態では、免疫不全マウスはＲａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。一部の例では、免疫不全マウスは、ＮＯＤ／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスまたはＮＯＤ／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスは、Ｆａｈのホモ接合型欠失を含むものである。他の実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスは、Ｆａｈに、該タンパク質の機能および／または産生が実質的に低減されるような１つ以上の点変異を含むものである。したがって、一部の実施形態では、該マウスは、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、ＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、またはＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。具体的な例では、該マウスは、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（ＦＲＧ）マウスである。他の実施形態では、該マウスは、Ｆａｈ^ｐｍ／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（Ｆ^ｐｍＲＧ）マウスである。
【０１２５】
また、該マウスの免疫不全は免疫抑制によるものであってもよい。一般的に、免疫抑制は、マウスに１種類以上の免疫抑制薬を投与し、それにより免疫不全を誘導することによってなされる。免疫抑制薬または免疫抑制薬の組合せは、当該技術分野において知られた、または本明細書に開示した（例えば、用語および方法を参照のこと）任意の免疫抑制薬から選択され得る。本明細書における使用を想定される免疫抑制薬には、免疫機構の１つ以上の態様（体液性の系、細胞性の系または補体系など）の活性または機能を低下させる任意の化合物が包含される。
【０１２６】
一部の実施形態では、１種類以上の免疫抑制薬は、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンもしくはアザチオプリン、またはその組合せから選択される。
【０１２７】
免疫抑制薬はマウスに、任意の適当な送達経路を用いて、例えば、経口投与または腹腔内注射によって投与され得る。具体的な例では、免疫抑制薬はＦＫ５０６である。一部の場合では、ＦＫ５０６は飲料水にて経口投与される。好適な用量は、当該技術分野において知られており、当業者によって決定され得る。例えば、ＦＫ５０６を飲料水にて７．５ｍｇ／Ｌの用量で連続的に与えると、１μｇ／ｇ／日のおおよその用量がもたらされ得る。しかしながら、他の適当な用量として、約２．０〜約１５ｍｇ／Ｌ（約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０．０、約１１．０、約１２．０、約１３．０、約１４．０または約１５．０ｍｇ／Ｌなど）が挙げられる。
【０１２８】
一部の例では、免疫抑制薬はシクロスポリンＡである。シクロスポリンＡは、例えば、飲料水にて約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日などの濃度で投与され得る。一部の場合では、シクロスポリンＡは、飲料水にて約３０〜約７０ｍｇ／ｋｇ／日（約５０ｍｇ／ｋｇ／日など）の濃度で投与される。
【０１２９】
一部の例では、免疫抑制薬はフルダラビンである。一般的に、フルダラビンは腹腔内注射によって毎日投与される。しかしながら、投与を、より高頻度またはより低頻度（１日２回、１日おき、または毎週など）で行なってもよい。フルダラビンの例示的な用量としては、１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられる。具体的な例では、該用量は約１５０〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日（約２００ｍｇ／ｋｇ／日など）である。
【０１３０】
他の実施形態では、該マウスに、免疫抑制薬の組合せ、例えば、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、アザチオプリン、ミコフェノレートおよびプレドニゾンのうちの２種類以上が投与される。一部の例では、免疫抑制薬の組合せは、ＦＫ５０６、ミコフェノレートおよびプレドニゾンを含むものである。他の例では、免疫抑制薬の組合せは、シクロスポリンＡ、ミコフェノレートおよびプレドニゾンを含むものである。他の例では、免疫抑制薬の組合せは、ラパマイシン、ミコフェノレートおよびプレドニゾンを含むものである。他の例では、免疫抑制薬の組合せは、アザチオプリン、ＦＫ５０６およびプレドニゾンを含むものである。他の例では、免疫抑制薬の組合せは、アザチオプリン、シクロスポリンＡおよびプレドニゾンを含むものである。他の例では、免疫抑制薬の組合せは、ラパマイシン、アザチオプリンおよびプレドニゾンを含むものである。
【０１３１】
移植効率を改善するため、免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、ＩＬ−１Ｒについてさらに欠損型であるか、またはＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与されるかのいずれかである。マウスがＩＬ−１Ｒの発現について欠損型である一部の実施形態では、該マウスはＩｌ１ｒ１遺伝子の破壊についてホモ接合型であり、該破壊は、機能性ＩＬ−１Ｒタンパク質の発現低下をもたらす。機能性ＩＬ−１Ｒタンパク質の発現低下は完全な発現低下である必要はない。一部の例では、機能性ＩＬ−１Ｒタンパク質の発現低下は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の発現低下である。一部の実施形態では、該破壊は、Ｉｌ１ｒ１遺伝子における挿入、欠失または１つ以上の点変異を含む。一部の例では、該マウスは、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウス、ＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウスまたはＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウスである。
【０１３２】
一部の実施形態では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される。該マウスに投与されるＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒの活性を阻害する任意の化合物（核酸分子、ポリペプチド、抗体または小分子など）であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストはアナキンラである。他の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−１ＲＡ（本明細書に配列番号１８もしくは配列番号２０として示すアミノ酸配列を有するＩＬ−１ＲＡなど）、またはそのバリアントもしくは誘導体である。一部の場合では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、マウスへの肝細胞の移植と同時またはほぼ同時に送達される。肝細胞の注入後、さらなる用量のＩＬ−１Ｒアンタゴニストを投与してもよい。
【０１３３】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、単回用量または反復用量で投与され得る。反復用量が使用される場合、投薬スケジュールは種々であり得る。例えば、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、１時間毎、１日２回、毎日、１日おき、または毎週投与され得る。具体的な例では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは毎日投与される。毎日の投与は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間またはそれより長く行なわれ得る。一例では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは毎日、７日間送達される。別の例では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは毎日、３日間送達される。
【０１３４】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの適切な用量は、使用される化合物の型および投与経路に応じて異なる。一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストはアナキンラである。具体的な例では、アナキンラの総用量は（単回用量として投与されようと、数回の用量に分けて投与されようと）、約０．２、約０．４、約０．６、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０ｍｇである。一部の例では、アナキンラの総用量は約１０〜約２０ｍｇ（約１２〜約１６ｍｇなど）である。具体的な例では、アナキンラの用量は約１４ｍｇである。他の例では、アナキンラの総用量は約０．２〜約６ｍｇ（約０．４〜約２ｍｇ、または約１〜約３ｍｇなど）である。
【０１３５】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストはマウスに、任意の適当な投与経路を用いて投与され得る。一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは注射によって投与される。例えば、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内注射によって投与される。
【０１３６】
本明細書に記載の方法の一実施形態では、肝細胞の注入の前に、Ｆａｈ欠損マウスに、該マウスにおける肝臓疾患の発症を抑止する、遅延させる、または予防する薬剤が投与される。該薬剤は、当該技術分野において、肝臓疾患を抑止することが知られている任意の化合物または組成物であり得る。かかる薬剤の一例（ｏｎ ｓｕｃｈ）は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣは、Ｆａｈ欠損マウスにおける肝臓疾患の発症を調節するために投与される。用量、投薬スケジュールおよび投与方法は、Ｆａｈ欠損マウスにおける肝臓の機能不全を抑制するために、必要に応じて調整され得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、ＮＴＢＣは約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。一実施形態において、ＮＴＢＣは約１．０ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｍｇ／ｋｇ／日（約１．４ｍｇ／ｋｇ／日〜約１．８ｍｇ／ｋｇ／日など）の用量で投与される。一例では、ＮＴＢＣは約１．６ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。一実施形態において、ＮＴＢＣは約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の実施形態では、ＮＴＢＣは約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日（約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日など）の用量で投与される。ＮＴＢＣは、ヒト肝細胞の注入前、および／または肝細胞の注入後に選択された期間、投与され得る。ＮＴＢＣは、肝細胞の増大期間中、必要に応じて、中止してもよく、再投与してもよい。一実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスにＮＴＢＣが、肝細胞の注入前と、肝細胞の注入後の少なくとも約３日間に投与される。別の実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスにＮＴＢＣが、肝細胞の注入前と、肝細胞の注入後の少なくとも約６日間に投与される。一態様において、ＮＴＢＣの用量は、肝細胞の注入後、６日間にわたって徐々に減少させる。
【０１３８】
ＮＴＢＣは、限定されないが、飲料水にて、食品にて、または注射によってなどの任意の適当な手段によって投与され得る。一実施形態において、肝細胞の注入前に飲料水にて投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１〜約８ｍｇ／Ｌ（約１ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌまたは約８ｍｇ／Ｌなど）である。別の実施形態では、肝細胞の注入前に飲料水にて投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１〜約２ｍｇ／Ｌ（約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．２ｍｇ／Ｌ、約１．４ｍｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／Ｌ、約１．８ｍｇ／Ｌまたは約２．０ｍｇ／Ｌなど）である。
【０１３９】
本明細書では、ヒト肝細胞を（注入などによって）免疫不全のＦａｈ欠損マウス（レシピエントマウスとも称する）に移植すること、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストを該マウスに投与すること、およびヒト肝細胞を増大させることを含む、インビボでのヒト肝細胞の増大方法を開示する。一部の実施形態では、該方法は、さらに、増大されたヒト肝細胞を該マウスから収集することを含む。あるいはまた、ヒト肝細胞の増大方法は、ヒト肝細胞を免疫不全のＦａｈ欠損およびＩＬ−１Ｒ欠損マウス（この型のマウスも「レシピエントマウス」と称する）に移植すること、および該ヒト肝細胞を増大させることを含む。一部の実施形態では、この方法は、さらに、増大されたヒト肝細胞を該マウスから収集することを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、レシピエントマウスに移植されるヒト肝細胞は、単離されたヒト肝細胞である。他の実施形態では、該ヒト肝細胞は、肝臓組織の一部として移植される。
【０１４１】
該肝細胞は、当該技術分野において知られた任意の適当な手段を用いて移植され得る。一実施形態では、ヒト肝細胞は、注入などによって、レシピエントマウスの脾臓に移植される。別の実施形態では、増大されたヒト肝細胞は、レシピエントマウスの肝臓から収集される。
【０１４２】
また、生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を提供し、レシピエントマウスは、該ヒト肝細胞の注入前、ウロキナーゼ遺伝子をコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ遺伝子は、ヒトウロキナーゼである。野生型ウロキナーゼは、分泌タンパク質である。したがって、一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３６：１８３−１８８，１９８５）。ヒトウロキナーゼ（分泌型）の配列は、当技術分野で知られており、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＨ００７０７３（１９９３年８月３日受入）、Ｄ１１１４３（１９９６年５月９日受入）、Ａ１８３９７（１９９４年７月２１日受入）、ＢＣ００２７８８（２００３年８月１９日受入）、Ｘ０２７６０（１９９３年４月２１日受入）、ＢＴ００７３９１（２００３年５月１３日受入）、ＮＭ＿００２６５８（２００４年１０月１日受入）、Ｘ７４０３９（１９９４年２月２０日受入）に限定されない。
【０１４３】
一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、非分泌型のウロキナーゼである。例えば、Ｌｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６２１０−６２１４，１９９５）は、ウロキナーゼのカルボキシル末端で小胞体保留シグナルをコード化する配列を挿入することにより、またはｐｒｅ−ｕＰＡシグナルペプチド（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６、Ｓｃｈｕｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１６９６−１７０５，１９９４）をアミノ末端ＲＲ保留シグナルと置換することにより作製された非分泌型のウロキナーゼ、ならびに細胞膜ＩＩタンパク質Ｉｉｐ３３（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６）からスペーサーペプチドにより引き離された膜貫通アンカーを記載する。非分泌型のウロキナーゼはまた、米国特許第５，９８０，８８６号に記載される。
【０１４４】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、マウスへの送達に適している任意の型のベクターであり得、ウロキナーゼ遺伝子を発現することができる。このようなベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む。一実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、ＡＡＶベクターである。ウロキナーゼをコード化するベクターは、当技術分野で知られている任意の適した手段により投与され得る。一実施形態において、該ベクターは、静脈内投与される。一態様において、該ベクターは、後眼窩注射により投与される。ウロキナーゼをコード化するベクターは、該ヒト肝細胞の注入前、いつでも投与され得る。一般に、該ベクターは、ウロキナーゼが十分な時間で発現できるように、投与される。一実施形態において、該ベクターは、肝細胞注入の２４〜４８時間前に投与される。
【０１４５】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書にさらに提供し、該レシピエントマウスは、該ヒト肝細胞の注入前、マクロファージが減損している。一実施形態において、該レシピエントマウスに、マクロファージ減損前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該レシピエントマウスに、マクロファージ減損後、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該マクロファージ減損レシピエントマウスに、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与されない。マクロファージを、化学物質または抗体を用いるような、当技術分野で周知のようないくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて、該レシピエントマウスから減損することができる。例えば、マクロファージを、Ｃ１２ＭＤＰ、またはマクロファージ発達、機能、および／または生存力を変える抗体を含む、有害物質のようなアンタゴニストの投与により減損することができる。アンタゴニストの投与は、周知の技法により行われ、欧州特許第１５５２７４０号に記載されるようなリポソームの使用を含む。クロドロネート含有リポソームはまた、ｖａｎ Ｒｉｊｎら（Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）により記載されるように、マクロファージを減損するために使用することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、免疫不全のＦａｈ欠損マウスに移植されるヒト肝細胞は、単離されたヒト肝細胞である。一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、肝臓組織移植片の一部として移植される。単離されたヒト肝細胞は、いくつかの異なる供給源の任意の１つから得られたものであり得る。一実施形態では、ヒト肝細胞は、臓器ドナーの肝臓から単離されたものである。別の実施形態では、ヒト肝細胞は外科的切除により単離されたものである。別の実施形態では、ヒト肝細胞は、幹細胞（胚性幹細胞など）、ｉＰＳ細胞、間葉由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、成人の多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）始原細胞、非制限体性幹細胞、または組織特異的肝臓幹細胞（これは、肝臓自体、胆嚢、腸もしくは膵臓にみられ得る）から誘導されたものである。別の実施形態では、ヒト肝細胞は、単球または羊膜細胞から誘導されたものであり、したがって、幹細胞または始原細胞をインビトロで得て、肝細胞を作製する。別の実施形態では、ヒト肝細胞が注入前に低温保存されたものである。
【０１４７】
さらに、本明細書では、Ｆａｈ欠損レシピエントマウスにおけるヒト肝細胞の累代移植方法を提供する。該方法は、増大したヒト肝細胞を第１のレシピエントマウスから収集すること、および該肝細胞を、二次、三次、四次またはそれ以上の高次のレシピエントマウス（Ｏｖｅｒｔｕｒｆら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１０７８−９１０７，１９９７）において、さらに増大させることを含む。ヒト肝細胞はマウスから、いくつかの手法の任意の１つを用いて収集され得る。例えば、肝細胞は、以下の実施例に記載のように、マウスの肝臓を灌流した後、静かに細分することにより収集され得る。さらに、肝細胞は、他の細胞型、組織および／または残屑から、よく知られた方法を用いて、例えば、ヒト細胞またはヒト肝細胞を特異的に認識する抗体を用いることによって分離され得る。かかる抗体としては、限定されないが、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体、例えば、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｍａｒｋｕｓら Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）が挙げられる。肝細胞に結合した抗体は、次いで、パニング（これは、固相マトリックスに結合させたモノクローナル抗体を利用する）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁性ビーズによる分離などによって分離され得る。肝細胞の収集の代替の方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書において提供する方法は、さらに、該マウスから生物学的試料を収集することを含む。例えば、生物学的試料は生物学的流体、細胞または組織試料であり得る。一部の例では、生物学的試料は、血液または尿試料などの液状試料である。一部の場合では、該方法は、増大させたヒト肝細胞を、レシピエントマウスから収集すること、および該マウスから、さらに血液または尿試料などの生物学的試料を収集することを含む。
【０１４９】
また、ヒト肝臓疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される）；および（ｉｉ）肝臓疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程を含む。該肝臓疾患の１つ以上の徴候または症状の改善は、該候補薬剤が該肝臓疾患の処置に有効であることを示す。一部の実施形態では、肝臓疾患は、肝臓感染症、線維症、肝硬変または肝臓癌（ＨＣＣなど）である。
【０１５０】
