生物学的製剤
【課題】繰り返し使用でき、容易にかつ効率的に製造できるＮＨＬを治療するための抗体分子の提供。
【解決手段】ＣＤ２２に対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体から得られる少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体が開示される。少なくとも１つのＣＤＲが修飾ＣＤＲであるＣＤＲ移植抗体も開示される。さらに、抗体分子の鎖をコードするＤＮＡ配列、ベクター、形質転換宿主細胞、およびＣＤ２２を発現する細胞により仲介される疾患の治療における抗体分子の使用が開示される。
【解決手段】ＣＤ２２に対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体から得られる少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体が開示される。少なくとも１つのＣＤＲが修飾ＣＤＲであるＣＤＲ移植抗体も開示される。さらに、抗体分子の鎖をコードするＤＮＡ配列、ベクター、形質転換宿主細胞、およびＣＤ２２を発現する細胞により仲介される疾患の治療における抗体分子の使用が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂリンパ球抗原であるＣＤ２２の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。本発明はまた、この抗体分子の治療的使用とこの抗体分子の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然の抗体分子には、２つの重鎖と２つの軽鎖がある。各重鎖と各軽鎖は、そのＮ末端に可変ドメインを有する。各可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が交互に存在する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。可変ドメイン中の残基は通常、カバト（Kabat）らが作成したシステムに従って番号付けがされている。このシステムは、カバト（Kabat）ら、１９８７、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、米国保健社会福祉省(US Department of Health and Human Services、NIH、USA（以後「カバト（Kabat）ら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、本明細書におけるこの番号付けシステムが使用されている。
【０００３】
カバト（Kabat）残基表記法は、アミノ酸残基の線形の番号付けと必ずしも直接相関しない。実際の線形のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであってもＣＤＲであっても、構造成分の短縮またはそこへの挿入に対応して、厳密なカバト（Kabat）番号付け中より、少ないまたは多いアミノ酸を有する。ある抗体について残基の正しいカバト（Kabat）番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を「標準的」カバト（Kabat）番号付け配列と整列することにより、決定される。
【０００４】
カバト（Kabat）番号付けに従うと、重鎖可変ドメインのＣＤＲは、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）および残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。
【０００５】
カバト（Kabat）番号付けに従うと、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）および残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【０００６】
ＣＤＲ移植抗体の構築は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００に記載されており、これは、部位特異的突然変異誘発により長いオリゴヌクレオチドを使用して、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に移植される方法を開示する。ＣＤＲは抗体の抗体結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域上にある比較的短いペプチド配列である。
【０００７】
ＣＤＲ移植によりモノクローナル抗体をヒト化する初期の研究は、合成抗原（例えばＮＰ）を認識するモノクローナル抗体について行われた。しかし、リゾチームを認識するマウスモノクローナル抗体と、ヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットモノクローナル抗体が、ＣＤＲ移植によりヒト化された例が、それぞれベルホーエン（Verhoeyen）ら（Science, 239, 1534-1536, 1988）と、リーチマン（Riechmann）ら（Nature, 332, 323-324, 1988）により記載されている。
【０００８】
リーチマン（Riechmann）らは、ＣＤＲ単独の移動［カバト（Kabat）（カバト（Kabat）ら（前述）、およびウー（Wu）ら、J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970）］は、ＣＤＲ移植生成物の充分な抗原結合活性を提供するのに充分ではないことを見いだした。多くのフレームワーク残基は、これらが供与体フレームワーク領域のものに対応するように、改変されなければならないことがわかった。改変することが必要なフレームワーク残基を選択するための基準は、国際特許出願ＷＯ９０／０７８６１に記載されている。
【０００９】
ＣＤＲ移植抗体を記載する多くの総説が公表されており、例えばボーガン（Vaughan）ら（Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998）がある。
【００１０】
悪性リンパ腫は、多様な群の新生物である。大部分の症例は老人である。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、現在米国に２００，０００〜２５０，０００人の患者がいる疾患である。これは、米国で２番目に増加率の高い癌であり、毎年約５５，０００症例の速度で増加している。この発症頻度は、人口の高齢化や既知の危険因子への暴露のみでは説明されない速度で上昇している。
【００１１】
リンパ腫の分類は複雑であり、過去数十年間に漸進的に変化してきた。１９９４年に改訂ヨーロッパ−アメリカリンパ腫（ＲＥＡＬ）分類が導入された。この分類は、Ｂ細胞のリンパ腫（最も頻繁に見つかる）、Ｔ細胞のリンパ腫、および分類不可能な起源のリンパ腫とを、認められたサブタイプに分類している。日々の診療において、一般的な組織学的外観に基づくＮＨＬの群別の低、中および高グレードへの分類は、その臨床的挙動を広く反映する。
【００１２】
ＮＨＬは主にリンパ節を冒すが、個々の患者ではこの腫瘍は、体の他の部位（例えば、肝臓、脾臓、骨髄、肺、消化管および皮膚）が関与する。この疾患は通常、無痛のリンパ節の腫脹を示す。リンパ節外リンパ腫は最も頻繁に消化管を冒すが、ほとんどすべての臓器の初期リンパ腫が報告されている。全身症状には、発熱、発汗、疲労、および体重減少がある。
【００１３】
最近まで、完全に疾患の解剖学的程度に基づくアンアーバー（Ann Arbor）ステージ分類システムが、ＮＨＬの治療の主要な決定因子であった。この情報は、追加の予後指標（年齢、血清乳酸脱水素酵素レベル、および動作状態を含む）を取り込むことにより改良される。それでも、アンアーバー（Ann Arbor）ステージ分類システムは、腫瘍の組織学的および免疫学的サブタイプとともに治療の主要な決定因子である。
【００１４】
低グレードＮＨＬは、無痛性の経過をたどり、患者のメジアン生存期間は８〜１０年である。生存は現在利用可能な治療法によりほとんど影響を受けないが、局所的疾患の放射線照射や全身性症状の化学療法は、患者のクオリティオブライフを改善する。疾患の再発には併用化学療法がある。中グレードの疾患と特に高グレードの疾患には、緊急の治療が必要である。非常に大きい疾患の患者では放射線療法が、有効な治療法である。多くの異なる化学療法が使用されており、半分以上の患者で長期の疾患の無い生存が得られている。高用量治療は最初、再発性または抵抗性疾患の患者について導入されたが、現在は低リスク疾患の患者について第一線の治療法としてますます利用されている。ますます攻撃的になっている治療法の最近の傾向は、ＮＨＬ患者の高齢と相対的弱質に対してバランスを取らなければならず、各患者の疾患の個々の予後に治療の毒性を一致させる必要がある。
【００１５】
より有効で良好に許容される改善された治療が必要である。最近導入されたものには、併用療法への取り込みが増加している新しい細胞障害性薬剤、および抗体ベースの治療法の導入がある。
【００１６】
非ホジキンリンパ腫は、一連のＢ細胞リンパ球を包含する。すなわちＢ細胞抗原は、抗体治療法の適当な標的である。
【００１７】
ＣＤ２２は、シアロアドヘシン（sialoadhesin）と呼ぶシアル酸結合タンパク質の群に属する１３５kDaの膜糖タンパク質である。これは、Ｂ細胞発生の初期に細胞質中で検出され、ＩｇＤと同時に細胞表面上に出現し、ほとんどの成熟Ｂ細胞上に見いだされる。Ｂ細胞活性化により発現が上昇する。最終分化によりＣＤ２２は失われ、一般に植物細胞上には存在しないと報告されている。すなわちこのインターナライズ性抗原は、プレＢ細胞と成熟Ｂ細胞の表面には存在するが、幹細胞または植物細胞には存在しない。
【００１８】
ヒトではＣＤ２２の２つのアイソフォームが存在する。優勢な型（ＣＤ２２β）は、細胞外領域中に７つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含有する。ＣＤ２２α変種は、Ｉｇ様ドメイン４が欠如し、末端切断型の細胞質ドメインを有する。単球、好中球、リンパ球および赤血球へのＣＤ２２接着を阻止する抗体は、第１または第２のＩｇ様ドメイン内で結合することが証明されている。
【００１９】
ＣＤ２２の細胞障害性ドメインは、Ｂ細胞抗原受容体の結合によりチロシンリン酸化され、Ｌｙｋ、Ｓｙｋおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼと結合する。ＣＤ２２の機能は、Ｂ細胞活性化閾値を下方に調節することである。これはまた、適切なシアログリコ結合体を有する細胞との相互作用を介して細胞接着を仲介する。
ＣＤ２２はほとんどのＢ細胞白血病とリンパ腫［ＮＨＬ、急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、および特に急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）を含む］で発現される。
【００２０】
ＣＤ２２に対するモノクローナル抗体は、先行技術で記載されている。ＷＯ９８／４１６４１は、ＶH４４とＶL１００にシステイン残基を有する組換え抗ＣＤ２２抗体を記載する。ＷＯ９６／０４９２５は、抗ＣＤ２２抗体ＬＬ２のＶHとＶL領域を記載する。ＵＳ５６８６０７２は、抗ＣＤ２２と抗ＣＤ１９免疫毒素の併用を記載する。ＷＯ９８／４２３７８は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために裸の抗ＣＤ２２抗体の使用を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
多くの抗体ベースの治療薬がライセンス化［例えばリツキサン（Rituxan）、（ＣＤ２０に特異的な非標識キメラヒトγ１（＋ｍγ１Ｖ領域））］されているか、またはこの疾患のために臨床治験中である。これらは、Ｂ細胞の補体性もしくはＡＤＣＣ性死滅、または放射性核種（例えば131Ｉまたは90Ｙ）（これらは臨床家と患者にとって、関連する調製と使用の問題がある）の使用に依存する。繰り返し使用でき、容易にかつ効率的に製造できるＮＨＬを治療するための抗体分子に対するニーズがある。また、ＣＤ２２に対して高い親和性を有し、ヒトでの免疫原性の低い抗体分子に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第１の態様において本発明は、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について、図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、重鎖を含んでなる上記抗体分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、マウスモノクローナル抗体５／４４のＣＤＲのアミノ酸配列を示す（配列番号１〜６）。
【図２】図２は、マウスモノクローナル抗体５／４４の軽鎖可変ドメインの完全な配列を示す。
【図３】図３は、マウスモノクローナル抗体５／４４の重鎖可変ドメインの完全な配列を示す。
【図４】図４は、ＣＤＲ−Ｈ２におけるグリコシル化部位および反応性リジンの除去のための方策を示す。
【図５】図５は、５／４４軽鎖配列のための移植設計図を示す。
【図６】図６は、５／４４重鎖配列のための移植設計図を示す。
【図７】図７は、ベクター：ｐＭＲＲ１４およびｐＭＲＲ１０．１を示す。
【図８】図８は、キメラ５／４４変異体のビアコア（Biacore）アッセイ結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、５／４４ｇＨ１およびｇＬ１遺伝子組立体のためのオリゴヌクレオチドを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、５／４４ｇＨ１およびｇＬ１遺伝子組立体のためのオリゴヌクレオチドを示す。
【図１０】図１０は、中間体ベクター：ｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）およびｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１）を示す。
【図１１】図１１は、さらに別の移植片を作るために使用したオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【図１２】図１２は、蛍光標識マウス５／４４抗体と移植変種との間の競合アッセイを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【００２４】
本発明の第１の態様の抗体分子は、重鎖可変ドメインについてＨ１、Ｈ２およびＨ３（配列番号１、配列番号２，および配列番号３）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは抗体分子は、重鎖可変ドメインに少なくとも２つ以上、好ましくは３つのＣＤＲを含む。
【００２５】
本発明の第２の態様において、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、軽鎖を含んでなる上記抗体分子が提供される。
【００２６】
本発明の第２の態様の抗体分子は、軽鎖可変ドメインについてＬ１、Ｌ２およびＬ３（配列番号４、配列番号５、および配列番号６）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは抗体分子は、軽鎖可変ドメインに少なくとも２つ以上、好ましくは３つのＣＤＲを含む。
本発明の第１と第２の態様の抗体分子は、好ましくはそれぞれ相補的軽鎖または相補的重鎖を有する。
【００２７】
好ましくは本発明の第１と第２の態様の抗体分子は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む重鎖と、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む軽鎖とを含む。
【００２８】
配列番号１〜６に示し上記で図１に示すＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体５／４４から得られる。
【００２９】
マウス５／４４抗体の可変ドメインの完全な配列を、図２（軽鎖）（配列番号７）と図３（重鎖）（配列番号８）に示す。このマウス抗体はまた、以下で「ドナー抗体」または「マウスモノクローナル抗体」と呼ばれる。
【００３０】
本発明の第１と第２の態様の最初の好ましい別の実施態様は、それぞれ図２（配列番号７）と図３（配列番号８）に示される軽鎖と重鎖の可変ドメイン配列を有するマウスモノクローナル抗体５／４４である。５／４４の軽鎖の定常領域はカッパであり、そして重鎖の定常領域はＩｇＧ１である。
【００３１】
第２の好ましい別の実施態様において、本発明の第１と第２の態様のいずれかの抗体はキメラマウス／ヒト抗体分子であり、本明細書ではキメラ５／４４抗体分子と呼ぶ。このキメラ抗体分子は、マウスモノクローナル抗体５／４４の可変ドメイン（配列番号７と８）とヒト定常ドメインを含む。好ましくは、キメラ５／４４抗体分子は、軽鎖にヒトＣカッパドメイン（ヒーター（Hieter）ら、Cell, 22, 197-207, 1980；ジーンバンク（Genebank）受け入れ番号Ｊ００２４１）と、重鎖に（場合により２４１位のセリン残基がプロリン残基により置換されている）ヒトガンマ４ドメイン（フラナガン（Flanagan）ら、Nature, 300, 709-713, 1982）を含む。
【００３２】
好ましくは本発明の抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２’［可能なグリコシル化部位配列が除去されており、かつＣＤ２２抗原に対するキメラ５／４４抗体の親和性を予想外に上昇させ、かつ好ましくはＣＤＲ−Ｈ２としてＨ２’として与えられる配列（配列番号１３）を有する］を含む重鎖を含む。
【００３３】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２”［ＣＤＲ−Ｈ２内の露出部に位置し、かつ結合剤と反応することにより抗原結合親和性を低下させる能力を有すると考えられる６０位のリジン残基が、別のアミノ酸の代わりに使用され、保存性置換となる］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２”として与えられる配列（配列番号１５）を有する。
