生分解性樹脂の分解方法
【課題】大量生産が可能で、安価なポリ乳酸分解酵素を提供する。また、30℃未満の温度であっても、ポリ乳酸分解活性を示す分解酵素を提供する。
【解決手段】Streptomyces coelicolor A32を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法を提供する。 以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質を提供する：（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び（３）Streptomyces coelicolor A32由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。 また、本発明は、前記前駆物質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主を提供する。
【解決手段】Streptomyces coelicolor A32を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法を提供する。 以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質を提供する：（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び（３）Streptomyces coelicolor A32由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。 また、本発明は、前記前駆物質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性樹脂の分解方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、包装容器の廃棄が問題となっている。汎用樹脂と同様な焼却処理は、二酸化炭素を環境へ直接排出するため、良い方法とは言えない。埋め立て等の環境中の微生物に分解させる方法は、環境への付加が低減されると期待できるが、分解に時間が掛かるだけでなく用地の確保も難しい。また、環境中から単離してきた生分解性樹脂分解微生物を用いても酵素量が少ない等の問題から迅速に分解できない。
一方、ポリ乳酸は水溶液中で加水分解する高分子であり、医療及び医薬用材料として応用されている。ポリ乳酸は、澱粉等の再生可能な資源から乳酸醗酵を通して合成できることから、環境分解が困難である汎用樹脂に代わる生分解性樹脂の素材として注目されている。ポリ乳酸としては、その構成モノマーの種類によって、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸又は他のモノマーとの共重合体などが挙げられる。また、ポリ乳酸は、酵素によって加水分解が促進されていることが知られている。このような酵素としては、放線菌Amycolatopsis sp. K104-1の分解酵素が知られている（非特許文献１）。しかしながら、前記の酵素は30℃未満では、ポリ乳酸分解活性を示さない。また、生分解性樹脂分解酵素を大量に精製・抽出し、分解に用いる方法では、コストが高く実現は難しい。このことから、生分解性酵素を大量に取得する方法や生分解性樹脂分解酵素の大量取得方法を応用した環境に優しいシステム開発等が求められている。
【０００３】
【非特許文献１】J Bacteriol. 2005 Nov;187(21):7333-40.、Appl Environ Microbiol. 2001 Jan;67(1):345-53.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、大量生産が可能で、安価なポリ乳酸分解酵素を提供することである。また、本発明の目的は、30℃未満の温度であっても、ポリ乳酸分解活性を示す分解酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法を提供する。
また、本発明は、以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質を提供する：
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
また、本発明は、前記前駆物質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主を提供する。
また、本発明は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤を提供する。
また、本発明は、前記可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む生分解性樹脂の可溶化方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の生分解性樹脂の分解方法は、Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む。
生分解性樹脂は、生分解性を有する樹脂であればよく、化学合成系樹脂、微生物系樹脂、天然物利用系樹脂などであってもよく、例えば脂肪族ポリエステル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、セルロース類などが挙げられる。脂肪族ポリエステルとしては、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）樹脂及びその誘導体、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）樹脂及びその誘導体、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）及びその誘導体、ポリエチレンアジペート（ＰＥＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリテトラメチレンアジペート、ジオールとジカルボン酸の縮合物などが挙げられる。セルロース類としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、アセチルセルロースなどが挙げられる。また、上記生分解性樹脂の修飾体や上記生分解性樹脂同士及び汎用化学樹脂との混合体であっても良い。好ましくは、ポリ乳酸樹脂である。
ポリ乳酸樹脂は、ポリマーの主要な構成単位として乳酸を有する樹脂である。例えば、ポリＬ−乳酸やポリＤ−乳酸などの乳酸ホモポリマー、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とアラニン、グリコリド、グリシン、グリコール酸、グルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ε−カプロラクトン、ポリビニルアルコール、糖類、多価アルコールの少なくとも１種との乳酸コポリマー、ポリＤ，Ｌ−乳酸などが挙げられる。好ましくは、乳酸ホモポリマー、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とアラニン若しくはグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリＤ，Ｌ−乳酸であり、さらに好ましくはＬ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリＬ−乳酸である。ポリ乳酸の数平均分子量は特に制限されないが、好ましくは５０００〜１×１０6、さらに好ましくは５００００〜４×１０5である。ポリ乳酸中の乳酸単位の重量比率は特に制限されないが、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは３０％以上である。
【０００７】
Streptomyces coelicolor A3(2)を培養する培地としては、従来から用いられている培地などを使用することができる。例えば、ＰＹＭ培地、ＣＦＭＭ培地などである。
