異種染色体添加４倍体植物とその細胞及びその子孫植物
【課題】
本発明は、ネギ属植物の種間交雑を用いた異種染色体添加技術において、シャロット由来の染色体が添加され雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供することを目的とする
【解決手段】
上記課題の解決のため、本発明は、シャロットの特定の染色体（第１、第２染色体）が添加され、強い雄性不稔形質を有する異種染色体添加４倍体植物を提供する。
本発明は、ネギ属植物の種間交雑を用いた異種染色体添加技術において、シャロット由来の染色体が添加され雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供することを目的とする
【解決手段】
上記課題の解決のため、本発明は、シャロットの特定の染色体（第１、第２染色体）が添加され、強い雄性不稔形質を有する異種染色体添加４倍体植物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用植物の育種分野において、品種改良の際に必要不可欠な雄性不稔形質の付与方法に関し、より詳しくは、シャロットの第１または第２染色体が添加され、雄性不稔形質を有した異種染色体添加４倍体植物とその細胞及びその子孫植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
作物など有用植物において、ある株と別の株との交配によって改良品種（Ｆ１）を得る手法は、Ｆ１が親品種を上回る収量や耐病性を示したり、両親の持つ良い形質をともに受け継いだりすることが知られ、古くから農業分野において利用されてきた。交配による品種の作出において非常に重要な点は、交配の際、自分の花粉で自分の胚珠が受粉する「自家受粉」を避け、確実に別株からの花粉を受粉することであり、その最も効率的かつ計画的な手法としては、親株の片方に雄性不稔（自身の花粉が主因で自家受粉による種子を形成しない）の形質を付与するという手法が用いられている。雄性不稔形質の導入方法としては、自然突然変異により生まれながらにして雄性不稔形質を持った株を利用する方法や、遺伝子組み換えを含む外来遺伝子の導入、薬品処理などによって人工的に雄性不稔形質を付与する方法、などがこれまでに提案されている（特許文献１−３）。
【０００３】
また、近年、ネギ属植物における細胞質雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ：ＣＭＳ）の解析から、アリウム・ガランサム（Ａｌｌｉｕｍ ｇａｌａｎｔｈｕｍ）の細胞質を有した雄性不稔のネギが作出されたり、雄性不稔に関する遺伝子の解析が進められてその一部が明らかになりつつある（非特許文献１−４）。
しかしながら、従来の技術は、雄性不稔形質に関与する個別の遺伝因子を明らかにしてこれを利用したり、薬品処理などで人工的に雄性不稔を誘導するというものであり、通常の育種現場で適用可能なものでは無かった。食用・園芸用植物として極めて重要な位置にあるネギ属植物の育種分野において、通常の交配と顕微鏡観察等によって利用可能な、染色体レベルで雄性不稔形質を付与する技術の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００６−０４２７３０号公報 単子葉植物の雄性不稔体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【特許文献２】特開平０５−３０１８０７号公報 ユリ綱植物において雄性不稔を誘発する方法
【特許文献３】特表平１１−５１２２９０号公報 Ｐｏｌｉｍａ ＣＭＳ細胞質を有し、高温及び低温において雄性不稔性である細胞質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物
【特許文献４】特許第２６５６３１１号公報 雄性不稔誘発剤及びそれを用いた雄性不稔誘発方法ならびにＦ▲下１▼採種法
【非特許文献１】Ｈａｖｅｙ Ｍ．Ｊ．１９９９．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１２４（６）：６２６−６２９．
【非特許文献２】Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｃｅｌｌｕ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７（２Ｂ）：６２５−６３４．
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００５．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１１：１５−２２．
【非特許文献４】Ｓｏｎｇ，Ｌ．−Ｑ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１３（１）：５５−６２．
【非特許文献５】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７１：３６３−３７１．
【非特許文献６】Ａｄａｎｉｙａ Ｓ．＆ Ｔａｍａｋｉ Ｓ．１９９１．Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６０：１０５−１１２．
【非特許文献７】Ａｄａｎｉｙａ Ｓ．＆ Ａｒｄｉａｎ ．１９９３．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ７９：５−１２．
【非特許文献８】執行ら ２０００．園芸学会誌６９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明は、ネギ属植物の種間交雑を用いた異種染色体添加技術において、シャロット由来の染色体が添加され雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物とその細胞及びその子孫植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）をレシピエント（異種染色体が添加される植物）とし、種間交雑によってシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加するという異種染色体添加技術を独自に開発し、これまでにシャロットの各染色体を１本だけ持つ単一異種染色体添加２倍体ネギ系統の作出に成功している（非特許文献５）。
これら単一異種染色体添加系統はシャロットの持つ様々な有用形質を発現するなど、食用作物の品種改良法に新たな里程を築くものであるが、本発明者らは更に、添加された異種染色体の次世代への伝達のため、これら単一異種染色体添加２倍体ネギ系統の染色体倍加により４倍体系統の作出にも成功した。この異種染色体添加４倍体系統の作出過程において、本発明者らは、シャロットの特定の染色体が極めて強い雄性不稔形質をレシピエントであるネギに付与するという事実を見いだし、これを育種分野に適用すべく種々の解析を進めて、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、請求項１記載の発明では、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を１対、及び／または第２染色体を１対有し、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においては、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントに対して発揮するように作用する。
【０００７】
