界面活性非酵素タンパク質の織布洗浄への利用
界面活性非酵素タンパク質を含有する織布洗浄用の洗浄組成物、および
このようなタンパク質を用いる洗浄方法。
このようなタンパク質を用いる洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性をもつ非酵素タンパク質の織布洗浄への利用に関する。また本発明は、界面活性非酵素タンパク質を含有する織布洗浄用の洗剤組成物、及びこのようなタンパク質を用いる洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
織布の洗浄において、汚れ、特に疎水性汚れを満足できるレベルにまで除去するには、現在のところ比較的高温が必要となる。中間温度、特に室温では、現在もなお洗浄性能の向上が、かなり求められている。従来技術では、疎水性汚れの除去には、特に界面活性剤と脂質分解酵素とが併用されている。
【０００３】
洗剤組成物への添加物として酵素タンパク質を利用することは、原則として公知である。特にプロテアーゼが洗剤組成物に多用されているが、アミラーゼやセルラーゼ、リパーゼも知られている。詳細については、例えば、“Waschmittel-Enzyme” [洗浄組成物酵素] in Rompp Chemie-Lexikon, Online edition, Version 2.6, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, ２００５年２月、に記載されている。
【０００４】
固定剤やＵＶ保護剤、芳香物質、防汚助剤などの洗浄助剤を繊維に固定するためにタンパク質が利用できることも公知である。ＷＯ９８／００５００では、この目的のためのセルラーゼ、セルラーゼ誘導体又はセルラーゼ様タンパク質の利用を開示しており、ＷＯ０１／４６３５７では、この目的のためにセルロース結合部位と他の化合物の結合部位を有する融合タンパク質の利用を開示している。
【０００５】
界面活性タンパク質は、原則として公知である。特に表面活性が強いあるクラスのタンパク質は、「ハイドロフォビン」と呼ばれている。ハイドロフォビンは、界面に強い親和性を示すため、表面塗布に適している。例えば、テフロン（登録商標）表面にハイドロフォビンを塗布すると、テフロン（登録商標）が親水化する。
【０００６】
ハイドロフォビン類は、１００〜１５０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であり、糸状菌、例えばシゾフィラム・コミューンに特徴的なものである。これらは、一般にシステイン単位を６個有している。
【０００７】
ハイドロフォビンは、天然源から単離可能である。しかし、遺伝子工学的な手法で得ることもできる。発明者らの以前の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０７１９には、ハイドロフォビンの製造方法が開示されている。
【０００８】
従来技術では、ハイドロフォビンのいろいろな用途での利用が提案されている。
【０００９】
ＷＯ９６／４１８８２では、ハイドロフォビンを乳化剤や増粘剤、界面活性物質として、疎水性の表面の親水化、親水性基板の耐水性の改良や水中油型水乳濁液又は油中水型乳濁液の製造に利用することが開示されている。また、軟膏又はクリームの生産など医薬品用途や皮膚の保護やシャンプーやヘアリンスの生産などの化粧品用途での利用も提案されている。
【００１０】
ＥＰ１２５２５１６には、ハイドロフォビンを含む溶液を３０〜８０℃の温度で、窓やコンタクトレンズ、バイオセンサー、医療用具、試験容器又は保管容器、船殻、固体粒子、又は乗用車のフレームやシャーシに塗布することが開示されている。
【００１１】
ＷＯ０３／５３３８３には、化粧品用途のケラチン材料の処理にハイドロフォビンを用いることが開示されている。
【００１２】
ＷＯ０３／１０３３１には、ハイドロフォビンを塗布したセンサ、例えば、他の物質、例えば電気活性物質や抗体又は酵素が非共有状態で結合した試験電極が開示されている。
【００１３】
洗剤組成物用防汚添加剤としての界面活性非酵素タンパク質の利用、特にハイドロフォビンの利用に関する記述は、現在のところ見られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、改良された洗剤組成物、及び改良された織布の洗浄方法を提供することである。特に低温での洗浄において優れた洗浄性能が得られる。
【００１５】
したがって、織布洗浄における界面活性非酵素タンパク質の利用が見出された。
本発明の第二の側面では、界面活性非酵素タンパク質を含む洗剤組成物が見出された。
【００１６】
本発明の第三の側面では、界面活性非酵素タンパク質を含む洗浄液を用いる洗浄方法が見出された。本方法のある特定の実施様態では、この洗浄が６０℃以下の温度で行われる。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施様態においては、この界面活性非酵素タンパク質がいずれの場合もハイドロフォビンである。
【００１８】
驚くべきことに、界面活性非酵素タンパク質を洗浄液に添加すると、大幅な洗浄効率の上昇が認められた。特に驚くべきことは、低洗浄温度でも、またタンパク質の使用量が非常に少ない場合でも、この効果が認められることである。例えば、洗浄液中のタンパク質濃度が約２．５ｐｐｍであっても、既存の洗剤組成物と組合わせると、洗浄温度が２５℃と低温でも最大８％まで洗浄効果を増強することができる。
【００１９】
防汚作用の増強以外に、着色した油性の汚れに対する灰色化防止作用が認められた。洗浄過程で織布から除かれる疎水性の汚れは、洗濯の際に細かく分解されて織物の裏面に移行し、織布を灰色化または退色させることが起こりうる。通常、この影響は特に白色の織物あるいは淡色の織物で顕著である、特に界面活性剤やビルダー系の顔料が少ないときに、この問題が顕著である。本発明のように界面活性非酵素タンパク質を添加すると、この再付着が防止され、タンパク質の添加なしに洗浄された織物と較べると、洗浄後の織物の白色度が改善される。
【００２０】
以下に、本発明を詳細かつ具体的に説明する。
【００２１】
本発明の実施に当たり、界面活性を持つ非酵素タンパク質が使用される。「非酵素」とは、酵素活性を持たない、あるいは持っていてもごくわずかであるタンパク質であることを示す。
【００２２】
「界面活性」とは、使用するタンパク質が界面特性に影響を与えることができることを示す。この界面は、固体−固体界面であっても、固体−液体界面、固体−ガス界面、液体−液体界面、液体−ガス界面であってもよい。特に、固液界面や液液界面であってもよい。
【００２３】
固液界面の場合に、用いるタンパク質で影響を受ける性質が、例えば固体表面の親水性又は疎水性であってもよい。親水性又は疎水性の変化は、塗布表面及び非塗布表面上での水滴の接触角を測定する既知の方法により測定可能である。もう一つの界面特性は、液体の表面張力の変化であり、これも既知の方法により測定可能である。
【００２４】
本発明の実施にあたり、好ましくは低濃度においても界面活性を示すタンパク質が好ましい。特に０．０５〜５０ｐｐｍの濃度で大きな界面活性作用を持つタンパク質が好ましい。
【００２５】
本発明のある好ましい実施様態においては、使用するタンパク質が、もしこのタンパク質をガラス表面に塗布してその上に水滴（５μｌ）を落とした場合、その水滴の接触角が、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°の増加させるものである。接触角を少なくとも２５°増加させるタンパク質の使用が好ましく、少なくとも３０°増加させるタンパク質の使用がさらに好ましい。接触角の測定方法は、当業界の熟練者には原則として公知である。接触角の測定に適当な方法の具体的な実験条件が、下記の実施例欄に記載されている。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施様態においては、この使用するタンパク質がハイドロフォビンである。
【００２７】
本発明において、「ハイドロフォビン」とは、一般構造式（Ｉ）で表されるポリペプチド類をさす。
【００２８】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ1-50−Ｃ2−Ｘ0-5−Ｃ3−Ｘ1-100−Ｃ4−Ｘ1-100−Ｃ5−Ｘ1-50−Ｃ6−Ｘ0-5−Ｃ7−Ｘ1-50−Ｃ8−Ｘm （１）
【００２９】
式中、Ｘは２０個の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれかである。式中、Ｘ基は、いずれも同一であっても異なっていてもよい。Ｘの添字は、特定の部分配列Ｘ中のアミノ酸の数の数を示し、Ｃは、システイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニン又はトレオニンを示し、Ｃ残基のうち少なくとも４個はシステインであり、及び添字のｎとｍは、それぞれ独立して０〜５００の自然数、好ましくは１５〜３００の自然数を示す。
【００３０】
また、式（Ｉ）のポリペプチドは、このタンパク質をガラス表面に塗布して水滴をたらした時、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°及びさらに好ましくは３０°の水滴接触角の増加をもたらすという特徴を有している。
【００３１】
Ｃ1〜Ｃ8で表されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。しかし、これらは、空間充填量の類似する他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、メチオニン又はグリシンで置換されていてもよい。しかし、Ｃ1〜Ｃ8の位置の、少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも６個、特に少なくとも７個がシステインである。本発明のタンパク質において、システインは、還元型で存在しても、相互にジスルフィドブリッジを形成していてもよい。 特に好ましくは、分子内にＣ−Ｃブリッジを形成していることが好ましく、また、少なくとも１個の分子内ジスルフィドブリッジ、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは４個の分子内ジスルフィドブリッジを形成していることが好ましい。上記のようにシステインが、空間充填量の類似したアミノ酸で置換されている場合、分子内ジスルフィドブリッジを相互に形成しうる対の両方が置換されていることが好ましい。
【００３２】
Ｘで示される位置にシステイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニン又はトレオニンが使用されている場合、上記一般式中の各Ｃ位置の番号も、これに伴って変化しうる。
【００３３】
好ましくは、一般式（ＩＩ）のハイドロフォビンの使用が好ましい。
【００３４】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ3-25−Ｃ2−Ｘ0-2−Ｃ3−Ｘ5-50−Ｃ4−Ｘ2-35−Ｃ5−Ｘ2-15−Ｃ6−Ｘ0-2−Ｃ7−Ｘ3-35−Ｃ8−Ｘm （ＩＩ）
【００３５】
本発明の実施に当たりＸとＣ、およびこれらの添字が上記と同じである場合、添字のｎとｍはそれぞれ０〜３５０、好ましくは１５〜３００であり、これらのタンパク質が上記の接触角変化をもたらし、またＣで示される残基のうち少なくとも６個がシステインである。すべてのＣ残基がシステインであることがさらに好ましい。
【００３６】
一般式（ＩＩＩ）のハイドロフォビンの使用が特に好ましい。
【００３７】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ5-9−Ｃ2−Ｃ3−Ｘ11-39−Ｃ4−Ｘ2-23−Ｃ5−Ｘ5-9−Ｃ6−Ｃ7−Ｘ6-18−Ｃ8−Ｘm （ＩＩＩ）
【００３８】
式中、ＸとＣ、およびこれらの添字は上記と同じであり、添字のｎとｍは、それぞれ０〜２００であり、これらのタンパク質が上記の接触角変化をもたらし、またＣで示される残基のうち少なくとも６個がシステインである。すべてのＣ残基がシステインであることがさらに好ましい。
【００３９】
Ｘn残基とＸm残基は、ハイドロフォビンに自然に結合するペプチド配列であってもよい。しかし、これらの残基の一方または両方が、自然にはハイドロフォビンと結合しないペプチド配列であってもよい。したがって、これらのＸn残基及び／又はＸm残基において、自然にハイドロフォビンに起こるペプチド配列が、自然にはハイドロフォビンに起こらないペプチド配列により延長されていてもよい。
【００４０】
Ｘn残基及び／又はＸm残基が自然にはハイドロフォビンに起こらないペプチド配列である場合、これらの配列の長さは、一般的には少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸及び、例えば、少なくとも１００個のアミノ酸である。これらの配列は、２０〜５００個のアミノ酸、好ましくは３０〜４００個のアミノ酸、さらに好ましくは３５〜１００個のアミノ酸からなる。自然にはハイドロフォビンに結合しないこのような残基を、以降、融合パートナーと称す。このことは、このタンパク質が、少なくとも一種のハイドロフォビン基と一種の融合パートナー基からなる、自然にはこの形で存在しないものであってもよいことを意味する。
【００４１】
この融合パートナー基はいろいろなタンパク質から選択可能である。また、単一の融合パートナーがハイドロフォビン基に結合していてもよく、あるいは、複数の融合パートナーが１個のハイドロフォビン基に、例えば、ハイドロフォビン基のアミノ末端（Ｘn）とカルボキシル末端（Ｘm）に結合していてもよい。しかし、例えば二つの融合パートナーが、本発明のタンパク質の一箇所（Ｘn又はＸm）に結合していてもよい。
【００４２】
特に好適な融合パートナーは、微生物、特に大腸菌又は枯草菌中で自然にできるタンパク質である。このような融合パートナーの例としては、配列ｙａａｄ（配列番号１５と１６）、配列ｙａａｅ（配列番号１７と１８）、及びチオレドキシンがあげられる。また特に好適なのは、これらの配列のフラグメント又は誘導体であり、上記配列の例えば７０〜９９％、好ましくは５〜５０％の、さらに好ましくは１０〜４０％の部分配列を含むもの、あるいは、個々のアミノ酸又はヌクレオチドが上記の配列とは異なるものであり、この場合、上記のパーセント比率は異なるアミノ酸の数を意味する。
【００４３】
さらに好ましい実施様態においては、この融合ハイドロフォビン、また上記の融合パートナーは、Ｘn又はＸm基として又はそのような基の端末部分として、いわゆる親和性ドメイン（親和性タグ／親和性尾部）を有している。公知のように、これは特定の相補的な基に相互作用を待つアンカー基を有し、タンパク質の処理や精製を容易にさせる。親和性ドメインの例としては、（Ｈｉｓ）k基、（Ａｒｇ）k基、（Ａｓｐ）k基、（Ｐｈｅ）k基又は（Ｃｙｓ）k基があげられ、式中、ｋは一般に１〜１０の自然数である。この基は、好ましくは（Ｈｉｓ）k基であり、ｋは４〜６である。この場合、Ｘn基及び／又はＸm基は、このような親和性ドメインのみからなっていてもよく、あるいはハイドロフォビンに自然に結合している、あるいは自然には結合しないＸn基又はＸm基が、端末親和性ドメインと結合して伸びていてもよい。
【００４４】
したがって、本発明においてハイドロフォビン又はそれらの誘導体として用いるタンパク質は、それらのポリペプチド配列中に修飾を含んでいてもよく、そのようの修飾の例としは、グリコシル化、アセチル化、あるいは、例えばグルタールアルデヒドでの化学架橋があげられる。
【００４５】
本発明において用いられるハイドロフォビンやその誘導体の特徴の一つは、このようなタンパク質で被覆された表面の性質の変化である。表面の性質の変化は実験的に測定可能であり、例えば、タンパク質を表面に塗布する前後で水滴の接触角の測定して、それらの差を求めることで求めることができる。
【００４６】
接触角の測定方法は、原則として当業界の熟練者には公知である。この測定では、室温でガラス板を基板に用いて、５μｌの水滴を測定する。接触角の好適な測定方法の正確な実験条件は、実施例の欄で述べる。そのような条件下では、本発明において用いられる融合タンパク質は、このタンパク質をガラス表面に塗布して水滴を落とし接触角を測定すると、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、さらに好ましくは３０°の水滴接触角の増加をもたらすという特徴を有している。
【００４７】
本発明を実施するうえで特に好ましいハイドロフォビンは、ｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２などのハイドロフォビン類であり、構造的には下記の配列を有している。これらはまた、その一部又は誘導体であってもよい。複数のハイドロフォビン基が、好ましくは２個又は３個の同一又は異なる構造が、相互に結合するか、相当する適当な天然のハイドロフォビンには結合しないポリペプチド配列に結合していてもよい。
【００４８】
本発明において特に好適なのは、融合タンパク質のｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号：２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号：２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号：２４）であり（括弧中のポリペプチド配列番号を示す）、及びそれをコードする核酸配列、特に配列番号１９、２１、２３で表される配列である。さらに好ましくは、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）を用いることができる。配列番号２０、２２又は２４で示されるポリペプチド配列から少なくとも１個〜１０個の、好ましくは５個のアミノ酸、さらに好ましくは全アミノ酸の５％のアミノ酸が置換、挿入又は欠失したタンパク質であって、出発タンパク質の生物学的な性質を少なくとも５０％保持するものも、特に好ましい実施様態である。このタンパク質の生物学的な性質とは、上述のように、接触角の少なくとも２０°の変化を意味する。
【００４９】
本発明を実施するうえで特に好適な誘導体は、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）から、ｙａａｄ融合パートナーを切断してできる残基である。９４個のアミノ酸からなる完全なｙａａｄ融合パートナー（配列番号１６）に代えて、部分ｙａａｄ残基を用いることは有益である。切断される残基は、少なくとも２０個の、さらに好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸を含む必要がある。例えば、２０〜２９３個の、好ましくは２５〜２５０個の、さらに好ましくは３５〜１５０個の、例えば３５〜１００個のアミノ酸なる部分残基が使用される。このようなタンパク質の一例は、ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２６）であり、これは、４０アミノ酸まで切断されたｙａａｄ残基である。
【００５０】
ハイドロフォビンと融合パートナー又は複数の融合パートナー間の切断部位は、純粋なハイドロフォビンを非修飾状態で（例えば、メチオニンでのＢｒＣＮ切断、Ｘａ因子切断、エンテロキナーゼ切断、トロンビン切断、ＴＥＶ切断などにより）放出するのに利用できる。
【００５１】
ある融合パートナー、例えばｙａａｄ又はｙａａｅと、複数のハイドロフォビン（異なる配列であってもよい）とから、融合タンパク質を作ることができ、その例としては、ＤｅｗＡ−ＲｏｄＡ、Ｓｃ３−ＤｅｗＡ、又はＳｃ３−ＲｏｄＡがあげられる。同様に、ハイドロフォビンのフラグメント（例えば、Ｎ末端又はＣ末端除去物）又は相同性が７０％以上である変異タンパク質を用いることもできる。好適なコンストラクトは、いずれの場合も、特定の用途、即ち分離される液相との関係で選択される。
【００５２】
本発明において織布の洗浄に用いられるハイドロフォビンは、既知の化学的ペプチド合成、例えばメリフィールド固相合成により製造できる。
【００５３】
天然のハイドロフォビンを、天然資源より適当な方法で取り出してもよい。例えば、Wosten et al.、Eur. J Cell Bio. 63、122-129 (1994)又はWO 96/41882を参照。
【００５４】
融合パートナーを使用しないタラロマイセス・サーモフィルスからの遺伝子工学的なハイドロフォビンの生産方法が、米国特許２００６／００４０３４９に記載されている。
【００５５】
融合タンパク質は遺伝子工学的な方法により得ることが好ましく、この際、融合パートナーをコードするある核酸配列、特にＤＮＡ配列と、ハイドロフォビン基をコードするものとを結合し、結合した核酸配列を遺伝子発現させて、宿主生物中に所望のタンパク質を産生される。このような製造方法は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０７１９に開示されている。
【００５６】
上記の製造方法に好適な宿主生物（産生生物）は、原核生物（古細菌を含む）又は真核生物であり、特にハロバクテリアやメタノコッカスなどのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞であり、さらに好ましくは特に、大腸菌、枯草菌、巨大菌、コウジカビ、偽巣性コウジ菌、クロカビ、ピチア・パストリス、シュードモナス種、乳酸菌、ハンセヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・レーゼイ、ＳＦ９（あるいは関連細胞）である。
【００５７】
本発明はまた、調節核酸配列による遺伝子制御下にある、本発明において使用するポリペプチドをコードする核酸酸配列を含む発現コンストラクト、及びこれらの発現コンストラクトの少なくとも一つを含むベクターの利用を提供する。
【００５８】
使用するコンストラクトは、好ましくは特定のコード配列の５’上流、プロモーター及び、３’下流、ターミネーター配列、及び必要ならさらにいろいろな調節成分を含み、いずれの場合もこれらが作動可能な状態でコード配列に連結している。
【００５９】
本発明において、「作動可能な状態で連結」しているとは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び必要ならさらなる調節成分が、コード配列の発現において各調節成分が目的とする機能を発揮するように連続的に配列していることをいう。
【００６０】
