生体試料の抗酸化能力を評価する方法
生体試料の抗酸化能力を評価する方法であって： （ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階； （ｂ） 前記被酸化性基質の酸化反応を開始させる段階； （ｃ）前記酸化反応を継続する段階；および（ｄ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階を含んでなり、前記段階（ｂ）および（ｃ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、生体内における酸化ストレスに対する抗酸化能力の評価方法に関する。
【背景技術】
ヒトを含む好気性生物は、酸素による酸化的リン酸化によってエネルギーを得ている。この酸化的リン酸化は、酸素から生じる酸素ラジカルを介して進行する。したがって、酸素ラジカルの存在は、生体にとって必須である。
しかし、酸素ラジカルは、生体内の組織または生体成分を酸化するという酸化ストレスにもなると考えられ、その酸化ストレスが、白内障、糖尿病、アルツハイマー、癌、動脈硬化、心肺疾患、高コレステロール血症、慢性炎症性疾患、虚血性疾患のような種々の疾患の増悪因子になることが知られている（Ｓｉｅｓ Ｈ．（１９９７）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ：ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２：２９１−５；Ｓｃｏｔｔ Ｇ．（１９９７）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｌ Ｈｏｕｓｅ，ＵＫ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｐｏｒｔｅｒ Ｎ．Ａ．（１９９０）Ａｕｔｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ：Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（ｂａｓｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）．Ｖｉｇｏ−Ｐｅｌｆｒｅｙ，Ｃ．ｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．１ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｉｍｉｃ Ｍ．，Ｋａｒｅｌ Ｍ．（１９８０）Ａｕｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）。酸素ラジカルを介する生体内でのエネルギー生産は常に行われているから、生体は常に酸素ラジカルによる酸化ストレスに曝されていることになる。
生体は、この酸化ストレスから個体を護るための防御手段として抗酸化能力を有している。この抗酸化能力のレベルには個体差があるため、かなりの酸化ストレスに曝されても上記のような疾患を患わない個体もあれば、容易に患う個体もある。
したがって、酸化ストレスによって増悪する上記のような疾患に対する個体の抗酸化能力を正確に評価できれば、そうした疾患を予防または治療するうえで有用な情報を得ることができる。
これまで、抗酸化能力の評価方法として、生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法と、まだ酸化されていない生体試料を取り出してｅｘ ｖｉｖｏで酸化を惹起して、試料の酸化され難さを調べる方法とが知られている。
生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法については、酸化生成物としてＴＢＡ反応性物質である過酸化脂質を測定する方法が古くから用いられている（Ｙａｇｉ Ｋ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ．１９７６ １５：２１２−６．）。この方法は、過酸化脂質をＴＢＡとともに酸性条件下で加熱し生成する蛍光強度を測定することによって、生体内で生成した過酸化脂質を測定する方法である。しかしながら、この方法では、過酸化脂質が生体内のどこで生成したか、およびどのような反応によって生成したかについての情報が得られないため、その測定値が、生体内のどの組織におけるどのような酸化反応に対する抗酸化能力を反映したものであるかを知ることができない。さらに、過酸化脂質は、生体内の酵素反応によっても生成することに加えて、その濃度は代謝や排泄による影響が避けられないので、生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法は、生体の抗酸化能力の評価法としては不十分である。
近年開発された酸化生成物の測定法であるイソプロステインＦ２αを測定する方法によれば、生体内の酸化反応のうち酵素反応による酸化反応の影響を避けることができるので、ラジカル反応による酸化生成物のみを測定でき、したがって、そうした酸化反応に対する抗酸化能力のみを評価できることが報告されている（Ｐａｔｒｏｎｏ Ｃ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＧＡ．Ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１９９７ １７：２３０９−１５）。しかし、生体内のどの組織のどのようなラジカル酸化反応に対する抗酸化能力であるかを知ることができず、しかも依然として酸化生成物の代謝や排泄による影響が避けられない。
一方、ｅｘ ｖｉｖｏで生体試料の酸化を惹起する方法では、生体から試料を取り出し、そしてその試料を体外で酸化反応に付することにより、その試料中に含まれる生体内抗酸化成分の抗酸化能力を評価することで、その生体試料が取り出された特定の組織における抗酸化能力を評価することができる。
この方法では、例えば、血清もしくは組織ホモジネート試料などを用いるＴＡＳ法（Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｓｔａｔｕｓ法；Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ Ｃ，Ｍｉｌｌｅｒ ＮＪ．Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４ ２３４：２７９−９３．）が臨床検査法として使用されている。このＴＡＳ法では、酸化剤として過酸化水素とメトミオグロビン（ｍｅｔｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）とを用いて、鉄イオンを介したラジカル反応による酸化反応を惹起し、この酸化反応に抗する試料の能力を測定することで、試料の抗酸化能力を評価するものである。この方法は、反応時間が典型的には６分と短時間であるため、自動分析機でも測定可能である。過酸化水素とメトミオグロビンによる酸化の代わりに、定常的にラジカルを発生することができる２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）による酸化反応を利用した方法として、ＴＲＡＰ法（Ｔｏｔａｌ Ｒａｄｉｃａｌ−ｔｒａｐｐｉｎｇ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）も開発されている（Ｗａｙｎｅｒ ＤＤ，Ｂｕｒｔｏｎ ＧＷ，Ｉｎｇｏｌｄ ＫＵ，Ｌｏｃｋｅ Ｓ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ，ｐｅｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ−ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｍａｄｅ ｂｙ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８５ １８７：３３−７）。これら方法では、短時間に多量に発生したラジカルがサンプル中に存在する抗酸化物質を消費することから、酸化開始のために発生させたラジカルと抗酸化物質との直接の反応が起こっていると考えられる。したがって、ラジカルと酸化反応可能な抗酸化成分の総量を抗酸化能力と見做して評価している。
このように、ｅｘ ｖｉｖｏで生体試料の酸化を惹起する方法では、ラジカルとの反応が可能なそのサンプル中の特定の抗酸化能を評価することができる。
ＬＤＬ試料を用いる方法もあり、Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒにより提唱されたＥｓｔｅｒｂａｕｅｒ法が使用されている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ，Ｓｔｒｉｅｇｌ Ｇ，Ｐｕｈｌ Ｈ，Ｒｏｔｈｅｎｅｄｅｒ Ｍ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９ ６：６７−７５）。このＥｓｔｅｒｂａｕｅｒ法では、ＬＤＬ試料にｅｘ ｖｉｖｏで銅イオンを添加して３７℃で保温することで脂質過酸化の連鎖反応を起こし、この脂質過酸化反応に対するそのＬＤＬ試料の抗酸化能力を評価している。この測定においては、酸化物の生成を２３４ｎｍにおける吸光度により評価しており、反応開始後２３４ｎｍの吸光度変化が検出され始めるまでのラグタイムが、試料中の抗酸化成分の量を反映していると考えられている。この測定において、α−トコフェロールの投与がヒトにおけるラグタイムの延長を引き起こすことが報告されている（Ｄｉｅｂｅｒ−Ｒｏｔｈｅｎｅｄｅｒ Ｍ，Ｐｕｈｌ Ｈ，Ｗａｅｇ Ｇ，Ｓ ｔｒｉｅｇｌ Ｇ，Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄ−ａｌｐｈａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１ ３２：１３２５−３２）。
上記のＴＡＳ法、ＴＲＡＰ法、Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ法のいずれの評価方法も、ｅｘ ｖｉｖｏで試料中に含まれる抗酸化成分が消失するまで酸化反応を行うものであり、抗酸化成分の総量をもって抗酸化能力と見做している。これら評価方法において用いられる試料中の主要な抗酸化成分は、ビタミンＥの中でもっとも抗酸化活性の高い分子種であるα−トコフェロールと考えられる（二木鋭雄、島崎弘幸、美濃真編、抗酸化成分 フリーラジカルと生体防御、１９９４学会出版センター）。したがって、これら評価方法においては、主にα−トコフェロールの総量を抗酸化能力として評価していることになるから、個体からの試料中のα−トコフェロール含量が高ければその個体の抗酸化能力は高いものと、すなわち、その個体は、酸化ストレスによって増悪される動脈硬化や虚血性疾患のような疾患を患い難いと評価されてきた。事実、これら方法を行うためのキットが、Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．，ＯＸＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．等により、臨床診断に有用なものとして市販されている。