【００３４】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２'''［可能なグリコシル化部位配列と６０位のリジン残基の両方が、別のアミノ酸の代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２'''として与えられる配列（配列番号１６）を有する。
【００３５】
第３の好ましい別の実施態様では、本発明の第１と第２の態様のいずれかの抗体は、ＣＤＲ移植抗体分子である。「ＣＤＲ移植抗体分子」という用語は、本明細書において使用されるとき、重鎖および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖の可変領域フレームワークに移植された、ドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲ（所望であれば、修飾ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を意味する。
【００３６】
好ましくは、このようなＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域と、さらには１つまたはそれ以上の前記のドナーＣＤＲを含む、可変ドメインを有する。
【００３７】
ＣＤＲが移植されると、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／タイプに関する、マウス、霊長類およびヒトフレームワーク領域を含む、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。本発明において使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（カバト（Kabat）ら（前述））。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは、重鎖に使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖に使用することができ、そしてＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖細胞系配列を使用してもよい。軽鎖に好ましいフレームワーク領域は、図５に示されるヒト生殖細胞系のサブグループ配列（ＤＰＫ９＋ＪＫ１）である（配列番号１７）。重鎖に好ましいフレームワーク領域は、図６に示されるヒトサブグループ配列（ＤＰ７＋ＪＨ４）である（配列番号２１）。
【００３８】
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体の鎖と相同的な鎖を有するものを使用することが好ましい。アクセプターの重鎖と軽鎖は、必ずしも同じ抗体から誘導される必要はなく、所望であれば異なる鎖から誘導されたフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
【００３９】
また、本発明のＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプにとって一般的でない残基を、より高い頻度で存在する残基に変えてもよい。あるいは、アクセプターフレームワーク領域内で選択された残基を、ドナー抗体の同じ位置に見い出される残基に対応するように、またはドナー抗体の同じ位置に見い出される残基への保存的置換である残基に対応するように変えてもよい。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限に保つべきである。変える必要があるアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００４０】
好ましくは本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がヒトサブグループＤＰＫ９＋ＪＫ１配列（図２に示される）（配列番号１７）を有するならば、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、２、４、３７、３８、４５および６０位にドナー残基を含み、そしてさらに３位にドナー残基を含んでいてもよい（カバト（Kabat）ら（前述）による）。
【００４１】
好ましくは本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトＤＰ７＋ＪＨ４配列（図３に示される）（配列番号２１）を有するならば、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１つまたはそれ以上のドナーＣＤＲに加えて、１、２８、４８、７１および９３位にドナー残基を含むことを特徴とし、そしてさらに６７および６９位にドナー残基を含んでいてもよい（カバト（Kabat）（前述）による）。
【００４２】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、元々ＣＤＲが誘導された抗体からの残基である。
【００４３】
好ましくは本発明の抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２’［ＣＤ２２抗原に対するキメラ５／４４抗体の親和性を上昇させるために、可能なグリコシル化部位配列が除去されており、かつ好ましくはＣＤＲ−Ｈ２としてＨ２’として与えられる配列（配列番号１３）を有する］を含む重鎖を含む。
【００４４】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２”［ＣＤＲ−Ｈ２内の露出部に位置し、かつ結合剤と反応することにより抗原結合親和性を低下させる能力を有すると考えられる６０位のリジン残基が、別のアミノ酸の代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２”として与えられる配列（配列番号１５）を有する。
【００４５】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２'''［可能なグリコシル化部位配列と６０位のリジン残基の両方が、別のアミノ酸に代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２'''として与えられる配列（配列番号１６）を有する。
【００４６】
本発明の抗体分子は、以下を含んでいてよい：完全長の重鎖と軽鎖を有する完全な抗体分子；Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｖ断片のような、その断片；軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマー；１本鎖抗体、例えば、重鎖と軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーにより結合している１本鎖Ｆｖ。同様に、重鎖と軽鎖の可変領域は、適宜、他の抗体ドメインと組合せることができる。
【００４７】
本発明の抗体分子は、これに結合したエフェクターまたはレポーター分子を有していてもよい。例えば、共有ブリッジ構造によりこれに結合している重金属原子をキレート化するための大環状化合物、又はリシンのような毒素を有していてもよい。あるいは、組換えＤＮＡ技術の手順を利用することにより、完全な免疫グロブリン分子のＦｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメイン）、ＣＨ２とＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインが、ペプチド結合により置換されているか、または同結合によりそこに結合している抗体分子である、酵素または毒素分子のような機能性の非免疫グロブリンタンパク質を製造することができる。
【００４８】
本発明の抗体分子は、好ましくは少なくとも０．８５×１０-10Ｍ、さらに好ましくは少なくとも０．７５×１０-10Ｍ、そして最も好ましくは少なくとも０．５×１０-10Ｍの結合親和性を有する。
【００４９】
好ましくは、本発明の抗体分子は、軽鎖可変ドメイン５／４４−ｇＬ１（配列番号１９）と重鎖可変ドメイン５／４４−ｇＨ７（配列番号２７）を含む。これらの軽鎖と重鎖の可変ドメインの配列は、それぞれ図５と６に示される。
【００５０】
本発明はまた、ＣＤ２２に対する親和性が改善された本発明の抗体分子の変種に関する。このような変種は、ＣＤＲの突然変異（ヤン（Yang）ら、J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、チェーン・シャッフリング（マークス（Marks）ら、Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（E. coli）のミューテーター株の使用（ロウ（Low）ら、J. Mol. Biol. 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（パッテン（Patten）ら、Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージ提示法（トンプソン（Thompson）ら、J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）およびセクシュアルＰＣＲ（クラメリ（Crameri）ら、Nature, 391, 288-291, 1998）を含む、幾つかの親和性成熟プロトコールにより入手することができる。ボーガン（Vaughan）ら（前述）は、親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【００５１】
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を提供する。
【００５２】
好ましくは、このＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする。
【００５３】
本発明のＤＮＡ配列は、（例えば、化学的処理により製造される）合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはこれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の本発明のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターに関する。好ましくは、このクローニングまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖と重鎖をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。
【００５５】
ベクターを作成することができる一般法であるトランスフェクション法と培養法は、当業者には周知である。この点に関しては「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１９９９、エフ・エム・アウスベル（F.M. Ausubel）（編）、ワイリー・インターサイエンス（Wiley Interscience）、ニューヨーク、およびコールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Publishing）により出版されたマニアティス・マニュアル（Maniatis Manual）を参照されたい。
【００５６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者には周知の方法により入手することができる。例えば、抗体の重鎖と軽鎖の一部または全部をコードするＤＮＡ配列は、要望どおりに決定ＤＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
【００５７】
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く利用可能であり、そしてこれらの既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【００５８】
分子生物学の標準法を利用することにより、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。目的とするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成法を利用して、完全に、または部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を、適宜利用することができる。
【００５９】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌（例えば大腸菌（E. coli））および他の微生物系は、部分的にはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片のような抗体断片、そして特にＦｖ断片および１本鎖抗体断片、例えば１本鎖Ｆｖの発現のために使用することができる。真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の製造のために使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞がある。
【００６０】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養すること、および抗体分子を単離することを特徴とする、本発明の抗体分子の製造方法を提供する。
【００６１】
この抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドだけを含んでいてもよく、この場合、重鎖または軽鎖ポリペプチドだけをコードする配列を使用することにより、宿主細胞をトランスフェクトする必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む産物の製造には、細胞株は２つのベクター（軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター）でトランスフェクトされる。あるいは、軽鎖と重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターである、単一のベクターを使用してもよい。
【００６２】
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組合せて含む、治療用または診断用組成物を提供する。
【００６３】
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合することを特徴とする、治療用または診断用組成物の製造方法を提供する。
【００６４】
この抗体分子は、治療用または診断用組成物の中で唯一の活性成分であっても、あるいは他の抗体成分（例えば、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体）またはキサンチン類のような非抗体成分を含む、他の活性成分を伴ってもよい。
【００６５】
薬剤組成物は、好ましくは治療上有効量の本発明の抗体を含む。「治療上有効量」という用語は、本明細書において使用されるとき、標的とする疾患または症状を治療、改善または予防するために、あるいは検出可能な治療または予防効果を示すために必要な治療剤の量を意味する。任意の抗体について、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類）のいずれかにおいて推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与の経路を決定するために使用してもよい。そしてこのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与の経路を決定するために使用することができる。
【００６６】
ヒト対象に対する正確な有効量は、病状の重篤度、対象の全般的な健康度、対象の年齢、体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤併用、反応感度、および治療法に対する耐性／応答性に依存する。この量は日常的な実験により決定することができ、そして臨床医の判断の範囲内である。一般に有効用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇであろう。
【００６７】
組成物は、個別に患者に投与しても、または他の物質、薬物またはホルモンと組合せて投与してもよい。
【００６８】
本発明の抗体分子が投与される用量は、処置すべき症状の性質、悪性リンパ腫または白血病の悪性度によって、また抗体分子が予防的に使用されるか、または存在する症状を治療するために使用されるかによって異なる。
【００６９】
投与の頻度は、抗体分子の半減期およびその作用時間に依存しよう。抗体分子の半減期が短ければ（例えば、２〜１０時間）、１日に１回またはそれ以上の投与が必要となろう。あるいは、抗体の半減期が長ければ（例えば、２〜１５日間）、１日に１回、１週間に１回または場合によっては１ないし２ヶ月毎に１回の投与しか必要でないかもしれない。
【００７０】
薬剤組成物はまた、抗体の投与のために薬剤学的に許容される担体を含んでいてもよい。担体はそれ自体が、組成物を投与される個人に有害な抗体の産生を誘導してはならず、また毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活化ウイルス粒子のような、大きくゆっくり代謝される高分子である。
【００７１】
薬剤学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩のような鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩を使用することができる。
【００７２】
治療用組成物中の薬剤学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含んでいてもよい。さらに湿潤剤または乳化剤のような助剤物質が、このような組成物中に存在してもよい。このような担体により薬剤組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として処方することができる。
【００７３】
投与に好ましい剤形は、非経口投与に適した剤形（例えば、注射または点滴による、例えばボーラス注射または持続点滴による）を含む。製品が注射または点滴用である場合、これは油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液の形をとってよく、そして懸濁剤、保存料、安定剤および／または分散剤のような処方用剤を含んでいてもよい。あるいは抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体で復元するための乾燥剤形にしてもよい。
