生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する方法及び装置が提供される。方法は、ａ）Ｚ軸と平行なレンズ軸を有する対物レンズに対してチャンバーをＺ軸位置に位置させるステップと、ｂ）一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対して移動させるステップと、ｃ）Ｚ軸に沿ったフォーカス検索範囲内を一方又は両方のチャンバー及び対物レンズが互いに対して移動している時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するステップと、を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法（U.S.C.35）第１１９条に基づく２００９年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６１／２９１，４１６号の優先権の利益を主張するものであり、これに開示された内容は参照により本願に援用される。
【０００２】
本発明は生物検体を撮像する方法及び装置に関し、特に分析のために生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来、例えば全血液（whole blood）や尿、脳髄（cerebrospinal）、体腔内（body cavity fluids）等の生物学的液体サンプルは、スライドガラス上に塗布して顕微鏡の下に塗りつけて検査される無希釈の微量な微粒子や細胞を有する。
【０００４】
塗布標本の異なる領域は、スライドをＸ−Ｙ平面で操作することで検査されていた。フォーカスは、顕微鏡対物レンズに対してスライドの位置をＺ軸に沿って変化することで実現される。
【０００５】
これらの技術を用いることで、妥当な結果を達成することは可能だが、これらは技術者の経験や技能に大きく依存する。様々な分野のサンプルを手動で検査することも労働集約的（labor intensive）であり、そのため市販の検査室用途に用いることは実際に不可能である。
【０００６】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプル（biologic fluid samples）を撮像して分析する自動装置が知られている。チャンバー内に静止状態で存在するサンプルの分析を正確に行うためには、様々な異なる高さ（例えば、Ｘ−Ｙ平面内に配置されたサンプル・チャンバーのＺ軸に沿った、異なる高さ）で装置の光学系の焦点を合わせる必要がある。このような分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行う必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関し、分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する方法が提供される。方法は、ａ）対物レンズの光軸と平行なＺ軸位置にチャンバーを位置させるステップと、ｂ）一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対してＺ軸に沿って速く移動させるステップと、ｃ）一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを焦点検索範囲内でＺ軸に沿って互いに対して速く移動させながら、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するステップとを備えている。
【０００９】
本発明の他の態様によれば、チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する装置が提供される。装置は、フィールド照明装置（field illuminator）と、位置決め装置（positioner）と、解像機構（image dissector）と、プログラム可能な分析装置（programmable analyzer）とを備えている。
【００１０】
フィールド照明装置は、光軸を有する対物レンズを備えている。位置決め装置は、一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに位置決めするのに適用される。解像機構は、チャンバー内にあるサンプルの撮像に適用される。プログラム可能な分析装置は、一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対してレンズ軸と平行なＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用される。
【００１１】
分析装置はさらに、Ｚ軸に沿ったフォーカス検索範囲（focus search range）内を一方又は両方のチャンバー及び対物レンズが移動する時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するのに適用される。
【００１２】
本発明の特徴及び利点は、以下に記載された発明の詳細な説明、及び添付図面から明らかになる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関し、分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、生物学的液体サンプルの分析装置を示す概略図である。
【図２】図２は、分析装置内の構成機器を示す概略図である。
【図３】図３は、本実施形態に係る生物学的液体サンプルのカートリッジにおいて、液体モジュールが閉じられた状態を図示している。
【図４】図４は、本実施形態に係る生物学的液体サンプルのカートリッジにおいて、液体モジュールが開位置にある状態を図示している。
【図５】図５は、分析チャンバーの概略図である。
【図６】図６は、本実施形態の分析チャンバーにおいて、チャンバーの均一な高さを許容するようにセパレータが圧縮された状態を示している。
【図７】図７は、本実施形態の分析チャンバーにおいて、チャンバーの均一な高さを許容するように第一のパネルが変形された状態を示している。
【図８】図８は、サンプル・チャンバーと対物レンズとの間のＺ軸位置に関連する横軸に対して、フォーカス・インデックスの縦軸を有するプロット図である。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、連続撮像モードのロール・シャッタによるフォーカスの変化を示す概略図に関し、図９Ａは、チャンバー速度がゼロから一定速度（フォーカス検索中維持される）まで加速される状態を示し、図９Ｂは、Ｚ軸位置の機能としての画像フォーカスを示し、図９Ｃは、関連するＺ軸位置の縦軸に対して横軸を有するプロット図を示している。
【図１０】図１０は、スマート・フォーカス処理手順のフローチャートを示している。
【図１１】図１１は、フォーカス検索範囲２０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１２】図１２は、フォーカス検索範囲４０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１３】図１３は、フォーカス検索範囲８０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１４】図１４は、チャンバー内のサンプル・フィールドに直交格子が重ね合わされた分析チャンバーの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１，２に示すように、分析装置１６は、分析対象の生物学的サンプル（例えば、血液）を包含するように構成された分析チャンバー（analysis chamber）２０を備えたサンプル分析カートリッジ１８を受容するのに適用される。装置１６は、フィールド照明装置２２と、解像機構２４と、位置決め装置２６と、プログラム可能な分析装置２８とを備えている。説明上の目的で、“分析”及び“解析”の用語は、任意の検査や液体サンプルの検査に限定されず、生物学的液体サンプル内の構成成分の検査を含むものとして定義される。
【００１６】
分析装置１６は、本願明細書にそのまま援用される同時係属の米国特許出願第１２／９７１，８６０；１２／０６１，３９４号明細書及び、米国特許第７，８５０，９１６号明細書に記載されている多種類のサンプル分析チャンバー２０に使用することが可能である。説明上の目的で、本発明は米国特許出願第１２／９７１，８６０号明細書に記載されている分析チャンバーとカートリッジとを使用するものとして記載されている。本発明はこれに限定されないが、上述のチャンバー２０とカートリッジ１８とを使用する。
【００１７】
図３，４に示すように、サンプル分析カートリッジ１８は、液体モジュール（fluid module）３０と、画像処理トレイ（image tray）３２と、ハウジング３４とを備えている。液体モジュール３０は、例えば指やヒールスティック（heel stick）等の被検体収集サイト（subject collection site）から注射器で取り出した液体サンプルを受容するように構成されたサンプルポート（sample port）３６を備えている。液体サンプルは、画像処理トレイ３２内にロックされた分析チャンバー２０（図５〜７参照）に選択的に移動可能なカートリッジ１８内に吸引される。
【００１８】
図５〜７に示すように、分析チャンバー２０は、第一のパネル３８と、第二のパネル４０とを備えている。これらパネル３８，４０の少なくとも一方は、パネル３８，４０間に配置された生物学的液体サンプルが分析目的のために画像処理されるように、十分な透明性を備えている。第一及び第二のパネル３８，４０は互いに平行に位置合わせされると共に、互いに表面３９，４１を対向させて間隔を隔てて配置されている。
【００１９】
パネル３８，４０間の位置合わせは、光が一方のパネル３８に垂直に伝達すると共に、他方のパネル４０も透明の場合は、一方のパネル３８、サンプル、他方のパネル４０を透過することができる領域を定めている。対向するパネル表面の離間距離（以下、チャンバー２０の“高さ” ４２ともいう）は、二つの表面３９，４１間に配置された生物学的液体サンプルが両表面と接触する距離で設定されている。
【００２０】
