生体分子に共有結合できる、複数の官能基を持つ表面固定化高分子電解質
【課題】
【解決手段】複数の露出した官能基を有し、かかる各基が分子と共有結合できる高分子電解質を、生体分子に結合させる目的で表面に固定化する。生体分子は、例えば、核酸、例えばアミン官能化オリゴヌクレオチドでよい。高分子電解質は、例えば、共有固定化手段、例えばトシル活性化微粒子の表面との反応を用いて官能化表面に結合されるBSA（ウシ血清アルブミン）を含むことができる。このような反応の後、タンパク質上に露出している、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル基のような反応性官能基をさらに利用し、好適な化学を用いて関心対象のオリゴヌクレオチドを共有結合できる。
【解決手段】複数の露出した官能基を有し、かかる各基が分子と共有結合できる高分子電解質を、生体分子に結合させる目的で表面に固定化する。生体分子は、例えば、核酸、例えばアミン官能化オリゴヌクレオチドでよい。高分子電解質は、例えば、共有固定化手段、例えばトシル活性化微粒子の表面との反応を用いて官能化表面に結合されるBSA（ウシ血清アルブミン）を含むことができる。このような反応の後、タンパク質上に露出している、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル基のような反応性官能基をさらに利用し、好適な化学を用いて関心対象のオリゴヌクレオチドを共有結合できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、2003年9月22日出願の米国仮出願番号第60/504,716号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、高分子電解質化学の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドの「スポットアレイ」の診断使用に関連する多くの問題（この問題については、2002年8月23日に出願された、米国特許出願第10/204,799号；国際公開第01/98765号、“Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific Random Particle Arrays,”の中で概略が述べられている）を解決するための別の方法として、好ましいアレイが、オリゴヌクレオチドプローブを、ポリマー樹脂製のコード化された粒子を含むコード化されたマイクロビーズ粒子に結合させることによって形成される。2002年10月15日出願の米国特許出願第10/271,602号“Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection,”、および第10/204,799号上記を参照。コード化された粒子−プローブ複合体は、次に二次元アレイ型に組み立てられて、プローブに対し相補的なサブシーケンスを持つターゲットポリヌクレオチドを含有すると思われるサンプルと接するように置かれるが、この場合サンプル中のターゲットポリヌクレオチドは事前に蛍光標識されている。プローブとターゲットとの結合は、蛍光アッセイシグナルの存在によって判定される。アレイを解読することによって、陽性のアッセイシグナルを発生する特定のプローブを判定できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
マイクロビーズにオリゴヌクレオチドプローブを付着するための方法がいくつか知られており、また市販されている。微粒子へのオリゴヌクレオチドプローブを共有固定化する方法は数多く工夫されており、公開文献または市販品として利用できる。伝統的な共有固定化する技術は、官能化ビーズ（即ちアミノ、カルボキシル、トシル、アルデヒド、エポキシ、ヒドラジド等のような反応基で官能化されたビーズ）を用い、オリゴヌクレオチドプローブ末端にある相補的官能基と結合する（Maire K.Walsh, Xinwen WangおよびBart C. Weimer、Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto glass beads, J. Biochem. Biophys. Methods 2001; 47:221-231）。この様な結合プロトコルでは配向が不適切となり、立体障害問題を起こすことが多い。このように共有固定化されたプローブのハイブリダイゼーション性能は、スペーサー分子を導入することで改善できるが（Edwin Southern, Kalim MirおよびMikhail Schepinov；Molecular interactions on Microarrays. Nature Genetics Supplement, 21, 1999, pp.5-9）、実施が難しく、実用的でないことが多い。
【０００５】
このような理由から、アッセイをベースとしたマイクロビーズアレイの最適性能にとって、実用的で、強いプローブ結合化学が重要である。このような化学は、ビーズ表面で一貫したプローブ濃度を保持するために高い効率でプローブの粒子への結合を可能にし、さらに、反応がプローブ−ターゲット結合の効率を変化させることはない。さらに、反応はバッチ間の変動を最小にする。１つの一般的に用いられる方法では、官能化した微粒子は、ニュートラアビジン（Pierce, Rockford, IL）、ストレプトアビジン、またはアビジンでコーティングされるが、これらはビオチン結合タンパク質であり、ビオチン化されたプローブの固定化を仲介する。アビジン−ビオチン相互作用は極めて特異的な、既知の最も強い結合の１つであり（水溶液中で1015M-1のオーダーの結合定数（KA)を持つ）、ビーズ表面に固定化されたタンパク質とビオチン化されたプローブ分子との間に、ほとんど不可逆的である結合を提供する。米国特許出願第10/271,602号、上記を参照。高分子電解質にプローブを結合するための下記方法はこれら既知方法よりも好ましいが、それは、これらがビーズへより多いオリゴヌクレオチドの付着を誘発できることが実証されたからである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
多数の露出した官能基を有し、その各基は分子と共有結合できる高分子電解質を、生体分子へ結合させることを目的として、表面に固定化する。生体分子は、例えば核酸、例えばアミン官能化オリゴヌクレオチドでよい。高分子電解質は、例えば、共有結合固定化法、例えばトシル活性化微粒子の表面との反応を用いて官能化表面に結合されるBSA（ウシ血清アルブミン）を含むこともある。このような反応の後、タンパク質上に露出している、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル基のような反応性官能基をさらに利用して、好適な化学を用い、関心対象のオリゴヌクレオチドを共有結合に利用することができる。
【０００７】