【００７４】
一旦処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。処置する対象は動物であってもよい。しかし組成物はヒト対象への投与に適合させるのが好ましい。
【００７５】
本発明の薬剤組成物は、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸内経路をはじめとする、あらゆる経路により投与することができる。本発明の薬剤組成物を投与するために、ハイポスプレーも使用することができる。典型的にはこの治療用組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注射用として調製することができる。注射の前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するための固体剤形もまた調製することができる。
【００７６】
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内への注射により、あるいは組織の間質腔へ送達される注射により達成されよう。組成物はまた、病変部に投与することができる。投薬処置は、単回投与計画であってもまたは多回投与計画であってもよい。
【００７７】
組成物中の活性成分が１つの抗体分子であることは理解されるであろう。それ自体が胃腸管内で分解を受けやすいであろう。すなわち組成物が胃腸管を利用する経路により投与されるなら、この組成物は抗体を分解から防御するが、一旦これが胃腸管から吸収されると、抗体を放出する物質を含む必要があろう。
【００７８】
薬剤学的に許容される担体の網羅的な考察は、レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック出版社（Mack Publishing Company）、ニュージャージー州、１９９１年）にある。
【００７９】
また、本発明の抗体が遺伝子治療の利用により投与されることも企図される。これを達成するために、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現しかつその場で組立てられるように、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入される。
【００８０】
本発明はまた、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療に使用するための、本発明の抗体分子を提供する。
【００８１】
本発明はさらに、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療用の医薬の製造における本発明の抗体分子の使用法を提供する。
【００８２】
本発明の抗体分子は、ヒトまたは動物体内に存在する、ＣＤ２２を発現する細胞のレベルを低下させることが望まれる、任意の療法に利用することができる。これらのＣＤ２２発現細胞は、体内を循環しているかまたは体内の特定部位に望ましくなく高レベルに局在している。例えば高レベルのＣＤ２２を発現する細胞は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病に存在するであろう。本発明の抗体分子は、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療において利用することができる。
【００８３】
本発明の抗体分子は、好ましくは悪性リンパ腫および白血病、最も好ましくはＮＨＬの治療のために使用される。
【００８４】
本発明はまた、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する障害に罹患しているか、そのリスクのあるヒトまたは動物対象の治療方法であって、対象に有効量の本発明の抗体分子を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００８５】
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば、ＣＤ２２を発現する細胞が関わる病状のインビボ診断およびイメージングにも使用することができる。
【００８６】
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例において例示のためだけに説明される。
【００８７】
発明の詳細な説明
実施例１：候補抗体の生成
以下の選択基準を利用して、ＣＤ２２に対する抗体の一団をハイブリドーマから選択した：ダウディ（Daudi）細胞への結合、ダウディ細胞でのインターナリゼーション、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合、ＰＢＭＣでのインターナリゼーション、親和性（１０-9Ｍを超える）、マウスγ１および産生速度。５／４４を好ましい抗体として選択した。
【００８８】
実施例２：キメラ５／４４抗体分子の遺伝子クローニングおよび発現
５／４４ハイブリドーマ細胞の調製およびそこからのＲＮＡ調製
【００８９】
ハイブリドーマ５／４４は、ヒトＣＤ２２タンパク質でマウスを免疫後、従来のハイブリドーマ法により生成した。ＲＮＡは、５／４４ハイブリドーマ細胞から、ＲＮイージー（RNEasy）キット（キアゲン（Qiagen）、クローリー（Crawley）、英国；カタログ番号７４１０６）を用いて調製した。得られたＲＮＡは、後述するようにｃＤＮＡに逆転写した。
【００９０】
ＮＨＬ腫瘍でのＣＤ２２の分布
５／４４抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を用いる染色の出現率と分布を調べるために免疫組織化学試験に着手した。腫瘍のＢ細胞領域を確認するために、試験には対照の抗ＣＤ２０および抗ＣＤ７９ａ抗体を含めた。
【００９１】
全部で５０個の腫瘍を試験して、ワーキング・フォーミュレーション（Working Formulation）分類およびＲＥＡＬ分類システムを用いることにより、これらを以下のとおり類別した：
【００９２】
・ ７個 Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫（高／Ｉ）
・ ４個 Ｂ−ＣＬＬ／小リンパ球性リンパ腫（低／Ａ）
・ ３個 リンパ形質細胞様／免疫細胞腫（低／Ａ）
・ １個 外套細胞（中／Ｆ）
・ １４個 濾胞性リンパ腫（低〜中／Ｄ）
・ １３個 びまん性大細胞型リンパ腫（中〜高／Ｇ、Ｈ）
・ ６個 分類不能（Ｋ）
・ ２個 Ｔ細胞リンパ腫
【００９３】
４０個のＢ細胞リンパ腫は、５／４４抗体では０．１μｇ／ｍｌでＣＤ２２抗原に対して陽性であり、そして濃度が０．５μｇ／ｍｌまで上昇すると、さらに６個が陽性になった。０．１μｇ／ｍｌで陰性であった残り２個のＢ細胞腫瘍では、より高濃度で試験するには残った組織が不充分であった。しかし、５／４４よりも強い染色が得られた、別のセルテック（Celltech）抗ＣＤ２２抗体６／１３による並行試験では、４８個全部のＢ細胞リンパ腫がＣＤ２２に対して染色陽性になった。
【００９４】
すなわち、ＣＤ２２抗原は、Ｂ細胞リンパ腫で広く発現されており、よってＮＨＬにおける免疫療法の適切な標的を与えると結論づけることができる。
【００９５】
５／４４ＶHおよびＶLのＰＣＲクローニング
５／４４重鎖と軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡ配列は、逆転写酵素を用いて全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡコピーを生成させることにより合成した。次にこれを、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（ＰＣＲ）による特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてマウスＶ領域配列の増幅のための鋳型として使用した。
【００９６】
ａ） ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡは、以下の試薬：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、２０単位のＲＮＡｓｉｎ、７５ｎｇランダムヘキサヌクレオチドプライマー、２μｇの５／４４ＲＮＡおよび２００単位のマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素を含む２０μｌの反応容量中で合成した。４２℃で６０分間インキュベート後、９５℃で５分間加熱して、反応を停止させた。
【００９７】
ｂ） ＰＣＲ
ｃＤＮＡのアリコートを、重鎖と軽鎖に特異的なプライマーの組合せを用いるＰＣＲにかけた。シグナルペプチドの保存配列とアニーリングするために設計された変性したプライマープールを前進プライマーとして使用した。これらの配列は全て、順に、５’末端から７ヌクレオチドで開始する制限部位（ＶLＳＦｕＩ；ＶHＨｉｎｄIII）、生じたｍＲＮＡの最適な翻訳を可能にする配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号５０）、開始コドン、および既知のマウス抗体のリーダーペプチド配列に基づく２０〜３０ヌクレオチドを含む（カバト（Kabat）ら、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第５版、１９９１年、米国保健社会福祉省（U.S. Department of Health and Human Services）、公衆衛生局（Public Health Service）、国立衛生研究所（National Institutes of Health））。
【００９８】
３’プライマーは、抗体のフレームワーク４ Ｊ−Ｃ接合部に及び、ＶLＰＣＲ断片のクローニングを促進するために酵素ＢｓｉＷＩの制限部位を含むように設計される。重鎖３’プライマーは、抗体のＪ−Ｃ接合部に及ぶように設計された混合物である。この３’プライマーは、クローニングを促進するためにＡｐａＩ制限部位を含む。プライマーの３’領域は、既知のマウス抗体に見い出された配列に基づく混合配列を含む（カバト（Kabat）ら、１９９１、前述）。
【００９９】
上述のプライマーの組合せにより、ＶHとＶ１のＰＣＲ産物を適切な発現ベクター（以下を参照のこと）中に直接クローン化して、キメラ（マウス−ヒト）重鎖と軽鎖を産生することができ、そしてこれらの遺伝子を哺乳動物細胞で発現させて、目的のアイソタイプのキメラ抗体を産生することができる。
【０１００】
ＰＣＲのためのインキュベーション（１００μl）は以下のとおり設定した。各反応液は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ｗ／ｖゼラチン、０．２５ｍＭ各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１０ｐｍｏｌ ５’プライマー混合物、１０ｐｍｏｌ ３’プライマー、１μｌ ｃＤＮＡおよび１単位Ｔａｑポリメラーゼを含有した。反応液を９５℃で５分間インキュベートし、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルにかけた。３０サイクル後、各反応液のアリコートを、アガロースゲルで電気泳動して分析した。
【０１０１】
重鎖Ｖ領域については、フレームワークＩの開始点内のプライマープールアニーリングが、シグナルペプチドプライマープールを置換すると、増幅ＤＮＡ産物だけが得られた。この断片をＤＮＡ配列決定ベクター中にクローン化した。ＤＮＡ配列を決定して翻訳することにより、推定アミノ酸配列が得られた。この推定配列は、実験的に求めたＮ末端タンパク質配列を参照することにより証明した。図２と３は、それぞれマウスモノクローナル抗体５／４４の成熟軽鎖と重鎖のＶ領域のＤＮＡ／タンパク質配列を示す。
【０１０２】
ｃ） ＰＣＲ断片の分子クローニング
次にマウスＶ領域配列を、発現ベクターｐＭＲＲ１０．１およびｐＭＲＲ１４中にクローン化した（図７）。これらは、ヒトカッパ軽鎖とヒトガンマ−４重鎖の定常領域をコードするＤＮＡを含む、それぞれ軽鎖と重鎖の発現用のベクターである。ＶL領域は、ＳｆｕＩとＢｓｉＷＩ制限部位を用いて、配列決定ベクターからの制限消化と連結により、発現ベクター中にサブクローン化して、プラスミドｐＭＲＲ１０（５４４ｃＬ）を作成した。重鎖ＤＮＡは、５’プライマーを用いてＰＣＲにより増幅することによりシグナルペプチドを導入したが、これは、異なる社内のハイブリドーマ（１６２と呼ばれる）からのマウス重鎖抗体リーダーを使用したクローニング方策では得られなかったためである。５’プライマーは、以下の配列を有する：
【０１０３】
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' （配列番号１）
【０１０４】
逆進プライマーは、元々のＶH遺伝子クローニングに使用したものと同一であった。生じたＰＣＲ産物を酵素のＨｉｎｄIIIとＡｐａＩで消化してサブクローン化し、そしてそのＤＮＡ配列を確認してプラスミドｐＭＲＲ１４（５４４ｃＨ）を作成した。ＣＨＯ細胞への両方の発現ベクターの一過性同時トランスフェクションによって、キメラｃ５／４４抗体を作成した。これは、リポフェクタミン試薬を製造業者のプロトコールにより用いて達成した（インビトロジェン：ライフテクノロジー（In Vitrogen:Life Technology）、フローニンゲン、オランダ、カタログ番号１１６６８−０２７）。
【０１０５】
グリコシル化部位と反応性リジンの除去
可能なＮ結合グリコシル化部位配列は、アミノ酸配列Ｎ−Ｙ−Ｔを有するＣＤＲ−Ｈ２に観察された（図３）。５／４４およびその断片（Ｆａｂを含む）のゲルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングおよび炭水化物染色は、この部位が実際にグリコシル化されていることを示している（図示せず）。さらにリジン残基は、ＣＤＲ−Ｈ２内の露出位置に観察されたが、これは、抗体が結合体形成しうる物質との結合体形成のための追加の部位を提供することにより、抗体の結合親和性を低下させる潜在力を有する。
【０１０６】
図４に示されるように、ＰＣＲ方策を利用することにより、グリコシル化部位および／または反応性リジンを除去するために、ＣＤＲ−Ｈ２配列中にアミノ酸置換を導入した。突然変異Ｎ５５Ｑ、Ｔ５７ＡまたはＴ５７Ｖをコードする前進プライマーを使用することにより、グリコシル化部位を除去し（図４）、そして置換Ｋ６０Ｒを含む第４の前進プライマーを作成することにより、反応性リジン残基を除去した（図４）。フレームワーク４の逆進プライマーを、これらのＰＣＲ増幅のそれぞれにおいて使用した。ＰＣＲ産物を酵素ＸｂａＩとＡｐａＩで消化して、ｐＭＲＲ１４（５４４ｃＨ）（これもＸｂａＩとＡｐａＩで切断）中に挿入することにより、これらの変異体をコードする発現プラスミドを作成した。Ｎ５５Ｑ、Ｔ５７ＡおよびＴ５７Ｖ突然変異は、アミノ酸配列をコンセンサスＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓから変化させることにより、グリコシル化部位を切断するが、一方Ｋ６０Ｒ突然変異は、潜在的に反応性のリジンを同様に正に荷電した残基のアルギニンで置換する。生じたｃＨ変種プラスミドを、ｃＬプラスミドと共に同時トランスフェクトすることにより、発現されたキメラ抗体変種を作成した。
【０１０７】
キメラ遺伝子の活性の評価
キメラ遺伝子の活性は、ＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションにより評価した。
【０１０８】
ｃ） ビアコア（BiaCore）分析による親和定数の決定
グリコシル化部位または反応性リジンを除去したキメラ５／４４またはその変種の親和性は、ＣＤ２２−ｍＦｃ構築体への結合についてＢＩＡ法を用いて調査した。結果を図８に示す。全ての結合測定は、ＢＩＡコア（BIAcore）（登録商標）２０００機器（ファルマシア・バイオセンサー（Pharmacia Biosensor AB）、ウプサラ、スウェーデン）で実施した。このアッセイは、固定化抗マウスＦｃを介したＣＤ２２ｍＦｃの捕捉により実施した。抗体は可溶性相に入れた。試料、標準物質、および対照（５０ｕｌ）を固定化抗マウスＦｃに注入し、続いて可溶性相の抗体を加えた。各サイクル後に、表面を５０ｕｌの４０ｍＭ ＨＣｌで３０ｕｌ／分で再生した。反応速度分析は、ＢＩＡ評価３．１ソフトウェア（ファルマシア（Pharmacia））を用いて実施した。
【０１０９】
構築体Ｔ５７Ａのグリコシル化部位を除去すると、キメラ５／４４に比較してオンレートがわずかに速くなりオフレートが有意に遅くなり、約５倍の親和性改善があった。Ｎ５５Ｑ突然変異は、親和性に影響しなかった。この結果は、炭水化物自体の除去が（Ｎ５５Ｑの変化のように）恐らく結合に影響しないことを示唆するため、予想外であった。親和性の改善は、Ｔ５７Ａの変化でのみ観察された。１つの可能な説明は、炭水化物の存在に関わりなくトレオニンからアラニンへの変換で除去される５７位のトレオニンが、負の作用を及ぼしているということである。アラニンのサイズが小さいことが重要であり、そしてトレオニンの負の作用がそのサイズに関係しているという仮説は、Ｔ５７Ｖ突然変異を用いて得られた結果から支持される：５７位のバリンでの置換は効果がない（結果は示していない）。
【０１１０】
Ｋ６０Ｒ突然変異によるリジンの除去は、親和性に中立的効果であった、すなわちアルギニンの導入は、親和性を傷つけることなく可能な反応性部位を除去する。
【０１１１】
したがって、グリコシル化部位の除去および反応性リジンの除去のための突然変異は、両方ともヒト化設計に含まれた。
【０１１２】
実施例２：５／４４のＣＤＲ移植
５／４４抗体の重鎖と軽鎖の可変領域の遺伝子の分子クローニング、およびキメラ（マウス／ヒト）５／４４抗体を産生するためのその使用を上記した。マウス５／４４のＶLおよびＶHドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図２と３に示される（配列番号７と８）。この実施例は、アデア（Adair）ら（ＷＯ９１／０９９６７）の方法による、ヒトにおける潜在的な免疫原性を低下させるためのヒトフレームワークへの５／４４抗体のＣＤＲ移植を説明する。
【０１１３】
５／４４軽鎖のＣＤＲ移植
ヒトサブグループＩカッパ軽鎖Ｖ領域からのコンセンサス配列とのタンパク質配列の整列は、６４％の配列同一性を示した。その結果、ＣＤＲ移植軽鎖を作成するために選択したアクセプターフレームワーク領域は、ヒトＶＫサブグループＩ生殖細胞系Ｏ１２、ＤＰＫ９配列のものに対応した。フレームワーク４のアクセプター配列は、ヒトＪ領域生殖細胞系配列ＪＫ１から誘導した。