他の実施形態において、第一及び第二のパネル３８，４０は互いに少なくとも三つのセパレータ４４（一般的な球状ビーズ）により区分けされている。好適な実施形態において、少なくとも一方のパネル３８，４０もしくはセパレータ４４は、チャンバー高さ４２がセパレータ４４の平均高さと近似することを許容するために、十分な可撓性を備えている。相対柔軟度（relative flexibility）は、セパレータ４４内の小さな許容自由度にかかわらず、チャンバー２０を実質的に均一な高さにする。
【００２１】
チャンバー２０は、約０．２〜１．０マイクロリットル（μｌ）のサンプルを保持する一般的なサイズであるが、その大きさは特定の容量に限定されず、分析用途に応じて変更することができる。チャンバー２０は、液体サンプルを静止状態で保持することが可能である。ここでいう“静止状態”の定義は、サンプルが分析のためにチャンバー２０内に配置されると共に、分析の間は意図的に動かされないことをいう。主に血液サンプルのブラウン運動（Brownian motion）によって生じる本発明の使用を不能にしない血液サンプル内の拡張運動は、構成成分（constituents）を形成する。
【００２２】
図２に示すように、フィールド照明装置２２は、光源４６と、対物光学素子（例えば、対物レンズ４８やフィルター５０等）とを備えている。光源４６は複数の分析のために十分な長波長領域（例えば約３４０ｎｍ〜６７０ｎｍ）の光を発生する。光源４６は、例えばキセノンアークランプ、タングステンハロゲンランプ、ＬＥＤ、拍動性源など、選択的に所望波長の光を単一の発生源もしくは複数の発生源から発生させることが可能である。
【００２３】
光源４６から放射される光の通路は、サンプルが蛍光発光もしくは透過光の何れを用いて分析されるかに依存する。蛍光発光が用いられた場合、光源４６から放射される光がチャンバー２０内に静止状態で存在するサンプル上に直接照射されるように、対物レンズ４８は光線の焦点を合わせる。光線は、解像機構２４上に入射するサンプル画像の断面領域によって定義されるサンプルの少なくとも一部のフィールドを照射する。光は、サンプル内に物質（例えば蛍光色素）を生じさせて蛍光を発させると共に、特定波長の光を放射する。放射された光は、対物レンズ４８を通過して戻ると共に、解像機構２４によって捕捉される。
【００２４】
透過光が用いられた場合、フィールド照明装置２２は、液体サンプルが存在するチャンバーの第一のパネル３８及び第二のパネル４０（これらは光の透過を許容するように十分な透明性を備える）の間に、光を方向付けて透過させるように構成されている。伝達される光は対物レンズ４８を透過した後、解像機構２４によって捕捉される。
【００２５】
位置決め装置２６は、対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の相対位置を変化させるのに適用される。対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の相対位置の変化は、例えば対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の一方を他方に対して関連する全ての軸（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に沿って移動させるか、又は、チャンバー２０を特定の軸（Ｘ，Ｙ軸）に沿って移動させると共に、レンズを他の軸（Ｚ軸）に沿って移動させる等、多くの異なった方法で実現することができる。
【００２６】
簡略化のために、位置決め装置２６は、分析チャンバー２０と結合して、固定された対物レンズ４８に対してカートリッジ１８を複数の移動軸（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に沿って移動させるのに適用される。しかしながら、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。
【００２７】
チャンバー２０は、チャンバー２０内に存在するサンプルの全フィールドを対物レンズ４８で捕捉すると共に、Ｚ軸に沿った移動を許容してサンプル高さに対する焦点位置を変化させるように、Ｘ−Ｙ平面を移動可能に構成されている。対物レンズ４８に対するチャンバー２０の動作は、これに限定されるものではないが、例えば対物レンズ４８に対するチャンバー２０の連続動作（continuous motion）やインクリメント動作（incremental movement）を選択的に制御可能なステッパモータ等、多くの異なる装置によって実現される。
【００２８】
適用可能な解像機構２４は、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）タイプのデジタル画像解像機構であって、好ましくはピクセル当たりの解像度を少なくとも８ビット、最も好ましくは１２ビット備えている。解像機構２４は、光画像をリアルタイムもしくは経時的に確認できる電子データフォーマットに変換する。あるいは、ＣＭＯＳ以外の解像機構２４が光画像の電子データフォーマットへの変換に用いられてもよい。
【００２９】
好適な実施形態において、解像機構２４は電子ロール・シャッタ（ＥＲＳ）スナップショット・モードや電子ロール・シャッタ（ＥＲＳ）連続モードが可能なＣＭＯＳカメラである。スナップショット・モードにおいて、カメラは不連続時間でフィールド画像を撮像するように適用される。ロール・シャッタ連続モードにおいて、カメラは特定期間でフィールド画像を撮像するように適用される。適用可能な解像機構２４の一例は、米国カリフォルニア州サンジョセ（San Jose, California, U.S.A.）にあるAptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器である。しかしながら、本発明はこの解像機構２４に限定されるものではない。
【００３０】
プログラム可能な分析装置２８は、本実施形態の方法を実行するのに必要な機能を選択的に作動させるようにプログラムされた中央演算処理装置（ＣＰＵ）を備えている。プログラム可能な分析装置２８の機能性は、ハードウェア、ソフトウェア、もしくは、これらの組み合わせによって実施されることに留意すべきである。当業者であれば、過度の実験を要することなく、ここに記載された機能を作動させるように中央演算処理装置をプログラム可能である。
【００３１】
プログラム可能な分析装置２８は、チャンバー２０内に静止状態で存在する液体サンプルを撮像するように、フィールド照明装置２２、解像機構２４及び、位置決め装置２６と電気的に接続されており、これらの作動を調整するようにプログラムされている。多くの具体例において、分析装置１６は、サンプルの複数フィールドを撮像するプロセスを含むチャンバー２０内のサンプル全体撮像を行うように作動する。チャンバー２０は、分析フィールドが特定の直交する行及び列によって定義されるものとして記載される。全てのフィールド画像は、サンプル全体の画像を生成するように結合することができる。
【００３２】
各サンプル・フィールドに関し、プログラム可能な分析装置２８は、フィールド照明装置２２、解像機構２４、及び、位置決め装置２６の作動を調整するようにプログラムされている。また、位置決め装置２６は、フィールドのために与えられたＺ軸に沿った焦点面の微差を装置１６が計算することを許容する自動フォーカス・モードで作動する。自動フォーカス・モードにおいて、画像が許容可能な鮮明度（すなわちコントラスト）で捕捉されて決定されるように、分析チャンバー２０及び対物レンズ４８の相対位置はＺ軸に沿って変化する。
【００３３】
位置決め装置２６は、好ましくはチャンバー２０を対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる。チャンバー２０の移動中に、フィールド照明装置２２及び解像機構２４は協働して画像を捕捉するように作動する。本発明の実施形態における一定速度の移動は、例えば停止に必要な時間による相対的に遅い作動、引き続いてチャンバー２０の移動及び決定、チャンバー２０を速く正確にミクロンもしくはサブミクロンのインクリメントで移動及び決定するのに必要なハードウェアとの協働など、“移動−停止−収集−移動”モードにより生じる問題を回避する。
【００３４】
自動フォーカス・モードにおいて、チャンバー２０の移動及び撮像は、チャンバー２０が対物レンズ４８に対するＺ位置を変化させて個々の画像を徐々に捕捉するように調整される。図８に示すプロットは、２０個のデータ・ポイントを含む１μｍの解像度において、２０μｍのフォーカス検索範囲によるチャンバー２０の対物レンズ４８に対するＺ軸位置と、フォーカス・インデックスとの関係を示している。このモードの一実施形態において、解像機構２４は位置決め装置２６によって画像を捕捉するように指示される（すなわち、外部トリガー・モード（external trigger mode））。
【００３５】
位置決め装置２６は、チャンバー２０がＺ軸に沿って所定の距離（すなわち、ΔＺ）を移動する都度、解像機構２４に“トリガー”信号（例えば、ＴＴＬ信号）を送信する。この例において、画像が収集できる位置は以下の数式１で示される。
【００３６】
【数１】
【００３７】
数式１において、変数“≡”はイメージ・インデックスである。チャンバー２０の初期位置（Ｚ≡）が分かり、ΔＺが当面のアプリケーションのために選択されるので、個々のインクリメント位置（incremental position）も分かる。
【００３８】
このモードの他の実施形態において、解像機構２４はタイミング機構（例えば、コントロール・ソフトウェア）によって周期的に独立して作動されるが、例えば画像がΔｔ毎に捕捉されると共にチャンバー２０が速度ΔＺ／Δｔで移動するように、チャンバー２０のＺ軸移動と協調される。他の実施形態において、解像機構２４は、画像が撮像された位置を記録するために、位置決め装置２６に信号（例えば“ストロボ”信号）を送信することが可能である。
【００３９】
両実施形態において、画像が捕捉されるインクリメント率（incremental rate）は、画像の解像度及び解像機構２４が画像を生成するのに必要な時間（すなわち、“フレーム時間”）の観点から選択される。例えば、Ｚ速度（すなわち、距離／時間）は、画像が捕捉されるＺ軸位置間を移動する距離（すなわち、“フォーカス解像度”）を“フレーム時間”で除算した値以下でなければならず、以下の数式（２）で示される。