１つの実施態様では、末端位置（3’または5’末端位置）をアミンで修飾したオリゴヌクレオチド（例えばアミノ修飾オリゴヌクレオチド）を、EDAC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）反応（D.Seligal et al., Analytical Biochemistry 218:87091 (1994)参照）を用いてBSAに共有結合する。共有反応は、オリゴヌクレオチドの末端にあるアミン基とBSAのカルボキシル基との間にアミド結合を形成する。反応を図１に図示する。
【０００８】
官能化表面はビーズまたは微粒子の表面でもありうるが、それはポリマー、ポリマー樹脂、ガラス、ラテックスまたは高分子電解質を固定化するために官能化できるその他のものを含む、様々な材料から成ることができる。実験を行い、BSAコーティングビーズと、別の例示的高分子電解質であるヒト血清アルブミン（“HSA”）を比較し、さらにニュートラアビジンとも比較した。ハイブリダイゼーション実験の結果は、BSAコーティングビーズが、より高濃度のオリゴヌクレオチドをビーズに結合できることを示した。
【実施例１】
【０００９】
BSAコーティングトシル官能化ビーズの調製
BSA50mgを10mLのPBSに溶解して、5mg/mL濃度のBSA溶液を調製した。2.0mLのPBS-Tを15mLの遠心分離管に加えた。1%固形物濃度（10mg）の蛍光色ビーズ1mLを遠心分離管に移し、ボルテックスすることによってよく混合した。ビーズを3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけて落とし、上清をデカントした。管にPBST3mLを加えて、ビーズを再懸濁し、ボルテックスすることによってよく混合した。ビーズを、3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を捨てた。BSA溶液（5mg/mL）3.0mLをビーズに加え、ボルテックスすることによってよく混合した。管を37℃のインキュベーター内のシェーカーに乗せ、一晩、250rpmで混合しながらビーズを反応させた。
【００１０】
その後、ビーズを3,500rpmの遠心分離に４分間かけて落とし、上清を捨てた。次に、管にPBS-Tを3.0mL加えてビーズを洗い、ボルテックスミキサーで混合した。次にビーズを、再度3500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を流し捨てた。続いて洗浄と遠心分離の段階を繰り返した。
【００１１】
保存バッファー（0.1%のNaN3を含有する0.1M PBS）3.0mLを加えて、ボルテックスミキサーで混合した。ビーズを再度3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を流し捨てた。次にビーズをボルテックスすることによって1mlの保存バッファーに再懸濁した。ビーズ濃度は1%固形物濃度（10mg/mL）となり、4〜6℃で保存した。これらビーズは、下記実施例３に記載のように、EDAC反応を介してアミン含有生体分子（例えばBSA）を容易に付着できる。
【実施例２】
【００１２】
BSAコーティングカルボキシル官能化ビーズの調製
カルボキシル化粒子へのBSAの結合を、次のように実施した。1%固形物濃度のカルボキシル化粒子100μlを、2mlのエッペンドルフチューブに移した。次に遠心分離してビーズを沈殿させ、上清を取り除いた。その後、ビーズを1mlのMES（詳述）バッファー（pH4.5）で１回洗浄した。別にBSA（5mgBSA/ml）のMESバッファー貯蔵溶液およびEDC（20mg/ml）のMESバッファー貯蔵溶液を調整した。BSA貯蔵溶液100μlをビーズの沈殿に加え、懸濁液をボルテックスすることによってよく混合した。続いてEDC貯蔵溶液400μlをビーズ懸濁液に加え、ボルテックスすることによってよく混合してから室温で１時間、逆に入れかえながら反応させた。１時間インキュベーション後、100μl のPBS-Tを懸濁液に加え、ビーズを遠心分離した。沈殿を、遠心分離−再分散サイクルにより、1mlのPBSで２回洗浄し、最後にビーズを100μlの保存バッファー（0.1%アジ化ナトリウム、NaN3を含有する0.1MのPBS）に懸濁して、4〜6℃に保存した。
【実施例３】
【００１３】
BSAビーズへアミノ化オリゴヌクレオチドプローブを結合させるためのEDAC反応
実施例１および２で調製したビーズへのアミノ化オリゴヌクレオチドプローブの結合は、次のように実施した。一連の1.5mlエッペンドルフチューブを取り出し、微粒子と、結合するオリゴヌクレオチドプローブが識別できるように標識化した。次に、各管に500μLのPBSTを分注し、続いて1%固形物濃度のBSA結合ビーズ100μLを加えた。管をボルテックスミキサーで10秒間、よく混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離に2+/-0.5分間かけて沈殿させ、上清を捨てた。0.05MのMESバッファー（pH4.5）500μLを沈殿に加え、ボルテックスすることによってよく混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離に2+/-0.5分かけ、上清を捨てた。0.05MのEDACのMESバッファー溶液（使用直前に調製する）500ulをビーズに加え、ボルテックスすることによってよく混合した。各アミノ修飾DNAプローブ（例えばプローブMS-508、Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville IAより購入）10μLを、ビーズ懸濁液の入った各管に100μMの濃度で加え、よく混合した。逆に入れかえながら、１時間、室温（20〜25℃）で反応させた。
【００１４】
インキュベーション後、100μLのPBS-Tを各管に加え、ボルテックスすることによって混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離で2+/-0.5分間遠沈し、上清を捨てた。次にビーズを、遠心分離再分散サイクルを用いて、500μlのPBS-Tで２回洗浄した。
【００１５】
ビーズを100μLのPBSTに再懸濁して、最終濃度を1%固形物濃度に合わせ、使用するまで4〜6℃で保存した。
【００１６】
オリゴの添加量（100uM/200ug粒子を0.25、0.5、1、2、4、8ul）の関数として、オリゴヌクレオチド官能化粒子のハイブリダイゼーション性能（プロトコルについては実施例４を参照）を図２に示す。従って、上記の100uM/1mgを10ulという量は、飽和濃度を表している。また、高い方の温度で結合したBSAを有するビーズは、後述するように、ハイブリダイゼーション性能の向上を示した。
【実施例４】
【００１７】
オリゴヌクレチド官能化ビーズを用いたハイブリダイゼーションアッセイ
１．ビーズ混合物を８個の異なるチップ上にアセンブルした。蛍光標識DNAターゲット貯蔵溶液（MS508-90mer-CY5）をハイブリダイゼーションバッファー（1×TMAC）で調製した。ターゲット貯蔵溶液から、８つの異なる連続希釈液を調製した。次に、８枚の別々のチップに、連続希釈ターゲット液を各20μl加えた。
