生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子およびその製造方法、ならびに当該ナノ粒子からなる外用剤
【課題】 生理活性タンパク質またはペプチドについて、皮膚ならびに粘膜経由の投与方法により、生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティーを発揮し、その効果が注射投与に匹敵するものである、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を提供すること。
【解決手段】 生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子であり、また当該ナノ粒子を有効成分として含有する外用剤である。
【解決手段】 生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子であり、また当該ナノ粒子を有効成分として含有する外用剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子に関し、さらに詳細には、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子およびその製造方法、ならびに当該ナノ粒子からなる外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテテクノロジー、ヒトゲノム解析の進歩により、生理活性タンパク質の医薬品としての重要性がますます高くなってきている。生理活性タンパク質は消化管に存在するペプチダーゼによる不活性化を受けるため、経口投与することができず、通常注射により体内投与が行われている。しかしながら、このような方法は、患者にとって注射部位での疼痛を与え、好ましいものではない。また、通常の間隔で投与を行う場合には、患者に著しい苦痛を与えることとなる。したがって安全、かつ頻回に投与するためには簡便であり、自己投与可能な非注射投与方法の開発が望まれている。
【０００３】
近年、注射によらず皮膚、粘膜などから生理活性タンパク質を活性体のまま高濃度で生体内吸収させる技術の開発が、治療学的研究、特にＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）研究における重要なテーマの一つとなっている。しかしながら、ヒトへの吸収性、生物学的利用能（バイオアベイラビリティー）においては、未だ満足する結果は得られておらず、生理活性タンパク質について、皮膚、粘膜経由の投与法、特に経皮吸収投与方法はほとんど成功していないのが現状である。
【０００４】
事実、生理活性タンパク質の一つとして、比較的低分子で、しかも化学的に安定なインスリンを用いて皮膚、粘膜経由の投与法について種々の研究が行われているが、その吸収率は、皮膚、消化器粘膜、気道粘膜の順で高くなっているものの、それでも粘膜経由の投与での吸収率は、確実なデータでは、数パーセントにすぎず、皮膚経由の投与ではほとんど吸収されないとされている（非特許文献１）。
【０００５】
また、生理活性タンパク質をカルシウム含有水難溶性無機物粒子に封入した製剤（特許文献１）、生理活性タンパク質あるいはペプチドと亜鉛イオンとの沈殿物による水不溶性徐放性組成物（特許文献２）などが提案されている。しかしながら、これらの製剤は、薬物の吸収性、あるいは局所刺激等の点で十分なものとは言い難く、未だ実用化に至ったものはない。また、本発明が目的とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を用いて皮膚、粘膜経由により生体内吸収させようとする技術については、これまで一切知られているものではない。
【０００６】
【特許文献１】国際公開 ＷＯ ０２／０９６３９６号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１８６５号公報
【非特許文献１】DRUG DELIVERY SYSTEM 今日のＤＤＳ 薬物送達システム（医薬ジャーナル社）325〜331頁、1999年
【非特許文献２】臨床薬理（Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther.）26(1), p.127-128（1995）
【非特許文献３】Yakugaku Zasshi, 121(12), p.929-948 (2001)
【非特許文献４】J. Controlled Release, 79, p.81-91 (2002)
【０００７】
上述したように、生理活性タンパク質は、経口投与ではその薬効を発揮することができず、主に注射投与によるものである。したがって、患者への注射による苦痛感を解除し、自己投与が可能な投与方法の簡便化のためには、注射投与に代わる非経口投与手段として皮膚、粘膜経由の投与方法が効果的ではあるが、未だ吸収性、バイオアベイラビリティーにおいて満足するものはなく、高い生体内吸収性および生物学的利用率を有する薬剤の出現が、医療の現場で強く望まれているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明は、これまで経口投与ではその薬効を発揮することができず、主に注射投与がなされてきた生理活性タンパク質またはペプチドについて、皮膚ならびに粘膜経由の投与方法により、生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティーを発揮し得る技術を提供することを課題とする。
【０００９】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、ナノテクノロジーを応用し、赤血球よりも遥かに小さい、いわゆるナノ粒子を利用し、そこに生理活性タンパク質またはペプチドを含有させることに成功し、かくして得られたナノ粒子を、皮膚ならびに粘膜経由による投与を行った場合、ナノ粒子に含有された生理活性タンパク質またはペプチドの生体内への高い吸収性が得られ、バイオアベイラビリティーに優れたものであることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって本発明は、皮膚または粘膜投与により優れた吸収性、バイオアベイラビリティーを有する、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子、
（２）一次ナノ粒子が、水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、これを多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより作製されるものである（１）に記載のナノ粒子、
（３）粒子の直径が５〜１５０ｎｍである（１）または（２）に記載のナノ粒子、
（４）粒子の直径が１０〜８０ｎｍである（１）または（２）に記載のナノ粒子、
（５）生理活性タンパク質またはペプチドが、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および酵素から選択されるものである（１）〜（４）に記載のナノ粒子、
（６）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が、２価または３価の金属イオンとの接触、酸性または塩基性多糖体との接触、ｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段である（１）に記載のナノ粒子、
（７）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とするために接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである（６）に記載のナノ粒子、
（８）疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物が、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびそれらの塩から選択されるものである（１）ないし（４）に記載のナノ粒子、
（９）一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩または尿酸塩である（１）ないし（４）に記載のナノ粒子、