また、ヒト肝臓病原体による感染の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、免疫不全のＦａｈ欠損マウスの移植ヒト肝細胞は該肝臓病原体に感染させたものである）；および（ｉｉ）該肝臓感染症に対する候補薬剤の効果を評価する工程を含む。該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損マウスの感染量と比べた該肝臓病原体の感染量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す。
【０１５１】
一部の実施形態では、感染量を、該マウスから採取した試料中の病原体の力価を測定することにより決定する。一部の実施形態では、感染量を、該マウスから採取した試料中の病原体特異的抗原を測定することにより決定する。一部の実施形態では、感染量を、該マウスから採取した試料中の病原体特異的核酸分子を測定することにより決定する。一部の実施形態では、肝臓病原体が、ＨＢＶまたはＨＣＶなどの肝指向性ウイルスである。
【０１５２】
さらに、肝硬変の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスには、該マウスにおいて肝硬変の発生を誘発する化合物が投与されている）；および（ｉｉ）該免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいて、肝硬変の少なくとも１種類の診断用マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程（ここで、該肝硬変の少なくとも１種類の診断用マーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択される）を含む。該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損マウスと比べての、該Ｆａｈ欠損マウスにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少またはアルブミンの増加は、該候補薬剤が肝硬変の処置に有効であることを示す。
【０１５３】
また、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の処置に有効な薬剤を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスには、該マウスにおいてＨＣＣの発生を誘発する化合物が投与されているか、または悪性肝細胞が移植されている）；および（ｉｉ）免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいてＨＣＣに対する候補薬剤の効果を評価する工程を含む。該候補薬剤の投与前の該マウスと比べての、該マウスの腫瘍成長または腫瘍体積の減少は、該候補薬剤がＨＣＣの処置に有効であることを示す。
【０１５４】
さらに、ヒト肝細胞に対する外因性因子のインビボでの効果の評価方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに外因性因子を投与する工程（ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される）；および（ｉｉ）該免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいて、肝臓機能の少なくとも１種類のマーカーを測定する工程（ここで、該肝臓機能の少なくとも１種類のマーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択される）を含む。外因性因子の投与前の該マウスと比べての、該マウスにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの増加またはアルブミンの減少は、該外因性因子が毒性であることを示す。一部の実施形態では、外因性因子は、既知の毒素であるかまたは毒素である疑いがある物質である。
【０１５５】
ＩＶ． インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）アンタゴニスト
本明細書において、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの投与により、Ｆａｈの機能欠失を有する免疫不全のマウスでのヒト肝細胞の移植が有意に増進することを開示する。したがって、本明細書において、免疫不全／Ｆａｈ欠損マウスにおけるヒト肝細胞の移植および増大のための方法であって、一部の実施形態では、該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。ＩＬ−１Ｒアンタゴニストとしての機能を果す任意の化合物（核酸分子、ポリペプチド、抗体または小分子など）が本明細書における使用を想定される。また、ＩＬ−１Ｒについてさらに欠損型である免疫不全のＦａｈ欠損マウスの使用も想定される。
【０１５６】
本明細書で用いる場合、用語「ＩＬ−１受容体拮抗薬」は、ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡＰ）に結合し、ＩＬ−１Ｒによって媒介される活性化に、例えば、ＩＬ−１ＲとＩＬ−１ＲＡＰの相互作用またはＩＬ−１とＩＬ−１Ｒの相互作用を阻害または抑制することにより干渉する任意の分子をいう。一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストはアナキンラである。他の実施形態では、ＩＬ−１ＲアンタゴニストはＩＬ−１ＲＡ（それぞれ、本明細書に配列番号１８および２０として示したヒトもしくはマウスのＩＬ−１ＲＡなど）、またはその機能性バリアント（ＩＬ−１ＲＡの保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）バリアントなど）である。他の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒに特異的な抗体（Ｉ型ＩＬ−１Ｒに特異的な抗体など）、ＩＬ−１ＲＡＰに特異的な抗体、Ｉ型ＩＬ−１Ｒに結合するペプチド、またはＩＬ−１ＲＡＰに結合するペプチドである。
【０１５７】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡならびにそのバリアントおよび誘導体を含む）は、これまでに報告されている（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９１／０８２８５；ＷＯ９１／１７１８４；ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９３／２１９４６；ＷＯ９４／０６４５７；ＷＯ９４／２１２７５；ＷＯ９４／２１２３５；ＷＯ９４／２０５１７；ＷＯ９６／２２７９３；ＷＯ９７／２８８２８；および ＷＯ９９／３６５４１；米国特許第５，０７５，２２２号および同第６，５９９，８７３号；同第６，２６８，１４２号；同第６，１６８，７９１号；同第６，１５９，４６０号；同第６，０９０，７７５号；同第６，０６３，６００号；同第６，０３６，９７８号；同第６，０５４，５５９号；同第５，９２２，５７３号；同第５，８６３，７６９号；同第５，８５８，３５５号；同第５，８６３，７６９号；同第５，５０８，２６２号；同第６，０１３，２５３号；および同第６，３９９，５７３号；ならびに米国特許出願公開公報第２００４／００７６９９１号および同第２００５／０２８２７５２号を参照のこと）。
【０１５８】
本発明の開示の解釈上、用語「ＩＬ−１ＲＡ」は、ＩＬ−１ＲＡのアミノ酸が欠失、挿入または置換されたＩＬ−１ＲＡの修飾形態を含む。当業者には、欠失、挿入および置換の多くの組合せが、ＩＬ−１ＲＡのアミノ酸配列（本明細書に配列番号１８および配列番号２０で示したアミノ酸配列など）において行なわれ得ることが認識されようが、得られる分子は生物学的に活性である（例えば、ＩＬ−１Ｒを阻害する能力を有する）ものとする。
【０１５９】
また、用語「ＩＬ−１受容体拮抗薬」は、ＩＬ−１ＲＡを含む融合タンパク質も包含する。例示的な融合タンパク質としては、Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡおよび当該技術分野において報告された他の融合分子（例えば、米国特許出願公開公報第２００７／０２４８５９７号および米国特許第６，２９４，１７０号を参照のこと）が挙げられる。
【０１６０】
一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、Ｉ型ＩＬ−１Ｒ（ＩＬ−１ＲＩ）に特異的な抗体である。ＩＬ−１ＲＩ抗体の例は、当該技術分野において報告されており（例えば、米国特許出願公開公報第２００４／００９７７１２号を参照のこと）、さまざまな供給元から市販されている。さらに、ＩＬ−１ＲＩ抗体は、よく知られた方法に従って作製することができる。本明細書で用いる場合、「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子または抗体断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片など）、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）をいう。抗体は、例えば、キメラ抗体、マウス抗体またはヒト化抗体であってもよい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が、開示した方法での使用を想定される。
【０１６１】
一部の実施形態では、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストをコードする核酸分子がレシピエントマウスに送達される。一部の実施形態では、該核酸分子はアナキンラをコードするものである。他の実施形態では、該核酸分子はＩＬ−１ＲＡまたはＩＬ−１ＲＡのバリアントもしくは誘導体をコードするものである。具体的な例では、該核酸分子は配列番号１７または配列番号１９を含むものである。一部の場合では、該核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含むものである。異種核酸配列の送達に好適なプラスミドおよびウイルスベクターは、当該技術分野においてよく知られており、本明細書において後述する（後述するウロキナーゼの送達用ベクターなど）。
【０１６２】
Ｖ． ヒト肝細胞の増大のための遺伝子組み換えマウス
いくつかのグループは、齧歯動物において、一次ヒト肝細胞を移植および増大しようとした（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。Ｄａｎｄｒｉら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３：９８１−９８８，２００１）が、ヒト肝細胞を用いてマウス肝臓の再増殖の成功を初めて報告した。その後、他のグループは、マウスにおいて、成功を収めたヒト肝臓細胞の移植を報告している。これらの研究のすべてにおいて、使用された動物は、アルブミンプロモータの転写制御下で、ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する、トランスジェニック動物であった（Ｓａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６６：２４５−２５６，１９９１）。ｕＰＡの過剰発現は、代謝破壊を引き起こし、移植されたヒト肝細胞に影響を及ぼすことなく、マウス肝細胞の細胞死をもたらし、それは導入遺伝子を発現しない。該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、様々な免疫不全のバックグラウンドと交錯し、ヒト細胞の拒絶を阻止した（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４、Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：４２８−４３７，２００７、Ｔｕｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３８：１１８１−１１８４，２００６）。
【０１６３】
最大９０％の移植レベルが、これらのモデルにおいて報告されているが、該系は、広範な使用を阻止しているいくつかの主要な不利点がある。第１に、該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、若年期に、不活性化または喪失する。この理由のため、非常に初期（１４日齢）にヒト細胞を移植し、導入遺伝子がホモ接合体であるマウスを使用することが必須である。この狭い移植の時間窓が、モデルの柔軟性を著しく制限する。第２に、該導入遺伝子の自発的不活性化は、導入遺伝子陰性の健康なマウス肝細胞のプールを作成する。これらの復帰突然変異体マウス肝細胞は、再増殖中、ヒト細胞と効率的に競合する。したがって、該ヒト細胞を連続移植すると同時に二次受容者を再増殖することは不可能である。第３に、肝臓疾患は、このモデルにおいて、非常に早発型であり、ひいては、トランスジェニックマウスの生存力を低下させる。したがって、十分な数の実験動物を繁殖することが困難である。さらに、該トランスジェニックマウスには、手術中、死亡率を増加する出血傾向がある。最後に、ａｌｂ−ｕＰＡトランスジェニック動物は、一旦ヒト細胞を用いる再増殖が５０％を超えると、腎疾患を発症する。これは、腎臓上皮上のヒト補体によるためであると考えられる。ヒト移植の非常に高いレベルを得るために、抗相補性プロテアーゼ阻害剤で移植されたマウスを処理することが必要である（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４）。これらの多くの限定のため、ヒト肝細胞を増大させるためのさらに堅牢なシステムが非常に望ましい。
【０１６４】
遺伝子欠失の独自の組み合わせを有する遺伝子組み換えマウスを用いて、生体内でヒト肝細胞を増大させるための高効率な方法を、本明細書に記載する。マウス肝臓においてヒト肝細胞の成功を収めた移植および増大は、ある程度の肝機能障害がある免疫不全マウスを必要とする。マウス肝臓は、様々な異なる型の免疫不全マウスにおいて、ヒト肝細胞を用いて再増殖し、ＲＡＧ−２ノックアウトまたはＳＣＩＤマウスを含み、これらの両方は、Ｂ細胞およびＴ細胞を欠如する（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。肝機能障害に達するために、免疫不全マウスを、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）トランスジェニックマウスと交配させた。マウス肝臓において、ｕＰＡの発現は、マウス肝細胞の成長の不利点を生じ、移植したヒト肝細胞の増大を促進する（ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号）。該ｕＰＡ導入遺伝子の限界を避けるために、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト肝細胞の増大を可能にさせる能力について分析された。ＦＡＨは、チロシン異化の最後のステップを触媒する代謝酵素である。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）。
【０１６５】
Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（ＦＲＧ）三重変異体マウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠如することを、本明細書に開示する。Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスは、当技術分野で知られている（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４、Ｇｏｒａｎｔｌａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２７００−２７１２，２００７）。
【０１６６】
以下の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞の移植および増大は、驚くべきことに、ＦＲＧマウスにおいて、高効率である。例えば、ＦＲＧマウスに、１００万の単離されたヒト肝細胞を注入できる。１０％の効率を仮定すると、１００，０００のヒト肝細胞が、レシピエントマウスに移植される。増大後のＦＲＧマウスからの平均収量は、その後、約８，０００万から約１億２，０００万のヒト肝細胞であり、ヒト肝細胞の８００倍から１，２００倍の増加と同じである。ＦＲＧマウスはまた、ヒト肝細胞の連続移植にも使用することができる。連続移植は、多重マウスを含み得、マウスあたりヒト肝細胞の少なくとも約１，０００倍の増大をもたらし得る。
【０１６７】
Ｆａｈ欠損を含む任意の免疫不全マウスは、本明細書に記載される諸方法に適している。一実施形態において、該マウスは、Ｆａｈが欠損しているＲａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスでもある。別の実施形態では、該マウスはＲａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。他の実施形態では、該マウスは、ＮＯＤ／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスまたはＮＯＤ／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである。一部の特定の遺伝子改変の組合せを本明細書に記載しているが、免疫不全をもたらす遺伝子改変の他の組合せも、本明細書において想定される。例えば、他の遺伝子改変としては、ＳＣＩＤ変異、ヌード変異およびＮＯＤ遺伝子型が挙げられる。
【０１６８】
該Ｆａｈ欠損マウスは、例えば、Ｆａｈのホモ接合体欠失、またはＦａｈの１つもしくは複数の点変異を含むことができる。Ｆａｈ欠損（点変異またはホモ接合体欠失等による）は、Ｆａｈ ｍＲＮＡ発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。該ＦＲＧマウスに加えて、Ｆａｈ遺伝子において、点変異がホモ抱合体である免疫不全マウス（Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−）（本明細書では、Ｆ^ｐｍＲＧマウスと称される）はまた、生体内でヒト肝細胞の移植および増大に適したマウスでもあることを、本明細書に記載する。また、本明細書において、免疫不全のＦａｈ欠損およびＩＬ−１Ｒ欠損マウスの使用も想定される。ＩＬ−１Ｒ欠損マウスは、これまでに報告されており（例えば、Ｎｏｒｍａｎら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２３（２）：１６３−１６９，１９９６；Ｇｌａｃｃｕｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３３６４−３３７１，１９９７を参照のこと）、および、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から市販されている（例えば、Ｂ６；１２９Ｓ１−Ｉｌ１ｒ１^{ｔｍ１Ｒｏｍｌ}／ＪおよびＢ６．１２９Ｓ７−Ｉｌ１ｒ１^{ｔｍ１Ｉｍｘ}／Ｊ系統）。
【０１６９】
ＶＩ． ヒト肝細胞の単離および送達
インビボでのヒト肝細胞の増大にＦａｈ欠損マウスを使用することの顕著な利点は、該マウスに、さまざまな供給源に由来するヒト肝細胞を移植することができることである。任意の適当な供給源のヒト肝細胞または肝細胞の前駆細胞／始原細胞が、開示した方法においてＦａｈ欠損マウスへの移植のために使用され得る。下述の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞は、死体ドナーまたは肝臓切除術から採取し得る、または市販の源から得ることができる。さらに、本明細書に示されるように、ＦＲＧマウスに、すべての年齢のドナーからのヒト肝細胞、または凍結保存された肝細胞を、うまく移植することができる。多くの場合、ヒト肝細胞の単離と移植との間の遅延（一般に、１〜２日）があり、これは該肝細胞の生存能力の低下をもたらし得る。しかしながら、該ＦＲＧマウス系は、限定された生存能力がある肝細胞を移植した場合でさえ、ヒト肝細胞を増大させることができる。
【０１７０】
ヒト肝細胞を単離する方法は、当技術分野で周知である。例えば、臓器ドナーまたは肝臓切除術からのヒト肝細胞を単離する諸方法が、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００４／００９７６６号および第ＷＯ ２００５／０２８６４０号、ならびに米国特許第６，９９５，２９９号および第６，５０９，５１４号に記載される。肝細胞は、経皮的に、または開腹手術を介して採取された肝生検から得ることができる。ＦＲＧマウスのような、受容動物への移植手術のためのヒト肝細胞は、当技術分野で知られている任意の従来の方法によりヒト肝臓組織から単離される。肝臓組織は、機械的に、または酵素的に分離し、単一細胞の懸濁液に供給することができる、さもなければ完全なヒト肝組織のフラグメントを使用してもよい。例えば、該肝細胞は、所定のコラゲナーゼ潅流によりドナー組織から摘出し（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２９，１９７６）、次いで、低速遠心分離を行う。肝細胞は、その後、ステンレス製のメッシュで濾過することにより精製し、次いで、密度勾配遠心分離法を行うことができる。あるいは、肝細胞を濃縮するための他の諸方法、例えば、蛍光活性化細胞分類、またはパンニング、または磁気ビーズ分離、または遠心力場内の水簸、または当技術分野で周知のような任意の他の方法を使用することができる。類似の肝細胞単離法が、レシピエントマウスの肝臓から増大されたヒト肝細胞を採取するために使用することができる。
【０１７１】
あるいは、ヒト肝細胞は、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏら（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐ．６：６２５−６２８，１９８２）により記載される技法を用いて調製され得る。簡潔に述べると、肝臓またはその一部は、単離され、カニューレは、門脈または門脈管に導入される。該肝臓組織は、その後、３７℃で、１分間あたり３０から７０ミリリットルの流量で、無カルシウム緩衝液、次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、塩化カルシウム溶液（約０．０７５％塩化カルシウム等）のコラゲナーゼ（約０．０２５％コラゲナーゼ）を含有する酵素溶液で、該カニューレを介して潅流される。潅流された該肝臓組織は、小部分（約１立法ミリメートル等）に細分化される。該酵素消化を、上記に記載されるように、同一の緩衝液で、３７℃で約１０〜２０分間、徐々に撹拌しながら行い、細胞懸濁液を生成する。放出した肝細胞は、該細胞懸濁液を６０〜８０マイクロメーターのナイロン製のメッシュで濾過することにより採取する。採取した肝細胞は、その後、ｐＨ７．０で、低温ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄し、低速遠心分離を用いて、コラゲナーゼおよび細胞残屑を除去することができる。非実質細胞は、メトリザミド勾配遠心法により除去してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号参照）。
【０１７２】
ヒト肝細胞は、新鮮組織（死亡してから数時間内に得られた組織等）、または新鮮冷凍された組織（約０℃以下で、冷凍保存された新鮮組織等）から得ることができる。好ましくは、該ヒト組織は、検出可能な病原体がなく、形態学および組織学において正常であり、原則的に無病である。移植に使用される肝細胞は、最近、例えば、数時間以内に単離され得る、または細胞が適切な保存培地で保存される場合、より長期間後でも移植することができる。下述の実施例に記載されるこのような一培地は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）である。肝細胞はまた、移植手術前に、凍結保存することができる。肝細胞を凍結保存する諸方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第６，１３６，５２５号に記載される。
