異種間及び複数種提示系
本発明は、原核遺伝子パッケージ及び／又は真核宿主細胞の外面上でのポリペプチドの複数種及び異種間提示のためのベクターセットとして様々な組み合わせで使用することができる、発現ベクター及びヘルパー提示ベクターを提供する。提示ベクターを変更又は再操作する必要なく、本発明のベクターセットを用いて、複数種及び異種間提示系を実施することができる。本発明の提示系は、ファージ、細菌宿主細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞の表面上でポリペプチドの遺伝学的に多様なレパートリー又はライブラリを提示するのに特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、米国仮出願第６０／７４６，４８９号（２００６年５月４日出願、題名「複数種提示系」）の３５ＵＳＣ １１９（ｅ）の定めるところに従い、優先権を主張する。この仮出願の開示は、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、タンパク質提示の分野に関し、発現ベクターの分子操作を何ら行うことなく、原核及び／又は真核生物宿主細胞の表面での、タンパク質ライブラリの、連続的な複数種提示又は異種間提示を可能にする提示系を提供する。
【０００３】
発明の背景
ファージ提示系は、ポリペプチドライブラリ（例えば抗体ライブラリ）の構築及びスクリーニングのためのコアテクノロジープラットフォームと考えられる。これは、様々な遺伝学的ツールの利用可能性、操作の利便性及びＥ．コリ細胞の高い形質転換効率（通常、１０９から１０１０ｃｆｕ／μｇ ｐＵＣ１８ ＤＮＡ）を含む、数多くの実施上の配慮点による。現在、ファージ上で提示されるナイーブ抗体ライブラリが日常的に抗体探索のために使用されており、これにより、動物免疫付与及び従来のハイブリドーマ技術の使用が不要となる。ファージ提示ライブラリの複雑性は、１０１１の規模に達した。しかし、抗体探索及び操作技術においてファージ提示がうまく使用されているにもかかわらず、原核生物系での真核タンパク質の発現及び提示に関連して多くの欠点がある。例えば、一部の真核生物タンパク質は、原核細胞において機能的に発現され得ず、原核生物宿主細胞は、真核生物宿主細胞の特徴である翻訳後修飾を完全に行うことができない。
【０００４】
原核生物提示系の使用に関連する制限の一部は、真核生物提示系を使用することによって解決できる。例えば、真核生物宿主細胞は一般に、比較的大型のタンパク質の提示に適応し得、複雑なグリコシル化を含む翻訳後修飾が可能である。酵母提示系の使用に付随するユニークな長所には、酵母細胞が比較的単純で安価な培養液中で高密度になるまで培養できるという有利な特性が含まれる。加えて、真核細胞は大きいので、フローサイトメトリーによる所望の特性を有するタンパク質を発現する１個の細胞についてライブラリをスクリーニングすることができる。
【０００５】
しかし、実際、タンパク質提示のために真核宿主細胞を大規模に使用することは、宿主細胞の形質転換効率などのいくつかの根本的な問題により制限される。例えば、酵母細胞形質転換の効率は、通常、１０４−１０５ｃｆｕ／μｇＤＮＡであり、これにより、酵母提示に基づく系において大型のライブラリを提示する能力が大きく制限される。今日、報告されている酵母提示ライブラリの最大のものは１０９前後のサイズである。
【０００６】
研究者が抗体探索及び分子進化適用のために原核及び真核提示系の威力を活用することを可能にする複数種提示系は、タンパク質提示の領域での重要な進歩と言える。複数種又は異種間提示系を開発するための以前の取り組みは、特異的外面タンパク質との関心のあるタンパク質配列のライブラリの融合に基づく提示ストラテジーが、表面タンパク質が由来する１種類の宿主細胞に限定されるということによって妨げられている。例えば、関心のあるタンパク質が酵母細胞壁タンパク質を含む融合タンパク質として提示される提示ストラテジーにおいて前提とされる酵母提示系は、本質的に酵母に限定され、ファージ及び哺乳動物宿主細胞で実施することはできない。
【０００７】
Ｈｕｆｔｏｎら（米国特許出願２００３０１８６３７４ Ａ１）で示されるように、先行技術の提示系は、通常、原核（ファージ）提示ベクターから真核（酵母）提示ベクターへとコード配列を移入するためにさらなる段階が必要であるベクターを使用する。一般的に、異なる遺伝子パッケージを用いて第一の提示系から第二の提示系へと移動させるために、第一のベクターから第二のベクターへの発現カセットの移動に制限部位の同じセットを使用するように設計されたクローニングストラテジーを用いた消化及び核酸連結によって、第二の宿主細胞（例えば種）での使用のためにベクターを修飾しなければならない。実際に、第二の種での提示に対してコード配列のライブラリを適合させるためにＤＮＡ消化及び核酸連結を行わなければならないプロセスは非効率的であり、プロセス中にユニークな特性を有する所望のものである可能性があるメンバーが失われ得る恐れがあり、それによりライブラリの多様性に悪影響がある。
【０００８】
従って、提示ベクター又は提示ベクターのライブラリの分子操作を何ら行わずに、原核（ファージ又は細菌）遺伝子パッケージの別の異なる種間又は原核遺伝子パッケージと真核（酵母、哺乳動物細胞）系との間又は２種類の別の真核生物宿主細胞（酵母及び哺乳動物細胞）間で、提示ベクターを移動させることができる理想的なタンパク質提示系に対するニーズは満たされていない。
【０００９】
本発明の要約
本発明は、ポリペプチドの様々なライブラリの異種間複数種の両方の提示を可能にするタンパク質提示系を提供する。何らかの分子操作（即ち、ＤＮＡ消化及び核酸連結）の必要なく、同じ発現ベクターを用いて、異種間及び複数種提示法を実施することができる。ファージ及び細菌細胞又はファージ及び酵母細胞又はファージ及び哺乳動物細胞などの遺伝子パッケージの複数種の表面上で、コード配列の多様性のあるレパートリーによりコードされるタンパク質産物を提示するために、本発明の組成物及び方法を使用することができる。本発明の組成物及び方法は、探索（即ちスクリーニング）又は分子進化プロトコールとの関連においてタンパク質のコレクションの提示に特に有用である。
【００１０】
とりわけ、本発明は、提示ベクター又は提示ベクターのライブラリの分子操作を何ら行わずに、原核（例えばファージ又は細菌）と真核（酵母、哺乳動物細胞）生物宿主細胞との間又は真核生物宿主細胞（例えば、酵母及び哺乳動物細胞）の異なる種の間の両方で研究者が発現／提示ベクターを移動させることができるようになる、タンパク質提示系を提供する。
【００１１】
図１で示されるように、開示される提示系によって、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の様々な種の外面上で外来配列を提示できるようになる。各提示系は、一般に、２つの成分：１）複数種又は異種間発現ベクターと、２）各種に対する対応するヘルパーベクターと、を有する。ある実施形態において、本発明は、異種間又は複数種発現ベクター、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ６及びＰＭＡＴ５を提供する。ｐＭＡＧ１及びｐＭＡＧ９ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。ベクターｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ５及びｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、酵母プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ヘルパー提示ベクター、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８を提供する。細菌ヘルパー提示ベクターｐＭＡＬ１（図１５Ａ参照）及びｐＭＡＬ２（図１５Ｂ参照）は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外膜ドメインに融合したアダプター２を含む融合タンパク質を発現する発現カセットを含む。各酵母ヘルパー提示ベクターは、様々な酵母細胞外壁タンパク質に融合したアダプター２を含む融合タンパク質の発現を支配する（図１１参照）。とりわけ、ｐＭＡＴ３は、Ｆｌｏ１のＣ末端ドメインに融合したアダプター２の発現を支配し、ｐＭＡＴ７はアダプター２ Ａｇａ２融合タンパク質を発現し；ｐＭＡＴ８はアダプター２ Ｃｗｐ２融合タンパク質を発現する。
【００１３】
異種間又は複数種発現ベクターのみを対応する宿主細胞（Ｅ．コリ又は酵母細胞又は哺乳動物細胞など）へ導入することによって、第一のアダプターエレメント（本明細書中で「アダプター１」と呼ぶ。）とインフレームで融合した外来ポリペプチドが発現され分泌される。特定の提示ベクターセットの対応するヘルパーベクターと組み合わせた本発明の発現ベクターの同時発現は、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上でのタンパク質ライブラリの外来ポリペプチドメンバーの提示を支配する。特定のベクターセットのヘルパーベクター成分が第二のアダプターエレメント（本明細書中で「アダプター２」と呼ぶ。）を含み、それが、タンパク質配列のライブラリを提示するために使用されている特異的遺伝子パッケージ又は宿主細胞で機能的である外面アンカータンパク質に融合した第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用を介して支配する結果、表面提示が起こる。
【００１４】
例えば、Ｅ．コリ細胞での外来ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質の発現を支配する複数種又は異種間提示ベクターと組み合わせた、ファージコートタンパク質に融合したアダプター２を含むヘルパーベクターの同時発現によって、外来ポリペプチドのライブラリがファージ粒子上で提示される。同様に、外来ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質の発現を支配する複数種提示ベクターと組み合わせた、細菌外膜アンカータンパク質に融合したアダプター２を含む細菌ヘルパーベクターの同時発現によって、細菌提示ライブラリが得られる。あるいは、ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質のライブラリの発現を支配する複数種提示ベクターと組み合わせて、酵母外面アンカータンパク質に融合したアダプター２を含む酵母ヘルパーベクターを使用することによって、酵母提示ライブラリが得られる。本発明の複数種提示ベクターと組み合わせて、哺乳動物外面タンパク質に融合したアダプター２を含む哺乳動物ヘルパーベクターを同時発現させることにより、哺乳動物提示ライブラリを調製することができる。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、原核及び真核細胞提示系間で、関心のあるタンパク質のライブラリを移動させるのに適切な異種間提示系を提供する。とりわけ、本発明は、関心のあるポリペプチド配列をコードする発現ベクターを操作する必要のない、原核生物宿主及び真核生物宿主細胞での、関心のあるポリペプチド配列のレパートリーの連続提示のための異種間提示系を提示する。
【００１６】
大まかに言えば、本発明の各異種間提示ベクターセットは、１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする異種間発現カセットと、を含む提示ベクターと、２）原核生物宿主により発現される外面タンパク質に融合した、提示ベクターの第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第一のヘルパーベクターと、３）真核生物宿主細胞により発現される外面タンパク質に融合した、第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第二のヘルパーベクターと、を含む。開示される細菌／酵母異種間提示ベクターは、次の機能的エレメント：酵母プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、細菌／酵母二重機能シグナル配列；関心のある遺伝子；アダプターコード配列；及び酵母転写終結配列を含む。細菌ヘルパーベクターは、アダプター２及び細菌外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含み、Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、関心のあるタンパク質がＥ．コリ細胞で細胞表面提示される。従って、酵母細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、関心のあるタンパク質が酵母細胞上で表面提示される。
【００１７】
本発明のこの態様の特定の実施形態は、関心のあるタンパク質又はタンパク質のライブラリを連続的にファージウイルス粒子（原核生物宿主細胞）及び酵母又は哺乳動物細胞の何れか（真核生物宿主細胞）の上で提示するための方法を提供する。一般に、ファージ／哺乳動物異種間提示ベクターは、次の機能的エレメント：（１）哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、（２）細菌／哺乳動物二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）哺乳動物ポリＡ配列を含む。米国特許第７，１７５，９８３号に記載のように、ファージに対するヘルパーベクターは、ウイルス粒子のアセンブリーに必要とされるファージ遺伝子全て及びアダプター２及び外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含む。哺乳動物細胞に対するヘルパーベクターは、哺乳動物表面アンカーシグナルとのアダプター２融合物を発現するための発現カセットを含む。Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、ファージ粒子上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、哺乳動物細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、哺乳動物細胞において関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００１８】