【０１１４】
マウス５／４４のフレームワーク領域のアミノ酸配列とアクセプター配列との比較は図５に示し、ドナーとアクセプター鎖の間に２７個の違いがあることを示している。各位置で、パッキングに及ぼす作用、またはＶH／ＶL界面での作用を介して直接または間接に抗原結合に寄与するマウス残基の可能性について分析を行った。マウス残基が重要であり、かつサイズ、極性または電荷に関してヒト残基と充分に異なると考えられたならば、そのマウス残基は保持した。この分析に基づき配列番号１９と配列番号２０（図５）に与えられる配列を有する、２つのバージョンのＣＤＲ移植軽鎖を作成した。
【０１１５】
５／４４重鎖のＣＤＲ移植
５／４４重鎖のＣＤＲ移植は、軽鎖に関して記述されたものと同じ方策を用いて行った。５／４４重鎖のＶドメインは、サブグループＩに属するヒト重鎖と相同である（７０％の配列同一性）ことが見い出されたため、ヒトサブグループＩ生殖細胞系フレームワークＶＨ１−３、ＤＰ７の配列をアクセプターフレームワークとして使用した。フレームワーク４アクセプター配列は、ヒトＪ領域生殖細胞系配列ＪＨ４から誘導した。
【０１１６】
５／４４重鎖とフレームワーク領域との比較を図６に示すが、これは、５／４４重鎖がアクセプター配列と２２個の位置で異なることを示す。これらのいずれかが抗原結合に及ぼす寄与の分析によって、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に与えられる配列を有する５つのバージョンのＣＤＲ移植重鎖を構築した（図６）。
【０１１７】
移植配列のための遺伝子の構築
遺伝子は、移植配列ｇＨ１とｇＬ１をコードするように設計し、一連の重複オリゴヌクレオチドを設計し構築した（図９）。ＰＣＲ組立法を利用することにより、ＣＤＲ移植Ｖ領域遺伝子を作成した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、０．２５ｍＭ各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１ｐｍｏｌ各「内部」プライマー（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）、１０ｐｍｏｌ各「外部」プライマー（Ｆ１、Ｒ１）、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（アンプリＴａｑ（AmpliTaq）、アプライド・バイオシステムズ（Applied BioSystems）、カタログ番号Ｎ８０８−０１７１）を含む、１００ｕｌの反応容量を設定した。ＰＣＲサイクルパラメータは、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクルであった。次に反応産物を１．５％アガロースゲルに流して、切り出し、キアゲン（QIAGEN）スピンカラム（ＱＩＡクイック（QIAquick）ゲル抽出キット、カタログ番号２８７０６）を用いて回収した。ＤＮＡを３０μlの容量で溶出した。次にｇＨ１とｇＬ１ ＤＮＡのアリコート（１μｌ）を、インビトロジェン（InVitrogen）ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（カタログ番号Ｋ４５００−０１）中に製造業者の説明書によってクローン化した。この非発現ベクターは、多数のクローンの配列決定を促進するためのクローニング中間体の役目を果たした。ベクター特異的プライマーを用いるＤＮＡ配列決定を使用することにより、ｇＨ１とｇＬ１を含む誤りのないクローンを同定して、プラスミドｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）とｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１）を作成した（図１０）。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドカセット置換法を使用することにより、ヒト化移植片ｇＨ４、５、６および７、並びにｇＬ２を作成した。図１１は、オリゴヌクレオチドカセットの設計図を示す。各変種を作成するために、ベクター（ｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）またはｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１））を、記載のように制限酵素で切断した（重鎖にはＸｍａＩ／ＳａｃII、軽鎖にはＸｍａＩ／ＢｓｔＥII）。大きなベクター断片をアガロースからゲル精製して、オリゴヌクレオチドカセットとの連結に使用した。これらのカセットは、２個の相補的オリゴヌクレオチドからなり（図１１に示される）、０．５ＰＭＯＬ／ΜＬの濃度で２００ΜＬの容量（１２．５ＭＭトリス−ＨＣＬ（ＰＨ７．５）、２．５ＭＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５ｍＭジチオエリトリトール）中で混合される。アニーリングは、水浴（容量５００ｍｌ）中で３分間９５℃まで加熱し、次に反応液を室温までゆっくり冷却させることにより行った。次にアニーリングしたオリゴヌクレオチドカセットを水で１０倍希釈し、次いで適切に切断したベクター中に連結した。ＤＮＡ配列決定を利用することにより正しい配列を確認して、プラスミドｐＣＲ２．１（５／４４−ｇＨ４−７）とｐＣＲ２．１（５／４４−ｇＬ２）を作成した。次に証明した移植配列を発現ベクターｐＭＲＲ１４（重鎖）とｐＭＲ１０．１（軽鎖）中にサブクローン化した。
【０１１９】
ＣＤＲ移植配列のＣＤ２２結合活性
移植変種をコードするベクターを、元々のキメラ抗体鎖と一緒に種々の組合せでＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトした。結合活性は、元々のマウス５／４４抗体の結合をラモス（Ramos）細胞（ＡＴＣＣから入手；表面ＣＤ２２を発現するバーキット（Burkitt's）リンパ腫リンパ芽球ヒト細胞株）への結合に関して競合させて、競合アッセイで比較した。このアッセイは、移植片をその細胞表面ＣＤ２２に結合する能力において比較するための最良の方法と考えられた。結果を図８に示す。明らかなように、移植片のいずれの間にもほとんど差がなく、全てがマウスの親に対する競合でキメラより有効に奏効する。ＣＤＲ−Ｈ３（ｇＨ５とｇＨ７）の末端に３個の追加のヒト残基を導入しても、結合に影響はないようである。
【０１２０】
最小数のマウス残基との移植片の組合せ（ｇＬ１ｇＨ７）を選択した。軽鎖移植片ｇＬ１は６個のドナー残基を有する。残基Ｖ２、Ｖ４、Ｌ３７およびＱ４５は、潜在的に重要なパッキング残基である。残基Ｈ３８は、ＶH／ＶL界面に位置する。残基Ｄ６０はＣＤＲ−Ｌ２に近い表面残基であり、抗原結合に直接寄与しうる。これらの残基の中でＶ２、Ｌ３７、Ｑ４５およびＤ６０は、他のサブグループからのヒトカッパ遺伝子の生殖細胞系配列において見い出される。重鎖移植片ｇＨ７は、４個のドナーフレームワーク残基を有する［残基Ｒ２８は、ＣＤＲ移植において使用した構造定義下のＣＤＲ−Ｈ１の一部と考えられる（アデア（Adair）ら（１９９１年、ＷＯ９１／０９９６７）を参照のこと］。残基Ｅ１とＡ７１は、ＣＤＲに近い表面残基である。残基Ｉ４８は潜在的なパッキング残基である。残基Ｔ９３はＶH／ＶL界面に存在する。これらの残基の中で、Ｅ１とＡ７１はヒトサブグループＩの他の生殖細胞系遺伝子に見い出される。残基Ｉ４８はヒト生殖細胞系サブグループ４に見い出され、そしてＴ７３はヒト生殖細胞系サブグループ３に見い出される。
【０１２１】
軽鎖と重鎖両方の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列は、ベクターにより提供される定常領域遺伝子内のイントロンのおよその位置を含めて図１３に示し、そして軽鎖についてはそれぞれ配列番号２９と配列番号２８に、そして重鎖についてはそれぞれ配列番号３１と配列番号３０に与えられる。
【０１２２】
これらの軽鎖と重鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、これらのベクターから切り出した。重鎖ＤＮＡは、５’ＨｉｎｄIII部位で消化し、次に大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）断片で処理することにより、５’平滑末端を作成した。３’ＥｃｏＲＩ部位での切断によりアガロースゲルから精製して、重鎖断片が得られた。同じ方法で軽鎖断片を製造して、５’ＳＦｕＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位で平滑処理した。両方の断片をＤＨＦＲに基づく発現ベクター中にクローン化して、ＣＨＯ細胞に安定な細胞株を作成するために使用した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂリンパ球抗原であるＣＤ２２の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。本発明はまた、この抗体分子の治療的使用とこの抗体分子の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然の抗体分子には、２つの重鎖と２つの軽鎖がある。各重鎖と各軽鎖は、そのＮ末端に可変ドメインを有する。各可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が交互に存在する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。可変ドメイン中の残基は通常、カバト（Kabat）らが作成したシステムに従って番号付けがされている。このシステムは、カバト（Kabat）ら、１９８７、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、米国保健社会福祉省(US Department of Health and Human Services、NIH、USA（以後「カバト（Kabat）ら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、本明細書におけるこの番号付けシステムが使用されている。
【０００３】
カバト（Kabat）残基表記法は、アミノ酸残基の線形の番号付けと必ずしも直接相関しない。実際の線形のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであってもＣＤＲであっても、構造成分の短縮またはそこへの挿入に対応して、厳密なカバト（Kabat）番号付け中より、少ないまたは多いアミノ酸を有する。ある抗体について残基の正しいカバト（Kabat）番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を「標準的」カバト（Kabat）番号付け配列と整列することにより、決定される。
【０００４】
カバト（Kabat）番号付けに従うと、重鎖可変ドメインのＣＤＲは、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）および残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。
【０００５】
カバト（Kabat）番号付けに従うと、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）および残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【０００６】
ＣＤＲ移植抗体の構築は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００に記載されており、これは、部位特異的突然変異誘発により長いオリゴヌクレオチドを使用して、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に移植される方法を開示する。ＣＤＲは抗体の抗体結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域上にある比較的短いペプチド配列である。
【０００７】
ＣＤＲ移植によりモノクローナル抗体をヒト化する初期の研究は、合成抗原（例えばＮＰ）を認識するモノクローナル抗体について行われた。しかし、リゾチームを認識するマウスモノクローナル抗体と、ヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットモノクローナル抗体が、ＣＤＲ移植によりヒト化された例が、それぞれベルホーエン（Verhoeyen）ら（Science, 239, 1534-1536, 1988）と、リーチマン（Riechmann）ら（Nature, 332, 323-324, 1988）により記載されている。
【０００８】
リーチマン（Riechmann）らは、ＣＤＲ単独の移動［カバト（Kabat）（カバト（Kabat）ら（前述）、およびウー（Wu）ら、J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970）］は、ＣＤＲ移植生成物の充分な抗原結合活性を提供するのに充分ではないことを見いだした。多くのフレームワーク残基は、これらが供与体フレームワーク領域のものに対応するように、改変されなければならないことがわかった。改変することが必要なフレームワーク残基を選択するための基準は、国際特許出願ＷＯ９０／０７８６１に記載されている。
【０００９】
ＣＤＲ移植抗体を記載する多くの総説が公表されており、例えばボーガン（Vaughan）ら（Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998）がある。
【００１０】
悪性リンパ腫は、多様な群の新生物である。大部分の症例は老人である。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、現在米国に２００，０００〜２５０，０００人の患者がいる疾患である。これは、米国で２番目に増加率の高い癌であり、毎年約５５，０００症例の速度で増加している。この発症頻度は、人口の高齢化や既知の危険因子への暴露のみでは説明されない速度で上昇している。
【００１１】
リンパ腫の分類は複雑であり、過去数十年間に漸進的に変化してきた。１９９４年に改訂ヨーロッパ−アメリカリンパ腫（ＲＥＡＬ）分類が導入された。この分類は、Ｂ細胞のリンパ腫（最も頻繁に見つかる）、Ｔ細胞のリンパ腫、および分類不可能な起源のリンパ腫とを、認められたサブタイプに分類している。日々の診療において、一般的な組織学的外観に基づくＮＨＬの群別の低、中および高グレードへの分類は、その臨床的挙動を広く反映する。
【００１２】
ＮＨＬは主にリンパ節を冒すが、個々の患者ではこの腫瘍は、体の他の部位（例えば、肝臓、脾臓、骨髄、肺、消化管および皮膚）が関与する。この疾患は通常、無痛のリンパ節の腫脹を示す。リンパ節外リンパ腫は最も頻繁に消化管を冒すが、ほとんどすべての臓器の初期リンパ腫が報告されている。全身症状には、発熱、発汗、疲労、および体重減少がある。
【００１３】
最近まで、完全に疾患の解剖学的程度に基づくアンアーバー（Ann Arbor）ステージ分類システムが、ＮＨＬの治療の主要な決定因子であった。この情報は、追加の予後指標（年齢、血清乳酸脱水素酵素レベル、および動作状態を含む）を取り込むことにより改良される。それでも、アンアーバー（Ann Arbor）ステージ分類システムは、腫瘍の組織学的および免疫学的サブタイプとともに治療の主要な決定因子である。
【００１４】
低グレードＮＨＬは、無痛性の経過をたどり、患者のメジアン生存期間は８〜１０年である。生存は現在利用可能な治療法によりほとんど影響を受けないが、局所的疾患の放射線照射や全身性症状の化学療法は、患者のクオリティオブライフを改善する。疾患の再発には併用化学療法がある。中グレードの疾患と特に高グレードの疾患には、緊急の治療が必要である。非常に大きい疾患の患者では放射線療法が、有効な治療法である。多くの異なる化学療法が使用されており、半分以上の患者で長期の疾患の無い生存が得られている。高用量治療は最初、再発性または抵抗性疾患の患者について導入されたが、現在は低リスク疾患の患者について第一線の治療法としてますます利用されている。ますます攻撃的になっている治療法の最近の傾向は、ＮＨＬ患者の高齢と相対的弱質に対してバランスを取らなければならず、各患者の疾患の個々の予後に治療の毒性を一致させる必要がある。
【００１５】
より有効で良好に許容される改善された治療が必要である。最近導入されたものには、併用療法への取り込みが増加している新しい細胞障害性薬剤、および抗体ベースの治療法の導入がある。
【００１６】
非ホジキンリンパ腫は、一連のＢ細胞リンパ球を包含する。すなわちＢ細胞抗原は、抗体治療法の適当な標的である。
【００１７】
ＣＤ２２は、シアロアドヘシン（sialoadhesin）と呼ぶシアル酸結合タンパク質の群に属する１３５kDaの膜糖タンパク質である。これは、Ｂ細胞発生の初期に細胞質中で検出され、ＩｇＤと同時に細胞表面上に出現し、ほとんどの成熟Ｂ細胞上に見いだされる。Ｂ細胞活性化により発現が上昇する。最終分化によりＣＤ２２は失われ、一般に植物細胞上には存在しないと報告されている。すなわちこのインターナライズ性抗原は、プレＢ細胞と成熟Ｂ細胞の表面には存在するが、幹細胞または植物細胞には存在しない。
【００１８】
ヒトではＣＤ２２の２つのアイソフォームが存在する。優勢な型（ＣＤ２２β）は、細胞外領域中に７つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含有する。ＣＤ２２α変種は、Ｉｇ様ドメイン４が欠如し、末端切断型の細胞質ドメインを有する。単球、好中球、リンパ球および赤血球へのＣＤ２２接着を阻止する抗体は、第１または第２のＩｇ様ドメイン内で結合することが証明されている。
【００１９】
ＣＤ２２の細胞障害性ドメインは、Ｂ細胞抗原受容体の結合によりチロシンリン酸化され、Ｌｙｋ、Ｓｙｋおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼと結合する。ＣＤ２２の機能は、Ｂ細胞活性化閾値を下方に調節することである。これはまた、適切なシアログリコ結合体を有する細胞との相互作用を介して細胞接着を仲介する。
ＣＤ２２はほとんどのＢ細胞白血病とリンパ腫［ＮＨＬ、急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、および特に急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）を含む］で発現される。
【００２０】