【００４０】
【数２】
【００４１】
フレーム時間は、解像機構２４の容量に基づいて選択される。当面のアプリケーションは、許容可能なフォーカス解像度を示す。例えば、分析チャンバー２０内に配置された全血サンプルの画像解析のために許容可能なフォーカス解像度は、１．０から４．０μｍまでの、約２．７μｍの焦点深度を有する。
【００４２】
フォーカス解像度が選択されると、与えられたフォーカス範囲のための画像数は以下の数式（３）によって決定される。
【００４３】
【数３】
【００４４】
画像数が決定されると、フォーカス検索の合計時間は、画像数に一つのイメージ当たりのフレーム時間を乗算することで決定される。分析装置１６の処理能力を向上するために、解像機構２４は細部のコントラストを識別して、画像解像度を低下させることなく最大速度に設定可能である。上述のように、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、スナップショット収集モードで作動可能な解像機構２４の一例である。Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、スナップショット・モードで作動する場合、約１０〜１４ｍｓｅｃのフレームの、ａ）４分の１中心の解析範囲、ｂ）ビン２、ｃ）１ｍｓｅｃの露光時間の設定に調整される。
【００４５】
上述した自動フォーカス・モードにおいて、画像が撮像される個々の位置間における分析チャンバー２０の対物レンズ４８に対する移動は一定速度である必要はないが、一定速度であることが好ましい。上述したように、“移動−停止−収集−移動”の撮像モードの作動には問題が伴う。分析チャンバー２０の対物レンズ４８に対する一定速度の移動は、これらの問題を減少させて解消する。
【００４６】
他の自動フォーカス・モードにおいて、フォーカス検索範囲全体のために対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動する時に、分析チャンバー２０は連続撮像される。最初に、チャンバー２０は検索領域の開始位置（すなわち、サンプルの特定フィールド）に移動されると共に、Ｚ軸のゼロ点から所定位置に到達するまで加速される。チャンバー２０はその後、Ｚ軸の所定位置にあるレンズ４８に対して連続的に移動される。
【００４７】
図９Ａは、レンズ４８に対するチャンバー２０のＺ方向の加速と、その後の定速移動とを示している。Ｚ軸に沿った移動が一定速度に到達すると、カメラのロール・シャッタが開始されると共に、サンプルの連続撮像が開始される。ロール・シャッタ解像機構２４は、フィールド内にあるサンプルの撮像をサンプル・フィールドの底部（すなわち、チャンバーの最も低いＺ位置）から開始すると共に、サンプル・フィールドの上部（すなわち、チャンバーの最も高いＺ位置）に向けて移動する。
【００４８】
図９Ｂは、サンプル・フィールドの底部から上部までのサンプル画像を示している。焦点面が検索範囲内（すなわち、フィールド内のサンプルの底部と上部との間）に配置される場合、撮像される画像のコントラストは、チャンバー２０がＺ軸に沿って移動する間、イメージ・フィールドの底部から上部に渡りぼやけた状態から鮮明になり（blurred to sharp）、再びぼやけた状態（blurred）に変化する。コントラスト値はその時、焦点面のＺ位置に対してプロットすることができる。
【００４９】
図９Ｃは、最良な焦点面の位置５２としての、Ｚ軸位置に対応するフォーカス・インデックスのプロット（例えば、画像の鮮明度）を示している。この連続モードにおけるチャンバー２０の対物レンズ４８に対するＺ軸方向の速度は、好ましくは解像機構２４が画像を捕捉する間にチャンバー２０がフォーカス範囲を通過する速度で設定される。
【００５０】
上述したように、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、連続撮像モードにおいて作動可能な解像機構２４に適用できる一例である。Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器をロール・シャッタ連続モードで作動させる場合の推奨設定条件は、ａ）最大解像度、ｂ）ビン無し（no bin）、ｃ）ロール・シャッタ幅を２７列にする１ｍｓｅｃの露光時間である。これらの設定において、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１は、フレーム時間を約７１．６６ｍｓｅｃで作動することができる。サンプル検索範囲が８０μｍの場合、対物レンズ４８に対するチャンバー２０のＺ軸方向の速度は８０μｍ／７１．６６ｍｓｅｃ、すなわち１．１２μｍ／ｍｓｅｃである。
【００５１】
他の実施形態において、プログラム可能な分析装置２８は、短時間で許容可能なＺ軸の焦点位置を決定するのに適用される“スマート・フォーカス（Smart Focus）”処理手順でプログラムされる。上述の方法において、Ｚ軸のサンプル検索範囲は、規定された特定の解像度、例えば２０個の画像を取得してこれら２０個の画像を生成する時間を必要とする５μｍの解像度及び１００μｍのサンプル検索範囲に従って撮像される。
【００５２】
対照的にスマート・フォーカス処理手順は、最適な解像度が達成されたか否かを決定するために、前回の画像に対する個々の画像の解像度を評価する。上述したように、焦点面が検索範囲内にある場合、チャンバー２０が対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って移動するので、画像は焦点の外から焦点の中に移動した後、再び焦点の外に移動される。Ｚ軸位置の機能としての解像度内におけるプロットの変更は、ベル曲線（bell curve）で現われる。
【００５３】
スマート・フォーカス処理手順は、例えば勾配導関数（derivative of the slope）における変化の兆候、もしくは、データ位置に適合する多項方程式（polynomial equation）の最大位置や最少位置など、曲線勾配の変化を探すことでベル形状の関係（bell-shaped relationship）を利用する。勾配導関数の変化が決定され、もしくは、プロットの最大位置や最少位置が決定されると、さらなるＺ軸の撮像は要求されない。最大位置や最少位置で捕捉された画像は最適な鮮明度を備え、さらなる分析に用いることができる。さらなる画像が必要とされないので、この技術は要求される鮮明度で画像を捕捉するのに必要な時間を短縮することができる。
【００５４】
多項方程式が分析データに適合されると、精度を低減することなく解像度を低減（例えば、１μｍ毎に替えて４μｍ毎に撮像）することで、Ｚ軸の焦点位置を決定する時間をさらに短縮することができる。２０個の画像のテストデータは、フォーカス検索範囲における２０μｍ，４０μｍ，８０μｍ（図１１〜１３に示す、１μｍ，２μｍ，４μｍの収量解像度）で取得され、画像の鮮明度データはそれぞれの解像度値に選択される。多項方程式は、個々の検索範囲のためのフォーカス・データにも適合される。Ｚ軸位置及び多項方程式に対する画像の鮮明度の値は、個々のフォーカス検索範囲にプロットされる。
【００５５】
異なるフォーカス検索範囲にプロットされた結果は、画像の鮮明度データが適合される多項方程式から決定可能なデータと密接に関連することを示している。実際に、多項方程式の適合から決定可能な焦点位置が許容誤差の範囲内になるような相関関係がある。
【００５６】
本発明は、位置決め装置２６がチャンバー２０を対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる操作モードを備えるものとして上述されている。本発明は特に、サンプル・フィールドの個々の画像がＺ軸に沿った異なる位置で周期的に捕捉される第一の自動フォーカス・モード及び、チャンバー２０が一定速度で移動する期間にサンプル・フィールドを連続撮像する第二の自動フォーカス・モードに適用されるものとして上述されている。これら自動フォーカス・モードの操作は、互いに独立して使用されるか、もしくは、互いに組み合わせて使用される。
【００５７】
例えば、統計的に関連する分析データを含む確率が低いサンプル・フィールドは、不連続のスナップショット撮像モードを用いて分析することが可能であり、統計的に関連する分析データを含む確率が高いサンプル・フィールドは、連続撮像モードを用いて分析することが可能である。
【００５８】
図１４を参照すると、直交格子を重ね合わせた分析チャンバー２０が概略的に示されている。サンプル５４は、チャンバー２０内に静止状態で存在する。チャンバーの外側周囲にあるサンプル・フィールド５６は、サンプルを欠いた空の状態で示されている。他の実施形態において、周辺視野５６は、統計的に高い確率でサンプル５４を含む中央サンプル・フィールド５８と比較して、統計的に高い確率でサンプルを欠いた状態（又は、関連する分析データを欠いた状態）にある。
【００５９】
両方の自動フォーカス・モードが使用される操作モードにおいて、周辺視野５６（すなわち、統計的に関連する分析データを含む確率が低い）は不連続のスナップショット撮像モードを用いて分析され、中央サンプル・フィールド５８（すなわち、統計的に関連する分析データを含む確率が高い）は連続撮像モードを用いて分析される。特定のアプリケーションに応じて、本発明の操作は、望ましい精度を維持しつつ効果的で早いサンプルのプロセスが得られる両方の自動フォーカス・モードを用いる。
【００６０】
本発明の方法は数々の利点を提供する。例えば、本発明の方法は、実質的に並行処理（連続処理ではなく）において、分析チャンバー２０が配置されて撮像されると共に画像処理されるので、液体サンプルの迅速な分析を許容する。
【００６１】
本発明の他の利点は、チャンバー２０の対物レンズ４８に対する連続的なＺ軸移動を利用することにある。連続的なＺ軸移動は、チャンバー２０の対物レンズ４８に対する始動及び停止動作のために位置決め装置２６が適用される必要性を排除する。
【００６２】
本発明は、チャンバー２０を一定速度にするための反復的な加速、チャンバー２０を一定速度から静止状態にするための減速、及び、チャンバー２０を一旦停止させた後に対物レンズ４８に対して移動させることに関連付けられる時間も排除する。その結果、始動・停止モードの操作に要求される装置よりも一般的に安価なものを用いて、分析を短時間で実施することが可能になる。