しかしながら、生体内で酸化が進行した動脈硬化病変においても、α−トコフェロールが消失せずにその病変中に存在することが報告されている（Ｕｐｓｔｏｎ ＪＭ，Ｔｅｒｅｎｔｉｓ ＡＣ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｋ，Ｋｅａｎｅｙ Ｊｒ ＪＦ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００２ １；３６３：７５３−６０）。このことは、動脈硬化病変のような酸化ストレスによって増悪する病変において、α−トコフェロールに代表される生体内抗酸化成分が存在する状態でも酸化が進行すること、すなわち、そのような生体内抗酸化成分でも阻止できない酸化が起こっていることを示唆している。
これに関して、近年、α−トコフェロールが特定の実験条件では脂質過酸化を促進することが報告されている（Ｍａｉｏｒｉｎｏ Ｍ，Ｚａｍｂｕｒｌｉｎｉ Ａ，Ｒｏｖｅｒｉ Ａ，Ｕｒｓｉｎｉ Ｆ．Ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ ｃｏｐｐｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９３ ３３０：１７４−６．）。また、α−トコフェロールによる脂質過酸化促進作用を測定する方法も報告されている（Ｗｉｔｔｉｎｇ ＰＫ，Ｍｏｈｒ Ｄ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；２９９：３６２−７５）。この現象は、α−トコフェロールに特有の脂質過酸化の促進作用として捉えられており（Ｕｐｓｔｏｎ ＪＭ，Ｔｅｒｅｎｔｉｓ ＡＣ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９９ １３：９７７−９４）、それが、抗酸化成分が存在している状態でも酸化が進行する原因の一つとして捉えられている。
こうしたことから、従来の抗酸化能力の評価方法では、酸化ストレスによって増悪する病変の真のリスク評価ができていなかったと考えられる。Ｋａｒｍａｎｓｋｙらは、評価された抗酸化能力の程度と病態の程度とが必ずしも良好な相関を示さなかったことを報告している（Ｋａｒｍａｎｓｋｙ Ｉ，Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ｈ，Ｐａｌａｎｔ Ａ，Ｇｒｕｅｎｅｒ Ｎ．Ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｌｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６ ２９：５７３−９）。
したがって、生体内抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応による生成物を定量できれば、酸化ストレスによって増悪する病変のリスク評価をより正確に行うことができる。
生体試料の酸化反送による生成物の同定については、ＬＤＬ酸化の段階を定めるために、コレステロールエステルの酸化生成物であるコレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）をＨＰＬＣで分離する方法が確立されている（Ｌ．Ｋｒｉｔｈａｒｉｄｅｓ，Ｗ．Ｊｅｓｓｕｐ，Ｊ．Ｇｉｆｆｏｒｄ，ａｎｄ Ｒ．Ｔ．Ｄｅａｎ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１３，７９−８９（１９９３））。
【発明の開示】
本発明は、抗酸化成分が存在する状態で起こる酸化に対する生体の抗酸化能力を評価する方法を提供する。
本発明者らは、抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応の存在に着目して研究を重ねた結果、そのような酸化生成物を測定する方法を見出した。
本発明は、生体試料の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記被酸化性基質の酸化反応を開始させる段階；
（ｃ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｄ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｂ）および（ｃ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法の発明である。
また、本発明は、この方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行う方法の発明でもある。
さらに、本発明は、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記生体試料に前記抗酸化性被検成分を添加する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の混合物の酸化反応を開始させる段階；
（ｄ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｅ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｃ）および（ｄ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法の発明である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において酸化反応を停止させた後の処理液の代表的なＨＰＬＣチャートを示す。約９分の保持時間のピークがＣＥＯＯＨとＣＥＯＨであり、約５分の保持時間のピークがα−トコフェロールである。
図２は、ＡＡＰＨ濃度と酸化生成物との関係を示したグラフを示す。横軸はＡＡＰＨ濃度であり、縦軸はコレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）の生成量の和である。
図３は、実施例２においてα−トコフェロールが消失した酸化反応液の代表的なＨＰＬＣチャートを示す。
図４は、種々の濃度のα−トコフェロール、プロブコールまたはＢＯ−６５３存在下でのＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量の推移を示したグラフを示す。
発明の詳細な説明
本発明の１つの側面は、抗酸化成分と被酸化性基質とを含有する生体試料にｅｘ ｖｉｖｏで酸化反応を開始させ、その抗酸化成分が酸化種によって消費し尽くされない状態でその酸化反応を継続させ、そしてこの酸化反応により酸化された被酸化性基質を定量することを含んでなる、生体試料の抗酸化能力を評価する方法である。この方法では、生体試料、引いては、その生体試料が取り出された個体の抗酸化能力が評価されることになる。
この方法において対象となる生体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。生体試料には、組織ホモジネート、リンパ液、尿、血液、血漿および血清が含まれる。試料が取り出される組織は、特に制限されず、皮膚、肝臓、血管壁、血液、尿が含まれ、好ましくは血液である。本発明の方法に使用される試料は、生体内におけるそのままの濃度で、またはそれを１００００倍まで、好ましくは１０倍までに希釈して使用される。希釈は、生理食塩水で行うのが好ましい。場合により、試料の酸化を防ぐために、キレーターを加えてもよい。一般に、３〜１０のｐＨに調節するのが好ましい。
本発明の方法において生体試料中に生来的に含有される“抗酸化成分”は、生体が酸化ストレスに抗するために有している易酸化性物質の総称であって、特にα−トコフェロールを挙げることができる。この抗酸化成分は、試料中に共存する被酸化性基質よりも先に酸化されることにより系内の酸化種を相殺し、それによって、その被酸化性基質が酸化されるのを阻止する働きを行うものと考えられてきた。しかし、上述のように、α−トコフェロールが特定の実験条件では脂質過酸化を促進することが報告されているので、必ずしも被酸化性基質が酸化されるのを阻止するとは限らないと考えられる。
本発明の方法において用いられる“被酸化性基質”という用語は、例えば、試料が血液、血漿または血清である場合には、コレステロールエステル、中性脂質、リン脂質などの脂質；ヘモグロビン、ＳＨ基を有する蛋白などを意味し、コレステロールエステルが主要な被酸化性基質である。
本発明の方法における酸化反応は、酸化開始剤を加えることにより、紫外線もしくは放射線のような照射を行うことにより、または自働酸化により開始させることができる。しかしながら、酸化開始剤の使用は、その種類や添加量の増減により酸化反応の強さを調節するのが容易なことから、好ましい開始方法である。用いられる酸化開始剤には、例えば、過酸化水素およびｔ−ブチルヒドロペルオキシドのような過酸化物；塩化鉄および硫酸銅のような金属塩；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）および２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）のようなアゾ系開始剤；銅、鉄およびヘミンのような遷移金属；ならびに次亜塩素酸、ヘム鉄およびヘモグロビンなどが含まれる。また、酸化開始剤として酵素を用いてもよく、それらには、例えば、リポキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびラクトペルオキシダーゼなどが含まれる。
これら酸化開始剤は、単独でも二種以上を組み合わせてもよい。適切な強さの酸化反応に調節できる点でＡＡＰＨを単独で使用するのが好ましい。
本発明の具体的な態様においては、酸化開始剤にＡＡＰＨを用い、生体試料が血漿のときに、ＡＡＰＨ濃度が５〜３０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである。照射により酸化反応を開始させるには、紫外線または放射線を用いるのが好ましい。自働酸化は、試料を空気中もしくは酸素中に曝すことにより開始することができる。酸化を開始させる温度は一般に２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃である。
本発明の方法において用いられる“１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下”という用語は、抗酸化成分が酸化種との酸化還元反応によって消費され尽くされていない状態を意味する。そのような状態を維持することで、従来から被酸化性基質の酸化を阻止すると考えられてきた抗酸化成分によっても阻止できない酸化またはそれにより促進される酸化が進行する状況をつくり上げたのである。場合により、生体試料に抗酸化物質を添加することにより抗酸化成分の存在下の状態を人工的に創り出してもよい。この際、添加する抗酸化物質は、生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と同一であっても異なっていてもよいが、生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と同一物質であるかまたは生体試料に含有される抗酸化成分のうちの１種であることが好ましく、生体試料に含有される抗酸化成分のうちの１種であることがより好ましい。生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と異なる抗酸化物質には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような脂溶性抗酸化化合物およびトロロックスのような水溶性抗酸化化合物が含まれる。