２．チップが乗ったスライドをハイブリダイゼーションヒーター/シェーカーに入れ、55℃で20分間、100rpmでインキュベーションした。
３．スライドを取り出して室温まで冷まし、トランスファーピペットを使ってハイブリダイゼーション溶液を取り出した。
４．各チップに1×TMACを20μl加え、溶液を8〜10回ピペッティングしてチップを洗浄した。
５．洗浄溶液を取り出してから、各チップに5mlの封入溶液（1×TMAC）を加え、アッセイシグナル（CY5）を、カバーガラスを用いた蛍光顕微鏡下に読み取った。
６．滴定曲線は、DNAプローブ濃度に対するハイブリダイゼーションシグナル（CY5）のプロットである。
滴定曲線の例を図３に示す。
【実施例５】
【００１８】
実験を行い、ビーズ−プローブ懸濁液にDEACを２回加えることの効果（EDACは、酸性pHにおいて、極めて短時間で加水分解することが知られている）を比較し、２回加えることがBSA層へのプローブの結合を高めるか評価した。第一に、プローブMS-508-N25を次の各条件でBSAコーティングビーズに結合した：（10μl 100μMのプローブ/100μlの1%ビーズ）。１時間の反応時間後、1×管から1/2量のビーズを取り出し、新しいEDACを加え、この管の反応をさらに１時間進めた。次に、合致しないプローブSSP36について、全部のプロセスを繰り返した。ビーズの各セットを非特異的ビーズと一緒にプールし、チップ上にアセンブルしてから、全てのセットをターゲットのMS508-40mer-Cy5とハイブリダイズ条件のもとに接するように置かれた。次に結果を記録し、下表２にまとめた。EDACの２回添加により、より高いハイブリダイゼーションを提供した。
【００１９】
【表２】
【実施例６】
【００２０】
さまざまな温度でのトシル活性化ビーズのBSA結合およびそのハイブリダイゼーション特徴
2.0mLのPBSTを5本の15mL遠心分離管に加えてから各管に固形物濃度1%（10mg）の蛍光着色ビーズ1mLを加え、ボルテックスすることによってビーズを混合した。このビーズを、3,500rpmの遠心分離で4+/-0.5分間遠沈し、上清をデカントした。次にビーズを3.0mLのPBSTに再懸濁し、ボルテックスすることによってよく混合してから、再度3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間遠沈した。次に上清を流し出した。
【００２１】
2mLのPBS（pH7.2）および1mLのBSA溶液（PBS中に50mg/mL）を各管に加え、ボルテックスすることによってよく混合した。各管のインキュベータ内の周囲温度を次のように設定する：管A-22℃、管B-37℃、管Ｃ-50℃、管D-65℃および管E-75℃、そしてビーズをBSAと14時間、指定温度で、逆に入れかえて反応させた。次に管を室温まで冷却し、ビーズを3,500rpmの遠心分離に4分間遠沈し、上清を流し出した。次にビーズを、管に3.0mLのPBSTを加えることで洗浄してから、ボルテックスミキサーで混合し、3500rpmで4+/-0.5分間、遠心分離で遠沈した。上清は流し出した。
【００２２】
保存バッファー（0.1%NaN3を含むPBS）を1mL加え、ボルテックスミキサーを用いて管を混合した。ビーズ濃度は1%固形物濃度（10mg/mL）であった。BSA結合ビーズは、4〜6℃で保存した。
【００２３】
25-merのMS-508 N25ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを、上記EDAC結合法により、各ビーズのセットに複合した。次に、各ビーズのセットを、一定濃度の、そのプローブに対する標識化ターゲット（Cy-5で標識化された90-merのオリゴヌクレオチド）と、ハイブリダイズ条件の下に接触させた。ビーズ上の標識物の量は、ビーズ上のプローブ濃度と相関する。
【００２４】
図４に示すように、より高い温度でBSAと結合したビーズほど、ビーズ表面に表示されたオリゴヌクレオチドに対し、より多くのターゲットの結合を表示した。このことは、このようなビーズの表面にあるプローブの濃度がより高いことを示しており、これはおそらく65℃であったことによってBSAが変性して開き、プローブにより多くの利用可能な結合部位を提示したのだろう。
【実施例７】
【００２５】
トシル官能化粒子へのBSA結合に関する各種インキュベーション時間の比較
実験を実施し、トシル化粒子へのBSA結合反応の経時変化を調べた。上記実施例１および５と同一のプロトコルに従って、それぞれBSA-トシル粒子反応混合物を含む12本の個々の管を、オーブンの中にて65℃でインキュベーションし、１本のコントロールチューブを37℃でインキュベーションした。あらかじめ決められたインキュベーション時間後、洗浄し、各管を取り出し、実施例３に概要を示した方法に従ってオリゴヌクレオチドプローブ（コントロールプローブ１つも含めて）と結合した。その後、ハイブリダイゼーション反応を行い、アッセイ強度を記録した（実施例４参照）。結果は図５に示すが、BSA結合反応が１時間未満で実質的に完了していることが示されている。
【実施例８】
【００２６】
通常のビオチン−アビジンオリゴヌクレオチド結合とニュートラアビジンコーティング化学との比較
実験を実施し、オリゴ複合したBSA官能化ビーズとビオチン化オリゴ複合ニュートラアビジンビーズとの捕捉およびハイブリダイゼーション効率を比較した。タンパク質は、実施例１に概要を示したプロトコルを用いて、37℃でビーズ表面に結合した。その後、ビオチン化（またアミノ化）オリゴを粒子に複合し（実施例３のように）、同種のターゲットとの間でハイブリダイゼーションアッセイを行った。
【００２７】
コード化が異なっている以外は同一である２種類のBSAコーティング粒子を取り出し、合致するプローブを１つのグループに結合し、他のグループには合致しないプローブを結合した。同様の、２種類の別のニュートラアビジン官能化ビーズを取り出し、合致するビオチン化プローブと合致しないビオチン化プローブとに結合した。
【００２８】
アッセイの結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。BSAコーティングは、ニュートラアビジン捕捉化学を用いた時に得られるものに比べ、より均一（CVがより低い）で、より高いシグナル対ノイズ比（合致しないプローブのハイブリダイゼーション強度をノイズとした）を提供することが明らかである。
【実施例９】
【００２９】
HSAコーティングとの比較
HSA（ヒト血清アルブミン）を、トシル官能化粒子にBSAを結合するのに用いた条件と同一の条件で結合した。次にHSA官能化粒子にオリゴヌクレオチドプローブを結合し、蛍光標識したモデルDNAターゲット（実施例４に同じ）にハイブリダイゼーション（滴定測定）した。結果を図７に示す。HSAは、BSA同様に、オリゴヌクレオチドプローブへの結合に利用できる官能性カルボキシル基を多く有しているという事実にも関わらず、HSAコーティングは、オリゴヌクレオチドプローブ結合に関して、BSAコーティングほど有効ではないことが示される。