培養温度は、ポリ乳酸分解酵素が産生される限り特に制限されないが、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。
培地のｐＨは、好ましくは５．０〜９．０であり、より好ましくは６．０〜８．０である。
培養時間は、特に制限されず、使用する菌量、培地などに応じて適宜選択される。例えばＣＦＭＭ培地では、５０〜１００時間、好ましくは６０〜７０時間である。
また、培養時には、必ずしも必要ではないが、撹拌することが好ましい。他の培養条件については、本発明の目的を考慮して適宜選択される。
【０００８】
次いで、得られた培養物に生分解性樹脂を接触、好ましくは浸漬する。このときの温度は、好ましくは１０〜６０℃であり、より好ましくは２０〜５０℃である。また、上述のようにして得られた培養物から酵素を採取して、この酵素を含む処理剤を生分解性樹脂と接触させてもよい。酵素を採取する方法としては、例えば常法により培養液を濾過等によって菌体を除去し、必要により透析、塩析、イオン交換樹脂によるイオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製する方法などが挙げられる。
【０００９】
また、本発明の生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質は、以下のアミノ酸配列からなる。
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
シャペロン領域は発現されるタンパク質の構造を正常な構造にするために必要な配列である。シャペロン領域を構成するアミノ酸配列としては、例えばＤ−−ＰＱＰ（−は任意のアミノ酸）が挙げられ、好ましくはＤＧＧＰＱＰ（配列番号４）である。
シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸としては、Ser、Gly、Thr、Ala、Valなどが挙げられ、好ましくはSerである。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、すでに蛋白質加水分解能を有するタンパク質として公知である（National Center for Biotechnology Information 、登録番号CAC36053）。しかしながら、これをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させても、産生されるタンパク質は可溶化せず、生分解性樹脂の分解活性を示さない。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列にシャペロン領域を付加した配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させても、産生されるタンパク質は可溶化するが、生分解性樹脂の分解活性を示さない。一方、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列にシャペロン領域及びシャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸を付加した配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させると、産生されるタンパク質は可溶化し、生分解性樹脂の分解活性を示すものとなることが本発明者らによる研究により始めて見いだされた。可溶化のメカニズムにおいては、ＤＧＧＰＱＰ（配列番号４）の６残基がシャペロンとして機能しており、可溶化を促進する。活性化のメカニズムにおいては、前駆物質の最初のＤのＮ末端側が切り離された状態になると、自己反応によりＤＧＧＰＱＰＳのＳのＣ末端側を切断する。
なお、本発明において、生分解性樹脂分解タンパク質は、生分解性樹脂分解活性を有する限り、当業者に公知の方法で、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させてもよい。
前記前駆物質をコードする遺伝子としては、例えば配列番号５が挙げられる。
【００１０】
本発明において、前記タンパク質は、ポリ乳酸分解活性を有するものであればよく、天然のタンパク質でも組み換えタンパク質でも、あるいは化学合成タンパク質でもよく、その起源は特に限定されない。天然のタンパク質を得る方法としては、目的タンパク質を発現する微生物を出発原料として、それを培養し、次いで必要に応じて培養して得られた微生物体から目的タンパク質を溶出させて、得られた培養物を塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク質の単離、精製のための公知の方法に供して、ポリ乳酸分解活性を指標として目的タンパク質を単離、精製する方法を例示することができる。ここで、例えばアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タンパク質を精製することができる。
また、組み換えタンパク質を得る方法としては、上記のように目的タンパク質をコードする本発明の遺伝子を好適な発現ベクター中にクローニングして得られた組み換え発現ベクターを宿主（大腸菌、酵母など）に形質転換し、形質転換体を好適な条件下で培養することにより目的とするタンパク質を産生させることができる。目的タンパク質の単離のためには、目的タンパク質を培養上清中に分泌させることが一般には好ましく、これは、組み換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件などを適宜選択することによって行うことができる。また、本発明によって開示されたポリ乳酸分解活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に従って、所望のアミノ酸配列を有する該タンパク質を化学合成的に製造することも当業者ならば適宜行うことができる。
【００１１】
本発明によれば、ポリ乳酸分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターが提供される。ここで、上記遺伝子を組み込むベクターの種類は特に限定されず、その後の操作の目的に応じて適当なベクターを選択できる。一般的には、プラスミドベクター、ファージベクターなどが使用でき、これらは多くの業者から市販されている。また、本発明の遺伝子がコードする組み換えタンパク質（ポリ乳酸分解活性を有するタンパク質）を産生させる場合には、発現ベクターが好適に使用される。
かかる発現ベクターは、例えば、（1）本発明のポリ乳酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを切り出し、（2）該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０等）、放線菌Streptomyces lividans由来のプラスミド（ｐＩＪ７０２等）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９等）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００１２】
また本発明によれば、上記組み換えベクターを宿主に形質転換することによって作製される形質転換体が提供される。宿主としては任意の好適な生物体を選択でき、微生物、真核微生物（動物細胞、植物細胞、酵母など）、原核微生物（大腸菌など）等が使用可能である。例えば、大腸菌（Escherichia coli等）、バチルス属菌（Bacillus subtilis、Brevibacillus brevis等）、放線菌（Streptomyces lividans等）、酵母（Saccaromyces cerevisiae等）、昆虫または昆虫細胞、動物細胞（マウス細胞、ハムスター細胞、サル細胞、ヒト細胞等）などが用いられる。好ましくは、Brevibacillus brevisである。形質転換の方法は当業者に公知の方法を使用することができ、具体的には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション法などを適宜使用できる。