本発明の異種間提示系のある実施形態は、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞の表面上でのタンパク質配列のライブラリの連続提示のための系を提供する。開示されるファージ／哺乳動物異種間提示ベクター＋（プラス）上記の細菌ヘルパーベクターを用いて、Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、細菌細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、ファージ／哺乳動物異種間提示ベクター＋哺乳動物ヘルパーベクターを用いることにより、哺乳動物細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、哺乳動物細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、２種を超える受容宿主細胞上での異種間提示のための方法を提供する。例えば、何らかの組み合わせ又は順序で、ファージ、酵母又は哺乳動物宿主細胞上でタンパク質配列のライブラリを連続的に提示するために、本発明を使用することができる。ファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクターは：（１）イントロン配列内部の哺乳動物プロモーター、酵母プロモーター及びイントロン後のより短い細菌プロモーター；（２）Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において機能的であるシグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）転写終結配列を含む。個々の種に対するヘルパーベクターは上記で述べられている。従って、ファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクター＋各種に対する対応するヘルパーベクターを使用することにより、対応する種においてアダプター１及びアダプター２融合物を同時発現させると、ファージ又は酵母細胞又は哺乳動物細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示されるようになる。
【００２０】
本発明はまた、様々な原核及び真核生物宿主細胞でタンパク質の表面提示を支配するのに適切なヘルパー提示ベクターと組み合わせた異種間及び複数種発現ベクターの特定のセットを含む、本発明の提示ベクターセットを含むキットも提供する。例えば、ファージ及び哺乳動物宿主細胞の表面上でのタンパク質発現ライブラリの連続提示を支配するための用途に適切な異種間提示キットは、適切な包装中に、哺乳動物細胞での細胞表面提示を支配する哺乳動物ヘルパー提示ベクターｐＭＡＧ２（図５）と組み合わせて、ファージ提示を促進するベクターセットｐＭＡＧ９（図２）及びＧＭＣＴ（図４）を含み得る。あるいは、酵母及び哺乳動物細胞上でのタンパク質発現ライブラリの連続提示を支配するための用途に適切な複数種提示キットは、適切な包装中に、哺乳動物提示に対するベクターｐＭＡＧ９（図２）及びｐＭＡＧ２（図５）及び酵母提示に対するベクターｐＭＡＴ５（図１０）及びｐＭＡＴ３（図１１）を含むベクターセットを含み得る。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルパー提示ベクターを含む宿主細胞を含む。適切な原核生物宿主には、Ｅ．コリ細胞又はファージが含まれる。適切な真核生物宿主は酵母細胞又は哺乳動物細胞である。好ましい原核及び真核生物宿主は、線状ファージウイルス及び酵母Ｓ．セレビシエ細胞である。
【００２２】
本発明のファージ／酵母異種間提示ベクターセットは、一般に、次の機能的エレメント：（１）酵母プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、（２）細菌／酵母二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）酵母転写終結配列を含む。米国特許第７，１７５，９８３号に記載のように、ファージに対するヘルパーベクターは、ウイルス粒子のアセンブリーに必要なファージ遺伝子全て及びアダプター２及び外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含む。酵母Ｓ．セレビシエに対するヘルパーベクターは、酵母外壁タンパク質に融合したアダプター２を含む融合タンパク質の発現を支配する発現カセットを含む。Ｅ．コリ細胞におけるアダプター１及びアダプター融合物の同時発現によって、ファージ粒子上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、酵母細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、酵母細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００２３】
本発明はまた、別の種の宿主細胞で可溶性タンパク質を発現するための用途の広い方法も提供する。異種間発現カセットのタンパク質産物に融合した適合性のあるアダプター配列と対をなし相互作用することができるアダプター配列と組み合わせた、外面アンカータンパク質を含む融合タンパク質を含むヘルパーベクターなしで本発明の発現ベクターを使用すると、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞を含む複数の宿主細胞においてタンパク質の可溶性発現が起こる。本発明の複数種及び異種間発現／提示ベクターを使用することにより、ベクターの分子操作を何ら行う必要なく、異なる宿主細胞で連続的に関心のあるタンパク質を産生させることができる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、原核又は真核宿主細胞の２種類の異なる種上で関心のあるタンパク質又は多様性のあるタンパク質のライブラリを提示するために使用することができる、複数種提示方法を提供する。適切な原核細胞には、グラム陰性細菌細胞が含まれる。適切な真核生物宿主には、以下に限定されないがＳ．セレビシエ細胞などの酵母細胞又は哺乳動物細胞が含まれる。
【００２５】
特定の複数種実施形態において、本発明は、酵母及び哺乳動物細胞上での関心のあるタンパク質配列のライブラリの連続的細胞表面提示のための方法を提供する。本発明の酵母／哺乳動物複数種提示ベクターは、次の機能的エレメント：（１）イントロン配列内部の哺乳動物プロモーター及び酵母プロモーター；（２）酵母／哺乳動物二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）酵母及び哺乳動物のための転写終結配列を含む。酵母又は哺乳動物に対するヘルパーベクターは、上記の酵母又は哺乳動物細胞の細胞表面アンカーシグナルとのアダプター２融合物を発現するための発現カセットを含む。従って、対応する種でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、酵母細胞又は哺乳動物細胞上での関心のあるタンパク質の表面提示が起こる。
【００２６】
従って、本発明は、関心のあるタンパク質のライブラリから所望のタンパク質特性を特徴とする関心のあるタンパク質を単離するために使用することができる方法を提供する。好ましい方法は、ファージ上で提示されるタンパク質配列のライブラリから所望の特性を有するタンパク質を最初に同定すること、及び、続いて酵母又は哺乳動物提示系を用いてリードタンパク質を再評価することである。例えば、ヒトタンパク質を改変するために、大規模なライブラリ（多様性＞１０ｅ９）をファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクターで構築する。ファージ提示技術のユニークな長所を利用して、この大規模なライブラリを最初にファージヘルパーベクターでのファージ提示方式で構築することができ、数回のライブラリパニングを行う。このように、小規模の酵母提示ライブラリを構築するために、ファージパニングからのリードライブラリのＤＮＡ（多様性＜１０ｅ６）を直接、酵母ヘルパーベクターで酵母細胞に形質転換する。酵母提示ライブラリのＦＡＣＳソーティングから単離されるリードは折りたたみ及びグリコシル化などの所望の真核生物特性を有し、これは、機能及び産生などの下流のプロセスにおいて非常に有益となる。さらに、必要に応じて、機能アッセイのために、哺乳動物細胞表面上で酵母提示から単離されたリードを直接提示することができる。
【００２７】
本発明はまた、ライブラリの大きさが酵母提示ライブラリの構築に適切である場合、酵母／哺乳動物異種間提示ライブラリからの、所望の結合特異性を特徴とするタンパク質の単離のための方法も提供する。本発明の酵母ヘルパー提示ベクターを用いて、関心のあるタンパク質を含むライブラリを最初に酵母上で提示することができる。続いて、細胞表面提示及び選択の第二回目に対して、酵母ライブラリ選択アッセイから単離されたリードＤＮＡを直接哺乳動物細胞へと形質移入することができる。発現／提示ベクターの分子操作を何ら行う必要なく、上記の異種間（酵母から哺乳動物細胞）を行うことができる。本発明の異種間提示能により、第一の提示系で同定されたリードの機能確認を同時に提供するスクリーニングアッセイを研究者が行えるようになる。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、異種間複数種の機能などの所望の特性を有するシグナル配列の単離のための方法を提供する。対応する異種間提示ベクターを用いてシグナル配列のライブラリを構築することができる。対応する種における提示ライブラリのシャトリング選択から、対応する種での機能を有するシグナル配列を単離することができる。
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に指示されない限り、複数の意味も含む。本明細書中で使用する場合、「種」という用語は、比較的最近の共通の祖先を有するために、形態学的、解剖学的、生理学的及び遺伝学的に非常に類似している生物の群を指す。様々な種は、通常、その他の違いにかかわらず、共通の生命機能を果たすことにおいて共通の特性を示す。例えば、ヒト細胞とマウス細胞とは、共通のある種の分子標認点を有し、同じ種のメンバーであるとみなされ（即ち哺乳動物細胞）、一方、ヒト細胞と酵母細胞とは、真核宿主細胞の異なる種である。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子パッケージ」という用語は、関心のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が発現及び／又は表面提示のためにパッケージ化されている、ウイルス又は細胞を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「複数種提示」という用語は、様々なタイプの原核遺伝子パッケージ（即ち、ファージ又は細菌）又は様々なタイプの真核生物宿主細胞（即ち、酵母又は哺乳動物細胞）の表面上でポリペプチド配列のライブラリをコードするポリヌクレオチド配列の様々なレパートリーを研究者が発現させることを可能にする提示ストラテジーを指す。例えば、複数種提示ストラテジーによって、酵母及び哺乳動物細胞の表面上で抗体を提示することが可能となる。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「異種間提示」という用語は、原核遺伝子パッケージ及び真核生物宿主細胞の表面上で連続的にポリペプチド配列のライブラリをコードするポリヌクレオチド配列の様々なレパートリーを研究者が提示することを可能にする提示ストラテジーを指す。例えば、異種間提示ストラテジーによって、ファージ上及び連続的に酵母上で抗体ライブラリを提示することが可能となる。
【００３３】
「原核細胞系」及び「原核遺伝子パッケージ」という用語は、細菌細胞又は原核ウイルス（ファージ又は細菌胞子など）などの原核細胞を指すために、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３４】
「真核細胞系」及び「真核宿主細胞」という用語は、動物、植物、真菌及び原生生物及び真核ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）の細胞を含む真核細胞を指すために、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。この用語は、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター又はエンハンサーなどの非翻訳隣接領域を含まない。
【００３６】
「発現カセット」という用語は、本明細書中で、組み換えタンパク質／ペプチドを発現させるためにベクターにおいて構築された機能的単位を指すために使用される。これは通常、プロモーター、リボソーム結合部位及び発現標的のｃＤＮＡからなる。発現カセットを構築するために、その他の副成分を付加することができる。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、挿入された核酸分子を宿主細胞へ及び／又は宿主細胞間で移動させる核酸分子、好ましくは自己複製するものを指す。通常、ベクターは、複製起点、選択マーカー及び又はウイルスパッケージシグナル及びその他の制御エレメントを含む環状ＤＮＡである。ベクター、ベクターＤＮＡ、プラスミドＤＮＡは、本明細書の記述において交換可能な用語である。この用語は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記機能の複数を与えるベクターも含まれる。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞に導入された場合にポリペプチドへと転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。