請求項２記載の発明では、レシピエントがユリ科ネギ属植物である、請求項１に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様、シャロットの特定の染色体が強い雄性不稔形質をレシピエントであるユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【０００８】
請求項３記載の発明では、レシピエントがネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれか１種類より選択される、請求項２記載に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントであるネギやニンニクなどのユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【０００９】
請求項４記載の発明では、レシピエントが花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれか１種類より選択される、請求項２記載に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントである花ネギやコワニーなどのユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【００１０】
請求項５記載の発明では、請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の植物から単離された、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物細胞においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【００１１】
請求項６記載の発明では、請求項５に記載の植物細胞を培養して得られる、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【００１２】
請求項７記載の発明では、請求項１から請求項４のうちいずれか１項または請求項６に記載の異種染色体添加４倍体植物を種子親として得られる、子孫植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物の子孫植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の提供するシャロット由来の染色体を添加された植物を利用することにより、ネギ属植物の改良品種に対して雄性不稔形質を染色体レベルという安定かつ確実なレベルで付与することが可能となる。この事はまた、添加された異種染色体が母系（雌性配偶子）を通じて後代に確実に伝達されることも示しており、これは交配育種分野においては極めて重要な形質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明の第１の実施の形態は、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体または第２染色体が添加され、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
本発明者らはこれまでに、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）にシャロット由来の染色体１本を添加した「単一異種染色体添加ネギ系統」の作出に成功している。そして、第１染色体を導入したネギがさび病抵抗性を示すことも明らかにしている（非特許文献８）。
これらの系統について異種染色体の後代への伝達能を付与するため、染色体の倍加によって４倍体植物を作出し、この植物の性状を解析する中で、第１染色体または第２染色体を添加した系統に非常に強い雄性不稔形質が付与されている事を見いだし、本発明を完成した。ネギ属植物の雄性不稔についてはこれまで、ミトコンドリア遺伝子の関与や他の遺伝子の関与などが明らかにされつつあるが、これらはあくまで個別の遺伝子であって、例えばこれを利用して対象とする作物に雄性不稔形質を付与しようとする場合には遺伝子組み換えなどの操作が必要という問題点があった。
それに比し本実施の形態に係る異種染色体添加４倍体植物では、通常の掛け合わせ技術を基に染色体レベルで雄性不稔形質を付与することが可能であり、作物の育種分野においては遺伝子操作など複雑で高度な操作を要さない点、遺伝子組み換え技術を用いないため新品種に対する社会的な抵抗感を心配しなくても良い点が優れている。
下記実施例に示す通り、異種染色体の添加方法は異種同士の掛け合わせ（Ｆ×Ａ）で生じた雑種第１代の染色体を倍加して４倍体とし、これに片親で用いた種（Ｆ）を掛け合わせて次代を作出し、さらにこの次代株に前記片親で用いた種（Ｆ）を掛け合わせる戻し交雑を行って子孫株を得るというものである。ここでは、戻し交雑を行うことにより、戻し交雑に用いなかった親（Ａ）由来の染色体が不均等に分配されるという性質を利用し、Ａ由来の染色体がランダムに分配された一連の子孫株群を作出している。こうして得られた子孫株由来細胞の染色体を顕微鏡等で観察することにより、特定の染色体が添加された系統を選抜するというものである。掛け合わせに用いる株やその手法、選抜に用いる手法などは、本発明を限定するものでは無い。
また、シャロットの第１染色体と第２染色体はどちらも異種染色体として添加した際に高い雄性不稔形質を付与するため、このどちらか一方が添加されれば十分な効果が期待できるが、下記実施例に示すとおり第１染色体添加系統は花粉の形成そのものがほとんど起こらず、第２染色体添加系統は花粉の形成は起こるが花粉の発芽率が極めて低いという異なった形質により雄性不稔を示すものであり、より高い効果を得る目的で２本両方を添加しても良いし、また第１染色体と第２染色体の一方または両方と他のシャロット染色体を添加して、更に異なった形質を付与しても良い。このうち特にシャロット第１染色体については、本発明者らが既にネギに添加した際にアスコルビン酸高生産能を付与することを明らかにしており、有用形質を付与しつつ雄性不稔形質も付与するという、育種上極めて優れた形質を有する染色体である。
【００１５】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントについては、シャロットとの掛け合わせが可能な植物であれば特に限定はされないが、近縁種であれば掛け合わせやその後の子孫取りが容易になるため、好ましくはユリ科のネギ属植物が適しており（第２の実施の形態）、更に好ましくは食用のネギ属植物、例えばネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれか１種類より選択される植物などが適している（第３の実施の形態）。これらの作物の品種改良において、シャロットの第１染色体と第２染色体の一方または両方を添加して４倍体化し、雄性不稔とすることは極めて有効である。
【００１６】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントとしては更に、ネギ属植物のうち園芸用として栽培される植物、例えば花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれか１種類より選択される植物もまた好適である（第４の実施の形態）。美しい花を咲かせるこれらの植物についても、品種改良により様々な品種が産み出されているが、それに本発明の提供する雄性不稔形質を加えれば、より効果的な品種改良が可能となる。
【００１７】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントとして特に好適なのは、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）であり、上述の通りネギについては第１染色体の添加と４倍体化によって雄性不稔形質が付与される事が確認されており、新品種として即活用可能である。