（１０）上記（１）ないし（９）のいずれかに記載のナノ粒子からなることを特徴とする皮膚または粘膜用外用剤、
（１１）外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤および貼付剤から選択されるものである（１０）に記載の外用剤、
（１２）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液に２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次加えることを特徴とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の製造方法、
（１３）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が２価または３価の金属イオンとの接触であり、一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩である（１２）に記載のナノ粒子の製造方法、
（１４）金属イオンが亜鉛イオンである（１３）に記載のナノ粒子の製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有される生理活性タンパク質またはペプチドを皮膚または粘膜経由により生体内吸収させるものであり、注射投与に代わり得る生体内吸収性を示すものである。したがって、これまで達成されていなかった生理活性タンパク質またはペプチドの経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、高吸収性の生理活性タンパク質およびペプチドを含有する外用剤が創製される優れた効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、上記するように、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子とし、次いで、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子、その製造方法、および当該ナノ粒子からなる外用剤である。
【００１３】
本発明のナノ粒子は、その直径は５〜１５０ｎｍ程度であり、好ましくは１０〜８０ｎｍ程度である。かかる粒子径は、含有させる生理活性タンパク質またはペプチドの水不溶体と中長鎖有機化合物との配合量比率、使用する溶媒の量、攪拌の強度によって調整することができ、直径５〜５００ｎｍ程度の粒子を作製することができる。なお、中長鎖有機化合物の配合量を多くすると、粒子径が小さなものとなることが判明した。粒子径の測定は、光散乱法あるいは電子顕微鏡下で測定することができる。
【００１４】
本発明が提供するナノ粒子に含有される生理活性タンパク質またはペプチドとしては、特に限定されないが、２価または３価の金属塩により沈澱物を形成するものが好ましい。そのような生理活性タンパク質またはペプチドとしては、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＥＦＧ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および各種酵素をあげることができる。その中でも、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチンが特に好ましいものである。
【００１５】
本発明のナノ粒子を製造する場合において、最初に生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする。この水不溶体とする手段として最も好ましいものは、生理活性タンパク質またはペプチドと沈澱物を形成する２価または３価の金属イオンを使用することである。そのような２価または３価の金属イオンとしては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩による亜鉛イオン；塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム塩によるカルシウムイオン；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩による鉄イオン；塩化銅、硫酸銅などの銅塩による銅イオン等をあげることができ、なかでも亜鉛イオンを好ましく使用することができる。
【００１６】
この場合の生理活性タンパク質またはペプチドと２価または３価の金属イオンとの配合比は特に限定されず、両物質が結合することにより水不溶体が生じるに十分な比率であればよい。例えば、亜鉛イオンの場合には、生理活性タンパク質またはペプチドと亜鉛塩とを、重量比で１０：１〜１：２程度とするのがよい。その他の水不溶化方法として、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサンなどの酸性または塩基性多糖体と接触させること、あるいは生理活性タンパク質またはペプチドを溶解した溶液のｐＨ調節、イオン強度の変化などにより行うことも可能である。なお、生理活性タンパク質またはペプチド自体が水不溶性である場合には、そのまま使用することができる。
【００１７】
本発明のナノ粒子を製造するためには、疎水基と、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基などの陰イオン残基を併せもつ化合物を配合する必要がある。そのような疎水基と陰イオン残基を併せもつ有機化合物であればどのようなものでも使用することができるが、なかでもカルボキシル基を有する中長鎖有機化合物が特に好ましい。そのような中長鎖有機化合物としては、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸が好ましい。中長鎖有機化合物は粉末である場合にはそのまま加えることが可能であるが、有機溶媒または含水有機溶媒中に溶解して使用するのが好ましい。そのような有機溶媒としては、アセトン；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが使用でき、なかでもアセトン、エタノールが好ましい。なお、生理活性タンパク質またはペプチドと中長鎖有機化合物との配合重量比は、１：０．５〜１：０．０３程度とするのが好ましい。
【００１８】
本発明のナノ粒子を製造するに際しては、生成したナノ粒子同士の凝集を避けるために、適量の界面活性剤を添加するのが好ましく、その配合量はナノ粒子同士が凝集しない程度で適宜選択することができ、中長鎖有機化合物に対しモル比で０．３〜０．０３程度使用するのがよい。そのような界面活性剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Tween 80）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を使用することができ、なかでもポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Tween 80）が好ましい。
【００１９】
本発明の最も重要な特徴は、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いることにより、一次ナノ粒子を作製した後、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより、金属塩と塩基性塩が順次結合して、結果的に一次ナノ粒子の周囲を水不溶性の金属塩が覆う状態を有する結合体とすることである。
【００２０】
かくして得られた結合体自体が、本発明が目的とするナノ粒子そのものであり、驚くべきことに、このナノ粒子を経皮、経粘膜投与した場合に、当該ナノ粒子がキャリヤとして作用し、そこに含有された生理活性タンパク質またはペプチドを良好に生体内吸収させるものであり、その生体内吸収性は、注射投与に代わり得るものとなる。
【００２１】
使用される２価または３価の金属塩としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；または塩化銅、硫化銅などの銅塩であり、なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、有効成分となる生理活性タンパク質またはペプチドに対し、重量比で３〜０．０１程度であるのが好ましい。