作動可能な状態で連結可能な配列の例としては、標的配列や、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等があげられる。他の調節成分としては、選択可能なマーカー、増幅信号、複製開始点等があげられる。好適な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００６１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然な調節領域が実際の構造遺伝子の上流に存在するかもしれないが、必要ならこれらは、遺伝子組換により自然な調節を除き、遺伝子の発現が増加するようにされてきた。
【００６２】
好ましい核酸コンストラクトはまた、好ましくは、プロモーターに機能的に連結する１個以上のいわゆる「エンハンサー」配列を有しており、核酸配列の発現が増強されている。また、ＤＮＡ配列の３’末端には、他の調節成分又はターミネーターなどの好ましい配列をさらに挿入することも可能である。
【００６３】
このような核酸は、コンストラクト中に、１個以上のコピー数で存在していてもよい。コンストラクトの選択に望ましいなら、抗生物質耐性マーカー等の他のマーカーや、栄養要求性を与える遺伝子がコンストラクト中に存在していてもよい。
【００６４】
そのような調剤中の好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、Ｉａｃｌｑ−Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ−ＰＲ、又はｉｍｌａｍｂｄａ−Ｐプロモーターなどのプロモーター中に存在し、好ましくはグラム陰性バクテリア中で使用される。さらに好ましい調節配列は、例えば、ａｍｙやＳＰ０２などのグラム陽性プロモーター中や、ＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨなどの酵母又は真菌プロモーター中に存在する。
【００６５】
調節に合成プロモーターを使用することも可能である。
【００６６】
宿主生物での発現のためには、核酸コンストラクトを宿主中での遺伝子発現を最適とさせるプラスミドやファージ等のベクターに挿入することが好ましい。プラスミドやファージとは異なり、ベクターは、当業界の熟練者には公知である他のすべてのベクターを意味し、その例としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス等のウイルスや、トランスポソン、ＩＳ成分、プラスミド、コスミド、及び直線状又は環状ＤＮＡ、及びアグロバクテリウムシステムがあげられる。
【００６７】
これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製させてもよいし、染色体を経由して複製させてもよい。好適なプラスミドの例としては、大腸菌では、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐｌＮ−ｌｌｌ”３−Ｂ１、ｔｇｔ１１、又はｐＢｄＣｌがあげられ、ストレプトミセス属ではｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２、又はｐｌＪ３６１が、バチルス属ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、又はｐＢＤ２１４が、コリネバクテリウム属ではｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７が、真菌類ではｐＡＬＳ１、ｐｌＬ２、又はｐＢＢ１１６が、酵母では２ａｌｐｈａ、ＰＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、又はｐＥＭＢＬＹｅ２３が、また植物ではＬＧＶ２３、ｐＧＨＩａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４又はｐＤＨ５１があげられる。これらのプラスミドは、多様なプラスミドの候補の一部であるにすぎない。他のプラスミドも当業界の熟練者には公知であり、例えば、Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985、ISBN0444904018)に記載されている。
【００６８】
この核酸コンストラクトは、他に存在する遺伝子の発現のために、好ましくは、用いる宿主生物や遺伝子（群）に応じて発現が最適となるように選択された発現増強用の３’−及び／又は５’−端末調節配列を有している。
【００６９】
これらの調節配列は、遺伝子やタンパク質の発現をうまく制御するようにするためのものである。このことは、宿主生物によっては、遺伝子が誘導によってのみ発現あるいは過剰発現されたり、遺伝子が直ちに発現及び／又は過剰発現されたりすることを意味する。
【００７０】
この調節配列又は調節因子は、プラスの影響を与え、導入遺伝子の遺伝子発現を増加させることが好ましい。したがって、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いて、これらの調節成分の増幅を転写レベルで行うことが好ましい。また、例えばｍＲＮＡの安定性を改善して翻訳を加速することもできる。
【００７１】
ベクターの他の実施様態においては、核酸コンストラクト又は核酸を含むベクターを直線状ＤＮＡの形で微生物に導入し、宿主生物のゲノムに異形組換え又は相同組換えにより組み込むことも好ましい。この直線状ＤＮＡは、プラスミドが直線状となったベクターであっても、単に核酸コンストラクト又は核酸であってもよい。
【００７２】
生物内で異種遺伝子をうまく発現させるためには、生物で用いられる「コドン使用頻度」に応じて、核酸配列を変更することが有利である。「コドン使用頻度」は、目的生物の他の既知の遺伝子のコンピュータ解析結果を参照して容易に決定することができる。
【００７３】
発現カセットは、適当なプロモーター、適当なコード核酸配列、及びターミネーター信号又はポリアデニル化シグナルを融合して製造される。このために、一般的な組換え及びクローニング法が用いられ、その例は、例えば以下の文献に記載されている。T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987）。
【００７４】
適当な宿主生物で発現させるには、組換え核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクトを、好ましくは宿主に特異的なベクターに挿入させ、遺伝子を宿主中で好適に発現させる。ベクターは当業界の熟練者には公知であり、例えば、“Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に記載されている。
【００７５】
ベクターを用いて、例えば少なくとも一個のベクターを用いて、形質添加された本発明のハイドロフォビン又はその誘導体の生産に使用可能な組換え微生物を作成することができる。好ましくは、上記の組換えコンストラクトを適当な宿主システムに導入して発現させる。特定の発現システムで上記の核酸を発現させるためには、当業界の熟練者に馴染みのあるクローニング法やトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等を用いることが好ましい。好適なシステムが、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載されている。
【００７６】
相同型の遺伝子組み換え微生物を作ることも可能である。このためには、使用する遺伝子又はコード配列の少なくとも一部で、適当なら配列を機能的に混乱させるために、少なくとも一個のアミノ酸を欠失、挿入、又は置換させたベクター（「ノックアウト」ベクター）が作られる。この導入される配列が、例えば、関連する微生物由来の、あるいは哺乳類、酵母又は昆虫から由来する相同体であってもよい。あるいは、相同組換えに使用するベクターを、相同組換えの場合、内因性の遺伝子に変異が認められるが、機能性タンパク質を依然としてコードしている（例えば、内因性タンパク質の発現が変化するように上流の調整領域を変えるとができる）ようにすることもできる。本発明において用いられる遺伝子中の変化部分は、相同組換えベクター中に存在する。相同組換え用の適当なベクターの作成は、例えば、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００７７】
原則として、あらゆる原核生物又は真核生物が、このような核酸又は核酸コンストラクトの組換え宿主生物として使用できる。使用する宿主生物は、バクテリアや真菌、酵母などの微生物であることが好ましい。グラム陽性又はグラム陰性のバクテリアが好ましく用いられ、好ましくは腸内細菌、シュードモナダセア、リゾビウム、ストレプトミセス又はノカルディア科のバクテリアであり、さらに好ましくは、大腸菌、シュードモナス、ストレプトミセス、ノカルディア、ブルコルデリア、サルモネラ、アグロバクテリウム又はロドコッカス属のバクテリアである。
【００７８】
上記の融合タンパク質の製造プロセスで使用する生物は、当業界の熟練者には公知の方法により、宿主生物に応じて成長あるいは培養される。微生物は、一般に、通常糖類などの炭素源と、通常酵母抽出物などの有機窒素源である窒素源と、硫酸アンモニウムなどの塩類と、鉄、マンガン及びマグネシウム塩などの微量成分、及び必要に応じてビタミン類を含む液体培地中で、０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃の温度で、酸素を供給しながら培養される。栄養液のｐＨを調整して、培養中一定値に維持してもよいし、調整しなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式、又は連続式のいずれで行ってもよい。栄養物は培養の開始時に投入してもよいし、半連続的又は連続的に追加してもよい。これらの酵素は、実施例に記載の方法により、生物から単離してもよいし、粗抽出液として反応に用いてもよい。
【００７９】
本発明において用いられるハイドロフォビン又はそれらの機能的生物的に活性なフラグメントは、遺伝子組み換え法により生産され、具体的には、ポリペプチド産生微生物を培養し、必要ならタンパク質の発現を誘導し、得られたハイドロフォビンを培養物から単離する。これらのタンパク質は、このようにして必要なら工業的な規模で製造できる。組換え微生物の培養や発酵は、既知の方法で行われる。バクテリアは、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中で、２０〜４０℃の温度、６〜９のｐＨで増殖させる。適当な培養条件は、具体的には、例えば、T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。
【００８０】
融合パートナーの存在は、ハイドロフォビンの製造をかなり容易にする。融合ハイドロフォビンは、融合パートナーを持たないハイドロフォビンよりかなり大きな収率で得られる。
【００８１】
これらのタンパク質が培養培地中に分泌されない場合は、細胞を破砕し、この溶解物から既知のタンパク質単離方法により生産品を得る。必要に応じて、細胞破砕を、高周波数超音波、フレンチプレスなどでの加圧、浸透圧、洗剤の作用、溶菌酵素又は有機溶剤、ホモジナイザー、あるいは、これらの方法のいくつかを組み合わせて実施する。
【００８２】
タンパク質の精製は、既知のクロマトグラフ法、例えばＱセファローズクロマトグラフィー等のモレキュラーシーブ・クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィーを、限外濾過、晶出、塩析、透析及び天然ゲル電気泳動などの他の汎用法と組合わせて実施する。好適な方法が、例えば、Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００８３】
固体支持体上の、特に適当なポリマー上に存在する相補的な基に結合する特定のアンカー基を付与すると、融合ハイドロフォビンの単離と精製が容易となりため、特に有益である。このような固体支持体は、例えばクロマトグラフィーカラムの充填物として使用可能であり、このようにして一般に分離効率を大幅に上げることができる。このような分離工程は、アフィニティークロマトグラフィーとしても知られている。アンカー基を導入するため、上記タンパク質の製造において、特定の核酸配列によりｃＤＮＡを延長し、他のタンパク質又は融合タンパク質をコードさせるベクターシステム又はオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。精製を容易にするため、修飾タンパク質は、アンカーとして作用するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーと呼ばれる修飾を有することが好ましい。ヒスチジンアンカーで修飾された融合ハイドロフォビンは、クロマトグラフィーで精製可能で、例えばニッケルセファローズをカラム充填して精製される。この融合ハイドロフォビンは、その後適当な溶離剤、例えばイミダゾール溶液を用いてカラムから溶離される。
【００８４】
簡単な精製工程では、クロマトグラフィーで精製可能である。このためには、適当な方法で、例えばマイクロ濾過又は遠心分離により、まず発酵液から細胞を分離する。次いで、適当な方法、例えば上記の方法により細胞を破砕し、細胞片を封入体から分離する。細胞片は、好ましくは遠心分離で分離する。最後に、封入体を原則として公知の方法で破壊し、融合ハイドロフォビンを放出させる。例えば酸、塩基及び／又は洗浄剤を用いて実施する。本発明において用いられる融合ハイドロフォビンを含む封入体は、一般に、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液に、約１時間で完全に溶解する。この簡便法により得られる融合ハイドロフォビンの純度は、総タンパク質量当たり、一般に６０〜８０重量％である。
【００８５】
この簡便精製工程により得られた溶液は、さらに精製することなく本発明の実施に使用できる。ただし、融合ハイドロフォビンを、この溶液から固体として取り出してもよい。これは、例えば凍結乾燥や噴霧乾燥などの原則として公知の方法で行われる。
【００８６】
本発明のある好ましい実施様態においては、この単離を噴霧乾燥を用いて行う。噴霧乾燥は、クロマトグラフィーで精製後の溶液を用いて行ってもよいが、封入体の調整の際の簡易精製工程後に得られる溶液を使用することが好ましい。
【００８７】
噴霧乾燥を行う前に、必要なら溶液を中和してもよい。ｐＨは７〜９の範囲が、特に有利であった。
【００８８】
一般に出発溶液を少し濃縮することが好ましい。出発溶液中の好ましい固体濃度は、最大３０重量％である。固体含量が５％を超えると一般に、細かな製品粉末を与える。次いで、この溶液を原則として既知の方法で噴霧乾燥できる。好適な噴霧乾燥装置は市販されている。至適噴霧乾燥条件は、装置の種類や所望の収率により異なる。１３０〜１８０℃の供給温度と５０〜８０℃の排出温度が、ハイドロフォビン溶液に対して好適であった。必要に応じて噴霧乾燥の際に、糖類、マンニトール、デキストラン又はマルトデキストリンなどの助剤を用いてもよい。このような助剤のハイドロフォビンに対する量は、０〜３０重量％が好ましく、５〜２０重量％がさらに好ましい。
【００８９】
上述のように作成したハイドロフォビンは、融合タンパク質として直接、あるいは融合パートナーを切断除去した「純」ハイドロフォビンとして使用可能である。
【００９０】
融合パートナーの除去が望ましい場合は、融合タンパク質のハイドロフォビン基と融合パートナー基との間に切断可能な部位（プロテアーゼの特定認識部位）を導入することが望ましい。適当な切断部位は、特にハイドロフォビン基にも融合パートナー中にも存在しないもので、バイオインフォマチック的な手段で容易に特定できるペプチド配列であることが好ましい。特に好適な例としては、メチオニンでのＢｒＣＮ切断、Ｘａ因子切断を伴うプロテアーゼ仲介切断、エンテロキナーゼ切断、トロンビン切断、又はＴＥＶ切断（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）があげられる。
【００９１】
本発明の織布洗浄への利用のためには、この界面活性非酵素タンパク質をまず洗剤組成物成分として用い、これを洗浄液に添加する。しかし、この界面活性非酵素タンパク質は洗浄液に別途添加してもよく、また界面活性非酵素タンパク質を含まない洗剤組成物を用いてもよい。別添加の場合、固体状のタンパク質、溶液状のタンパク質、あるいは適当な調合物状のタンパク質として添加してよい。もちろん、上記二種の添加方法を組合わせてもよい。
【００９２】
洗浄液中の界面活性非酵素タンパク質の含量は、所望の効果に応じて、当業界の熟練者により決定される。好ましい量は、一般に０．０５〜５０ｐｐｍであり、好ましくは０．１〜３０ｐｐｍ、さらに好ましくは０．２〜２０ｐｐｍ、さらに好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、特に好ましくは１〜６ｐｐｍである。
【００９３】
本発明の洗剤組成物は、少なくとも一種の洗浄活性物質及び少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含んでいる。
【００９４】
この少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質は、好ましくは、最初に述べた接触角の変化を引き起こすタンパク質であり、さらに好ましくは少なくとも一種のハイドロフォビンである。もちろん、異なるタンパク質の混合物を用いてもよい。
【００９５】
ハイドロフォビンを使用する場合、これらは、「純」ハイドロフォビンの形であるいは上記の融合タンパク質の形で使用される。本発明を実施するうえで有用なものの例としては、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ型（配列番号２０）の融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ型（配列番号２２）の融合タンパク質、又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ型（配列番号２４）の融合タンパク質があげられる。特に有用な例としては、完全なｙａａｄ融合パートナーを持つｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、又は部分融合パートナーを持つ例えばｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２６）である。
【００９６】
「織布洗浄用の洗剤組成物」とは、文字通りの意味であり、また文字通りの制限を有する。織布洗浄用の洗剤組成物は、例えば、粉末状、粒状、ペレット状、糊状、錠剤状、ゲル又は液体状、通常水溶液（洗浄液）で用いられる。これらの効果は、化学的及び物理化学的過程が複雑にからみ合ったものである。洗剤組成物は、少なくとも一種の洗浄活性物質を含むが、一般的には複数の異なる洗浄活性物質を含み、これらとの相互作用で最適の洗浄効果を発揮する。洗剤組成物中の主な洗浄活性成分としては、特に界面活性剤、ビルダー、コビルダー、漂白剤及び洗剤組成物酵素があげられる。通常の添加物、例えば芳香剤、腐食防止剤、転染防止剤、発泡防止剤、さらに必要に応じて光沢剤を、洗剤組成物の成分として添加してもよい。
【００９７】
この界面活性剤は、アニオン性、ノニオン性、カチオン性、又は両イオン性の界面活性剤のいずれでもよい。
【００９８】
適当なノニオン性界面活性剤の例としては、次のものが挙げられる。
−脂肪族アルコールアルコキシレートやオキソアルコールアルコキシレートなどのアルコシキル化Ｃ8−Ｃ22−アルコール、及びグルベアルコールエトキシレート。ただし、アルコキシル化はエチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドで行われる。ブロックコポリマー又はランダムコポリマーが存在していてもよい。少なくとも一種のアルキレンオキシドの量は、アルコール１モル当たり、２〜５０ｍｏｌ、好ましくは３〜２０ｍｏｌである。好ましいアルキレンオキシドはエチレンオキシドである。これらのアルコールは、好ましくは、１０〜１８個の炭素原子を有している。
−アルキルフェノールアルコキシレート、特にアルキルフェノールエトキシレート（Ｃ6−Ｃ14−アルキル鎖と５〜３０ｍｏｌのアルキレンオキシド／モルを含む）
−アルキルポリグルコシド（Ｃ8−Ｃ22−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルキル鎖及び一般的に１〜２０個の、好ましくは１．１〜５個のグルコシド単位を含む）
−Ｎ−アルキルグルカミド、脂肪酸アミドアルコキシレート、脂肪酸アルカノールアミドアルコキシレート、及びエチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドのブロックコポリマー。
【００９９】
好適なアニオン性界面活性剤は、次の通りである。
【０１００】
−炭素数が８〜２２、好ましくは１０〜１８の（脂肪族）アルコールスルフェート、特にＣ9−Ｃ11−アルコールスルフェート、Ｃ12−Ｃ14−アルコールスルフェート、Ｃ12−Ｃ18−アルコールスルフェート、ラルリルスルフェート、セチルスルフェート、ミリスチルスルフェート、パルミチルスルフェート、ステアリルスルフェート、及び獣脂脂肪族アルコールスルフェート
−アルコシキル化Ｃ8−Ｃ22−アルコールスルフェート（アルキルエーテルスルフェート）：この種の化合物は、例えば、Ｃ8−Ｃ22−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルコールをまず、例えば脂肪族アルコールでアルコキシル化させ、次いでアルコキシル化物を硫酸化する。アルコキシル化には、エチレンオキシドを用いることが好ましい。
−直線状Ｃ8−Ｃ20−アルキルスルホン酸塩（ＬＡＳ）、好ましくは直線状Ｃ9−Ｃ13−アルキルベンゼンスルホン酸塩、及びＣ9−Ｃ13−アルキルトルエンスルホン酸塩
−アルカンスルホン酸塩、特に、Ｃ8−Ｃ24−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルカンスルホン酸塩
−Ｃ8−Ｃ24−カルボン酸のナトリウム及びカリウム塩などの石鹸類
【０１０１】
アニオン性界面活性剤は、洗剤組成物に、好ましくは塩の形で添加される。好適な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩などのアルカリ金属塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩及びトリ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩などのアンモニウム塩があげられる。