【００１８】
本発明の第１から第４の実施の形態のうちいずれか１つに記載の植物から単離された、シャロット第１染色体とシャロット第２染色体の一方または両方を添加された４倍体植物細胞（第５の実施の形態）もまた、種苗生産等の目的で利用可能である。上記の染色体を有する４倍体植物は雄性不稔形質を示すため、次世代を得るためには種子親として利用し別株から花粉を得て受粉する手法が考えられるが、４倍体植物自身が非常に優れた形質を持つ場合などには、この４倍体植物の器官、組織或いは細胞を単離し、適当な培地で培養し更に発芽と発根を誘導し、これを更に育成して新たな植物体として提供することも可能である（第６の実施の形態）。器官、組織、細胞の単離方法、それらの培養方法、培養に用いる培地や温度、光、二酸化炭素濃度などの生育条件等は、農業分野で用いられている該当手法を適宜参照すれば良く、本発明を限定するものではない。
【００１９】
更に、本発明の提供する異種染色体添加４倍体植物を親（種子親）とし、２倍体植物や高次倍数体植物と掛け合わせて得られる植物もまた、本発明の範囲内に含まれるべきものである（第７の実施の形態）。下記実施例で述べるとおり、本発明の提供する異種染色体添加４倍体植物は強い雄性不稔形質を示し、これは掛け合わせなどによる品種改良にとって非常に有用な形質である。また４倍体植物であることから、添加された異種染色体を確実に次世代に伝達することが可能であり、例えばシャロットの第１または第２染色体と、それ以外の染色体という複数の組み合わせを持った４倍体植物を作成し、これらの染色体の担う形質を子孫植物に付与することも可能になる。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
（単一異種染色体添加ネギ系統の作出）
本発明に係る単一異種染色体添加ネギ系統は、非特許文献５に記載の方法で作出した（Ｓｈｉｇｙｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）。作出方法の概要を表１に示す。２倍体のネギ（ＦＦ，２ｎ＝１６）とシャロット（ＡＡ，２ｎ＝１６）を掛け合わせ、雑種第１代（ＡＦ，ｎ＋ｎ＝１６、Ｆはネギゲノムを、Ａはシャロットゲノムをそれぞれ表す）を得た。染色体の倍加によりＡｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ（ＡＡＦＦ，２ｎ＝３２）を得、これにネギ（ＦＦ）を掛け合わせて次代（ＡＦＦ，２ｎ＋ｎ＝２４）を得た。更にこれにネギ（ＦＦ）を掛け合わせ、シャロットゲノムＡに由来する染色体が不均等に分配された子孫株群を作出した。得られた子孫株の細胞を顕微鏡等で観察することにより、この中から染色体１本を含む子孫の系統（Ａｌｉｅｎ ｍｏｎｏｓｏｍｉｃ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）をそれぞれの染色体（第１〜第８）について作出した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
（異種染色体を添加した４倍体ネギの作出）
材料として、上記方法によりシャロットの第１（ＦＦ＋１Ａ）、第２（ＦＦ＋２Ａ）、第５（ＦＦ＋５Ａ）、第８（ＦＦ＋８Ａ）染色体をそれぞれ一本ずつもつネギ単一異種染色体添加系統（２ｎ＝１６＋１）を供試した。各単一添加系統の盤茎と葉鞘部を３ｃｍ残して、根など必要ない部分を除去した。これをポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０％次亜塩素酸溶液で１５分間殺菌し、滅菌蒸留水で３回洗浄した。１ｍｍ以下に切り出した茎頂部を０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチンと２％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加した３％（ｗ／ｖ）ショ糖含有ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）固形培地に置床して、暗所に４日間２５℃で培養した。その後、茎頂部から発生したシュートをホルモンフリー３％（ｗ／ｖ）ショ糖含有ＭＳ固形培地に移し、２５℃、１６時間日長の条件下で３ヶ月間培養し、再生個体を得た。なお、ＦＦ＋１Ａの茎頂培養に用いた固形培地は０．８％寒天を、それ以外は０．４％ゲランガムを用いた。
【実施例２】
【００２３】
（再生個体における倍数性調査）
各起源層（第１層から第３層）において、倍数性の調査を行った。第３層の倍数性は、再生個体の根を塩基性フクシンのホイルゲン染色による染色体数の調査により推定した。第２層は、葉身部をフローサイトメトリー分析に供試することで推定した。対照区には二倍性の単一異種染色体添加系統を、内部標準には野生種であるＡｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉを用いた。サンプルと内部標準との蛍光強度比ＥＩ（Ｅｘｔｒａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎｄｅｘ＝サンプルの平均蛍光強度／内部標準の平均蛍光強度）を算出し、対照区のＥＩと比較した。第１層の倍数性は、Ａｄａｎｉｙａら（非特許文献６，７）の表皮の孔辺細胞による検定方法を参考にした。また、第１層における倍数性の推定は、第３層および第２層において倍加が確認された個体のみ行った。完全展開葉の中央部から表皮を剥ぎ取り、１％酢酸カーミン液に２分間浸透させて染色した。染色後、蒸留水で余分な酢酸カーミン液を除去し、光学顕微鏡下で孔辺細胞を１５０細胞ずつ観察し、単一異種染色体添加系統と再生個体における孔辺細胞の直径を比較した。全ての起源層で倍加が確認された再生個体を、異種染色体を一対もつ四倍性ネギ（４ｎ＝３２＋２、ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａ、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａ）とした。
【００２４】
（異種染色体添加４倍体ネギにおける生殖能の検定）
得られた４倍体ネギのうち各系統１個体を用いて、細胞遺伝学的手法により花粉稔性を、自殖により種子生産能力を調査した。花粉稔性は、４倍体ネギにおける裂開前の葯の花粉１０００粒以上を用いた酢酸カーミン擦り付け法による花粉の染色性、および裂開後の花粉粒の発芽培地上での２時間後の花粉発芽率（１５０粒）により調査した。
なお、発芽培地は、１％（ｗ／ｖ）寒天と１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を溶かした寒天液をペトリ皿に約２ｍｍ厚になるように作製した後、カバーガラスで約１．５ｃｍの正方形ブロックに切り出して、スライドグラス上に置いて使用した。花粉を寒天培地に播種し、花粉が乾燥しないようにペトリ皿に蒸留水を湿らせたろ紙を敷いて、割り箸をスライドグラスとろ紙の間の枕木とした。ペトリ皿に蓋をして、播種２時間後に光学顕微鏡下で観察して花粉発芽率を算出した。
【実施例３】
【００２５】
（異種染色体を１対持つ４倍体ネギ）
ＦＦ＋１Ａの茎頂部９０個、ＦＦ＋２Ａの５０個、ＦＦ＋５Ａの４４個、ＦＦ＋８Ａの１５個を用いて培養を行ったところ、それぞれ２２，２０，１５，２個体からシュートが発生して、分げつおよび枯死を経て、最終的にそれぞれ２９，１８，１２，２個体の再生植物体を得た。得られた再生個体の第３層の倍数性を調査したところ、ＦＦ＋１Ａ茎頂由来では７個体が、ＦＦ＋２Ａ由来では４個体が、ＦＦ＋５Ａ由来では３個体が、ＦＦ＋８Ａ由来では１個体が、それぞれ倍加した染色体数４ｎ＝３２＋２を示した。