開始後に継続される酸化反応の種類はその開始手段に依存する。一般に、酸化開始剤や照射により酸化を開始する場合にはラジカル酸化反応となる。酸化反応の具体的な条件は、被酸化性基質の酸化が進行し、かつ酸化反応が停止するまで抗酸化成分が存在している条件であればよい。しかしながら、具体的な酸化反応の条件は、試料濃度、酸化開始剤濃度、温度および時間などの条件を様々に変えることにより設定することができる。温度は、２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃である。一般に酸化反応の開始時と同じ温度で行われる。開始後に酸化反応を継続する時間は２〜１０時間が好ましく、４〜８時間がより好ましい。
本発明の具体的な態様においては、生体試料が血漿であり、酸化開始剤がＡＡＰＨであってその濃度が５〜３０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭであり、反応温度が２０〜５０℃、好ましくは３７℃であり、そして反応時間が２４時間以内、好ましくは８時間以内である。
被酸化性基質の酸化生成物は、酸化反応の速度を測定することによっても、酸化反応が停止した後に酸化反応液中の成分の量を測定することによっても行うことができる。
酸化反応速度の測定法には、酸化により被酸化性基質が減少する割合を測定する方法、マーカー物質を添加してその変動により酸化の進行をモニターする方法、被酸化性基質の酸化により生じる酸化生成物が増加する割合を測定する方法などが含まれ、酸化により減少する被酸化性基質を測定する具体的な方法としては、例えば、酸素消費量の測定、不飽和脂質の減少の測定、グルタチオンの減少の測定などがあげられる。また、マーカー物質を添加してその変動により酸化の進行をモニターする具体的な方法としては、例えば、スピンとラップ剤をマーカー物質として用いる方法、蛍光物質をマーカー物質として用いる方法などがあげられる。被酸化性基質の酸化により生じる酸化生成物が増加する割合を測定する方法は、以下に記載する酸化反応停止後の酸化反応液中の酸化された被酸化性基質の定量と同様である。
酸化反応停止後の酸化反応液中の成分の測定による場合、酸化された被酸化性基質を定量しても、酸化された被酸化性基質の濃度と酸化されていない基質の濃度とを測定しその比率から酸化率を決定してもよい。いずれの場合も、酸化反応の停止もしくは減弱は、通常は酸化反応液を含む容器を氷水中に浸けることによる急冷、強力な抗酸化剤を添加することによる酸化阻止などによって行われる。次いで、その酸化反応液から酸化された被酸化性基質および／または酸化されていない被酸化性基質を分離する。分離は、抽出、電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどの方法により行われる。有機溶媒による抽出が好ましい。この目的に適する有機溶媒には、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトン、酢酸、水およびそれらの混合溶液が含まれる。酢酸を含むメタノール／ｎ−ヘキサン混合溶液が好ましい。抽出に使用する有機溶媒の量は、生体試料またはその希釈液の０．１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍である。抗体を用いて定量する場合などのように定量の特異性が高い場合には、分離を省略することができる。
酸化の進行をモニターする為に添加するマーカー物質、および酸化されまたは酸化されていない被酸化性基質の定量を行う手段は、被酸化性基質がいかなる物質であるかに依存する。分析対象物質がコレステロールエステル、中性脂質およびリン脂質などの脂質またはそれらの酸化生成物である場合は、一般的な酸化脂質の測定法やＴＢＡ反応性物質の測定法を用いることができ、ヘモグロビンなどの蛋白またはそれらの酸化生成物である場合は、一般的な蛋白の測定法または酸化変性蛋白の測定法を用いることができる。また、ＨＰＬＣ法、ＬＣ−ＥＤＣ法、ＴＬＣ法、質量分析法、ＥＬＩＳＡ法、および発色による吸光度変化もしくは蛍光強度変化による定量を用いることができる。しかしながら、あらゆる種類の分析対象物質の測定に用いることができる点、および分析対象物質の同定も可能である点で、ＨＰＬＣ法もしくはＥＬＩＳＡ法が好ましい。特にＵＶ検出器を装備したＨＰＬＣ法が操作性やコスト等の点で好ましい。
本発明の１つの態様において、被酸化性基質が脂質である場合、その酸化生成物には、酸化により分子内にペルオキシ結合（−Ｏ−Ｏ−）を有するに至った脂質過酸化物、オキシ結合（−Ｏ−）を有するに至った脂質酸化物、およびそれらの脱離により形成されるジエン結合を有するに至った脂質があげられる。したがって、被酸化性基質がコレステロールエステルである場合、その酸化生成物には、例えば、コレステロールエステルヒドロペルオキシド、コレステロールエステルヒドロキシド、酸化ステロールエステル、コレステロールエステルアルデヒドなどがあげられ、コレステロールエステルヒドロペルオキシドとコレステロールエステルヒドロキシドとの総量を測定することが好ましい。
被酸化性基質がコレステロールエステルであり、生体内抗酸化成分がα−トコフェロールであり、酸化反応の開始がＡＡＰＨで行われ、そして酸化反応が８時間行われる場合に、抗酸化成分の存在下の状態を維持するには、ＡＡＰＨの濃度を好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭであるようにする。
本発明の別の側面では、上記の方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行うことができる。対象となる疾患および／または病態としては、酸化ストレスが増悪因子になることが知られている疾患、例えば、白内障、糖尿病、アルツハイマー、癌、動脈硬化症、心肺疾患、高コレステロール血症、慢性炎症性疾患、虚血性疾患などが挙げられ、その中でも特に酸化ストレスの関与が深い疾患、例えば、糖尿病などの慢性内分泌疾患、アルツハイマーなどの脳疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺疾患、非アルコール性脂肪肝にともなう肝疾患（ＮＡＳＨ）のような肝疾患、慢性腎不全のような腎疾患、動脈硬化症のような循環器疾患、クローン病、リウマチのような慢性炎症性疾患、および癌、を挙げることができる。また、本評価を健康診断の１つの指標とすることも可能である。
本発明の更なる側面は、抗酸化成分と被酸化性基質とを含有する生体試料中に抗酸化性被検成分を加えて、酸化反応を開始させ、その抗酸化成分が酸化種によって消費し尽くされない状態でその酸化反応を継続させ、そしてこの酸化反応により酸化された被酸化性基質を定量することを含んでなる、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法である。
この方法は、抗酸化性被検成分を、抗酸化成分の存在下で起こる生体試料中の被酸化性基質の酸化反応のメカニズムの下に置くことにより、その環境下での抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価しようとするものである。評価の対象は生体試料ではなく、抗酸化性被検成分の抗酸化能力である。この方法によれば、生体内抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応に対する、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価することができる。生体試料、生体試料中に含まれる被酸化性基質、生体試料中に生来的に含有されても添加されてもよい抗酸化物質、酸化反応を開始および継続させる手段、および被酸化性基質からの酸化生成物の定量などは上記の通りである。しかし、生体試料は検査材料の１つに過ぎないから、その組成や抗酸化能力に変動がないのが好ましい。典型的には、予め標準的な生体試料が調製されるのがよい。評価に際して、生体試料は、抗酸化性被検成分と混合されるほか、抗酸化性被検成分との比較のためにコントロールとして使用されてもよく、また、その抗酸化能力が固定値として使用されてもよい。抗酸化性被検成分には、抗酸化性を有することが期待される合成されたかまたは天然の化合物が含まれる。これらは、今後その抗酸化性が期待される化合物であるから、その構造や由来を予め特定することはできない。しかしながら、合成された化合物には、例えば、４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン（以下、ＢＯ−６５３という）が含まれる。抗酸化性被検成分の、生体試料中に含有される抗酸化成分に対するモル濃度の比率は、０．００１〜１０００：１、好ましくは０．００２〜５００：１、より好ましくは０．０１〜１００：１、更に好ましくは０．１〜１０：１である。
【実施例】
実施例１：血漿試料中のコレステロールエステルの酸化生成物の定量再現性
正常人の血漿試料中のコレステロールエステルを被酸化性基質ととらえてその酸化生成物の定量再現性をみた。
インフォームドコンセントを得た一人の正常人からヘパリン採血を行ってプール血漿を調製した。
このプール血漿を１．１ｍＬづつ９本の試験管に分注して−８０℃で凍結保存した。
凍結された血漿試料を含有する３本の試験管Ａ、ＢおよびＣを３７℃に５分間保温することにより内容物を解凍した。解凍後それら試験管を氷中に維持した。
それぞれの試験管から取り出した３００μＬの血漿に１０μＬのＡＡＰＨ（和光純薬（株）製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＷＦ １１８３）水溶液をＡＡＰＨの濃度が１０ｍＭになるように加えた。次いで、３７℃に保温することで酸化反応を開始させた。
酸化反応開始後３７℃で８時間してからそれぞれの反応液の入った３つの容器を氷中に浸けることにより反応を停止させた。それぞれ１００μＬの反応液に１ｍＬの０．０２％酢酸を含むメタノール溶液と５ｍＬのヘキサンを加えて反応液中の脂質を抽出した。そのヘキサン抽出液４ｍＬをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ社製，ＡＥＳ１０１０）で濃縮し、それぞれの濃縮物を２００μＬのイソプロピルアルコール中に溶解させた。
Ｃ１８逆相カラムを用いる下記条件のＨＰＬＣにより脂質を溶離させた。２３４ｎｍのＵＶ光で検出を行った。
ＨＰＬＣ条件：
カラム： Ｃ１８逆相カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ社製、ＬＣ−１８）
移動相： エタノール：メタノール：イソプロパノール：水＝２９５０：９００：１５０：１５
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度： 室温
検出： ＵＶ検出器（２３４ｎｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＵＶ ｖａｒｉａｂｌｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｇ１３１４Ａ）
外部標準：コレステロールリノリエートヒドロペルオキサイド
このＨＰＬＣ条件では、コレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）の両分子種を含んだコレステロールエステル酸化生成物が約９分の保持時間で溶離され、α−トコフェロールが約５分で溶離された。α−トコフェロールが存在したことで、この試験ではα−トコフェロールが存在している状態で酸化反応が進行しかつ停止されたことが確認できた。この測定における代表的なＨＰＬＣチャートを図１に示す。