【０１７３】
臓器提供者または肝臓切除術からヒト肝細胞を得るステップに加えて、移植のために使用される該細胞は、ヒト幹細胞または、受容動物への移植手術後、増大可能なヒト肝細胞に発達または分化する肝細胞前駆細胞であり得る。ＥＳ細胞の性質を有するヒト細胞は、内胚盤胞細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７，１９９８）、および成長中の生殖細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８）から単離され、ヒト胚幹細胞を産生している（米国特許第６，２００，８０６号参照）。米国特許第６，２００，８０６号に開示されるように、ＥＳ細胞は、ヒトおよび非ヒト霊長類から産生することができる。また、ヒトおよび非ヒト霊長類細胞から誘導されたｉＰＳも得られ得る（例えば、Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１−８７２，２００７；Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３（６）：５８７−５９０，２００８を参照のこと）。通常、霊長類ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下で、マウス胎児線維芽細胞の融合層上に単離される。ＥＳ培地は、通常、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を有する、８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ピルビン酸塩なし、高グルコース、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなる。ＥＳ細胞の際立った特徴は、成人に存在する前駆「多分化能性」幹細胞と比較して、培養中に無制限に分化されない状態を維持するＥＳ細胞の能力、およびＥＳ細胞があらゆる異なる細胞型に発達する必要がある潜在能力を含む。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）は、特異的なモノクローナル抗体により認識される糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４、を発現する（例えば、Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２７１−２７８，２０００を参照）。
【０１７４】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。骨髄由来ｈＭＳＣの肝性因子への順次暴露は、肝細胞の性質を有する細胞への、幹細胞の分化をもたらす（Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．７：２４，２００７、Ａｕｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．５６（３）：４０５−１５，２００７）。骨髄由来間充織幹細胞と脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の肝細胞の分化もまた、記載されている（Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２（３６）：５８３４−４５，２００６参照）。ヒト肝細胞はまた、単球から作製することができる。Ｒｕｈｎｋｅら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９（９）：１０９７−１０３，２００５）は、最終分化した末梢血単球からの肝細胞様（ＮｅｏＨｅｐ）細胞の生成を記載する。該ＮｅｏＨｅｐ細胞は、形態、肝細胞マーカーの発現、様々な分泌および代謝機能、ならびに薬物解毒活性に関して主要なヒト肝細胞と類似している。さらに、羊膜細胞に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。
【０１７５】
ヒトＥＳ細胞株は、存在し、本明細書に開示される諸方法に使用することができる。ヒトＥＳ細胞はまた、体外受精した（ＩＶＦ）胚からの着床前の胚から採取し得る。未使用のヒトＩＶＦから産生した胚は、該胚が１４日齢未満である場合、シンガポールおよび英国のような多くの国で許可される。高品質の胚のみが、ＥＳ単離に適している。増大された胚盤胞への１つの細胞ヒト胚を培養するための現在の明確な培地条件が、記載されている（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６−７１３，１９８９参照）。ヒト卵管細胞とのヒト胚の共培養は、高品質の胚盤胞の産生をもたらす。細胞共培養、または改善された合成培地において成長したＩＶＦ由来の増大されたヒト胚盤胞は、ヒトＥＳ細胞の単離を可能にする（米国特許第６，２００，８０６号参照）。
【０１７６】
一実施形態において、ヒト肝細胞は、脾臓への注入等の、移植手術によりレシピエントマウスに送達される。肝細胞は、肝臓柔組織または門脈への注入等の、他の手段により送達され得る。レシピエントマウスに注入されたヒト肝細胞の数は、異なり得る。一実施形態において、約１０^５〜約１０^７のヒト肝細胞が、注入される。別の実施形態において、約５×１０^５〜約５×１０^６のヒト肝細胞が、注入される。例示的な一実施形態において、約１０^６のヒト肝細胞が、注入される。
【０１７７】
ＶＩＩ． Ｆａｈ欠損マウスおよびその使用
本明細書に開示したＦａｈ欠損マウスは、さまざまな研究目的および治療目的に使用され得る。例えば、免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいて増大させた肝細胞（ヒト肝細胞など）は、薬物代謝および毒性ならびに肝臓病原体の感染の試験に使用され得る。本明細書ではヒト肝細胞を例示しているが、他の種、例えば、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマまたは非ヒト霊長類（ヒヒ、チンパンジーおよびアカゲザルなど）に由来する肝細胞も、Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させることができる。Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させたヒト肝細胞は、ヒト肝臓を再構成する治療を必要とする被験体において、ヒト肝臓を再構成するために使用され得る。また、ヒト肝細胞での再構成が行なわれたＦａｈ欠損マウスは、ＨＣＣ、肝硬変および肝臓感染症などの肝臓疾患の動物モデルとして供され得る。Ｆａｈ欠損マウス、およびＦａｈ欠損マウスにおいて増大させた肝細胞の例示的な使用は、以下にさらに論考する。
【０１７８】
Ａ． ヒト肝細胞の増大およびその医学的使用
本発明の開示では、ヒト肝細胞の供給源としてのレシピエントマウスにおいて増大し、該マウスから収集したヒト肝細胞の、肝臓再構成治療を必要とする被験体における肝臓再構成のための使用を想定する。肝細胞の導入による患者における肝臓組織の再構成は、肝臓移植に先行する一時的処置、または孤立性代謝欠陥を有する患者に対する最終的処置のいずれかとして、急性肝不全を有する患者に対する潜在的な治療選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３−６１，１９９８）。肝細胞の再構成は、例えば、遺伝子療法のために遺伝子操作された肝細胞を導入するため、あるいは疾患、物理的もしくは化学的損傷、または悪性腫瘍の結果としての肝細胞の減損を補うため（米国特許第６，９９５，２９９号）に使用され得る。また、増大させたヒト肝細胞は、人工肝臓補助デバイスを装着するために使用され得る。Ｆａｈ欠損マウスからのヒト肝細胞の収集方法、ならびに（ａｓ ｗｅｌｌ）増大させたヒト肝細胞の医学的使用は、以下にさらに詳細に記載する。
【０１７９】
１．Ｆａｈ欠損マウスからのヒト肝細胞の収集
ヒト肝細胞は、当技術分野で知られているいくつかの技法のうちのいずれかを用いて、レシピエントマウスから採取することができる。例えば、マウスは、麻酔することができ、門脈または下大静脈に、カテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓は、その後、適切な緩衝液（０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムＥＢＳＳ）で潅流し、次いで、該肝臓にコラゲナーゼ処理（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＸＩおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉが追加されたＥＢＳＳからなる溶液を用いて）を行うことができる。該肝臓は、徐々に細分化し、ナイロン製のメッシュで濾過（７０μｍと４０μｍのナイロン製のメッシュでの連続等）し、次いで、遠心分離し、該細胞の洗浄を行った。
【０１８０】
レシピエントマウスから採取したヒト肝細胞は、当技術分野で周知の任意の技法を用いて、非ヒト細胞または他の混入物質（組織または細胞残屑等）から分離することができる。例えば、このような方法は、ヒト肝細胞に選択的に結合する抗体を用いるステップを含む。このような抗体としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）またはＣＤ４６のような、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト細胞またはヒト肝細胞に対して特異的な抗体は、ＦＡＣＳ、またはパンニング、または磁気ビーズ分離を含む、様々な異なる技法に使用することができる。あるいは、マウス細胞に選択的に結合する抗体は、混入マウス細胞を除くのに使用され得、それによりヒト肝細胞が豊富になる。ＦＡＣＳは、他のさらに高度な検出レベルのうちで、複数の色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用して、抗体が結合した細胞を分離または分類する（米国特許第５，０６１，６２０号参照）。磁気分離は、１）ヒト特異抗体と接合する、または２）ヒト特異抗体と結合することができる検出抗体と接合する、または３）ビオチン化抗体と結合することができるアビジンと接合する、常磁性粒子の使用を含む。パンニングは、アガロースビーズ、またはポリスチレンビーズ、または中空糸膜、またはプラスチック製のペトリ皿のような、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体を含む。該抗体で結合した細胞は、試料から固体支持体を単に物理的に分離することにより試料から単離させることができる。
【０１８１】
Ｆａｈ欠損マウスから収集した肝細胞は、例えば、後の使用のために低温保存され得るか、または配送およびさらなる使用のために組織培養状態にプレーティングされ得る。
【０１８２】
２． ヒト肝臓再構成
Ｆａｈ欠損マウスにより、肝臓移植の代替法または補助法として、ヒト肝臓を再構成するために使用され得るヒト肝細胞を増殖させるための系がもたらされる。現在、肝臓疾患に苦しんでいる患者は、移植に適した臓器が入手可能になるまで長期間、待たなければならないことがあり得る。移植後、患者は、ドナーの肝臓の拒絶を回避するために一生涯、免疫抑制剤での処置を受ける必要がある。患者自身の細胞を増殖させる方法では、バイアブルなままであるために免疫抑制を必要としない機能性肝臓組織のソースが提供され得る。したがって、本明細書に開示した免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、肝臓疾患および／または肝不全を有する被験体の肝臓を、Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させた該被験体自身の肝細胞（例えば、患者の特定の幹細胞から作製されたもの）、またはドナー由来の肝細胞を用いて再構成するために使用され得る。
【０１８３】
肝細胞の導入（「肝細胞の移植」とも称する）による患者の肝臓組織の再構成は、肝臓移植に先行する一時的処置、または孤立性代謝欠陥を有する患者に対する最終的処置のいずれかとして、急性肝不全を有する患者に対する潜在的な治療選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３−６１，１９９８）。治療的肝臓再構成を行なうための大きな障壁は、移植された肝細胞に対する宿主による免疫拒絶であり、これは（宿主細胞とドナー細胞が遺伝的および表現型的に異なる場合）、「同種移植片拒絶」と称される現象である。免疫抑制剤は、同種移植片拒絶の抑制において、一部の場合でのみ好成績である（Ｊａｖｒｅｇｕｉら，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５：３５３−３６７，１９９６；Ｍａｋｏｗｋａら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４２：５３７−５４１，１９８６）。Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させたヒト肝細胞はまた、遺伝子療法適用用途にも使用され得る。最も広い意味で、かかる肝細胞はヒト宿主に、遺伝的欠陥を修正するために移植される。継代された肝細胞は、移植片のレシピエントになる同じ個体からもともと由来するものである必要はないが、そうであってもよい。
【０１８４】
一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させたヒト肝細胞は、肝臓移植の前処置法または代替法として、被験体の肝臓組織を再構成するために使用され得る。非限定的な一例として、例えばアルコール依存症の結果として進行性の肝臓変性に苦しんでいる被験体が肝細胞のドナーとして供され得、次いで、該細胞がＦａｈ欠損マウスにおいて増大する。肝細胞の数は、被験体から最初に得られ、Ｆａｈ欠損マウスに移植される数と比べて増大する。増大後、ヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損マウスから単離され得、被験体の肝臓機能を再構成するために使用され得る。Ｆａｈ欠損マウスにおける肝細胞の増大は、肝細胞の数を増加させるためだけでなく、感染性疾患または悪性疾患に罹患している肝細胞を選択的に除去するためにも使用され得る。具体的には、被験体がウイルス性肝炎に苦しんでいる被験体であり得、この場合、全部ではないが一部の肝細胞が感染しており、感染した肝細胞は、細胞表面内または該表面上のウイルス抗原の存在によって特定され得る。かかる場合では、肝細胞が被験体から収集され得、非感染細胞が１匹以上のＦａｈ欠損マウスにおける増大のために選択され得る（例えば、ＦＡＣＳによって）。一方、患者の感染を解消するために侵襲的な措置が取られることがある。処置後、被験体の肝臓組織は、１匹以上のＦａｈ欠損マウスにおいて増大させた肝細胞によって再構成され得る。類似の方法を使用し、肝臓悪性腫瘍（ＨＣＣなど）に苦しんでいる患者由来の非悪性細胞が選択的に継代され得る。
【０１８５】
Ｂ． 肝臓疾患モデルとしてのＦａｈ欠損マウス
動物におけるＦａｈ欠損は、ヒト疾患である遺伝性チロシン血症１型（ＨＴ１）と同様の疾患表現型をもたらす。死亡率を抑制するため、肝臓機能不全を抑制するＮＴＢＣでＦａｈ欠損動物を維持する（動物に対して、ＦＡＨを発現するヒト肝細胞での再生息（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が行なわれていない場合）が、ＮＴＢＣの滴定用量を用いてＨＴ１−型の表現型（例えば、ＨＣＣ、線維症および肝硬変）の発現を促進させることができる。また、ヒト肝細胞での再生息が行なわれた免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、例えば、毒性薬剤である形質転換剤を用いて、または悪性のヒト肝細胞を導入することにより、肝臓疾患の発症が誘導され得る。したがって、本明細書に開示したＦａｈ欠損マウスは、さまざまな肝臓疾患（例えば、ＨＣＣおよび肝硬変）を研究するために使用され得る。
【０１８６】
一部の実施形態では、本明細書に開示したＦａｈ欠損マウスは、ヒト肝臓疾患の動物モデルとして使用される。Ｆａｈ欠損マウスは、例えば、毒素への曝露、感染性疾患もしくは悪性腫瘍または遺伝的欠陥（すなわち、ＨＴ１をもたらすＦａｈ−欠損）に起因する肝臓疾患のモデルとして使用され得る。Ｆａｈ欠損マウスがモデルとして供され得るヒト遺伝性肝臓疾患の例としては、限定されないが、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ尿病、グリコーゲン蓄積病、リソソーム蓄積病（ゴーシェ病など）、および任意の先天性の代謝異常が挙げられる。開示したモデル系は、特定の肝臓疾患に対するより良好な理解を得るため、および疾患プロセスを予防、遅延または逆転し得る薬剤を同定するために使用され得る。
【０１８７】
Ｆａｈ欠損マウスが毒素によって引き起こされる肝臓疾患のモデルとして使用される一部の場合では、肝臓機能不全を抑制するＮＴＢＣでＦａｈ欠損マウスを、肝臓におけるヒト肝細胞の再生息が充分となるまで維持する。対応するヒトの状態が最もよく模倣される結果を得るのに必要とされる毒性薬剤の量は、漸増用量の毒性薬剤に曝露した数匹のＦａｈ欠損マウスを使用することによって決定され得る。毒性薬剤の例としては、限定されないが、エタノール、アセトアミノフェン、フェニトイン、メチルドパ、イソニアジド、四塩化炭素、黄リン（ｙｅｌｌｏｗ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）およびファロイジンが挙げられる。一部の場合では、ヒト肝細胞なし（だが、ＮＴＢＣまたは他の類似化合物の存在下）でのＦａｈ欠損マウスが、毒素の効果を評価するためのモデルとして使用される。他の例では、Ｆａｈ欠損マウスにヒト肝細胞を移植して、ヒト肝細胞に対する毒素の効果を評価する。この例では、ＮＴＢＣでＦａｈ欠損マウスを維持することは必要でない。典型的には、ヒト肝細胞の増大をヒト肝細胞集団の大きさが十分になる時点（例えば、最大に近づく）まで進行させた後に、Ｆａｈ欠損マウスを毒性薬剤に曝露する。
【０１８８】
Ｆａｈ欠損マウスが、ヒト肝細胞なしで悪性肝臓疾患（ＨＣＣまたはヘパトームなど）のモデルとして使用される一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損マウスに、肝臓機能不全による致死が抑制されるのに充分高いが、ＨＣＣまたは他の肝臓悪性腫瘍の発生が可能となるのには充分低い用量のＮＴＢＣが投与される。あるいはまた、Ｆａｈ欠損マウスは肝臓機能不全が予防される用量のＮＴＢＣで維持され得、そして、悪性腫瘍は、形質転換剤への曝露または悪性細胞の導入によって生成し得る。別の代替法は、ヒト肝細胞を移植してＨＣＣを誘導すること（形質転換剤の使用などによって）、またはマウスに悪性ヒト肝細胞を移植することである。したがって、一部の例では、ヒト肝細胞なしのＦａｈ欠損マウスが悪性肝臓疾患のモデルとして使用される。他の例では、Ｆａｈ欠損マウスにヒト肝細胞を移植して、ヒト細胞の悪性肝臓疾患を評価する。この例では、ＮＴＢＣでＦａｈ欠損マウスを維持することは必要でない。形質転換剤または悪性細胞は、ヒト肝細胞の初期転移増殖導入（ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）とともに導入してもよく、ヒト肝細胞が宿主動物内で増殖し始めた後に導入してもよい。形質転換剤の場合、該薬剤を、ヒト肝細胞が活発に増殖しているときに投与することが好ましい場合がある。
【０１８９】
形質転換剤の例としては、アフラトキシン、ジメチルニトロサミン、および０．０５〜０．１％ ｗ／ｗのＤＬ−エチオニンを含有するコリン欠損飼料（ＦａｒｂｅｒおよびＳａｒｍａ，１９８７、ｉｎ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｉｅｓ ｉｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｍａｓｋｅｎｓら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１８５−２２０）が挙げられる。かかる形質転換剤は、動物に対して全身投与され得るか、または肝臓自体に局所投与され得るかのいずれかである。悪性細胞を肝臓に直接接種してもよい。
【０１９０】
Ｃ． 肝臓感染症のモデルとしてのＦａｈ欠損マウス
Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞はまた、さまざまな微生物学的研究にも使用され得る。いくつかの病原体（例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫）は、ヒト宿主またはヒト一次肝細胞のみで複製する。したがって、ヒト一次肝細胞の充分な供給源を有することは、このような病原体の研究に不可欠である。増大させたヒト肝細胞は、ウイルスの感染および複製の研究、または肝臓ウイルスの感染をモジュレートする化合物を同定するための研究に使用され得る。肝臓ウイルスの研究のためのヒト一次肝細胞の使用方法は、例えば、欧州特許第１５５２７４０号、米国特許第６，５０９，５１４号およびＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／１７３３８に記載されている。肝臓ウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。肝臓に感染する寄生虫の例としては、例えば、マラリアの原因因子（プラズモディウム種、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）ならびにリーシュマニア症の原因因子（リーシュマニア種、例えば、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ，Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ，Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ，Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ，Ｌ．ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ，Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ；Ｌ．ｍａｊｏｒ；Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ，Ｌ．（Ｖ．）ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ，Ｌ．（Ｖ．）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ，Ｌ．（Ｖ．）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ、およびＬ．（Ｖ．）ｐｅｒｕｖｉａｎａ）が挙げられる。
【０１９１】
微生物学的研究のためのＦａｈ欠損マウスにおいて増大させたヒト肝細胞の使用に加えて、Ｆａｈ欠損マウス自体が肝臓病原体感染の動物モデルとして供され得る。例えば、ヒト肝細胞での再生息が行なわれたＦａｈ欠損マウスに肝臓病原体を感染させ、該感染の処置のための候補薬剤をスクリーニングするために使用され得る。候補薬剤としては、いくつかの化学物質の類型の任意の１つに由来する任意の化合物（低分子有機化合物など）が挙げられる。また、候補薬剤としては、生体分子、例えば、核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、発現ベクターなど）、ペプチドおよび抗体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、その構造類似体、またはその組合せなどが挙げられる。
【０１９２】