かくして得られる形質転換体を好適な条件下で培養することにより、本発明のポリ乳酸分解活性を有するタンパク質を産生することができる。培養は、形質転換体（宿主）に応じて慣用の方法を使用することができる。培養に使用する培地の種類や組成についても形質転換体（宿主）に応じて慣用の方法を使用することができる。目的タンパク質の単離のためには、ポリ乳酸分解活性タンパク質を培養上清中に分泌させることが好ましく、これを目して組み換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件などを適宜選択することができる。
次いで得られた培養物からポリ乳酸分解活性を有するタンパク質を回収し、単離し、必要に応じて精製する工程に供せられる。タンパク質は、目的タンパク質が培養物に分泌される場合は培養液（遠心分離処理後の上清）から、また菌体に蓄積される場合は培養物（菌体）を粉砕または溶解した後に得られる培養液（遠心分離処理後の上清）から回収することができる。得られた培養液は塩析、アフィニティ−クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク質の単離、精製のための公知の方法に供され、これによってポリ乳酸分解活性を指標として目的タンパク質を単離、精製することができる。なお、ここで例えばアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タンパク質を精製することができる。
【００１３】
本発明の生分解性樹脂の可溶化方法は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む。前記可溶化剤は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質が溶媒中に溶解又は懸濁しているものであってもよい。適した溶媒としては、生分解性樹脂の可溶化に必要な水を含んでいるものであれば特に限定されないが、具体的にはＰＹＭ培地、ＣＦＭＭ培地等の培地やBugBuster Protein Extraction Reagent等の酵素活性が保たれる溶液などが挙げられる。水溶液であることが好ましい。また、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質は細粒体に担持させたものであってもよい。細粒体としては、接触させる生分解性樹脂との接触面積がある程度大きくなるものであれば特に限定されないが、粒状、粉末状などの形状において、土やコンポストに用いられる堆肥などを用いることができる。例えば、本発明の遺伝子のＣ末端側に他物質への吸着配列（His-tag）や結合配列等を融合させて発現し、各々と結合する物質および結合を触媒する物質等により固定化する方法が挙げられる。具体的には、本発明の酵素または固定化材にアミノ酸のGlnまたはLysのどちらかを付加もしくは融合発現させ、GlnとLysの結合を触媒するトランスグルミナーゼを用いることにより得られる（Biotechnol. Bioeng. 2004 May 20;86(4):399-404）。または、微生物等の細胞膜上に発現させる方法（Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Mar;64(1):28-40. Epub 2004 Jan 10.）や微生物等を用いて無機物質に吸着させる方法（Biotechnol Bioeng. 2000 Dec 20;70(6):704-9.）等により得られる担持体でもよい。
【００１４】
前記可溶化剤は、本発明の宿主を含むものであってもよく、この場合、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質は宿主から継続して産生される。また、前記可溶化剤には、本発明の宿主から産生された前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を分離して添加してもよい。この場合、生分解性樹脂を接触させる前の除菌処理や、可溶化後に組み換え体の拡散防止などの目的で行う殺菌処理などを省略することができる。これらの方法は、宿主の性質や生分解性樹脂などを考慮して適宜選択すればよい。
生分解性樹脂を接触させる方法としては、例えば生分解性樹脂を本発明の可溶化剤に浸漬する方法、水との接触を避ける処理をして樹脂に混入する方法、上記の坦持体等を混在させる方法などが挙げられる。
生分解性樹脂は、そのままの形状で本発明の可溶化剤と接触させてもよいが、分解時間を短くすることなどを目的として予め細分化してもよい。例えば、機械的な粉砕や切断又は加熱などで流体としてから細分化してもよい。
なお、本発明の生分解性樹脂の可溶化方法は、生分解性樹脂の可溶化を阻害しない内容物、例えば食品などを含む状態で生分解性樹脂を可溶化することが可能である。また、生分解性樹脂分解酵素を発現する微生物の培養温度と生分解性樹脂の可溶化温度が異なる場合は、別工程にしても良い（図６）。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、薬品名後に会社名を記していないものは、和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水であり、培地は培養前に１２１℃、２０分加圧・加熱処理を行っている。
（ＣＦＭＭ培地）
（ＰＹＭ培地）
（２×ＹＴ培地）
（ＴＥバッファー）
4mmol/l Tris-HCl（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）塩酸
1mmol/l エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム２水和物（EDTA）
pH8.0に調整
（ＣＴＡＢ溶液）
10％/l 臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）
1mol/l 塩化ナトリウム
６０℃で溶解
（ＴＡＥ電気泳動用ゲル）
1.5％アガロース
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 酢酸
（２×ＹＴ＋Ｇ培地）
（Ｍ９培地）
【００１６】
（実施例１）
（１．Streptomyces coelicolor A3(2)である ATCC BAA-471 の培養方法）
ＰＹＭ培地を用い、２８℃、２４時間培養した。
（２．Streptomyces coelicolor ATCC BAA-471 のゲノム抽出方法）
菌体を６０００×ｇ、５分で遠心分離し、得られた菌体をＴＥバッファーに懸濁し、１／５量の５ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液を添加、攪拌し、その後１／１０量のＣＴＡＢ溶液を添加、攪拌後、６０℃、３０分インキュベーションした。クロロホルムを上記混合液の等量添加、攪拌し、１５，０００×ｇで５分遠心分離を行い、水溶液層を取り除いた。この操作を２回繰り返した。その後、２−プロパノールを等量添加し、沈殿物を回収後、１００％、８０％エタノールで各１回ずつ洗浄、室温で乾燥後、ＴＥバッファーに溶解し、ゲノム溶液を得た。
【００１７】
（３．遺伝子の調製方法）
下記に示す酵素製品、Kit製品は、特別に記さない限り取扱説明書に従った。また、ベクター、宿主においても各々選別に必要な抗生物質は添加している。
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）には、DNA Polymerase Z-taq（タカラバイオ社）を使用し、プライマー（下記に記載）は、Invitrogen社製を用いた。鋳型として、上記で調製したStreptomyces coelicolor ATCC BAA-471のゲノム溶液を用いた。
下記に示した温度でPCR反応を行った。また、反応に用いたアニール温度は、プラスミド（Ｉ）、（II）及び（III）について、それぞれ６２℃（Forward：Reverse）、６５℃（H-F：Reverse）、６８℃（SH-F：Reverse）。
９８℃、２分間 −(i)
９８℃、５秒間 −(ii)
各アニール温度、５秒間 −(iii) (ii)〜(iv)を３０サイクル
７２℃、１０秒間 −(iv)
７２℃、２分間 −(v)
４℃、∞ −(vi)
【００１８】