【００３９】
「発現ベクター」、「複数種発現ベクター」及び「異種間発現ベクター」という用語は、本発明のヘルパーベクターにより産生されるアダプター配列と対をなして会合する能力を特徴とするアダプター配列とインフレームで融合した関心のあるタンパク質の可溶性の発現を支配するベクターを指す。
【００４０】
「ヘルパーベクター」という用語は、本発明の発現ベクターにより産生されたアダプター配列と対をなして会合する能力を特徴とするアダプター配列とインフレームで融合したアンカータンパク質を含む融合タンパク質を産生するように設計された遺伝子パッケージ又は宿主細胞特異的ベクターを指す。一時的に同時形質転換することにより、又は恒久的に宿主ゲノムに組み込むことにより、発現ベクターと組み合わせて、ヘルパーベクターを受容宿主細胞に導入することができる。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「複数種提示ベクターセット」という用語は、特定の種の遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上でポリペプチドを提示するように機能する相補的アダプター配列を含むように設計されている発現ベクター及びヘルパーベクターの特定の組み合わせを指す。例えば、哺乳動物提示のための一連のベクター、ｐＭＡＧ９（図２）及びｐＭＡＧ２（図５）、酵母提示のための一連のベクター、ｐＭＡＴ５（図１０）及びｐＭＡＴ３（図１１）である。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「異種間提示ベクターセット」という用語は、原核真核細胞系の両方においてポリペプチドを連続提示するように機能する相補的アダプター配列を含むように設計されている発現ベクター及びヘルパーベクターの特定の組み合わせを指す。例えば、ベクターセットｐＭＡＧ９（図２）及びＧＭＣＴ（図４）はファージ提示を促進し、一方、ｐＭＡＧ２（図５）と組み合わせたｐＭＡＧ９の使用は、哺乳動物細胞での細胞表面提示を支配する。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「発現系」という用語は、通常、所望の発現産物を産生するように機能できる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「表面抗原」という用語は、細胞の原形質膜成分を指す。これは、原形質膜を構成する、内在性膜タンパク質及び表在性膜タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質を包含する。「内在性膜タンパク質」は、細胞の原形質膜の脂質二重層にまたがる膜貫通型タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質は、一般に疎水性アミノ酸残基を含む少なくとも１つの「膜貫通セグメント」からなる。表在性膜タンパク質は、脂質二重層の疎水性の内部には広がらず、これらはその他の膜タンパク質との非共有相互作用により膜表面に結合している。
【００４５】
「外面アンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、遺伝子パッケージの外面に組み込まれるか又は連結される、ポリペプチド又はタンパク質又はタンパク質ドメインを指す。これは、天然由来であるか又は何らかの手段により人工的に作製されたものであり得る。この用語は、「表面アンカー配列」又は「シグナルコートタンパク質」、「外面配列」、「外膜タンパク質」、「膜アンカータンパク質」、「アンカータンパク質」、「細胞壁タンパク質」、「ＧＰＩアンカーシグナル」、「ＧＰＩ結合シグナル」及び「シグナルアンカー配列」と交換可能に使用される。
【００４６】
「シグナル配列」及び「リーダー配列」という用語は、ＤＮＡレベルでより大きいペプチドの成分である分泌ペプチドをコードするＤＮＡ配列を指すために本明細書中で交換可能に使用される。これはまた、分泌ペプチドのアミノ酸配列も指し得る。分泌ペプチドの機能は、細胞の分泌経路を通じてより大きいポリペプチドを支配することである。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用される。これらは、何らかの長さの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの何れかのヌクレオチド又はその類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、何らかの３次元構造を有し得、既知又は未知の何らかの機能を果たし得る。次のものは、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、リンケージ分析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリーの前又は後で行われ得る。非ヌクレオチド成分がヌクレオチド配列の途中に入り得る。ポリヌクレオチドは、重合後、標識成分との連結などにより、さらに修飾され得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸の何れかを指す。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」及び「関心のあるタンパク質」という用語は、何れかの長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書中で交換可能に使用される。このポリマーは、直線状、環状又は分枝状であり得、これは、修飾アミノ酸を含み得、途中に非アミノ酸が入り得る。この用語はまた、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファーＲＮＡを介したアミノ酸付加（アルギンニン化など）、ユビキチン化又は標識成分との連結などの何らかのその他の操作などにより修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性のある部分、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。構造的に、最も単純な天然の抗体（例えばＩｇＧ）は、ジスルフィド結合により相互連結した、４個のポリペプチド鎖、２個の重（Ｈ）鎖及び２個の軽（Ｌ）鎖を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーに相当する。「免疫グロブリン分子」という用語は、例えば、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びそれらの断片を含む。抗体断片の非限定例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（４）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（５）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（６）Ｆ（Ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片；（７）より短いリンカーを有する２個の同一の１本鎖Ｆｖからなるダイアボディ；（８）コイルドコイルドメインのペアの相互作用により安定化されたＦｖからなるｃｃＦｖ抗体が含まれる。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「対をなす相互作用」という用語は、安定な複合体を形成するために、２個のアダプターが、互いに相互作用でき、結合できることを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外面上にポリペプチドをパッケージングできるよう十分に長持ちしなければならない。複合体又は二量体は、どんな条件が存在しても、又は提示されるポリペプチドの形成と検出との時間の間にどんな条件が導入されても（これらの条件は、行われているアッセイ又は反応の機能である。）持ちこたえることができなければならない。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、目標ベクターに対する受容者であり得る又は受容者である、個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれる。この子孫は、天然、偶発的又は故意の突然変異のために、起源となる親細胞と必ずしも完全に（形態において又はトータルＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターによりインビボで形質移入された細胞が含まれる。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「レパートリー」という用語は、機能的又は物理的起源の種々のメンバーの総合的集団を指す。ライブラリは、同種の種々のメンバーの総合的集団である。一般に、レパートリーは、非常に広範で大型の機能的及び物理的背景を示し、従って、これは、機能的に定義されるライブラリを含み得る。例えば、種における免疫グロブリンの全体的な遺伝学的能力は、その免疫グロブリンレパートリーであり；タンパク質改変の目的のために、ライブラリは通常、１又は定義される多くの祖先由来の種々の分子の集団を指す。治療用抗体の作製などの、ある種の実際的な目的のレパートリーには、このような目的のために作製された全てのライブラリが含まれる。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「アダプター」という用語は、２個の異なる相互作用するアダプター間で物理的及び／又は機能的な合致に基づき物理的単位を形成するために互いに対をなし相互作用できる、相補的エレメント又は成分を指す。アダプターは、天然又は人工的起源由来の、タンパク質、タンパク質ドメイン、ペプチド、非ポリペプチドの化合物などであり得る。アダプターに対する典型例には、コイルドコイルへテロ二量体を形成する２つの相互作用するポリペプチド、ＧＲ１及びＧＲ２など（配列番号１９及び２０で示される。）；ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎ；天然及び人工的ロイシンジッパーなど；リガンドとその同族の受容体との間の特異的結合由来の特異的タンパク質−タンパク質相互作用；機能的単位を形成するための２つの異なるタンパク質のヘテロ二量体複合体など；ビオチン及びストレプトアビジンなどの２つの異なる非ポリペプチド成分からの特異的結合など、が含まれる。本発明に記載の表面提示において使用されるアダプターは宿主種にとって内因性及び／又は外来性であり得、及び／又は人工的なものであり得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、ペプチドの直線状配列は、両配列が実質的なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を示すならば、別の直線状配列と「基本的に同一」である。一般的に、基本的に同一である配列は、相同領域のアラインメント後、互いに少なくとも約６０％同一である。好ましくは、これらの配列は、少なくとも約７０％同一；より好ましくは、これらは少なくとも約８０％同一；より好ましくは、これらは少なくとも約９０％同一；より好ましくは、これらの配列は少なくとも約９５％同一；さらにより好ましくは、これらの配列は１００％同一である。
【００５６】
先行技術の原核生物提示系
ファージ提示
遺伝子パッケージの表面上でのポリペプチドの提示は、ポリペプチド配列のライブラリをスクリーニングするための強力な方法となる。非常に多様な分子のライブラリを構築し、所望の特性を有する分子を選択することができることから、スクリーニング／探索プロトコールならびに分子進化プロトコールを含む多くの応用に対して、この技術が広く利用可能となった。ファージ提示の起源は、ファージコートタンパク質に外来配列を融合させることによりバクテリオファージＭ１３ウイルス粒子の表面上でＧｅｏｒｇｅ Ｓｍｉｔｈが初めてタンパク質の外来セグメントを発現させた、１９８０年代中頃に遡る（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１３１５−１３１７）。このときから、Ｇｅｏｒｇｅ Ｓｍｉｔｈの知見に基づき、一連の提示系が開発されてきた。これらの系は、２つのカテゴリーに大きく分類することができる（米国特許第５，９６９，１０８号及び同第５，８３７，５００号）。第一世代の系は１−ベクター系である。この系でのベクターは、ファージゲノム全体、その中の挿入物、コートタンパク質遺伝子とインフレームで外来配列を含有する。得られたファージ粒子はファージゲノム全体を担うので、これらは比較的不安定で感染性が低い。第二世代の系は、一般にファージミド系と呼ばれ、２つの成分：（１）ファージ粒子へのファージミドのパッケージングを可能にするためのファージコートタンパク質及びファージ由来複製起点に融合した外来配列を担うファージミドベクター；及び（２）ファージパッケージングに必要とされる全てのその他の配列を担うヘルパーファージを有する。ヘルパーファージは通常、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製造のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ及びＳｔｒａｔａｇｅｎ製造のその誘導体ＶＣＳＭ１３などの複製欠損体である。ヘルパーファージによる細菌細胞の重複感染において、ファージミドベクターを担い、外来配列を提示する、新しくパッケージングされたファージが産生される。このように、先行技術のファージミド系は、ファージ外面配列（即ちコート配列）の少なくとも一部への外来配列の融合を必要とする。最もよく使用される融合又は提示部位は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩ及びＶＩＩＩ内であるが、遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸ融合物が報告されている。