同じ測定験操作を残る６本の試験管に含有される血漿試料についても行った。なお、それらのうち３本を用いた測定は上記測定日の翌日（第２日）に行い、残る３本を用いた測定は翌々日（第３日）に行った。結果を表１に示す。
表１において、日内変動幅とは、同日に測定した試料Ａ、ＢおよびＣの日内平均値に対する標準偏差のパーセンテージであり、日間変動幅とは、第１〜３日の日間平均値に対する標準偏差のパーセンテージである。
表１から明らかなように、日内および日間変動幅（ＣＶ％）がいずれも２０％以内である。また、９試料の全体の変動幅は１８．２％である。この程度の変動幅は、コレステロールエステルの酸化生成物が再現性良く測定できることを示している。
実施例２：抗酸化成分が存在する状態のＡＡＰＨ濃度への依存性
血漿試料中でのＡＡＰＨの濃度を０〜４８ｍＭで変動させた以外は実施例１と同様な測定を行うことにより、本発明の測定法において抗酸化成分が存在する状態を維持することのＡＡＰＨ濃度への依存性を検討した。結果を図２に示す。
図２から、ＡＡＰＨ濃度が５ｍＭ以上であればＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの酸化が進行することが分かる。一方、ＡＡＰＨ濃度が２９ｍＭ以上になると、抗酸化成分であるα−トコフェロールが存在しなくなることがＨＰＬＣにより確認された。α−トコフェロールが消失した酸化反応液の代表的なＨＰＬＣチャートを図３に示す。
したがって、α−トコフェロールが存在する状態でコレステロールエステルの酸化反応を進行させるには、ＡＡＰＨを酸化開始剤にした場合には、その濃度を５〜３０ｍＭ程度にする必要があることが明らかとなった。
実施例３：α−トコフェロールの脂質酸化促進作用の確認
実施例１の血漿試料に、ＡＡＰＨの添加５分前に抗酸化物質であるα−トコフェロール、プロブコールまたは４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン（ＢＯ−６５３）を種々の濃度になるように添加した以外は実施例１と同様な測定を行うことにより、試料中に存在する抗酸化物質の種類によってＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量がどのように変化するかを調べた。なお、ＢＯ−６５３は、ＷＯ９４／０８９３０号公報、米国特許第５，５７４，１７８号公報、ヨーロッパ特許出願公開第０６６５２０８号公報記載の方法により製造することができる。
プロブコール（ＳＩＧＭＡ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．６１Ｋ１１２１）およびＢＯ−６５３（中外製薬株式会社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．００９００２）のリノール酸ペルオキシラジカルとの反応速度は、α−トコフェロール（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ａ０１５８２１３０１）についての速度を１とした場合、それぞれ１／１７．５および１／２と報告されている（Ｇｏｔｏｈ Ｎ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ，Ｋｏｍｕｒｏ Ｅ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｊ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｎｉｋｉ Ｅ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｂｕｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９２ １１２８：１４７−５４；Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｉｗａｋｉ Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｋｏｍｕｒｏ Ｅ，Ｋａｔｏ Ｙ，Ｔａｍｕｒａ Ｋ，Ｃｙｎｓｈｉ Ｏ，Ｋｏｄａｍａ Ｔ，Ｎｉｋｉ Ｅ．２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，２−ｄｉｐｅｎｔｙｌ−４，６−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９７ ３４２：２３６−４３）。リノール酸ペルオキシラジカルとの反応速度を調べる方法は従来の抗酸化能力の評価方法なので、α−トコフェロール、プロブコールおよびＢＯ−６５３はいずれも従来の評価方法では抗酸化能力を有するとされた物質である。
結果を図４に示す。なお、図４に示された抗酸化物質の濃度は血漿試料中に外部から加えたものの濃度だけを表示してある。現実には、全ての血漿試料に生来的なα−トコフェロールが存在する。したがって、α−トコフェロールを外部から加えた試料のα−トコフェロール濃度は表示された値より大きい。
図４から、α−トコフェロールでは、その濃度の上昇とともにＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量が有意に上昇するが、ＢＯ−６５３では、その濃度の上昇とともにＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量が有意に低下している。これは、α−トコフェロールは、従来の抗酸化能力の評価方法でＢＯ−６５３よりも大きな抗酸化能力があるとされているのに、コレステロールエステルのような脂質の酸化については、むしろそれを促進することを示している。
この結果は、生体試料中のα−トコフェロールに代表される生体内抗酸化成分の総量を抗酸化能力として評価してきた従来の方法では、酸化ストレスによって増悪する病変の真のリスク評価ができていなかったことを示すとともに、生体内抗酸化成分の存在下でも起こる酸化を捉えられる本発明の測定方法が、そのようなリスク評価を的確に行えることを示している。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、α−トコフェロールなどの抗酸化成分が存在する状態で起こる酸化反応に対する生体の抗酸化能力を評価することができる。特に、酸化ストレスによって増悪する病態においては、抗酸化成分であるα−トコフェロールが存在する状態で起こる酸化反応が重要であると考えられることから、本発明は臨床検査法として有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
本発明は、生体内における酸化ストレスに対する抗酸化能力の評価方法に関する。
【背景技術】
ヒトを含む好気性生物は、酸素による酸化的リン酸化によってエネルギーを得ている。この酸化的リン酸化は、酸素から生じる酸素ラジカルを介して進行する。したがって、酸素ラジカルの存在は、生体にとって必須である。
しかし、酸素ラジカルは、生体内の組織または生体成分を酸化するという酸化ストレスにもなると考えられ、その酸化ストレスが、白内障、糖尿病、アルツハイマー、癌、動脈硬化、心肺疾患、高コレステロール血症、慢性炎症性疾患、虚血性疾患のような種々の疾患の増悪因子になることが知られている（Ｓｉｅｓ Ｈ．（１９９７）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ：ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２：２９１−５；Ｓｃｏｔｔ Ｇ．（１９９７）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｌ Ｈｏｕｓｅ，ＵＫ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｐｏｒｔｅｒ Ｎ．Ａ．（１９９０）Ａｕｔｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ：Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（ｂａｓｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）．Ｖｉｇｏ−Ｐｅｌｆｒｅｙ，Ｃ．ｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．１ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｉｍｉｃ Ｍ．，Ｋａｒｅｌ Ｍ．（１９８０）Ａｕｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）。酸素ラジカルを介する生体内でのエネルギー生産は常に行われているから、生体は常に酸素ラジカルによる酸化ストレスに曝されていることになる。
生体は、この酸化ストレスから個体を護るための防御手段として抗酸化能力を有している。この抗酸化能力のレベルには個体差があるため、かなりの酸化ストレスに曝されても上記のような疾患を患わない個体もあれば、容易に患う個体もある。
したがって、酸化ストレスによって増悪する上記のような疾患に対する個体の抗酸化能力を正確に評価できれば、そうした疾患を予防または治療するうえで有用な情報を得ることができる。
これまで、抗酸化能力の評価方法として、生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法と、まだ酸化されていない生体試料を取り出してｅｘ ｖｉｖｏで酸化を惹起して、試料の酸化され難さを調べる方法とが知られている。
生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法については、酸化生成物としてＴＢＡ反応性物質である過酸化脂質を測定する方法が古くから用いられている（Ｙａｇｉ Ｋ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ．１９７６ １５：２１２−６．）。この方法は、過酸化脂質をＴＢＡとともに酸性条件下で加熱し生成する蛍光強度を測定することによって、生体内で生成した過酸化脂質を測定する方法である。しかしながら、この方法では、過酸化脂質が生体内のどこで生成したか、およびどのような反応によって生成したかについての情報が得られないため、その測定値が、生体内のどの組織におけるどのような酸化反応に対する抗酸化能力を反映したものであるかを知ることができない。さらに、過酸化脂質は、生体内の酵素反応によっても生成することに加えて、その濃度は代謝や排泄による影響が避けられないので、生体内で既に酸化された酸化生成物を測定する方法は、生体の抗酸化能力の評価法としては不十分である。
近年開発された酸化生成物の測定法であるイソプロステインＦ２αを測定する方法によれば、生体内の酸化反応のうち酵素反応による酸化反応の影響を避けることができるので、ラジカル反応による酸化生成物のみを測定でき、したがって、そうした酸化反応に対する抗酸化能力のみを評価できることが報告されている（Ｐａｔｒｏｎｏ Ｃ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＧＡ．Ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１９９７ １７：２３０９−１５）。しかし、生体内のどの組織のどのようなラジカル酸化反応に対する抗酸化能力であるかを知ることができず、しかも依然として酸化生成物の代謝や排泄による影響が避けられない。