【００２２】
また、２価または３価の塩基性塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩；尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などであり、なかでも炭酸塩、特に炭ナトリウムが好ましい。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、上記の金属塩に対し、モル比で１．０〜０．０５程度であるのが好ましい。
【００２３】
以下に、本発明が提供するナノ粒子の製造方法について、説明する。
先ず、生理活性タンパク質またはペプチドを酸性、塩基性または中性の水に溶解し、その溶液に２価または３価の金属イオンを加え、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする。この懸濁液に、中長鎖有機化合物と界面活性剤を有機溶媒あるいは含水有機溶媒に溶解した液を加え、完全に溶解させ、この溶液を多量の水に、攪拌、振とうしながら加える。この溶液を１〜３０分間程度攪拌することにより、一次ナノ粒子が作製される。かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間攪拌し、次いで２価または３価の塩基塩を加え、１〜３０分攪拌することにより本発明のナノ粒子を製造することができる。
【００２４】
かくして製造された本発明の生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の溶液を凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等することにより溶媒を除去し、製剤用組成物として、適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の外用剤を調製することができる。
【００２５】
本発明は、また、そのような生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を有効成分として含有する皮膚、粘膜用の外用剤を提供するものでもある。そのような外用剤としては、全身および局所投与・治療を目的として局所へ塗布、貼付、滴下、噴霧などの形態で投与しうる形態で適用し得るものであり、具体的には、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤、貼付剤等をあげることができる。皮膚または粘膜への塗布、上気道への噴霧などが有効な投与形態である。
【００２６】
これらの外用剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に外用剤の調製に使用されている基剤、成分をあげることができる。具体的には、ワセリン、プラチスベース、パラフィン、流動パラフィン、軽質流動パラフィン、サラシミツロウ、シリコン油などの油脂性基剤；水、マクロゴール、エタノール、メチルエチルケトン、綿実油、オリーブ油、落花生油などの溶剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキスプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤；ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），キサンタンガム、トラガントガム、ゼラチン、アラビアゴム、アルブミンなどの増粘剤；ジブチルヒドロキシトルエンなどの安定化剤；グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、尿素、ショ糖、エリスリトールソルビトールなどの保湿剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｐ−クレゾールなどの防腐剤等であり、剤型に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２７】
例えば、本発明のナノ粒子を有効成分として含有する軟膏剤の場合には、基剤等の成分としてワセリンを使用し、懸濁安定化するために０．０５〜０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を一緒に使用するのがよい。
【００２８】
本発明を、以下の実施例、試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：
インスリン１ｍｇ（２１ ＩＵ）を、１Ｍ塩酸１μＬおよび蒸留水９９μＬに溶解した。この溶液に塩化亜鉛０．４ｍｇを加え、次いで、ミリスチン酸６．５ｍｇをアセトン１００μＬに溶解しさらに水３０μＬを加えた溶液のうち１０μＬを加えた。この溶液に２μＬのTween 80を加え、蒸留水９８μＬを加えて攪拌した。以上の混合液を５ｍＬの蒸留水に加え、よく攪拌することにより、一次ナノ粒子を作製した。この溶液に５Ｍ塩化カルシウム水溶液１５μＬを加え、３０分間攪拌し、さらに１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液１５μＬを加えて５分間攪拌し、３０分間放置することにより、ナノ粒子（本発明のナノ粒子）を作製した。このナノ粒子を含む溶液を一夜凍結乾燥した。得られたナノ粒子について光散乱法ならびに電子顕微鏡による粒度観察をしたところ、大部分の粒子の直径が１０〜９０ｎｍであり、６０ｎｍのものが最も多く存在していた。
【００３０】
このナノ粒子を用い、ワセリンあるいは１％ＣＭＣ溶液に所定量のインスリン量を再分散させ、混和して軟膏またはゾルを得た。
以上のようにして製造された軟膏またはゾル（以下「本製剤」という場合もある）を、以下の動物実験に使用した。
【実施例２】
【００３１】
実施例２：
実施例１における５Ｍ塩化カリウム水溶液１５μＬに代え、５Ｍ酢酸亜鉛水溶液１５μＬを使用したほかは、実施例１と同様の操作を行い、本発明のナノ粒子を製造した。
【実施例３】
【００３２】
試験例１：皮膚透過性試験（先天性糖尿病発症マウス）
先天性糖尿病発症マウスＫＫＡｙ／ｔａ雄性、５週齢（日本クレア）９匹を搬入後、1週間予備飼育を行い、1週間後にグルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）で血糖値を測定し、糖尿病を発症していることを確認後、実験に供した。
３匹のマウスの背を電気バリカンで皮膚表面を傷つけないように剪毛して、本製剤（インスリン量：３μｇ）を背部に塗布した。
他の３匹のマウスには、実施例１における凍結乾燥後のペースト状のナノ粒子を生理食塩水に再分散させた懸濁液（インスリン量：２μｇ）を皮下注射した。
さらにもう一群の３匹を無投与とし、コントロールとした。
【００３３】
マウスは絶食後２時間から試験を開始し、インスリン投与前、投与後１、２、３、４、６および２４時間後毎に尾静脈から採血し、血糖値を、グルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）を使用して測定した。
なお、マウスは試験開始後６時間後には餌を自由摂取とし、２２時間後には餌の摂取を停止させた。
その結果を表１に示し、またその血糖値の推移を図１に示した。
【００３４】
【表１】
【実施例４】
【００３５】
試験例２：皮膚透過性試験（糖尿病発症ラット）
血糖値および体調が正常範囲であるwistar系雄性ラット（８週齢）を３匹使用して、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３週間連続投与し、血糖値測定により糖尿病の発症を確認し、本試験に使用した。
２匹のラットの背毛を試験例１と同様に剪毛して、各ラットに本製剤（インスリン量：２０μｇおよび５μｇ）を背部皮膚に塗布した。
残りの１匹のラットは、無投与コントロールとした。
【００３６】
ラットは絶食後２時間から試験を開始し、インスリン投与前、投与後３０、６０、９０分、２、３、４、６、２４および４８時間後毎に尾静脈から採血し、血糖値を、グルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）を使用して測定した。