ＣＤ２２に対するモノクローナル抗体は、先行技術で記載されている。ＷＯ９８／４１６４１は、ＶH４４とＶL１００にシステイン残基を有する組換え抗ＣＤ２２抗体を記載する。ＷＯ９６／０４９２５は、抗ＣＤ２２抗体ＬＬ２のＶHとＶL領域を記載する。ＵＳ５６８６０７２は、抗ＣＤ２２と抗ＣＤ１９免疫毒素の併用を記載する。ＷＯ９８／４２３７８は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために裸の抗ＣＤ２２抗体の使用を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
多くの抗体ベースの治療薬がライセンス化［例えばリツキサン（Rituxan）、（ＣＤ２０に特異的な非標識キメラヒトγ１（＋ｍγ１Ｖ領域））］されているか、またはこの疾患のために臨床治験中である。これらは、Ｂ細胞の補体性もしくはＡＤＣＣ性死滅、または放射性核種（例えば131Ｉまたは90Ｙ）（これらは臨床家と患者にとって、関連する調製と使用の問題がある）の使用に依存する。繰り返し使用でき、容易にかつ効率的に製造できるＮＨＬを治療するための抗体分子に対するニーズがある。また、ＣＤ２２に対して高い親和性を有し、ヒトでの免疫原性の低い抗体分子に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第１の態様において本発明は、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について、図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、重鎖を含んでなる上記抗体分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、マウスモノクローナル抗体５／４４のＣＤＲのアミノ酸配列を示す（配列番号１〜６）。
【図２】図２は、マウスモノクローナル抗体５／４４の軽鎖可変ドメインの完全な配列を示す。
【図３】図３は、マウスモノクローナル抗体５／４４の重鎖可変ドメインの完全な配列を示す。
【図４】図４は、ＣＤＲ−Ｈ２におけるグリコシル化部位および反応性リジンの除去のための方策を示す。
【図５】図５は、５／４４軽鎖配列のための移植設計図を示す。
【図６】図６は、５／４４重鎖配列のための移植設計図を示す。
【図７】図７は、ベクター：ｐＭＲＲ１４およびｐＭＲＲ１０．１を示す。
【図８】図８は、キメラ５／４４変異体のビアコア（Biacore）アッセイ結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、５／４４ｇＨ１およびｇＬ１遺伝子組立体のためのオリゴヌクレオチドを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、５／４４ｇＨ１およびｇＬ１遺伝子組立体のためのオリゴヌクレオチドを示す。
【図１０】図１０は、中間体ベクター：ｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）およびｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１）を示す。
【図１１】図１１は、さらに別の移植片を作るために使用したオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【図１２】図１２は、蛍光標識マウス５／４４抗体と移植変種との間の競合アッセイを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、移植重鎖と軽鎖の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。
【００２４】
本発明の第１の態様の抗体分子は、重鎖可変ドメインについてＨ１、Ｈ２およびＨ３（配列番号１、配列番号２，および配列番号３）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは抗体分子は、重鎖可変ドメインに少なくとも２つ以上、好ましくは３つのＣＤＲを含む。
【００２５】
本発明の第２の態様において、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、軽鎖を含んでなる上記抗体分子が提供される。
【００２６】
本発明の第２の態様の抗体分子は、軽鎖可変ドメインについてＬ１、Ｌ２およびＬ３（配列番号４、配列番号５、および配列番号６）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは抗体分子は、軽鎖可変ドメインに少なくとも２つ以上、好ましくは３つのＣＤＲを含む。
本発明の第１と第２の態様の抗体分子は、好ましくはそれぞれ相補的軽鎖または相補的重鎖を有する。
【００２７】
好ましくは本発明の第１と第２の態様の抗体分子は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む重鎖と、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列を有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む軽鎖とを含む。
【００２８】
配列番号１〜６に示し上記で図１に示すＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体５／４４から得られる。
【００２９】
マウス５／４４抗体の可変ドメインの完全な配列を、図２（軽鎖）（配列番号７）と図３（重鎖）（配列番号８）に示す。このマウス抗体はまた、以下で「ドナー抗体」または「マウスモノクローナル抗体」と呼ばれる。
【００３０】
本発明の第１と第２の態様の最初の好ましい別の実施態様は、それぞれ図２（配列番号７）と図３（配列番号８）に示される軽鎖と重鎖の可変ドメイン配列を有するマウスモノクローナル抗体５／４４である。５／４４の軽鎖の定常領域はカッパであり、そして重鎖の定常領域はＩｇＧ１である。
【００３１】
第２の好ましい別の実施態様において、本発明の第１と第２の態様のいずれかの抗体はキメラマウス／ヒト抗体分子であり、本明細書ではキメラ５／４４抗体分子と呼ぶ。このキメラ抗体分子は、マウスモノクローナル抗体５／４４の可変ドメイン（配列番号７と８）とヒト定常ドメインを含む。好ましくは、キメラ５／４４抗体分子は、軽鎖にヒトＣカッパドメイン（ヒーター（Hieter）ら、Cell, 22, 197-207, 1980；ジーンバンク（Genebank）受け入れ番号Ｊ００２４１）と、重鎖に（場合により２４１位のセリン残基がプロリン残基により置換されている）ヒトガンマ４ドメイン（フラナガン（Flanagan）ら、Nature, 300, 709-713, 1982）を含む。
【００３２】
好ましくは本発明の抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２’［可能なグリコシル化部位配列が除去されており、かつＣＤ２２抗原に対するキメラ５／４４抗体の親和性を予想外に上昇させ、かつ好ましくはＣＤＲ−Ｈ２としてＨ２’として与えられる配列（配列番号１３）を有する］を含む重鎖を含む。
【００３３】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２”［ＣＤＲ−Ｈ２内の露出部に位置し、かつ結合剤と反応することにより抗原結合親和性を低下させる能力を有すると考えられる６０位のリジン残基が、別のアミノ酸の代わりに使用され、保存性置換となる］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２”として与えられる配列（配列番号１５）を有する。
【００３４】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２'''［可能なグリコシル化部位配列と６０位のリジン残基の両方が、別のアミノ酸の代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２'''として与えられる配列（配列番号１６）を有する。
【００３５】
第３の好ましい別の実施態様では、本発明の第１と第２の態様のいずれかの抗体は、ＣＤＲ移植抗体分子である。「ＣＤＲ移植抗体分子」という用語は、本明細書において使用されるとき、重鎖および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖の可変領域フレームワークに移植された、ドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲ（所望であれば、修飾ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を意味する。
【００３６】
好ましくは、このようなＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域と、さらには１つまたはそれ以上の前記のドナーＣＤＲを含む、可変ドメインを有する。
【００３７】
ＣＤＲが移植されると、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／タイプに関する、マウス、霊長類およびヒトフレームワーク領域を含む、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。本発明において使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（カバト（Kabat）ら（前述））。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは、重鎖に使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖に使用することができ、そしてＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖細胞系配列を使用してもよい。軽鎖に好ましいフレームワーク領域は、図５に示されるヒト生殖細胞系のサブグループ配列（ＤＰＫ９＋ＪＫ１）である（配列番号１７）。重鎖に好ましいフレームワーク領域は、図６に示されるヒトサブグループ配列（ＤＰ７＋ＪＨ４）である（配列番号２１）。
【００３８】
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体の鎖と相同的な鎖を有するものを使用することが好ましい。アクセプターの重鎖と軽鎖は、必ずしも同じ抗体から誘導される必要はなく、所望であれば異なる鎖から誘導されたフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
【００３９】
また、本発明のＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプにとって一般的でない残基を、より高い頻度で存在する残基に変えてもよい。あるいは、アクセプターフレームワーク領域内で選択された残基を、ドナー抗体の同じ位置に見い出される残基に対応するように、またはドナー抗体の同じ位置に見い出される残基への保存的置換である残基に対応するように変えてもよい。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限に保つべきである。変える必要があるアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００４０】
好ましくは本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がヒトサブグループＤＰＫ９＋ＪＫ１配列（図２に示される）（配列番号１７）を有するならば、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、２、４、３７、３８、４５および６０位にドナー残基を含み、そしてさらに３位にドナー残基を含んでいてもよい（カバト（Kabat）ら（前述）による）。
【００４１】
好ましくは本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトＤＰ７＋ＪＨ４配列（図３に示される）（配列番号２１）を有するならば、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１つまたはそれ以上のドナーＣＤＲに加えて、１、２８、４８、７１および９３位にドナー残基を含むことを特徴とし、そしてさらに６７および６９位にドナー残基を含んでいてもよい（カバト（Kabat）（前述）による）。
【００４２】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、元々ＣＤＲが誘導された抗体からの残基である。
【００４３】
好ましくは本発明の抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２’［ＣＤ２２抗原に対するキメラ５／４４抗体の親和性を上昇させるために、可能なグリコシル化部位配列が除去されており、かつ好ましくはＣＤＲ−Ｈ２としてＨ２’として与えられる配列（配列番号１３）を有する］を含む重鎖を含む。
【００４４】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２”［ＣＤＲ−Ｈ２内の露出部に位置し、かつ結合剤と反応することにより抗原結合親和性を低下させる能力を有すると考えられる６０位のリジン残基が、別のアミノ酸の代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２”として与えられる配列（配列番号１５）を有する。
【００４５】
あるいはまたはさらに本発明の抗体は、可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ２（カバト（Kabat）ら（前述）による定義に同じ）としてＨ２'''［可能なグリコシル化部位配列と６０位のリジン残基の両方が、別のアミノ酸に代わりに使用されている］を含む重鎖を含んでいてもよい。好ましくはＣＤＲ−Ｈ２は、Ｈ２'''として与えられる配列（配列番号１６）を有する。
【００４６】
本発明の抗体分子は、以下を含んでいてよい：完全長の重鎖と軽鎖を有する完全な抗体分子；Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｖ断片のような、その断片；軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマー；１本鎖抗体、例えば、重鎖と軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーにより結合している１本鎖Ｆｖ。同様に、重鎖と軽鎖の可変領域は、適宜、他の抗体ドメインと組合せることができる。
【００４７】
本発明の抗体分子は、これに結合したエフェクターまたはレポーター分子を有していてもよい。例えば、共有ブリッジ構造によりこれに結合している重金属原子をキレート化するための大環状化合物、又はリシンのような毒素を有していてもよい。あるいは、組換えＤＮＡ技術の手順を利用することにより、完全な免疫グロブリン分子のＦｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメイン）、ＣＨ２とＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインが、ペプチド結合により置換されているか、または同結合によりそこに結合している抗体分子である、酵素または毒素分子のような機能性の非免疫グロブリンタンパク質を製造することができる。
【００４８】
本発明の抗体分子は、好ましくは少なくとも０．８５×１０-10Ｍ、さらに好ましくは少なくとも０．７５×１０-10Ｍ、そして最も好ましくは少なくとも０．５×１０-10Ｍの結合親和性を有する。
【００４９】
好ましくは、本発明の抗体分子は、軽鎖可変ドメイン５／４４−ｇＬ１（配列番号１９）と重鎖可変ドメイン５／４４−ｇＨ７（配列番号２７）を含む。これらの軽鎖と重鎖の可変ドメインの配列は、それぞれ図５と６に示される。
【００５０】
本発明はまた、ＣＤ２２に対する親和性が改善された本発明の抗体分子の変種に関する。このような変種は、ＣＤＲの突然変異（ヤン（Yang）ら、J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、チェーン・シャッフリング（マークス（Marks）ら、Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（E. coli）のミューテーター株の使用（ロウ（Low）ら、J. Mol. Biol. 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（パッテン（Patten）ら、Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージ提示法（トンプソン（Thompson）ら、J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）およびセクシュアルＰＣＲ（クラメリ（Crameri）ら、Nature, 391, 288-291, 1998）を含む、幾つかの親和性成熟プロトコールにより入手することができる。ボーガン（Vaughan）ら（前述）は、親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【００５１】
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を提供する。
【００５２】
好ましくは、このＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする。
【００５３】
本発明のＤＮＡ配列は、（例えば、化学的処理により製造される）合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはこれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の本発明のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターに関する。好ましくは、このクローニングまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖と重鎖をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。
【００５５】