一方、ｅｘ ｖｉｖｏで生体試料の酸化を惹起する方法では、生体から試料を取り出し、そしてその試料を体外で酸化反応に付することにより、その試料中に含まれる生体内抗酸化成分の抗酸化能力を評価することで、その生体試料が取り出された特定の組織における抗酸化能力を評価することができる。
この方法では、例えば、血清もしくは組織ホモジネート試料などを用いるＴＡＳ法（Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｓｔａｔｕｓ法；Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ Ｃ，Ｍｉｌｌｅｒ ＮＪ．Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４ ２３４：２７９−９３．）が臨床検査法として使用されている。このＴＡＳ法では、酸化剤として過酸化水素とメトミオグロビン（ｍｅｔｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）とを用いて、鉄イオンを介したラジカル反応による酸化反応を惹起し、この酸化反応に抗する試料の能力を測定することで、試料の抗酸化能力を評価するものである。この方法は、反応時間が典型的には６分と短時間であるため、自動分析機でも測定可能である。過酸化水素とメトミオグロビンによる酸化の代わりに、定常的にラジカルを発生することができる２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）による酸化反応を利用した方法として、ＴＲＡＰ法（Ｔｏｔａｌ Ｒａｄｉｃａｌ−ｔｒａｐｐｉｎｇ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）も開発されている（Ｗａｙｎｅｒ ＤＤ，Ｂｕｒｔｏｎ ＧＷ，Ｉｎｇｏｌｄ ＫＵ，Ｌｏｃｋｅ Ｓ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ，ｐｅｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ−ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｍａｄｅ ｂｙ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８５ １８７：３３−７）。これら方法では、短時間に多量に発生したラジカルがサンプル中に存在する抗酸化物質を消費することから、酸化開始のために発生させたラジカルと抗酸化物質との直接の反応が起こっていると考えられる。したがって、ラジカルと酸化反応可能な抗酸化成分の総量を抗酸化能力と見做して評価している。
このように、ｅｘ ｖｉｖｏで生体試料の酸化を惹起する方法では、ラジカルとの反応が可能なそのサンプル中の特定の抗酸化能を評価することができる。
ＬＤＬ試料を用いる方法もあり、Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒにより提唱されたＥｓｔｅｒｂａｕｅｒ法が使用されている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ，Ｓｔｒｉｅｇｌ Ｇ，Ｐｕｈｌ Ｈ，Ｒｏｔｈｅｎｅｄｅｒ Ｍ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９ ６：６７−７５）。このＥｓｔｅｒｂａｕｅｒ法では、ＬＤＬ試料にｅｘ ｖｉｖｏで銅イオンを添加して３７℃で保温することで脂質過酸化の連鎖反応を起こし、この脂質過酸化反応に対するそのＬＤＬ試料の抗酸化能力を評価している。この測定においては、酸化物の生成を２３４ｎｍにおける吸光度により評価しており、反応開始後２３４ｎｍの吸光度変化が検出され始めるまでのラグタイムが、試料中の抗酸化成分の量を反映していると考えられている。この測定において、α−トコフェロールの投与がヒトにおけるラグタイムの延長を引き起こすことが報告されている（Ｄｉｅｂｅｒ−Ｒｏｔｈｅｎｅｄｅｒ Ｍ，Ｐｕｈｌ Ｈ，Ｗａｅｇ Ｇ，Ｓ ｔｒｉｅｇｌ Ｇ，Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄ−ａｌｐｈａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１ ３２：１３２５−３２）。
上記のＴＡＳ法、ＴＲＡＰ法、Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ法のいずれの評価方法も、ｅｘ ｖｉｖｏで試料中に含まれる抗酸化成分が消失するまで酸化反応を行うものであり、抗酸化成分の総量をもって抗酸化能力と見做している。これら評価方法において用いられる試料中の主要な抗酸化成分は、ビタミンＥの中でもっとも抗酸化活性の高い分子種であるα−トコフェロールと考えられる（二木鋭雄、島崎弘幸、美濃真編、抗酸化成分 フリーラジカルと生体防御、１９９４学会出版センター）。したがって、これら評価方法においては、主にα−トコフェロールの総量を抗酸化能力として評価していることになるから、個体からの試料中のα−トコフェロール含量が高ければその個体の抗酸化能力は高いものと、すなわち、その個体は、酸化ストレスによって増悪される動脈硬化や虚血性疾患のような疾患を患い難いと評価されてきた。事実、これら方法を行うためのキットが、Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．，ＯＸＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．等により、臨床診断に有用なものとして市販されている。
しかしながら、生体内で酸化が進行した動脈硬化病変においても、α−トコフェロールが消失せずにその病変中に存在することが報告されている（Ｕｐｓｔｏｎ ＪＭ，Ｔｅｒｅｎｔｉｓ ＡＣ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｋ，Ｋｅａｎｅｙ Ｊｒ ＪＦ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００２ １；３６３：７５３−６０）。このことは、動脈硬化病変のような酸化ストレスによって増悪する病変において、α−トコフェロールに代表される生体内抗酸化成分が存在する状態でも酸化が進行すること、すなわち、そのような生体内抗酸化成分でも阻止できない酸化が起こっていることを示唆している。
これに関して、近年、α−トコフェロールが特定の実験条件では脂質過酸化を促進することが報告されている（Ｍａｉｏｒｉｎｏ Ｍ，Ｚａｍｂｕｒｌｉｎｉ Ａ，Ｒｏｖｅｒｉ Ａ，Ｕｒｓｉｎｉ Ｆ．Ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ ｃｏｐｐｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９３ ３３０：１７４−６．）。また、α−トコフェロールによる脂質過酸化促進作用を測定する方法も報告されている（Ｗｉｔｔｉｎｇ ＰＫ，Ｍｏｈｒ Ｄ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；２９９：３６２−７５）。この現象は、α−トコフェロールに特有の脂質過酸化の促進作用として捉えられており（Ｕｐｓｔｏｎ ＪＭ，Ｔｅｒｅｎｔｉｓ ＡＣ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｒ．Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９９ １３：９７７−９４）、それが、抗酸化成分が存在している状態でも酸化が進行する原因の一つとして捉えられている。
こうしたことから、従来の抗酸化能力の評価方法では、酸化ストレスによって増悪する病変の真のリスク評価ができていなかったと考えられる。Ｋａｒｍａｎｓｋｙらは、評価された抗酸化能力の程度と病態の程度とが必ずしも良好な相関を示さなかったことを報告している（Ｋａｒｍａｎｓｋｙ Ｉ，Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ｈ，Ｐａｌａｎｔ Ａ，Ｇｒｕｅｎｅｒ Ｎ．Ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｌｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６ ２９：５７３−９）。
したがって、生体内抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応による生成物を定量できれば、酸化ストレスによって増悪する病変のリスク評価をより正確に行うことができる。
生体試料の酸化反送による生成物の同定については、ＬＤＬ酸化の段階を定めるために、コレステロールエステルの酸化生成物であるコレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）をＨＰＬＣで分離する方法が確立されている（Ｌ．Ｋｒｉｔｈａｒｉｄｅｓ，Ｗ．Ｊｅｓｓｕｐ，Ｊ．Ｇｉｆｆｏｒｄ，ａｎｄ Ｒ．Ｔ．Ｄｅａｎ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１３，７９−８９（１９９３））。
【発明の開示】
本発明は、抗酸化成分が存在する状態で起こる酸化に対する生体の抗酸化能力を評価する方法を提供する。
本発明者らは、抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応の存在に着目して研究を重ねた結果、そのような酸化生成物を測定する方法を見出した。
本発明は、生体試料の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記被酸化性基質の酸化反応を開始させる段階；
（ｃ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｄ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｂ）および（ｃ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法の発明である。
また、本発明は、この方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行う方法の発明でもある。
さらに、本発明は、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記生体試料に前記抗酸化性被検成分を添加する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の混合物の酸化反応を開始させる段階；
（ｄ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｅ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｃ）および（ｄ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法の発明である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において酸化反応を停止させた後の処理液の代表的なＨＰＬＣチャートを示す。約９分の保持時間のピークがＣＥＯＯＨとＣＥＯＨであり、約５分の保持時間のピークがα−トコフェロールである。