【００６３】
本発明の他の利点は、結果の再現性を向上することが可能になり、したがって、接近した間隔で多くの画像が収集されて全体的な精度も向上することができる。本発明は、解像度を低減してフォーカス時間を長くすることなく、広いフォーカス検索範囲を利用することも可能にする。
【００６４】
以上、本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、本発明を逸脱しない範囲で種々の変更や同等の部材に代替されることは当業者に理解されるであろう。さらに、特定の状況や部材を本質的範囲から逸脱しない本発明の教示に適用するために多くの修正がおこなわれるであろう。すなわち、本発明の実行のために最良の形態として説明した特定の実施形態に限定されないことを意図している。
【符号の説明】
【００６５】
１６ 分析装置
２０ 分析チャンバー
２２ フィールド照明装置
２４ 解像機構
２６ 位置決め装置
２８ プログラム可能な分析装置
４８ 対物レンズ
５０ フィルター
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法（U.S.C.35）第１１９条に基づく２００９年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６１／２９１，４１６号の優先権の利益を主張するものであり、これに開示された内容は参照により本願に援用される。
【０００２】
本発明は生物検体を撮像する方法及び装置に関し、特に分析のために生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来、例えば全血液（whole blood）や尿、脳髄（cerebrospinal）、体腔内（body cavity fluids）等の生物学的液体サンプルは、スライドガラス上に塗布して顕微鏡の下に塗りつけて検査される無希釈の微量な微粒子や細胞を有する。
【０００４】
塗布標本の異なる領域は、スライドをＸ−Ｙ平面で操作することで検査されていた。フォーカスは、顕微鏡対物レンズに対してスライドの位置をＺ軸に沿って変化することで実現される。
【０００５】
これらの技術を用いることで、妥当な結果を達成することは可能だが、これらは技術者の経験や技能に大きく依存する。様々な分野のサンプルを手動で検査することも労働集約的（labor intensive）であり、そのため市販の検査室用途に用いることは実際に不可能である。
【０００６】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプル（biologic fluid samples）を撮像して分析する自動装置が知られている。チャンバー内に静止状態で存在するサンプルの分析を正確に行うためには、様々な異なる高さ（例えば、Ｘ−Ｙ平面内に配置されたサンプル・チャンバーのＺ軸に沿った、異なる高さ）で装置の光学系の焦点を合わせる必要がある。このような分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行う必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関し、分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する方法が提供される。方法は、ａ）対物レンズの光軸と平行なＺ軸位置にチャンバーを位置させるステップと、ｂ）一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対してＺ軸に沿って速く移動させるステップと、ｃ）一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを焦点検索範囲内でＺ軸に沿って互いに対して速く移動させながら、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するステップとを備えている。
【０００９】
本発明の他の態様によれば、チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する装置が提供される。装置は、フィールド照明装置（field illuminator）と、位置決め装置（positioner）と、解像機構（image dissector）と、プログラム可能な分析装置（programmable analyzer）とを備えている。
【００１０】
フィールド照明装置は、光軸を有する対物レンズを備えている。位置決め装置は、一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに位置決めするのに適用される。解像機構は、チャンバー内にあるサンプルの撮像に適用される。プログラム可能な分析装置は、一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対してレンズ軸と平行なＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用される。
【００１１】
分析装置はさらに、Ｚ軸に沿ったフォーカス検索範囲（focus search range）内を一方又は両方のチャンバー及び対物レンズが移動する時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するのに適用される。
【００１２】
本発明の特徴及び利点は、以下に記載された発明の詳細な説明、及び添付図面から明らかになる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生物検体を高速フォーカス撮像する方法及び装置に関し、分析を効率的に行うために、異なる高さの焦点合わせを正確かつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、生物学的液体サンプルの分析装置を示す概略図である。
【図２】図２は、分析装置内の構成機器を示す概略図である。
【図３】図３は、本実施形態に係る生物学的液体サンプルのカートリッジにおいて、液体モジュールが閉じられた状態を図示している。
【図４】図４は、本実施形態に係る生物学的液体サンプルのカートリッジにおいて、液体モジュールが開位置にある状態を図示している。
【図５】図５は、分析チャンバーの概略図である。
【図６】図６は、本実施形態の分析チャンバーにおいて、チャンバーの均一な高さを許容するようにセパレータが圧縮された状態を示している。
【図７】図７は、本実施形態の分析チャンバーにおいて、チャンバーの均一な高さを許容するように第一のパネルが変形された状態を示している。
【図８】図８は、サンプル・チャンバーと対物レンズとの間のＺ軸位置に関連する横軸に対して、フォーカス・インデックスの縦軸を有するプロット図である。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、連続撮像モードのロール・シャッタによるフォーカスの変化を示す概略図に関し、図９Ａは、チャンバー速度がゼロから一定速度（フォーカス検索中維持される）まで加速される状態を示し、図９Ｂは、Ｚ軸位置の機能としての画像フォーカスを示し、図９Ｃは、関連するＺ軸位置の縦軸に対して横軸を有するプロット図を示している。
【図１０】図１０は、スマート・フォーカス処理手順のフローチャートを示している。
【図１１】図１１は、フォーカス検索範囲２０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１２】図１２は、フォーカス検索範囲４０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１３】図１３は、フォーカス検索範囲８０μｍにおいて、Ｚ軸位置に対するフォーカス・インデックスのプロットを示している。
【図１４】図１４は、チャンバー内のサンプル・フィールドに直交格子が重ね合わされた分析チャンバーの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１，２に示すように、分析装置１６は、分析対象の生物学的サンプル（例えば、血液）を包含するように構成された分析チャンバー（analysis chamber）２０を備えたサンプル分析カートリッジ１８を受容するのに適用される。装置１６は、フィールド照明装置２２と、解像機構２４と、位置決め装置２６と、プログラム可能な分析装置２８とを備えている。説明上の目的で、“分析”及び“解析”の用語は、任意の検査や液体サンプルの検査に限定されず、生物学的液体サンプル内の構成成分の検査を含むものとして定義される。
【００１６】
分析装置１６は、本願明細書にそのまま援用される同時係属の米国特許出願第１２／９７１，８６０；１２／０６１，３９４号明細書及び、米国特許第７，８５０，９１６号明細書に記載されている多種類のサンプル分析チャンバー２０に使用することが可能である。説明上の目的で、本発明は米国特許出願第１２／９７１，８６０号明細書に記載されている分析チャンバーとカートリッジとを使用するものとして記載されている。本発明はこれに限定されないが、上述のチャンバー２０とカートリッジ１８とを使用する。
【００１７】
図３，４に示すように、サンプル分析カートリッジ１８は、液体モジュール（fluid module）３０と、画像処理トレイ（image tray）３２と、ハウジング３４とを備えている。液体モジュール３０は、例えば指やヒールスティック（heel stick）等の被検体収集サイト（subject collection site）から注射器で取り出した液体サンプルを受容するように構成されたサンプルポート（sample port）３６を備えている。液体サンプルは、画像処理トレイ３２内にロックされた分析チャンバー２０（図５〜７参照）に選択的に移動可能なカートリッジ１８内に吸引される。
【００１８】
図５〜７に示すように、分析チャンバー２０は、第一のパネル３８と、第二のパネル４０とを備えている。これらパネル３８，４０の少なくとも一方は、パネル３８，４０間に配置された生物学的液体サンプルが分析目的のために画像処理されるように、十分な透明性を備えている。第一及び第二のパネル３８，４０は互いに平行に位置合わせされると共に、互いに表面３９，４１を対向させて間隔を隔てて配置されている。