【００５７】
コートタンパク質融合系の代わりに、融合ファージミド系への様々な修飾が記載されている。Ｃｒａｍｅｒｉらは、ｃＤＮＡ産物を提示するための系を考案したが、ここでは、ファージミドベクター上で提示されるべき外来配列の隣にＦｏｓ癌遺伝子が挿入され、同じベクター上で遺伝子ＩＩＩの隣にＪｕｎ癌遺伝子が挿入された（Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：６９−７５を参照）。Ｃｒａｍｅｒｉアプローチは、ｆｏｓとｊｕｎタンパク質との間の選択的相互作用を活用し：Ｆｏｓ−外来ポリペプチドが発現され、細胞膜周辺腔に分泌される場合、これがｐＩＩＩ−Ｊｕｎと複合体を形成し、次にこの複合体がＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージでの重複感染においてファージ粒子にパッケージングされる。
【００５８】
Ｃｒａｍｅｒｉ系と同様の別の変法は、ＷＯ０１／０５９５０、米国特許第６７５３１３６号に記載の「システインカップリング」提示系である。外来ポリペプチドの連結及び提示には、細菌細胞膜周辺腔における２個のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成が介在し、その一方は外来配列に含有され、他方は外面配列に挿入される。これらの２つの系が外面タンパク質に連結された外来タンパク質を含む融合物の発現を回避するにもかかわらず、これらの系は、提示ベクターにおいてコートタンパク質ｐＩＩＩが構成的に発現されるため、宿主細胞に対するコートタンパク質の毒性を最小限に抑えることはできない。さらに、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成には、外来配列及びコートタンパク質ｐＩＩＩの両方が高レベルで発現される必要がある。従って、低発現のものは何れも提示することができない。
【００５９】
最近、Ｗａｎｇらは、アダプターに支配される提示系に基づく代替的ファージ提示系を記載した（米国特許第７，１７５，９８３号）が、これには：（ａ）第一のアダプター配列にインフレームで融合した外来ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現ベクター；（ｂ）ファージ粒子をパッケージングするのに必要な外面タンパク質をコードする外面配列を含むヘルパーベクターが含まれ、外面タンパク質の１つが第二のアダプターにインフレームで融合している。従って、外来ポリペプチドの提示は、第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用によって達成される。
【００６０】
Ｅ．コリ提示
Ｅ．コリの表面上でのポリペプチドの提示は、ファージ提示技術に対する代替物として開発された。ファージ提示と同様に、細菌提示は、様々な遺伝学的ツール及び突然変異株が利用可能であり、形質転換効率が高く、そのため大規模なライブラリ構築及びスクリーニングに理想的であるので、魅力的な方法である。グラム陰性細菌において、提示されるべきタンパク質の様々なアンカータンパク質への融合に基づく表面提示系が報告されており、そこでは、外膜タンパク質（Ｃｈａｎｇ及びＬｏ ２０００、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７８：１１５−１２２；Ｌｅｅら、２００４、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：５０７４−５０８０）、線毛及び鞭毛（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ−Ｗｉｋｓｔｒｏｍら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：１３１９−１３２６）、修飾リポタンパク質（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：２３９−２４７）、氷核タンパク質（Ｊｕｎｇら、１９９８、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：５７６−５８０）及びオートトランスポーター（Ｖｅｉｇａら、２００３、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８５：５５８５−５５９０）が提示のためのアンカーとして使用された。
【００６１】
先行技術の真核提示系、酵母提示
真核生物宿主細胞、サッカロミセス・セレビシエの細胞壁での異種タンパク質の提示は、細胞壁タンパク質α−アグルチニンＡＧＡ１のＣ末端半分へのα−ガラクトシダーゼの融合によって、１９９３年に最初に記載された（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ ＭＰら、Ｙｅａｓｔ ９：３９９−４０９）。これ以来、様々な細胞ウェルタンパク質（ｃｅｌｌ ｗｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）への関心のあるタンパク質の融合に基づく様々な酵母提示系が報告された（Ｋｏｎｄｏ Ｍら、概説）。酵母に対して開発された細胞−表面提示系は殆ど全て、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー依存性である。１０を超える、Ｃ末端に推定ＧＰＩ連結シグナルのある酵母細胞ウェルタンパク質が、ペプチド及びタンパク質を提示できることが証明されているが、これには、Ｓ．セレビシエにおける、ａ−アグルチニン（Ａｇａ１及びＡｇａ２）、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ４及びＩｃｗｐ；メタノール資化酵母（ハンセヌラ・ポリモルファ）における、ＨｐＳＥＤ１、ＨｐＧＡＳ１、ＨｐＴＩＰ１、ＨＰＷＰ１及びカンジダ・アルビカンスにおける、Ｈｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ｒｂｔ５ｐが含まれる。今日まで、酵母細胞表面上で２０を超える外来タンパク質の提示に成功している。
【００６２】
上記の細胞−表面提示系全ての中で、ａ−アグルチニン受容体に基づくＤａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐにより作製された系が、ｓｃＦｖ抗体及び抗体ライブラリなど、様々なペプチド及びタンパク質を提示するために広く使用されてきた（米国特許第６３０００６５号、同第６４２３５３８号、同第６６９６２５１号及び同第６６９９６５８号）。Ｓ．セレビシエにおいて、ａ−アグルチニン受容体は、細胞−細胞相互作用を安定化し、接合「ａ」及びα半数体酵母細胞の間の融合を促進するための接着分子として作用する。この受容体は、コアサブユニットＡｇａ１及び小サブユニットＡｇａ２からなる。この細胞からＡｇａ１が分泌され、そのＧＰＩアンカー−連結シグナルを通じて、酵母細胞壁の細胞外マトリクスにおいてＯ−結合型グルカンに共有結合するようになる。Ａｇａ２は、２個のジスルフィド結合を通じて、おそらく、ゴルジ体において、Ａｇａ１に結合し、分泌後、Ａｇａ１を介して細胞に連結し続ける。この酵母提示系は、Ａｇａ２サブユニットとのタンパク質の融合を通じて酵母細胞表面上で組み換えタンパク質を提示するために、Ａｇａ１及びＡｇａ２タンパク質の会合を利用する。
【００６３】
Ｗｉｔｔｒｕｐの系は、免疫グロブリンＦａｂ断片などの複数鎖ポリペプチドに適している（Ｈｕｆｔｏｎら、米国特許出願２００３０１８６３７４ Ａ１）。Ｈｕｆｔｏｎらは、真核細胞での使用に適切な提示系の基礎としてＦｏｓ／Ｊｕｎ相互作用をおそらく使用できるであろうことに言及している。しかし、Ｈｕｆｔｏｎらは、真核宿主細胞でのタンパク質提示を支配するためにＦｏｓ／Ｊｕｎ相互作用がどのように利用され得るかを実現する説明を提供しなかった。しかし、参考文献は、Ｄａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐにより開発された、Ｆａｂ抗体の酵母提示に対するＡｇ２融合の使用法（米国特許第６３０００６５号、同第６４２３５３８号、同第６６９６２５１号及び同第６６９９６５８号）及び分子クローニングによるファージ提示ベクターから酵母ベクターへの遺伝子移入法のみを教示する。
【００６４】
哺乳動物提示
細胞表面受容体の膜ドメイン（Ｃｈｅｓｎｕｔら、１９９６、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｈｏら、２００６、ＰＮＡＳ ０３：９６３７−９６４２）、ＧＰＩアンカー配列（米国特許６８３８４４６号）、非開裂型タイプＩＩシグナルアンカー配列（米国特許７１２５９７３号）を含む様々な膜アンカータンパク質への融合により哺乳動物細胞の表面上でのタンパク質の提示を遂行するために、多くのアプローチが使用されてきた。典型例は、ｐＤｉｓｐｌａｙベクターであり、これは、哺乳動物細胞表面上でタンパク質を提示するための、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．からの市販ベクターである。このベクターにおいて、関心のあるタンパク質を細胞表面受容体ＰＤＧＦＲの膜ドメインと融合させる。米国特許第６９１９１８３号において別のアプローチもまた報告された。この系において、細胞表面はタンパク質Ｇなどの分子を捕捉し、タンパク質Ａは、哺乳動物細胞表面上で抗体分子を捕捉するために使用される。
【００６５】
本発明の複数種及び異種間提示系
ファージ提示は、受容体リガンド選択、抗体操作及びタンパク質エピトープ同定などの様々な適用に対して最もよく使用される系である。利便性及びファージ遺伝子操作の効率ゆえに、サイズ１０９の大型の多様なライブラリを１つのファージライブラリにおいて作製することができる。しかし、ファージ系を使用することができるのは、翻訳後修飾及びその他の細胞内プロセシングが必要ないか所望されない状況においてのみである。抗体断片などの殆どの真核タンパク質の場合、これらの生物学的機能は、グリコシル化などの細胞内プロセシングと関与する。さらに、真核タンパク質の一部は原核細胞において機能的に折りたたまれ得ない。
【００６６】
真核細胞の表面上での外来タンパク質の提示により、原核細胞系の制限を克服することができる。これにより、発現される真核タンパク質の折りたたみ及びグリコシル化が可能となり、比較的大きなタンパク質の提示が可能となる。しかし、真核細胞形質転換の効率が低いことから、実現できるライブラリは非常に小さいサイズに限定されており、これによって、ファージ提示が提供できる規模に匹敵し得ない。
【００６７】
従って、様々な適用に対する原核及び真核両方の提示技術の力を合わせた提示系の開発は根本的な難題である。関心のあるタンパク質が特異的外面配列と融合される場合、このタンパク質を提示できるのは、対応する種の表面上のみである。ファージ提示から酵母提示に移すために、Ｈｕｆｔｏｎら（米国特許出願第２００３０１８６３７４ Ａ１号）は、消化及び核酸連結を通じて原核提示ベクター（ファージｐＩＩＩコートタンパク質融合ベクター）から真核提示ベクター（酵母Ａｇａ２融合ベクター）に関心のある遺伝子を移すための方法を記載した。
【００６８】
本発明は、複数種提示を行うことができる新しい提示系を提供する。より具体的に、ＤＮＡ消化及びクローニングなどの分子操作を何ら行わずに、同じ提示ベクターを用いて、ファージ及び細菌細胞又は／及び酵母細胞又は／及び哺乳動物細胞などの、複数種の表面上で関心のあるタンパク質を提示することができる。さらに、この提示系は、異種間提示法の機能を提供する。例えば、開示されるベクターセットを用いて、ファージ又は細菌細胞などの原核細胞系において関心のあるタンパク質を提示することができ、続いて、ベクターの分子操作を何ら行うことなく、このタンパク質又は、タンパク質の組み換えライブラリの場合、関心のあるタンパク質（複数形）を、酵母又は哺乳動物細胞などの真核細胞の表面上で提示することもできる。本発明の各提示系は、提示ベクターの特定のセットを利用する。本発明の様々なベクターセットは、特定の遺伝子パッケージ又は宿主細胞に特異的なヘルパーベクターと組み合わせて、第一のアダプター（即ちアダプター１）に融合したポリペプチド配列のライブラリをコードする複数種発現ベクターを含む。各ヘルパーベクターは、第二のアダプター（即ちアダプター２）に融合した細胞表面アンカータンパク質を含む。本明細書中で示されるように、対応するアダプターを含むヘルパーベクターと組み合わせた複数種提示ベクターの同時発現によって、アダプター（即ちアダプター１及びアダプター２）の対をなす相互作用を介してその表面上で提示されるポリペプチド配列のレパートリーを有する遺伝子パッケージ（又は宿主細胞）集団が作製される。
【００６９】
ベクターの成分
アダプター
本提示系の提示及びヘルパーベクターを構築するために適用可能なアダプター配列は、様々な起源由来であり得る。一般に、安定した多量体の形成に関与する何らかのタンパク質配列はアダプター配列候補である。このように、これらの配列は、何らかのホモ多量体又はヘテロ多量体タンパク質複合体由来であり得る。代表的ホモ多量体タンパク質は、ホモ二量体受容体（例えば血小板由来増殖因子ホモ二量体ＢＢ（ＰＤＧＦ）、ホモ二量体転写因子（例えばＭａｘホモ二量体、ＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）ホモ二量体）及び増殖因子（例えば神経栄養因子ホモ二量体）である。ヘテロ多量体タンパク質の非限定例は、タンパク質キナーゼ及びＳＨ２−ドメイン含有タンパク質の複合体（Ｃａｎｔｌｅｙら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７６７ ７７８；Ｃａｎｔｌｅｙら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４４）：２６０２９ ２６０３２）、ヘテロ二量体転写因子及びヘテロ二量体受容体である。
【００７０】