図１にＦＦ＋５Ａ（異種染色体添加２倍体植物；対照個体）およびＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ（異種染色体添加４倍体植物；再生個体）のフローサイトメトリー分析により得られたヒストグラムの一例を示す。
【００２６】
図１において、グラフ横軸は蛍光強度を、縦軸はその蛍光強度を示した細胞のカウント数をそれぞれ表す。フローサイトメトリー分析は、ＤＡＰＩによるＤＮＡの蛍光染色でその蛍光強度を測定する（ＤＮＡ含量が高いほど蛍光強度は強い）。フローサイトメトリーはＤＮＡを定量的ではなく相対的に測定するため、内部標準を用いることでより正確な結果が得られる。今回はネギ単一添加系統よりゲノムサイズが大きい野生種のＡｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉを内部標準に使用して分析を行った。左側の図ａでは、単一異種染色体添加系統の蛍光強度のピークが内部標準より左側にあり、これは、単一異種染色体添加系統の方が、ＤＮＡ含量が低い（ゲノムサイズが小さい）ことを示している。右側の図ｂでは、再生個体が内部標準より高いＤＮＡ含量を示した。本実施例では内部標準の平均蛍光強度を基にしたＥＩを算出することにより倍数性を推定した。単一異種染色体添加２倍体ではＥＩが０．７３９であり、再生個体は１．４６５であった。これは、内部標準に対してゲノムサイズがそれぞれ０．７３９倍および１．４６５倍であることを示す。対照区の単一異種染色体添加系統は染色体数が２ｎ＝１６＋１と分かっており、ＥＩより、再生個体はその対照区のおよそ２倍のゲノムサイズを有していることが示されているため、再生個体の染色体数は２倍の４ｎ＝３４であることが示された。
【００２７】
図１に示す第２層のフローサイトメトリー分析では、対照区の単一異種染色体添加系統と内部標準とのＥＩが０．７０９〜０．７４１であったため、これらの値に近いＥＩを示す再生個体は２倍体であると考えられた。一方、ＦＦ＋１Ａ由来において７個体が、ＦＦ＋２Ａ由来で９個体が、ＦＦ＋５Ａ由来で４個体が、ＦＦ＋８Ａ由来で１個体が、２倍体のおよそ倍のＥＩである１．４００〜１．５０４を示し、これらの個体では染色体が倍加していることが示された。第１層の調査は第２層および第３層において倍加の可能性がある再生個体のみについて行った。
【００２８】
図２に対照区（１４１、２６）および再生個体（ＤＡＭ１４１−１、ＤＡＭ２６−１）における孔辺細胞長のヒストグラムを示す。
この図は孔辺細胞の直径を光学顕微鏡下で測定し、それをヒストグラム化したものである。グラフ横軸は孔辺細胞の直径を、縦軸はその直径を有する孔辺細胞数をそれぞれ表す。孔辺細胞は倍数性が高次になるとその直径も大きくなることが明らかになっている。対照区である単一異種染色体添加２倍体ネギ系統と再生個体で孔辺細胞の直径を比較すると、再生個体のヒストグラムが右側にシフトしており、これは再生個体が単一添加系統より倍数性が高次であることを示している。
すなわち、図２に示すとおり、２倍体の孔辺細胞の直径と比較した結果、ＦＦ＋１Ａ由来では供試した１１個体のうち５個体、ＦＦ＋２Ａ由来では６個体中４個体、ＦＦ＋５Ａ由来では３個体全てにおいて孔辺細胞の直径が大きくなっており（ヒストグラムがグラフ右側にシフト）、これらは４倍体ネギであると考えられた。
【００２９】
（４倍体ネギの花粉稔性及び生殖能）
酢酸カーミンで染色された正常な花粉粒の割合はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０．８４±０．０４％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで２８．３１±０．８０％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで５９．２７±２．３５％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで２８．８３±１．１２％であった。また、発芽培地における花粉管の発芽率はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで６．７２±１．６７％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで３８．６７±３．５６％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで１４．６７±４．９７％であった（表２）。
さらに、４倍体ネギの自殖における種子形成胚珠率［｛種子数／（交配小花数×６）｝×１００］はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０．０７％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで０．３３％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで０．９３％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで１．０７％であった（表３）。第１染色体添加４倍体は花粉の形成そのものと花粉の発芽の両方がほとんど起こらず、更には自殖もしないほぼ完全な雄性不稔形質を示した。第２染色体添加４倍体については、花粉の形成は起こるが花粉の発芽率については第５，第８染色体に比べて１７％〜４６％の発芽率しか示さず、また自殖による種子形成胚珠率も第５，第８染色体添加系統に比べ３１％〜３５％の能力しか持たない雄性不稔の形質をそれぞれ示した。これらの結果から、シャロットの第１，第２染色体を添加した異種染色体添加４倍体ネギ系統は、他の染色体を添加した系統に比べて強い雄性不稔形質を有し、育種などの分野に利用可能である事が示された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（ａ）は、ＦＦ＋５Ａ（異種染色体添加２倍体植物；対照個体）、（ｂ）は、およびＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ（異種染色体添加４倍体植物；再生個体）のフローサイトメトリー分析により得られたヒストグラムの一例である。
【図２】（ａ）乃至（ｄ）は、それぞれ対照区（１４１、２６）および再生個体（ＤＡＭ１４１−１、ＤＡＭ２６−１）における孔辺細胞長のヒストグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用植物の育種分野において、品種改良の際に必要不可欠な雄性不稔形質の付与方法に関し、より詳しくは、シャロットの第１または第２染色体が添加され、雄性不稔形質を有した異種染色体添加４倍体植物とその細胞及びその子孫植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
作物など有用植物において、ある株と別の株との交配によって改良品種（Ｆ１）を得る手法は、Ｆ１が親品種を上回る収量や耐病性を示したり、両親の持つ良い形質をともに受け継いだりすることが知られ、古くから農業分野において利用されてきた。交配による品種の作出において非常に重要な点は、交配の際、自分の花粉で自分の胚珠が受粉する「自家受粉」を避け、確実に別株からの花粉を受粉することであり、その最も効率的かつ計画的な手法としては、親株の片方に雄性不稔（自身の花粉が主因で自家受粉による種子を形成しない）の形質を付与するという手法が用いられている。雄性不稔形質の導入方法としては、自然突然変異により生まれながらにして雄性不稔形質を持った株を利用する方法や、遺伝子組み換えを含む外来遺伝子の導入、薬品処理などによって人工的に雄性不稔形質を付与する方法、などがこれまでに提案されている（特許文献１−３）。