図２は、ＡＡＰＨ濃度と酸化生成物との関係を示したグラフを示す。横軸はＡＡＰＨ濃度であり、縦軸はコレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）の生成量の和である。
図３は、実施例２においてα−トコフェロールが消失した酸化反応液の代表的なＨＰＬＣチャートを示す。
図４は、種々の濃度のα−トコフェロール、プロブコールまたはＢＯ−６５３存在下でのＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量の推移を示したグラフを示す。
発明の詳細な説明
本発明の１つの側面は、抗酸化成分と被酸化性基質とを含有する生体試料にｅｘ ｖｉｖｏで酸化反応を開始させ、その抗酸化成分が酸化種によって消費し尽くされない状態でその酸化反応を継続させ、そしてこの酸化反応により酸化された被酸化性基質を定量することを含んでなる、生体試料の抗酸化能力を評価する方法である。この方法では、生体試料、引いては、その生体試料が取り出された個体の抗酸化能力が評価されることになる。
この方法において対象となる生体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。生体試料には、組織ホモジネート、リンパ液、尿、血液、血漿および血清が含まれる。試料が取り出される組織は、特に制限されず、皮膚、肝臓、血管壁、血液、尿が含まれ、好ましくは血液である。本発明の方法に使用される試料は、生体内におけるそのままの濃度で、またはそれを１００００倍まで、好ましくは１０倍までに希釈して使用される。希釈は、生理食塩水で行うのが好ましい。場合により、試料の酸化を防ぐために、キレーターを加えてもよい。一般に、３〜１０のｐＨに調節するのが好ましい。
本発明の方法において生体試料中に生来的に含有される“抗酸化成分”は、生体が酸化ストレスに抗するために有している易酸化性物質の総称であって、特にα−トコフェロールを挙げることができる。この抗酸化成分は、試料中に共存する被酸化性基質よりも先に酸化されることにより系内の酸化種を相殺し、それによって、その被酸化性基質が酸化されるのを阻止する働きを行うものと考えられてきた。しかし、上述のように、α−トコフェロールが特定の実験条件では脂質過酸化を促進することが報告されているので、必ずしも被酸化性基質が酸化されるのを阻止するとは限らないと考えられる。
本発明の方法において用いられる“被酸化性基質”という用語は、例えば、試料が血液、血漿または血清である場合には、コレステロールエステル、中性脂質、リン脂質などの脂質；ヘモグロビン、ＳＨ基を有する蛋白などを意味し、コレステロールエステルが主要な被酸化性基質である。
本発明の方法における酸化反応は、酸化開始剤を加えることにより、紫外線もしくは放射線のような照射を行うことにより、または自働酸化により開始させることができる。しかしながら、酸化開始剤の使用は、その種類や添加量の増減により酸化反応の強さを調節するのが容易なことから、好ましい開始方法である。用いられる酸化開始剤には、例えば、過酸化水素およびｔ−ブチルヒドロペルオキシドのような過酸化物；塩化鉄および硫酸銅のような金属塩；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）および２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）のようなアゾ系開始剤；銅、鉄およびヘミンのような遷移金属；ならびに次亜塩素酸、ヘム鉄およびヘモグロビンなどが含まれる。また、酸化開始剤として酵素を用いてもよく、それらには、例えば、リポキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびラクトペルオキシダーゼなどが含まれる。
これら酸化開始剤は、単独でも二種以上を組み合わせてもよい。適切な強さの酸化反応に調節できる点でＡＡＰＨを単独で使用するのが好ましい。
本発明の具体的な態様においては、酸化開始剤にＡＡＰＨを用い、生体試料が血漿のときに、ＡＡＰＨ濃度が５〜３０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである。照射により酸化反応を開始させるには、紫外線または放射線を用いるのが好ましい。自働酸化は、試料を空気中もしくは酸素中に曝すことにより開始することができる。酸化を開始させる温度は一般に２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃である。
本発明の方法において用いられる“１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下”という用語は、抗酸化成分が酸化種との酸化還元反応によって消費され尽くされていない状態を意味する。そのような状態を維持することで、従来から被酸化性基質の酸化を阻止すると考えられてきた抗酸化成分によっても阻止できない酸化またはそれにより促進される酸化が進行する状況をつくり上げたのである。場合により、生体試料に抗酸化物質を添加することにより抗酸化成分の存在下の状態を人工的に創り出してもよい。この際、添加する抗酸化物質は、生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と同一であっても異なっていてもよいが、生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と同一物質であるかまたは生体試料に含有される抗酸化成分のうちの１種であることが好ましく、生体試料に含有される抗酸化成分のうちの１種であることがより好ましい。生体試料中に生来的に含有される抗酸化成分と異なる抗酸化物質には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような脂溶性抗酸化化合物およびトロロックスのような水溶性抗酸化化合物が含まれる。
開始後に継続される酸化反応の種類はその開始手段に依存する。一般に、酸化開始剤や照射により酸化を開始する場合にはラジカル酸化反応となる。酸化反応の具体的な条件は、被酸化性基質の酸化が進行し、かつ酸化反応が停止するまで抗酸化成分が存在している条件であればよい。しかしながら、具体的な酸化反応の条件は、試料濃度、酸化開始剤濃度、温度および時間などの条件を様々に変えることにより設定することができる。温度は、２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃である。一般に酸化反応の開始時と同じ温度で行われる。開始後に酸化反応を継続する時間は２〜１０時間が好ましく、４〜８時間がより好ましい。
本発明の具体的な態様においては、生体試料が血漿であり、酸化開始剤がＡＡＰＨであってその濃度が５〜３０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭであり、反応温度が２０〜５０℃、好ましくは３７℃であり、そして反応時間が２４時間以内、好ましくは８時間以内である。
被酸化性基質の酸化生成物は、酸化反応の速度を測定することによっても、酸化反応が停止した後に酸化反応液中の成分の量を測定することによっても行うことができる。
酸化反応速度の測定法には、酸化により被酸化性基質が減少する割合を測定する方法、マーカー物質を添加してその変動により酸化の進行をモニターする方法、被酸化性基質の酸化により生じる酸化生成物が増加する割合を測定する方法などが含まれ、酸化により減少する被酸化性基質を測定する具体的な方法としては、例えば、酸素消費量の測定、不飽和脂質の減少の測定、グルタチオンの減少の測定などがあげられる。また、マーカー物質を添加してその変動により酸化の進行をモニターする具体的な方法としては、例えば、スピンとラップ剤をマーカー物質として用いる方法、蛍光物質をマーカー物質として用いる方法などがあげられる。被酸化性基質の酸化により生じる酸化生成物が増加する割合を測定する方法は、以下に記載する酸化反応停止後の酸化反応液中の酸化された被酸化性基質の定量と同様である。
酸化反応停止後の酸化反応液中の成分の測定による場合、酸化された被酸化性基質を定量しても、酸化された被酸化性基質の濃度と酸化されていない基質の濃度とを測定しその比率から酸化率を決定してもよい。いずれの場合も、酸化反応の停止もしくは減弱は、通常は酸化反応液を含む容器を氷水中に浸けることによる急冷、強力な抗酸化剤を添加することによる酸化阻止などによって行われる。次いで、その酸化反応液から酸化された被酸化性基質および／または酸化されていない被酸化性基質を分離する。分離は、抽出、電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどの方法により行われる。有機溶媒による抽出が好ましい。この目的に適する有機溶媒には、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトン、酢酸、水およびそれらの混合溶液が含まれる。酢酸を含むメタノール／ｎ−ヘキサン混合溶液が好ましい。抽出に使用する有機溶媒の量は、生体試料またはその希釈液の０．１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍である。抗体を用いて定量する場合などのように定量の特異性が高い場合には、分離を省略することができる。
酸化の進行をモニターする為に添加するマーカー物質、および酸化されまたは酸化されていない被酸化性基質の定量を行う手段は、被酸化性基質がいかなる物質であるかに依存する。分析対象物質がコレステロールエステル、中性脂質およびリン脂質などの脂質またはそれらの酸化生成物である場合は、一般的な酸化脂質の測定法やＴＢＡ反応性物質の測定法を用いることができ、ヘモグロビンなどの蛋白またはそれらの酸化生成物である場合は、一般的な蛋白の測定法または酸化変性蛋白の測定法を用いることができる。また、ＨＰＬＣ法、ＬＣ−ＥＤＣ法、ＴＬＣ法、質量分析法、ＥＬＩＳＡ法、および発色による吸光度変化もしくは蛍光強度変化による定量を用いることができる。しかしながら、あらゆる種類の分析対象物質の測定に用いることができる点、および分析対象物質の同定も可能である点で、ＨＰＬＣ法もしくはＥＬＩＳＡ法が好ましい。特にＵＶ検出器を装備したＨＰＬＣ法が操作性やコスト等の点で好ましい。
本発明の１つの態様において、被酸化性基質が脂質である場合、その酸化生成物には、酸化により分子内にペルオキシ結合（−Ｏ−Ｏ−）を有するに至った脂質過酸化物、オキシ結合（−Ｏ−）を有するに至った脂質酸化物、およびそれらの脱離により形成されるジエン結合を有するに至った脂質があげられる。したがって、被酸化性基質がコレステロールエステルである場合、その酸化生成物には、例えば、コレステロールエステルヒドロペルオキシド、コレステロールエステルヒドロキシド、酸化ステロールエステル、コレステロールエステルアルデヒドなどがあげられ、コレステロールエステルヒドロペルオキシドとコレステロールエステルヒドロキシドとの総量を測定することが好ましい。
被酸化性基質がコレステロールエステルであり、生体内抗酸化成分がα−トコフェロールであり、酸化反応の開始がＡＡＰＨで行われ、そして酸化反応が８時間行われる場合に、抗酸化成分の存在下の状態を維持するには、ＡＡＰＨの濃度を好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭであるようにする。