【実施例１０】
【００３０】
BSA結合のバッチ間変動
各10mgの３バッチのビーズを別々に、BSAに65℃で14時間結合したが、この時のBSA-ビーズ比は５（W/W、mg/mg）であった。結合のための反応容積は3mLであった。１バッチのビーズをBSAに37℃で結合し、コントロールとして用いた。結合効率は、ビーズに結合したDNAプローブと同種のターゲットとのハイブリダイゼーションのシグナル強度に基づいて判定した。ハイブリダイゼーションは55℃で、20分間、1×TMAC中で実施し、ターゲットは濃度400nMのMS508-90mer-CY5であった。アッセイを読み取るための積算時間は200msであった。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
65℃バッチは、37℃で結合したバッチに比べ、一貫して高い強度を有し、またバッチ間の変動も小さかった。
【００３２】
本明細書中の上記の用語、表現および例は単なる例示であり、なんらの限定もせず、そして発明は以下の特許請求の範囲によってのみ定義され、また特許請求の課題に均等である全てのものを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】官能化ビーズへのBSAの結合およびEDAC反応を用いたBSAへのオリゴヌクレオチドプローブの結合を示す図である。
【図２】結合のために加えられたアミノ化プローブの量の関数として表したオリゴ官能化BSA結合ビーズからのハイブリダイゼーションシグナルの図である。完全に合致するプローブを２セットのBSA結合ビーズに結合した。BSAをビーズの第１セットには65℃にて、そして第２セットには37℃で結合した。65℃でBSAを結合した第１セットのビーズに、より高いハイブリダイゼーション効率（より高いシグナル）が示された。65℃でBSAを結合させ、且つ合致しない陰性コントロールプローブで官能化した第３セットのビーズは極わずかなハイブリダイゼーションを示し、かくしてシグナルの上昇が非特異的結合の増加の結果ではないことを示した。
【図３】BSA結合ビーズの滴定結果を示す図である。37℃でビーズの１セットにBSAを結合させたBSA結合ビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブと、65℃で別のビーズのセットにBSAを結合させたBSA結合ビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブに接するように置かれたターゲットからのハイブリダイゼーションシグナルの差として表した場合、図２同様、ハイブリダイゼーションの効率は、低い温度でBSAを結合させたビーズよりも、高い温度でBSAを結合させたビーズの方が高い。（実施例４参照）
【図４】オリゴヌクレオチドプローブをビーズ上に固定化されたBSAに結合し、次に相補的な蛍光標識ターゲットと反応させるハイブリダイゼーションアッセイを用いて判定した、異なる温度での、トシル官能化ビーズへのBSA結合効率の差を示す図である。（実施例６参照）
【図５】トシル活性化ビーズへのBSA結合反応に関して、65℃以上で約１時間インキュベーションすることがビーズ表面へのBSAの結合効率に影響しないことを、BSA結合ビーズに結合したオリゴヌクレオチドプローブと接するように置かれたターゲットからのハイブリダイゼーションシグナルの差として表した図である。（実施例７参照）
【図６Ａ】プローブと結合させ、ターゲットとハイブリダイゼーションさせた後、BSAコーティングトシル官能化ビーズがニュートラアビジンコーティングトシルビーズに比べ、より均一でより強いハイブリダイゼーションシグナルを発することを示す図である。（実施例８参照）
【図６Ｂ】図６Ａのシグナルの変動係数を示す図である。
【図７】トシル官能化ビーズにコーティングされた高分子電解質がBSAではなくHSAであり、オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ、ビーズに固定化されたBSAまたはHSAに結合させ、次に蛍光標識された相補的ターゲットと反応させた時、ハイブリダイゼーションに有意な差があることを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、2003年9月22日出願の米国仮出願番号第60/504,716号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、高分子電解質化学の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドの「スポットアレイ」の診断使用に関連する多くの問題（この問題については、2002年8月23日に出願された、米国特許出願第10/204,799号；国際公開第01/98765号、“Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific Random Particle Arrays,”の中で概略が述べられている）を解決するための別の方法として、好ましいアレイが、オリゴヌクレオチドプローブを、ポリマー樹脂製のコード化された粒子を含むコード化されたマイクロビーズ粒子に結合させることによって形成される。2002年10月15日出願の米国特許出願第10/271,602号“Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection,”、および第10/204,799号上記を参照。コード化された粒子−プローブ複合体は、次に二次元アレイ型に組み立てられて、プローブに対し相補的なサブシーケンスを持つターゲットポリヌクレオチドを含有すると思われるサンプルと接するように置かれるが、この場合サンプル中のターゲットポリヌクレオチドは事前に蛍光標識されている。プローブとターゲットとの結合は、蛍光アッセイシグナルの存在によって判定される。アレイを解読することによって、陽性のアッセイシグナルを発生する特定のプローブを判定できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
マイクロビーズにオリゴヌクレオチドプローブを付着するための方法がいくつか知られており、また市販されている。微粒子へのオリゴヌクレオチドプローブを共有固定化する方法は数多く工夫されており、公開文献または市販品として利用できる。伝統的な共有固定化する技術は、官能化ビーズ（即ちアミノ、カルボキシル、トシル、アルデヒド、エポキシ、ヒドラジド等のような反応基で官能化されたビーズ）を用い、オリゴヌクレオチドプローブ末端にある相補的官能基と結合する（Maire K.Walsh, Xinwen WangおよびBart C. Weimer、Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto glass beads, J. Biochem. Biophys. Methods 2001; 47:221-231）。この様な結合プロトコルでは配向が不適切となり、立体障害問題を起こすことが多い。このように共有固定化されたプローブのハイブリダイゼーション性能は、スペーサー分子を導入することで改善できるが（Edwin Southern, Kalim MirおよびMikhail Schepinov；Molecular interactions on Microarrays. Nature Genetics Supplement, 21, 1999, pp.5-9）、実施が難しく、実用的でないことが多い。