なお、ラットは試験開始後６時間後には餌を自由摂取とし、２２および４６時間後には餌の摂取を停止させた。
その結果を表２に示し、血糖値の推移を図２に示した。
【００３７】
【表２】
【実施例５】
【００３８】
試験例３：
試験例１および２で使用したマウスおよびラットについて、本製剤を塗布した部分の皮膚を採取し、標本を作製した。アリザリンＳを用いてカルシウム染色し、本製剤の経皮吸収性を、カルシウムをマーカーとして検討した。
その結果、試験例１で使用したマウス（動物番号１〜３）および試験例２で使用したラット（動物番号１，２）とも、本製剤を塗布した皮膚には、本製剤の経皮吸収性を認めるカルシウム染色の陽性が確認された。
【００３９】
以上の試験例１および試験例２の結果を示す表１および２、ならびに図１および２から明らかなように、本製剤は、先天性糖尿病発症マウスおよびストレプトゾトシン発症糖尿病ラットにおいて、本製剤を皮膚塗布することにより、有意な血糖値の低下が観測され、その血糖値低下作用は持続性のものであった。さらにその血糖値低下作用は、皮下注射投与に匹敵するものであった。
このことは、インスリンを含有するナノ粒子を有効成分とした本製剤を皮膚投与することで、良好にインスリンが生体内吸収され、血糖値を低下させていることを示すものである。また、その点は、試験例３の結果からも支持されていた。
したがって、インスリンを含有するナノ粒子を有効成分とした本製剤は、これまでの注射投与によるインスリン投与製剤に比較し、著しく患者にメリットがあるものであり、臨床上極めて有効なものである。
【実施例６】
【００４０】
実施例３：
ヒト成長ホルモン１ｍｇを蒸留水１００μＬに溶解し、この溶液に塩化亜鉛１００μｇを加え、攪拌後静置した。次いで２％tween 80水溶液１００μＬを加え、攪拌した後、０．１〜０．５ｍｇのミリスチン酸をアセトン１００μＬに溶解した溶液を加え、さらに5分間攪拌することにより一次ナノ粒子を作製した。次に、０．５Ｍ塩化カルシウム水溶液３０μＬを加え、３０分間攪拌した。その後０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３０μＬを加えて３０分間攪拌することにより、ヒト成長ホルモンを含有する本発明のナノ粒子を作製した。
この溶液中に含まれるナノ粒子の粒径を光散乱法により測定したところ、大部分のナノ粒子の直径は１０〜９０ｎｍのものであった。特に、ミリスチン酸を０．３ｍｇ添加した場合には、粒径が５０ｎｍのものが最も多く存在した。
【実施例７】
【００４１】
製剤例１：軟膏剤／ハイドロゲル剤
実施例１で得られた本発明のナノ粒子、白色ワセリン、カルボキシメチルセルロースおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量をとり、全量が均質になるまで混和し、軟膏剤およびハイドロゲル剤とした。
【実施例８】
【００４２】
製剤例２：外用貼付剤（水性パップ剤）
実施例１のナノ粒子 ０．１重量部
ポリアクリル酸 ２．０重量部
ポリアクリル酸ナトリウム ５．０重量部
カルボキシメチルセルロースナトリウム ２．０重量部
ゼラチン ２．０重量部
ポリビニルアルコール ０．５重量部
グリセリン ２５．０重量部
カオリン １．０重量部
水酸化アルミニウム ０．６重量部
酒石酸 ０．４重量部
ＥＤＴＡ−２−ナトリウム ０．１重量部
精製水 残 部
上記成分配合をベースとし、常法により外用貼付剤（水性パップ剤）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上記載のように、本発明は生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子とし、次いで、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子である。当該本発明のナノ粒子は、そこに含有される生理活性タンパク質またはペプチドを皮膚または粘膜経由により生体内吸収させるものであり、注射投与に代わり得る生体内吸収性を示すものである。したがって、これまで達成されていなかった生理活性タンパク質またはペプチドの経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、生理活性タンパク質およびペプチドを含有する高吸収性の外用剤が創製され、医療上の価値は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】試験例１におけるマウスの血糖値の推移を示す図である。
【図２】試験例２におけるラットの血糖値の推移を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子に関し、さらに詳細には、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子およびその製造方法、ならびに当該ナノ粒子からなる外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテテクノロジー、ヒトゲノム解析の進歩により、生理活性タンパク質の医薬品としての重要性がますます高くなってきている。生理活性タンパク質は消化管に存在するペプチダーゼによる不活性化を受けるため、経口投与することができず、通常注射により体内投与が行われている。しかしながら、このような方法は、患者にとって注射部位での疼痛を与え、好ましいものではない。また、通常の間隔で投与を行う場合には、患者に著しい苦痛を与えることとなる。したがって安全、かつ頻回に投与するためには簡便であり、自己投与可能な非注射投与方法の開発が望まれている。
【０００３】
近年、注射によらず皮膚、粘膜などから生理活性タンパク質を活性体のまま高濃度で生体内吸収させる技術の開発が、治療学的研究、特にＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）研究における重要なテーマの一つとなっている。しかしながら、ヒトへの吸収性、生物学的利用能（バイオアベイラビリティー）においては、未だ満足する結果は得られておらず、生理活性タンパク質について、皮膚、粘膜経由の投与法、特に経皮吸収投与方法はほとんど成功していないのが現状である。
【０００４】
事実、生理活性タンパク質の一つとして、比較的低分子で、しかも化学的に安定なインスリンを用いて皮膚、粘膜経由の投与法について種々の研究が行われているが、その吸収率は、皮膚、消化器粘膜、気道粘膜の順で高くなっているものの、それでも粘膜経由の投与での吸収率は、確実なデータでは、数パーセントにすぎず、皮膚経由の投与ではほとんど吸収されないとされている（非特許文献１）。
【０００５】
また、生理活性タンパク質をカルシウム含有水難溶性無機物粒子に封入した製剤（特許文献１）、生理活性タンパク質あるいはペプチドと亜鉛イオンとの沈殿物による水不溶性徐放性組成物（特許文献２）などが提案されている。しかしながら、これらの製剤は、薬物の吸収性、あるいは局所刺激等の点で十分なものとは言い難く、未だ実用化に至ったものはない。また、本発明が目的とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を用いて皮膚、粘膜経由により生体内吸収させようとする技術については、これまで一切知られているものではない。
【０００６】
【特許文献１】国際公開 ＷＯ ０２／０９６３９６号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１８６５号公報
【非特許文献１】DRUG DELIVERY SYSTEM 今日のＤＤＳ 薬物送達システム（医薬ジャーナル社）325〜331頁、1999年
【非特許文献２】臨床薬理（Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther.）26(1), p.127-128（1995）
【非特許文献３】Yakugaku Zasshi, 121(12), p.929-948 (2001)
【非特許文献４】J. Controlled Release, 79, p.81-91 (2002)
【０００７】