本発明の別の側面では、上記の方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行うことができる。対象となる疾患および／または病態としては、酸化ストレスが増悪因子になることが知られている疾患、例えば、白内障、糖尿病、アルツハイマー、癌、動脈硬化症、心肺疾患、高コレステロール血症、慢性炎症性疾患、虚血性疾患などが挙げられ、その中でも特に酸化ストレスの関与が深い疾患、例えば、糖尿病などの慢性内分泌疾患、アルツハイマーなどの脳疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺疾患、非アルコール性脂肪肝にともなう肝疾患（ＮＡＳＨ）のような肝疾患、慢性腎不全のような腎疾患、動脈硬化症のような循環器疾患、クローン病、リウマチのような慢性炎症性疾患、および癌、を挙げることができる。また、本評価を健康診断の１つの指標とすることも可能である。
本発明の更なる側面は、抗酸化成分と被酸化性基質とを含有する生体試料中に抗酸化性被検成分を加えて、酸化反応を開始させ、その抗酸化成分が酸化種によって消費し尽くされない状態でその酸化反応を継続させ、そしてこの酸化反応により酸化された被酸化性基質を定量することを含んでなる、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法である。
この方法は、抗酸化性被検成分を、抗酸化成分の存在下で起こる生体試料中の被酸化性基質の酸化反応のメカニズムの下に置くことにより、その環境下での抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価しようとするものである。評価の対象は生体試料ではなく、抗酸化性被検成分の抗酸化能力である。この方法によれば、生体内抗酸化成分が存在する状態でも進行する酸化反応に対する、抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価することができる。生体試料、生体試料中に含まれる被酸化性基質、生体試料中に生来的に含有されても添加されてもよい抗酸化物質、酸化反応を開始および継続させる手段、および被酸化性基質からの酸化生成物の定量などは上記の通りである。しかし、生体試料は検査材料の１つに過ぎないから、その組成や抗酸化能力に変動がないのが好ましい。典型的には、予め標準的な生体試料が調製されるのがよい。評価に際して、生体試料は、抗酸化性被検成分と混合されるほか、抗酸化性被検成分との比較のためにコントロールとして使用されてもよく、また、その抗酸化能力が固定値として使用されてもよい。抗酸化性被検成分には、抗酸化性を有することが期待される合成されたかまたは天然の化合物が含まれる。これらは、今後その抗酸化性が期待される化合物であるから、その構造や由来を予め特定することはできない。しかしながら、合成された化合物には、例えば、４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン（以下、ＢＯ−６５３という）が含まれる。抗酸化性被検成分の、生体試料中に含有される抗酸化成分に対するモル濃度の比率は、０．００１〜１０００：１、好ましくは０．００２〜５００：１、より好ましくは０．０１〜１００：１、更に好ましくは０．１〜１０：１である。
【実施例】
実施例１：血漿試料中のコレステロールエステルの酸化生成物の定量再現性
正常人の血漿試料中のコレステロールエステルを被酸化性基質ととらえてその酸化生成物の定量再現性をみた。
インフォームドコンセントを得た一人の正常人からヘパリン採血を行ってプール血漿を調製した。
このプール血漿を１．１ｍＬづつ９本の試験管に分注して−８０℃で凍結保存した。
凍結された血漿試料を含有する３本の試験管Ａ、ＢおよびＣを３７℃に５分間保温することにより内容物を解凍した。解凍後それら試験管を氷中に維持した。
それぞれの試験管から取り出した３００μＬの血漿に１０μＬのＡＡＰＨ（和光純薬（株）製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＷＦ １１８３）水溶液をＡＡＰＨの濃度が１０ｍＭになるように加えた。次いで、３７℃に保温することで酸化反応を開始させた。
酸化反応開始後３７℃で８時間してからそれぞれの反応液の入った３つの容器を氷中に浸けることにより反応を停止させた。それぞれ１００μＬの反応液に１ｍＬの０．０２％酢酸を含むメタノール溶液と５ｍＬのヘキサンを加えて反応液中の脂質を抽出した。そのヘキサン抽出液４ｍＬをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ社製，ＡＥＳ１０１０）で濃縮し、それぞれの濃縮物を２００μＬのイソプロピルアルコール中に溶解させた。
Ｃ１８逆相カラムを用いる下記条件のＨＰＬＣにより脂質を溶離させた。２３４ｎｍのＵＶ光で検出を行った。
ＨＰＬＣ条件：
カラム： Ｃ１８逆相カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ社製、ＬＣ−１８）
移動相： エタノール：メタノール：イソプロパノール：水＝２９５０：９００：１５０：１５
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度： 室温
検出： ＵＶ検出器（２３４ｎｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＵＶ ｖａｒｉａｂｌｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｇ１３１４Ａ）
外部標準：コレステロールリノリエートヒドロペルオキサイド
このＨＰＬＣ条件では、コレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥＯＯＨ）とコレステロールエステルヒドロキシド（ＣＥＯＨ）の両分子種を含んだコレステロールエステル酸化生成物が約９分の保持時間で溶離され、α−トコフェロールが約５分で溶離された。α−トコフェロールが存在したことで、この試験ではα−トコフェロールが存在している状態で酸化反応が進行しかつ停止されたことが確認できた。この測定における代表的なＨＰＬＣチャートを図１に示す。
同じ測定験操作を残る６本の試験管に含有される血漿試料についても行った。なお、それらのうち３本を用いた測定は上記測定日の翌日（第２日）に行い、残る３本を用いた測定は翌々日（第３日）に行った。結果を表１に示す。
表１において、日内変動幅とは、同日に測定した試料Ａ、ＢおよびＣの日内平均値に対する標準偏差のパーセンテージであり、日間変動幅とは、第１〜３日の日間平均値に対する標準偏差のパーセンテージである。
表１から明らかなように、日内および日間変動幅（ＣＶ％）がいずれも２０％以内である。また、９試料の全体の変動幅は１８．２％である。この程度の変動幅は、コレステロールエステルの酸化生成物が再現性良く測定できることを示している。
実施例２：抗酸化成分が存在する状態のＡＡＰＨ濃度への依存性
血漿試料中でのＡＡＰＨの濃度を０〜４８ｍＭで変動させた以外は実施例１と同様な測定を行うことにより、本発明の測定法において抗酸化成分が存在する状態を維持することのＡＡＰＨ濃度への依存性を検討した。結果を図２に示す。
図２から、ＡＡＰＨ濃度が５ｍＭ以上であればＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの酸化が進行することが分かる。一方、ＡＡＰＨ濃度が２９ｍＭ以上になると、抗酸化成分であるα−トコフェロールが存在しなくなることがＨＰＬＣにより確認された。α−トコフェロールが消失した酸化反応液の代表的なＨＰＬＣチャートを図３に示す。
したがって、α−トコフェロールが存在する状態でコレステロールエステルの酸化反応を進行させるには、ＡＡＰＨを酸化開始剤にした場合には、その濃度を５〜３０ｍＭ程度にする必要があることが明らかとなった。
実施例３：α−トコフェロールの脂質酸化促進作用の確認
実施例１の血漿試料に、ＡＡＰＨの添加５分前に抗酸化物質であるα−トコフェロール、プロブコールまたは４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン（ＢＯ−６５３）を種々の濃度になるように添加した以外は実施例１と同様な測定を行うことにより、試料中に存在する抗酸化物質の種類によってＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量がどのように変化するかを調べた。なお、ＢＯ−６５３は、ＷＯ９４／０８９３０号公報、米国特許第５，５７４，１７８号公報、ヨーロッパ特許出願公開第０６６５２０８号公報記載の方法により製造することができる。
プロブコール（ＳＩＧＭＡ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．６１Ｋ１１２１）およびＢＯ−６５３（中外製薬株式会社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．００９００２）のリノール酸ペルオキシラジカルとの反応速度は、α−トコフェロール（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ａ０１５８２１３０１）についての速度を１とした場合、それぞれ１／１７．５および１／２と報告されている（Ｇｏｔｏｈ Ｎ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ，Ｋｏｍｕｒｏ Ｅ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｊ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｎｉｋｉ Ｅ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｂｕｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９２ １１２８：１４７−５４；Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｉｗａｋｉ Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｋｏｍｕｒｏ Ｅ，Ｋａｔｏ Ｙ，Ｔａｍｕｒａ Ｋ，Ｃｙｎｓｈｉ Ｏ，Ｋｏｄａｍａ Ｔ，Ｎｉｋｉ Ｅ．２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，２−ｄｉｐｅｎｔｙｌ−４，６−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９７ ３４２：２３６−４３）。リノール酸ペルオキシラジカルとの反応速度を調べる方法は従来の抗酸化能力の評価方法なので、α−トコフェロール、プロブコールおよびＢＯ−６５３はいずれも従来の評価方法では抗酸化能力を有するとされた物質である。
結果を図４に示す。なお、図４に示された抗酸化物質の濃度は血漿試料中に外部から加えたものの濃度だけを表示してある。現実には、全ての血漿試料に生来的なα−トコフェロールが存在する。したがって、α−トコフェロールを外部から加えた試料のα−トコフェロール濃度は表示された値より大きい。
図４から、α−トコフェロールでは、その濃度の上昇とともにＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量が有意に上昇するが、ＢＯ−６５３では、その濃度の上昇とともにＣＥＯＯＨとＣＥＯＨの生成量が有意に低下している。これは、α−トコフェロールは、従来の抗酸化能力の評価方法でＢＯ−６５３よりも大きな抗酸化能力があるとされているのに、コレステロールエステルのような脂質の酸化については、むしろそれを促進することを示している。