【０１０２】
好適なカチオン性界面活性剤としては、次のものが挙げられる。
【０１０３】
−Ｃ7−Ｃ25−アルキルアミン；
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（Ｃ2−Ｃ4−ヒドロキシアルキル）（Ｃ7−Ｃ25−アルキル）アンモニウム塩；
−アルキル化剤で四級化されたモノ−及びジ（Ｃ7−Ｃ25−アルキル）ジメチルアンモニウム化合物；
−エステル四級アンモニウム、特に、Ｃ8−Ｃ22−カルボン酸でエステル化された四級モノ−、ジ−及びトリアルカノールアミン類；
−イミダゾリン四級化合物、特に、式ＩＩ又はＩＩＩの１−アルキルイミダゾリニウム塩。
【０１０４】
【化１】
【０１０５】
なお、式中の変数は次のように定義される。
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ25−アルキル基、又はＣ2−Ｃ25−アルケニル基を表し；
Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、又はヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル基を表し；
Ｒ5は、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、又はＲ1−（ＣＯ）−Ｘ−（ＣＨ2）m−基（Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ｍは２又は３である）を表し、なお、少なくとも一つのＲ3基がＣ7−Ｃ22−アルキル基である。
【０１０６】
好適な両イオン性界面活性剤の例としては、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アミノプロピオネート、アミノグリシネート及び両イオン性イミダゾリウム化合物があげられる。
【０１０７】
洗浄工程において、ビルダー（不均質無機ビルダーＨＩＢともよばれる）は、水の軟化を行う。これらは、そのアルカリ性により洗浄作用を強化し、系内やファイバブリッジ内のカルシウムやマグネシウムイオンを抽出して、洗浄液中での顔料性物質の分散を強化する。
【０１０８】
好適な無機ビルダーとしては、特に次のものである。
【０１０９】
−イオン交換性を有する結晶性及び非晶質アルミノケイ酸塩、特にゼオライト： いろいろな種類のゼオライトが好適であり、特にＡ、Ｘ、Ｂ、Ｐ、ＭＡＰ及びＨＳ型のゼオライトで、Ｎａ型又はＮａの一部がＬｉ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ又はアンモニウムなどの他のカチオンで置換されたものが好ましい。
−結晶性ケイ酸塩、特に二ケイ酸塩及び層状ケイ酸塩、例えばδ−及びβ−Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5。これらのケイ酸塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩の形で使用可能であり、好ましくはナトリウム塩、リチウム塩、及びマグネシウムケイ酸塩である。
−メタケイ酸ナトリウムや非晶質二ケイ酸塩などの非晶質ケイ酸塩
−炭酸塩及び重炭酸塩：これらは、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩の形で使用可能である。好ましくは、ナトリウム、リチウム及びマグネシウムの炭酸塩及び重炭酸塩、特に炭酸ナトリウム及び／又はナトリウムの重炭酸塩
−三リン酸五ナトリウムなどのポリリン酸塩。
【０１１０】
コビルダーは、ビルダーと共同して作用し、例えば貯槽として、カルシウムやマグネシウムイオンをビルダーより高速で吸収し、これをビルダーに引き渡す。また、これらは結晶の種の上に吸着されて起こる結晶成長に抵抗を示す。
【０１１１】
好適な有機コビルダーは、特に次のものである。
【０１１２】
−クエン酸、疎水的に修飾されたクエン酸、例えば、アガリシン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルタール酸、コハク酸、イミドジコハク酸、オキシジコハク酸、プロパントリカルボン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、アルキル−及びアルケニルコハク酸など、及びアミノポリカルボン酸、ｅ．ｇ．ニトリロ三酢酸、ｐ−アラニン二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、セリン二酢酸、イソセリン二酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ酢酸、エチレンジアミンジコハク酸及びメチル−及びエチルグリシン二酢酸などの低分子量カルボン酸類、
−アクリル酸やアスパラギン酸のホモポリマー、オリゴマレイン酸、マレイン酸とアクリル酸、メタクリル酸又はＣ2−Ｃ22−オレフィン（例えば、イソブテン又は長分子鎖α−オレフィン）とのコポリマーなどのオリゴマーやポリマーカルボン酸；ビニルＣ1−Ｃ8−アルキルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、Ｃ4−Ｃ8−アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、及びスチレン。好ましくは、アクリル酸のホモポリマー、及びアクリル酸とマレイン酸のコポリマーである。オリゴマーやポリマーカルボン酸は、酸の形あるいはナトリウム塩の形で使用される。
【０１１３】
好適な漂白剤の例としては、無機塩類への過酸化水素の付加物、例えば過ホウ酸ナトリウム・一水和物、過ホウ酸ナトリウム・四水和物、及び炭酸ナトリウム過水和物、及びフタルイミド過酸化カプロン酸などの過カルボン酸があげられる。
【０１１４】
好適な漂白活性剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ｐ−ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム及びＮ−メチルモルホリノアセトニトリルメチル硫酸があげられる。
【０１１５】
洗剤組成物において好ましく用いられる酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及びパーオキシダーゼがあげられる。
【０１１６】
好適な転染防止剤としては、１−ビニルピロリドン、１−ビニルイミダゾール、４−ビニルピリジン−Ｎ−オキシドのホモポリマー、コポリマー及びグラフトポリマー、及び４−ビニルピリジンのホモポリマー及びコポリマーでクロロ酢酸と反応させたものがあげられる。
【０１１７】
使用する成分の種類と量は、洗剤組成物の用途に応じて当業界の熟練者により決定される。例えば、漂白剤は、通常重質の洗剤組成物には使用されるが、軽質の洗剤組成物には使用されない。洗剤組成物の組成や成分のさらなる詳細については、例えば、“Waschmittel” ［洗浄組成物］ in Rompp Chemie-Lexikon, Online edition, Version 2.6, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, Febr. 2005, or in “Detergents” in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Edt., 2000, Electronic Release, Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2000に記載されている。
【０１１８】
本発明を実施するうえ好ましい界面活性剤は、アニオン性界面活性剤及び／又はノニオン性界面活性剤である。
【０１１９】
本発明において用いられる界面活性非酵素タンパク質、特にハイドロフォビンは、直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートと、アルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせとともに使用される。
【０１２０】
Ｃ8−Ｃ18−アルコール及び／又はそれらのアルコキシル化物由来のアニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤を、必要に応じて他の界面活性剤と混合して使用することが特に好ましい。これらのアルコキシ基は、エチレンオキシド単位及び／又はプロピレンオキシド単位、好ましくはエチレンオキシド単位を含む基が好ましい。これらは、例えば１〜２５個のエチレンオキシド単位、好ましくは３〜２０個の及びさらに好ましくは５〜１５個の単位を持つ基、又はエチレンオキシドとプロピレンオキシド単位を含む基であり、この場合、後者は、いずれの場合も、全アルコキシ単位の総数に対して少なくとも５０ｍｏｌ％、好ましくは６０ｍｏｌ％のエチレンオキシド単位を有す必要がある。
【０１２１】
好ましい界面活性剤の例としては、脂肪族アルコールアルコキシレートなどのアルコシキル化Ｃ8−Ｃ18−アルコール、オキソアルコールアルコキシレート、グルベアルコールアルコキシレート、Ｃ8−Ｃ18−アルコールスルフェート、硫酸化アルコシキル化Ｃ8−Ｃ18−アルコール（アルキルエーテルスルフェート）、又は直線状Ｃ8−Ｃ18−アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、好ましくは直線状Ｃ9−Ｃ13−アルキルベンゼンスルホン酸及びＣ9−Ｃ13−アルキルトルエンスルホン酸塩があげられる。
【０１２２】
特に好ましいのは、２−プロピルヘプタノール及びトリデカノールのアルコキシル化物、及びそれらの硫酸化物である。
【０１２３】
洗剤組成物中の界面活性非酵素タンパク質の量は、洗剤組成物の目標性能をもとに当業界の熟練者により決定される。この場合、この量は、好ましくは、指示どおりに洗剤組成物を添加する際に、上記濃度の界面活性非酵素タンパク質が得られるように選定される。
【０１２４】
洗剤組成物の全成分の総量当たりの界面活性非酵素タンパク質含量は、０．００２〜２．５重量％が好適であった。この量は、好ましくは０．０１〜１．５重量％であり、さらに好ましくは０．０２５〜１．０重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．５重量％、特に好ましくは０．１〜０．３重量％である。
【０１２５】
ある好ましい実施様態においては、本発明の洗剤組成物は、０．０１〜１．５重量％の界面活性非酵素タンパク質と、０．５〜４０重量％の界面活性剤、好ましくはアニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と、５９〜９９．４５重量％の他の洗浄活性添加物又は配合助剤とを含んでいる。
【０１２６】
使用する成分（ｃ）は、好ましくは、リパーゼ及び／又は両親媒性ポリマー、例えばエチレンオキシド−プロピレンオキシドブロックコポリマーである。
【０１２７】
本発明の洗剤組成物は、原則として当業界の熟練者には公知である方法で製造可能である。洗剤組成物の製造工程の詳細は、例えば、上記の“Rompp Chemie-Lexikon”又は“Ullmann’s”を参照されたい。
【０１２８】
洗剤組成物を製造するに当たり、本界面活性非酵素タンパク質を溶液で使用しても固体で使用してもよい。固体のタンパク質は、タンパク質の溶液から出発して当業界の熟練者には公知である方法により、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥により得られる。
【０１２９】
洗剤組成物の生産に当たり、界面活性非酵素タンパク質にかかる熱的ストレスが問題とならないように注意すべきである。その限度は、もちろんタンパク質の種類により変動する。ハイドロフォビンを使用する場合、製品温度が１２０℃を超えないようにすることが有益であった。処理温度、例えば、スプレードライヤー中のガス流の温度は、もちろん製品温度が限界値を超えないかぎり、これより高くてもよい。
【０１３０】
洗剤組成物に各主成分を穏やかに添加する方法は、当業界の熟練者には公知である。粉末状の洗剤組成物は、例えば、第一工程で洗剤組成物中の熱的に安定な成分の水スラリーから噴霧乾燥により粗製品を作り、第二の工程でこの粗製品と熱的感受性の高い成分とを穏やかな条件で混合することにより製造可能である。一般的には、本発明において用いられる界面活性非酵素タンパク質を、この第二の工程で投入することが好ましいが、特に本発明がこれに限定されるわけではない。
【０１３１】
本発明の織布材料の洗浄方法は、少なくとも、洗浄すべき織布材料と水洗浄液とを洗浄装置に入れ、織布材料と洗浄液からなる混合物に機械的なエネルギーを加え、水洗浄液を除去し、必要に応じて織布材料を洗浄して、織布材料を乾燥させる工程を含んでいる。
【０１３２】
使用する洗浄装置は、いかなる洗浄機であってもよい。しかし、この用語「洗浄機」は、通常手洗いで用いる容器、例えばたらいや洗面器をも含んでいる。工程（ａ）では、洗浄装置にまず織布と水洗浄液を満たすが、その順序は重要でない。
【０１３３】
洗浄液は、一般に公知のように、少なくとも一種の洗浄活性物質を含んでいる。本発明によれば、水洗浄液は少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含有している。好ましいタンパク質は上述のとおりである。この界面活性非酵素タンパク質を洗剤組成物に添加してもよいが、別途添加してもよい。洗浄サイクルの初めに添加することが好ましいが、もちろん後で添加してもよい。
【０１３４】
工程段階（ｂ）の洗浄操作は、既知の方法で、織布材料と洗浄液の混合物に機械的なエネルギーを作用させて行う。機械的なエネルギーは、洗浄機により、例えば回転ドラムによりかけるが、手洗いの場合は、手及び／又は他の補助手段によりかけられる。
【０１３５】
洗浄操作中の温度は、状況に応じて当業界の熟練者により決定される。例えば、この温度が、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、あるいは１００℃であってもよい。本発明のいくつかの特長は、洗浄温度が温和か低い場合に特にはっきり出現する。本発明のある好ましい実施様態においては、洗浄操作が、６０℃以下の温度で、特に５０℃以下の温度で実施される。本発明の洗浄工程を実施するのに特に好ましい温度範囲は、５〜４５℃で、さらに特に好ましいのは１５〜３５℃で、さらに好ましくは２０〜３０℃である。
洗浄操作中の界面活性非酵素タンパク質の濃度は、当業界の熟練者により選択される。好ましい濃度範囲は、上に述べたとおりである。
【０１３６】
本発明の洗剤組成物を通して添加する場合、その濃度は、通常、洗浄液に対して、０．０５〜２５ｇ／ｌ、好ましくは０．２５〜１５ｇ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜６ｇ／ｌ、特に好ましくは１．５〜４ｇ／ｌである。
【０１３７】
実際の洗浄操作の後、洗浄液は原則として既知の方法で除かれる。通常、織布材料は続いて、一回以上水洗され、最後に乾燥させられる（工程段階（ｄ）と（ｅ））。水洗の間に、織物柔軟剤を添加物として使用してもよい。
【０１３８】
本発明の方法は、あらゆる種類の織布材料の洗浄に適している。これらは、織布ファイバや半加工織物や加工織物、及びこれらからなる加工後の衣料品であってもよい。これらは、通常の衣料用織物、カーペット、カーテン、テーブルクロスなどの家庭用織物、及び工業用の織布であってもよい。また、フリースなとの不定形構造、撚糸、糸、ヤーン、ライン、ストリング、レース、ニット、コードなどの直線状構造、フェルト、織布、不織布及び詰め綿などの三次元構造であってもよい。織布材料は、綿、羊毛又は亜麻などの天然由来の材料、あるいはポリアクリロニトリル、ポリアミド又はポリエステルなどの合成材料からなっていてもよい。もちろん、混紡織物、例えば綿／ポリエステル又は綿／ポリアミド混紡の織物であってもよい。
【０１３９】
以下、本発明を実施例を参照しながら説明する。
【０１４０】
第Ａ部：
本発明において用いられるハイドロフォビンの調整と試験
【０１４１】
実施例１
ｙａａｄ−Ｈｉｓ6／ｙａａＥ−Ｈｉｓ6のクローニングの準備
オリゴヌクレオチドのＨａｌ５７０とＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、バクテリアである枯草菌のゲノムＤＮＡである。得られたＰＣＲフラグメントは、枯草菌ｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子のコード配列を含み、またＮｃｏｌ及びＢｇＩＩＩ制限酵素切断部位をそれぞれ末端に持っていた。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、制限酵素のＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで前もって直線化させたキアゲン社のベクターｐＱＥ６０にクローニングした。このようにして得られたベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２とｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５は、ＹＡＡＤ：：Ｈｉｓ6又はＹＡＡＥ：：Ｈｉｓ6からなるタンパク質の発現に使用できる。
【０１４２】
Ｈａｌ５７０：ｇｃｇｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔｃａａａｃａｇｇｔａｃｔｇａ
Ｈａｌ５７１：ｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｔａｃ
Ｈａｌ５７２：ｇｇｃｃａｔｇｇｇａｔｔａａｃａａｔａｇｇｔｇｔａｃｔａｇｇ
Ｈａｌ５７３：ｇｃａｇａｔｃｔｔａｃａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｃｃ
【０１４３】
実施例２
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１６とＫａＭ４１７を用いてポリメラーゼ連鎖反応をおこなった。使用したテンプレートＤＮＡは、カビの偽巣性コウジ菌のゲノムＤＮＡである。得られたＰＣＲフラグメントは、ハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡのコード配列とＮ−端末Ｘａ因子プロテイナーゼ切断部位とからなっていた。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、前もって制限酵素ＢｇＩＩＩで直線化させた前記ベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２にクローニングした。
【０１４４】
このようにして得られたベクター＃５０８は、ＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：Ｈｉｓ6からなる融合タンパク質の発現に使用できる。
【０１４５】
ＫａＭ４１６：ＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＣ
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
【０１４６】
実施例３
ｙａａｄハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４３４とＫａＭ４３５を用いて、プラスミド＃５１３を、同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
【０１４７】
ＫａＭ４３４：ＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４３５：ＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ
【０１４８】
実施例４
ｙａａｄハイドロフォビンＨｙｐＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
ｐＱＥ６０中のＨｙｐＡ（＃５２２）のクローニング
【０１４９】
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４４９とＫａＭ４５０を用いてＰＣＲを行った。使用したテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のプラスミドｐＣＲ２．１中のＨｙｐＡであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＡ遺伝子のコード配列を含むが、開始コドン及び停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＮｃｏｌとＢｇＩＩＩとで直線化されたベクターｐＱＥ６０に連結した。
【０１５０】
ＫａＭ４４９：ＧＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴ
ＫａＭ４５０：ＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
ｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤ中のＨｙｐＡ（＃５２３）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５１とＫａＭ４５２を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐＣＲ２．１のプラスミドＨｙｐＡであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＡ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＢｇＩＩＩとＢａｍＨｌで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤに連結した。
【０１５３】
ＫａＭ４５１：ＣＧＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４５２：ＣＧＡＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
実施例５