上述したように、生理活性タンパク質は、経口投与ではその薬効を発揮することができず、主に注射投与によるものである。したがって、患者への注射による苦痛感を解除し、自己投与が可能な投与方法の簡便化のためには、注射投与に代わる非経口投与手段として皮膚、粘膜経由の投与方法が効果的ではあるが、未だ吸収性、バイオアベイラビリティーにおいて満足するものはなく、高い生体内吸収性および生物学的利用率を有する薬剤の出現が、医療の現場で強く望まれているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明は、これまで経口投与ではその薬効を発揮することができず、主に注射投与がなされてきた生理活性タンパク質またはペプチドについて、皮膚ならびに粘膜経由の投与方法により、生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティーを発揮し得る技術を提供することを課題とする。
【０００９】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、ナノテクノロジーを応用し、赤血球よりも遥かに小さい、いわゆるナノ粒子を利用し、そこに生理活性タンパク質またはペプチドを含有させることに成功し、かくして得られたナノ粒子を、皮膚ならびに粘膜経由による投与を行った場合、ナノ粒子に含有された生理活性タンパク質またはペプチドの生体内への高い吸収性が得られ、バイオアベイラビリティーに優れたものであることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって本発明は、皮膚または粘膜投与により優れた吸収性、バイオアベイラビリティーを有する、生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子、
（２）一次ナノ粒子が、水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、これを多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより作製されるものである（１）に記載のナノ粒子、
（３）粒子の直径が５〜１５０ｎｍである（１）または（２）に記載のナノ粒子、
（４）粒子の直径が１０〜８０ｎｍである（１）または（２）に記載のナノ粒子、
（５）生理活性タンパク質またはペプチドが、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および酵素から選択されるものである（１）〜（４）に記載のナノ粒子、
（６）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が、２価または３価の金属イオンとの接触、酸性または塩基性多糖体との接触、ｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段である（１）に記載のナノ粒子、
（７）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とするために接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである（６）に記載のナノ粒子、
（８）疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物が、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびそれらの塩から選択されるものである（１）ないし（４）に記載のナノ粒子、
（９）一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩または尿酸塩である（１）ないし（４）に記載のナノ粒子、
（１０）上記（１）ないし（９）のいずれかに記載のナノ粒子からなることを特徴とする皮膚または粘膜用外用剤、
（１１）外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤および貼付剤から選択されるものである（１０）に記載の外用剤、
（１２）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液に２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次加えることを特徴とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の製造方法、
（１３）生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が２価または３価の金属イオンとの接触であり、一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩である（１２）に記載のナノ粒子の製造方法、
（１４）金属イオンが亜鉛イオンである（１３）に記載のナノ粒子の製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有される生理活性タンパク質またはペプチドを皮膚または粘膜経由により生体内吸収させるものであり、注射投与に代わり得る生体内吸収性を示すものである。したがって、これまで達成されていなかった生理活性タンパク質またはペプチドの経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、高吸収性の生理活性タンパク質およびペプチドを含有する外用剤が創製される優れた効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、上記するように、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子とし、次いで、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子、その製造方法、および当該ナノ粒子からなる外用剤である。
【００１３】
本発明のナノ粒子は、その直径は５〜１５０ｎｍ程度であり、好ましくは１０〜８０ｎｍ程度である。かかる粒子径は、含有させる生理活性タンパク質またはペプチドの水不溶体と中長鎖有機化合物との配合量比率、使用する溶媒の量、攪拌の強度によって調整することができ、直径５〜５００ｎｍ程度の粒子を作製することができる。なお、中長鎖有機化合物の配合量を多くすると、粒子径が小さなものとなることが判明した。粒子径の測定は、光散乱法あるいは電子顕微鏡下で測定することができる。
【００１４】
本発明が提供するナノ粒子に含有される生理活性タンパク質またはペプチドとしては、特に限定されないが、２価または３価の金属塩により沈澱物を形成するものが好ましい。そのような生理活性タンパク質またはペプチドとしては、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＥＦＧ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および各種酵素をあげることができる。その中でも、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチンが特に好ましいものである。
【００１５】
本発明のナノ粒子を製造する場合において、最初に生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする。この水不溶体とする手段として最も好ましいものは、生理活性タンパク質またはペプチドと沈澱物を形成する２価または３価の金属イオンを使用することである。そのような２価または３価の金属イオンとしては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩による亜鉛イオン；塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム塩によるカルシウムイオン；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩による鉄イオン；塩化銅、硫酸銅などの銅塩による銅イオン等をあげることができ、なかでも亜鉛イオンを好ましく使用することができる。
【００１６】