ベクターを作成することができる一般法であるトランスフェクション法と培養法は、当業者には周知である。この点に関しては「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１９９９、エフ・エム・アウスベル（F.M. Ausubel）（編）、ワイリー・インターサイエンス（Wiley Interscience）、ニューヨーク、およびコールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Publishing）により出版されたマニアティス・マニュアル（Maniatis Manual）を参照されたい。
【００５６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者には周知の方法により入手することができる。例えば、抗体の重鎖と軽鎖の一部または全部をコードするＤＮＡ配列は、要望どおりに決定ＤＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
【００５７】
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く利用可能であり、そしてこれらの既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【００５８】
分子生物学の標準法を利用することにより、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。目的とするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成法を利用して、完全に、または部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を、適宜利用することができる。
【００５９】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌（例えば大腸菌（E. coli））および他の微生物系は、部分的にはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片のような抗体断片、そして特にＦｖ断片および１本鎖抗体断片、例えば１本鎖Ｆｖの発現のために使用することができる。真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の製造のために使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞がある。
【００６０】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養すること、および抗体分子を単離することを特徴とする、本発明の抗体分子の製造方法を提供する。
【００６１】
この抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドだけを含んでいてもよく、この場合、重鎖または軽鎖ポリペプチドだけをコードする配列を使用することにより、宿主細胞をトランスフェクトする必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む産物の製造には、細胞株は２つのベクター（軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター）でトランスフェクトされる。あるいは、軽鎖と重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターである、単一のベクターを使用してもよい。
【００６２】
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組合せて含む、治療用または診断用組成物を提供する。
【００６３】
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合することを特徴とする、治療用または診断用組成物の製造方法を提供する。
【００６４】
この抗体分子は、治療用または診断用組成物の中で唯一の活性成分であっても、あるいは他の抗体成分（例えば、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体）またはキサンチン類のような非抗体成分を含む、他の活性成分を伴ってもよい。
【００６５】
薬剤組成物は、好ましくは治療上有効量の本発明の抗体を含む。「治療上有効量」という用語は、本明細書において使用されるとき、標的とする疾患または症状を治療、改善または予防するために、あるいは検出可能な治療または予防効果を示すために必要な治療剤の量を意味する。任意の抗体について、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類）のいずれかにおいて推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与の経路を決定するために使用してもよい。そしてこのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与の経路を決定するために使用することができる。
【００６６】
ヒト対象に対する正確な有効量は、病状の重篤度、対象の全般的な健康度、対象の年齢、体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤併用、反応感度、および治療法に対する耐性／応答性に依存する。この量は日常的な実験により決定することができ、そして臨床医の判断の範囲内である。一般に有効用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇであろう。
【００６７】
組成物は、個別に患者に投与しても、または他の物質、薬物またはホルモンと組合せて投与してもよい。
【００６８】
本発明の抗体分子が投与される用量は、処置すべき症状の性質、悪性リンパ腫または白血病の悪性度によって、また抗体分子が予防的に使用されるか、または存在する症状を治療するために使用されるかによって異なる。
【００６９】
投与の頻度は、抗体分子の半減期およびその作用時間に依存しよう。抗体分子の半減期が短ければ（例えば、２〜１０時間）、１日に１回またはそれ以上の投与が必要となろう。あるいは、抗体の半減期が長ければ（例えば、２〜１５日間）、１日に１回、１週間に１回または場合によっては１ないし２ヶ月毎に１回の投与しか必要でないかもしれない。
【００７０】
薬剤組成物はまた、抗体の投与のために薬剤学的に許容される担体を含んでいてもよい。担体はそれ自体が、組成物を投与される個人に有害な抗体の産生を誘導してはならず、また毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活化ウイルス粒子のような、大きくゆっくり代謝される高分子である。
【００７１】
薬剤学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩のような鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩を使用することができる。
【００７２】
治療用組成物中の薬剤学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含んでいてもよい。さらに湿潤剤または乳化剤のような助剤物質が、このような組成物中に存在してもよい。このような担体により薬剤組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として処方することができる。
【００７３】
投与に好ましい剤形は、非経口投与に適した剤形（例えば、注射または点滴による、例えばボーラス注射または持続点滴による）を含む。製品が注射または点滴用である場合、これは油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液の形をとってよく、そして懸濁剤、保存料、安定剤および／または分散剤のような処方用剤を含んでいてもよい。あるいは抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体で復元するための乾燥剤形にしてもよい。
【００７４】
一旦処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。処置する対象は動物であってもよい。しかし組成物はヒト対象への投与に適合させるのが好ましい。
【００７５】
本発明の薬剤組成物は、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸内経路をはじめとする、あらゆる経路により投与することができる。本発明の薬剤組成物を投与するために、ハイポスプレーも使用することができる。典型的にはこの治療用組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注射用として調製することができる。注射の前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するための固体剤形もまた調製することができる。
【００７６】
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内への注射により、あるいは組織の間質腔へ送達される注射により達成されよう。組成物はまた、病変部に投与することができる。投薬処置は、単回投与計画であってもまたは多回投与計画であってもよい。
【００７７】
組成物中の活性成分が１つの抗体分子であることは理解されるであろう。それ自体が胃腸管内で分解を受けやすいであろう。すなわち組成物が胃腸管を利用する経路により投与されるなら、この組成物は抗体を分解から防御するが、一旦これが胃腸管から吸収されると、抗体を放出する物質を含む必要があろう。
【００７８】
薬剤学的に許容される担体の網羅的な考察は、レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック出版社（Mack Publishing Company）、ニュージャージー州、１９９１年）にある。
【００７９】
また、本発明の抗体が遺伝子治療の利用により投与されることも企図される。これを達成するために、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現しかつその場で組立てられるように、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入される。
【００８０】
本発明はまた、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療に使用するための、本発明の抗体分子を提供する。
【００８１】
本発明はさらに、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療用の医薬の製造における本発明の抗体分子の使用法を提供する。
【００８２】
本発明の抗体分子は、ヒトまたは動物体内に存在する、ＣＤ２２を発現する細胞のレベルを低下させることが望まれる、任意の療法に利用することができる。これらのＣＤ２２発現細胞は、体内を循環しているかまたは体内の特定部位に望ましくなく高レベルに局在している。例えば高レベルのＣＤ２２を発現する細胞は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病に存在するであろう。本発明の抗体分子は、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する疾患の治療において利用することができる。
【００８３】
本発明の抗体分子は、好ましくは悪性リンパ腫および白血病、最も好ましくはＮＨＬの治療のために使用される。
【００８４】
本発明はまた、ＣＤ２２を発現する細胞が介在する障害に罹患しているか、そのリスクのあるヒトまたは動物対象の治療方法であって、対象に有効量の本発明の抗体分子を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００８５】
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば、ＣＤ２２を発現する細胞が関わる病状のインビボ診断およびイメージングにも使用することができる。
【００８６】
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例において例示のためだけに説明される。
【００８７】
発明の詳細な説明
実施例１：候補抗体の生成
以下の選択基準を利用して、ＣＤ２２に対する抗体の一団をハイブリドーマから選択した：ダウディ（Daudi）細胞への結合、ダウディ細胞でのインターナリゼーション、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合、ＰＢＭＣでのインターナリゼーション、親和性（１０-9Ｍを超える）、マウスγ１および産生速度。５／４４を好ましい抗体として選択した。
【００８８】
実施例２：キメラ５／４４抗体分子の遺伝子クローニングおよび発現
５／４４ハイブリドーマ細胞の調製およびそこからのＲＮＡ調製
【００８９】
ハイブリドーマ５／４４は、ヒトＣＤ２２タンパク質でマウスを免疫後、従来のハイブリドーマ法により生成した。ＲＮＡは、５／４４ハイブリドーマ細胞から、ＲＮイージー（RNEasy）キット（キアゲン（Qiagen）、クローリー（Crawley）、英国；カタログ番号７４１０６）を用いて調製した。得られたＲＮＡは、後述するようにｃＤＮＡに逆転写した。
【００９０】
ＮＨＬ腫瘍でのＣＤ２２の分布
５／４４抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を用いる染色の出現率と分布を調べるために免疫組織化学試験に着手した。腫瘍のＢ細胞領域を確認するために、試験には対照の抗ＣＤ２０および抗ＣＤ７９ａ抗体を含めた。
【００９１】
全部で５０個の腫瘍を試験して、ワーキング・フォーミュレーション（Working Formulation）分類およびＲＥＡＬ分類システムを用いることにより、これらを以下のとおり類別した：
【００９２】
・ ７個 Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫（高／Ｉ）
・ ４個 Ｂ−ＣＬＬ／小リンパ球性リンパ腫（低／Ａ）
・ ３個 リンパ形質細胞様／免疫細胞腫（低／Ａ）
・ １個 外套細胞（中／Ｆ）
・ １４個 濾胞性リンパ腫（低〜中／Ｄ）
・ １３個 びまん性大細胞型リンパ腫（中〜高／Ｇ、Ｈ）
・ ６個 分類不能（Ｋ）
・ ２個 Ｔ細胞リンパ腫
【００９３】
４０個のＢ細胞リンパ腫は、５／４４抗体では０．１μｇ／ｍｌでＣＤ２２抗原に対して陽性であり、そして濃度が０．５μｇ／ｍｌまで上昇すると、さらに６個が陽性になった。０．１μｇ／ｍｌで陰性であった残り２個のＢ細胞腫瘍では、より高濃度で試験するには残った組織が不充分であった。しかし、５／４４よりも強い染色が得られた、別のセルテック（Celltech）抗ＣＤ２２抗体６／１３による並行試験では、４８個全部のＢ細胞リンパ腫がＣＤ２２に対して染色陽性になった。
【００９４】
すなわち、ＣＤ２２抗原は、Ｂ細胞リンパ腫で広く発現されており、よってＮＨＬにおける免疫療法の適切な標的を与えると結論づけることができる。
【００９５】
５／４４ＶHおよびＶLのＰＣＲクローニング
５／４４重鎖と軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡ配列は、逆転写酵素を用いて全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡコピーを生成させることにより合成した。次にこれを、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（ＰＣＲ）による特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてマウスＶ領域配列の増幅のための鋳型として使用した。
【００９６】
ａ） ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡは、以下の試薬：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、２０単位のＲＮＡｓｉｎ、７５ｎｇランダムヘキサヌクレオチドプライマー、２μｇの５／４４ＲＮＡおよび２００単位のマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素を含む２０μｌの反応容量中で合成した。４２℃で６０分間インキュベート後、９５℃で５分間加熱して、反応を停止させた。
【００９７】
ｂ） ＰＣＲ
ｃＤＮＡのアリコートを、重鎖と軽鎖に特異的なプライマーの組合せを用いるＰＣＲにかけた。シグナルペプチドの保存配列とアニーリングするために設計された変性したプライマープールを前進プライマーとして使用した。これらの配列は全て、順に、５’末端から７ヌクレオチドで開始する制限部位（ＶLＳＦｕＩ；ＶHＨｉｎｄIII）、生じたｍＲＮＡの最適な翻訳を可能にする配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号５０）、開始コドン、および既知のマウス抗体のリーダーペプチド配列に基づく２０〜３０ヌクレオチドを含む（カバト（Kabat）ら、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第５版、１９９１年、米国保健社会福祉省（U.S. Department of Health and Human Services）、公衆衛生局（Public Health Service）、国立衛生研究所（National Institutes of Health））。
【００９８】
３’プライマーは、抗体のフレームワーク４ Ｊ−Ｃ接合部に及び、ＶLＰＣＲ断片のクローニングを促進するために酵素ＢｓｉＷＩの制限部位を含むように設計される。重鎖３’プライマーは、抗体のＪ−Ｃ接合部に及ぶように設計された混合物である。この３’プライマーは、クローニングを促進するためにＡｐａＩ制限部位を含む。プライマーの３’領域は、既知のマウス抗体に見い出された配列に基づく混合配列を含む（カバト（Kabat）ら、１９９１、前述）。
【００９９】
上述のプライマーの組合せにより、ＶHとＶ１のＰＣＲ産物を適切な発現ベクター（以下を参照のこと）中に直接クローン化して、キメラ（マウス−ヒト）重鎖と軽鎖を産生することができ、そしてこれらの遺伝子を哺乳動物細胞で発現させて、目的のアイソタイプのキメラ抗体を産生することができる。
【０１００】