ｙａａｄハイドロフォビンＨｙｐＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
【０１５６】
ｐＱＥ６０中のＨｙｐＢ（＃５２４）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５３とＫａＭ４５４を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐｕＣ１９中のプラスミドＨｙｐＢであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＢ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０に連結した。
【０１５７】
ＫａＭ４５３：ＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧ
ＫａＭ４５４：ＧＣＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣ
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
ｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤ中のＨｙｐＢ（＃５２５）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５５とＫａＭ４５６を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐｕＣ１９中のプラスミドＨｙｐＢであった。得られたフラグメントはハイドロフォビンＨｙｐＢ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＢｇＩＩＩとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤに連結した。
【０１６０】
ＫａＭ４５５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣ
ＫａＭ４５６：ＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣ
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
実施例６
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いて、プラスミド＃５０７を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
用いたテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列−ハイドロフォビンＢＡＳＦ１であった（付録参照）。
【０１６３】
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１６４】
実施例７
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いて、プラスミド＃５０６を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
用いたテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列−ハイドロフォビンＢＡＳＦ２であった（付録参照）。
【０１６５】
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１６６】
実施例８
ｙａａｄハイドロフォビンＳＣ３ −Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４６４とＫａＭ４６５を用いて、プラスミド＃５２６を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
【０１６７】
用いたテンプレートＤＮＡは、シゾフィラム・コミューンのｃＤＮＡであった（付録参照）。
【０１６８】
ＫａＭ４６４：ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＫａＭ４６５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ
【０１６９】
実施例９
組換え大腸菌菌株ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6の発酵
１５ｍｌのグライナーチューブ中の３ ｍｌのＬＢ液体培地に、ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6を発現する大腸菌株を接種する。３７°Ｃで８時間、シェーカー上で２００ｒｐｍで培養する。いずれの場合も、２個のじゃま板付の１ｌエルレンマイアーフラスコ中の２５０ ｍｌのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に、１ｍｌの前記前培養物を接種し、シェーカー上で１８０ｒｐｍで振盪しながら、３７°Ｃで７時間培養する。２０ｌの培養槽中の１３．５ｌのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に、０．５ｌの前培養物（ＯＤ600nm １：１０、Ｈ2Ｏを対象に測定）を接種する。ＯＤ600nmが約３．５となる時、１４０ｍｌの１００ｍＭのＩＰＴＧを添加する。３時間後、培養槽を冷却して１０℃とし、発酵液を遠心分離する。さらに精製するには、セルペレットを使用する。
【０１７０】
実施例１０
組換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製（Ｃ−端末にＨｉｓ6タグを持つハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
１００ｇの細胞ペレット（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン）を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で総体積２００ｍｌとし、再懸濁させる。この懸濁液を、ウルトラタラックスＴ２５型（ヤンケアンドクンケル社；ＩＫＡ−ラボテクニック）に１０分間かけ、続いて５００単位のベンゾナーゼ（メルク社、ドイツ；注文番号１．０１６９７．０００１）とともに、室温で１時間培養して、核酸を分解させる。細胞破砕に先立ち、ガラスカートリッジ（Ｐ１）で濾過する。細胞破砕と残存ゲノムＤＮＡの切断のため、二回ホモジナイザーサイクルに１５００ｂａｒでかける（マイクロフルイダイザーＭ−１１０ＥＨ；マイクロフルイディックス社）。このホモジネートを遠心分離し（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡ回転子、２５０ｍｌ遠心器カップ、６０分間、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）、上澄液を氷冷し、ペレットを１００ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。遠心分離と再懸濁とを三回繰返し、繰返し三度目には、１％のＳＤＳを含むリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。再懸濁後、混合物を１時間攪拌し、最後の遠心分離にかけた（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡ回転子、２５０ ｍｌ遠心器カップ、６０分、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、最後の遠心分離後の上澄液中にハイドロフォビンが認められる（図１）。この試験により、ハイドロフォビンが、相当する大腸菌細胞中に封入体の形で存在しているようであることがわかる。５０ｍｌのハイドロフォビン含有上澄液を、５０ｍｌの前もって５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させておいたニッケルセファローズ高性能１７−５２６８−０２カラム（アマシャム社）にかける。このカラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、ついでハイドロフォビンを、２００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶離させる。イミダゾールを除くため、溶液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析する。
【０１７１】
図１は、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
レーン１：ニッケル−セファローズカラム（１：１０希釈）
レーン２：流出＝洗浄工程での溶離
レーン３〜５：溶離フラクションのＯＤ２８０最大値
【０１７２】
図１のハイドロフォビンの分子量は約５３ｋＤである。小さなバンドのいくつかは、ハイドロフォビンの分解生成物である。
【０１７３】
実施例１１
性能試験；ガラス上の水滴の接触角の変化によるハイドロフォビンの評価
基板：
ガラス（窓ガラス、スードドイチェグラス社、ドイツ）
【０１７４】
実施例１０の融合ハイドロフォビンを用いた。
ハイドロフォビン濃度：１００μｇ／ｍｌの水溶液； 添加物：５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）＋０．１％ポリオキシエチレン（２０）−モノラウリン酸ソルビタン（ツイーン（Ｒ）２０）．
−ガラス板を一夜保温（温度８０℃）、次いで、塗膜を蒸留水中で洗浄。
−次いで、１０ ｍｉｎ／８０℃／１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の蒸留水溶液中で保温。
−蒸留水中で洗浄
【０１７５】
サンプルを風乾し、５μｌの水液滴の接触角（°）を室温で測定する。
【０１７６】
接触角は、データフィジックス社のＯＣＡ１５＋接触角システム、ソフトウェアＳＣＡ２０．２．０．（２００２年１１月）を用いて測定した。測定はメーカの説明書に応じて行った。
【０１７７】
非処理ガラスでは、接触角が３０±５°であり、機能性の実施例８のハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）を塗布したものの接触角は７５±５°であった。
【０１７８】
第Ｂ部：
界面活性非酵素タンパク質の織布洗浄への利用
試験の概要：
活性の試験のために、市販の試験装置（ランデロメーター、アトラス社、米国）を用いて洗浄試験を行った。試験はいずれも、洗浄液に上記のタンパク質の存否の両方でおこなった。
【０１７９】
試験には、市販の試験布と自家製の試験布を用いた。
【０１８０】
【表５】
【０１８１】
洗浄試験の実施：
上記の試験布より３０×３０ｍｍの試料を切り出し、非染色の漂白綿編布に縫い付けた。
【０１８２】
市販の試験布の場合、いずれの場合も、２枚の試験片（５０ｍｍ×２００ｍｍ）を、いずれも４枚の異なる縫合試験布（試験布１〜４）又は、いずれも２枚の異なる縫合試験布（試験布５及び６）を５ｇの白色綿／ポリエステル混紡布とともに、特定の条件下で洗浄した。
【０１８３】
自家製の試験布の場合、０．１ｇの着色油脂又は着色油を綿布片（５０ｍｍ×２００ｍｍ非染色漂白綿編布）に二滴たらし、５０℃で３０分間処理した。スダンレッドを着色に用いた。
【０１８４】
洗浄後、布を２５０ｍｌの水道水で５分間洗浄し、乾燥した。
【０１８５】
洗浄効果は、水洗前後の反射率（４２０ｎｍ）を測定して評価した。
【０１８６】
いずれの場合も、一つの試験は界面活性非酵素タンパク質を添加して行い、もう一試験は、同様な条件、つまりタンパク質が無添加である以外はまったく同一の条件で実施した。
【０１８７】
結果の表中のパーセント比率は、タンパク質を添加した試験では、タンパク質無添加の試験に比べ洗浄効果が増加していることを示している。なお、この比率は次式で計算される。
【０１８８】
洗浄効果の増加率［％］＝（ＩE−ＩOE）／（Ｉwhite−ＩA）×１００
【０１８９】
ＩEは、いずれの場合も、試験洗浄後の試験布の反射率を示し、ＩAは、試験洗浄実施前の反射率である。０は、本発明でタンパク質が無添加の比較試験をさす。Ｉwhiteは、汚れのないきれいな布の反射率を示す。
【０１９０】
汚れの再付着を、いずれの場合も試験タンパク質の添加の有無の両試験で、汚れのないきれいな布の洗浄前後の反射率を比較して評価した。
【０１９１】
実施例１２：
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質濃度： 表１参照
洗剤組成物 市販の粉状洗剤組成物（ホワイトキャット、中国、２００３）
洗浄液の量 一缶当たり２５０ ｍｌ
洗浄組成物の量 ２．０ｇ／ｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９２】
タンパク質を希釈し水溶液として添加した。上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表１にまとめて表示する。
【０１９３】
実施例１３：
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質濃度： 表１参照
洗剤組成物 市販の粉末状の洗浄組成物（アリエール、中国、２００４、プロクタ
ーアンドギャンブル社）
洗浄液の量 一缶２５０ｍｌ
洗浄組成部の量 ２．０ｇ／ｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝ ３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９４】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表１にまとめて表示する。
【０１９５】
【表６】
【０１９６】
すべての試験で、大幅な洗浄効果の増強が見られた。
【０１９７】
実施例１４：
以下の試験洗浄では、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、及びビルダーを含む、洗剤組成物用の基本製剤を使用した。
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：２６）
タンパク質濃度： 表２参照
アニオン性界面活性剤 ４００ｐｐｍのＣ12/14−脂肪族アルコール硫酸ナトリウム
ノニオン性共界面活性剤 いずれの場合も、３０ｐｐｍのＣ13/15−オキソアルコールエ
トキシラート、アルコキシラート基の種類については表２を参
照
ビルダー ２５０ｐｐｍの炭酸ナトリウム
洗浄液量 一缶２５０ｍｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝ ３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９８】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表２にまとめて表示する。
【０１９９】
【表７】
【０２００】
実施例１５：
以下の試験洗浄では、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、及びビルダーを含む、洗剤組成物用の基本製剤を使用した。
試験の変数：
使用のタンパク質 タンパク質Ａ：
ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質Ｂ：
ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗ Ａ−ｈｉｓ（配列番号：２６）
タンパク質濃度： 表３参照
アニオン性界面活性剤 ４００ｐｐｍのＮ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
共界面活性剤 いずれの場合も、３０ｐｐｍ、種類は表３参照
ビルダー ２５０ｐｐｍの炭酸ナトリウム
洗浄液量 一缶２５０ｍｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ（Ｃａ：Ｍｇモル比＝３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０２０１】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表３にまとめて表示する。
【０２０２】
【表８】
【０２０３】
すべての試験で、大幅な洗浄効果の増強が見られた。いずれの場合も、部分ｙａａｄ融合パートナー（Ｂ）（４０アミノ酸）を有する融合ハイドロフォビンは、完全なｙａａｄ融合パートナー（Ａ）（２９４アミノ酸）を有する融合ハイドロフォビンより良好な結果を与えた。
【０２０４】
配列表中のＤＮＡ及びポリペプチド配列と配列番号の相関
【０２０５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性をもつ非酵素タンパク質の織布洗浄への利用に関する。また本発明は、界面活性非酵素タンパク質を含有する織布洗浄用の洗剤組成物、及びこのようなタンパク質を用いる洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
織布の洗浄において、汚れ、特に疎水性汚れを満足できるレベルにまで除去するには、現在のところ比較的高温が必要となる。中間温度、特に室温では、現在もなお洗浄性能の向上が、かなり求められている。従来技術では、疎水性汚れの除去には、特に界面活性剤と脂質分解酵素とが併用されている。
【０００３】
洗剤組成物への添加物として酵素タンパク質を利用することは、原則として公知である。特にプロテアーゼが洗剤組成物に多用されているが、アミラーゼやセルラーゼ、リパーゼも知られている。詳細については、例えば、“Waschmittel-Enzyme” [洗浄組成物酵素] in Rompp Chemie-Lexikon, Online edition, Version 2.6, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, ２００５年２月、に記載されている。
【０００４】
固定剤やＵＶ保護剤、芳香物質、防汚助剤などの洗浄助剤を繊維に固定するためにタンパク質が利用できることも公知である。ＷＯ９８／００５００では、この目的のためのセルラーゼ、セルラーゼ誘導体又はセルラーゼ様タンパク質の利用を開示しており、ＷＯ０１／４６３５７では、この目的のためにセルロース結合部位と他の化合物の結合部位を有する融合タンパク質の利用を開示している。
【０００５】
界面活性タンパク質は、原則として公知である。特に表面活性が強いあるクラスのタンパク質は、「ハイドロフォビン」と呼ばれている。ハイドロフォビンは、界面に強い親和性を示すため、表面塗布に適している。例えば、テフロン（登録商標）表面にハイドロフォビンを塗布すると、テフロン（登録商標）が親水化する。
【０００６】
ハイドロフォビン類は、１００〜１５０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であり、糸状菌、例えばシゾフィラム・コミューンに特徴的なものである。これらは、一般にシステイン単位を６個有している。
【０００７】
ハイドロフォビンは、天然源から単離可能である。しかし、遺伝子工学的な手法で得ることもできる。発明者らの以前の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０７１９には、ハイドロフォビンの製造方法が開示されている。
【０００８】
従来技術では、ハイドロフォビンのいろいろな用途での利用が提案されている。
【０００９】
ＷＯ９６／４１８８２では、ハイドロフォビンを乳化剤や増粘剤、界面活性物質として、疎水性の表面の親水化、親水性基板の耐水性の改良や水中油型水乳濁液又は油中水型乳濁液の製造に利用することが開示されている。また、軟膏又はクリームの生産など医薬品用途や皮膚の保護やシャンプーやヘアリンスの生産などの化粧品用途での利用も提案されている。
【００１０】
ＥＰ１２５２５１６には、ハイドロフォビンを含む溶液を３０〜８０℃の温度で、窓やコンタクトレンズ、バイオセンサー、医療用具、試験容器又は保管容器、船殻、固体粒子、又は乗用車のフレームやシャーシに塗布することが開示されている。
【００１１】
ＷＯ０３／５３３８３には、化粧品用途のケラチン材料の処理にハイドロフォビンを用いることが開示されている。
【００１２】
ＷＯ０３／１０３３１には、ハイドロフォビンを塗布したセンサ、例えば、他の物質、例えば電気活性物質や抗体又は酵素が非共有状態で結合した試験電極が開示されている。
【００１３】
洗剤組成物用防汚添加剤としての界面活性非酵素タンパク質の利用、特にハイドロフォビンの利用に関する記述は、現在のところ見られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、改良された洗剤組成物、及び改良された織布の洗浄方法を提供することである。特に低温での洗浄において優れた洗浄性能が得られる。
【００１５】
したがって、織布洗浄における界面活性非酵素タンパク質の利用が見出された。
本発明の第二の側面では、界面活性非酵素タンパク質を含む洗剤組成物が見出された。
【００１６】
本発明の第三の側面では、界面活性非酵素タンパク質を含む洗浄液を用いる洗浄方法が見出された。本方法のある特定の実施様態では、この洗浄が６０℃以下の温度で行われる。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施様態においては、この界面活性非酵素タンパク質がいずれの場合もハイドロフォビンである。
【００１８】
驚くべきことに、界面活性非酵素タンパク質を洗浄液に添加すると、大幅な洗浄効率の上昇が認められた。特に驚くべきことは、低洗浄温度でも、またタンパク質の使用量が非常に少ない場合でも、この効果が認められることである。例えば、洗浄液中のタンパク質濃度が約２．５ｐｐｍであっても、既存の洗剤組成物と組合わせると、洗浄温度が２５℃と低温でも最大８％まで洗浄効果を増強することができる。
【００１９】
防汚作用の増強以外に、着色した油性の汚れに対する灰色化防止作用が認められた。洗浄過程で織布から除かれる疎水性の汚れは、洗濯の際に細かく分解されて織物の裏面に移行し、織布を灰色化または退色させることが起こりうる。通常、この影響は特に白色の織物あるいは淡色の織物で顕著である、特に界面活性剤やビルダー系の顔料が少ないときに、この問題が顕著である。本発明のように界面活性非酵素タンパク質を添加すると、この再付着が防止され、タンパク質の添加なしに洗浄された織物と較べると、洗浄後の織物の白色度が改善される。