候補薬剤は、さまざまな供給源、例えば、合成化合物または天然の化合物のライブラリーから得られ得る。例えば、さまざまな有機化合物および生体分子の無作為および指向的な合成、例えば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現に対して、数多くの手段が利用可能である。あるいはまた、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に作製される。さらに、天然の、または合成により作製したライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段によって容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤が、構造類似体を作製するための指向的または無作為な化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供され得る。
【０１９３】
ＨＣＶ感染およびＨＢＶ感染を研究するため、ならびにこれらの感染の処置のための候補薬剤を評価するためのＦａｈ欠損マウスの使用を以下に論考する。しかしながら、該方法は任意の対象肝臓病原体に適用され得る。一実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスは、ウイルス感染を阻害する薬剤、ウイルスの複製を低減させる薬剤および／またはＨＢＶもしくはＨＣＶ感染によって引き起こされる１つ以上の症状を改善する薬剤を同定するために使用される。一般に、候補薬剤をＦａｈ欠損マウスに投与し、対照と比べた候補薬剤の効果を評価する。例えば、候補薬剤はＨＣＶ感染Ｆａｈ欠損マウスに投与され得、処置動物のウイルス力価（例えば、血清試料のＲＴ−ＰＣＲによって測定する場合）が、処置前の該動物および／または未処置ＨＣＶ感染動物のウイルス力価と比較され得る。候補薬剤での処置後の感染動物のウイルス力価の検出可能な低減は、該薬剤の抗ウイルス活性を示す。
【０１９４】
候補薬剤は、該薬剤の送達に適切な任意の適当な様式で投与され得る。例えば、候補薬剤は、注射（静脈内、筋肉内、皮下もしくは標的組織内への直接的な注射など）、経口、または任意の他の望ましい手段によって投与され得る。一部の場合では、インビボスクリーニングは、種々の量および濃度の候補薬剤（薬剤なしから、動物に対して安全に送達され得る量の上限に近い量の薬剤まで）を受ける数匹のＦａｈ欠損マウスを伴い、異なる製剤および経路での薬剤の送達を含み得る。候補薬剤は、単独で、または特に薬剤の組合せの投与によって相乗効果がもたらされ得る場合は２種類以上の組合せで投与され得る。
【０１９５】
候補薬剤の活性は、当該技術分野において知られたさまざまな手段の任意の１つを用いて評価され得る。例えば、Ｆａｈ欠損マウスを肝指向性病原体（例えば、ＨＢＶまたはＨＣＶ）に感染させた場合、該薬剤の効果は、該病原体の存在（例えば、ウイルス力価を測定する）または該病原体の存在に関連しているマーカー（例えば、病原体特異的タンパク質もしくはコード核酸）の存在について血清試料を調べることにより評価され得る。ウイルス感染の存在および重症度を検出および評価するための定性的および定量的な方法は、当該技術分野においてよく知られている。一実施形態では、ＨＢＶ感染に対する薬剤の活性は、ウイルス抗原（ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはＨＢＶコア抗原（ＨｂｃＡｇ）など）の存在について、血清試料および／または組織切片を調べることにより評価され得る。別の実施形態では、ウイルス感染に対する薬剤の活性は、ウイルス核酸（ＨＣＶ ＲＮＡなど）の存在について、血清試料を調べることにより評価され得る。例えば、ＨＣＶ ＲＮＡは、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合的ＲＴ−ＰＣＲもしくは分岐型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲによるマイナス鎖ＲＮＡ（ＨＣＶの複製性中間体）の検出、または治療を伴うウイルスゲノム内の変異／シフト（「擬種の進化」）を検出するためのウイルスＲＮＡの配列決定、を用いて検出され得る。あるいはまたさらに、宿主の肝臓の生検を行ない、インサイチュＲＴ−ＰＣＲハイブリダイゼーションを行なうと、組織切片内のウイルス粒子の量の定性的または定量的な変化が直接的に示され得る。あるいはまたさらに、宿主を安楽死させ、感染の徴候および／または該薬剤によって引き起こされる毒性について、肝臓を組織学的に検査してもよい。
【０１９６】
また、Ｆａｈ欠損マウスは、候補ワクチンを、肝指向性病原体による感染を予防または改善する能力についてスクリーニングするために使用され得る。一般に、ワクチンは、投与後、宿主に標的病原体に対する免疫応答が起こるのを助長する薬剤である。惹起される体液性、細胞性または体液性／細胞性の免疫応答により、ワクチンの開発対象の病原体による感染の阻害が助長され得る。本発明の開示において、肝指向性病原体（例えば、微生物病原体、ウイルス病原体、もしくは寄生虫病原体）、特に、ウイルス病原体（ＨＢＶおよび／またはＨＣＶなど）による感染および／または該病原体の肝臓内複製を阻害する免疫応答を惹起するワクチンは特に重要である。
【０１９７】
候補ワクチンを評価するため、Ｆａｈ欠損マウスにヒト肝細胞を移植し、該マウスの肝臓にヒト肝細胞を再生息させる。有効なワクチンのスクリーニングは、上記のスクリーニング方法と同様である。一部の実施形態では、候補ワクチンをＦａｈ欠損マウスに、肝指向性病原体の接種前に投与する。一部の場合では、候補ワクチンは、単回ボーラスを施与することによって投与され（例えば、腹腔内もしくは筋肉内注射、局所投与または経口投与）、続いて、任意選択で、１回以上の追加刺激の免疫処置が行なわれる。免疫応答の誘導は、抗原／ワクチンに特異的なＢ細胞応答およびＴ細胞応答を、当該技術分野でよく知られた方法に従って調べることにより評価され得る。次いで、免疫処置したＦａｈ欠損マウスに肝指向性病原体で抗原刺激を行なう。典型的には、数匹の免疫処置した動物に、漸増力価の病原体で抗原刺激を行なう。次いで、該動物を感染の発生について観察し、感染の重症度を評価する（存在する病原体の力価を評価すること、またはヒト肝細胞機能パラメータを調べることなどにより）。病原体による感染の有意な低減および／または抗原刺激後に起こる疾患の重症度の有意な低減をもたらすワクチン候補を生ワクチンと同定する。
【０１９８】
Ｄ． 薬理学的、毒物学的および遺伝子療法試験
Ｆａｈ欠損マウスおよび／またはＦａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞は、任意の薬理学的化合物（小分子、生物学的薬剤、環境性もしくは生物性の毒素または遺伝子送達系など）による、ヒト肝細胞における遺伝子発現の改変を評価するために使用され得る。
【０１９９】
下述の実施例に記載されるように、いくつかの肝細胞輸送タンパク質を含む、薬物抱合および解毒に関与する遺伝子の発現を、レシピエントマウスから採取した増大されたヒト肝細胞において検出した。最近の研究では、薬物毒性を予測する際に、これらの抱合経路（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１１９２−１１９７，２０００）、および肝細胞輸送タンパク質（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．９０：４５１−４５９，２００６）が、重要な役割を果たすことを示している。リファンピシンもしくはＰＢ、またはＢＮＦのような外因性薬物によるＣＹＰ誘導に対する正常ヒト反応に加えて、核ホルモン受容体転写因子の発現、抱合経路、およびＦＲＧマウスにおいて増大されたヒト肝細胞による主要な輸送タンパク質は、生体内で、ヒト薬物代謝および毒性において、これらの遺伝子産物の役割の評価を可能にする。
【０２００】
ヒト化ＦＲＧマウスは、有意に高いＬＤＬコレステロール含量を有するヒトに典型的な血中脂質プロフィールを示すが（表４参照）、対照マウスは、マウス血液に典型的な高ＨＤＬ含量を示す。したがって、ヒト化ＦＲＧマウスは、抗高脂血症薬および抗アテローム性動脈硬化の薬剤を試験するのに有用である。ヒト化ＦＲＧマウスは、胆嚢においてヒト胆汁酸組成を示す（表３参照）。これは、このマウスが、通常の代謝産物および生体異物性の代謝産物の胆汁中排泄をアッセイするために使用され得ることを示す。
【０２０１】
例えば、Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞は、ヒト細胞における特定の化合物の毒性を評価するために使用され得る。単離された肝細胞における化合物の毒性の試験方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２００７／０２２４１９に記載されている。同様に、ヒト肝細胞が移植されたＦａｈ欠損マウスは、外因性因子の毒性を評価するために使用され得る。一部の実施形態では、外因性因子は、既知の毒素であるかまたは毒素である疑いがある物質である。
【０２０２】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞が移植されたＦａｈ欠損マウス（またはＦａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞）は、薬物代謝および薬物動態のいくつかのパラメータの任意の１つを評価するために使用される。例えば、薬物代謝、インビボでの薬物／薬物相互作用、薬物半減期、排出／排泄経路、尿、糞、胆汁、血液もしくは他の体液中の代謝産物、シトクロムｐ４５０誘導、腸肝再循環、および酵素／輸送体誘導を評価するための試験が行なわれ得る。
【０２０３】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞が移植されたＦａｈ欠損マウス（またはＦａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞）は、化合物、例えば、治療用薬剤もしくは候補薬剤（小分子もしくは生物学的薬剤など）、環境性もしくは生物性の毒素、または遺伝子送達系の毒物学的特性および安全性を評価するために使用される。例えば、ヒト肝細胞の細胞周期増殖は、例えば、該化合物への曝露後、癌のリスクを調べるために評価され得る。また、肝細胞に対する毒性は、例えば、組織学的検査、アポトーシス指数、肝臓機能試験などによって評価され得る。また、安定同位体前駆物質の感染後の代謝産物の解析などの、肝細胞代謝の解析も行なわれ得る。
【０２０４】
また、特定の薬物の有効性も、ヒト肝細胞が移植されたＦａｈ欠損マウスにおいて評価され得る。かかる薬物としては、例えば、高脂血症／アテローム性動脈硬化、肝炎およびマラリアを処置するための薬物が挙げられる。
【０２０５】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞が移植されたＦａｈ欠損マウス（またはＦａｈ欠損マウスにおいて増大させ、収集したヒト肝細胞）は、遺伝子療法プロトコルおよびベクターを試験するために使用される。例えば、以下のパラメータ：遺伝子導入ビークル（例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター）の形質導入効率；有効負荷遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｙｌｏａｄ）の組込みの頻度および位置（組込み部位の解析）；有効負荷遺伝子の機能性（遺伝子発現レベル、遺伝子ノックダウン効率）；ならびに有効負荷遺伝子の副作用（インビボでのヒト肝細胞における遺伝子発現の解析またはプロテオミクス）が評価され得る。例えば、家族性高コレステロール血症に苦しんでいる患者の遺伝子療法におけるトランスフェクト肝細胞の使用が報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３５，１９９４）。
【０２０６】
ＶＩＩＩ． ウロキナーゼをコード化するベクター
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスに、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）としても知られる）は、分泌型のヒトウロキナーゼである。別の実施形態において、該ウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照）。マウスにおけるウロキナーゼの発現に適した任意の型のベクターが企図される。このようなベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む。適したベクターとしては、ＤＮＡベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、テナガザル白血病のベクター、ＶＳＶ−Ｇ、ＶＬ３０ベクター、リポソーム媒介ベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。該アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型を含む、任意の適したアデノウイルスに由来し得る（Ａｄ２およびＡｄ５等であるが、これらに限定されない）。アデノウイルスベクターは、第１、第２、第３、および／または第４世代のアデノウイルスベクター、またはアデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、プラスミド、ホスホリン脂質、異なる構造のリポソーム（陽イオンおよび陰イオン）により構成することができる。別の実施形態において、該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。該ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られている任意の適したＡＡＶベクターであり得る。
【０２０７】
ウロキナーゼをコード化するウイルスおよび非ウイルスベクターは、当技術分野で周知である。例えば、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターは、米国特許第５，９８０，８８６号、およびＬｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１３）：６２１０−４，１９９５）に記載される。米国特許出願公開第２００５−１７６１２９号および米国特許第５，５８５，３６２号は、組み換えアデノウイルスベクターを記載し、米国特許第６，０２５，１９５号は、肝臓特的な発現のアデノウイルスベクターを開示する。米国特許出願公開第２００３−０１６６２８４号は、ウロキナーゼを含む、着目遺伝子の肝臓特異的な発現のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。米国特許第６，５２１，２２５号および第５，５８９，３７７号は、組み換えＡＡＶベクターを記載する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ０２４４３９３号は、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子遺伝子を含む、ウイルスおよび非ウイルスベクターを記載する。該ヒトウロキナーゼ遺伝子の高レベルの発現が可能である発現ベクターは、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３０８７３９３号に開示される。
【０２０８】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、任意に、適切なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコード化する遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンを含む、発現調節配列を含むことができる。通常、発現調節配列は、転写を指示するのに十分な最小配列である、プロモータを含む。
【０２０９】
該発現ベクターは、複製起点、プロモータ、ならびに形質転換細胞の表現型選抜を可能にする特異的遺伝子（抗生物質耐性カセット等）を含むことができる。通常、該発現ベクターは、プロモータを含み得る。該プロモータは、誘導性または構成的であり得る。該プロモータは、組織特異的であり得る。適したプロモータとしては、チミジンキナーゼプロモータ（ＴＫ）プロモータ、またはメタロチオネインＩプロモータ、またはポリヒドロンプロモータ、またはニューロン特異的エノラーゼプロモータ、またはチロシンヒドロキシラーゼプロモータ、またはベータアクチンプロモータ、または他のプロモータが挙げられる。一実施形態において、該プロモータは、異種プロモータである。
【０２１０】
一実施例において、ウロキナーゼをコード化する配列は、所望のプロモータの下流にある。任意に、エンハンサ要素もまた、含まれ、通常、該ベクター上のどこかにあり得、増強効果も有する。しかしながら、増大した活性量は、通常、距離とともに減少する。
【０２１１】
ウロキナーゼをコード化する該ベクターは、静脈内投与、または腹腔内投与、または門脈を介して血管内注入が挙げられるが、これらに限定されない、様々な経路により投与することができる。投与されたベクター量は、異なり、日常の実験を用いて決定され得る。一実施形態において、ＦＲＧマウスに、約１×１０^８〜約１×１０^１０のプラーク形成単位の用量で、アデノウイルスウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。好ましい一実施形態において、該用量は、約５×１０^９のプラーク形成単位である。
【０２１２】
例示的な一実施形態において、ＦＲＧマウスに、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターが投与される。アデノウイルスベクターは、非常に高い力価のある感染粒子に作製され得る、多種多様の細胞に感染する、分裂してない細胞へ遺伝子を効率的に転送する、およびゲストゲノムにほとんど組み込まれない（これは挿入突然変異により細胞形質転換のリスクを避ける）等の、他の型のウイルスベクターに優るいくつかの利点がある（Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９７，ｐａｇｅｓ ４４−５３、Ｚｅｒｎ ａｎｄ Ｋｒｅｓｉｎａｍ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２５（２），４８４−４９１，１９９７）。ウロキナーゼをコード化するために使用することができる代表的なアデノウイルスベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ（Ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：１０９−１２８，１９９１）、およびＢａｒｒら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：１５１−１５５，１９９５）に記載される。
【０２１３】
以下の実施例を提供し、ある特定の特性、および／または実施形態を説明する。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特性または実施形態に制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１４】
実施例１：Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（ＦＲＧ）マウスの作製
免疫不全マウスの作製には、いくつかの異なるストラテジーが使用され得、例えば、免疫抑制薬の投与によるもの、または１つ以上の遺伝子改変の導入によるものが挙げられる。この実施例では、遺伝子改変型の免疫不全マウスの作製を記載する。
【０２１５】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞が完全に欠如するが、ＤＮＡ修復欠損のない、免疫不全Ｆａｈ^−／−マウス株を作製するために、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（ＦＲＧ）マウスを作製した。オスＦａｈ^−／−１２９Ｓ４マウス（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）を、メスＲａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配させた。すべての動物に、１．６ｍｇ／Ｌの濃度で、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を含有する飲料水を与えてすべての動物を維持した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５３−４６０，１９９５）。各動物の遺伝子型を確認するために、ＰＣＲベースの遺伝子タイピングを、足指組織から単離した２００ｎｇのゲノムＤＮＡに実行した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ７：２２９８−２３０７，１９９３、Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４）。
【０２１６】
飲料水内にＮＴＢＣを継続して与えた場合、ＦＲＧマウスはよく生育し、十分な繁殖力があった。ＦＲＧマウス肝臓は、大きさおよび形において、肉眼的に正常であり、組織学的検査は、従来のＦａｈ^−／−マウスと該ＦＲＧマウスとの間で差異を示さなかった。従来のＦａｈ^−／−マウスの場合のように、ＮＴＢＣの中止は、ＦＲＧマウスにおいて、漸次の肝臓細胞損傷をもたらし、４〜８週間後、ＦＲＧマウスは最終的に死亡した（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２６６−２７３，１９９６）。
【０２１７】
実施例２：組織学および移植検出アッセイ
組織学および免疫細胞化学
ＦＡＨ免疫組織化学を、前述のように行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：５６５−５７４，２００２）。簡潔に述べると、ｐＨ７．４で、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定された肝臓組織および腎臓組織は、１００％エタノール中で脱水され、５８℃で、パラフィンワックスに包埋された。脱パラフィン処理した４μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、切片は、３％Ｈ_２Ｏ_２を含むメタノールで、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングのために処理した。また、アビジンおよびビオチンブロッキングは、一次抗体でインキュベーションする前に、行なった。切片は、室温で２時間、抗ＦＡＨウサギ抗体またはＨｅｐＰａｒ抗体（ＤＡＫＯ）でインキュベートし、次いで、ＨＲＰに接合した二次抗体でインキュベートした。シグナルは、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により検出した。
【０２１８】
ＦＡＨ酵素アッセイ
フマリルアセト酢酸は、受容者の肝臓からの細胞質の肝臓分画とともにインキュベートし、消失速度を、３３０ｎｍで分光学的に測定した。野生型およびＦａｈ^−／−肝臓はそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。フマリルアセト酢酸は、ホモゲンチジン酸から酵素的に調製した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０２１９】
Ａｌｕ配列のためのゲノムＰＣＲ
ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。ヒトＡｌｕ配列は、以下のプライマー５’−ＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号２）を用いた標準手順に従って、ＰＣＲにより増幅した。
【０２２０】
肝細胞特異遺伝子発現のためのＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。相補的ＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により合成した。表１に示されるプライマーは、ヒトまたはマウス特異的ｃＤＮＡ増幅のために使用した。
【０２２１】
【表１】