【０００５】
このような理由から、アッセイをベースとしたマイクロビーズアレイの最適性能にとって、実用的で、強いプローブ結合化学が重要である。このような化学は、ビーズ表面で一貫したプローブ濃度を保持するために高い効率でプローブの粒子への結合を可能にし、さらに、反応がプローブ−ターゲット結合の効率を変化させることはない。さらに、反応はバッチ間の変動を最小にする。１つの一般的に用いられる方法では、官能化した微粒子は、ニュートラアビジン（Pierce, Rockford, IL）、ストレプトアビジン、またはアビジンでコーティングされるが、これらはビオチン結合タンパク質であり、ビオチン化されたプローブの固定化を仲介する。アビジン−ビオチン相互作用は極めて特異的な、既知の最も強い結合の１つであり（水溶液中で1015M-1のオーダーの結合定数（KA)を持つ）、ビーズ表面に固定化されたタンパク質とビオチン化されたプローブ分子との間に、ほとんど不可逆的である結合を提供する。米国特許出願第10/271,602号、上記を参照。高分子電解質にプローブを結合するための下記方法はこれら既知方法よりも好ましいが、それは、これらがビーズへより多いオリゴヌクレオチドの付着を誘発できることが実証されたからである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
多数の露出した官能基を有し、その各基は分子と共有結合できる高分子電解質を、生体分子へ結合させることを目的として、表面に固定化する。生体分子は、例えば核酸、例えばアミン官能化オリゴヌクレオチドでよい。高分子電解質は、例えば、共有結合固定化法、例えばトシル活性化微粒子の表面との反応を用いて官能化表面に結合されるBSA（ウシ血清アルブミン）を含むこともある。このような反応の後、タンパク質上に露出している、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル基のような反応性官能基をさらに利用して、好適な化学を用い、関心対象のオリゴヌクレオチドを共有結合に利用することができる。
【０００７】
１つの実施態様では、末端位置（3’または5’末端位置）をアミンで修飾したオリゴヌクレオチド（例えばアミノ修飾オリゴヌクレオチド）を、EDAC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）反応（D.Seligal et al., Analytical Biochemistry 218:87091 (1994)参照）を用いてBSAに共有結合する。共有反応は、オリゴヌクレオチドの末端にあるアミン基とBSAのカルボキシル基との間にアミド結合を形成する。反応を図１に図示する。
【０００８】
官能化表面はビーズまたは微粒子の表面でもありうるが、それはポリマー、ポリマー樹脂、ガラス、ラテックスまたは高分子電解質を固定化するために官能化できるその他のものを含む、様々な材料から成ることができる。実験を行い、BSAコーティングビーズと、別の例示的高分子電解質であるヒト血清アルブミン（“HSA”）を比較し、さらにニュートラアビジンとも比較した。ハイブリダイゼーション実験の結果は、BSAコーティングビーズが、より高濃度のオリゴヌクレオチドをビーズに結合できることを示した。
【実施例１】
【０００９】
BSAコーティングトシル官能化ビーズの調製
BSA50mgを10mLのPBSに溶解して、5mg/mL濃度のBSA溶液を調製した。2.0mLのPBS-Tを15mLの遠心分離管に加えた。1%固形物濃度（10mg）の蛍光色ビーズ1mLを遠心分離管に移し、ボルテックスすることによってよく混合した。ビーズを3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけて落とし、上清をデカントした。管にPBST3mLを加えて、ビーズを再懸濁し、ボルテックスすることによってよく混合した。ビーズを、3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を捨てた。BSA溶液（5mg/mL）3.0mLをビーズに加え、ボルテックスすることによってよく混合した。管を37℃のインキュベーター内のシェーカーに乗せ、一晩、250rpmで混合しながらビーズを反応させた。
【００１０】
その後、ビーズを3,500rpmの遠心分離に４分間かけて落とし、上清を捨てた。次に、管にPBS-Tを3.0mL加えてビーズを洗い、ボルテックスミキサーで混合した。次にビーズを、再度3500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を流し捨てた。続いて洗浄と遠心分離の段階を繰り返した。
【００１１】
保存バッファー（0.1%のNaN3を含有する0.1M PBS）3.0mLを加えて、ボルテックスミキサーで混合した。ビーズを再度3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間かけ、上清を流し捨てた。次にビーズをボルテックスすることによって1mlの保存バッファーに再懸濁した。ビーズ濃度は1%固形物濃度（10mg/mL）となり、4〜6℃で保存した。これらビーズは、下記実施例３に記載のように、EDAC反応を介してアミン含有生体分子（例えばBSA）を容易に付着できる。
【実施例２】
【００１２】
BSAコーティングカルボキシル官能化ビーズの調製
カルボキシル化粒子へのBSAの結合を、次のように実施した。1%固形物濃度のカルボキシル化粒子100μlを、2mlのエッペンドルフチューブに移した。次に遠心分離してビーズを沈殿させ、上清を取り除いた。その後、ビーズを1mlのMES（詳述）バッファー（pH4.5）で１回洗浄した。別にBSA（5mgBSA/ml）のMESバッファー貯蔵溶液およびEDC（20mg/ml）のMESバッファー貯蔵溶液を調整した。BSA貯蔵溶液100μlをビーズの沈殿に加え、懸濁液をボルテックスすることによってよく混合した。続いてEDC貯蔵溶液400μlをビーズ懸濁液に加え、ボルテックスすることによってよく混合してから室温で１時間、逆に入れかえながら反応させた。１時間インキュベーション後、100μl のPBS-Tを懸濁液に加え、ビーズを遠心分離した。沈殿を、遠心分離−再分散サイクルにより、1mlのPBSで２回洗浄し、最後にビーズを100μlの保存バッファー（0.1%アジ化ナトリウム、NaN3を含有する0.1MのPBS）に懸濁して、4〜6℃に保存した。
【実施例３】
【００１３】
BSAビーズへアミノ化オリゴヌクレオチドプローブを結合させるためのEDAC反応