【０００３】
また、近年、ネギ属植物における細胞質雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ：ＣＭＳ）の解析から、アリウム・ガランサム（Ａｌｌｉｕｍ ｇａｌａｎｔｈｕｍ）の細胞質を有した雄性不稔のネギが作出されたり、雄性不稔に関する遺伝子の解析が進められてその一部が明らかになりつつある（非特許文献１−４）。
しかしながら、従来の技術は、雄性不稔形質に関与する個別の遺伝因子を明らかにしてこれを利用したり、薬品処理などで人工的に雄性不稔を誘導するというものであり、通常の育種現場で適用可能なものでは無かった。食用・園芸用植物として極めて重要な位置にあるネギ属植物の育種分野において、通常の交配と顕微鏡観察等によって利用可能な、染色体レベルで雄性不稔形質を付与する技術の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００６−０４２７３０号公報 単子葉植物の雄性不稔体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【特許文献２】特開平０５−３０１８０７号公報 ユリ綱植物において雄性不稔を誘発する方法
【特許文献３】特表平１１−５１２２９０号公報 Ｐｏｌｉｍａ ＣＭＳ細胞質を有し、高温及び低温において雄性不稔性である細胞質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物
【特許文献４】特許第２６５６３１１号公報 雄性不稔誘発剤及びそれを用いた雄性不稔誘発方法ならびにＦ▲下１▼採種法
【非特許文献１】Ｈａｖｅｙ Ｍ．Ｊ．１９９９．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１２４（６）：６２６−６２９．
【非特許文献２】Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｃｅｌｌｕ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７（２Ｂ）：６２５−６３４．
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００５．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１１：１５−２２．
【非特許文献４】Ｓｏｎｇ，Ｌ．−Ｑ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１３（１）：５５−６２．
【非特許文献５】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７１：３６３−３７１．
【非特許文献６】Ａｄａｎｉｙａ Ｓ．＆ Ｔａｍａｋｉ Ｓ．１９９１．Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６０：１０５−１１２．
【非特許文献７】Ａｄａｎｉｙａ Ｓ．＆ Ａｒｄｉａｎ ．１９９３．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ７９：５−１２．
【非特許文献８】執行ら ２０００．園芸学会誌６９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明は、ネギ属植物の種間交雑を用いた異種染色体添加技術において、シャロット由来の染色体が添加され雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物とその細胞及びその子孫植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）をレシピエント（異種染色体が添加される植物）とし、種間交雑によってシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加するという異種染色体添加技術を独自に開発し、これまでにシャロットの各染色体を１本だけ持つ単一異種染色体添加２倍体ネギ系統の作出に成功している（非特許文献５）。
これら単一異種染色体添加系統はシャロットの持つ様々な有用形質を発現するなど、食用作物の品種改良法に新たな里程を築くものであるが、本発明者らは更に、添加された異種染色体の次世代への伝達のため、これら単一異種染色体添加２倍体ネギ系統の染色体倍加により４倍体系統の作出にも成功した。この異種染色体添加４倍体系統の作出過程において、本発明者らは、シャロットの特定の染色体が極めて強い雄性不稔形質をレシピエントであるネギに付与するという事実を見いだし、これを育種分野に適用すべく種々の解析を進めて、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、請求項１記載の発明では、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を１対、及び／または第２染色体を１対有し、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においては、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントに対して発揮するように作用する。
【０００７】
請求項２記載の発明では、レシピエントがユリ科ネギ属植物である、請求項１に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様、シャロットの特定の染色体が強い雄性不稔形質をレシピエントであるユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【０００８】
請求項３記載の発明では、レシピエントがネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれか１種類より選択される、請求項２記載に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントであるネギやニンニクなどのユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【０００９】
請求項４記載の発明では、レシピエントが花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれか１種類より選択される、請求項２記載に記載の異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質をレシピエントである花ネギやコワニーなどのユリ科ネギ属植物に対して発揮するように作用する。
【００１０】
請求項５記載の発明では、請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の植物から単離された、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物細胞においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【００１１】
請求項６記載の発明では、請求項５に記載の植物細胞を培養して得られる、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【００１２】
請求項７記載の発明では、請求項１から請求項４のうちいずれか１項または請求項６に記載の異種染色体添加４倍体植物を種子親として得られる、子孫植物を提供する。