以下に限定されないが、増殖因子に結合する受容体（例えばヘレグリン）、神経伝達因子（例えばγ−アミノ酪酸）及びその他の有機又は無機小分子（例えば鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）を含む、非常に多数のヘテロ二量体受容体が知られている。好ましいヘテロ二量体受容体は、核ホルモン受容体（Ｂｅｌｓｈａｗら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９３（１０）：４６０４−４６０７）、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２受容体複合体及びＧ−タンパク質共役受容体（以下に限定されないが、オピオイド（Ｇｏｍｅｓら、（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０（２２）：ＲＣ１１０）；Ｊｏｒｄａｎら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９９：６９７ ７００）、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン及びＧＡＢＡ．ｓｕｂ．Ｂの受容体ファミリーを含む。）である。既知のヘテロ二量体受容体の大多数の場合、それらのＣ末端配列がヘテロ二量体形成に介在することが分かっている。
【００７１】
ＧＡＢＡＢ−Ｒ１／ＧＡＢＡ−Ｒ２受容体は、上記の物理的特性を示す。これらの２つの受容体は、基本的に、生理的条件下（例えばインビボ）及び生理的体温でホモ二量体を形成することができない。Ｋｕｎｅｒら及びＷｈｉｔｅらによる研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８３：７４ ７７）；Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９６：６７９ ６８２））は、インビボでのＧＡＢＡＢＲ１及びＧＡＢＡＢＲ２Ｃのヘテロ二量体形成特異性を示した。実際、Ｗｈｉｔｅらは、このヘテロ二量体受容体ペアの独占的な特異性に基づき、酵母細胞からＧＡＢＡ．ｓｕｂ．Ｂ−Ｒ２をクローニングすることができた。Ｋａｍｍｅｒｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８：１３２６３-１３２６９）によるインビトロ実験は、生理的体温でアッセイした場合、生理的緩衝液条件下でＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２Ｃ末端配列の両方とも、ホモ二量体を形成することができないことを示した。具体的に、Ｋａｍｍｅｒｅｒらは、沈降実験によって、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２のヘテロ二量体形成配列は、単独で試験した場合、生理的条件下及び生理的体温で単量体の分子量で沈降することを明らかにした。等モル量で混合した場合、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２ヘテロ二量体形成配列は、この２つの配列のヘテロ二量体に対応する分子量で沈降する（Ｋａｍｍｅｒｅｒらの表１参照）。しかし、ＧＡＢＡＢＲ１及びＧＡＢＡＢＲ２Ｃ末端配列がシステイン残基に連結される場合、ジスルフィド結合の形成を介してホモ二量体が生じ得る。
【００７２】
本提示系において、アダプターとして多量体形成に関与する多様なコイルドコイルを使用することができる。好ましいコイルドコイルはヘテロ二量体受容体由来である。従って、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２由来のコイルドコイルアダプターを包含する。ある態様において、本コイルドコイルアダプターは、本明細書中でＧＲ１と呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体１のＣ末端配列（配列番号１９）ＥＥＫＳＲＬＬＥＫＥＮＲＥＬＥＫＩＩＡＥＫＥＥＲＶＳＥＬＲＨＱＬＱＳＶＧＧＣ及び本明細書中でＧＲ２と呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体２の配列（配列番号２０）ＴＳＲＬＥＧＬＱＳＥＮＨＲＬＲＭＫＩＴＥＬＤＫＤＬＥＥＶＴＭＱＬＱＤＶＧＧＣを含む。
【００７３】
この例は、アダプター配列の同じ対を含むベクターセットの使用を述べるが（発現ベクター１に関連してアダプター１と呼ばれ、ヘルパー提示ベクターに関連してアダプター２と呼ばれる。）、代替的アダプターを用いて、本明細書中に記載のベクターを調製することができ、本発明の方法を実施することができることを理解されたい。例えば、本明細書中で提供される開示に基づき、適切なアダプター配列は、例えばＷｉｎｚｉｐ−Ａ２Ｂ１（Ｋａｔｊａ Ｍ Ａｒｎｄｔら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００２、１０：１２３５−１２４８）；Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ１Ｂ１（Ｋａｔｊａ Ｍ Ａｒｎｄｔら、ＪＭＢ、２０００、２９５：６２７−６３９）；ＦＮｆｎ１０（Ｓａｎｊｉｂ Ｄｕｔｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５、１４：２８３８−２８４８）、ＩＡＡＬ−Ｅ３／Ｋ３（Ｊｅｎｉｆｅｒ Ｒ．Ｌｉｔｏｗｓｋｉ及びＲｏｂｅｒｔ Ｓ Ｈｏｄｇｅｓ、ＪＢＣ、２００２、２７７（４０）：３７２７２−３７２７９）、ＰｃｒＶ／ＰｃｒＧ（Ｍａｘ Ｎａｎａｏら、ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３：１−９）、ｂＺｉｐ及び誘導体（Ｊｕｍｉ Ａ．Ｓｈｉｎ、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４、７６（７−８）：１５７９−１５９０）、ＥＳＣＲＴ−Ｉ／ＩＩ（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｇｉｌｌら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００７、２６：６００−６１２）、ＥＥ１２３４／ＲＲ１２３４及び誘導体（Ｊｏｈｎｔｈａｎ Ｒ．Ｍｏｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１０：６４９−６５５）、Ｌａｍｉｎｉｎ ａ、ｂ、ｇ（Ａｔｓｕｓｈｉ Ｕｔａｎｉら、ＪＢＣ １９９５、２７０（７）：３２９２−３２９８）、ペプチドＡ／Ｂ及び誘導体（Ｉｌｉａｎ Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ及びＨａｎｓ Ｒｕｄｏｌｆ Ｂｏｓｓｈａｒｄ、ＪＭＢ、１９９６、２６３：３４４−３５８）、人工的に設計されたペプチド（Ｄｅｒｅｋ Ｎ．Ｗｏｏｌｆｓｏｎ及びＴｏｍ Ａｌｂｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４：１５９６−１６０７）、ＤｃｏＨ−ＨＮＦ−ｐｌ（Ｒｏｂｅｒｔ．Ｂ．Ｒｏｓｅら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２０００、７（９）：７４４−７４８）及びＡＰＣペプチド（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｌ．Ｄａｙ及びＴｏｍ Ａｌｂｅｒ、ＪＭＢ、２０００、３０１：１４７−１５６）を含む多くのコイルドコイルドメインの何れか由来であり得る。
【００７４】
アダプターサブユニットの特定のペアと会合するアダプターサブユニット相互作用の親和性に依存して、生じたコイルドコイル相互作用を安定させるためにジスルフィド結合を使用する必要がなくなり得る。例えば、上記で列挙するコイルドコイルドメインの一部に対する文献で報告される親和性は、．００００１ｎＭから７０ｎＭ（Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ２Ｂ１に対して４，５ｎＭ、Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ１Ｂ１に対して２４ｎＭ、ＦＮｆｎ１０に対して３ｎＭ、ＩＡＡＬ−Ｅ３／Ｋ３に対して７０ｎＭ、ＰｃｒＶ／ＰｃｒＧに対して１５，６ｎＭ及びＥＥ１２３４／ＲＲ１２３４及び誘導体に対して０．０００１ｎＭ）の範囲である。アダプターとしての使用に適切な代替的ヘテロ二量体転写因子には、α−Ｐａｌ／Ｍａｘ複合体及びＨｏｘ／Ｐｂｘ複合体が含まれる。Ｈｏｘは、胚形成中、前後軸のパターン形成に関与する転写因子の大きなファミリーに相当する。Ｈｏｘタンパク質は、保存された３個のアルファへリックスホメオドメインを有するＤＮＡと結合する。特異的ＤＮＡ配列と結合するために、Ｈｏｘタンパク質は、Ｐｂｘホメオドメインなどのヘテロ−パートナーの存在を必要とする。Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒらは、Ｈｏｘ−Ｐｂｘ複合体形成がどのように起こり、この複合体がどのようにＤＮＡに結合するかを理解するために、ＨｏｘＢ１−Ｐｂｘ１−ＤＮＡ三次元複合体の２．３５．ＡＮＧ．結晶構造を解析した。この構造から、各タンパク質のホメオドメインが、ＤＮＡの反対側において、隣接認識配列に結合することが示される。ヘテロ二量体形成は、ＨｏｘＢ１のホメオドメインに対する６個のアミノ酸ヘキサペプチドＮ−末端の間に形成される接触及びヘリックス３とへリックス１及び２との間に形成されるＰｂｘ１のポケットを通じて起こる。Ｐｂｘ１ホメオドメインのＣ末端伸長によって、へリックス１に対して密集するアルファへリックスが形成され、より大きな４個のへリックスホメオドメインが形成される（Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒら、（１９９９）Ｃｅｌｌ ９６：５８７ ５９７；Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９１：５２１ ５３０）。
【００７５】
例えば、新規へテロ多量体タンパク質からの配列をアダプターとして使用することができる。このような状況において、ヘテロ多量体の形成に関与する候補配列の同定は、過度の実験を行わずに、何らかの遺伝学的又は生化学的アッセイにより行うことができる。さらに、コンピュータモデリング及び検索技術によって、さらに、関連及び非関連遺伝子で見られる共通ドメインの配列相同性に基づくヘテロ多量体配列の検出が容易になる。相同性検索を可能にするプログラムの非限定例は、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、Ｆａｓｔａ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｐａｃｋａｇｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｃｌｕｓｔｌａｗ、ＴＯＦＦＥＥ、ＣＯＢＬＡＴＨ、Ｇｅｎｔｈｒｅａｄｅｒ及びＭｅｇＡｌｉｇｎが含まれる。標的受容体又はそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含有する何らかの配列データベースを配列分析のために使用することができる。一般によく使用されるデータベースには、以下に限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ及びＨＴＧＳが含まれる。
【００７６】
ヘテロ二量体形成配列由来の適切なアダプターは、その物理的特性に基づくさらなる特徴を有する。好ましいヘテロ二量体形成配列は、対をなす親和性を示し、結果として、ホモ二量体は実質的に除外され、ヘテロ二量体の形成が主となる。好ましくは、主な形成は、生理的緩衝液条件下及び／又は生理的体温で形成することを可能とする、少なくとも６０％のヘテロ二量体、より好ましくは少なくとも８０％のヘテロ二量体、より好ましくは８５−９０％の間のヘテロ二量体及びより好ましくは９０−９５％の間のヘテロ二量体及びさらにより好ましくは９６−９９％の間のヘテロ二量体を含有するヘテロ多量体プールをもたらす。本発明のある実施形態において、アダプターペアのヘテロ二量体形成配列の少なくとも１つは、生理的緩衝液条件下及び／又は生理的体温でホモ二量体を形成することが基本的に不可能である。「基本的に不可能」とは、選択されたへテロ二量体形成配列が、単独で試験した場合、Ｋａｍｍｅｒｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３ １３２６９）で詳述されるようなインビトロ沈降実験又はインビボ２−ハイブリッド酵母分析（例えばＷｈｉｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９６：６７９−６８２参照）において検出可能量のホモ二量体が生成されないことを意味する。さらに、個々のヘテロ二量体形成配列を宿主細胞で発現させることができ、宿主細胞におけるホモ二量体の欠如は、以下に限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット及び免疫沈降を含む様々なタンパク質分析によって示すことができる。インビトロアッセイは、生理的緩衝条件下及び／又は好ましくは生理的体温において実行しなければならない。一般に、生理的緩衝液は、塩の生理的濃度を含有し、約６．５から約７．８、好ましくは約７．０から約７．５の範囲の中性ｐＨに調整される。様々な生理的緩衝液はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出で挙げられており、従って、本明細書中では詳述しない。好ましい生理的条件は、Ｋａｍｍｅｒｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８：１３２６３−１３２６９）で述べられている。
【００７７】
アダプターはさらにその二次構造に基づく特徴を有する。好ましいアダプターは、コイルドコイルへリックス構造に適した両親媒性ペプチドからなる。へリックスコイルドコイルは、タンパク質における主要なサブユニットオリゴマー形成配列の１つである。一次配列分析から、全タンパク質残基のおよそ２ ３％がコイルドコイルを形成することが分かる（Ｗｏｌｆら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：１１７９ １１８９）。よく特徴が分かっているコイルドコイル含有タンパク質には、細胞骨格ファミリーのメンバー（例えばアルファ−ケラチン、ビメンチン）、細胞骨格モーターファミリー（例えばミオシン、キネシン及びダイニン）、ウイルス膜タンパク質（例えばエボラ又はＨＩＶの膜タンパク質）、ＤＮＡ結合タンパク質及び細胞表面受容体（例えばＧＡＢＡＢ受容体１及び２）が含まれる。