実施例１および２で調製したビーズへのアミノ化オリゴヌクレオチドプローブの結合は、次のように実施した。一連の1.5mlエッペンドルフチューブを取り出し、微粒子と、結合するオリゴヌクレオチドプローブが識別できるように標識化した。次に、各管に500μLのPBSTを分注し、続いて1%固形物濃度のBSA結合ビーズ100μLを加えた。管をボルテックスミキサーで10秒間、よく混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離に2+/-0.5分間かけて沈殿させ、上清を捨てた。0.05MのMESバッファー（pH4.5）500μLを沈殿に加え、ボルテックスすることによってよく混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離に2+/-0.5分かけ、上清を捨てた。0.05MのEDACのMESバッファー溶液（使用直前に調製する）500ulをビーズに加え、ボルテックスすることによってよく混合した。各アミノ修飾DNAプローブ（例えばプローブMS-508、Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville IAより購入）10μLを、ビーズ懸濁液の入った各管に100μMの濃度で加え、よく混合した。逆に入れかえながら、１時間、室温（20〜25℃）で反応させた。
【００１４】
インキュベーション後、100μLのPBS-Tを各管に加え、ボルテックスすることによって混合した。次にビーズを9500rpmの遠心分離で2+/-0.5分間遠沈し、上清を捨てた。次にビーズを、遠心分離再分散サイクルを用いて、500μlのPBS-Tで２回洗浄した。
【００１５】
ビーズを100μLのPBSTに再懸濁して、最終濃度を1%固形物濃度に合わせ、使用するまで4〜6℃で保存した。
【００１６】
オリゴの添加量（100uM/200ug粒子を0.25、0.5、1、2、4、8ul）の関数として、オリゴヌクレオチド官能化粒子のハイブリダイゼーション性能（プロトコルについては実施例４を参照）を図２に示す。従って、上記の100uM/1mgを10ulという量は、飽和濃度を表している。また、高い方の温度で結合したBSAを有するビーズは、後述するように、ハイブリダイゼーション性能の向上を示した。
【実施例４】
【００１７】
オリゴヌクレチド官能化ビーズを用いたハイブリダイゼーションアッセイ
１．ビーズ混合物を８個の異なるチップ上にアセンブルした。蛍光標識DNAターゲット貯蔵溶液（MS508-90mer-CY5）をハイブリダイゼーションバッファー（1×TMAC）で調製した。ターゲット貯蔵溶液から、８つの異なる連続希釈液を調製した。次に、８枚の別々のチップに、連続希釈ターゲット液を各20μl加えた。
２．チップが乗ったスライドをハイブリダイゼーションヒーター/シェーカーに入れ、55℃で20分間、100rpmでインキュベーションした。
３．スライドを取り出して室温まで冷まし、トランスファーピペットを使ってハイブリダイゼーション溶液を取り出した。
４．各チップに1×TMACを20μl加え、溶液を8〜10回ピペッティングしてチップを洗浄した。
５．洗浄溶液を取り出してから、各チップに5mlの封入溶液（1×TMAC）を加え、アッセイシグナル（CY5）を、カバーガラスを用いた蛍光顕微鏡下に読み取った。
６．滴定曲線は、DNAプローブ濃度に対するハイブリダイゼーションシグナル（CY5）のプロットである。
滴定曲線の例を図３に示す。
【実施例５】
【００１８】
実験を行い、ビーズ−プローブ懸濁液にDEACを２回加えることの効果（EDACは、酸性pHにおいて、極めて短時間で加水分解することが知られている）を比較し、２回加えることがBSA層へのプローブの結合を高めるか評価した。第一に、プローブMS-508-N25を次の各条件でBSAコーティングビーズに結合した：（10μl 100μMのプローブ/100μlの1%ビーズ）。１時間の反応時間後、1×管から1/2量のビーズを取り出し、新しいEDACを加え、この管の反応をさらに１時間進めた。次に、合致しないプローブSSP36について、全部のプロセスを繰り返した。ビーズの各セットを非特異的ビーズと一緒にプールし、チップ上にアセンブルしてから、全てのセットをターゲットのMS508-40mer-Cy5とハイブリダイズ条件のもとに接するように置かれた。次に結果を記録し、下表２にまとめた。EDACの２回添加により、より高いハイブリダイゼーションを提供した。
【００１９】
【表２】
【実施例６】
【００２０】
さまざまな温度でのトシル活性化ビーズのBSA結合およびそのハイブリダイゼーション特徴
2.0mLのPBSTを5本の15mL遠心分離管に加えてから各管に固形物濃度1%（10mg）の蛍光着色ビーズ1mLを加え、ボルテックスすることによってビーズを混合した。このビーズを、3,500rpmの遠心分離で4+/-0.5分間遠沈し、上清をデカントした。次にビーズを3.0mLのPBSTに再懸濁し、ボルテックスすることによってよく混合してから、再度3,500rpmの遠心分離に4+/-0.5分間遠沈した。次に上清を流し出した。
【００２１】
2mLのPBS（pH7.2）および1mLのBSA溶液（PBS中に50mg/mL）を各管に加え、ボルテックスすることによってよく混合した。各管のインキュベータ内の周囲温度を次のように設定する：管A-22℃、管B-37℃、管Ｃ-50℃、管D-65℃および管E-75℃、そしてビーズをBSAと14時間、指定温度で、逆に入れかえて反応させた。次に管を室温まで冷却し、ビーズを3,500rpmの遠心分離に4分間遠沈し、上清を流し出した。次にビーズを、管に3.0mLのPBSTを加えることで洗浄してから、ボルテックスミキサーで混合し、3500rpmで4+/-0.5分間、遠心分離で遠沈した。上清は流し出した。
【００２２】
保存バッファー（0.1%NaN3を含むPBS）を1mL加え、ボルテックスミキサーを用いて管を混合した。ビーズ濃度は1%固形物濃度（10mg/mL）であった。BSA結合ビーズは、4〜6℃で保存した。
【００２３】
25-merのMS-508 N25ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを、上記EDAC結合法により、各ビーズのセットに複合した。次に、各ビーズのセットを、一定濃度の、そのプローブに対する標識化ターゲット（Cy-5で標識化された90-merのオリゴヌクレオチド）と、ハイブリダイズ条件の下に接触させた。ビーズ上の標識物の量は、ビーズ上のプローブ濃度と相関する。
【００２４】
図４に示すように、より高い温度でBSAと結合したビーズほど、ビーズ表面に表示されたオリゴヌクレオチドに対し、より多くのターゲットの結合を表示した。このことは、このようなビーズの表面にあるプローブの濃度がより高いことを示しており、これはおそらく65℃であったことによってBSAが変性して開き、プローブにより多くの利用可能な結合部位を提示したのだろう。
【実施例７】
【００２５】
トシル官能化粒子へのBSA結合に関する各種インキュベーション時間の比較