【表１】
【００１９】
反応終了後、ＴＡＥ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕であるMupid-ex（アドバンス社）を用いて電気泳動（１００Ｖ、５０分）を行った。
その後、核酸染色試薬SYBR GreenI（タカラバイオ社）で染色、ゲルからの目的ＤＮＡ断片の抽出をＤＮＡ抽出キットNucleoSpin Extract Kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて回収した。
上記のＤＮＡ断片をクローニングベクターpT7 Blue2 T-vector（Novagen社）とＤＮＡ結合酵素Ligation Convenience Kit（ニッポンジーン社）を用いて結合させ、宿主Escherichia coli DH5α（タカラバイオ社）へ形質転換し（図１）、２×ＹＴ培地を用い、３７℃で培養した。プラスミドの回収は、NucleoSpin plasmid Kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて行った。
ＤＮＡ配列は、同一性が１００％であることを確認後（タカラバイオ社に委託）、発現用ベクターpET26b(+)（Novagen社）とＤＮＡ配列を確認したプラスミドを制限酵素NcoI/XhoI（両制限酵素ともタカラバイオ社）で処理（37℃、2時間）し、電気泳動後、Nucleospin plasmid Kitを用いてＤＮＡ断片を回収した。両者をLigation Convenience Kit処理後、Escherichia coli DH5α（タカラバイオ社）へ形質転換し、２×ＹＴ培地を用い、３７℃で培養した。
得られたプラスミドを発現用宿主Rosetta2（Novagen社）へ形質転換させた。
【００２０】
発現の有無については、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）で確認した。各プラスミド（（Ｉ）、（II）、（III）、pET26b(+)）をRosetta2に形質転換し、抗生物質を含む2×YT+G培地プレートで37℃、16〜24時間生育させた。その後、液体の2×YT+G培地で37℃、12〜16時間で生育させた。その後、液体のM9培地に菌体の培地を0.1%植菌し、600nmの吸光度（O.D.(600)）= 0.6〜0.8まで37℃で生育させ、イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトシド(IPTG)（終濃度1mM）を添加し、20℃、24時間振とうした。その後、遠心分離（15,000×g、1分）により各大腸菌を回収、培地上精を取り除いた後、細胞破砕液BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen社）で溶菌させ、遠心分離（15,000×g、15分）によって上精を得た。この上精10μlとLaemmli Sample Buffer（BIO-RAD社）−メルカプトエタノール（95：5）混合液20μlを混合し、98℃、4分間インキュベーションした。その後、室温になるまで放置した。プラスミド（Ｉ）については、不溶性画分において発現したタンパク質が含まれることを確認したが、可溶性画分にはタンパク質は含まれなかった。プラスミド（II）及び（III）については、可溶性画分において発現したタンパク質が含まれていることが確認できた。
電気泳動用のゲルにはCriterionレディーゲルJ（BIO-RAD社）、電気泳動層にはCriterionセル（BIO-RAD社）、電気泳動試薬には１０×Tris/Glycine/SDS Buffer（BIO-RAD社）、電源にはパワーサプライBasic（BIO-RAD社）を用いて、各サンプルについて電気泳動（40mA、120分）を行った。その後、染色液SimplyBlue SafeStain（Invitrogen社）で染色した。
活性の評価方法においては、以下のような重層培地を作成し、蛋白質分解活性として評価した。
上層：2%スキムミルク、1.5%アガロース、0.1ｍmol/l IPTGを懸濁させた2×YT培地5ml
下層：1.5%アガロース、0.1ｍmol/l IPTGを含んだ2×YT培地15ml
この重層培地に以下の組み換え大腸菌を20℃で生育させた。pET26b(+)、（II）、（III）の遺伝子をRosetta2へ形質転換し、組み換え大腸菌を得た。結果は、図３に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
（４．低分子量ポリ乳酸（ＰＬＡ）溶液の調整法）
撹拌装置、窒素導入管、Dean-Stark型水分離器を備えた３００ｍｌのセパラブルフラスコにＤＬ−乳酸２００ｇ、１８０℃反応させ、生成する水を除きながら窒素雰囲気中で約４時間反応後、２００℃に昇温して３時間反応させることにより得た。
得られたポリ乳酸を０．５ｍｏｌ／ｌのビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンに溶解させ、溶解後ｐＨを７．２に調整した。
【００２３】
（５．ポリ乳酸分解活性検出）
各プラスミド（（Ｉ）、（II）、（III）（図２））をRosetta2に形質転換し、２×ＹＴ＋Ｇ培地プレートで３７℃、１６〜２４時間生育させた。
その後、液体の２×ＹＴ＋Ｇ培地で３７℃、１２〜１６時間で生育させた。
その後、液体のＭ９培地に菌体の培地を０．１％植菌し、Ｏ．Ｄ．(600)＝０．６〜０．８まで３７℃で生育させ、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）、ポリ乳酸溶液（終濃度０．１％）を添加し、２０℃、２４時間振とうした。
上精を回収後、リン酸（終濃度１％）を添加し、試料液を調整した。高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography；HPLC：日本分光ガリバー社）により検出した。
【００２４】
試料液２ｍｌを０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し試料液とした。カラムにWARTERS Atlantis ４．６×２５０ｍｍを用い、試料液５０μｌを注入してＵＶ２１０ｎｍで検出した。溶離液はカラム温度４０℃で表３に示す濃度勾配をつけ分離を行った。乳酸を用いて標準曲線を作成した。図４および５において、その結果を示す。横軸は乳酸の重合数を示し、縦軸はポリ乳酸の濃度である。左棒グラフは、IPTGで誘導していないRosetta2であり、ポリ乳酸との反応時間は０時間である。中央の棒グラフは、IPTGで誘導していないRosetta2であり、ポリ乳酸と２４時間反応させた。右棒グラフは、IPTGで本発明の遺伝子の発現を誘導させたRosetta2であり、ポリ乳酸と２４時間反応させた。その結果、３量体以下は増加し、４量体以上は減少した。このことは、より高分子量のポリ乳酸が低分子量へと変化したことを示し、ポリ乳酸の分解活性を検出したと言える。図４と５は、本質的に同じ図であり、図４は、縦軸の濃度が０〜８００mg/l、横軸が乳酸１量体〜１２量体であり、図５は、縦軸の濃度が０〜５０mg/l、横軸が乳酸９量体〜１２量体である。また、Rosetta2の生成物質により乳酸６量体と８量体は検出できなかった。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１で使用したプラスミドの模式図を示す。
【図２】目的酵素の詳細とプラスミドの名称を示す。
【図３】図２のプラスミドにおけるプロテイナーゼ活性検出
【図４】大腸菌発現時におけるポリ乳酸の分解挙動（１〜１２量体）
【図５】大腸菌発現時におけるポリ乳酸の分解挙動（９〜１２量体）
【図６】分解・可溶化システムの概要
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性樹脂の分解方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、包装容器の廃棄が問題となっている。汎用樹脂と同様な焼却処理は、二酸化炭素を環境へ直接排出するため、良い方法とは言えない。埋め立て等の環境中の微生物に分解させる方法は、環境への付加が低減されると期待できるが、分解に時間が掛かるだけでなく用地の確保も難しい。また、環境中から単離してきた生分解性樹脂分解微生物を用いても酵素量が少ない等の問題から迅速に分解できない。