【００１９】
パネル３８，４０間の位置合わせは、光が一方のパネル３８に垂直に伝達すると共に、他方のパネル４０も透明の場合は、一方のパネル３８、サンプル、他方のパネル４０を透過することができる領域を定めている。対向するパネル表面の離間距離（以下、チャンバー２０の“高さ” ４２ともいう）は、二つの表面３９，４１間に配置された生物学的液体サンプルが両表面と接触する距離で設定されている。
【００２０】
他の実施形態において、第一及び第二のパネル３８，４０は互いに少なくとも三つのセパレータ４４（一般的な球状ビーズ）により区分けされている。好適な実施形態において、少なくとも一方のパネル３８，４０もしくはセパレータ４４は、チャンバー高さ４２がセパレータ４４の平均高さと近似することを許容するために、十分な可撓性を備えている。相対柔軟度（relative flexibility）は、セパレータ４４内の小さな許容自由度にかかわらず、チャンバー２０を実質的に均一な高さにする。
【００２１】
チャンバー２０は、約０．２〜１．０マイクロリットル（μｌ）のサンプルを保持する一般的なサイズであるが、その大きさは特定の容量に限定されず、分析用途に応じて変更することができる。チャンバー２０は、液体サンプルを静止状態で保持することが可能である。ここでいう“静止状態”の定義は、サンプルが分析のためにチャンバー２０内に配置されると共に、分析の間は意図的に動かされないことをいう。主に血液サンプルのブラウン運動（Brownian motion）によって生じる本発明の使用を不能にしない血液サンプル内の拡張運動は、構成成分（constituents）を形成する。
【００２２】
図２に示すように、フィールド照明装置２２は、光源４６と、対物光学素子（例えば、対物レンズ４８やフィルター５０等）とを備えている。光源４６は複数の分析のために十分な長波長領域（例えば約３４０ｎｍ〜６７０ｎｍ）の光を発生する。光源４６は、例えばキセノンアークランプ、タングステンハロゲンランプ、ＬＥＤ、拍動性源など、選択的に所望波長の光を単一の発生源もしくは複数の発生源から発生させることが可能である。
【００２３】
光源４６から放射される光の通路は、サンプルが蛍光発光もしくは透過光の何れを用いて分析されるかに依存する。蛍光発光が用いられた場合、光源４６から放射される光がチャンバー２０内に静止状態で存在するサンプル上に直接照射されるように、対物レンズ４８は光線の焦点を合わせる。光線は、解像機構２４上に入射するサンプル画像の断面領域によって定義されるサンプルの少なくとも一部のフィールドを照射する。光は、サンプル内に物質（例えば蛍光色素）を生じさせて蛍光を発させると共に、特定波長の光を放射する。放射された光は、対物レンズ４８を通過して戻ると共に、解像機構２４によって捕捉される。
【００２４】
透過光が用いられた場合、フィールド照明装置２２は、液体サンプルが存在するチャンバーの第一のパネル３８及び第二のパネル４０（これらは光の透過を許容するように十分な透明性を備える）の間に、光を方向付けて透過させるように構成されている。伝達される光は対物レンズ４８を透過した後、解像機構２４によって捕捉される。
【００２５】
位置決め装置２６は、対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の相対位置を変化させるのに適用される。対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の相対位置の変化は、例えば対物レンズ４８及び分析チャンバー２０の一方を他方に対して関連する全ての軸（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に沿って移動させるか、又は、チャンバー２０を特定の軸（Ｘ，Ｙ軸）に沿って移動させると共に、レンズを他の軸（Ｚ軸）に沿って移動させる等、多くの異なった方法で実現することができる。
【００２６】
簡略化のために、位置決め装置２６は、分析チャンバー２０と結合して、固定された対物レンズ４８に対してカートリッジ１８を複数の移動軸（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に沿って移動させるのに適用される。しかしながら、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。
【００２７】
チャンバー２０は、チャンバー２０内に存在するサンプルの全フィールドを対物レンズ４８で捕捉すると共に、Ｚ軸に沿った移動を許容してサンプル高さに対する焦点位置を変化させるように、Ｘ−Ｙ平面を移動可能に構成されている。対物レンズ４８に対するチャンバー２０の動作は、これに限定されるものではないが、例えば対物レンズ４８に対するチャンバー２０の連続動作（continuous motion）やインクリメント動作（incremental movement）を選択的に制御可能なステッパモータ等、多くの異なる装置によって実現される。
【００２８】
適用可能な解像機構２４は、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）タイプのデジタル画像解像機構であって、好ましくはピクセル当たりの解像度を少なくとも８ビット、最も好ましくは１２ビット備えている。解像機構２４は、光画像をリアルタイムもしくは経時的に確認できる電子データフォーマットに変換する。あるいは、ＣＭＯＳ以外の解像機構２４が光画像の電子データフォーマットへの変換に用いられてもよい。
【００２９】
好適な実施形態において、解像機構２４は電子ロール・シャッタ（ＥＲＳ）スナップショット・モードや電子ロール・シャッタ（ＥＲＳ）連続モードが可能なＣＭＯＳカメラである。スナップショット・モードにおいて、カメラは不連続時間でフィールド画像を撮像するように適用される。ロール・シャッタ連続モードにおいて、カメラは特定期間でフィールド画像を撮像するように適用される。適用可能な解像機構２４の一例は、米国カリフォルニア州サンジョセ（San Jose, California, U.S.A.）にあるAptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器である。しかしながら、本発明はこの解像機構２４に限定されるものではない。
【００３０】
プログラム可能な分析装置２８は、本実施形態の方法を実行するのに必要な機能を選択的に作動させるようにプログラムされた中央演算処理装置（ＣＰＵ）を備えている。プログラム可能な分析装置２８の機能性は、ハードウェア、ソフトウェア、もしくは、これらの組み合わせによって実施されることに留意すべきである。当業者であれば、過度の実験を要することなく、ここに記載された機能を作動させるように中央演算処理装置をプログラム可能である。
【００３１】
プログラム可能な分析装置２８は、チャンバー２０内に静止状態で存在する液体サンプルを撮像するように、フィールド照明装置２２、解像機構２４及び、位置決め装置２６と電気的に接続されており、これらの作動を調整するようにプログラムされている。多くの具体例において、分析装置１６は、サンプルの複数フィールドを撮像するプロセスを含むチャンバー２０内のサンプル全体撮像を行うように作動する。チャンバー２０は、分析フィールドが特定の直交する行及び列によって定義されるものとして記載される。全てのフィールド画像は、サンプル全体の画像を生成するように結合することができる。
【００３２】
各サンプル・フィールドに関し、プログラム可能な分析装置２８は、フィールド照明装置２２、解像機構２４、及び、位置決め装置２６の作動を調整するようにプログラムされている。また、位置決め装置２６は、フィールドのために与えられたＺ軸に沿った焦点面の微差を装置１６が計算することを許容する自動フォーカス・モードで作動する。自動フォーカス・モードにおいて、画像が許容可能な鮮明度（すなわちコントラスト）で捕捉されて決定されるように、分析チャンバー２０及び対物レンズ４８の相対位置はＺ軸に沿って変化する。
【００３３】
位置決め装置２６は、好ましくはチャンバー２０を対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる。チャンバー２０の移動中に、フィールド照明装置２２及び解像機構２４は協働して画像を捕捉するように作動する。本発明の実施形態における一定速度の移動は、例えば停止に必要な時間による相対的に遅い作動、引き続いてチャンバー２０の移動及び決定、チャンバー２０を速く正確にミクロンもしくはサブミクロンのインクリメントで移動及び決定するのに必要なハードウェアとの協働など、“移動−停止−収集−移動”モードにより生じる問題を回避する。
【００３４】
自動フォーカス・モードにおいて、チャンバー２０の移動及び撮像は、チャンバー２０が対物レンズ４８に対するＺ位置を変化させて個々の画像を徐々に捕捉するように調整される。図８に示すプロットは、２０個のデータ・ポイントを含む１μｍの解像度において、２０μｍのフォーカス検索範囲によるチャンバー２０の対物レンズ４８に対するＺ軸位置と、フォーカス・インデックスとの関係を示している。このモードの一実施形態において、解像機構２４は位置決め装置２６によって画像を捕捉するように指示される（すなわち、外部トリガー・モード（external trigger mode））。
【００３５】
位置決め装置２６は、チャンバー２０がＺ軸に沿って所定の距離（すなわち、ΔＺ）を移動する都度、解像機構２４に“トリガー”信号（例えば、ＴＴＬ信号）を送信する。この例において、画像が収集できる位置は以下の数式１で示される。
【００３６】
【数１】
【００３７】
数式１において、変数“≡”はイメージ・インデックスである。チャンバー２０の初期位置（Ｚ≡）が分かり、ΔＺが当面のアプリケーションのために選択されるので、個々のインクリメント位置（incremental position）も分かる。
【００３８】
このモードの他の実施形態において、解像機構２４はタイミング機構（例えば、コントロール・ソフトウェア）によって周期的に独立して作動されるが、例えば画像がΔｔ毎に捕捉されると共にチャンバー２０が速度ΔＺ／Δｔで移動するように、チャンバー２０のＺ軸移動と協調される。他の実施形態において、解像機構２４は、画像が撮像された位置を記録するために、位置決め装置２６に信号（例えば“ストロボ”信号）を送信することが可能である。