実験を実施し、トシル化粒子へのBSA結合反応の経時変化を調べた。上記実施例１および５と同一のプロトコルに従って、それぞれBSA-トシル粒子反応混合物を含む12本の個々の管を、オーブンの中にて65℃でインキュベーションし、１本のコントロールチューブを37℃でインキュベーションした。あらかじめ決められたインキュベーション時間後、洗浄し、各管を取り出し、実施例３に概要を示した方法に従ってオリゴヌクレオチドプローブ（コントロールプローブ１つも含めて）と結合した。その後、ハイブリダイゼーション反応を行い、アッセイ強度を記録した（実施例４参照）。結果は図５に示すが、BSA結合反応が１時間未満で実質的に完了していることが示されている。
【実施例８】
【００２６】
通常のビオチン−アビジンオリゴヌクレオチド結合とニュートラアビジンコーティング化学との比較
実験を実施し、オリゴ複合したBSA官能化ビーズとビオチン化オリゴ複合ニュートラアビジンビーズとの捕捉およびハイブリダイゼーション効率を比較した。タンパク質は、実施例１に概要を示したプロトコルを用いて、37℃でビーズ表面に結合した。その後、ビオチン化（またアミノ化）オリゴを粒子に複合し（実施例３のように）、同種のターゲットとの間でハイブリダイゼーションアッセイを行った。
【００２７】
コード化が異なっている以外は同一である２種類のBSAコーティング粒子を取り出し、合致するプローブを１つのグループに結合し、他のグループには合致しないプローブを結合した。同様の、２種類の別のニュートラアビジン官能化ビーズを取り出し、合致するビオチン化プローブと合致しないビオチン化プローブとに結合した。
【００２８】
アッセイの結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。BSAコーティングは、ニュートラアビジン捕捉化学を用いた時に得られるものに比べ、より均一（CVがより低い）で、より高いシグナル対ノイズ比（合致しないプローブのハイブリダイゼーション強度をノイズとした）を提供することが明らかである。
【実施例９】
【００２９】
HSAコーティングとの比較
HSA（ヒト血清アルブミン）を、トシル官能化粒子にBSAを結合するのに用いた条件と同一の条件で結合した。次にHSA官能化粒子にオリゴヌクレオチドプローブを結合し、蛍光標識したモデルDNAターゲット（実施例４に同じ）にハイブリダイゼーション（滴定測定）した。結果を図７に示す。HSAは、BSA同様に、オリゴヌクレオチドプローブへの結合に利用できる官能性カルボキシル基を多く有しているという事実にも関わらず、HSAコーティングは、オリゴヌクレオチドプローブ結合に関して、BSAコーティングほど有効ではないことが示される。
【実施例１０】
【００３０】
BSA結合のバッチ間変動
各10mgの３バッチのビーズを別々に、BSAに65℃で14時間結合したが、この時のBSA-ビーズ比は５（W/W、mg/mg）であった。結合のための反応容積は3mLであった。１バッチのビーズをBSAに37℃で結合し、コントロールとして用いた。結合効率は、ビーズに結合したDNAプローブと同種のターゲットとのハイブリダイゼーションのシグナル強度に基づいて判定した。ハイブリダイゼーションは55℃で、20分間、1×TMAC中で実施し、ターゲットは濃度400nMのMS508-90mer-CY5であった。アッセイを読み取るための積算時間は200msであった。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
65℃バッチは、37℃で結合したバッチに比べ、一貫して高い強度を有し、またバッチ間の変動も小さかった。
【００３２】
本明細書中の上記の用語、表現および例は単なる例示であり、なんらの限定もせず、そして発明は以下の特許請求の範囲によってのみ定義され、また特許請求の課題に均等である全てのものを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】官能化ビーズへのBSAの結合およびEDAC反応を用いたBSAへのオリゴヌクレオチドプローブの結合を示す図である。
【図２】結合のために加えられたアミノ化プローブの量の関数として表したオリゴ官能化BSA結合ビーズからのハイブリダイゼーションシグナルの図である。完全に合致するプローブを２セットのBSA結合ビーズに結合した。BSAをビーズの第１セットには65℃にて、そして第２セットには37℃で結合した。65℃でBSAを結合した第１セットのビーズに、より高いハイブリダイゼーション効率（より高いシグナル）が示された。65℃でBSAを結合させ、且つ合致しない陰性コントロールプローブで官能化した第３セットのビーズは極わずかなハイブリダイゼーションを示し、かくしてシグナルの上昇が非特異的結合の増加の結果ではないことを示した。
【図３】BSA結合ビーズの滴定結果を示す図である。37℃でビーズの１セットにBSAを結合させたBSA結合ビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブと、65℃で別のビーズのセットにBSAを結合させたBSA結合ビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブに接するように置かれたターゲットからのハイブリダイゼーションシグナルの差として表した場合、図２同様、ハイブリダイゼーションの効率は、低い温度でBSAを結合させたビーズよりも、高い温度でBSAを結合させたビーズの方が高い。（実施例４参照）
【図４】オリゴヌクレオチドプローブをビーズ上に固定化されたBSAに結合し、次に相補的な蛍光標識ターゲットと反応させるハイブリダイゼーションアッセイを用いて判定した、異なる温度での、トシル官能化ビーズへのBSA結合効率の差を示す図である。（実施例６参照）
【図５】トシル活性化ビーズへのBSA結合反応に関して、65℃以上で約１時間インキュベーションすることがビーズ表面へのBSAの結合効率に影響しないことを、BSA結合ビーズに結合したオリゴヌクレオチドプローブと接するように置かれたターゲットからのハイブリダイゼーションシグナルの差として表した図である。（実施例７参照）
【図６Ａ】プローブと結合させ、ターゲットとハイブリダイゼーションさせた後、BSAコーティングトシル官能化ビーズがニュートラアビジンコーティングトシルビーズに比べ、より均一でより強いハイブリダイゼーションシグナルを発することを示す図である。（実施例８参照）
【図６Ｂ】図６Ａのシグナルの変動係数を示す図である。
【図７】トシル官能化ビーズにコーティングされた高分子電解質がBSAではなくHSAであり、オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ、ビーズに固定化されたBSAまたはHSAに結合させ、次に蛍光標識された相補的ターゲットと反応させた時、ハイブリダイゼーションに有意な差があることを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上に固定化され、且つ生体分子と共有結合するため露出した官能基を複数有することを特徴とする高分子電解質。
【請求項２】