【００７８】
本発明のコイルドコイルアダプターは、左巻き及び右巻きコイルドコイルという２つの群に大きく分類することができる。左巻きコイルドコイルは、好ましくは第一（ａ）及び第四（ｄ）の位置に位置する無極性残基が生じる、「ａｂｃｄｅｆｇ」で表される７残基反復を特徴とする。これらの２箇所の残基は通常、ぴったりとした疎水性コアを形成するために他方のスタンドのものとかみ合う「取っ手と穴」のジグザグパターンを構成する。一方、コイルドコイルの周囲をカバーする第二（ｂ）、第三（ｃ）及び第六（ｆ）の位置は、好ましくは荷電残基である。荷電アミノ酸の例には、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性残基及び、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンなどの酸性残基が含まれる。ヘテロ二量体コイルドコイルを設計するのに適切な非電荷又は無極性アミノ酸には、以下に限定されないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンが含まれる。非電荷残基は一般に疎水性コアを形成するが、一方、全体的へリックコイルドコイル構造を安定化させるために、コア位置でさえも荷電残基を含む、へリックス間及びヘリックス内塩−架橋を使用し得る（Ｂｕｒｋｈａｒｄら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１６７２ １１６７７）。様々な長さのコイルドコイルを使用し得るが、本コイルドコイルアダプターは、好ましくは、２から１０の７残基反復を含有する。より好ましくは、このアダプターは、３から８の７残基反復を含有し、さらにより好ましくは、４から５の７残基反復を含有する。
【００７９】
最適なコイルドコイルアダプターの設計において、ペプチドの二次構造を予想する様々な既存のコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。実例となるコンピュータ分析は、アミノ酸配列を既知の２本鎖コイルドコイルのデータベース中の配列と比較し、高確率のコイルドコイルストレッチを予想する、ＣＯＩＬＳアルゴリズムを使用する（Ｋａｍｍｅｒｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３ １３２６９）。設計及び選択に基づき、ナノモルからフェントモル（ｆｅｎｔｏｍｏｌｅ）領域の親和性を有する様々な改変コイルドコイル配列が報告された（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００２、１０（９）：１２３５−４８；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００、２１；２９５（３）：６２７−３９；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５、１４（１１）：２８３８−４８；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２、２７７（４０）：３７２７２−９；ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３、１８；３：２１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１０：６４９−６５５）。例えば、ヒトＢ−ＺＩＰ由来の再設計ヘテロ二量体コイルドコイル配列の解離定数はフェントモルであり、これは、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用に対するものと同様である。
【００８０】
好ましいコイルドコイルアダプターの別のクラスは、ロイシンジッパーである。ロイシンジッパーは、当技術分野で、６個のアミノ酸で互いに隔てられている４−５個のロイシン残基を含有する約３５アミノ酸の一続きとして定義されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ及びＡｂｅｌ、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：２４）。ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物などの様々な真核細胞ＤＮＡ−結合タンパク質で生じることが分かった。これらのタンパク質において、ロイシンジッパーは、ロイシンジッパーを含有するタンパク質が安定したホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成し得る、二量体形成面を生成させる。２個の癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎによりコードされるタンパク質産物の分子分析から、このような選択的ヘテロ二量体形成のケースが明らかになった（Ｇｅｎｔｚら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６９５；Ｎａｋａｂｅｐｐｕら（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５：９０７；Ｃｏｈｅｎら（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１７３）。Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域を含む合成ペプチドはヘテロ二量体形成に介在することも分かっており、分子間ジスルフィド結合を可能にするために合成ペプチドそれぞれのアミノ末端がシステイン残基を含む場合、ヘテロ二量体形成が起こり、ホモ二量体形成が実質的に排除される。
【００８１】
本発明のロイシン−ジッパーアダプターは、７残基の繰り返しとして知られる一般構造式（ロイシン−Ｘ．ｓｕｂ−Ｘ．ｓｕｂ１−Ｘ．ｓｕｂ．３−Ｘ．ｓｕｂ．４−Ｘ．ｓｕｂ．５−Ｘ．ｓｕｂ．６）．ｓｕｂ．ｎを有するが、式中、Ｘは、従来の２０種類のアミノ酸の何れかであり得るが、例えばアラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びリジン及びなど、アルファ−へリックス形成能のあるアミノ酸である可能性が最も高く、ｎは２以上であるが、通常ｎは３から１０、好ましくは４から８、より好ましくは４から５である。好ましい配列は、Ｆｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパー配列である。
【００８２】
Ｌ及びＨ鎖の二量体化に関与する抗体鎖の配列も、本提示系を構築するためにアダプターとして使用することができる。これらの配列には、以下に限定されないが、Ｌ又はＨ鎖の定常領域配列が含まれる。さらに、アダプター配列は、抗原−結合部位配列及びその結合抗原由来であり得る。このような場合、その対の一方のアダプターは、対応する抗原残基を含有する他方のアダプターにより認識される（即ち、安定して会合できる）抗原結合部位アミノ酸残基を含有する。
【００８３】
第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用は共有又は非共有相互作用であり得る。非共有相互作用は、結果として共有結合が形成されない全ての既存の安定的連結を包含する。非共有相互作用の非限定例には、静電結合、水素結合、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチドの立体相互嵌合が含まれる。一方、共有相互作用の結果、以下に限定されないが、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合、２個の炭素含有分子間のＣ−−Ｃ結合、炭素とそれぞれ酸素又は水素含有分子との間のＣ−−Ｏ又はＣ−−Ｈ及び酸素とリン酸含有分子との間のＯ−−Ｐ結合を含む共有結合が形成される。
【００８４】
遺伝子の巨大なファミリーにおける豊富な遺伝学及び生化学データに基づき、当業者は、過度な実験を行わずに、本提示系を構築するために、適切なアダプター配列を選択し、得ることができる。
【００８５】
外面アンカータンパク質
ファージ提示のための適切なアンカータンパク質には、何れかのコートタンパク質、例えばｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸなど、又はこのようなコートタンパク質のドメイン又は発明者らのファージ粒子の表面に集合させられるかもしくはこれに連結される何らかの人工配列が含まれる。本明細書中の実施例７で示されるように、ヘルパーベクター ＹＧＭＣＴを用いることにより、ファージ上でｓｃＦｖ抗体が提示されたが、この場合、外膜アンカータンパク質は図４で示されるｐＩＩＩのＣ末端ドメインである。
【００８６】
細菌提示のための適切なアンカータンパク質には、細菌外膜タンパク質、例えば、線毛及び鞭毛、リポタンパク質、氷核タンパク質及びオートトランスポーターが含まれる。あるいは、このアンカータンパク質は、Ｅ．コリの外面に集合させられるか又はこれに連結される人工配列であり得る。本明細書中で示されるように、実施例２９−３２は、ヘルパーベクターｐＭＡＬ１及びｐＭＡＬ２を用いることによるｓｃＦｖ抗体提示を示し（図１５）、この場合、細菌外面ドメインＬｐｐ−ＯｍｐＡは外面アンカータンパク質である。
【００８７】
酵母提示の場合、適切な外面アンカータンパク質は、ＧＰＩシグナルを有するか又は持たない外壁タンパク質の何れかであり得、これには、Ｓ．セレビシエにおける、ａ−アグルチニン（Ａｇａ１及びＡｇａ２；注記：ＧＰＩありでＡｇａ１及びＧＰＩなしでＡｇａ２）、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ４及びＩｃｗｐ；メタノール資化酵母（ハンセヌラ・ポリモルファ）における、ＨｐＳＥＤ１、ＨｐＧＡＳ１、ＨｐＴＩＰ１、ＨＰＷＰ１及びカンジダ・アルビカンスにおける、Ｈｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ｒｂｔ５ｐが含まれる。あるいは、本発明の方法は、酵母の外壁に集合させられるか又はこれに連結させることができる人工配列である細胞表面アンカーを用いて、酵母に関連して実施することができる。本明細書中で示されるように、実施例１８は、ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８を使用することによるｓｃＦｖ抗体の酵母提示を示すが、この場合、酵母外面アンカータンパク質は、図１１で示される、Ｆｌｏ１又はＣｗｐ２又はＡｇａ２のＣ末端ドメイン由来である。
【００８８】
表面アンカーとして、何らかの既知の細胞膜タンパク質の膜貫通ドメイン又はＧＰＩアンカー配列を有するポリペプチド又は非切断タイプＩＩシグナルアンカー配列を用いて、哺乳動物細胞表面提示を実施することができる。あるいは、本発明の方法は、哺乳動物細胞の細胞膜に集合させるか又はこれに連結させることができる人工配列である細胞表面アンカーを用いて、哺乳動物細胞に関連して実施することができる。本明細書中で示されるように、実施例８は、ヘルパーベクターｐＭＡＧ２（図５）を使用することによる、哺乳動物細胞上でのｓｃＦｖタンパク質の提示を示し、この場合、アダプター２に融合するヒトＥＧＦ受容体の膜貫通ドメインが提示のための表面アンカーとして使用される。
【００８９】
シグナル配列
同じ一般的な系列に従って、原核及び真核両方からのシグナル配列が構築される。これらは、約１５−３０アミノ酸長であり、３つの領域：正荷電Ｎ末端領域、中央の疎水性領域及びより極性が大きいＣ末端領域からなる。原核及び真核細胞系のシグナルペプチド間で、大きな機能的及び構造相同性がある。従って、一部のネイティブシグナルペプチドが原核及び真核細胞の両方で機能すると予想される。
【００９０】
予想と一致して、一部の真核シグナルペプチドは、原核細胞において機能的であることが報告されている。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びラットプロインスリンタンパク質からのシグナルペプチドはＥ．コリで機能し（Ｇｅｎｅ、１９８５、３９：２４７−２５４）；エンド−β−１，３−グルカナーゼの酵母シグナルペプチドもまたＥ．コリで機能的である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ．、２０００、２０：２５２−２６４）。さらに、ブドウ球菌タンパク質Ａ、細菌ｂ−ラクタマーゼタンパク質及び細菌ＯｍｐＡの原核シグナルペプチドは哺乳動物細胞で機能的である（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．２０００、２０：２５２−２６４）。本明細書中で示されるように、実施例６及び７は、ヒト成長ホルモン１からのシグナルペプチドがｓｃＦｖ分泌及びファージ提示に対してＥ．コリ細胞において機能したことを示した。同様に、エンド−β−１，３−グルカナーゼの酵母シグナルペプチドは、本発明において実施例１６及び１７で示されたｓｃＦｖ分泌及びファージ提示について、Ｅ．コリにおいて機能的であった。
【００９１】
酵母及び哺乳動物細胞の間にわたり作用するシグナルペプチドの例は、ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）、ヒトインターフェロン、ヒト胆汁塩刺激性リパーゼ及び酵母サッカロミセス・セレビシエ インベルターゼ（ＳＵＣ２）に対するシグナルペプチドである（Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９９６、１８０：２９７−３０８；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ．、２００６、４７：４１５−４２１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ、１９９８、１４：４２５−４３３）。本明細書中で示されるように、実施例２２は、酵母／哺乳動物異種間提示のためのヒト膵臓リパーゼタンパク質１のシグナルペプチドの使用を示す。