上記構成の異種染色体添加４倍体植物の子孫植物においても同様に、シャロットの特定の染色体が、強い雄性不稔形質を発揮するように作用する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の提供するシャロット由来の染色体を添加された植物を利用することにより、ネギ属植物の改良品種に対して雄性不稔形質を染色体レベルという安定かつ確実なレベルで付与することが可能となる。この事はまた、添加された異種染色体が母系（雌性配偶子）を通じて後代に確実に伝達されることも示しており、これは交配育種分野においては極めて重要な形質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明の第１の実施の形態は、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体または第２染色体が添加され、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物を提供する。
本発明者らはこれまでに、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）にシャロット由来の染色体１本を添加した「単一異種染色体添加ネギ系統」の作出に成功している。そして、第１染色体を導入したネギがさび病抵抗性を示すことも明らかにしている（非特許文献８）。
これらの系統について異種染色体の後代への伝達能を付与するため、染色体の倍加によって４倍体植物を作出し、この植物の性状を解析する中で、第１染色体または第２染色体を添加した系統に非常に強い雄性不稔形質が付与されている事を見いだし、本発明を完成した。ネギ属植物の雄性不稔についてはこれまで、ミトコンドリア遺伝子の関与や他の遺伝子の関与などが明らかにされつつあるが、これらはあくまで個別の遺伝子であって、例えばこれを利用して対象とする作物に雄性不稔形質を付与しようとする場合には遺伝子組み換えなどの操作が必要という問題点があった。
それに比し本実施の形態に係る異種染色体添加４倍体植物では、通常の掛け合わせ技術を基に染色体レベルで雄性不稔形質を付与することが可能であり、作物の育種分野においては遺伝子操作など複雑で高度な操作を要さない点、遺伝子組み換え技術を用いないため新品種に対する社会的な抵抗感を心配しなくても良い点が優れている。
下記実施例に示す通り、異種染色体の添加方法は異種同士の掛け合わせ（Ｆ×Ａ）で生じた雑種第１代の染色体を倍加して４倍体とし、これに片親で用いた種（Ｆ）を掛け合わせて次代を作出し、さらにこの次代株に前記片親で用いた種（Ｆ）を掛け合わせる戻し交雑を行って子孫株を得るというものである。ここでは、戻し交雑を行うことにより、戻し交雑に用いなかった親（Ａ）由来の染色体が不均等に分配されるという性質を利用し、Ａ由来の染色体がランダムに分配された一連の子孫株群を作出している。こうして得られた子孫株由来細胞の染色体を顕微鏡等で観察することにより、特定の染色体が添加された系統を選抜するというものである。掛け合わせに用いる株やその手法、選抜に用いる手法などは、本発明を限定するものでは無い。
また、シャロットの第１染色体と第２染色体はどちらも異種染色体として添加した際に高い雄性不稔形質を付与するため、このどちらか一方が添加されれば十分な効果が期待できるが、下記実施例に示すとおり第１染色体添加系統は花粉の形成そのものがほとんど起こらず、第２染色体添加系統は花粉の形成は起こるが花粉の発芽率が極めて低いという異なった形質により雄性不稔を示すものであり、より高い効果を得る目的で２本両方を添加しても良いし、また第１染色体と第２染色体の一方または両方と他のシャロット染色体を添加して、更に異なった形質を付与しても良い。このうち特にシャロット第１染色体については、本発明者らが既にネギに添加した際にアスコルビン酸高生産能を付与することを明らかにしており、有用形質を付与しつつ雄性不稔形質も付与するという、育種上極めて優れた形質を有する染色体である。
【００１５】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントについては、シャロットとの掛け合わせが可能な植物であれば特に限定はされないが、近縁種であれば掛け合わせやその後の子孫取りが容易になるため、好ましくはユリ科のネギ属植物が適しており（第２の実施の形態）、更に好ましくは食用のネギ属植物、例えばネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれか１種類より選択される植物などが適している（第３の実施の形態）。これらの作物の品種改良において、シャロットの第１染色体と第２染色体の一方または両方を添加して４倍体化し、雄性不稔とすることは極めて有効である。
【００１６】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントとしては更に、ネギ属植物のうち園芸用として栽培される植物、例えば花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれか１種類より選択される植物もまた好適である（第４の実施の形態）。美しい花を咲かせるこれらの植物についても、品種改良により様々な品種が産み出されているが、それに本発明の提供する雄性不稔形質を加えれば、より効果的な品種改良が可能となる。
【００１７】
本実施の形態におけるシャロット染色体のレシピエントとして特に好適なのは、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）であり、上述の通りネギについては第１染色体の添加と４倍体化によって雄性不稔形質が付与される事が確認されており、新品種として即活用可能である。
【００１８】
本発明の第１から第４の実施の形態のうちいずれか１つに記載の植物から単離された、シャロット第１染色体とシャロット第２染色体の一方または両方を添加された４倍体植物細胞（第５の実施の形態）もまた、種苗生産等の目的で利用可能である。上記の染色体を有する４倍体植物は雄性不稔形質を示すため、次世代を得るためには種子親として利用し別株から花粉を得て受粉する手法が考えられるが、４倍体植物自身が非常に優れた形質を持つ場合などには、この４倍体植物の器官、組織或いは細胞を単離し、適当な培地で培養し更に発芽と発根を誘導し、これを更に育成して新たな植物体として提供することも可能である（第６の実施の形態）。器官、組織、細胞の単離方法、それらの培養方法、培養に用いる培地や温度、光、二酸化炭素濃度などの生育条件等は、農業分野で用いられている該当手法を適宜参照すれば良く、本発明を限定するものではない。
【００１９】
更に、本発明の提供する異種染色体添加４倍体植物を親（種子親）とし、２倍体植物や高次倍数体植物と掛け合わせて得られる植物もまた、本発明の範囲内に含まれるべきものである（第７の実施の形態）。下記実施例で述べるとおり、本発明の提供する異種染色体添加４倍体植物は強い雄性不稔形質を示し、これは掛け合わせなどによる品種改良にとって非常に有用な形質である。また４倍体植物であることから、添加された異種染色体を確実に次世代に伝達することが可能であり、例えばシャロットの第１または第２染色体と、それ以外の染色体という複数の組み合わせを持った４倍体植物を作成し、これらの染色体の担う形質を子孫植物に付与することも可能になる。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
（単一異種染色体添加ネギ系統の作出）