【００３９】
両実施形態において、画像が捕捉されるインクリメント率（incremental rate）は、画像の解像度及び解像機構２４が画像を生成するのに必要な時間（すなわち、“フレーム時間”）の観点から選択される。例えば、Ｚ速度（すなわち、距離／時間）は、画像が捕捉されるＺ軸位置間を移動する距離（すなわち、“フォーカス解像度”）を“フレーム時間”で除算した値以下でなければならず、以下の数式（２）で示される。
【００４０】
【数２】
【００４１】
フレーム時間は、解像機構２４の容量に基づいて選択される。当面のアプリケーションは、許容可能なフォーカス解像度を示す。例えば、分析チャンバー２０内に配置された全血サンプルの画像解析のために許容可能なフォーカス解像度は、１．０から４．０μｍまでの、約２．７μｍの焦点深度を有する。
【００４２】
フォーカス解像度が選択されると、与えられたフォーカス範囲のための画像数は以下の数式（３）によって決定される。
【００４３】
【数３】
【００４４】
画像数が決定されると、フォーカス検索の合計時間は、画像数に一つのイメージ当たりのフレーム時間を乗算することで決定される。分析装置１６の処理能力を向上するために、解像機構２４は細部のコントラストを識別して、画像解像度を低下させることなく最大速度に設定可能である。上述のように、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、スナップショット収集モードで作動可能な解像機構２４の一例である。Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、スナップショット・モードで作動する場合、約１０〜１４ｍｓｅｃのフレームの、ａ）４分の１中心の解析範囲、ｂ）ビン２、ｃ）１ｍｓｅｃの露光時間の設定に調整される。
【００４５】
上述した自動フォーカス・モードにおいて、画像が撮像される個々の位置間における分析チャンバー２０の対物レンズ４８に対する移動は一定速度である必要はないが、一定速度であることが好ましい。上述したように、“移動−停止−収集−移動”の撮像モードの作動には問題が伴う。分析チャンバー２０の対物レンズ４８に対する一定速度の移動は、これらの問題を減少させて解消する。
【００４６】
他の自動フォーカス・モードにおいて、フォーカス検索範囲全体のために対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動する時に、分析チャンバー２０は連続撮像される。最初に、チャンバー２０は検索領域の開始位置（すなわち、サンプルの特定フィールド）に移動されると共に、Ｚ軸のゼロ点から所定位置に到達するまで加速される。チャンバー２０はその後、Ｚ軸の所定位置にあるレンズ４８に対して連続的に移動される。
【００４７】
図９Ａは、レンズ４８に対するチャンバー２０のＺ方向の加速と、その後の定速移動とを示している。Ｚ軸に沿った移動が一定速度に到達すると、カメラのロール・シャッタが開始されると共に、サンプルの連続撮像が開始される。ロール・シャッタ解像機構２４は、フィールド内にあるサンプルの撮像をサンプル・フィールドの底部（すなわち、チャンバーの最も低いＺ位置）から開始すると共に、サンプル・フィールドの上部（すなわち、チャンバーの最も高いＺ位置）に向けて移動する。
【００４８】
図９Ｂは、サンプル・フィールドの底部から上部までのサンプル画像を示している。焦点面が検索範囲内（すなわち、フィールド内のサンプルの底部と上部との間）に配置される場合、撮像される画像のコントラストは、チャンバー２０がＺ軸に沿って移動する間、イメージ・フィールドの底部から上部に渡りぼやけた状態から鮮明になり（blurred to sharp）、再びぼやけた状態（blurred）に変化する。コントラスト値はその時、焦点面のＺ位置に対してプロットすることができる。
【００４９】
図９Ｃは、最良な焦点面の位置５２としての、Ｚ軸位置に対応するフォーカス・インデックスのプロット（例えば、画像の鮮明度）を示している。この連続モードにおけるチャンバー２０の対物レンズ４８に対するＺ軸方向の速度は、好ましくは解像機構２４が画像を捕捉する間にチャンバー２０がフォーカス範囲を通過する速度で設定される。
【００５０】
上述したように、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器は、連続撮像モードにおいて作動可能な解像機構２４に適用できる一例である。Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１画像機器をロール・シャッタ連続モードで作動させる場合の推奨設定条件は、ａ）最大解像度、ｂ）ビン無し（no bin）、ｃ）ロール・シャッタ幅を２７列にする１ｍｓｅｃの露光時間である。これらの設定において、Aptina Imaging社製のモデルＭＴ９Ｐ０３１は、フレーム時間を約７１．６６ｍｓｅｃで作動することができる。サンプル検索範囲が８０μｍの場合、対物レンズ４８に対するチャンバー２０のＺ軸方向の速度は８０μｍ／７１．６６ｍｓｅｃ、すなわち１．１２μｍ／ｍｓｅｃである。
【００５１】
他の実施形態において、プログラム可能な分析装置２８は、短時間で許容可能なＺ軸の焦点位置を決定するのに適用される“スマート・フォーカス（Smart Focus）”処理手順でプログラムされる。上述の方法において、Ｚ軸のサンプル検索範囲は、規定された特定の解像度、例えば２０個の画像を取得してこれら２０個の画像を生成する時間を必要とする５μｍの解像度及び１００μｍのサンプル検索範囲に従って撮像される。
【００５２】
対照的にスマート・フォーカス処理手順は、最適な解像度が達成されたか否かを決定するために、前回の画像に対する個々の画像の解像度を評価する。上述したように、焦点面が検索範囲内にある場合、チャンバー２０が対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って移動するので、画像は焦点の外から焦点の中に移動した後、再び焦点の外に移動される。Ｚ軸位置の機能としての解像度内におけるプロットの変更は、ベル曲線（bell curve）で現われる。
【００５３】
スマート・フォーカス処理手順は、例えば勾配導関数（derivative of the slope）における変化の兆候、もしくは、データ位置に適合する多項方程式（polynomial equation）の最大位置や最少位置など、曲線勾配の変化を探すことでベル形状の関係（bell-shaped relationship）を利用する。勾配導関数の変化が決定され、もしくは、プロットの最大位置や最少位置が決定されると、さらなるＺ軸の撮像は要求されない。最大位置や最少位置で捕捉された画像は最適な鮮明度を備え、さらなる分析に用いることができる。さらなる画像が必要とされないので、この技術は要求される鮮明度で画像を捕捉するのに必要な時間を短縮することができる。
【００５４】
多項方程式が分析データに適合されると、精度を低減することなく解像度を低減（例えば、１μｍ毎に替えて４μｍ毎に撮像）することで、Ｚ軸の焦点位置を決定する時間をさらに短縮することができる。２０個の画像のテストデータは、フォーカス検索範囲における２０μｍ，４０μｍ，８０μｍ（図１１〜１３に示す、１μｍ，２μｍ，４μｍの収量解像度）で取得され、画像の鮮明度データはそれぞれの解像度値に選択される。多項方程式は、個々の検索範囲のためのフォーカス・データにも適合される。Ｚ軸位置及び多項方程式に対する画像の鮮明度の値は、個々のフォーカス検索範囲にプロットされる。
【００５５】
異なるフォーカス検索範囲にプロットされた結果は、画像の鮮明度データが適合される多項方程式から決定可能なデータと密接に関連することを示している。実際に、多項方程式の適合から決定可能な焦点位置が許容誤差の範囲内になるような相関関係がある。
【００５６】
本発明は、位置決め装置２６がチャンバー２０を対物レンズ４８に対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる操作モードを備えるものとして上述されている。本発明は特に、サンプル・フィールドの個々の画像がＺ軸に沿った異なる位置で周期的に捕捉される第一の自動フォーカス・モード及び、チャンバー２０が一定速度で移動する期間にサンプル・フィールドを連続撮像する第二の自動フォーカス・モードに適用されるものとして上述されている。これら自動フォーカス・モードの操作は、互いに独立して使用されるか、もしくは、互いに組み合わせて使用される。
【００５７】
例えば、統計的に関連する分析データを含む確率が低いサンプル・フィールドは、不連続のスナップショット撮像モードを用いて分析することが可能であり、統計的に関連する分析データを含む確率が高いサンプル・フィールドは、連続撮像モードを用いて分析することが可能である。
【００５８】
図１４を参照すると、直交格子を重ね合わせた分析チャンバー２０が概略的に示されている。サンプル５４は、チャンバー２０内に静止状態で存在する。チャンバーの外側周囲にあるサンプル・フィールド５６は、サンプルを欠いた空の状態で示されている。他の実施形態において、周辺視野５６は、統計的に高い確率でサンプル５４を含む中央サンプル・フィールド５８と比較して、統計的に高い確率でサンプルを欠いた状態（又は、関連する分析データを欠いた状態）にある。
【００５９】
両方の自動フォーカス・モードが使用される操作モードにおいて、周辺視野５６（すなわち、統計的に関連する分析データを含む確率が低い）は不連続のスナップショット撮像モードを用いて分析され、中央サンプル・フィールド５８（すなわち、統計的に関連する分析データを含む確率が高い）は連続撮像モードを用いて分析される。特定のアプリケーションに応じて、本発明の操作は、望ましい精度を維持しつつ効果的で早いサンプルのプロセスが得られる両方の自動フォーカス・モードを用いる。
【００６０】
本発明の方法は数々の利点を提供する。例えば、本発明の方法は、実質的に並行処理（連続処理ではなく）において、分析チャンバー２０が配置されて撮像されると共に画像処理されるので、液体サンプルの迅速な分析を許容する。
【００６１】
本発明の他の利点は、チャンバー２０の対物レンズ４８に対する連続的なＺ軸移動を利用することにある。連続的なＺ軸移動は、チャンバー２０の対物レンズ４８に対する始動及び停止動作のために位置決め装置２６が適用される必要性を排除する。