この結果は、生体試料中のα−トコフェロールに代表される生体内抗酸化成分の総量を抗酸化能力として評価してきた従来の方法では、酸化ストレスによって増悪する病変の真のリスク評価ができていなかったことを示すとともに、生体内抗酸化成分の存在下でも起こる酸化を捉えられる本発明の測定方法が、そのようなリスク評価を的確に行えることを示している。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、α−トコフェロールなどの抗酸化成分が存在する状態で起こる酸化反応に対する生体の抗酸化能力を評価することができる。特に、酸化ストレスによって増悪する病態においては、抗酸化成分であるα−トコフェロールが存在する状態で起こる酸化反応が重要であると考えられることから、本発明は臨床検査法として有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記被酸化性基質の酸化反応を開始させる段階；
（ｃ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｄ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｂ）および（ｃ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法。
【請求項２】
前記生体試料が、血液、血漿または血清である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１種の抗酸化成分がα−トコフェロールである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記酸化反応の開始が酸化開始剤によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記酸化反応の開始時における前記酸化開始剤の濃度によって前記抗酸化成分が前記酸化反応の間存在し続けることができるように調節される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記酸化開始剤が２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリドである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記酸化開始剤が２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリドであり、前記濃度が５〜３０ｍＭである、請求項５載の方法。
【請求項８】
前記被酸化性基質が脂質であり、前記脂質からの酸化生成物が脂質酸化物と脂質過酸化物とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記脂質がコレステロールエステルであり、前記脂質酸化物がコレステロールエステルヒドロキシドであり、そして前記脂質過酸化物がコレステロールエステルヒドロペルオキシドである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記被酸化性基質からの酸化生成物の定量が前記酸化反応の停止後の測定により行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記被酸化性基質からの酸化生成物の定量が、その定量を可能にする分析対象物質のＨＰＬＣによる溶離を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記分析対象物質がＵＶ光により検出される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、前記段階（ｂ）および（ｃ）を抗酸化成分の存在下で行うのに十分な量の抗酸化成分を含んでいない場合に、前記段階（ｂ）を行う前に、前記生体試料に抗酸化物質を添加する段階を更に含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料に添加される前記抗酸化物質が、前記生体試料に生来的に含有される抗酸化成分のうちの１種である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行う方法。
【請求項１６】
前記疾患が、慢性内分泌疾患、脳疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患、循環器疾患、慢性炎症性疾患または癌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記生体試料に前記抗酸化性被検成分を添加する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の混合物の酸化反応を開始させる段階；
（ｄ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｅ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｃ）および（ｄ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、前記段階（ｃ）および（ｄ）を抗酸化成分の存在下で行うのに十分な量の抗酸化成分を含んでいない場合に、前記段階（ｃ）を行う前に、抗酸化物質を添加する段階を更に含んでなる、請求項１７記載の方法。
【請求項１】
生体試料の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記被酸化性基質の酸化反応を開始させる段階；
（ｃ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｄ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｂ）および（ｃ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法。
【請求項２】
前記生体試料が、血液、血漿または血清である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１種の抗酸化成分がα−トコフェロールである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記酸化反応の開始が酸化開始剤によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記酸化反応の開始時における前記酸化開始剤の濃度によって前記抗酸化成分が前記酸化反応の間存在し続けることができるように調節される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記酸化開始剤が２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリドである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記酸化開始剤が２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリドであり、前記濃度が５〜３０ｍＭである、請求項５載の方法。
【請求項８】
前記被酸化性基質が脂質であり、前記脂質からの酸化生成物が脂質酸化物と脂質過酸化物とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記脂質がコレステロールエステルであり、前記脂質酸化物がコレステロールエステルヒドロキシドであり、そして前記脂質過酸化物がコレステロールエステルヒドロペルオキシドである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記被酸化性基質からの酸化生成物の定量が前記酸化反応の停止後の測定により行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記被酸化性基質からの酸化生成物の定量が、その定量を可能にする分析対象物質のＨＰＬＣによる溶離を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記分析対象物質がＵＶ光により検出される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、前記段階（ｂ）および（ｃ）を抗酸化成分の存在下で行うのに十分な量の抗酸化成分を含んでいない場合に、前記段階（ｂ）を行う前に、前記生体試料に抗酸化物質を添加する段階を更に含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料に添加される前記抗酸化物質が、前記生体試料に生来的に含有される抗酸化成分のうちの１種である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法により評価された生体試料の抗酸化能力に基づいて、対象患者の疾患の診断または病態の予後評価および／または進展予測を行う方法。
【請求項１６】
前記疾患が、慢性内分泌疾患、脳疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患、循環器疾患、慢性炎症性疾患または癌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗酸化性被検成分の抗酸化能力を評価する方法であって：
（ａ）少なくとも被酸化性基質を含有する試料を生体から取り出す段階；
（ｂ）前記生体試料に前記抗酸化性被検成分を添加する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の混合物の酸化反応を開始させる段階；
（ｄ）前記酸化反応を継続する段階；および
（ｅ）前記酸化反応の進行中にその速度を測定することにより、または前記酸化反応を停止させた後の測定により、前記被酸化性基質からの酸化生成物を定量する段階
を含んでなり、前記段階（ｃ）および（ｄ）が１種またはそれを越える抗酸化成分の存在下で行われる方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、前記段階（ｃ）および（ｄ）を抗酸化成分の存在下で行うのに十分な量の抗酸化成分を含んでいない場合に、前記段階（ｃ）を行う前に、抗酸化物質を添加する段階を更に含んでなる、請求項１７記載の方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３８６９
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３７７５（Ｐ２００５−５０３７７５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８７３
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（５０２１８９１５５）ザ・ハート・リサーチ・インスティチュート・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８７３
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（５０２１８９１５５）ザ・ハート・リサーチ・インスティチュート・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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