本発明に係る単一異種染色体添加ネギ系統は、非特許文献５に記載の方法で作出した（Ｓｈｉｇｙｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）。作出方法の概要を表１に示す。２倍体のネギ（ＦＦ，２ｎ＝１６）とシャロット（ＡＡ，２ｎ＝１６）を掛け合わせ、雑種第１代（ＡＦ，ｎ＋ｎ＝１６、Ｆはネギゲノムを、Ａはシャロットゲノムをそれぞれ表す）を得た。染色体の倍加によりＡｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ（ＡＡＦＦ，２ｎ＝３２）を得、これにネギ（ＦＦ）を掛け合わせて次代（ＡＦＦ，２ｎ＋ｎ＝２４）を得た。更にこれにネギ（ＦＦ）を掛け合わせ、シャロットゲノムＡに由来する染色体が不均等に分配された子孫株群を作出した。得られた子孫株の細胞を顕微鏡等で観察することにより、この中から染色体１本を含む子孫の系統（Ａｌｉｅｎ ｍｏｎｏｓｏｍｉｃ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）をそれぞれの染色体（第１〜第８）について作出した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
（異種染色体を添加した４倍体ネギの作出）
材料として、上記方法によりシャロットの第１（ＦＦ＋１Ａ）、第２（ＦＦ＋２Ａ）、第５（ＦＦ＋５Ａ）、第８（ＦＦ＋８Ａ）染色体をそれぞれ一本ずつもつネギ単一異種染色体添加系統（２ｎ＝１６＋１）を供試した。各単一添加系統の盤茎と葉鞘部を３ｃｍ残して、根など必要ない部分を除去した。これをポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０％次亜塩素酸溶液で１５分間殺菌し、滅菌蒸留水で３回洗浄した。１ｍｍ以下に切り出した茎頂部を０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチンと２％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加した３％（ｗ／ｖ）ショ糖含有ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）固形培地に置床して、暗所に４日間２５℃で培養した。その後、茎頂部から発生したシュートをホルモンフリー３％（ｗ／ｖ）ショ糖含有ＭＳ固形培地に移し、２５℃、１６時間日長の条件下で３ヶ月間培養し、再生個体を得た。なお、ＦＦ＋１Ａの茎頂培養に用いた固形培地は０．８％寒天を、それ以外は０．４％ゲランガムを用いた。
【実施例２】
【００２３】
（再生個体における倍数性調査）
各起源層（第１層から第３層）において、倍数性の調査を行った。第３層の倍数性は、再生個体の根を塩基性フクシンのホイルゲン染色による染色体数の調査により推定した。第２層は、葉身部をフローサイトメトリー分析に供試することで推定した。対照区には二倍性の単一異種染色体添加系統を、内部標準には野生種であるＡｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉを用いた。サンプルと内部標準との蛍光強度比ＥＩ（Ｅｘｔｒａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎｄｅｘ＝サンプルの平均蛍光強度／内部標準の平均蛍光強度）を算出し、対照区のＥＩと比較した。第１層の倍数性は、Ａｄａｎｉｙａら（非特許文献６，７）の表皮の孔辺細胞による検定方法を参考にした。また、第１層における倍数性の推定は、第３層および第２層において倍加が確認された個体のみ行った。完全展開葉の中央部から表皮を剥ぎ取り、１％酢酸カーミン液に２分間浸透させて染色した。染色後、蒸留水で余分な酢酸カーミン液を除去し、光学顕微鏡下で孔辺細胞を１５０細胞ずつ観察し、単一異種染色体添加系統と再生個体における孔辺細胞の直径を比較した。全ての起源層で倍加が確認された再生個体を、異種染色体を一対もつ四倍性ネギ（４ｎ＝３２＋２、ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａ、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａ）とした。
【００２４】
（異種染色体添加４倍体ネギにおける生殖能の検定）
得られた４倍体ネギのうち各系統１個体を用いて、細胞遺伝学的手法により花粉稔性を、自殖により種子生産能力を調査した。花粉稔性は、４倍体ネギにおける裂開前の葯の花粉１０００粒以上を用いた酢酸カーミン擦り付け法による花粉の染色性、および裂開後の花粉粒の発芽培地上での２時間後の花粉発芽率（１５０粒）により調査した。
なお、発芽培地は、１％（ｗ／ｖ）寒天と１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を溶かした寒天液をペトリ皿に約２ｍｍ厚になるように作製した後、カバーガラスで約１．５ｃｍの正方形ブロックに切り出して、スライドグラス上に置いて使用した。花粉を寒天培地に播種し、花粉が乾燥しないようにペトリ皿に蒸留水を湿らせたろ紙を敷いて、割り箸をスライドグラスとろ紙の間の枕木とした。ペトリ皿に蓋をして、播種２時間後に光学顕微鏡下で観察して花粉発芽率を算出した。
【実施例３】
【００２５】
（異種染色体を１対持つ４倍体ネギ）
ＦＦ＋１Ａの茎頂部９０個、ＦＦ＋２Ａの５０個、ＦＦ＋５Ａの４４個、ＦＦ＋８Ａの１５個を用いて培養を行ったところ、それぞれ２２，２０，１５，２個体からシュートが発生して、分げつおよび枯死を経て、最終的にそれぞれ２９，１８，１２，２個体の再生植物体を得た。得られた再生個体の第３層の倍数性を調査したところ、ＦＦ＋１Ａ茎頂由来では７個体が、ＦＦ＋２Ａ由来では４個体が、ＦＦ＋５Ａ由来では３個体が、ＦＦ＋８Ａ由来では１個体が、それぞれ倍加した染色体数４ｎ＝３２＋２を示した。
図１にＦＦ＋５Ａ（異種染色体添加２倍体植物；対照個体）およびＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ（異種染色体添加４倍体植物；再生個体）のフローサイトメトリー分析により得られたヒストグラムの一例を示す。
【００２６】
図１において、グラフ横軸は蛍光強度を、縦軸はその蛍光強度を示した細胞のカウント数をそれぞれ表す。フローサイトメトリー分析は、ＤＡＰＩによるＤＮＡの蛍光染色でその蛍光強度を測定する（ＤＮＡ含量が高いほど蛍光強度は強い）。フローサイトメトリーはＤＮＡを定量的ではなく相対的に測定するため、内部標準を用いることでより正確な結果が得られる。今回はネギ単一添加系統よりゲノムサイズが大きい野生種のＡｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉを内部標準に使用して分析を行った。左側の図ａでは、単一異種染色体添加系統の蛍光強度のピークが内部標準より左側にあり、これは、単一異種染色体添加系統の方が、ＤＮＡ含量が低い（ゲノムサイズが小さい）ことを示している。右側の図ｂでは、再生個体が内部標準より高いＤＮＡ含量を示した。本実施例では内部標準の平均蛍光強度を基にしたＥＩを算出することにより倍数性を推定した。単一異種染色体添加２倍体ではＥＩが０．７３９であり、再生個体は１．４６５であった。これは、内部標準に対してゲノムサイズがそれぞれ０．７３９倍および１．４６５倍であることを示す。対照区の単一異種染色体添加系統は染色体数が２ｎ＝１６＋１と分かっており、ＥＩより、再生個体はその対照区のおよそ２倍のゲノムサイズを有していることが示されているため、再生個体の染色体数は２倍の４ｎ＝３４であることが示された。
【００２７】
図１に示す第２層のフローサイトメトリー分析では、対照区の単一異種染色体添加系統と内部標準とのＥＩが０．７０９〜０．７４１であったため、これらの値に近いＥＩを示す再生個体は２倍体であると考えられた。一方、ＦＦ＋１Ａ由来において７個体が、ＦＦ＋２Ａ由来で９個体が、ＦＦ＋５Ａ由来で４個体が、ＦＦ＋８Ａ由来で１個体が、２倍体のおよそ倍のＥＩである１．４００〜１．５０４を示し、これらの個体では染色体が倍加していることが示された。第１層の調査は第２層および第３層において倍加の可能性がある再生個体のみについて行った。