【０２２２】
ヒトアルブミンの測定
少量の血液を、ヘパリン化された毛細血管を有する左側の伏在静脈から１週間に１回採取した。トリス緩衝食塩水で１，０００倍または１０，０００倍希釈した後、ヒトアルブミン濃度は、製造業者のプロトコルに従って、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて測定した。
【０２２３】
蛍光免疫細胞化学
ヒト化マウス肝臓からの肝細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で懸濁し、コラーゲン型１被覆６ウェルプレート上に播種した。付着した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで、１５分間固定し、５％スキムミルクでブロックした。ウサギ抗ＦＡＨ、ヤギ抗ヒトアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）、ヤギ抗マウスアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）を、１／２００の希釈で、一次抗体として使用した。ＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ４８８抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ５５５抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体として使用した。該画像は、Ｎｉｋｏｎのデジタルカメラを用いることによりＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００顕微鏡で捕捉した。
【０２２４】
ＦＡＣＳ解析
受容者の肝臓の解離後、実質細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合した抗ヒトヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、Ｂ、Ｃ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）を接合した抗マウスＨ２−Ｋ（ｂ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。その後、これらをＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで解析した。ＦＩＴＣを接合したＩｇＧおよびＰＥを接合したＩｇＧを、負の対照として使用した（図８参照）。
【０２２５】
蛍光原位置ハイブリダイゼーション
全ゲノムＤＮＡプローブは、全マウスゲノムＤＮＡおよび全ヒトゲノムＤＮＡのニックトランスレーション法により作製した。Ｃｙ３−ｄＵＴＰの取り込みは、製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実行した。最終プローブ濃度は、２００ｎｇ／μｌであった。付着した細胞のあるスライドを、３７℃で１時間、１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅで処理し、２Ｘ ＳＳＣ中で３回（１回３分間）洗浄した。洗浄ステップ後、スライドを、７０％、９０％、および１００％エタノール中で、３分間、それぞれ脱水した。染色体を、７５℃で３分間、７０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で変性し、次いで、冷７０％、９０％、および１００％エタノールで３分間、それぞれ脱水した。プローブカクテルを、７５℃で１０分間変性し、３７℃で３０分間あらかじめハイブリダイズした。プローブを、スライドに適用し、湿潤チャンバ中で、３７℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、５０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で３回の３分洗浄、ＰＮ緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、２．５％ ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０）中で３回の３分洗浄において、すべて４５℃で行われた。スライドは、その後、紫外線蛍光（Ｚｅｉｓｓ）下で、ヘキスト（０．２ｕｇ／ｍｌ）で対比染色し、カバースリップをかぶせ、観察した。
【０２２６】
実施例３：ヒト肝細胞の単離および凍結保存
ヒト肝細胞は、前述の手順に従って、肝臓移植手術のために使用されないドナー肝臓から単離した（Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１５：Ｓ１０５−１１０，２００６）。簡潔に述べると、肝臓組織を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）およびＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）が追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス液（Ｃａｍｂｒｅｘ）で潅流し、次いで、既存の脈管構造を通してイーグル最小必須培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、１００ｍｇ／ＬのコラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）および５０ｍｇ／ＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて消化した。該細胞を、イーグル最小必須培地と７％小ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で、５０ｘｇで２分間、３回洗浄した。ペレット化された肝細胞は、冷ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）に移した。
【０２２７】
輸送された肝細胞は、１ｍｌあたり５×１０^６の肝細胞で、１０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドが追加されたＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液に移した。該クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）を、紙タオルで厚く覆い、−８０℃で１日間保存し、液体窒素に最終的に移した。解凍のために、細胞を、３７℃の水浴中で急速に再加熱し、ＤＭＥＭを徐々に加え、ＤＭＳＯ濃度の変化速度を最小化した。
【０２２８】
実施例４：ヒト肝細胞を用いたＦＲＧマウス肝臓の再増殖
ウロキナーゼの過剰発現は、いくつかの系において、肝細胞移植を強化することが示されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１０２９−１０３７，１９９５）。したがって、実験を行い、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼを発現するアデノウイルスの投与が有益であるかどうかを判定した。分泌型のヒトウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；ｕＰＡ）を発現するアデノウイルスベクターは、先に説明されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６２１０−６２１４，１９９５および米国特許第５，９８０，８８６号参照）。
【０２２９】
ドナー肝細胞は、単離し、単離してから２４〜３６時間後に、移植した。大抵の場合、細胞は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液中に保存し、輸送中、４℃に保った。しかしながら、２つの実験において、凍結保存した肝細胞を移植した。ドナー肝細胞の生存能力および品質は、１０％〜６０％の範囲の平板効率を伴い、大いに変化した。
【０２３０】
移植手術のために、以下の汎用プロトコルを使用した。成熟（６〜１５週齢）オスまたはメスＦＲＧマウスに、移植手術する２４〜４８時間前に、ｕＰＡアデノウイルス（マウスあたり５×１０^９のプラーク形成単位（ＰＦＵ））の静脈注射（後眼窩注射）をした。１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地中で、１００万の生存能力のあるヒト肝細胞（トリパンブルー色素排除試験法により判定された）を、２７ゲージ針で脾臓内に注入した。ＮＴＢＣの投与を、次の６日間（１．６ｍｇ／Ｌ ０〜２日目、０．８ｍｇ／Ｌ ３〜４日目、０．４ｍｇ／Ｌ ５〜６日目）にわたり徐々に中止し、移植手術から１週間後、完全に中止した。ＮＴＢＣの投与を停止してから２週間後、動物は、５日間薬物の投与を再開した後、再度中止した。
【０２３１】
３つの別個の移植手術において、ヒト肝細胞の一次移植は、最初にｕＰＡアデノウイルスを受けた受容者であるＦＲＧマウスにおいて観察した。したがって、ｕＰＡの前処理レジメンを、ほとんどのその後の移植手術実験において使用した。
【０２３２】
全体で、９つの異なるドナーからのヒト肝細胞をうまく使用して、ｕＰＡアデノウイルスレジメンの導入後、移植の失敗は生じなかった。これらのうち、７つは、脳死ドナーの肝臓から単離し、２つは、外科的肝臓切除術から単離した。ドナーの年齢は、１．２歳から６４歳の範囲で異なった（表２）。
【０２３３】
【表２】