【００２０】
以下に、本発明を詳細かつ具体的に説明する。
【００２１】
本発明の実施に当たり、界面活性を持つ非酵素タンパク質が使用される。「非酵素」とは、酵素活性を持たない、あるいは持っていてもごくわずかであるタンパク質であることを示す。
【００２２】
「界面活性」とは、使用するタンパク質が界面特性に影響を与えることができることを示す。この界面は、固体−固体界面であっても、固体−液体界面、固体−ガス界面、液体−液体界面、液体−ガス界面であってもよい。特に、固液界面や液液界面であってもよい。
【００２３】
固液界面の場合に、用いるタンパク質で影響を受ける性質が、例えば固体表面の親水性又は疎水性であってもよい。親水性又は疎水性の変化は、塗布表面及び非塗布表面上での水滴の接触角を測定する既知の方法により測定可能である。もう一つの界面特性は、液体の表面張力の変化であり、これも既知の方法により測定可能である。
【００２４】
本発明の実施にあたり、好ましくは低濃度においても界面活性を示すタンパク質が好ましい。特に０．０５〜５０ｐｐｍの濃度で大きな界面活性作用を持つタンパク質が好ましい。
【００２５】
本発明のある好ましい実施様態においては、使用するタンパク質が、もしこのタンパク質をガラス表面に塗布してその上に水滴（５μｌ）を落とした場合、その水滴の接触角が、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°の増加させるものである。接触角を少なくとも２５°増加させるタンパク質の使用が好ましく、少なくとも３０°増加させるタンパク質の使用がさらに好ましい。接触角の測定方法は、当業界の熟練者には原則として公知である。接触角の測定に適当な方法の具体的な実験条件が、下記の実施例欄に記載されている。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施様態においては、この使用するタンパク質がハイドロフォビンである。
【００２７】
本発明において、「ハイドロフォビン」とは、一般構造式（Ｉ）で表されるポリペプチド類をさす。
【００２８】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ1-50−Ｃ2−Ｘ0-5−Ｃ3−Ｘ1-100−Ｃ4−Ｘ1-100−Ｃ5−Ｘ1-50−Ｃ6−Ｘ0-5−Ｃ7−Ｘ1-50−Ｃ8−Ｘm （１）
【００２９】
式中、Ｘは２０個の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれかである。式中、Ｘ基は、いずれも同一であっても異なっていてもよい。Ｘの添字は、特定の部分配列Ｘ中のアミノ酸の数の数を示し、Ｃは、システイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニン又はトレオニンを示し、Ｃ残基のうち少なくとも４個はシステインであり、及び添字のｎとｍは、それぞれ独立して０〜５００の自然数、好ましくは１５〜３００の自然数を示す。
【００３０】
また、式（Ｉ）のポリペプチドは、このタンパク質をガラス表面に塗布して水滴をたらした時、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°及びさらに好ましくは３０°の水滴接触角の増加をもたらすという特徴を有している。
【００３１】
Ｃ1〜Ｃ8で表されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。しかし、これらは、空間充填量の類似する他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、メチオニン又はグリシンで置換されていてもよい。しかし、Ｃ1〜Ｃ8の位置の、少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも６個、特に少なくとも７個がシステインである。本発明のタンパク質において、システインは、還元型で存在しても、相互にジスルフィドブリッジを形成していてもよい。 特に好ましくは、分子内にＣ−Ｃブリッジを形成していることが好ましく、また、少なくとも１個の分子内ジスルフィドブリッジ、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは４個の分子内ジスルフィドブリッジを形成していることが好ましい。上記のようにシステインが、空間充填量の類似したアミノ酸で置換されている場合、分子内ジスルフィドブリッジを相互に形成しうる対の両方が置換されていることが好ましい。
【００３２】
Ｘで示される位置にシステイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニン又はトレオニンが使用されている場合、上記一般式中の各Ｃ位置の番号も、これに伴って変化しうる。
【００３３】
好ましくは、一般式（ＩＩ）のハイドロフォビンの使用が好ましい。
【００３４】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ3-25−Ｃ2−Ｘ0-2−Ｃ3−Ｘ5-50−Ｃ4−Ｘ2-35−Ｃ5−Ｘ2-15−Ｃ6−Ｘ0-2−Ｃ7−Ｘ3-35−Ｃ8−Ｘm （ＩＩ）
【００３５】
本発明の実施に当たりＸとＣ、およびこれらの添字が上記と同じである場合、添字のｎとｍはそれぞれ０〜３５０、好ましくは１５〜３００であり、これらのタンパク質が上記の接触角変化をもたらし、またＣで示される残基のうち少なくとも６個がシステインである。すべてのＣ残基がシステインであることがさらに好ましい。
【００３６】
一般式（ＩＩＩ）のハイドロフォビンの使用が特に好ましい。
【００３７】
Ｘn−Ｃ1−Ｘ5-9−Ｃ2−Ｃ3−Ｘ11-39−Ｃ4−Ｘ2-23−Ｃ5−Ｘ5-9−Ｃ6−Ｃ7−Ｘ6-18−Ｃ8−Ｘm （ＩＩＩ）
【００３８】
式中、ＸとＣ、およびこれらの添字は上記と同じであり、添字のｎとｍは、それぞれ０〜２００であり、これらのタンパク質が上記の接触角変化をもたらし、またＣで示される残基のうち少なくとも６個がシステインである。すべてのＣ残基がシステインであることがさらに好ましい。
【００３９】
Ｘn残基とＸm残基は、ハイドロフォビンに自然に結合するペプチド配列であってもよい。しかし、これらの残基の一方または両方が、自然にはハイドロフォビンと結合しないペプチド配列であってもよい。したがって、これらのＸn残基及び／又はＸm残基において、自然にハイドロフォビンに起こるペプチド配列が、自然にはハイドロフォビンに起こらないペプチド配列により延長されていてもよい。
【００４０】
Ｘn残基及び／又はＸm残基が自然にはハイドロフォビンに起こらないペプチド配列である場合、これらの配列の長さは、一般的には少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸及び、例えば、少なくとも１００個のアミノ酸である。これらの配列は、２０〜５００個のアミノ酸、好ましくは３０〜４００個のアミノ酸、さらに好ましくは３５〜１００個のアミノ酸からなる。自然にはハイドロフォビンに結合しないこのような残基を、以降、融合パートナーと称す。このことは、このタンパク質が、少なくとも一種のハイドロフォビン基と一種の融合パートナー基からなる、自然にはこの形で存在しないものであってもよいことを意味する。
【００４１】
この融合パートナー基はいろいろなタンパク質から選択可能である。また、単一の融合パートナーがハイドロフォビン基に結合していてもよく、あるいは、複数の融合パートナーが１個のハイドロフォビン基に、例えば、ハイドロフォビン基のアミノ末端（Ｘn）とカルボキシル末端（Ｘm）に結合していてもよい。しかし、例えば二つの融合パートナーが、本発明のタンパク質の一箇所（Ｘn又はＸm）に結合していてもよい。
【００４２】
特に好適な融合パートナーは、微生物、特に大腸菌又は枯草菌中で自然にできるタンパク質である。このような融合パートナーの例としては、配列ｙａａｄ（配列番号１５と１６）、配列ｙａａｅ（配列番号１７と１８）、及びチオレドキシンがあげられる。また特に好適なのは、これらの配列のフラグメント又は誘導体であり、上記配列の例えば７０〜９９％、好ましくは５〜５０％の、さらに好ましくは１０〜４０％の部分配列を含むもの、あるいは、個々のアミノ酸又はヌクレオチドが上記の配列とは異なるものであり、この場合、上記のパーセント比率は異なるアミノ酸の数を意味する。
【００４３】
さらに好ましい実施様態においては、この融合ハイドロフォビン、また上記の融合パートナーは、Ｘn又はＸm基として又はそのような基の端末部分として、いわゆる親和性ドメイン（親和性タグ／親和性尾部）を有している。公知のように、これは特定の相補的な基に相互作用を待つアンカー基を有し、タンパク質の処理や精製を容易にさせる。親和性ドメインの例としては、（Ｈｉｓ）k基、（Ａｒｇ）k基、（Ａｓｐ）k基、（Ｐｈｅ）k基又は（Ｃｙｓ）k基があげられ、式中、ｋは一般に１〜１０の自然数である。この基は、好ましくは（Ｈｉｓ）k基であり、ｋは４〜６である。この場合、Ｘn基及び／又はＸm基は、このような親和性ドメインのみからなっていてもよく、あるいはハイドロフォビンに自然に結合している、あるいは自然には結合しないＸn基又はＸm基が、端末親和性ドメインと結合して伸びていてもよい。
【００４４】
したがって、本発明においてハイドロフォビン又はそれらの誘導体として用いるタンパク質は、それらのポリペプチド配列中に修飾を含んでいてもよく、そのようの修飾の例としは、グリコシル化、アセチル化、あるいは、例えばグルタールアルデヒドでの化学架橋があげられる。
【００４５】
本発明において用いられるハイドロフォビンやその誘導体の特徴の一つは、このようなタンパク質で被覆された表面の性質の変化である。表面の性質の変化は実験的に測定可能であり、例えば、タンパク質を表面に塗布する前後で水滴の接触角の測定して、それらの差を求めることで求めることができる。
【００４６】
接触角の測定方法は、原則として当業界の熟練者には公知である。この測定では、室温でガラス板を基板に用いて、５μｌの水滴を測定する。接触角の好適な測定方法の正確な実験条件は、実施例の欄で述べる。そのような条件下では、本発明において用いられる融合タンパク質は、このタンパク質をガラス表面に塗布して水滴を落とし接触角を測定すると、非塗布ガラス表面上の同容量の水滴の接触角と較べて、室温で少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、さらに好ましくは３０°の水滴接触角の増加をもたらすという特徴を有している。
【００４７】
本発明を実施するうえで特に好ましいハイドロフォビンは、ｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２などのハイドロフォビン類であり、構造的には下記の配列を有している。これらはまた、その一部又は誘導体であってもよい。複数のハイドロフォビン基が、好ましくは２個又は３個の同一又は異なる構造が、相互に結合するか、相当する適当な天然のハイドロフォビンには結合しないポリペプチド配列に結合していてもよい。
【００４８】
本発明において特に好適なのは、融合タンパク質のｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号：２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号：２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号：２４）であり（括弧中のポリペプチド配列番号を示す）、及びそれをコードする核酸配列、特に配列番号１９、２１、２３で表される配列である。さらに好ましくは、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）を用いることができる。配列番号２０、２２又は２４で示されるポリペプチド配列から少なくとも１個〜１０個の、好ましくは５個のアミノ酸、さらに好ましくは全アミノ酸の５％のアミノ酸が置換、挿入又は欠失したタンパク質であって、出発タンパク質の生物学的な性質を少なくとも５０％保持するものも、特に好ましい実施様態である。このタンパク質の生物学的な性質とは、上述のように、接触角の少なくとも２０°の変化を意味する。
【００４９】
本発明を実施するうえで特に好適な誘導体は、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）から、ｙａａｄ融合パートナーを切断してできる残基である。９４個のアミノ酸からなる完全なｙａａｄ融合パートナー（配列番号１６）に代えて、部分ｙａａｄ残基を用いることは有益である。切断される残基は、少なくとも２０個の、さらに好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸を含む必要がある。例えば、２０〜２９３個の、好ましくは２５〜２５０個の、さらに好ましくは３５〜１５０個の、例えば３５〜１００個のアミノ酸なる部分残基が使用される。このようなタンパク質の一例は、ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２６）であり、これは、４０アミノ酸まで切断されたｙａａｄ残基である。
【００５０】
ハイドロフォビンと融合パートナー又は複数の融合パートナー間の切断部位は、純粋なハイドロフォビンを非修飾状態で（例えば、メチオニンでのＢｒＣＮ切断、Ｘａ因子切断、エンテロキナーゼ切断、トロンビン切断、ＴＥＶ切断などにより）放出するのに利用できる。
【００５１】
ある融合パートナー、例えばｙａａｄ又はｙａａｅと、複数のハイドロフォビン（異なる配列であってもよい）とから、融合タンパク質を作ることができ、その例としては、ＤｅｗＡ−ＲｏｄＡ、Ｓｃ３−ＤｅｗＡ、又はＳｃ３−ＲｏｄＡがあげられる。同様に、ハイドロフォビンのフラグメント（例えば、Ｎ末端又はＣ末端除去物）又は相同性が７０％以上である変異タンパク質を用いることもできる。好適なコンストラクトは、いずれの場合も、特定の用途、即ち分離される液相との関係で選択される。
【００５２】
本発明において織布の洗浄に用いられるハイドロフォビンは、既知の化学的ペプチド合成、例えばメリフィールド固相合成により製造できる。
【００５３】
天然のハイドロフォビンを、天然資源より適当な方法で取り出してもよい。例えば、Wosten et al.、Eur. J Cell Bio. 63、122-129 (1994)又はWO 96/41882を参照。
【００５４】
融合パートナーを使用しないタラロマイセス・サーモフィルスからの遺伝子工学的なハイドロフォビンの生産方法が、米国特許２００６／００４０３４９に記載されている。
【００５５】
融合タンパク質は遺伝子工学的な方法により得ることが好ましく、この際、融合パートナーをコードするある核酸配列、特にＤＮＡ配列と、ハイドロフォビン基をコードするものとを結合し、結合した核酸配列を遺伝子発現させて、宿主生物中に所望のタンパク質を産生される。このような製造方法は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０７１９に開示されている。
【００５６】
上記の製造方法に好適な宿主生物（産生生物）は、原核生物（古細菌を含む）又は真核生物であり、特にハロバクテリアやメタノコッカスなどのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞であり、さらに好ましくは特に、大腸菌、枯草菌、巨大菌、コウジカビ、偽巣性コウジ菌、クロカビ、ピチア・パストリス、シュードモナス種、乳酸菌、ハンセヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・レーゼイ、ＳＦ９（あるいは関連細胞）である。
【００５７】
本発明はまた、調節核酸配列による遺伝子制御下にある、本発明において使用するポリペプチドをコードする核酸酸配列を含む発現コンストラクト、及びこれらの発現コンストラクトの少なくとも一つを含むベクターの利用を提供する。
【００５８】
使用するコンストラクトは、好ましくは特定のコード配列の５’上流、プロモーター及び、３’下流、ターミネーター配列、及び必要ならさらにいろいろな調節成分を含み、いずれの場合もこれらが作動可能な状態でコード配列に連結している。
【００５９】
本発明において、「作動可能な状態で連結」しているとは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び必要ならさらなる調節成分が、コード配列の発現において各調節成分が目的とする機能を発揮するように連続的に配列していることをいう。
【００６０】
作動可能な状態で連結可能な配列の例としては、標的配列や、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等があげられる。他の調節成分としては、選択可能なマーカー、増幅信号、複製開始点等があげられる。好適な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００６１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然な調節領域が実際の構造遺伝子の上流に存在するかもしれないが、必要ならこれらは、遺伝子組換により自然な調節を除き、遺伝子の発現が増加するようにされてきた。
【００６２】
好ましい核酸コンストラクトはまた、好ましくは、プロモーターに機能的に連結する１個以上のいわゆる「エンハンサー」配列を有しており、核酸配列の発現が増強されている。また、ＤＮＡ配列の３’末端には、他の調節成分又はターミネーターなどの好ましい配列をさらに挿入することも可能である。
【００６３】
このような核酸は、コンストラクト中に、１個以上のコピー数で存在していてもよい。コンストラクトの選択に望ましいなら、抗生物質耐性マーカー等の他のマーカーや、栄養要求性を与える遺伝子がコンストラクト中に存在していてもよい。
【００６４】
そのような調剤中の好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、Ｉａｃｌｑ−Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ−ＰＲ、又はｉｍｌａｍｂｄａ−Ｐプロモーターなどのプロモーター中に存在し、好ましくはグラム陰性バクテリア中で使用される。さらに好ましい調節配列は、例えば、ａｍｙやＳＰ０２などのグラム陽性プロモーター中や、ＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨなどの酵母又は真菌プロモーター中に存在する。
【００６５】
調節に合成プロモーターを使用することも可能である。
【００６６】
宿主生物での発現のためには、核酸コンストラクトを宿主中での遺伝子発現を最適とさせるプラスミドやファージ等のベクターに挿入することが好ましい。プラスミドやファージとは異なり、ベクターは、当業界の熟練者には公知である他のすべてのベクターを意味し、その例としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス等のウイルスや、トランスポソン、ＩＳ成分、プラスミド、コスミド、及び直線状又は環状ＤＮＡ、及びアグロバクテリウムシステムがあげられる。
【００６７】
これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製させてもよいし、染色体を経由して複製させてもよい。好適なプラスミドの例としては、大腸菌では、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐｌＮ−ｌｌｌ”３−Ｂ１、ｔｇｔ１１、又はｐＢｄＣｌがあげられ、ストレプトミセス属ではｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２、又はｐｌＪ３６１が、バチルス属ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、又はｐＢＤ２１４が、コリネバクテリウム属ではｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７が、真菌類ではｐＡＬＳ１、ｐｌＬ２、又はｐＢＢ１１６が、酵母では２ａｌｐｈａ、ＰＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、又はｐＥＭＢＬＹｅ２３が、また植物ではＬＧＶ２３、ｐＧＨＩａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４又はｐＤＨ５１があげられる。これらのプラスミドは、多様なプラスミドの候補の一部であるにすぎない。他のプラスミドも当業界の熟練者には公知であり、例えば、Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985、ISBN0444904018)に記載されている。
【００６８】
この核酸コンストラクトは、他に存在する遺伝子の発現のために、好ましくは、用いる宿主生物や遺伝子（群）に応じて発現が最適となるように選択された発現増強用の３’−及び／又は５’−端末調節配列を有している。
【００６９】
これらの調節配列は、遺伝子やタンパク質の発現をうまく制御するようにするためのものである。このことは、宿主生物によっては、遺伝子が誘導によってのみ発現あるいは過剰発現されたり、遺伝子が直ちに発現及び／又は過剰発現されたりすることを意味する。
【００７０】
この調節配列又は調節因子は、プラスの影響を与え、導入遺伝子の遺伝子発現を増加させることが好ましい。したがって、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いて、これらの調節成分の増幅を転写レベルで行うことが好ましい。また、例えばｍＲＮＡの安定性を改善して翻訳を加速することもできる。
【００７１】
ベクターの他の実施様態においては、核酸コンストラクト又は核酸を含むベクターを直線状ＤＮＡの形で微生物に導入し、宿主生物のゲノムに異形組換え又は相同組換えにより組み込むことも好ましい。この直線状ＤＮＡは、プラスミドが直線状となったベクターであっても、単に核酸コンストラクト又は核酸であってもよい。
【００７２】
生物内で異種遺伝子をうまく発現させるためには、生物で用いられる「コドン使用頻度」に応じて、核酸配列を変更することが有利である。「コドン使用頻度」は、目的生物の他の既知の遺伝子のコンピュータ解析結果を参照して容易に決定することができる。
【００７３】