【００２８】
図２に対照区（１４１、２６）および再生個体（ＤＡＭ１４１−１、ＤＡＭ２６−１）における孔辺細胞長のヒストグラムを示す。
この図は孔辺細胞の直径を光学顕微鏡下で測定し、それをヒストグラム化したものである。グラフ横軸は孔辺細胞の直径を、縦軸はその直径を有する孔辺細胞数をそれぞれ表す。孔辺細胞は倍数性が高次になるとその直径も大きくなることが明らかになっている。対照区である単一異種染色体添加２倍体ネギ系統と再生個体で孔辺細胞の直径を比較すると、再生個体のヒストグラムが右側にシフトしており、これは再生個体が単一添加系統より倍数性が高次であることを示している。
すなわち、図２に示すとおり、２倍体の孔辺細胞の直径と比較した結果、ＦＦ＋１Ａ由来では供試した１１個体のうち５個体、ＦＦ＋２Ａ由来では６個体中４個体、ＦＦ＋５Ａ由来では３個体全てにおいて孔辺細胞の直径が大きくなっており（ヒストグラムがグラフ右側にシフト）、これらは４倍体ネギであると考えられた。
【００２９】
（４倍体ネギの花粉稔性及び生殖能）
酢酸カーミンで染色された正常な花粉粒の割合はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０．８４±０．０４％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで２８．３１±０．８０％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで５９．２７±２．３５％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで２８．８３±１．１２％であった。また、発芽培地における花粉管の発芽率はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで６．７２±１．６７％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで３８．６７±３．５６％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで１４．６７±４．９７％であった（表２）。
さらに、４倍体ネギの自殖における種子形成胚珠率［｛種子数／（交配小花数×６）｝×１００］はＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａで０．０７％、ＦＦＦＦ＋２Ａ２Ａで０．３３％、ＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａで０．９３％、ＦＦＦＦ＋８Ａ８Ａで１．０７％であった（表３）。第１染色体添加４倍体は花粉の形成そのものと花粉の発芽の両方がほとんど起こらず、更には自殖もしないほぼ完全な雄性不稔形質を示した。第２染色体添加４倍体については、花粉の形成は起こるが花粉の発芽率については第５，第８染色体に比べて１７％〜４６％の発芽率しか示さず、また自殖による種子形成胚珠率も第５，第８染色体添加系統に比べ３１％〜３５％の能力しか持たない雄性不稔の形質をそれぞれ示した。これらの結果から、シャロットの第１，第２染色体を添加した異種染色体添加４倍体ネギ系統は、他の染色体を添加した系統に比べて強い雄性不稔形質を有し、育種などの分野に利用可能である事が示された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（ａ）は、ＦＦ＋５Ａ（異種染色体添加２倍体植物；対照個体）、（ｂ）は、およびＦＦＦＦ＋５Ａ５Ａ（異種染色体添加４倍体植物；再生個体）のフローサイトメトリー分析により得られたヒストグラムの一例である。
【図２】（ａ）乃至（ｄ）は、それぞれ対照区（１４１、２６）および再生個体（ＤＡＭ１４１−１、ＤＡＭ２６−１）における孔辺細胞長のヒストグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を１対、及び／または第２染色体を１対有し、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物。
【請求項２】
レシピエントがユリ科ネギ属植物である、請求項１に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項３】
レシピエントがネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれかの種より選択される、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項４】
レシピエントが花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれかの種より選択される、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の植物から単離された、異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の植物細胞を培養して得られる、異種染色体添加４倍体植物。
【請求項７】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項または請求項６に記載の異種染色体添加４倍体植物を種子親として得られる、子孫植物。
【請求項１】
シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を１対、及び／または第２染色体を１対有し、雄性不稔形質を有することを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物。
【請求項２】
レシピエントがユリ科ネギ属植物である、請求項１に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項３】
レシピエントがネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、野生ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）のうちいずれかの種より選択される、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項４】
レシピエントが花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）のうちいずれかの種より選択される、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の植物から単離された、異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の植物細胞を培養して得られる、異種染色体添加４倍体植物。
【請求項７】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項または請求項６に記載の異種染色体添加４倍体植物を種子親として得られる、子孫植物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−７２９２９（Ｐ２００８−７２９２９Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５４２０８（Ｐ２００６−２５４２０８）
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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