【００９２】
本発明の複数種発現ベクターのためのシグナルペプチドとして、複数種で機能する能力について上記で同定されたネイティブシグナルペプチドの何れかを使用し得る。さらに、本明細書中で開示される方法を実施するために、様々な種の宿主細胞間で機能する能力を特徴とする人工シグナルペプチド配列を使用することもできる。この開示の実施例２８に記載の方法又は何らかのその他の方法によって、設計シグナルペプチドライブラリから人工シグナルペプチドを単離し得る。
【００９３】
本発明のベクターは、一般に、外来ポリペプチドを発現させるのに必要とされる転写又は翻訳調節配列を含む。適切な転写又は翻訳調節配列には、以下に限定されないが、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位及び転写及び翻訳に対する終結部位が含まれる。
【００９４】
複製起点（一般にｏｒｉ配列と呼ばれる。）により、適切な宿主細胞において、ベクターの複製が可能になる。ｏｒｉの選択は、使用される宿主細胞及び／又は遺伝子パッケージのタイプに依存する。宿主細胞が原核細胞であり、遺伝子パッケージがファージ粒子である場合、発現ベクターは通常、２個のｏｒｉ配列を含み、１つは原核細胞内でのベクターの自己複製を支配し、他方のｏｒｉはファージ粒子のパッケージングを支持する。好ましい原核細胞ｏｒｉは、細菌細胞においてベクター複製を支配することができる。ｏｒｉのこのクラスの非限定例には、ｐＭＢ１、ｐＵＣならびにその他のＥ．コリ起点が含まれる。ファージ粒子のパッケージングを支持する好ましいｏｒｉには、以下に限定されないが、ｆ１、ｏｒｉ、Ｐｆ３ファージ複製ｏｒｉが含まれる。ファージ提示のために、本発明において、例えば、ｐＵＣ ｏｒｉ及びｆ１ ｏｒｉが、異種間発現ベクターにおいて構築される。
【００９５】
真核細胞系において、高等真核細胞は、複数のＤＮＡ複製起点を含有する（１０４−１０６ｏｒｉ／哺乳動物ゲノムと推定される。）が、ｏｒｉ配列はあまり明確に定められていない。哺乳動物ベクターに対する適切な起点は通常、真核ウイルス由来である。好ましい真核ｏｒｉには、以下に限定されないが、ＳＶ４０ ｏｒｉ、ＥＢＶ ｏｒｉ、ＨＳＶ ｏｒｉが含まれる。酵母細胞に対する適切なｏｒｉには、以下に限定されないが、２ｕ ｏｒｉ ＣＥＮ６／ＡＲＳ４ ｏｒｉが含まれる。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、ある種の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモーターから下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。これは構成的又は誘導可能であり得る。一般に、プロモーター配列は、転写開始部位がその３’末端で結合し、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の塩基又はエレメントを含むように上流に伸びる（５’方向）。プロモーター配列内部は、転写開始部位ならびに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインである。
【００９７】
真核プロモーターは、必ずしもそうではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。
【００９８】
プロモーターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に大きく依存する。原核細胞の場合、様々な強力なプロモーターが当技術分野で公知である。好ましいプロモーターは、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター及びｐＢＡＤプロモーターである。通常、複数種において外来配列の発現を得るために、原核性プロモーターを真核性プロモーターの直後又は真核性プロモーターの後のイントロン配列内に置くことができる。
【００９９】
その他の真核細胞に対する適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその多の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素及び上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域である。哺乳動物細胞に対する好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｂ−アクチンプロモーター及びそれらのハイブリッドである。酵母細胞に対する好ましいプロモーターには、以下に限定されないが、Ｓ．セレビシエのＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ＴＥＦ１及びＰ．パストリスのＧＡＰ、ＡＯＸ１が含まれる。
【０１００】
本ベクターを構築することにおいて、外来配列に関与する終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び／又は転写終結シグナルを与えるために、転写したい配列の３’末端に挿入する。終止配列は、好ましくは、１以上の転写終結配列（ポリアデニル化配列など）を含有し、転写読み合わせをさらに阻止するためにさらなるＤＮＡ配列を包含することによって延長することもできる。本発明の好ましい終止配列（又は終結部位）は、転写終結配列、それ自身の終止配列又は異種終止配列の何れかが続く遺伝子を有する。このような終止配列の例には、当技術分野で公知の、広く利用可能で、下記で例を挙げる、様々な酵母転写終結配列又は哺乳動物ポリアデニル化配列に連結された終止コドンが含まれる。ターミネーターが遺伝子を含む場合、検出可能な又は選択可能なマーカーをコードする遺伝子を使用することは有利であり得；それにより、終止配列の存在及び／又は不在（及び、従って、転写単位の対応する不活性化及び／又は活性化）を検出及び／又は選択することができる手段が得られる。
【０１０１】
上記のエレメントに加えて、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、そのベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含有し得るが、宿主細胞に同時に導入される別のポリヌクレオチド配列でこのようなマーカー遺伝子を持ち込むことができる。選択条件下で、選択可能遺伝子を導入された宿主細胞のみが生存及び／又は増殖する。一般的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他の毒素、例えばアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキセートなどに対する耐性を与える；（ｂ）栄養要求性欠損を補完する；又は（ｃ）複合培地から得ることができない不可欠な栄養素を補給するタンパク質をコードする。適正なマーカー遺伝子の選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主に対する適切な遺伝子が当技術分野で公知である。
【０１０２】
本発明のある実施形態において、発現ベクターは、少なくとも２種類の無関係の発現系で複製可能なシャトルベクターである。このような複製を促進するために、本ベクターは通常、少なくとも２つの複製起点を含有し、各発現系で１つが有効である。通常、シャトルベクターは、真核細胞発現系及び原核細胞発現系で複製可能である。これにより、真核生物宿主（発現細胞型）でのタンパク質発現の検出及び原核生物宿主（増幅細胞型）でのこのベクターの増幅が可能になる。好ましくは、１つの複製起点はＳＶ４０由来であり、１つはｐＵＣ由来であるが、それがベクターの複製を支配するならば、当技術分野で公知の何れかの適切な起点を使用し得る。ベクターがシャトルベクターである場合、ベクターは、好ましくは、少なくとも２つの選択可能マーカーを含有し、１つは発現細胞型に対するものであり、１つは増幅細胞型に対するものである。それが利用される発現系で機能するならば、当技術分野で公知の何れかの選択可能マーカー又は本明細書中に記載のものを使用し得る。
【０１０３】
組み換えクローニング法を用いて及び／又は化学合成により、本発明に包含されるベクターを得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化及び核酸連結などの膨大な数の組み換えクローニング技術が当技術分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。当業者はまた、当技術分野で利用可能な何らかの合成手段によって所望のベクターを得るために、本明細書中で与えられる配列データ、又は公開もしくは私有のデータベースの配列データを使用することもできる。さらに、周知の制限及び核酸連結技術を用いて、様々なＤＮＡソースから適切な配列を切り出し、本発明に従い発現させるべき外来配列と操作可能な関係で組み込むことができる。
【０１０４】
本開示とともに提供される実施例及び図面は、原核及び真核細胞系での関心のあるタンパク質の複数種及び異種間提示における本発明の実施を例示する。次の実施例は、本発明の実施形態を例示するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。本開示を読むことから、多くの変更及び変形が当業者にとって明らかとなろう。かかる変更及び変形は本発明の一部をなす。
【０１０５】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技術内である、細胞生物学、分子生物学、細胞培養などの従来の技術を使用する。本明細書中で引用される刊行物及び特許出願は全て、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【０１０６】
抗−ＶＥＧＦ抗体に対するコード配列を用いて本発明の様々な組成物及び方法（複数種及び異種間提示ストラテジー）を本明細書中で例示するが、当業者にとって当然のことながら、抗体探索及び操作プロトコールを遂行するために、本発明の発現及び提示ベクターセットにおいて、抗体配列の様々なライブラリをコードする発現カセットのライブラリを使用することができる。
【０１０７】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組み換えＤＮＡの従来の技術を使用するが、これらは当技術分野の技術の範囲内である。例えば、ＰＨＡＧＥ ＤＩＳＰＬＡＹ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ（Ｂ．Ｋ．Ｋａｙら、１９９６）；ＰＨＡＧＥ ＤＩＳＰＬＡＹ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら、２００１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第二版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、（１９８７））；一連のＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））。
【０１０８】
ファージ及び哺乳動物細胞異種間提示系
【実施例１】
【０１０９】
提示ベクターｐＭＡＧ１
ベクターｐＭＡＧ１は、異種間提示での使用に適切な発現ベクター及び、ポリペプチドライブラリが原核細胞提示系（ファージ及び細菌細胞）で提示及び／又は産生され、続いて真核細胞提示系（哺乳動物細胞）で提示及び／又は産生される作製プロトコール（図２Ａで示す。）の範例となる。
【０１１０】
図２Ａで示されるｐＭＡＧ１ベクターは、ＥｃｏＲＩ及びＰｃｉＩ部位を３７９９ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片とともに挿入することにより、市販のベクター、ｐＵＣ１９の骨格において構築される。この完全合成ＤＮＡは次のエレメント：（１）ファージパッケージのためのｆ１ ｏｒｉ；（２）異種間発現カセット（ここでアダプターＧＲ１融合物の発現は２つのプロモーター、哺乳動物細胞に対するＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター及び細菌細胞に対するｐＬａｃプロモーターにより支配される。）を含む。関心のある遺伝子クローニングに対する多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列は、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞で機能を有するヒト成長ホルモン１からのシグナル配列の下流に構築される。ＨＡ−Ｈｉｓ６タグ（ＤＨ−タグ）配列は、タンパク質検出及びＮｉ−ＮＴＡ精製のため、ＧＲ１配列（アダプター１）（配列番号１９）に対するコード配列の上流である。（３）哺乳動物細胞選択マーカーネオマイシンに対する発現カセット。
【０１１１】
簡潔に述べると、遺伝子合成には、Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｂｉｏｆａｂプラットフォーム技術（Ｂｏｓｔｏｎ）を使用することによる遺伝子合成のために、１３７９、１２２７及び１２８７ｂｐの３片のセグメントに合成ＤＮＡを分割することが含まれた。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列のあるこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片に核酸連結し、次にこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、得られたベクター配列（配列番号１）を確認した。
【実施例２】
【０１１２】
提示ベクターｐＭＡＧ９