一方、ポリ乳酸は水溶液中で加水分解する高分子であり、医療及び医薬用材料として応用されている。ポリ乳酸は、澱粉等の再生可能な資源から乳酸醗酵を通して合成できることから、環境分解が困難である汎用樹脂に代わる生分解性樹脂の素材として注目されている。ポリ乳酸としては、その構成モノマーの種類によって、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸又は他のモノマーとの共重合体などが挙げられる。また、ポリ乳酸は、酵素によって加水分解が促進されていることが知られている。このような酵素としては、放線菌Amycolatopsis sp. K104-1の分解酵素が知られている（非特許文献１）。しかしながら、前記の酵素は30℃未満では、ポリ乳酸分解活性を示さない。また、生分解性樹脂分解酵素を大量に精製・抽出し、分解に用いる方法では、コストが高く実現は難しい。このことから、生分解性酵素を大量に取得する方法や生分解性樹脂分解酵素の大量取得方法を応用した環境に優しいシステム開発等が求められている。
【０００３】
【非特許文献１】J Bacteriol. 2005 Nov;187(21):7333-40.、Appl Environ Microbiol. 2001 Jan;67(1):345-53.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、大量生産が可能で、安価なポリ乳酸分解酵素を提供することである。また、本発明の目的は、30℃未満の温度であっても、ポリ乳酸分解活性を示す分解酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法を提供する。
また、本発明は、以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質を提供する：
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
また、本発明は、前記前駆物質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主を提供する。
また、本発明は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤を提供する。
また、本発明は、前記可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む生分解性樹脂の可溶化方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の生分解性樹脂の分解方法は、Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む。
生分解性樹脂は、生分解性を有する樹脂であればよく、化学合成系樹脂、微生物系樹脂、天然物利用系樹脂などであってもよく、例えば脂肪族ポリエステル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、セルロース類などが挙げられる。脂肪族ポリエステルとしては、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）樹脂及びその誘導体、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）樹脂及びその誘導体、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）及びその誘導体、ポリエチレンアジペート（ＰＥＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリテトラメチレンアジペート、ジオールとジカルボン酸の縮合物などが挙げられる。セルロース類としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、アセチルセルロースなどが挙げられる。また、上記生分解性樹脂の修飾体や上記生分解性樹脂同士及び汎用化学樹脂との混合体であっても良い。好ましくは、ポリ乳酸樹脂である。
ポリ乳酸樹脂は、ポリマーの主要な構成単位として乳酸を有する樹脂である。例えば、ポリＬ−乳酸やポリＤ−乳酸などの乳酸ホモポリマー、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とアラニン、グリコリド、グリシン、グリコール酸、グルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ε−カプロラクトン、ポリビニルアルコール、糖類、多価アルコールの少なくとも１種との乳酸コポリマー、ポリＤ，Ｌ−乳酸などが挙げられる。好ましくは、乳酸ホモポリマー、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とアラニン若しくはグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリＤ，Ｌ−乳酸であり、さらに好ましくはＬ−乳酸及びＤ−乳酸の少なくとも１種とグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリＬ−乳酸である。ポリ乳酸の数平均分子量は特に制限されないが、好ましくは５０００〜１×１０6、さらに好ましくは５００００〜４×１０5である。ポリ乳酸中の乳酸単位の重量比率は特に制限されないが、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは３０％以上である。
【０００７】
Streptomyces coelicolor A3(2)を培養する培地としては、従来から用いられている培地などを使用することができる。例えば、ＰＹＭ培地、ＣＦＭＭ培地などである。
培養温度は、ポリ乳酸分解酵素が産生される限り特に制限されないが、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。
培地のｐＨは、好ましくは５．０〜９．０であり、より好ましくは６．０〜８．０である。
培養時間は、特に制限されず、使用する菌量、培地などに応じて適宜選択される。例えばＣＦＭＭ培地では、５０〜１００時間、好ましくは６０〜７０時間である。
また、培養時には、必ずしも必要ではないが、撹拌することが好ましい。他の培養条件については、本発明の目的を考慮して適宜選択される。
【０００８】
次いで、得られた培養物に生分解性樹脂を接触、好ましくは浸漬する。このときの温度は、好ましくは１０〜６０℃であり、より好ましくは２０〜５０℃である。また、上述のようにして得られた培養物から酵素を採取して、この酵素を含む処理剤を生分解性樹脂と接触させてもよい。酵素を採取する方法としては、例えば常法により培養液を濾過等によって菌体を除去し、必要により透析、塩析、イオン交換樹脂によるイオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製する方法などが挙げられる。
【０００９】
また、本発明の生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質は、以下のアミノ酸配列からなる。
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
シャペロン領域は発現されるタンパク質の構造を正常な構造にするために必要な配列である。シャペロン領域を構成するアミノ酸配列としては、例えばＤ−−ＰＱＰ（−は任意のアミノ酸）が挙げられ、好ましくはＤＧＧＰＱＰ（配列番号４）である。
シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸としては、Ser、Gly、Thr、Ala、Valなどが挙げられ、好ましくはSerである。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、すでに蛋白質加水分解能を有するタンパク質として公知である（National Center for Biotechnology Information 、登録番号CAC36053）。しかしながら、これをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させても、産生されるタンパク質は可溶化せず、生分解性樹脂の分解活性を示さない。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列にシャペロン領域を付加した配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させても、産生されるタンパク質は可溶化するが、生分解性樹脂の分解活性を示さない。一方、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列にシャペロン領域及びシャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸を付加した配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌などに導入して前記タンパク質を発現させると、産生されるタンパク質は可溶化し、生分解性樹脂の分解活性を示すものとなることが本発明者らによる研究により始めて見いだされた。可溶化のメカニズムにおいては、ＤＧＧＰＱＰ（配列番号４）の６残基がシャペロンとして機能しており、可溶化を促進する。活性化のメカニズムにおいては、前駆物質の最初のＤのＮ末端側が切り離された状態になると、自己反応によりＤＧＧＰＱＰＳのＳのＣ末端側を切断する。
なお、本発明において、生分解性樹脂分解タンパク質は、生分解性樹脂分解活性を有する限り、当業者に公知の方法で、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させてもよい。
前記前駆物質をコードする遺伝子としては、例えば配列番号５が挙げられる。
【００１０】
本発明において、前記タンパク質は、ポリ乳酸分解活性を有するものであればよく、天然のタンパク質でも組み換えタンパク質でも、あるいは化学合成タンパク質でもよく、その起源は特に限定されない。天然のタンパク質を得る方法としては、目的タンパク質を発現する微生物を出発原料として、それを培養し、次いで必要に応じて培養して得られた微生物体から目的タンパク質を溶出させて、得られた培養物を塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク質の単離、精製のための公知の方法に供して、ポリ乳酸分解活性を指標として目的タンパク質を単離、精製する方法を例示することができる。ここで、例えばアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タンパク質を精製することができる。
また、組み換えタンパク質を得る方法としては、上記のように目的タンパク質をコードする本発明の遺伝子を好適な発現ベクター中にクローニングして得られた組み換え発現ベクターを宿主（大腸菌、酵母など）に形質転換し、形質転換体を好適な条件下で培養することにより目的とするタンパク質を産生させることができる。目的タンパク質の単離のためには、目的タンパク質を培養上清中に分泌させることが一般には好ましく、これは、組み換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件などを適宜選択することによって行うことができる。また、本発明によって開示されたポリ乳酸分解活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に従って、所望のアミノ酸配列を有する該タンパク質を化学合成的に製造することも当業者ならば適宜行うことができる。
【００１１】
本発明によれば、ポリ乳酸分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターが提供される。ここで、上記遺伝子を組み込むベクターの種類は特に限定されず、その後の操作の目的に応じて適当なベクターを選択できる。一般的には、プラスミドベクター、ファージベクターなどが使用でき、これらは多くの業者から市販されている。また、本発明の遺伝子がコードする組み換えタンパク質（ポリ乳酸分解活性を有するタンパク質）を産生させる場合には、発現ベクターが好適に使用される。
かかる発現ベクターは、例えば、（1）本発明のポリ乳酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを切り出し、（2）該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０等）、放線菌Streptomyces lividans由来のプラスミド（ｐＩＪ７０２等）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９等）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００１２】
また本発明によれば、上記組み換えベクターを宿主に形質転換することによって作製される形質転換体が提供される。宿主としては任意の好適な生物体を選択でき、微生物、真核微生物（動物細胞、植物細胞、酵母など）、原核微生物（大腸菌など）等が使用可能である。例えば、大腸菌（Escherichia coli等）、バチルス属菌（Bacillus subtilis、Brevibacillus brevis等）、放線菌（Streptomyces lividans等）、酵母（Saccaromyces cerevisiae等）、昆虫または昆虫細胞、動物細胞（マウス細胞、ハムスター細胞、サル細胞、ヒト細胞等）などが用いられる。好ましくは、Brevibacillus brevisである。形質転換の方法は当業者に公知の方法を使用することができ、具体的には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション法などを適宜使用できる。
かくして得られる形質転換体を好適な条件下で培養することにより、本発明のポリ乳酸分解活性を有するタンパク質を産生することができる。培養は、形質転換体（宿主）に応じて慣用の方法を使用することができる。培養に使用する培地の種類や組成についても形質転換体（宿主）に応じて慣用の方法を使用することができる。目的タンパク質の単離のためには、ポリ乳酸分解活性タンパク質を培養上清中に分泌させることが好ましく、これを目して組み換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件などを適宜選択することができる。
次いで得られた培養物からポリ乳酸分解活性を有するタンパク質を回収し、単離し、必要に応じて精製する工程に供せられる。タンパク質は、目的タンパク質が培養物に分泌される場合は培養液（遠心分離処理後の上清）から、また菌体に蓄積される場合は培養物（菌体）を粉砕または溶解した後に得られる培養液（遠心分離処理後の上清）から回収することができる。得られた培養液は塩析、アフィニティ−クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク質の単離、精製のための公知の方法に供され、これによってポリ乳酸分解活性を指標として目的タンパク質を単離、精製することができる。なお、ここで例えばアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タンパク質を精製することができる。
【００１３】