発現カセットは、適当なプロモーター、適当なコード核酸配列、及びターミネーター信号又はポリアデニル化シグナルを融合して製造される。このために、一般的な組換え及びクローニング法が用いられ、その例は、例えば以下の文献に記載されている。T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987）。
【００７４】
適当な宿主生物で発現させるには、組換え核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクトを、好ましくは宿主に特異的なベクターに挿入させ、遺伝子を宿主中で好適に発現させる。ベクターは当業界の熟練者には公知であり、例えば、“Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に記載されている。
【００７５】
ベクターを用いて、例えば少なくとも一個のベクターを用いて、形質添加された本発明のハイドロフォビン又はその誘導体の生産に使用可能な組換え微生物を作成することができる。好ましくは、上記の組換えコンストラクトを適当な宿主システムに導入して発現させる。特定の発現システムで上記の核酸を発現させるためには、当業界の熟練者に馴染みのあるクローニング法やトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等を用いることが好ましい。好適なシステムが、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載されている。
【００７６】
相同型の遺伝子組み換え微生物を作ることも可能である。このためには、使用する遺伝子又はコード配列の少なくとも一部で、適当なら配列を機能的に混乱させるために、少なくとも一個のアミノ酸を欠失、挿入、又は置換させたベクター（「ノックアウト」ベクター）が作られる。この導入される配列が、例えば、関連する微生物由来の、あるいは哺乳類、酵母又は昆虫から由来する相同体であってもよい。あるいは、相同組換えに使用するベクターを、相同組換えの場合、内因性の遺伝子に変異が認められるが、機能性タンパク質を依然としてコードしている（例えば、内因性タンパク質の発現が変化するように上流の調整領域を変えるとができる）ようにすることもできる。本発明において用いられる遺伝子中の変化部分は、相同組換えベクター中に存在する。相同組換え用の適当なベクターの作成は、例えば、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００７７】
原則として、あらゆる原核生物又は真核生物が、このような核酸又は核酸コンストラクトの組換え宿主生物として使用できる。使用する宿主生物は、バクテリアや真菌、酵母などの微生物であることが好ましい。グラム陽性又はグラム陰性のバクテリアが好ましく用いられ、好ましくは腸内細菌、シュードモナダセア、リゾビウム、ストレプトミセス又はノカルディア科のバクテリアであり、さらに好ましくは、大腸菌、シュードモナス、ストレプトミセス、ノカルディア、ブルコルデリア、サルモネラ、アグロバクテリウム又はロドコッカス属のバクテリアである。
【００７８】
上記の融合タンパク質の製造プロセスで使用する生物は、当業界の熟練者には公知の方法により、宿主生物に応じて成長あるいは培養される。微生物は、一般に、通常糖類などの炭素源と、通常酵母抽出物などの有機窒素源である窒素源と、硫酸アンモニウムなどの塩類と、鉄、マンガン及びマグネシウム塩などの微量成分、及び必要に応じてビタミン類を含む液体培地中で、０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃の温度で、酸素を供給しながら培養される。栄養液のｐＨを調整して、培養中一定値に維持してもよいし、調整しなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式、又は連続式のいずれで行ってもよい。栄養物は培養の開始時に投入してもよいし、半連続的又は連続的に追加してもよい。これらの酵素は、実施例に記載の方法により、生物から単離してもよいし、粗抽出液として反応に用いてもよい。
【００７９】
本発明において用いられるハイドロフォビン又はそれらの機能的生物的に活性なフラグメントは、遺伝子組み換え法により生産され、具体的には、ポリペプチド産生微生物を培養し、必要ならタンパク質の発現を誘導し、得られたハイドロフォビンを培養物から単離する。これらのタンパク質は、このようにして必要なら工業的な規模で製造できる。組換え微生物の培養や発酵は、既知の方法で行われる。バクテリアは、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中で、２０〜４０℃の温度、６〜９のｐＨで増殖させる。適当な培養条件は、具体的には、例えば、T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。
【００８０】
融合パートナーの存在は、ハイドロフォビンの製造をかなり容易にする。融合ハイドロフォビンは、融合パートナーを持たないハイドロフォビンよりかなり大きな収率で得られる。
【００８１】
これらのタンパク質が培養培地中に分泌されない場合は、細胞を破砕し、この溶解物から既知のタンパク質単離方法により生産品を得る。必要に応じて、細胞破砕を、高周波数超音波、フレンチプレスなどでの加圧、浸透圧、洗剤の作用、溶菌酵素又は有機溶剤、ホモジナイザー、あるいは、これらの方法のいくつかを組み合わせて実施する。
【００８２】
タンパク質の精製は、既知のクロマトグラフ法、例えばＱセファローズクロマトグラフィー等のモレキュラーシーブ・クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィーを、限外濾過、晶出、塩析、透析及び天然ゲル電気泳動などの他の汎用法と組合わせて実施する。好適な方法が、例えば、Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００８３】
固体支持体上の、特に適当なポリマー上に存在する相補的な基に結合する特定のアンカー基を付与すると、融合ハイドロフォビンの単離と精製が容易となりため、特に有益である。このような固体支持体は、例えばクロマトグラフィーカラムの充填物として使用可能であり、このようにして一般に分離効率を大幅に上げることができる。このような分離工程は、アフィニティークロマトグラフィーとしても知られている。アンカー基を導入するため、上記タンパク質の製造において、特定の核酸配列によりｃＤＮＡを延長し、他のタンパク質又は融合タンパク質をコードさせるベクターシステム又はオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。精製を容易にするため、修飾タンパク質は、アンカーとして作用するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーと呼ばれる修飾を有することが好ましい。ヒスチジンアンカーで修飾された融合ハイドロフォビンは、クロマトグラフィーで精製可能で、例えばニッケルセファローズをカラム充填して精製される。この融合ハイドロフォビンは、その後適当な溶離剤、例えばイミダゾール溶液を用いてカラムから溶離される。
【００８４】
簡単な精製工程では、クロマトグラフィーで精製可能である。このためには、適当な方法で、例えばマイクロ濾過又は遠心分離により、まず発酵液から細胞を分離する。次いで、適当な方法、例えば上記の方法により細胞を破砕し、細胞片を封入体から分離する。細胞片は、好ましくは遠心分離で分離する。最後に、封入体を原則として公知の方法で破壊し、融合ハイドロフォビンを放出させる。例えば酸、塩基及び／又は洗浄剤を用いて実施する。本発明において用いられる融合ハイドロフォビンを含む封入体は、一般に、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液に、約１時間で完全に溶解する。この簡便法により得られる融合ハイドロフォビンの純度は、総タンパク質量当たり、一般に６０〜８０重量％である。
【００８５】
この簡便精製工程により得られた溶液は、さらに精製することなく本発明の実施に使用できる。ただし、融合ハイドロフォビンを、この溶液から固体として取り出してもよい。これは、例えば凍結乾燥や噴霧乾燥などの原則として公知の方法で行われる。
【００８６】
本発明のある好ましい実施様態においては、この単離を噴霧乾燥を用いて行う。噴霧乾燥は、クロマトグラフィーで精製後の溶液を用いて行ってもよいが、封入体の調整の際の簡易精製工程後に得られる溶液を使用することが好ましい。
【００８７】
噴霧乾燥を行う前に、必要なら溶液を中和してもよい。ｐＨは７〜９の範囲が、特に有利であった。
【００８８】
一般に出発溶液を少し濃縮することが好ましい。出発溶液中の好ましい固体濃度は、最大３０重量％である。固体含量が５％を超えると一般に、細かな製品粉末を与える。次いで、この溶液を原則として既知の方法で噴霧乾燥できる。好適な噴霧乾燥装置は市販されている。至適噴霧乾燥条件は、装置の種類や所望の収率により異なる。１３０〜１８０℃の供給温度と５０〜８０℃の排出温度が、ハイドロフォビン溶液に対して好適であった。必要に応じて噴霧乾燥の際に、糖類、マンニトール、デキストラン又はマルトデキストリンなどの助剤を用いてもよい。このような助剤のハイドロフォビンに対する量は、０〜３０重量％が好ましく、５〜２０重量％がさらに好ましい。
【００８９】
上述のように作成したハイドロフォビンは、融合タンパク質として直接、あるいは融合パートナーを切断除去した「純」ハイドロフォビンとして使用可能である。
【００９０】
融合パートナーの除去が望ましい場合は、融合タンパク質のハイドロフォビン基と融合パートナー基との間に切断可能な部位（プロテアーゼの特定認識部位）を導入することが望ましい。適当な切断部位は、特にハイドロフォビン基にも融合パートナー中にも存在しないもので、バイオインフォマチック的な手段で容易に特定できるペプチド配列であることが好ましい。特に好適な例としては、メチオニンでのＢｒＣＮ切断、Ｘａ因子切断を伴うプロテアーゼ仲介切断、エンテロキナーゼ切断、トロンビン切断、又はＴＥＶ切断（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）があげられる。
【００９１】
本発明の織布洗浄への利用のためには、この界面活性非酵素タンパク質をまず洗剤組成物成分として用い、これを洗浄液に添加する。しかし、この界面活性非酵素タンパク質は洗浄液に別途添加してもよく、また界面活性非酵素タンパク質を含まない洗剤組成物を用いてもよい。別添加の場合、固体状のタンパク質、溶液状のタンパク質、あるいは適当な調合物状のタンパク質として添加してよい。もちろん、上記二種の添加方法を組合わせてもよい。
【００９２】
洗浄液中の界面活性非酵素タンパク質の含量は、所望の効果に応じて、当業界の熟練者により決定される。好ましい量は、一般に０．０５〜５０ｐｐｍであり、好ましくは０．１〜３０ｐｐｍ、さらに好ましくは０．２〜２０ｐｐｍ、さらに好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、特に好ましくは１〜６ｐｐｍである。
【００９３】
本発明の洗剤組成物は、少なくとも一種の洗浄活性物質及び少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含んでいる。
【００９４】
この少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質は、好ましくは、最初に述べた接触角の変化を引き起こすタンパク質であり、さらに好ましくは少なくとも一種のハイドロフォビンである。もちろん、異なるタンパク質の混合物を用いてもよい。
【００９５】
ハイドロフォビンを使用する場合、これらは、「純」ハイドロフォビンの形であるいは上記の融合タンパク質の形で使用される。本発明を実施するうえで有用なものの例としては、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ型（配列番号２０）の融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ型（配列番号２２）の融合タンパク質、又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ型（配列番号２４）の融合タンパク質があげられる。特に有用な例としては、完全なｙａａｄ融合パートナーを持つｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、又は部分融合パートナーを持つ例えばｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２６）である。
【００９６】
「織布洗浄用の洗剤組成物」とは、文字通りの意味であり、また文字通りの制限を有する。織布洗浄用の洗剤組成物は、例えば、粉末状、粒状、ペレット状、糊状、錠剤状、ゲル又は液体状、通常水溶液（洗浄液）で用いられる。これらの効果は、化学的及び物理化学的過程が複雑にからみ合ったものである。洗剤組成物は、少なくとも一種の洗浄活性物質を含むが、一般的には複数の異なる洗浄活性物質を含み、これらとの相互作用で最適の洗浄効果を発揮する。洗剤組成物中の主な洗浄活性成分としては、特に界面活性剤、ビルダー、コビルダー、漂白剤及び洗剤組成物酵素があげられる。通常の添加物、例えば芳香剤、腐食防止剤、転染防止剤、発泡防止剤、さらに必要に応じて光沢剤を、洗剤組成物の成分として添加してもよい。
【００９７】
この界面活性剤は、アニオン性、ノニオン性、カチオン性、又は両イオン性の界面活性剤のいずれでもよい。
【００９８】
適当なノニオン性界面活性剤の例としては、次のものが挙げられる。
−脂肪族アルコールアルコキシレートやオキソアルコールアルコキシレートなどのアルコシキル化Ｃ8−Ｃ22−アルコール、及びグルベアルコールエトキシレート。ただし、アルコキシル化はエチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドで行われる。ブロックコポリマー又はランダムコポリマーが存在していてもよい。少なくとも一種のアルキレンオキシドの量は、アルコール１モル当たり、２〜５０ｍｏｌ、好ましくは３〜２０ｍｏｌである。好ましいアルキレンオキシドはエチレンオキシドである。これらのアルコールは、好ましくは、１０〜１８個の炭素原子を有している。
−アルキルフェノールアルコキシレート、特にアルキルフェノールエトキシレート（Ｃ6−Ｃ14−アルキル鎖と５〜３０ｍｏｌのアルキレンオキシド／モルを含む）
−アルキルポリグルコシド（Ｃ8−Ｃ22−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルキル鎖及び一般的に１〜２０個の、好ましくは１．１〜５個のグルコシド単位を含む）
−Ｎ−アルキルグルカミド、脂肪酸アミドアルコキシレート、脂肪酸アルカノールアミドアルコキシレート、及びエチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドのブロックコポリマー。
【００９９】
好適なアニオン性界面活性剤は、次の通りである。
【０１００】
−炭素数が８〜２２、好ましくは１０〜１８の（脂肪族）アルコールスルフェート、特にＣ9−Ｃ11−アルコールスルフェート、Ｃ12−Ｃ14−アルコールスルフェート、Ｃ12−Ｃ18−アルコールスルフェート、ラルリルスルフェート、セチルスルフェート、ミリスチルスルフェート、パルミチルスルフェート、ステアリルスルフェート、及び獣脂脂肪族アルコールスルフェート
−アルコシキル化Ｃ8−Ｃ22−アルコールスルフェート（アルキルエーテルスルフェート）：この種の化合物は、例えば、Ｃ8−Ｃ22−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルコールをまず、例えば脂肪族アルコールでアルコキシル化させ、次いでアルコキシル化物を硫酸化する。アルコキシル化には、エチレンオキシドを用いることが好ましい。
−直線状Ｃ8−Ｃ20−アルキルスルホン酸塩（ＬＡＳ）、好ましくは直線状Ｃ9−Ｃ13−アルキルベンゼンスルホン酸塩、及びＣ9−Ｃ13−アルキルトルエンスルホン酸塩
−アルカンスルホン酸塩、特に、Ｃ8−Ｃ24−、好ましくはＣ10−Ｃ18−アルカンスルホン酸塩
−Ｃ8−Ｃ24−カルボン酸のナトリウム及びカリウム塩などの石鹸類
【０１０１】
アニオン性界面活性剤は、洗剤組成物に、好ましくは塩の形で添加される。好適な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩などのアルカリ金属塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩及びトリ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩などのアンモニウム塩があげられる。
【０１０２】
好適なカチオン性界面活性剤としては、次のものが挙げられる。
【０１０３】
−Ｃ7−Ｃ25−アルキルアミン；
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（Ｃ2−Ｃ4−ヒドロキシアルキル）（Ｃ7−Ｃ25−アルキル）アンモニウム塩；
−アルキル化剤で四級化されたモノ−及びジ（Ｃ7−Ｃ25−アルキル）ジメチルアンモニウム化合物；
−エステル四級アンモニウム、特に、Ｃ8−Ｃ22−カルボン酸でエステル化された四級モノ−、ジ−及びトリアルカノールアミン類；
−イミダゾリン四級化合物、特に、式ＩＩ又はＩＩＩの１−アルキルイミダゾリニウム塩。
【０１０４】
【化１】
【０１０５】
なお、式中の変数は次のように定義される。
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ25−アルキル基、又はＣ2−Ｃ25−アルケニル基を表し；
Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、又はヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル基を表し；
Ｒ5は、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、又はＲ1−（ＣＯ）−Ｘ−（ＣＨ2）m−基（Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ｍは２又は３である）を表し、なお、少なくとも一つのＲ3基がＣ7−Ｃ22−アルキル基である。
【０１０６】
好適な両イオン性界面活性剤の例としては、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アミノプロピオネート、アミノグリシネート及び両イオン性イミダゾリウム化合物があげられる。
【０１０７】
洗浄工程において、ビルダー（不均質無機ビルダーＨＩＢともよばれる）は、水の軟化を行う。これらは、そのアルカリ性により洗浄作用を強化し、系内やファイバブリッジ内のカルシウムやマグネシウムイオンを抽出して、洗浄液中での顔料性物質の分散を強化する。
【０１０８】
好適な無機ビルダーとしては、特に次のものである。
【０１０９】
−イオン交換性を有する結晶性及び非晶質アルミノケイ酸塩、特にゼオライト： いろいろな種類のゼオライトが好適であり、特にＡ、Ｘ、Ｂ、Ｐ、ＭＡＰ及びＨＳ型のゼオライトで、Ｎａ型又はＮａの一部がＬｉ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ又はアンモニウムなどの他のカチオンで置換されたものが好ましい。
−結晶性ケイ酸塩、特に二ケイ酸塩及び層状ケイ酸塩、例えばδ−及びβ−Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5。これらのケイ酸塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩の形で使用可能であり、好ましくはナトリウム塩、リチウム塩、及びマグネシウムケイ酸塩である。
−メタケイ酸ナトリウムや非晶質二ケイ酸塩などの非晶質ケイ酸塩
−炭酸塩及び重炭酸塩：これらは、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩の形で使用可能である。好ましくは、ナトリウム、リチウム及びマグネシウムの炭酸塩及び重炭酸塩、特に炭酸ナトリウム及び／又はナトリウムの重炭酸塩
−三リン酸五ナトリウムなどのポリリン酸塩。
【０１１０】
コビルダーは、ビルダーと共同して作用し、例えば貯槽として、カルシウムやマグネシウムイオンをビルダーより高速で吸収し、これをビルダーに引き渡す。また、これらは結晶の種の上に吸着されて起こる結晶成長に抵抗を示す。
【０１１１】
好適な有機コビルダーは、特に次のものである。
【０１１２】
−クエン酸、疎水的に修飾されたクエン酸、例えば、アガリシン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルタール酸、コハク酸、イミドジコハク酸、オキシジコハク酸、プロパントリカルボン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、アルキル−及びアルケニルコハク酸など、及びアミノポリカルボン酸、ｅ．ｇ．ニトリロ三酢酸、ｐ−アラニン二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、セリン二酢酸、イソセリン二酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ酢酸、エチレンジアミンジコハク酸及びメチル−及びエチルグリシン二酢酸などの低分子量カルボン酸類、
−アクリル酸やアスパラギン酸のホモポリマー、オリゴマレイン酸、マレイン酸とアクリル酸、メタクリル酸又はＣ2−Ｃ22−オレフィン（例えば、イソブテン又は長分子鎖α−オレフィン）とのコポリマーなどのオリゴマーやポリマーカルボン酸；ビニルＣ1−Ｃ8−アルキルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、Ｃ4−Ｃ8−アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、及びスチレン。好ましくは、アクリル酸のホモポリマー、及びアクリル酸とマレイン酸のコポリマーである。オリゴマーやポリマーカルボン酸は、酸の形あるいはナトリウム塩の形で使用される。
【０１１３】
好適な漂白剤の例としては、無機塩類への過酸化水素の付加物、例えば過ホウ酸ナトリウム・一水和物、過ホウ酸ナトリウム・四水和物、及び炭酸ナトリウム過水和物、及びフタルイミド過酸化カプロン酸などの過カルボン酸があげられる。
【０１１４】