【０２３４】
すべての実験において、少なくとも１つの受容者に、細胞バッチの使用にかかわらず、本プロトコルを用いて、ヒト肝細胞が有意に移植された（＞１％ヒト細胞）。移植は、組織学、ＤＮＡ解析、酵素アッセイ、および後の実験である、ヒト血清アルブミンを含む、異なる方法により実証された。アルブミンレベルによりモニターされた移植手術において、４３のうちの１７（３９．５％；１２〜６７％）の一次受容者は再増殖した（表２および図３）。これらのうち、７つは、高度に再増殖し（３０〜９０％）、アルブミンレベル＞１ｍｇ／ｍｌに達した。死体肝臓からの肝細胞だけでなく、肝臓切除術からの肝細胞も移植した。さらに、凍結保存細胞も、無事に移植された。
【０２３５】
高度に移植されたマウス（＞３０％再増殖）において、移植されたＦＲＧマウスの体重は、第２のＮＴＢＣ中止中に、安定したのに対して、同一の細胞を与えたＩｌ２ｒｇ（Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^＋／−）のヘテロ接合型である免疫不全同腹仔のうち減量し続けたものは少なかった（図１ａ）。三重変異体マウスにおいて、この体重の安定は、移植されたヒト肝細胞が、罹患Ｆａｈ^−／−受容肝細胞の機能を置換していることを示唆した。完全に体重が安定化するや否や（初期移植手術から２〜３ヶ月後）、受容者の肝臓は、その後、採取された。肉眼的に、ＦＲＧ肝臓は、大きさおよび形において、正常であり、肉眼的結節はなかった。ヒト特異的Ａｌｕ ＤＮＡ配列のゲノムＰＣＲは、ＦＲＧ受容者の肝臓において陽性であったのに対して、Ｉｌ２ｒｇヘテロ接合体は、すべて陰性であった（図１ｂ）。再増殖細胞の肝細胞機能を直接確認するために、ＦＡＨ酵素活性を、アッセイした（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０２３６】
レシピエントマウスの肝臓は、正常マウス肝臓と同等またはそれを超える、多量のＦＡＨ酵素活性があった（図１ｃ〜ｅ）。ＦＡＨは、十分に分化した肝細胞において、単独に発現するため、移植されたヒト肝細胞は、マウス肝臓に移植された場合、脱分化または異常がないことを示唆した。ＦＡＨ免疫染色により、７０％以上の肝実質が、ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞によって再増殖されたことが確認された（図１ｆおよび図１ｇ）。
【０２３７】
組織学的および免疫組織化学的試験は、追加の受容者の肝臓を用いて行った（図２ａおよび図２ｂ）。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、受容者の肝臓の構造に完全に統合されたようであった。いくつかの受容者において、移植された肝細胞は、受容者の肝臓組織を阻害することなく、８０％以上の柔組織を占めた（図２ｂ、２ｅ、および２ｆ）。クローン的に増加しているヒト肝細胞は、形態学的に、大きさにより、およびそれらの蒼白の細胞質により、マウス肝細胞とは明らかに区別することができた（図２ｃおよび図２ｄ）。ヒト肝細胞のその大きさは、恐らく、上述に報告されるようにグリコーゲン蓄積のため、比較的大きく、それらの細胞質は、鮮明であった（Ｍｅｕｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：８４７−８５６，２００５）。ＦＡＨ陽性肝細胞はまた、ＨｅｐＰａｒ抗体に対しても陽性であり、この抗体はヒト肝細胞を特異的に標識化するが、マウス肝細胞は、標識化しない（図２ｅおよび図２ｆ）。対照的に、ＦＡＨ陰性領域は、ＮＴＢＣ投与の中止後、従来のＦａｈ^−／−マウスにおいて所見と一致する、壊死炎症（ｎｅｃｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を示し、異形成肝細胞を含んだ。
【０２３８】
再増殖したヒト肝細胞が、成熟肝細胞特異遺伝子を発現するかどうかを検査するために、ＲＴ−ＰＣＲを、受容者の肝臓から抽出されたメッセンジャーＲＮＡに行った。ヒトアルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、トランスフェリン（ＴＦ）遺伝子、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子、チロシンアミノ転移酵素（ＴＡＴ）遺伝子、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子が、受容者の肝臓において、多量に発現した（図３ａ、図６ｃ、および図７）。肝細胞の機能性をまた、ヒトアルブミンの血中濃度を測定することにより評価した。ヒトアルブミンに対して特異的なＥＬＩＳＡキットを使用し、検出の閾値は、１：１００に希釈した試料を用いて、０．０５μｇ／ｍｌであった。ヒトアルブミンは、まず、一次受容者において、移植手術から４〜１０週間後に検出された。当初は、ヒトアルブミンレベルに変動があったが、その後、ヒトアルブミンの濃度は、さらに数週間、相対的に漸増した（図３ｂおよび図３ｃ）。
【０２３９】
キメラマウスにおけるヒト肝細胞の機能性をさらに評価するため、ヒト化マウスの胆汁酸組成およびリポタンパク質プロフィールを、正常なヒトおよびマウスの胆汁ならびにリポタンパク質のプロフィールと比較した。以下に示すように、ヒト化レベルを有するマウスの胆汁はヒト胆汁の組成に類似しており（表３）、ヒト化マウスは、ヒトと同様の高いＬＤＬおよびコレステロールレベルを有する（表４）。デオキシコール酸の存在はヒト胆汁に典型的であり、β−ムリコール酸レベルは、正常マウスの胆汁中よりもずっと低かった。コレステロールレベルはヒト化マウスにおいてずっと高く、この増大は、ＬＤＬコレステロールに起因したものであり得る。
【０２４０】
【表３】