この場合の生理活性タンパク質またはペプチドと２価または３価の金属イオンとの配合比は特に限定されず、両物質が結合することにより水不溶体が生じるに十分な比率であればよい。例えば、亜鉛イオンの場合には、生理活性タンパク質またはペプチドと亜鉛塩とを、重量比で１０：１〜１：２程度とするのがよい。その他の水不溶化方法として、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサンなどの酸性または塩基性多糖体と接触させること、あるいは生理活性タンパク質またはペプチドを溶解した溶液のｐＨ調節、イオン強度の変化などにより行うことも可能である。なお、生理活性タンパク質またはペプチド自体が水不溶性である場合には、そのまま使用することができる。
【００１７】
本発明のナノ粒子を製造するためには、疎水基と、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基などの陰イオン残基を併せもつ化合物を配合する必要がある。そのような疎水基と陰イオン残基を併せもつ有機化合物であればどのようなものでも使用することができるが、なかでもカルボキシル基を有する中長鎖有機化合物が特に好ましい。そのような中長鎖有機化合物としては、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸が好ましい。中長鎖有機化合物は粉末である場合にはそのまま加えることが可能であるが、有機溶媒または含水有機溶媒中に溶解して使用するのが好ましい。そのような有機溶媒としては、アセトン；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが使用でき、なかでもアセトン、エタノールが好ましい。なお、生理活性タンパク質またはペプチドと中長鎖有機化合物との配合重量比は、１：０．５〜１：０．０３程度とするのが好ましい。
【００１８】
本発明のナノ粒子を製造するに際しては、生成したナノ粒子同士の凝集を避けるために、適量の界面活性剤を添加するのが好ましく、その配合量はナノ粒子同士が凝集しない程度で適宜選択することができ、中長鎖有機化合物に対しモル比で０．３〜０．０３程度使用するのがよい。そのような界面活性剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Tween 80）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を使用することができ、なかでもポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Tween 80）が好ましい。
【００１９】
本発明の最も重要な特徴は、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いることにより、一次ナノ粒子を作製した後、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより、金属塩と塩基性塩が順次結合して、結果的に一次ナノ粒子の周囲を水不溶性の金属塩が覆う状態を有する結合体とすることである。
【００２０】
かくして得られた結合体自体が、本発明が目的とするナノ粒子そのものであり、驚くべきことに、このナノ粒子を経皮、経粘膜投与した場合に、当該ナノ粒子がキャリヤとして作用し、そこに含有された生理活性タンパク質またはペプチドを良好に生体内吸収させるものであり、その生体内吸収性は、注射投与に代わり得るものとなる。
【００２１】
使用される２価または３価の金属塩としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；または塩化銅、硫化銅などの銅塩であり、なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、有効成分となる生理活性タンパク質またはペプチドに対し、重量比で３〜０．０１程度であるのが好ましい。
【００２２】
また、２価または３価の塩基性塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩；尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などであり、なかでも炭酸塩、特に炭ナトリウムが好ましい。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、上記の金属塩に対し、モル比で１．０〜０．０５程度であるのが好ましい。
【００２３】
以下に、本発明が提供するナノ粒子の製造方法について、説明する。
先ず、生理活性タンパク質またはペプチドを酸性、塩基性または中性の水に溶解し、その溶液に２価または３価の金属イオンを加え、生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする。この懸濁液に、中長鎖有機化合物と界面活性剤を有機溶媒あるいは含水有機溶媒に溶解した液を加え、完全に溶解させ、この溶液を多量の水に、攪拌、振とうしながら加える。この溶液を１〜３０分間程度攪拌することにより、一次ナノ粒子が作製される。かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間攪拌し、次いで２価または３価の塩基塩を加え、１〜３０分攪拌することにより本発明のナノ粒子を製造することができる。
【００２４】
かくして製造された本発明の生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の溶液を凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等することにより溶媒を除去し、製剤用組成物として、適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の外用剤を調製することができる。
【００２５】
本発明は、また、そのような生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子を有効成分として含有する皮膚、粘膜用の外用剤を提供するものでもある。そのような外用剤としては、全身および局所投与・治療を目的として局所へ塗布、貼付、滴下、噴霧などの形態で投与しうる形態で適用し得るものであり、具体的には、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤、貼付剤等をあげることができる。皮膚または粘膜への塗布、上気道への噴霧などが有効な投与形態である。
【００２６】
これらの外用剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に外用剤の調製に使用されている基剤、成分をあげることができる。具体的には、ワセリン、プラチスベース、パラフィン、流動パラフィン、軽質流動パラフィン、サラシミツロウ、シリコン油などの油脂性基剤；水、マクロゴール、エタノール、メチルエチルケトン、綿実油、オリーブ油、落花生油などの溶剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキスプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤；ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），キサンタンガム、トラガントガム、ゼラチン、アラビアゴム、アルブミンなどの増粘剤；ジブチルヒドロキシトルエンなどの安定化剤；グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、尿素、ショ糖、エリスリトールソルビトールなどの保湿剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｐ−クレゾールなどの防腐剤等であり、剤型に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２７】
例えば、本発明のナノ粒子を有効成分として含有する軟膏剤の場合には、基剤等の成分としてワセリンを使用し、懸濁安定化するために０．０５〜０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を一緒に使用するのがよい。
【００２８】
本発明を、以下の実施例、試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：