【００６２】
本発明は、チャンバー２０を一定速度にするための反復的な加速、チャンバー２０を一定速度から静止状態にするための減速、及び、チャンバー２０を一旦停止させた後に対物レンズ４８に対して移動させることに関連付けられる時間も排除する。その結果、始動・停止モードの操作に要求される装置よりも一般的に安価なものを用いて、分析を短時間で実施することが可能になる。
【００６３】
本発明の他の利点は、結果の再現性を向上することが可能になり、したがって、接近した間隔で多くの画像が収集されて全体的な精度も向上することができる。本発明は、解像度を低減してフォーカス時間を長くすることなく、広いフォーカス検索範囲を利用することも可能にする。
【００６４】
以上、本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、本発明を逸脱しない範囲で種々の変更や同等の部材に代替されることは当業者に理解されるであろう。さらに、特定の状況や部材を本質的範囲から逸脱しない本発明の教示に適用するために多くの修正がおこなわれるであろう。すなわち、本発明の実行のために最良の形態として説明した特定の実施形態に限定されないことを意図している。
【符号の説明】
【００６５】
１６ 分析装置
２０ 分析チャンバー
２２ フィールド照明装置
２４ 解像機構
２６ 位置決め装置
２８ プログラム可能な分析装置
４８ 対物レンズ
５０ フィルター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する方法であって、
Ｚ軸と平行なレンズ軸を有する対物レンズに対して、チャンバーをＺ軸位置に位置させるステップと、
一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対して移動させるステップと、
Ｚ軸に沿ったフォーカス検索範囲内を一方又は両方のチャンバー及び対物レンズが互いに対して移動している時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するステップと、を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
画像が生成される時に、一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
画像を生成するステップは、フォーカス検索範囲内でＺ軸に関連付けられると共に、定量可能なフォーカス・インデックスを有する画像の周期的な生成を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
定量可能なフォーカス・インデックスが一定である請求項３記載の方法。
【請求項５】
一以上の画像の他の画像に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像に対してより鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像を分析するステップと、をさらに備える請求項３記載の方法。
【請求項６】
各画像のフォーカス・インデックスの相対量を決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像よりも大きな相対量のフォーカス・インデックスに関連するＺ軸位置で取得された画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項４記載の方法。
【請求項７】
フォーカス検索範囲内で取得された個々の画像のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量をプロットするステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像を識別するステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項６記載の方法。
【請求項８】
フォーカス検索範囲内で取得された画像のために、個々の画像のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量に多項方程式を適合するステップと、
多項方程式の勾配の変化を識別するステップと、
勾配の変化と関連するＺ軸位置で取得された画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項６記載の方法。
【請求項９】
フォーカス検索範囲内にあるサンプルの単一画像を生成するために、サンプルの連続撮像を含む一以上のサンプル画像を生成するステップにおいて、画像がフォーカス検索範囲内のＺ軸位置に関連すると共に定量可能なフォーカス・インデックスを有する複数の部分を備える請求項２記載の方法。
【請求項１０】
定量可能なフォーカス・インデックスが一定である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
一以上の画像部分の他の画像部分に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像部分のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像に対して鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像部分を分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
各画像のフォーカス・インデックスの相対量を決定するために、画像部分のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像よりも大きな相対量のフォーカス・インデックスに関連するＺ軸位置で取得された画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
個々の画像部分のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量をプロットするステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像部分を識別するステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個々の画像部分のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量に多項方程式を適合するステップと、
多項方程式の勾配の変化を識別するステップと、
勾配の変化と関連するＺ軸位置で取得された画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
一定速度は、画像が生成される近接したＺ軸に沿った位置間の距離を一つの画像を生成するのに掛かる時間で除算した値よりも低い請求項２記載の方法。
【請求項１６】
画像を生成するステップは、チャンバーの第一の部分に配置されたフォーカス検索範囲内にあるサンプルを不連続な画像で周期的に生成すると共に、サンプルの単一画像を生成するために、チャンバーの一以上の第二の部分に配置されたフォーカス検索範囲内にあるサンプルを連続的に撮像するステップを含み、
チャンバーの第一の部分に配置されたサンプルの不連続な画像は、Ｚ軸位置と関連付けられると共に、定量可能なフォーカス・インデックスを有し、
チャンバーの第二の部分に配置されたサンプルの連続的な画像は、Ｚ軸位置と関連付けられると共に、小部分と定量可能なフォーカス・インデックスとを有する請求項２記載の方法。
【請求項１７】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する装置であって、
レンズ軸を有する対物レンズを備えたフィールド照明装置と、
一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対して位置決めするのに適用される位置決め装置と、
チャンバー内のサンプルの撮像に適用される解像機構と、
一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対して一定速度でレンズ軸と平行なＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用され、かつ、一方又は両方のチャンバー及び対物レンズがＺ軸に沿ったフォーカス検索範囲内を互いに対して一定速度で移動している時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するのに適用されるプログラム可能な分析装置と、を備えることを特徴とする装置。
【請求項１８】
分析装置は、画像が生成される時に一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに一定速度でＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用される請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
分析装置はフォーカス検索範囲内にあるサンプルの画像を周期的に生成する解像機構の制御に適用されると共に、各画像をフォーカス検索範囲内のＺ軸位置に関連付けさせ、各画像は定量可能なフォーカス・インデックスを有する請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
定量可能なフォーカス・インデックスは一定である請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
分析装置は、一以上の画像の他の画像に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較すると共に、他の画像に対してより鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像を分析するのに適用される請求項１９記載の装置。
【請求項２２】
分析装置は、フォーカス検索範囲内のサンプルの単一画像を生成するために連続撮像する解像機構の制御に適用されると共に、固有のＺ軸位置を画像の特定部分と結合させ、各画像部分は定量可能なフォーカス・インデックスを有する請求項１８記載の装置。