ＰＣＲのためのインキュベーション（１００μl）は以下のとおり設定した。各反応液は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ｗ／ｖゼラチン、０．２５ｍＭ各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１０ｐｍｏｌ ５’プライマー混合物、１０ｐｍｏｌ ３’プライマー、１μｌ ｃＤＮＡおよび１単位Ｔａｑポリメラーゼを含有した。反応液を９５℃で５分間インキュベートし、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルにかけた。３０サイクル後、各反応液のアリコートを、アガロースゲルで電気泳動して分析した。
【０１０１】
重鎖Ｖ領域については、フレームワークＩの開始点内のプライマープールアニーリングが、シグナルペプチドプライマープールを置換すると、増幅ＤＮＡ産物だけが得られた。この断片をＤＮＡ配列決定ベクター中にクローン化した。ＤＮＡ配列を決定して翻訳することにより、推定アミノ酸配列が得られた。この推定配列は、実験的に求めたＮ末端タンパク質配列を参照することにより証明した。図２と３は、それぞれマウスモノクローナル抗体５／４４の成熟軽鎖と重鎖のＶ領域のＤＮＡ／タンパク質配列を示す。
【０１０２】
ｃ） ＰＣＲ断片の分子クローニング
次にマウスＶ領域配列を、発現ベクターｐＭＲＲ１０．１およびｐＭＲＲ１４中にクローン化した（図７）。これらは、ヒトカッパ軽鎖とヒトガンマ−４重鎖の定常領域をコードするＤＮＡを含む、それぞれ軽鎖と重鎖の発現用のベクターである。ＶL領域は、ＳｆｕＩとＢｓｉＷＩ制限部位を用いて、配列決定ベクターからの制限消化と連結により、発現ベクター中にサブクローン化して、プラスミドｐＭＲＲ１０（５４４ｃＬ）を作成した。重鎖ＤＮＡは、５’プライマーを用いてＰＣＲにより増幅することによりシグナルペプチドを導入したが、これは、異なる社内のハイブリドーマ（１６２と呼ばれる）からのマウス重鎖抗体リーダーを使用したクローニング方策では得られなかったためである。５’プライマーは、以下の配列を有する：
【０１０３】
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' （配列番号１）
【０１０４】
逆進プライマーは、元々のＶH遺伝子クローニングに使用したものと同一であった。生じたＰＣＲ産物を酵素のＨｉｎｄIIIとＡｐａＩで消化してサブクローン化し、そしてそのＤＮＡ配列を確認してプラスミドｐＭＲＲ１４（５４４ｃＨ）を作成した。ＣＨＯ細胞への両方の発現ベクターの一過性同時トランスフェクションによって、キメラｃ５／４４抗体を作成した。これは、リポフェクタミン試薬を製造業者のプロトコールにより用いて達成した（インビトロジェン：ライフテクノロジー（In Vitrogen:Life Technology）、フローニンゲン、オランダ、カタログ番号１１６６８−０２７）。
【０１０５】
グリコシル化部位と反応性リジンの除去
可能なＮ結合グリコシル化部位配列は、アミノ酸配列Ｎ−Ｙ−Ｔを有するＣＤＲ−Ｈ２に観察された（図３）。５／４４およびその断片（Ｆａｂを含む）のゲルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングおよび炭水化物染色は、この部位が実際にグリコシル化されていることを示している（図示せず）。さらにリジン残基は、ＣＤＲ−Ｈ２内の露出位置に観察されたが、これは、抗体が結合体形成しうる物質との結合体形成のための追加の部位を提供することにより、抗体の結合親和性を低下させる潜在力を有する。
【０１０６】
図４に示されるように、ＰＣＲ方策を利用することにより、グリコシル化部位および／または反応性リジンを除去するために、ＣＤＲ−Ｈ２配列中にアミノ酸置換を導入した。突然変異Ｎ５５Ｑ、Ｔ５７ＡまたはＴ５７Ｖをコードする前進プライマーを使用することにより、グリコシル化部位を除去し（図４）、そして置換Ｋ６０Ｒを含む第４の前進プライマーを作成することにより、反応性リジン残基を除去した（図４）。フレームワーク４の逆進プライマーを、これらのＰＣＲ増幅のそれぞれにおいて使用した。ＰＣＲ産物を酵素ＸｂａＩとＡｐａＩで消化して、ｐＭＲＲ１４（５４４ｃＨ）（これもＸｂａＩとＡｐａＩで切断）中に挿入することにより、これらの変異体をコードする発現プラスミドを作成した。Ｎ５５Ｑ、Ｔ５７ＡおよびＴ５７Ｖ突然変異は、アミノ酸配列をコンセンサスＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓから変化させることにより、グリコシル化部位を切断するが、一方Ｋ６０Ｒ突然変異は、潜在的に反応性のリジンを同様に正に荷電した残基のアルギニンで置換する。生じたｃＨ変種プラスミドを、ｃＬプラスミドと共に同時トランスフェクトすることにより、発現されたキメラ抗体変種を作成した。
【０１０７】
キメラ遺伝子の活性の評価
キメラ遺伝子の活性は、ＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションにより評価した。
【０１０８】
ｃ） ビアコア（BiaCore）分析による親和定数の決定
グリコシル化部位または反応性リジンを除去したキメラ５／４４またはその変種の親和性は、ＣＤ２２−ｍＦｃ構築体への結合についてＢＩＡ法を用いて調査した。結果を図８に示す。全ての結合測定は、ＢＩＡコア（BIAcore）（登録商標）２０００機器（ファルマシア・バイオセンサー（Pharmacia Biosensor AB）、ウプサラ、スウェーデン）で実施した。このアッセイは、固定化抗マウスＦｃを介したＣＤ２２ｍＦｃの捕捉により実施した。抗体は可溶性相に入れた。試料、標準物質、および対照（５０ｕｌ）を固定化抗マウスＦｃに注入し、続いて可溶性相の抗体を加えた。各サイクル後に、表面を５０ｕｌの４０ｍＭ ＨＣｌで３０ｕｌ／分で再生した。反応速度分析は、ＢＩＡ評価３．１ソフトウェア（ファルマシア（Pharmacia））を用いて実施した。
【０１０９】
構築体Ｔ５７Ａのグリコシル化部位を除去すると、キメラ５／４４に比較してオンレートがわずかに速くなりオフレートが有意に遅くなり、約５倍の親和性改善があった。Ｎ５５Ｑ突然変異は、親和性に影響しなかった。この結果は、炭水化物自体の除去が（Ｎ５５Ｑの変化のように）恐らく結合に影響しないことを示唆するため、予想外であった。親和性の改善は、Ｔ５７Ａの変化でのみ観察された。１つの可能な説明は、炭水化物の存在に関わりなくトレオニンからアラニンへの変換で除去される５７位のトレオニンが、負の作用を及ぼしているということである。アラニンのサイズが小さいことが重要であり、そしてトレオニンの負の作用がそのサイズに関係しているという仮説は、Ｔ５７Ｖ突然変異を用いて得られた結果から支持される：５７位のバリンでの置換は効果がない（結果は示していない）。
【０１１０】
Ｋ６０Ｒ突然変異によるリジンの除去は、親和性に中立的効果であった、すなわちアルギニンの導入は、親和性を傷つけることなく可能な反応性部位を除去する。
【０１１１】
したがって、グリコシル化部位の除去および反応性リジンの除去のための突然変異は、両方ともヒト化設計に含まれた。
【０１１２】
実施例２：５／４４のＣＤＲ移植
５／４４抗体の重鎖と軽鎖の可変領域の遺伝子の分子クローニング、およびキメラ（マウス／ヒト）５／４４抗体を産生するためのその使用を上記した。マウス５／４４のＶLおよびＶHドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図２と３に示される（配列番号７と８）。この実施例は、アデア（Adair）ら（ＷＯ９１／０９９６７）の方法による、ヒトにおける潜在的な免疫原性を低下させるためのヒトフレームワークへの５／４４抗体のＣＤＲ移植を説明する。
【０１１３】
５／４４軽鎖のＣＤＲ移植
ヒトサブグループＩカッパ軽鎖Ｖ領域からのコンセンサス配列とのタンパク質配列の整列は、６４％の配列同一性を示した。その結果、ＣＤＲ移植軽鎖を作成するために選択したアクセプターフレームワーク領域は、ヒトＶＫサブグループＩ生殖細胞系Ｏ１２、ＤＰＫ９配列のものに対応した。フレームワーク４のアクセプター配列は、ヒトＪ領域生殖細胞系配列ＪＫ１から誘導した。
【０１１４】
マウス５／４４のフレームワーク領域のアミノ酸配列とアクセプター配列との比較は図５に示し、ドナーとアクセプター鎖の間に２７個の違いがあることを示している。各位置で、パッキングに及ぼす作用、またはＶH／ＶL界面での作用を介して直接または間接に抗原結合に寄与するマウス残基の可能性について分析を行った。マウス残基が重要であり、かつサイズ、極性または電荷に関してヒト残基と充分に異なると考えられたならば、そのマウス残基は保持した。この分析に基づき配列番号１９と配列番号２０（図５）に与えられる配列を有する、２つのバージョンのＣＤＲ移植軽鎖を作成した。
【０１１５】
５／４４重鎖のＣＤＲ移植
５／４４重鎖のＣＤＲ移植は、軽鎖に関して記述されたものと同じ方策を用いて行った。５／４４重鎖のＶドメインは、サブグループＩに属するヒト重鎖と相同である（７０％の配列同一性）ことが見い出されたため、ヒトサブグループＩ生殖細胞系フレームワークＶＨ１−３、ＤＰ７の配列をアクセプターフレームワークとして使用した。フレームワーク４アクセプター配列は、ヒトＪ領域生殖細胞系配列ＪＨ４から誘導した。
【０１１６】
５／４４重鎖とフレームワーク領域との比較を図６に示すが、これは、５／４４重鎖がアクセプター配列と２２個の位置で異なることを示す。これらのいずれかが抗原結合に及ぼす寄与の分析によって、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に与えられる配列を有する５つのバージョンのＣＤＲ移植重鎖を構築した（図６）。
【０１１７】
移植配列のための遺伝子の構築
遺伝子は、移植配列ｇＨ１とｇＬ１をコードするように設計し、一連の重複オリゴヌクレオチドを設計し構築した（図９）。ＰＣＲ組立法を利用することにより、ＣＤＲ移植Ｖ領域遺伝子を作成した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、０．２５ｍＭ各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１ｐｍｏｌ各「内部」プライマー（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）、１０ｐｍｏｌ各「外部」プライマー（Ｆ１、Ｒ１）、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（アンプリＴａｑ（AmpliTaq）、アプライド・バイオシステムズ（Applied BioSystems）、カタログ番号Ｎ８０８−０１７１）を含む、１００ｕｌの反応容量を設定した。ＰＣＲサイクルパラメータは、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクルであった。次に反応産物を１．５％アガロースゲルに流して、切り出し、キアゲン（QIAGEN）スピンカラム（ＱＩＡクイック（QIAquick）ゲル抽出キット、カタログ番号２８７０６）を用いて回収した。ＤＮＡを３０μlの容量で溶出した。次にｇＨ１とｇＬ１ ＤＮＡのアリコート（１μｌ）を、インビトロジェン（InVitrogen）ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（カタログ番号Ｋ４５００−０１）中に製造業者の説明書によってクローン化した。この非発現ベクターは、多数のクローンの配列決定を促進するためのクローニング中間体の役目を果たした。ベクター特異的プライマーを用いるＤＮＡ配列決定を使用することにより、ｇＨ１とｇＬ１を含む誤りのないクローンを同定して、プラスミドｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）とｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１）を作成した（図１０）。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドカセット置換法を使用することにより、ヒト化移植片ｇＨ４、５、６および７、並びにｇＬ２を作成した。図１１は、オリゴヌクレオチドカセットの設計図を示す。各変種を作成するために、ベクター（ｐＣＲ２．１（５４４ｇＨ１）またはｐＣＲ２．１（５４４ｇＬ１））を、記載のように制限酵素で切断した（重鎖にはＸｍａＩ／ＳａｃII、軽鎖にはＸｍａＩ／ＢｓｔＥII）。大きなベクター断片をアガロースからゲル精製して、オリゴヌクレオチドカセットとの連結に使用した。これらのカセットは、２個の相補的オリゴヌクレオチドからなり（図１１に示される）、０．５ＰＭＯＬ／ΜＬの濃度で２００ΜＬの容量（１２．５ＭＭトリス−ＨＣＬ（ＰＨ７．５）、２．５ＭＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５ｍＭジチオエリトリトール）中で混合される。アニーリングは、水浴（容量５００ｍｌ）中で３分間９５℃まで加熱し、次に反応液を室温までゆっくり冷却させることにより行った。次にアニーリングしたオリゴヌクレオチドカセットを水で１０倍希釈し、次いで適切に切断したベクター中に連結した。ＤＮＡ配列決定を利用することにより正しい配列を確認して、プラスミドｐＣＲ２．１（５／４４−ｇＨ４−７）とｐＣＲ２．１（５／４４−ｇＬ２）を作成した。次に証明した移植配列を発現ベクターｐＭＲＲ１４（重鎖）とｐＭＲ１０．１（軽鎖）中にサブクローン化した。
【０１１９】
ＣＤＲ移植配列のＣＤ２２結合活性
移植変種をコードするベクターを、元々のキメラ抗体鎖と一緒に種々の組合せでＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトした。結合活性は、元々のマウス５／４４抗体の結合をラモス（Ramos）細胞（ＡＴＣＣから入手；表面ＣＤ２２を発現するバーキット（Burkitt's）リンパ腫リンパ芽球ヒト細胞株）への結合に関して競合させて、競合アッセイで比較した。このアッセイは、移植片をその細胞表面ＣＤ２２に結合する能力において比較するための最良の方法と考えられた。結果を図８に示す。明らかなように、移植片のいずれの間にもほとんど差がなく、全てがマウスの親に対する競合でキメラより有効に奏効する。ＣＤＲ−Ｈ３（ｇＨ５とｇＨ７）の末端に３個の追加のヒト残基を導入しても、結合に影響はないようである。
【０１２０】
最小数のマウス残基との移植片の組合せ（ｇＬ１ｇＨ７）を選択した。軽鎖移植片ｇＬ１は６個のドナー残基を有する。残基Ｖ２、Ｖ４、Ｌ３７およびＱ４５は、潜在的に重要なパッキング残基である。残基Ｈ３８は、ＶH／ＶL界面に位置する。残基Ｄ６０はＣＤＲ−Ｌ２に近い表面残基であり、抗原結合に直接寄与しうる。これらの残基の中でＶ２、Ｌ３７、Ｑ４５およびＤ６０は、他のサブグループからのヒトカッパ遺伝子の生殖細胞系配列において見い出される。重鎖移植片ｇＨ７は、４個のドナーフレームワーク残基を有する［残基Ｒ２８は、ＣＤＲ移植において使用した構造定義下のＣＤＲ−Ｈ１の一部と考えられる（アデア（Adair）ら（１９９１年、ＷＯ９１／０９９６７）を参照のこと］。残基Ｅ１とＡ７１は、ＣＤＲに近い表面残基である。残基Ｉ４８は潜在的なパッキング残基である。残基Ｔ９３はＶH／ＶL界面に存在する。これらの残基の中で、Ｅ１とＡ７１はヒトサブグループＩの他の生殖細胞系遺伝子に見い出される。残基Ｉ４８はヒト生殖細胞系サブグループ４に見い出され、そしてＴ７３はヒト生殖細胞系サブグループ３に見い出される。
【０１２１】
軽鎖と重鎖両方の完全長ＤＮＡおよびタンパク質配列は、ベクターにより提供される定常領域遺伝子内のイントロンのおよその位置を含めて図１３に示し、そして軽鎖についてはそれぞれ配列番号２９と配列番号２８に、そして重鎖についてはそれぞれ配列番号３１と配列番号３０に与えられる。
【０１２２】
これらの軽鎖と重鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、これらのベクターから切り出した。重鎖ＤＮＡは、５’ＨｉｎｄIII部位で消化し、次に大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）断片で処理することにより、５’平滑末端を作成した。３’ＥｃｏＲＩ部位での切断によりアガロースゲルから精製して、重鎖断片が得られた。同じ方法で軽鎖断片を製造して、５’ＳＦｕＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位で平滑処理した。両方の断片をＤＨＦＲに基づく発現ベクター中にクローン化して、ＣＨＯ細胞に安定な細胞株を作成するために使用した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、重鎖を含んでなる上記抗体分子
【請求項２】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、軽鎖を含んでなる上記抗体分子。
【請求項３】
可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２もしくは配列番号１３もしくは配列番号１５もしくは配列番号１６、またはＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、重鎖と、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５、またはＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、軽鎖とを含んでなる、請求項１または請求項２の抗体分子。
【請求項４】
ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２もしくは配列番号１３もしくは配列番号１５もしくは配列番号１６、ＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５、およびＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６を含む、請求項３の抗体分子。
【請求項５】
ＣＤＲ移植抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体分子。
【請求項６】
可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域と非ヒトドナーＣＤＲとを含む、請求項５の抗体分子。
【請求項７】
重鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、サブグループＩコンセンサス配列に基づき、配列番号８の位置の残基に対応する１、２８、４８、７１および９３位にドナー残基を含む、請求項６の抗体分子。
【請求項８】
配列番号８の位置の残基に対応する６７と６８位にドナー残基をさらに含む、請求項７の抗体分子。
【請求項９】