インスリン１ｍｇ（２１ ＩＵ）を、１Ｍ塩酸１μＬおよび蒸留水９９μＬに溶解した。この溶液に塩化亜鉛０．４ｍｇを加え、次いで、ミリスチン酸６．５ｍｇをアセトン１００μＬに溶解しさらに水３０μＬを加えた溶液のうち１０μＬを加えた。この溶液に２μＬのTween 80を加え、蒸留水９８μＬを加えて攪拌した。以上の混合液を５ｍＬの蒸留水に加え、よく攪拌することにより、一次ナノ粒子を作製した。この溶液に５Ｍ塩化カルシウム水溶液１５μＬを加え、３０分間攪拌し、さらに１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液１５μＬを加えて５分間攪拌し、３０分間放置することにより、ナノ粒子（本発明のナノ粒子）を作製した。このナノ粒子を含む溶液を一夜凍結乾燥した。得られたナノ粒子について光散乱法ならびに電子顕微鏡による粒度観察をしたところ、大部分の粒子の直径が１０〜９０ｎｍであり、６０ｎｍのものが最も多く存在していた。
【００３０】
このナノ粒子を用い、ワセリンあるいは１％ＣＭＣ溶液に所定量のインスリン量を再分散させ、混和して軟膏またはゾルを得た。
以上のようにして製造された軟膏またはゾル（以下「本製剤」という場合もある）を、以下の動物実験に使用した。
【実施例２】
【００３１】
実施例２：
実施例１における５Ｍ塩化カリウム水溶液１５μＬに代え、５Ｍ酢酸亜鉛水溶液１５μＬを使用したほかは、実施例１と同様の操作を行い、本発明のナノ粒子を製造した。
【実施例３】
【００３２】
試験例１：皮膚透過性試験（先天性糖尿病発症マウス）
先天性糖尿病発症マウスＫＫＡｙ／ｔａ雄性、５週齢（日本クレア）９匹を搬入後、1週間予備飼育を行い、1週間後にグルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）で血糖値を測定し、糖尿病を発症していることを確認後、実験に供した。
３匹のマウスの背を電気バリカンで皮膚表面を傷つけないように剪毛して、本製剤（インスリン量：３μｇ）を背部に塗布した。
他の３匹のマウスには、実施例１における凍結乾燥後のペースト状のナノ粒子を生理食塩水に再分散させた懸濁液（インスリン量：２μｇ）を皮下注射した。
さらにもう一群の３匹を無投与とし、コントロールとした。
【００３３】
マウスは絶食後２時間から試験を開始し、インスリン投与前、投与後１、２、３、４、６および２４時間後毎に尾静脈から採血し、血糖値を、グルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）を使用して測定した。
なお、マウスは試験開始後６時間後には餌を自由摂取とし、２２時間後には餌の摂取を停止させた。
その結果を表１に示し、またその血糖値の推移を図１に示した。
【００３４】
【表１】
【実施例４】
【００３５】
試験例２：皮膚透過性試験（糖尿病発症ラット）
血糖値および体調が正常範囲であるwistar系雄性ラット（８週齢）を３匹使用して、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３週間連続投与し、血糖値測定により糖尿病の発症を確認し、本試験に使用した。
２匹のラットの背毛を試験例１と同様に剪毛して、各ラットに本製剤（インスリン量：２０μｇおよび５μｇ）を背部皮膚に塗布した。
残りの１匹のラットは、無投与コントロールとした。
【００３６】
ラットは絶食後２時間から試験を開始し、インスリン投与前、投与後３０、６０、９０分、２、３、４、６、２４および４８時間後毎に尾静脈から採血し、血糖値を、グルコカード ダイアメータ（アークレイ ファクトリイ社製）を使用して測定した。
なお、ラットは試験開始後６時間後には餌を自由摂取とし、２２および４６時間後には餌の摂取を停止させた。
その結果を表２に示し、血糖値の推移を図２に示した。
【００３７】
【表２】
【実施例５】
【００３８】
試験例３：
試験例１および２で使用したマウスおよびラットについて、本製剤を塗布した部分の皮膚を採取し、標本を作製した。アリザリンＳを用いてカルシウム染色し、本製剤の経皮吸収性を、カルシウムをマーカーとして検討した。
その結果、試験例１で使用したマウス（動物番号１〜３）および試験例２で使用したラット（動物番号１，２）とも、本製剤を塗布した皮膚には、本製剤の経皮吸収性を認めるカルシウム染色の陽性が確認された。
【００３９】
以上の試験例１および試験例２の結果を示す表１および２、ならびに図１および２から明らかなように、本製剤は、先天性糖尿病発症マウスおよびストレプトゾトシン発症糖尿病ラットにおいて、本製剤を皮膚塗布することにより、有意な血糖値の低下が観測され、その血糖値低下作用は持続性のものであった。さらにその血糖値低下作用は、皮下注射投与に匹敵するものであった。
このことは、インスリンを含有するナノ粒子を有効成分とした本製剤を皮膚投与することで、良好にインスリンが生体内吸収され、血糖値を低下させていることを示すものである。また、その点は、試験例３の結果からも支持されていた。
したがって、インスリンを含有するナノ粒子を有効成分とした本製剤は、これまでの注射投与によるインスリン投与製剤に比較し、著しく患者にメリットがあるものであり、臨床上極めて有効なものである。
【実施例６】
【００４０】
実施例３：
ヒト成長ホルモン１ｍｇを蒸留水１００μＬに溶解し、この溶液に塩化亜鉛１００μｇを加え、攪拌後静置した。次いで２％tween 80水溶液１００μＬを加え、攪拌した後、０．１〜０．５ｍｇのミリスチン酸をアセトン１００μＬに溶解した溶液を加え、さらに5分間攪拌することにより一次ナノ粒子を作製した。次に、０．５Ｍ塩化カルシウム水溶液３０μＬを加え、３０分間攪拌した。その後０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３０μＬを加えて３０分間攪拌することにより、ヒト成長ホルモンを含有する本発明のナノ粒子を作製した。
この溶液中に含まれるナノ粒子の粒径を光散乱法により測定したところ、大部分のナノ粒子の直径は１０〜９０ｎｍのものであった。特に、ミリスチン酸を０．３ｍｇ添加した場合には、粒径が５０ｎｍのものが最も多く存在した。
【実施例７】
【００４１】
製剤例１：軟膏剤／ハイドロゲル剤
実施例１で得られた本発明のナノ粒子、白色ワセリン、カルボキシメチルセルロースおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量をとり、全量が均質になるまで混和し、軟膏剤およびハイドロゲル剤とした。
【実施例８】
【００４２】
製剤例２：外用貼付剤（水性パップ剤）
実施例１のナノ粒子 ０．１重量部
ポリアクリル酸 ２．０重量部
ポリアクリル酸ナトリウム ５．０重量部
カルボキシメチルセルロースナトリウム ２．０重量部
ゼラチン ２．０重量部
ポリビニルアルコール ０．５重量部
グリセリン ２５．０重量部
カオリン １．０重量部
水酸化アルミニウム ０．６重量部
酒石酸 ０．４重量部
ＥＤＴＡ−２−ナトリウム ０．１重量部
精製水 残 部
上記成分配合をベースとし、常法により外用貼付剤（水性パップ剤）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上記載のように、本発明は生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子とし、次いで、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子である。当該本発明のナノ粒子は、そこに含有される生理活性タンパク質またはペプチドを皮膚または粘膜経由により生体内吸収させるものであり、注射投与に代わり得る生体内吸収性を示すものである。したがって、これまで達成されていなかった生理活性タンパク質またはペプチドの経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、生理活性タンパク質およびペプチドを含有する高吸収性の外用剤が創製され、医療上の価値は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】試験例１におけるマウスの血糖値の推移を示す図である。
【図２】試験例２におけるラットの血糖値の推移を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子。
【請求項２】