好適な漂白活性剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ｐ−ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム及びＮ−メチルモルホリノアセトニトリルメチル硫酸があげられる。
【０１１５】
洗剤組成物において好ましく用いられる酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及びパーオキシダーゼがあげられる。
【０１１６】
好適な転染防止剤としては、１−ビニルピロリドン、１−ビニルイミダゾール、４−ビニルピリジン−Ｎ−オキシドのホモポリマー、コポリマー及びグラフトポリマー、及び４−ビニルピリジンのホモポリマー及びコポリマーでクロロ酢酸と反応させたものがあげられる。
【０１１７】
使用する成分の種類と量は、洗剤組成物の用途に応じて当業界の熟練者により決定される。例えば、漂白剤は、通常重質の洗剤組成物には使用されるが、軽質の洗剤組成物には使用されない。洗剤組成物の組成や成分のさらなる詳細については、例えば、“Waschmittel” ［洗浄組成物］ in Rompp Chemie-Lexikon, Online edition, Version 2.6, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, Febr. 2005, or in “Detergents” in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Edt., 2000, Electronic Release, Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2000に記載されている。
【０１１８】
本発明を実施するうえ好ましい界面活性剤は、アニオン性界面活性剤及び／又はノニオン性界面活性剤である。
【０１１９】
本発明において用いられる界面活性非酵素タンパク質、特にハイドロフォビンは、直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートと、アルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせとともに使用される。
【０１２０】
Ｃ8−Ｃ18−アルコール及び／又はそれらのアルコキシル化物由来のアニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤を、必要に応じて他の界面活性剤と混合して使用することが特に好ましい。これらのアルコキシ基は、エチレンオキシド単位及び／又はプロピレンオキシド単位、好ましくはエチレンオキシド単位を含む基が好ましい。これらは、例えば１〜２５個のエチレンオキシド単位、好ましくは３〜２０個の及びさらに好ましくは５〜１５個の単位を持つ基、又はエチレンオキシドとプロピレンオキシド単位を含む基であり、この場合、後者は、いずれの場合も、全アルコキシ単位の総数に対して少なくとも５０ｍｏｌ％、好ましくは６０ｍｏｌ％のエチレンオキシド単位を有す必要がある。
【０１２１】
好ましい界面活性剤の例としては、脂肪族アルコールアルコキシレートなどのアルコシキル化Ｃ8−Ｃ18−アルコール、オキソアルコールアルコキシレート、グルベアルコールアルコキシレート、Ｃ8−Ｃ18−アルコールスルフェート、硫酸化アルコシキル化Ｃ8−Ｃ18−アルコール（アルキルエーテルスルフェート）、又は直線状Ｃ8−Ｃ18−アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、好ましくは直線状Ｃ9−Ｃ13−アルキルベンゼンスルホン酸及びＣ9−Ｃ13−アルキルトルエンスルホン酸塩があげられる。
【０１２２】
特に好ましいのは、２−プロピルヘプタノール及びトリデカノールのアルコキシル化物、及びそれらの硫酸化物である。
【０１２３】
洗剤組成物中の界面活性非酵素タンパク質の量は、洗剤組成物の目標性能をもとに当業界の熟練者により決定される。この場合、この量は、好ましくは、指示どおりに洗剤組成物を添加する際に、上記濃度の界面活性非酵素タンパク質が得られるように選定される。
【０１２４】
洗剤組成物の全成分の総量当たりの界面活性非酵素タンパク質含量は、０．００２〜２．５重量％が好適であった。この量は、好ましくは０．０１〜１．５重量％であり、さらに好ましくは０．０２５〜１．０重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．５重量％、特に好ましくは０．１〜０．３重量％である。
【０１２５】
ある好ましい実施様態においては、本発明の洗剤組成物は、０．０１〜１．５重量％の界面活性非酵素タンパク質と、０．５〜４０重量％の界面活性剤、好ましくはアニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と、５９〜９９．４５重量％の他の洗浄活性添加物又は配合助剤とを含んでいる。
【０１２６】
使用する成分（ｃ）は、好ましくは、リパーゼ及び／又は両親媒性ポリマー、例えばエチレンオキシド−プロピレンオキシドブロックコポリマーである。
【０１２７】
本発明の洗剤組成物は、原則として当業界の熟練者には公知である方法で製造可能である。洗剤組成物の製造工程の詳細は、例えば、上記の“Rompp Chemie-Lexikon”又は“Ullmann’s”を参照されたい。
【０１２８】
洗剤組成物を製造するに当たり、本界面活性非酵素タンパク質を溶液で使用しても固体で使用してもよい。固体のタンパク質は、タンパク質の溶液から出発して当業界の熟練者には公知である方法により、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥により得られる。
【０１２９】
洗剤組成物の生産に当たり、界面活性非酵素タンパク質にかかる熱的ストレスが問題とならないように注意すべきである。その限度は、もちろんタンパク質の種類により変動する。ハイドロフォビンを使用する場合、製品温度が１２０℃を超えないようにすることが有益であった。処理温度、例えば、スプレードライヤー中のガス流の温度は、もちろん製品温度が限界値を超えないかぎり、これより高くてもよい。
【０１３０】
洗剤組成物に各主成分を穏やかに添加する方法は、当業界の熟練者には公知である。粉末状の洗剤組成物は、例えば、第一工程で洗剤組成物中の熱的に安定な成分の水スラリーから噴霧乾燥により粗製品を作り、第二の工程でこの粗製品と熱的感受性の高い成分とを穏やかな条件で混合することにより製造可能である。一般的には、本発明において用いられる界面活性非酵素タンパク質を、この第二の工程で投入することが好ましいが、特に本発明がこれに限定されるわけではない。
【０１３１】
本発明の織布材料の洗浄方法は、少なくとも、洗浄すべき織布材料と水洗浄液とを洗浄装置に入れ、織布材料と洗浄液からなる混合物に機械的なエネルギーを加え、水洗浄液を除去し、必要に応じて織布材料を洗浄して、織布材料を乾燥させる工程を含んでいる。
【０１３２】
使用する洗浄装置は、いかなる洗浄機であってもよい。しかし、この用語「洗浄機」は、通常手洗いで用いる容器、例えばたらいや洗面器をも含んでいる。工程（ａ）では、洗浄装置にまず織布と水洗浄液を満たすが、その順序は重要でない。
【０１３３】
洗浄液は、一般に公知のように、少なくとも一種の洗浄活性物質を含んでいる。本発明によれば、水洗浄液は少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含有している。好ましいタンパク質は上述のとおりである。この界面活性非酵素タンパク質を洗剤組成物に添加してもよいが、別途添加してもよい。洗浄サイクルの初めに添加することが好ましいが、もちろん後で添加してもよい。
【０１３４】
工程段階（ｂ）の洗浄操作は、既知の方法で、織布材料と洗浄液の混合物に機械的なエネルギーを作用させて行う。機械的なエネルギーは、洗浄機により、例えば回転ドラムによりかけるが、手洗いの場合は、手及び／又は他の補助手段によりかけられる。
【０１３５】
洗浄操作中の温度は、状況に応じて当業界の熟練者により決定される。例えば、この温度が、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、あるいは１００℃であってもよい。本発明のいくつかの特長は、洗浄温度が温和か低い場合に特にはっきり出現する。本発明のある好ましい実施様態においては、洗浄操作が、６０℃以下の温度で、特に５０℃以下の温度で実施される。本発明の洗浄工程を実施するのに特に好ましい温度範囲は、５〜４５℃で、さらに特に好ましいのは１５〜３５℃で、さらに好ましくは２０〜３０℃である。
洗浄操作中の界面活性非酵素タンパク質の濃度は、当業界の熟練者により選択される。好ましい濃度範囲は、上に述べたとおりである。
【０１３６】
本発明の洗剤組成物を通して添加する場合、その濃度は、通常、洗浄液に対して、０．０５〜２５ｇ／ｌ、好ましくは０．２５〜１５ｇ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜６ｇ／ｌ、特に好ましくは１．５〜４ｇ／ｌである。
【０１３７】
実際の洗浄操作の後、洗浄液は原則として既知の方法で除かれる。通常、織布材料は続いて、一回以上水洗され、最後に乾燥させられる（工程段階（ｄ）と（ｅ））。水洗の間に、織物柔軟剤を添加物として使用してもよい。
【０１３８】
本発明の方法は、あらゆる種類の織布材料の洗浄に適している。これらは、織布ファイバや半加工織物や加工織物、及びこれらからなる加工後の衣料品であってもよい。これらは、通常の衣料用織物、カーペット、カーテン、テーブルクロスなどの家庭用織物、及び工業用の織布であってもよい。また、フリースなとの不定形構造、撚糸、糸、ヤーン、ライン、ストリング、レース、ニット、コードなどの直線状構造、フェルト、織布、不織布及び詰め綿などの三次元構造であってもよい。織布材料は、綿、羊毛又は亜麻などの天然由来の材料、あるいはポリアクリロニトリル、ポリアミド又はポリエステルなどの合成材料からなっていてもよい。もちろん、混紡織物、例えば綿／ポリエステル又は綿／ポリアミド混紡の織物であってもよい。
【０１３９】
以下、本発明を実施例を参照しながら説明する。
【０１４０】
第Ａ部：
本発明において用いられるハイドロフォビンの調整と試験
【０１４１】
実施例１
ｙａａｄ−Ｈｉｓ6／ｙａａＥ−Ｈｉｓ6のクローニングの準備
オリゴヌクレオチドのＨａｌ５７０とＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、バクテリアである枯草菌のゲノムＤＮＡである。得られたＰＣＲフラグメントは、枯草菌ｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子のコード配列を含み、またＮｃｏｌ及びＢｇＩＩＩ制限酵素切断部位をそれぞれ末端に持っていた。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、制限酵素のＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで前もって直線化させたキアゲン社のベクターｐＱＥ６０にクローニングした。このようにして得られたベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２とｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５は、ＹＡＡＤ：：Ｈｉｓ6又はＹＡＡＥ：：Ｈｉｓ6からなるタンパク質の発現に使用できる。
【０１４２】
Ｈａｌ５７０：ｇｃｇｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔｃａａａｃａｇｇｔａｃｔｇａ
Ｈａｌ５７１：ｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｔａｃ
Ｈａｌ５７２：ｇｇｃｃａｔｇｇｇａｔｔａａｃａａｔａｇｇｔｇｔａｃｔａｇｇ
Ｈａｌ５７３：ｇｃａｇａｔｃｔｔａｃａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｃｃ
【０１４３】
実施例２
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１６とＫａＭ４１７を用いてポリメラーゼ連鎖反応をおこなった。使用したテンプレートＤＮＡは、カビの偽巣性コウジ菌のゲノムＤＮＡである。得られたＰＣＲフラグメントは、ハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡのコード配列とＮ−端末Ｘａ因子プロテイナーゼ切断部位とからなっていた。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、前もって制限酵素ＢｇＩＩＩで直線化させた前記ベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２にクローニングした。
【０１４４】
このようにして得られたベクター＃５０８は、ＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：Ｈｉｓ6からなる融合タンパク質の発現に使用できる。
【０１４５】
ＫａＭ４１６：ＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＣ
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
【０１４６】
実施例３
ｙａａｄハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４３４とＫａＭ４３５を用いて、プラスミド＃５１３を、同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
【０１４７】
ＫａＭ４３４：ＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４３５：ＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ
【０１４８】
実施例４
ｙａａｄハイドロフォビンＨｙｐＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
ｐＱＥ６０中のＨｙｐＡ（＃５２２）のクローニング
【０１４９】
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４４９とＫａＭ４５０を用いてＰＣＲを行った。使用したテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のプラスミドｐＣＲ２．１中のＨｙｐＡであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＡ遺伝子のコード配列を含むが、開始コドン及び停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＮｃｏｌとＢｇＩＩＩとで直線化されたベクターｐＱＥ６０に連結した。
【０１５０】
ＫａＭ４４９：ＧＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴ
ＫａＭ４５０：ＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
ｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤ中のＨｙｐＡ（＃５２３）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５１とＫａＭ４５２を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐＣＲ２．１のプラスミドＨｙｐＡであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＡ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＢｇＩＩＩとＢａｍＨｌで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤに連結した。
【０１５３】
ＫａＭ４５１：ＣＧＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４５２：ＣＧＡＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
実施例５
ｙａａｄハイドロフォビンＨｙｐＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
【０１５６】
ｐＱＥ６０中のＨｙｐＢ（＃５２４）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５３とＫａＭ４５４を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐｕＣ１９中のプラスミドＨｙｐＢであった。得られたフラグメントは、ハイドロフォビンＨｙｐＢ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＮｃｏｌとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＮｃｏｌとＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０に連結した。
【０１５７】
ＫａＭ４５３：ＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧ
ＫａＭ４５４：ＧＣＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣ
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
ｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤ中のＨｙｐＢ（＃５２５）のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４５５とＫａＭ４５６を用いてＰＣＲを行った。用いたテンプレートＤＮＡは、Ｎａｄｉｃｏｍ社のｐｕＣ１９中のプラスミドＨｙｐＢであった。得られたフラグメントはハイドロフォビンＨｙｐＢ遺伝子コード配列を持っていたが、開始コドンと停止コドンは持っていなかった。このＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動で精製し、制限酵素のＢｇＩＩＩとＢａｍＨＩで切断した。このフラグメントをインサートとして用い、前もってＢｇＩＩＩで直線化されたベクターｐＱＥ６０＋ＹＡＡＤに連結した。
【０１６０】
ＫａＭ４５５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣ
ＫａＭ４５６：ＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣ
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
実施例６
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いて、プラスミド＃５０７を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
用いたテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列−ハイドロフォビンＢＡＳＦ１であった（付録参照）。
【０１６３】
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１６４】
実施例７
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いて、プラスミド＃５０６を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
用いたテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列−ハイドロフォビンＢＡＳＦ２であった（付録参照）。
【０１６５】
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１６６】
実施例８
ｙａａｄハイドロフォビンＳＣ３ −Ｈｉｓ6のクローニング
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４６４とＫａＭ４６５を用いて、プラスミド＃５２６を同様にプラスミド＃５０８にクローニングした。
【０１６７】
用いたテンプレートＤＮＡは、シゾフィラム・コミューンのｃＤＮＡであった（付録参照）。
【０１６８】
ＫａＭ４６４：ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＫａＭ４６５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ
【０１６９】
実施例９
組換え大腸菌菌株ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6の発酵
１５ｍｌのグライナーチューブ中の３ ｍｌのＬＢ液体培地に、ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6を発現する大腸菌株を接種する。３７°Ｃで８時間、シェーカー上で２００ｒｐｍで培養する。いずれの場合も、２個のじゃま板付の１ｌエルレンマイアーフラスコ中の２５０ ｍｌのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に、１ｍｌの前記前培養物を接種し、シェーカー上で１８０ｒｐｍで振盪しながら、３７°Ｃで７時間培養する。２０ｌの培養槽中の１３．５ｌのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に、０．５ｌの前培養物（ＯＤ600nm １：１０、Ｈ2Ｏを対象に測定）を接種する。ＯＤ600nmが約３．５となる時、１４０ｍｌの１００ｍＭのＩＰＴＧを添加する。３時間後、培養槽を冷却して１０℃とし、発酵液を遠心分離する。さらに精製するには、セルペレットを使用する。
【０１７０】
実施例１０
組換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製（Ｃ−端末にＨｉｓ6タグを持つハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