軽鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、サブグループＩコンセンサス配列に基づき、配列番号７の位置の残基に対応する２、４、３７、３８、４５および６０位にドナー残基を含む、請求項６〜８のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１０】
配列番号７の位置の残基に対応する３位にドナー残基をさらに含む、請求項９の抗体分子。
【請求項１１】
請求項７または請求項８の重鎖と、請求項９または請求項１０の軽鎖とを含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１２】
軽鎖可変領域５／４４−ｇＬ１（配列番号１９）と重鎖可変領域５／４４−ｇＨ７（配列番号２７）とを含む、請求項１〜１１のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１３】
軽鎖の配列は配列番号２８に示す配列を含むことを特徴とする軽鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１４】
軽鎖の配列は配列番号２８に示す配列からなることを特徴とする軽鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１５】
重鎖の配列は配列番号３０に示す配列を含むことを特徴とする重鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１６】
重鎖の配列は配列番号３０に示す配列からなることを特徴とする重鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１７】
配列番号２８に示す配列を含むことを特徴とする軽鎖と、配列番号３０に示す配列を含むことを特徴とする重鎖とを有する、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１８】
配列番号２８に示す配列からなることを特徴とする軽鎖と、配列番号３０に示す配列からなることを特徴とする重鎖とを有する、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１９】
ＣＤ２２に対する改良された親和性を有する、請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子の変種。
【請求項２０】
親和性成熟プロトコールにより得られる、請求項１９の変種。
【請求項２１】
マウス抗ＣＤ２２モノクローナル抗体５／４４である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体であって、軽鎖の可変ドメインは配列番号７に示す配列を有し、重鎖の可変ドメインは配列番号８に示す配列を有する、上記抗体。
【請求項２２】
それぞれ配列番号７と配列番号８に記載の、請求項２１のモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインの配列を含むキメラ抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２３】
ドナーＣＤＲの欠失部分は異なる配列により置換され、機能性ＣＤＲを形成する、末端切断型ドナーＣＤＲ配列を含むハイブリッドＣＤＲを含んでなる抗体分子。
【請求項２４】
ＣＤＲ配列の欠失部分は、抗体分子のフレームワーク領域が得られる抗体からである、請求項２３の抗体分子。
【請求項２５】
ＣＤＲ配列の欠失部分は、コンセンサスフレームワーク領域を有する生殖細胞系抗体からである、請求項２４の抗体分子。
【請求項２６】
重鎖のＣＤＲ−Ｈ２は抗体分子中のハイブリッドである、請求項２３〜２５のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２７】
ドナーＣＤＲの末端切断は１〜８個のアミノ酸である、請求項２３〜２６のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２８】
末端切断は４〜６個のアミノ酸である、請求項２７の抗体分子。
【請求項２９】
末端切断はＣＤＲのＣ末端で行われる、請求項２３〜２８のいずれか１項の抗体分子。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３１】
請求項３０のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、または治療で使用される請求項３０のＤＮＡ配列。
【請求項３４】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、またはＣＤ２２を発現する細胞により仲介される病態を治療するのに使用される請求項３０のＤＮＡ配列。
【請求項３５】
請求項３３または請求項３４の抗体分子、または悪性リンパ腫を治療するのに使用される請求項３３または請求項３４のＤＮＡ配列。
【請求項３６】
悪性リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である、請求項３５の抗体分子またはＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ＣＤ２２を発現する細胞により仲介される病態の治療のために薬剤の製造における、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、または請求項３０のＤＮＡ配列の使用。
【請求項３８】
病態は悪性リンパ腫である、請求項３７の使用。
【請求項３９】
病態は非ホジキンリンパ腫である、請求項３８。
【請求項４０】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子または請求項３０のＤＮＡ配列を含む治療用または診断用組成物。
【請求項４１】
薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、請求項４０の治療用または診断用組成物。
【請求項４２】
抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ、または抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンのような非抗体成分をさらに含む、請求項４０または請求項４１の治療用または診断用組成物。
【請求項４３】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子の製造方法であって、該抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下で請求項３２の宿主細胞を培養し、該抗体分子を単離することを特徴とする、上記方法。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合することを特徴とする、請求項４０〜４２のいずれか１項の治療用または診断用組成物の調製法。
【請求項４５】
配列番号１〜２８または配列番号３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について図１にＨ１として示す配列（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２について図１にＨ２として示す配列（配列番号２）または可能なグリコシル化部位が除去されているＨ２、６０位（カバト（Kabat）の番号付けシステムに従って）のリジン残基が別のアミノ酸で置換されているＨ２、またはグリコシル化部位と６０位の反応性リジンの両方が除去されているＨ２として示す配列、またはＣＤＲ−Ｈ３について図１（配列番号３）にＨ３として示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲ［カバト（Kabat）ら（前述）が定義したように］を含む、重鎖を含んでなる上記抗体分子
【請求項２】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について図１にＬ１として示す配列（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２について図１にＬ２として示す配列（配列番号５）またはＣＤＲ−Ｌ３について図１（配列番号６）にＬ３として示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、軽鎖を含んでなる上記抗体分子。
【請求項３】
可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２もしくは配列番号１３もしくは配列番号１５もしくは配列番号１６、またはＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、重鎖と、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５、またはＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示す配列の少なくとも１つを有するＣＤＲを含む、軽鎖とを含んでなる、請求項１または請求項２の抗体分子。
【請求項４】
ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２もしくは配列番号１３もしくは配列番号１５もしくは配列番号１６、ＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５、およびＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６を含む、請求項３の抗体分子。
【請求項５】
ＣＤＲ移植抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体分子。
【請求項６】
可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域と非ヒトドナーＣＤＲとを含む、請求項５の抗体分子。
【請求項７】
重鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、サブグループＩコンセンサス配列に基づき、配列番号８の位置の残基に対応する１、２８、４８、７１および９３位にドナー残基を含む、請求項６の抗体分子。
【請求項８】
配列番号８の位置の残基に対応する６７と６８位にドナー残基をさらに含む、請求項７の抗体分子。
【請求項９】
軽鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、サブグループＩコンセンサス配列に基づき、配列番号７の位置の残基に対応する２、４、３７、３８、４５および６０位にドナー残基を含む、請求項６〜８のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１０】
配列番号７の位置の残基に対応する３位にドナー残基をさらに含む、請求項９の抗体分子。
【請求項１１】
請求項７または請求項８の重鎖と、請求項９または請求項１０の軽鎖とを含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１２】
軽鎖可変領域５／４４−ｇＬ１（配列番号１９）と重鎖可変領域５／４４−ｇＨ７（配列番号２７）とを含む、請求項１〜１１のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１３】
軽鎖の配列は配列番号２８に示す配列を含むことを特徴とする軽鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１４】
軽鎖の配列は配列番号２８に示す配列からなることを特徴とする軽鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１５】
重鎖の配列は配列番号３０に示す配列を含むことを特徴とする重鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１６】
重鎖の配列は配列番号３０に示す配列からなることを特徴とする重鎖を含む、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１７】
配列番号２８に示す配列を含むことを特徴とする軽鎖と、配列番号３０に示す配列を含むことを特徴とする重鎖とを有する、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１８】
配列番号２８に示す配列からなることを特徴とする軽鎖と、配列番号３０に示す配列からなることを特徴とする重鎖とを有する、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する抗体分子。
【請求項１９】
ＣＤ２２に対する改良された親和性を有する、請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子の変種。
【請求項２０】
親和性成熟プロトコールにより得られる、請求項１９の変種。
【請求項２１】
マウス抗ＣＤ２２モノクローナル抗体５／４４である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体であって、軽鎖の可変ドメインは配列番号７に示す配列を有し、重鎖の可変ドメインは配列番号８に示す配列を有する、上記抗体。
【請求項２２】
それぞれ配列番号７と配列番号８に記載の、請求項２１のモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインの配列を含むキメラ抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２３】
ドナーＣＤＲの欠失部分は異なる配列により置換され、機能性ＣＤＲを形成する、末端切断型ドナーＣＤＲ配列を含むハイブリッドＣＤＲを含んでなる抗体分子。
【請求項２４】
ＣＤＲ配列の欠失部分は、抗体分子のフレームワーク領域が得られる抗体からである、請求項２３の抗体分子。
【請求項２５】
ＣＤＲ配列の欠失部分は、コンセンサスフレームワーク領域を有する生殖細胞系抗体からである、請求項２４の抗体分子。
【請求項２６】
重鎖のＣＤＲ−Ｈ２は抗体分子中のハイブリッドである、請求項２３〜２５のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２７】
ドナーＣＤＲの末端切断は１〜８個のアミノ酸である、請求項２３〜２６のいずれか１項の抗体分子。
【請求項２８】
末端切断は４〜６個のアミノ酸である、請求項２７の抗体分子。
【請求項２９】
末端切断はＣＤＲのＣ末端で行われる、請求項２３〜２８のいずれか１項の抗体分子。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３１】
請求項３０のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、または治療で使用される請求項３０のＤＮＡ配列。
【請求項３４】
ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、またはＣＤ２２を発現する細胞により仲介される病態を治療するのに使用される請求項３０のＤＮＡ配列。
【請求項３５】
請求項３３または請求項３４の抗体分子、または悪性リンパ腫を治療するのに使用される請求項３３または請求項３４のＤＮＡ配列。
【請求項３６】
悪性リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である、請求項３５の抗体分子またはＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ＣＤ２２を発現する細胞により仲介される病態の治療のために薬剤の製造における、ヒトＣＤ２２に対する特異性を有する請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子、または請求項３０のＤＮＡ配列の使用。
【請求項３８】
病態は悪性リンパ腫である、請求項３７の使用。
【請求項３９】
病態は非ホジキンリンパ腫である、請求項３８。
【請求項４０】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子または請求項３０のＤＮＡ配列を含む治療用または診断用組成物。
【請求項４１】
薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、請求項４０の治療用または診断用組成物。
【請求項４２】
抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ、または抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンのような非抗体成分をさらに含む、請求項４０または請求項４１の治療用または診断用組成物。
【請求項４３】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子の製造方法であって、該抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下で請求項３２の宿主細胞を培養し、該抗体分子を単離することを特徴とする、上記方法。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか１項の抗体分子を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合することを特徴とする、請求項４０〜４２のいずれか１項の治療用または診断用組成物の調製法。
【請求項４５】
配列番号１〜２８または配列番号３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【公開番号】特開２０１０−２２３７２（Ｐ２０１０−２２３７２Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０５６６０（Ｐ２００９−２０５６６０）
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【分割の表示】特願２００４−５０１４５９（Ｐ２００４−５０１４５９）の分割
【原出願日】平成１５年５月２日（２００３．５．２）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【分割の表示】特願２００４−５０１４５９（Ｐ２００４−５０１４５９）の分割
【原出願日】平成１５年５月２日（２００３．５．２）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
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