前記官能基がカルボキシルまたはアミン基であることを特徴とする、請求項１に記載の高分子電解質。
【請求項３】
表面上に固定化され、且つ核酸に共有結合している高分子電解質を含むことを特徴とする生成物。
【請求項４】
前記高分子電解質がタンパク質であり、且つ前記表面がトシルで活性化されていることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項５】
前記タンパク質がBSAであり、且つ前記核酸がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、EDAC反応によって形成するアミド結合を介して前記タンパク質と結合することを特徴とする、請求項４に記載の生成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、その5’末端でビオチン化されていることを特徴とする、請求項５に記載の生成物。
【請求項８】
前記表面が、ポリマー、ポリマー樹脂、ガラスまたはラテックスから成る微粒子の表面であることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項９】
核酸を表面上に固定化した高分子電解質に共有結合することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記核酸が5’末端にあるアミン基で官能化されるか、またはビオチン化されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記高分子電解質が、BSAを含むタンパク質であり、タンパク質を固定化する前に、前記表面をトシルで活性化することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記高分子電解質が、高分子電解質のCOOH官能性とEDAC反応を介して前記表面に結合することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがEDAC反応を用いて前記タンパク質に結合し、それによって前記オリゴヌクレオチドと前記タンパク質との間にアミド結合が形成されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が65℃またはそれ以上で実施される反応で前記表面に固定化されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面がポリマー、ポリマー樹脂、ガラスまたはラテックスから成る微粒子の表面であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９〜１４のいずれかに記載の方法によって形成されることを特徴とする生成物。
【請求項１】
表面上に固定化され、且つ生体分子と共有結合するため露出した官能基を複数有することを特徴とする高分子電解質。
【請求項２】
前記官能基がカルボキシルまたはアミン基であることを特徴とする、請求項１に記載の高分子電解質。
【請求項３】
表面上に固定化され、且つ核酸に共有結合している高分子電解質を含むことを特徴とする生成物。
【請求項４】
前記高分子電解質がタンパク質であり、且つ前記表面がトシルで活性化されていることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項５】
前記タンパク質がBSAであり、且つ前記核酸がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、EDAC反応によって形成するアミド結合を介して前記タンパク質と結合することを特徴とする、請求項４に記載の生成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、その5’末端でビオチン化されていることを特徴とする、請求項５に記載の生成物。
【請求項８】
前記表面が、ポリマー、ポリマー樹脂、ガラスまたはラテックスから成る微粒子の表面であることを特徴とする、請求項３に記載の生成物。
【請求項９】
核酸を表面上に固定化した高分子電解質に共有結合することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記核酸が5’末端にあるアミン基で官能化されるか、またはビオチン化されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記高分子電解質が、BSAを含むタンパク質であり、タンパク質を固定化する前に、前記表面をトシルで活性化することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記高分子電解質が、高分子電解質のCOOH官能性とEDAC反応を介して前記表面に結合することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがEDAC反応を用いて前記タンパク質に結合し、それによって前記オリゴヌクレオチドと前記タンパク質との間にアミド結合が形成されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が65℃またはそれ以上で実施される反応で前記表面に固定化されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面がポリマー、ポリマー樹脂、ガラスまたはラテックスから成る微粒子の表面であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９〜１４のいずれかに記載の方法によって形成されることを特徴とする生成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５０６１０８（Ｐ２００７−５０６１０８Ａ）
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７１４９（Ｐ２００６−５２７１４９）
【出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１０５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３１３０５
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５０３３６９３５８）バイオアレイ ソリューションズ リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１０５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３１３０５
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５０３３６９３５８）バイオアレイ ソリューションズ リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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