１００ｇの細胞ペレット（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン）を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で総体積２００ｍｌとし、再懸濁させる。この懸濁液を、ウルトラタラックスＴ２５型（ヤンケアンドクンケル社；ＩＫＡ−ラボテクニック）に１０分間かけ、続いて５００単位のベンゾナーゼ（メルク社、ドイツ；注文番号１．０１６９７．０００１）とともに、室温で１時間培養して、核酸を分解させる。細胞破砕に先立ち、ガラスカートリッジ（Ｐ１）で濾過する。細胞破砕と残存ゲノムＤＮＡの切断のため、二回ホモジナイザーサイクルに１５００ｂａｒでかける（マイクロフルイダイザーＭ−１１０ＥＨ；マイクロフルイディックス社）。このホモジネートを遠心分離し（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡ回転子、２５０ｍｌ遠心器カップ、６０分間、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）、上澄液を氷冷し、ペレットを１００ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。遠心分離と再懸濁とを三回繰返し、繰返し三度目には、１％のＳＤＳを含むリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。再懸濁後、混合物を１時間攪拌し、最後の遠心分離にかけた（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡ回転子、２５０ ｍｌ遠心器カップ、６０分、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、最後の遠心分離後の上澄液中にハイドロフォビンが認められる（図１）。この試験により、ハイドロフォビンが、相当する大腸菌細胞中に封入体の形で存在しているようであることがわかる。５０ｍｌのハイドロフォビン含有上澄液を、５０ｍｌの前もって５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させておいたニッケルセファローズ高性能１７−５２６８−０２カラム（アマシャム社）にかける。このカラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、ついでハイドロフォビンを、２００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶離させる。イミダゾールを除くため、溶液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析する。
【０１７１】
図１は、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
レーン１：ニッケル−セファローズカラム（１：１０希釈）
レーン２：流出＝洗浄工程での溶離
レーン３〜５：溶離フラクションのＯＤ２８０最大値
【０１７２】
図１のハイドロフォビンの分子量は約５３ｋＤである。小さなバンドのいくつかは、ハイドロフォビンの分解生成物である。
【０１７３】
実施例１１
性能試験；ガラス上の水滴の接触角の変化によるハイドロフォビンの評価
基板：
ガラス（窓ガラス、スードドイチェグラス社、ドイツ）
【０１７４】
実施例１０の融合ハイドロフォビンを用いた。
ハイドロフォビン濃度：１００μｇ／ｍｌの水溶液； 添加物：５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）＋０．１％ポリオキシエチレン（２０）−モノラウリン酸ソルビタン（ツイーン（Ｒ）２０）．
−ガラス板を一夜保温（温度８０℃）、次いで、塗膜を蒸留水中で洗浄。
−次いで、１０ ｍｉｎ／８０℃／１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の蒸留水溶液中で保温。
−蒸留水中で洗浄
【０１７５】
サンプルを風乾し、５μｌの水液滴の接触角（°）を室温で測定する。
【０１７６】
接触角は、データフィジックス社のＯＣＡ１５＋接触角システム、ソフトウェアＳＣＡ２０．２．０．（２００２年１１月）を用いて測定した。測定はメーカの説明書に応じて行った。
【０１７７】
非処理ガラスでは、接触角が３０±５°であり、機能性の実施例８のハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）を塗布したものの接触角は７５±５°であった。
【０１７８】
第Ｂ部：
界面活性非酵素タンパク質の織布洗浄への利用
試験の概要：
活性の試験のために、市販の試験装置（ランデロメーター、アトラス社、米国）を用いて洗浄試験を行った。試験はいずれも、洗浄液に上記のタンパク質の存否の両方でおこなった。
【０１７９】
試験には、市販の試験布と自家製の試験布を用いた。
【０１８０】
【表５】
【０１８１】
洗浄試験の実施：
上記の試験布より３０×３０ｍｍの試料を切り出し、非染色の漂白綿編布に縫い付けた。
【０１８２】
市販の試験布の場合、いずれの場合も、２枚の試験片（５０ｍｍ×２００ｍｍ）を、いずれも４枚の異なる縫合試験布（試験布１〜４）又は、いずれも２枚の異なる縫合試験布（試験布５及び６）を５ｇの白色綿／ポリエステル混紡布とともに、特定の条件下で洗浄した。
【０１８３】
自家製の試験布の場合、０．１ｇの着色油脂又は着色油を綿布片（５０ｍｍ×２００ｍｍ非染色漂白綿編布）に二滴たらし、５０℃で３０分間処理した。スダンレッドを着色に用いた。
【０１８４】
洗浄後、布を２５０ｍｌの水道水で５分間洗浄し、乾燥した。
【０１８５】
洗浄効果は、水洗前後の反射率（４２０ｎｍ）を測定して評価した。
【０１８６】
いずれの場合も、一つの試験は界面活性非酵素タンパク質を添加して行い、もう一試験は、同様な条件、つまりタンパク質が無添加である以外はまったく同一の条件で実施した。
【０１８７】
結果の表中のパーセント比率は、タンパク質を添加した試験では、タンパク質無添加の試験に比べ洗浄効果が増加していることを示している。なお、この比率は次式で計算される。
【０１８８】
洗浄効果の増加率［％］＝（ＩE−ＩOE）／（Ｉwhite−ＩA）×１００
【０１８９】
ＩEは、いずれの場合も、試験洗浄後の試験布の反射率を示し、ＩAは、試験洗浄実施前の反射率である。０は、本発明でタンパク質が無添加の比較試験をさす。Ｉwhiteは、汚れのないきれいな布の反射率を示す。
【０１９０】
汚れの再付着を、いずれの場合も試験タンパク質の添加の有無の両試験で、汚れのないきれいな布の洗浄前後の反射率を比較して評価した。
【０１９１】
実施例１２：
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質濃度： 表１参照
洗剤組成物 市販の粉状洗剤組成物（ホワイトキャット、中国、２００３）
洗浄液の量 一缶当たり２５０ ｍｌ
洗浄組成物の量 ２．０ｇ／ｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９２】
タンパク質を希釈し水溶液として添加した。上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表１にまとめて表示する。
【０１９３】
実施例１３：
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質濃度： 表１参照
洗剤組成物 市販の粉末状の洗浄組成物（アリエール、中国、２００４、プロクタ
ーアンドギャンブル社）
洗浄液の量 一缶２５０ｍｌ
洗浄組成部の量 ２．０ｇ／ｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝ ３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９４】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表１にまとめて表示する。
【０１９５】
【表６】
【０１９６】
すべての試験で、大幅な洗浄効果の増強が見られた。
【０１９７】
実施例１４：
以下の試験洗浄では、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、及びビルダーを含む、洗剤組成物用の基本製剤を使用した。
試験の変数：
使用のタンパク質 ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：２６）
タンパク質濃度： 表２参照
アニオン性界面活性剤 ４００ｐｐｍのＣ12/14−脂肪族アルコール硫酸ナトリウム
ノニオン性共界面活性剤 いずれの場合も、３０ｐｐｍのＣ13/15−オキソアルコールエ
トキシラート、アルコキシラート基の種類については表２を参
照
ビルダー ２５０ｐｐｍの炭酸ナトリウム
洗浄液量 一缶２５０ｍｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ （Ｃａ：Ｍｇモル比＝ ３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０１９８】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表２にまとめて表示する。
【０１９９】
【表７】
【０２００】
実施例１５：
以下の試験洗浄では、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、及びビルダーを含む、洗剤組成物用の基本製剤を使用した。
試験の変数：
使用のタンパク質 タンパク質Ａ：
ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗ
Ａ−ｈｉｓ（配列番号：１９）
タンパク質Ｂ：
ハイドロフォビン融合タンパク質ｙａａｄ４０−Ｘａ−ｄｅｗ Ａ−ｈｉｓ（配列番号：２６）
タンパク質濃度： 表３参照
アニオン性界面活性剤 ４００ｐｐｍのＮ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
共界面活性剤 いずれの場合も、３０ｐｐｍ、種類は表３参照
ビルダー ２５０ｐｐｍの炭酸ナトリウム
洗浄液量 一缶２５０ｍｌ
液比 ２０：１
水硬度 ２．５ｍｍｏｌ／ｌ（Ｃａ：Ｍｇモル比＝３：１）
洗浄温度 ２５℃
洗浄時間 ３０分間
【０２０１】
上記の試験概要にしたがって試験洗浄を実施し、評価した。その結果を表３にまとめて表示する。
【０２０２】
【表８】
【０２０３】
すべての試験で、大幅な洗浄効果の増強が見られた。いずれの場合も、部分ｙａａｄ融合パートナー（Ｂ）（４０アミノ酸）を有する融合ハイドロフォビンは、完全なｙａａｄ融合パートナー（Ａ）（２９４アミノ酸）を有する融合ハイドロフォビンより良好な結果を与えた。
【０２０４】
配列表中のＤＮＡ及びポリペプチド配列と配列番号の相関
【０２０５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性非酵素タンパク質の織布洗浄への利用方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項１に記載の利用方法。
【請求項３】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項２に記載の利用方法。
【請求項４】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸を含む請求項３に記載の利用方法。
【請求項５】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸を有する部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項３に記載の利用方法。
【請求項６】
前記タンパク質の洗浄液中の使用濃度が、０．０５〜５０ｐｐｍである請求項１〜５のいずれか１項に記載の利用方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と組合わせて使用され、これらの界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の利用方法。
【請求項８】
少なくとも一種の洗浄活性物質を含み、該洗剤組成物がさらに少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含むことを特徴とする織布洗浄用の洗剤組成物。
【請求項９】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項９に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸からなる請求項１０に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸からなる部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項１１に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記界面活性非酵素タンパク質の量が、洗剤組成物の全成分に対して０．００２〜２．５重量％である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
（ａ）０．０１〜１．５重量％の界面活性非酵素タンパク質と、
（ｂ）０．５〜４０重量％の界面活性剤と、
（ｃ）５９〜９９．４５重量％の他の洗浄活性添加物又は配合助剤とを含む
請求項１３に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤である請求項１４に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
前記の界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１５に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
少なくとも以下の
（ａ）洗浄装置に洗浄すべき織布材料と水洗浄液とを満たす工程と、
（ｂ）織布材料と洗浄液との混合物に機械的なエネルギーをかける工程と、
（ｃ）水洗浄液を除き、必要に応じて織布材料を水洗する工程と、及び
（ｄ）その織布材料を乾燥する工程とを含む
（ただし、水洗浄液は少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含む）
ことを特徴とする織布材料の洗浄方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸からなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸からなる部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と組合わせて使用され、これらの界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄操作が６０℃以下の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄操作が５〜４５℃の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄操作が１５〜３５℃の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質の洗浄液中の使用濃度が、０．０５〜５０ｐｐｍである請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
界面活性非酵素タンパク質の織布洗浄への利用方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項１に記載の利用方法。
【請求項３】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項２に記載の利用方法。
【請求項４】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸を含む請求項３に記載の利用方法。
【請求項５】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸を有する部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項３に記載の利用方法。
【請求項６】
前記タンパク質の洗浄液中の使用濃度が、０．０５〜５０ｐｐｍである請求項１〜５のいずれか１項に記載の利用方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と組合わせて使用され、これらの界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の利用方法。
【請求項８】
少なくとも一種の洗浄活性物質を含み、該洗剤組成物がさらに少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含むことを特徴とする織布洗浄用の洗剤組成物。
【請求項９】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項９に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸からなる請求項１０に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸からなる部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項１１に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記界面活性非酵素タンパク質の量が、洗剤組成物の全成分に対して０．００２〜２．５重量％である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
（ａ）０．０１〜１．５重量％の界面活性非酵素タンパク質と、
（ｂ）０．５〜４０重量％の界面活性剤と、
（ｃ）５９〜９９．４５重量％の他の洗浄活性添加物又は配合助剤とを含む
請求項１３に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤である請求項１４に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
前記の界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１５に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
少なくとも以下の
（ａ）洗浄装置に洗浄すべき織布材料と水洗浄液とを満たす工程と、
（ｂ）織布材料と洗浄液との混合物に機械的なエネルギーをかける工程と、
（ｃ）水洗浄液を除き、必要に応じて織布材料を水洗する工程と、及び
（ｄ）その織布材料を乾燥する工程とを含む
（ただし、水洗浄液は少なくとも一種の界面活性非酵素タンパク質を含む）
ことを特徴とする織布材料の洗浄方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、ガラス表面に室温で塗布すると、その上に落とした水滴の接触角が、非塗布ガラス表面における同体積の水滴の接触角に比べ、少なくとも２０°増加することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質がハイドロフォビンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が融合ハイドロフォビンであり、その融合パートナーが２０〜５００個のアミノ酸からなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハイドロフォビンが、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）又はｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも一種である（ただし、ｙａａｄは、いずれの場合も、２０〜２９３個のアミノ酸からなる部分ｙａａｄ融合パートナーであってもよい）請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、アニオン性及び／又はノニオン性界面活性剤と組合わせて使用され、これらの界面活性剤が直線状アルキルベンゼンスルホン酸又は脂肪族アルコールスルフェートとアルキルエーテルスルフェート又はアルキルアルコキシレートとの組み合わせを含む請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄操作が６０℃以下の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄操作が５〜４５℃の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄操作が１５〜３５℃の温度で行われる請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質の洗浄液中の使用濃度が、０．０５〜５０ｐｐｍである請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５０３２８０（Ｐ２００９−５０３２８０Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４４９０（Ｐ２００８−５２４４９０）
【出願日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６４７２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４８９７
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６４７２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４８９７
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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