本発明の生分解性樹脂の可溶化方法は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む。前記可溶化剤は、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質が溶媒中に溶解又は懸濁しているものであってもよい。適した溶媒としては、生分解性樹脂の可溶化に必要な水を含んでいるものであれば特に限定されないが、具体的にはＰＹＭ培地、ＣＦＭＭ培地等の培地やBugBuster Protein Extraction Reagent等の酵素活性が保たれる溶液などが挙げられる。水溶液であることが好ましい。また、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質は細粒体に担持させたものであってもよい。細粒体としては、接触させる生分解性樹脂との接触面積がある程度大きくなるものであれば特に限定されないが、粒状、粉末状などの形状において、土やコンポストに用いられる堆肥などを用いることができる。例えば、本発明の遺伝子のＣ末端側に他物質への吸着配列（His-tag）や結合配列等を融合させて発現し、各々と結合する物質および結合を触媒する物質等により固定化する方法が挙げられる。具体的には、本発明の酵素または固定化材にアミノ酸のGlnまたはLysのどちらかを付加もしくは融合発現させ、GlnとLysの結合を触媒するトランスグルミナーゼを用いることにより得られる（Biotechnol. Bioeng. 2004 May 20;86(4):399-404）。または、微生物等の細胞膜上に発現させる方法（Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Mar;64(1):28-40. Epub 2004 Jan 10.）や微生物等を用いて無機物質に吸着させる方法（Biotechnol Bioeng. 2000 Dec 20;70(6):704-9.）等により得られる担持体でもよい。
【００１４】
前記可溶化剤は、本発明の宿主を含むものであってもよく、この場合、前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質は宿主から継続して産生される。また、前記可溶化剤には、本発明の宿主から産生された前記前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を分離して添加してもよい。この場合、生分解性樹脂を接触させる前の除菌処理や、可溶化後に組み換え体の拡散防止などの目的で行う殺菌処理などを省略することができる。これらの方法は、宿主の性質や生分解性樹脂などを考慮して適宜選択すればよい。
生分解性樹脂を接触させる方法としては、例えば生分解性樹脂を本発明の可溶化剤に浸漬する方法、水との接触を避ける処理をして樹脂に混入する方法、上記の坦持体等を混在させる方法などが挙げられる。
生分解性樹脂は、そのままの形状で本発明の可溶化剤と接触させてもよいが、分解時間を短くすることなどを目的として予め細分化してもよい。例えば、機械的な粉砕や切断又は加熱などで流体としてから細分化してもよい。
なお、本発明の生分解性樹脂の可溶化方法は、生分解性樹脂の可溶化を阻害しない内容物、例えば食品などを含む状態で生分解性樹脂を可溶化することが可能である。また、生分解性樹脂分解酵素を発現する微生物の培養温度と生分解性樹脂の可溶化温度が異なる場合は、別工程にしても良い（図６）。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、薬品名後に会社名を記していないものは、和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水であり、培地は培養前に１２１℃、２０分加圧・加熱処理を行っている。
（ＣＦＭＭ培地）
（ＰＹＭ培地）
（２×ＹＴ培地）
（ＴＥバッファー）
4mmol/l Tris-HCl（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）塩酸
1mmol/l エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム２水和物（EDTA）
pH8.0に調整
（ＣＴＡＢ溶液）
10％/l 臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）
1mol/l 塩化ナトリウム
６０℃で溶解
（ＴＡＥ電気泳動用ゲル）
1.5％アガロース
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 酢酸
（２×ＹＴ＋Ｇ培地）
（Ｍ９培地）
【００１６】
（実施例１）
（１．Streptomyces coelicolor A3(2)である ATCC BAA-471 の培養方法）
ＰＹＭ培地を用い、２８℃、２４時間培養した。
（２．Streptomyces coelicolor ATCC BAA-471 のゲノム抽出方法）
菌体を６０００×ｇ、５分で遠心分離し、得られた菌体をＴＥバッファーに懸濁し、１／５量の５ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液を添加、攪拌し、その後１／１０量のＣＴＡＢ溶液を添加、攪拌後、６０℃、３０分インキュベーションした。クロロホルムを上記混合液の等量添加、攪拌し、１５，０００×ｇで５分遠心分離を行い、水溶液層を取り除いた。この操作を２回繰り返した。その後、２−プロパノールを等量添加し、沈殿物を回収後、１００％、８０％エタノールで各１回ずつ洗浄、室温で乾燥後、ＴＥバッファーに溶解し、ゲノム溶液を得た。
【００１７】
（３．遺伝子の調製方法）
下記に示す酵素製品、Kit製品は、特別に記さない限り取扱説明書に従った。また、ベクター、宿主においても各々選別に必要な抗生物質は添加している。
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）には、DNA Polymerase Z-taq（タカラバイオ社）を使用し、プライマー（下記に記載）は、Invitrogen社製を用いた。鋳型として、上記で調製したStreptomyces coelicolor ATCC BAA-471のゲノム溶液を用いた。
下記に示した温度でPCR反応を行った。また、反応に用いたアニール温度は、プラスミド（Ｉ）、（II）及び（III）について、それぞれ６２℃（Forward：Reverse）、６５℃（H-F：Reverse）、６８℃（SH-F：Reverse）。
９８℃、２分間 −(i)
９８℃、５秒間 −(ii)
各アニール温度、５秒間 −(iii) (ii)〜(iv)を３０サイクル
７２℃、１０秒間 −(iv)
７２℃、２分間 −(v)
４℃、∞ −(vi)
【００１８】
【表１】
【００１９】
反応終了後、ＴＡＥ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕であるMupid-ex（アドバンス社）を用いて電気泳動（１００Ｖ、５０分）を行った。
その後、核酸染色試薬SYBR GreenI（タカラバイオ社）で染色、ゲルからの目的ＤＮＡ断片の抽出をＤＮＡ抽出キットNucleoSpin Extract Kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて回収した。
上記のＤＮＡ断片をクローニングベクターpT7 Blue2 T-vector（Novagen社）とＤＮＡ結合酵素Ligation Convenience Kit（ニッポンジーン社）を用いて結合させ、宿主Escherichia coli DH5α（タカラバイオ社）へ形質転換し（図１）、２×ＹＴ培地を用い、３７℃で培養した。プラスミドの回収は、NucleoSpin plasmid Kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて行った。
ＤＮＡ配列は、同一性が１００％であることを確認後（タカラバイオ社に委託）、発現用ベクターpET26b(+)（Novagen社）とＤＮＡ配列を確認したプラスミドを制限酵素NcoI/XhoI（両制限酵素ともタカラバイオ社）で処理（37℃、2時間）し、電気泳動後、Nucleospin plasmid Kitを用いてＤＮＡ断片を回収した。両者をLigation Convenience Kit処理後、Escherichia coli DH5α（タカラバイオ社）へ形質転換し、２×ＹＴ培地を用い、３７℃で培養した。
得られたプラスミドを発現用宿主Rosetta2（Novagen社）へ形質転換させた。
【００２０】