【０２４１】
【表４】

脂質は、非移植対照（Ｃ１〜Ｃ３）および高度にヒト化された（＞７０％）ＦＲＧマウス（Ｔ１〜Ｔ４）において測定した。
【０２４２】
薬理作用のアルプロティナーゼ阻害剤は、高度に再増殖したマウスの生存能力を長期間維持するために必要であり得、該ドナー肝細胞により産生されたヒト補体は、受容者の腎臓に損害を与える可能性がある（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ． Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４参照）。したがって、いくつかの（ｎ＝３）高度に再増殖したマウスを、長期間観察した。これらのマウスは、ＮＴＢＣの投与を中止した４ヶ月間減量しなくて、マウスのヒトアルブミン濃度は、安定していた。さらに、該マウスの腎臓は、採取時に、肉眼的かつ組織学的に正常であった（図２ｇ）。
【０２４３】
実施例５：ヒト肝細胞の連続移植
前述の肝臓異種再増殖モデルの限界のうちの１つは、移植されたヒト肝細胞をさらに増大させる能力の低下である。該ＦＲＧマウス系において、連続移植の実行可能性を試験するために、高度に再増殖した一次受容者の肝臓（約７０％ヒト細胞）を潅流し、実質肝細胞を、標準コラゲナーゼ消化プロトコルを用いて採取した。
【０２４４】
ヒト細胞で再増殖したマウスに麻酔をかけ、門脈または下大静脈に、２４ゲージのカテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのＥＢＳＳで５分間潅流した。該溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＸＩ（ｓｉｇｍａ）および０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（ｓｉｇｍａ）が追加されたＥＢＳＳに１０分間変更した。該肝臓は、第２の溶液中で徐々に細分化し、７０μｍおよび４０μｍのナイロン製のメッシュで連続して濾過した。５分間、１５０ｘｇで遠心分離した後、該ペレットを、５０ｘｇで２分間、さらに２回洗浄した。細胞の数および生存能力は、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。
【０２４５】
１００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁された１００万の生存能力のある細胞を、２７ゲージ針で受容者の脾臓に注入した。Ｆａｈ陽性ヒト肝細胞とＦａｈ陰性マウス肝細胞に分離することなく、二次ＦＲＧ受容者への肝細胞の移植手術を行った。一次移植のために使用した該細胞と対照的に、本方法において採取されたヒト肝細胞の生存能力は、＞８０％であり、それらは、コラーゲンで被覆した培養プレートに容易に付着した（図４ｃ〜ｅ）。二次受容者の移植後、該連続移植は、類似の方法において、三次および四次受容者に対して継続された。各世代において、すべてではないが、一部のレシピエントマウスのヒト血清アルブミンは、高度に陽性になった（図４ａ）。高度に再増殖したマウスの割合は、順次移植受容者においてさらに高く（７／４３と比較して１７／２８）、アルブミンの増加率は、さらに一貫していた（図３ｅ）。これは、連続継代の肝細胞が、最も移植可能なヒト肝細胞の質を高めることを表す可能性がある、あるいは、ドナーマウスから新たに採取した細胞のさらなる高品質および生存能力を単に反映する可能性がある。アルブミン陽性マウスからの肝臓試料のゲノムＰＣＲは、各世代において、ヒトＤＮＡの存在を示した（図４ｂ）。ヒト肝細胞による肝臓再増殖はまた、ＦＡＨに対する蛍光免疫染色により確認された（図４ｃ〜ｅ）。組織学的検査は、移植されたヒト肝細胞が、各世代において、形態学的に類似し、明らかにＦＡＨ陽性であることを示した（図４ｆ〜ｈ）。
【０２４６】
実施例６：肝細胞再増殖は、細胞融合の結果ではない。
【０２４７】
ウロキナーゼトランスジェニックマウスにおいて、一次細胞を用いた肝臓再増殖の最新報告は、細胞融合が、明らかな「肝細胞再増殖」を潜在的に明らかにすることを実証した（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５：２４７−２５７，２００６）。ｕＰＡトランスジェニックマウスが、その研究に使用されたため、これらの所見は、細胞融合がまた、他の報告において、マウス肝臓ヒト化のメカニズムでもあることの可能性を高めた。造血細胞と肝細胞との間の細胞融合はまた、Ｆａｈ欠損マウスにおいても観察されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２２：８９７−９０１，２００３）。マウス細胞とヒト細胞との間の細胞融合は、薬学的応用のために、ヒト化マウス肝臓の価値を大幅に減退し得る。該再増殖した肝細胞が、元来は真にヒト肝細胞であったことを確認するために、ヒトまたはマウス特異的アルブミン、およびＦＡＨに対して二重免疫染色を行った。ほとんど（＞９５％）のマウスアルブミン陽性肝細胞は、実際には、ＦＡＨ陰性であり、ほとんどのＦＡＨ陽性肝細胞は、マウスアルブミン陰性であった（図５ａ〜ｃ）。他方では、ほとんどすべて（＞９０％）のヒトアルブミン陽性肝細胞はまた、ＦＡＨ陽性であるが、一方残りの肝細胞は、二重陰性であった（図５ｄ〜ｆ）。
【０２４８】
アルブミンは、分泌タンパク質であり、故に、細胞は、他の細胞から異種アルブミンを得ることにより抗体陽性を示すことができた。細胞融合の欠如をさらに確認するために、ヒトおよびマウス抗主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗体を、フローサイトメトリーのために使用した。各抗体は、種特異であることが確認された（図５ｆ〜ｊ）。両方の種の表面マーカーとも肝細胞陽性でないことが、高度に再増殖した肝臓に認められた（図５ｋおよび図５ｌ）。
【０２４９】
最終的に、蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、高度に再増殖した移植受容者から得た肝細胞に、ヒトおよびマウス全ゲノムプローブを用いて行った。高度に再増殖した一次（キメラマウス＃５３１）および三次（キメラマウス＃６３１）マウスから得た肝細胞を、ヒト全ゲノムＤＮＡあるいはマウス全ゲノムＤＮＡを用いてハイブリダイズした。該ヒトプローブまたは該マウスプローブに対して陽性である細胞の割合を記録した（表５）。対照は、純ヒトおよびマウス肝細胞、またはヒト肝細胞とマウス肝細胞の等混合であった。キメラ肝臓において見出されたヒト細胞が、細胞融合の産物であった場合、多くの肝細胞は、ヒトプローブとマウスプローブの両方に対して二重陽性であり、故に、マウスＤＮＡおよびヒトＤＮＡが陽性である細胞の割合は、１００％を超え得る。それどころか、割合合計は、ヒト肝細胞とマウス肝細胞の混合の場合と同じように、ほぼ１００％であると概算された。さらに、ヒト肝細胞は、脾臓が、ヒト細胞の融合パートナーとしての役割をし得るマウス肝細胞を欠如するという事実にもかかわらず、高度に再増殖したマウスの脾臓に検出された（図２ｈ）。したがって、二重陽性細胞（融合産物）は、ヒト細胞の大部分を占めることができなかった。
【０２５０】
【表５】