【請求項１】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する方法であって、
Ｚ軸と平行なレンズ軸を有する対物レンズに対して、チャンバーをＺ軸位置に位置させるステップと、
一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対して移動させるステップと、
Ｚ軸に沿ったフォーカス検索範囲内を一方又は両方のチャンバー及び対物レンズが互いに対して移動している時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するステップと、を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
画像が生成される時に、一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに対してＺ軸に沿って一定速度で移動させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
画像を生成するステップは、フォーカス検索範囲内でＺ軸に関連付けられると共に、定量可能なフォーカス・インデックスを有する画像の周期的な生成を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
定量可能なフォーカス・インデックスが一定である請求項３記載の方法。
【請求項５】
一以上の画像の他の画像に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像に対してより鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像を分析するステップと、をさらに備える請求項３記載の方法。
【請求項６】
各画像のフォーカス・インデックスの相対量を決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像よりも大きな相対量のフォーカス・インデックスに関連するＺ軸位置で取得された画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項４記載の方法。
【請求項７】
フォーカス検索範囲内で取得された個々の画像のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量をプロットするステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像を識別するステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項６記載の方法。
【請求項８】
フォーカス検索範囲内で取得された画像のために、個々の画像のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量に多項方程式を適合するステップと、
多項方程式の勾配の変化を識別するステップと、
勾配の変化と関連するＺ軸位置で取得された画像を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項６記載の方法。
【請求項９】
フォーカス検索範囲内にあるサンプルの単一画像を生成するために、サンプルの連続撮像を含む一以上のサンプル画像を生成するステップにおいて、画像がフォーカス検索範囲内のＺ軸位置に関連すると共に定量可能なフォーカス・インデックスを有する複数の部分を備える請求項２記載の方法。
【請求項１０】
定量可能なフォーカス・インデックスが一定である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
一以上の画像部分の他の画像部分に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像部分のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像に対して鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像部分を分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
各画像のフォーカス・インデックスの相対量を決定するために、画像部分のフォーカス・インデックスを比較するステップと、
他の画像よりも大きな相対量のフォーカス・インデックスに関連するＺ軸位置で取得された画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
個々の画像部分のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量をプロットするステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像部分を識別するステップと、
プロットのピークに位置するフォーカス・インデックスを有する画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個々の画像部分のＺ軸位置に対するフォーカス・インデックスの相対量に多項方程式を適合するステップと、
多項方程式の勾配の変化を識別するステップと、
勾配の変化と関連するＺ軸位置で取得された画像部分を用いてサンプルを分析するステップと、をさらに備える請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
一定速度は、画像が生成される近接したＺ軸に沿った位置間の距離を一つの画像を生成するのに掛かる時間で除算した値よりも低い請求項２記載の方法。
【請求項１６】
画像を生成するステップは、チャンバーの第一の部分に配置されたフォーカス検索範囲内にあるサンプルを不連続な画像で周期的に生成すると共に、サンプルの単一画像を生成するために、チャンバーの一以上の第二の部分に配置されたフォーカス検索範囲内にあるサンプルを連続的に撮像するステップを含み、
チャンバーの第一の部分に配置されたサンプルの不連続な画像は、Ｚ軸位置と関連付けられると共に、定量可能なフォーカス・インデックスを有し、
チャンバーの第二の部分に配置されたサンプルの連続的な画像は、Ｚ軸位置と関連付けられると共に、小部分と定量可能なフォーカス・インデックスとを有する請求項２記載の方法。
【請求項１７】
チャンバー内に静止状態で存在する生物学的液体サンプルを撮像する装置であって、
レンズ軸を有する対物レンズを備えたフィールド照明装置と、
一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対して位置決めするのに適用される位置決め装置と、
チャンバー内のサンプルの撮像に適用される解像機構と、
一方又は両方の対物レンズ及びチャンバーを互いに対して一定速度でレンズ軸と平行なＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用され、かつ、一方又は両方のチャンバー及び対物レンズがＺ軸に沿ったフォーカス検索範囲内を互いに対して一定速度で移動している時に、生物学的液体サンプルの一以上の画像を生成するのに適用されるプログラム可能な分析装置と、を備えることを特徴とする装置。
【請求項１８】
分析装置は、画像が生成される時に一方又は両方のチャンバー及び対物レンズを互いに一定速度でＺ軸に沿って移動させる位置決め装置の制御に適用される請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
分析装置はフォーカス検索範囲内にあるサンプルの画像を周期的に生成する解像機構の制御に適用されると共に、各画像をフォーカス検索範囲内のＺ軸位置に関連付けさせ、各画像は定量可能なフォーカス・インデックスを有する請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
定量可能なフォーカス・インデックスは一定である請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
分析装置は、一以上の画像の他の画像に対するより鮮明なフォーカス・インデックスを決定するために、画像のフォーカス・インデックスを比較すると共に、他の画像に対してより鮮明なフォーカス・インデックスを有する少なくとも一つの画像を分析するのに適用される請求項１９記載の装置。
【請求項２２】
分析装置は、フォーカス検索範囲内のサンプルの単一画像を生成するために連続撮像する解像機構の制御に適用されると共に、固有のＺ軸位置を画像の特定部分と結合させ、各画像部分は定量可能なフォーカス・インデックスを有する請求項１８記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５１６６５０（Ｐ２０１３−５１６６５０Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４７３１２（Ｐ２０１２−５４７３１２）
【出願日】平成２２年１２月３０日（２０１０．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６２５７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８２３４４
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０１３５４５２１）アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月３０日（２０１０．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６２５７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８２３４４
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０１３５４５２１）アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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