発現の有無については、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）で確認した。各プラスミド（（Ｉ）、（II）、（III）、pET26b(+)）をRosetta2に形質転換し、抗生物質を含む2×YT+G培地プレートで37℃、16〜24時間生育させた。その後、液体の2×YT+G培地で37℃、12〜16時間で生育させた。その後、液体のM9培地に菌体の培地を0.1%植菌し、600nmの吸光度（O.D.(600)）= 0.6〜0.8まで37℃で生育させ、イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトシド(IPTG)（終濃度1mM）を添加し、20℃、24時間振とうした。その後、遠心分離（15,000×g、1分）により各大腸菌を回収、培地上精を取り除いた後、細胞破砕液BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen社）で溶菌させ、遠心分離（15,000×g、15分）によって上精を得た。この上精10μlとLaemmli Sample Buffer（BIO-RAD社）−メルカプトエタノール（95：5）混合液20μlを混合し、98℃、4分間インキュベーションした。その後、室温になるまで放置した。プラスミド（Ｉ）については、不溶性画分において発現したタンパク質が含まれることを確認したが、可溶性画分にはタンパク質は含まれなかった。プラスミド（II）及び（III）については、可溶性画分において発現したタンパク質が含まれていることが確認できた。
電気泳動用のゲルにはCriterionレディーゲルJ（BIO-RAD社）、電気泳動層にはCriterionセル（BIO-RAD社）、電気泳動試薬には１０×Tris/Glycine/SDS Buffer（BIO-RAD社）、電源にはパワーサプライBasic（BIO-RAD社）を用いて、各サンプルについて電気泳動（40mA、120分）を行った。その後、染色液SimplyBlue SafeStain（Invitrogen社）で染色した。
活性の評価方法においては、以下のような重層培地を作成し、蛋白質分解活性として評価した。
上層：2%スキムミルク、1.5%アガロース、0.1ｍmol/l IPTGを懸濁させた2×YT培地5ml
下層：1.5%アガロース、0.1ｍmol/l IPTGを含んだ2×YT培地15ml
この重層培地に以下の組み換え大腸菌を20℃で生育させた。pET26b(+)、（II）、（III）の遺伝子をRosetta2へ形質転換し、組み換え大腸菌を得た。結果は、図３に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
（４．低分子量ポリ乳酸（ＰＬＡ）溶液の調整法）
撹拌装置、窒素導入管、Dean-Stark型水分離器を備えた３００ｍｌのセパラブルフラスコにＤＬ−乳酸２００ｇ、１８０℃反応させ、生成する水を除きながら窒素雰囲気中で約４時間反応後、２００℃に昇温して３時間反応させることにより得た。
得られたポリ乳酸を０．５ｍｏｌ／ｌのビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンに溶解させ、溶解後ｐＨを７．２に調整した。
【００２３】
（５．ポリ乳酸分解活性検出）
各プラスミド（（Ｉ）、（II）、（III）（図２））をRosetta2に形質転換し、２×ＹＴ＋Ｇ培地プレートで３７℃、１６〜２４時間生育させた。
その後、液体の２×ＹＴ＋Ｇ培地で３７℃、１２〜１６時間で生育させた。
その後、液体のＭ９培地に菌体の培地を０．１％植菌し、Ｏ．Ｄ．(600)＝０．６〜０．８まで３７℃で生育させ、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）、ポリ乳酸溶液（終濃度０．１％）を添加し、２０℃、２４時間振とうした。
上精を回収後、リン酸（終濃度１％）を添加し、試料液を調整した。高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography；HPLC：日本分光ガリバー社）により検出した。
【００２４】
試料液２ｍｌを０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し試料液とした。カラムにWARTERS Atlantis ４．６×２５０ｍｍを用い、試料液５０μｌを注入してＵＶ２１０ｎｍで検出した。溶離液はカラム温度４０℃で表３に示す濃度勾配をつけ分離を行った。乳酸を用いて標準曲線を作成した。図４および５において、その結果を示す。横軸は乳酸の重合数を示し、縦軸はポリ乳酸の濃度である。左棒グラフは、IPTGで誘導していないRosetta2であり、ポリ乳酸との反応時間は０時間である。中央の棒グラフは、IPTGで誘導していないRosetta2であり、ポリ乳酸と２４時間反応させた。右棒グラフは、IPTGで本発明の遺伝子の発現を誘導させたRosetta2であり、ポリ乳酸と２４時間反応させた。その結果、３量体以下は増加し、４量体以上は減少した。このことは、より高分子量のポリ乳酸が低分子量へと変化したことを示し、ポリ乳酸の分解活性を検出したと言える。図４と５は、本質的に同じ図であり、図４は、縦軸の濃度が０〜８００mg/l、横軸が乳酸１量体〜１２量体であり、図５は、縦軸の濃度が０〜５０mg/l、横軸が乳酸９量体〜１２量体である。また、Rosetta2の生成物質により乳酸６量体と８量体は検出できなかった。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１で使用したプラスミドの模式図を示す。
【図２】目的酵素の詳細とプラスミドの名称を示す。
【図３】図２のプラスミドにおけるプロテイナーゼ活性検出
【図４】大腸菌発現時におけるポリ乳酸の分解挙動（１〜１２量体）
【図５】大腸菌発現時におけるポリ乳酸の分解挙動（９〜１２量体）
【図６】分解・可溶化システムの概要
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質：
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の前駆物質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主。
【請求項６】
請求項２に記載の前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤。
【請求項７】
請求項６に記載の可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む生分解性樹脂の可溶化方法。
【請求項１】
Streptomyces coelicolor A3(2)を培養し、得られる培養物を生分解性樹脂と接触させることを含む生分解性樹脂の分解方法。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列からなる生分解性樹脂分解タンパク質の前駆物質：
（１）シャペロン領域を構成するアミノ酸配列、
（２）シャペロン領域を切断するために必要なアミノ酸配列、及び
（３）（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、このアミノ酸配列からなるタンパク質が生分解性樹脂分解活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の前駆物質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主。
【請求項６】
請求項２に記載の前駆物質又はこの前駆物質から誘導され得る活性化した生分解性樹脂分解タンパク質を含む生分解性樹脂の可溶化剤。
【請求項７】
請求項６に記載の可溶化剤に、生分解性樹脂を接触させることを含む生分解性樹脂の可溶化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−３１９０９２（Ｐ２００７−３１９０９２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１５３６４３（Ｐ２００６−１５３６４３）
【出願日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
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