【０２５１】
総合すれば、これらの結果は、融合事象が生じる場合、融合事象は、まれであり、再増殖する細胞の大部分は、連続移植を行う場合でさえ、純ヒト由来からなることを示す。したがって、ＦＲＧマウスにおいて増大されるヒト肝細胞は、ヒトの遺伝的および生化学的性質のみ有する。
【０２５２】
実施例７：ヒト化マウスにおける薬物代謝の機能的特性
キメラマウスにおける、ヒト肝臓特異的遺伝子の基底の発現および誘導を、検査した。培養された肝細胞におけるテストステロン代謝およびエトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性の評価を、それぞれ、Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．２７：８８７−８９４，１９９９）、およびＷｅｎら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：９７７−９８４，２００２）に記載されるように実行した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲを、Ｋｏｍｏｒｏｓｋｉら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３２：５１２−５１８，２００４）に記載されるように実行した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られたプライマーは、ヒトＣＹＰ１Ａ１（Ｈｓ００１５３１２０＿ｍ１）、ＣＹＰ１Ａ２（Ｈｓ００１６７９２７＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ４（Ｈｓ００４３００２１＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ７（Ｈｓ００４２６３６１＿ａ１）、ＣＹＰ２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７＿ｇ１）、ＣＹＰ２Ｄ６（Ｈｓ００１６４３８５＿ａ１）、多剤体制関連タンパク質ＭＲＰ２（Ｈｓ００１６６１２３＿ｍ１）、胆汁塩輸出ポンプＢＳＥＰ、（Ｈｓ００１８４８２９＿ｍ１）、ＣＡＲ（Ｈｓ００２３１９５９＿ｍ１）アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１＿ｍ１）、ＨＮＦ４α（Ｈｓ００２３０８５３＿ｍ１）、シクロフィリン（Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１）、およびマウスアクチン（Ｍａ００６０７９３９＿ｓ１）に対して特異的であった。
【０２５３】
単離された肝細胞の培養物を、構築し、シトクロムＰ４５０遺伝子の原型誘導物質に暴露した。該結果は、シトクロム（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７）、輸送（ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２）、および薬物抱合酵素（ＵＧＴ１Ａ１）の基底遺伝子発現レベルは、培養された正常成熟ヒト肝細胞に見られる、まさにそのものであった（図６ｃ、図７）。さらに、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）のような化合物により誘発された遺伝子型は、正常ヒト細胞から予期されたとおりであった。ヒト薬物代謝遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに加えて、ヒトＣＹＰ１Ａおよび３Ａファミリーメンバーの酵素活性を測定した。エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ活性（ＥＲＯＤ）は、ヒト肝臓において、ＣＹＰ１Ａ１および１Ａ２により媒介されることが知られている。該結果は、ＥＲＯＤ活性が、ヒト化マウス肝臓細胞において、ＢＮＦへの事前暴露により特異的かつ堅牢的に誘導されたことを示す（図６ａ）。逆に、ＰＢまたはリファンピシンへの事前暴露は、ＣＹＰ３Ａ４を介した代謝の特異的測定である６−ベータ−ヒドロキシルテストステロンへのテストステロンの転換を特異的に誘導した（図６ｂ）。したがって、再増殖したＦＲＧ肝臓からの肝細胞は、これらの標準薬物代謝アッセイにおいて、正常成熟ヒト肝細胞との区別がつかなかった。
【０２５４】
実施例８：肝細胞再増殖前のマクロファージの減損
一次移植は、ウロキナーゼアデノウイルスの事前投与を行っても、１００％のＦＲＧレシピエントマウスで生じなかった。ＦＲＧマウスにおいて、正常数存在する肝臓マクロファージは、先天性免疫反応を促進することにより、ヒト細胞移植を限定することが可能である。
【０２５５】
潜在的なマクロファージにより惹起される免疫反応を中止するために、ＦＲＧマウスから、ヒト肝細胞の移植手術前に、マクロファージを減損させる。マクロファージ減損は、化学的減損（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：３５−４３，２００３）、または抗体（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０６：１２５９−１２６１，２００５）を用いることを含む、当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて達成され得る。マクロファージはまた、クロドロネート含有リポソームを用いて減損され得る（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）。マクロファージを減損するための追加の化合物および組成物は、米国特許公開第２００４−０１４１９６７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０８７４２４号に記載される。マクロファージ減損後、ＦＲＧマウスに、本明細書の前述の実施例に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植する、または連続移植する。
【０２５６】
実施例９：Ｆ^ｐｍＲＧマウスにおけるヒト肝細胞の移植
ＦＲＧマウスは、Ｆａｈ遺伝子のエクソン５（Ｆａｈ^{Δｅｘｏｎ５}）に欠失を含む。ヒト肝細胞を、Ｆａｈ欠損の任意のモデルにおいて、移植および増大し得ることを確認するために、Ｆａｈ遺伝子に点変異を含むマウス株を作製した。Ｆａｈ点変異（Ｆａｈ^ｐｍ）マウスと呼ばれる、これらのマウスは、ミススプライシングを起させＦａｈ ｍＲＮＡにおいて、エクソン７の喪失を生じさせる該Ｆａｈ遺伝子に点変異を有する（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１、参照することにより本明細書に組み込まれる）。表現型における差異は、Ｆａｈ^ｐｍマウスとＦａｈ^{Δｅｘｏｎ５}マウスとの間で検出されなかった。
【０２５７】
Ｆａｈ^ｐｍマウスをＲａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス（実施例１に記載されるような）と交配させて、ホモ接合性Ｆａｈ^ｐｍ／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−（Ｆ^ｐｍＲＧ）三重変異体マウスを作製した。Ｆ^ｐｍＲＧマウスの２つのコホートに、実施例４に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植した。肝細胞移植手術の約２４〜４８時間前、マウスは、ｕＰＡアデノウイルスの静脈注射（後眼窩注射）を受けた。比較するために、同時に、ＦＲＧマウスに、ヒト肝細胞を移植した。ヒト血清アルブミンを、移植手術から２ヶ月および３ヶ月後に、極めて有意なレベル（２３μｇ／ｍｌ）で、Ｆ^ｐｍＲＧマウスの末梢血に検出した。ヒト血清アルブミンのこれらの血中濃度は、同時に移植されたＦＲＧマウスに見られる濃度と似ていた。
【０２５８】
これらの結果は、Ｆ^ｐｍＲＧマウスが、ＦＲＧマウスと同程度に、ヒト肝細胞で再増殖することができることを示す。したがって、ヒト化肝臓再増殖は、Ｆａｈ^{Δｅｘｏｎ５}変異を有するＦＲＧマウスに特有ではないが、Ｆａｈ欠損マウスの任意の株で達成することができる。
【０２５９】
実施例１０：ＦＲＧマウスにおけるヒト肝細胞の移植を増進させるためのＩＬ−１Ｒアンタゴニストの使用
上記（実施例４など）のヒト肝細胞再生息法を使用すると、５０％より大きいマウス肝臓のヒト化が達成されることは稀である。１００万個のヒト肝細胞を移植した後であっても、ヒトアルブミンの血清レベルは、初期において検出不可能であり、これは、ほとんどのヒト肝細胞が再生息の初期段階でなくなったことを示す。
【０２６０】
ＩＬ−１Ｒの活性化のブロックによってマクロファージの活性化が消去され得、したがって、移植されたヒト肝細胞の破壊が抑制され得るかどうかを調べた。アナキンラは、重度の関節炎に対してＦＤＡに承認された組換えヒトＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（Ａｍｇｅｎ）である。アナキンラ投与により、炎症応答経路がブロックされ、以下に示すように、肝細胞に再生息に対してプラスの影響を有する。
【０２６１】
同じバッチの１００万個のヒト肝細胞を６匹のＦＲＧマウスに脾臓内に注入した。３匹のマウスには、アナキンラ（２ｍｇ）を外科処置中に腹腔内投与し、次いで、１日１回でさらに６回投与した（総用量＝７日間で１４ｍｇ）。移植の１ヶ月後、血中ヒトアルブミンをＥＬＩＳＡによって測定した。アナキンラでの処置により、肝細胞の再生息が顕著に増進した。アナキンラを受けなかった３匹のうち２匹のマウスは検出可能なヒトアルブミンを有さず、３匹のうち１匹のマウスでは、アナキンラは３μｇ／ｍｌの濃度で検出された。３匹のアナキンラ処置マウスはすべて、ずっと高いアルブミンレベル（１３０、１６５および２００μｇ／ｍｌ）を有していた。
【０２６２】
さらなる実験により、これらの初期観察結果を確認した。以下の表６に、３つの独立した試験の結果を示す。遺伝学的に同一のマウスのコホートに同じバッチのヒト細胞を注入し、未処置とする（Ｃｏｎ）か、またはアナキンラで処置するか（Ａｎａ）のいずれかとした。異なるアナキンラ投薬レジメンを使用し、異なる投与期間で試験した。高用量アナキンラ（Ｈｉ）は２ｍｇ／マウス／日とし、低用量（ｌｏ）は０．４ｍｇ／マウス／日とした。薬物は、３日間（×３）または７日間（×７）のいずれかで毎日注射した。ヒトアルブミンの血中レベルはＥＬＩＳＡによって測定し、ヒト再生息の度合を確認した。
【０２６３】
【表６】

アナキンラで処置したマウスは、一貫して、ずっと高い再生息レベルを有していた。アナキンラで処置したマウスだけがミリグラム／ミリリットル範囲の血中レベルに達した。平均すると、アナキンラでの処置により、およそ１００倍の再生息の増進がもたらされた。概して、高用量（２ｍｇ／日）で、最も一貫した結果が得られた。
【０２６４】
この結果は、ヒト肝細胞の移植後に高度にヒト化されたＦＲＧマウスの割合は、処置なしの場合よりもアナキンラで処置した場合の方が有意に高いことを示す。薬物代謝試験および一部のウイルス学的適用用途では、ヒト細胞での肝臓の再生息は７０％を超えなければならない。したがって、再生息効率の増大は、さまざまな研究および治療目的に望ましい。また、アナキンラでの処置により、ヒトの臨床的肝細胞の移植の効率が増進され得、臨床的に実行可能な処置となり得る。
【０２６５】
本開示の原理が適用され得る多くの考えられ得る実施形態を鑑みると、例示した実施形態は、本開示の好ましい一例にすぎないことが認識されるはずであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。そうではなく、本開示の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明はすべて、特許請求の範囲の範囲および精神に含まれるものであることを主張する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞を免疫不全のＦａｈ欠損マウスに移植する工程であって、ここで、（ｉ）該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または（ｉｉ）該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される工程；および
該ヒト肝細胞が増大するのを可能にする工程であって、それにより該ヒト肝細胞が増大する工程
を含む、インビボでのヒト肝細胞を増大させる方法。
【請求項２】
前記ヒト肝細胞を少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスがＦａｈ遺伝子にホモ接合型破壊を含み、該破壊は、機能性ＦＡＨタンパク質の発現低下をもたらす、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記破壊が、前記Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失または１つ以上の点変異を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記破壊が、前記Ｆａｈ遺伝子における欠失を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスは、機能性のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が欠乏している、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マウスの前記免疫不全が遺伝子改変、免疫抑制、またはその組合せによるものである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マウスの前記免疫不全が遺伝子改変によるものであり、前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスが、リコンビナーゼ活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）欠損、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）欠損、インターロイキン−２受容体γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）欠損、ＳＣＩＤ変異、非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）遺伝子型、ヌードマウス変異、およびその組合せからなる群より選択される遺伝子改変を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスが、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、ＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウス、またはＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記マウスがＦａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−マウスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫不全が免疫抑制によるものであり、前記マウスに１種類以上の免疫抑制薬を投与して該免疫不全を誘導する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種類以上の免疫抑制薬が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにその組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスがＩＬ−１Ｒの発現について欠損型である、請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マウスがＩｌ１ｒ１遺伝子の破壊についてホモ接合型であり、該破壊は、機能性ＩＬ−１Ｒタンパク質の発現低下をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記破壊が、前記Ｉｌ１ｒ１遺伝子における挿入、欠失または１つ以上の点変異を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マウスが、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウス、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウス、ＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−マウスまたはＮＯＤ／Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／− マウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される、請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＬ−１Ｒアンタゴニストがアナキンラである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アナキンラが約０．２ｍｇ／日〜約６ｍｇ／日の用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アナキンラが約５日間〜約１０日間投与される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
肝細胞の移植の前に、前記マウスに２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を投与する、請求項１〜２０いずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＴＢＣが約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＴＢＣが飲料水にて投与される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
肝細胞の移植の前に前記飲料水にて投与される前記ＮＴＢＣの濃度が約１ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＴＢＣが食品にて投与される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＴＢＣが注射によって投与される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒト肝細胞を移植する前に、前記マウスにヒトウロキナーゼをコードしているベクターを投与する、請求項１〜２６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターが静脈内投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが肝細胞の移植の約２４〜４８時間前に投与される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒト肝細胞の移植が、前記マウスの脾臓または門脈への該ヒト肝細胞の注入を含む、請求項１〜２９いずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスに移植される前記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、請求項１〜３０いずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト肝細胞が、臓器ドナーの肝臓から単離されたもの、外科的切除により単離されたもの、または幹細胞、単球もしくは羊膜細胞から誘導されたものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記肝細胞が注入前に低温保存されたものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、前記マウスから前記ヒト肝細胞を収集する工程を含む、請求項１〜３３いずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト肝細胞を前記マウスの肝臓から収集する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、前記収集したヒト肝細胞を累代移植によって増大させる工程を含む、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、前記マウスから生物学的試料を収集する工程を含む、請求項１〜３６いずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的試料が血液、尿、細胞または組織試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ｉ） ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される工程；および
（ｉｉ） ヒト肝臓疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝臓疾患の１つ以上の徴候または症状の改善は、該候補薬剤が該肝臓疾患の処置に有効であることを示す工程、
を含む、ヒト肝臓疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法。
【請求項４０】
前記ヒト肝臓疾患がヒト肝臓病原体による感染である、請求項３９に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ） ヒト肝細胞を移植した前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスの該移植ヒト肝細胞は該肝臓病原体に感染させたものである工程；および
（ｉｉ） 該肝臓感染症に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損マウスの感染量と比べた該肝臓病原体の感染量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す工程、
を含む、方法。
【請求項４１】
前記感染量を、前記マウスから採取した試料中の前記病原体の力価を測定することにより決定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記感染量を、前記マウスから採取した試料中の病原体特異的抗原を測定することにより決定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染量を、前記マウスから採取した試料中の病原体特異的核酸分子を測定することにより決定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記肝臓病原体が肝指向性ウイルスである、請求項４０〜４３いずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記肝指向性ウイルスがＨＢＶまたはＨＣＶである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヒト肝臓疾患が肝硬変である、請求項３９に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ） ヒト肝細胞を移植した前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスには、該マウスにおいて肝硬変の発生を誘発する化合物が投与されている工程；および
（ｉｉ） 該免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいて、肝硬変の少なくとも１種類の診断用マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝硬変の少なくとも１種類の診断用マーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損マウスと比べた該Ｆａｈ欠損マウスにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少またはアルブミンの増加は、該候補薬剤が肝硬変の処置に有効であることを示す工程、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記ヒト肝臓疾患が肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項３９に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ） ヒト肝細胞を移植した前記免疫不全のＦａｈ欠損マウスに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与され、該免疫不全のＦａｈ欠損マウスには、該マウスにおいてＨＣＣの発生を誘発する化合物が投与されているか、または悪性肝細胞が移植されている工程；および
（ｉｉ） 該免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいてＨＣＣに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該マウスと比べた該マウスの腫瘍成長または腫瘍体積の減少は、該候補薬剤がＨＣＣの処置に有効であることを示す工程、
を含む、方法。
【請求項４８】
（ｉ） ヒト肝細胞を移植した免疫不全のＦａｈ欠損マウスに外因性因子を投与する工程であって、ここで、該マウスは、さらにＩＬ−１Ｒの発現について欠損型であるか、または該マウスにＩＬ−１Ｒアンタゴニストが投与される工程；および
（ｉｉ） 該免疫不全のＦａｈ欠損マウスにおいて、肝臓機能の少なくとも１種類のマーカーを測定する工程であって、ここで、該肝臓機能の少なくとも１種類のマーカーが、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、該外因性因子の投与前の該マウスと比べて該マウスにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの増加またはアルブミンの減少は、該外因性因子が毒性であることを示す工程、
を含む、ヒト肝細胞に対する外因性因子のインビボでの効果の評価方法。
【請求項４９】
前記外因性因子は、既知の毒素であるかまたは毒素である疑いがある物質である、請求項４８に記載の方法。

【図１ｆ】

【図１ｇ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図２Ｇ】

【図２Ｈ】

【図４ａ】

【図４ｃ】

【図４ｄ】

【図４ｅ】

【図４ｆ】

【図４ｇ】

【図４ｈ】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図５ｃ】

【図５ｄ】

【図５ｅ】

【図５ｆ】

【図５ｋ】

【図５ｌ】

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図１ｃ】

【図１ｄ】

【図１ｅ】

【図３ａ】

【図３ｂ】

【図３ｃ】

【図３ｄ】

【図３ｅ】

【図４ｂ】

【図５ｇ】

【図５ｈ】

【図５ｉ】

【図５ｊ】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図６ｃ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図７ｃ】

【図７ｄ】

【図７ｅ】

【図７ｆ】

【図７ｇ】

【図７ｈ】

【図８】

【公表番号】特表２０１２−５２５１５４（Ｐ２０１２−５２５１５４Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０８７８３（Ｐ２０１２−５０８７８３）
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３２１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７２７５
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０６１２４２３９）オレゴン　ヘルス　アンド　サイエンス　ユニバーシティ (8)
【Ｆターム（参考）】