一次ナノ粒子が、水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性体を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、これを多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより作製されるものである請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
粒子の直径が５〜１５０ｎｍである請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
粒子の直径が１０〜８０ｎｍである請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項５】
生理活性タンパク質またはペプチドが、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＥＦＧ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および酵素から選択されるものである請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が、２価または３価の金属イオンとの接触、酸性または塩基性多糖体との接触、ｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とするために接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物が、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸及びそれらの塩から選択されるものである請求項１ないし４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩または尿酸塩である請求項１ないし４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のナノ粒子からなることを特徴とする皮膚または粘膜用外用剤。
【請求項１１】
外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤および貼付剤から選択されるものである請求項１０に記載の外用剤。
【請求項１２】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液に２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次加えることを特徴とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が２価または３価の金属イオンとの接触であり、一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩である請求項１２に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
金属イオンが亜鉛イオンである請求項１３に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を用いて一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩と順次接触させることにより得られる生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子。
【請求項２】
一次ナノ粒子が、水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性体を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、これを多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより作製されるものである請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
粒子の直径が５〜１５０ｎｍである請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
粒子の直径が１０〜８０ｎｍである請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項５】
生理活性タンパク質またはペプチドが、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、ＩＬ−１１、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＳＯＤ、ＦＧＦ、ＥＦＧ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、レプチン、ＮＴ−３、抗原、抗体および酵素から選択されるものである請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が、２価または３価の金属イオンとの接触、酸性または塩基性多糖体との接触、ｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とするために接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物が、ミリスチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パルミチン酸及びそれらの塩から選択されるものである請求項１ないし４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩または尿酸塩である請求項１ないし４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のナノ粒子からなることを特徴とする皮膚または粘膜用外用剤。
【請求項１１】
外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、点鼻剤、点眼剤、噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、パップ剤および貼付剤から選択されるものである請求項１０に記載の外用剤。
【請求項１２】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とし、当該水不溶体、疎水基と陰イオン残基を併せもつ中長鎖有機化合物および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に攪拌、振とうしながら加えることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液に２価または３価の金属塩、および２価または３価の塩基性塩を順次加えることを特徴とする生理活性タンパク質またはペプチドを含有するナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
生理活性タンパク質またはペプチドを水不溶体とする手段が２価または３価の金属イオンとの接触であり、一次ナノ粒子に接触させる２価または３価の金属塩がカルシウム塩であり、２価または３価の塩基性塩が炭酸塩である請求項１２に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
金属イオンが亜鉛イオンである請求項１３に記載のナノ粒子の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１９９５８９（Ｐ２００６−１９９５８９Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−３１２０３１（Ｐ２００３−３１２０３１）
【出願日】平成１５年９月３日（２００３．９．３）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月３日（２００３．９．３）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
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