ベクターｐＭＡＧ９（配列番号２）は、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体 ｓｃＦｖをコードする遺伝子を挿入することによって、ｐＭＡＧ１ベクターから得られた。当業者にとって当然のことながら、様々な様式の抗体をコードするコード配列のライブラリを提示するためにｐＭＡＧ９を使用することができる。ＰＣＲによりｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。簡潔に述べると、ｐＡＢＭＸ２６８（米国特許出願第２００４０１３３３５７Ａ１号）ＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲプライマーは下記で列挙した：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３（配列番号４）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に従い、ｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによって、ＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件を次のように設定した：９４℃で３分間変性させ；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング及び７２℃で１分３０秒間伸長反応を３０サイクル行い；次に、７２℃で１０分間のポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＧ１ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によりｓｃＦｖの配列を確認した。得られたｐＭＡＧ９ベクターを図２Ｂで示す。
【０１１３】
ＤＮＡ複製のためのｐＵＣ ｏｒｉ、アンピシリン選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子及びファージミドＤＮＡパッケージのためのｆ１ ｏｒｉを有するので、このベクターはＥ．コリ細胞で機能する。さらに、ｓｃＦｖ−アダプターＧＲ１の融合物の転写及び発現は、Ｅ．コリ細胞においてｐＬａｃプロモーターにより、及び哺乳動物細胞においてニワトリｂ−アクチンプロモーターにより駆動される。哺乳動物及び細菌細胞の両方で機能を有するヒト成長ホルモンＩのシグナルペプチド（Ｇｅｎｅ、１９８５、３９：２４７−２５４）は哺乳動物及び細菌細胞両方で分泌経路を通じてアダプター融合タンパク質を支配する。
【実施例３】
【０１１４】
ファージヘルパーベクターＧＭＣＴ
特徴がよく分かっているベクター、即ちＭ１３ＫＯ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａより）から、下記で詳述する手段に従い２段階でベクターＧＭＣＴを構築した。第一段階において、ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発により、ＫＯ７ヘルパーファージベクターの遺伝子ＩＩＩシグナル配列にＫｐｎＩ部位を導入した。このサイレント突然変異によって、ｐＩＩＩシグナルペプチドのコード配列は変化しなかった。ＫｐｎＩ部位を含有する次のプライマーを用いてＰＣＲによりＫＯ７ゲノムを増幅した：ｐ３ＫＮＩ：５’−ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧ−３’（配列番号５）及びｐ３ＫＮ２：５’−ＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’（配列番号６）。これらのプライマーは、遺伝子ＩＩＩシグナル配列と相同性のある共通の部分配列を有する。１００ｎｇ ＫＯ７ベクターＤＮＡ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、２５０μＭ ｄＮＴＰ及び１Ｘｐｆｕ緩衝液及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する１００μＬ反応混合液中でＰＣＲを行った。反応混合液を最初に約９６℃で温置し、次にサーモサイクラー中で次のようにＰＣＲ１５サイクル：９６℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１０分間伸長を行った。増幅後、産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで切断して核酸連結し、エレクトロポレーションによりＴＧ１細菌細胞に形質転換した。
【０１１５】
細菌細胞をカナマイシン耐性に関して選択した。具体的には、カナマイシン耐性コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの２ＹＴ培地中で増殖させ、ＰＣＲエラーにより生じた機能欠損突然変異を除外するために、ファージＥＬＩＳＡアッセイによって、培養上清をファージスクリーニングに使用した。簡潔に述べると、次のようにファージＥＬＩＳＡを行った：ファージ粒子を含有する上清１００μＬを４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートのコートウェルに対して使用した。ＰＢＳ緩衝液中の５％ミルクで室温にて３０分間ブロッキング処理を行った後、ＥＬＩＳＡプレートに結合したファージ粒子をＨＲＰ−標識抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともに室温で１時間さらに温置した。
【０１１６】
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより遊離抗Ｍ１３抗体を洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収により、ＨＲＰ活性を調べた。全部で４８個のクローンをファージ生成についてスクリーニングした。クローンＣ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９及びＡ１２が図３で示されるようにファージ陽性であった。クローンＢ７、Ｂ９及びＡ１２から抽出されたＤＮＡをＴＧ１培養物から調製した。Ａｃｃ６５Ｉ（ＫｐｎＩのイソシゾマー）及びＢａｍＨＩでベクターＤＮＡを二重消化することによって、６００ｂｐ ＤＮＡ断片が示され、これにより、この３種類のＫＯ７ｋｐｎベクタークローン全てにＫｐｎＩ部位が存在することが確認される。得られたベクターは、遺伝子ＩＩＩコード領域を妨害することなくユニークなＫｐｎＩ制限部位が遺伝子ＩＩＩシグナル配列（改変遺伝子ＩＩＩシグナル、配列番号７）にサイレントに導入されていることを除き、ＫＯ７と同一である。
【０１１７】
ＫＯ７ｋｐｎＢ７ヘルパーベクター中の遺伝子ＩＩＩのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片を合成ＤＮＡ断片（配列番号８）で置換することによって、ＧＭＣＴファージヘルパーベクターを構築した。得られたＧＭＣＴファージベクター（図４）は、改変ｐＩＩＩキャプシドのさらなるコピーをコードし、これには、ＧＲ２ドメイン（配列番号２０）（アダプター２）、改変ｐＩＩＩタンパク質の検出のためのｍｙｃ−ｔａｇ配列及びｐＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴドメイン）が含まれる。この改変遺伝子ＩＩＩの下流、リボソーム結合配列（Ｓ／Ｄ）及び細菌タンパク質ＯｍｐＡからのシグナル配列を遺伝子ＩＩＩ配列に融合させた。遺伝子ＩＩＩ含有配列のこれらの２コピーはオリジナルの遺伝子ＩＩＩプロモーター調節下に置かれる。
【０１１８】
核酸連結したベクターＤＮＡをＴＧ１細胞へと形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの２ＹＴ培地中で増殖させ、上記のようにファージ陽性クローンを選択するために、ファージＥＬＩＳＡアッセイによるファージスクリーニングに対して上清を使用した。１０個以上のクローンがファージ粒子を生成することが分かった。大規模ファージ調製のためにクローン＃３を使用した。
【実施例４】
【０１１９】
ＧＭＣＴヘルパーファージの生成
クローン＃３から生成されたＧＭＣＴヘルパーファージを含有する上清を２ＹＴ寒天プレート上にストリーク播種した。ＴＧ１培養物（ＯＤ６０００−５）０．５ｍＬと混合した軟寒天４ｍＬをプレート上に注いだ。３７℃で一晩温置した後、ファージプラークを形成させた。１個のファージプラークを採取し、７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの１０ｍＬ ２ＹＴ培養液に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで一定に振盪しながら３７℃で２時間温置した後、７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの５００ｍＬの２ＹＴを含有する２Ｌフラスコに培養物を移した。３７℃で一定に振盪しながら培養物を一晩温置した。次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて上清中のファージを沈降させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。ＯＤ２６８の測定によりファージ濃度を調べた。通常、ＯＤ２６８での１単位の読み取りは、上清１ｍＬがおよそ５ｘ１０１２個のウイルウ粒子を含有することを指す。ＧＭＣＴヘルパーファージに対するファージ回収率は、およそ８ｘ１０１１／ｍＬ培養液であり、これは、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージと同様であり、このことから、アダプターＧＲ２−ｐＩＩＩ融合物がファージ粒子集合に影響を与えないことが分かった。
【０１２０】
抗−ＭｙｃタグファージＥＬＩＳＡによって、ヘルパーファージ粒子上のＧＲ２−Ｍｙｃアセンブリーが確認された。簡潔に述べると、抗−Ｍｙｃタグ抗体９Ｅ１０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより）でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ＨＲＰ標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を用いて、９Ｅ１０抗体に結合したファージを検出した。
【実施例５】
【０１２１】
哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２
市販のベクターｐＵＣ１９の骨格において、３１３４ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片を用いてＥｃｏＲＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することにより哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２（図５）を作製した。この完全合成ＤＮＡは、２つの成分：（１）ＳＶ４０ ｏｒｉ／プロモーター及びＳＶ４０ポリＡを伴うＺｅｏｃｉｎ発現カセット；（２）ＣＭＶプロモーターにより駆動され、ＢＧＨポリＡにより停止される、ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）の膜貫通ドメインとのアダプター２（ＧＲ２、配列番号２０）融合物、に対する配列を含む。アダプターＧＲ２融合物に対する分泌シグナル配列はｈＥＧＦＲ由来である。
【０１２２】
簡潔に述べると、ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した合成のために、８０８、７９０、８２９及び８１７ｂｐのセグメント４片に合成ＤＮＡを分割することにより、ベクターを合成した。オリゴ合成から生じたエラーは、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製により修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列付きのこれらのＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片に核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法により、得られたベクター配列（配列番号９）を確認した。
【実施例６】
【０１２３】
ｐＭＡＧ９ベクターを用いた、Ｅ．コリ細胞での可溶性Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）の発現
ヘルパーベクターなしでｐＭＡＧ９発現ベクターを使用すると、アダプター１（ＧＲ１）と組み合わせたコード配列の産物を含む融合タンパク質として、関心のあるタンパク質が発現及び分泌される。
【０１２４】
発現される融合タンパク質を遺伝子パッケージの表面上で提示するためには、対をなすアダプター１（ＧＲ１）と会合することができる第二のアダプター（例えばＧＲ２）とインフレームで融合したアンカータンパク質を含む第二の融合タンパク質を提供するヘルパーベクター存在下での同時発現が必要である。２個のアダプター間の対をなす相互作用によって、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上で関心のあるタンパク質の提示が促進される。
【０１２５】
ヘルパーベクターなしで、ｐＭＡＧ９が発現ベクターとして機能することを示すために、可溶性タンパク質発現のためにｐＭＡＧ９を直接ＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＡＧ９ベクターで形質転換された細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ入りの２ＹＴ培地中で３７℃振盪器でＯＤ６０００．９まで増殖させた。次に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度まで添加し、３０℃振盪器で一晩誘導した。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡアッセイによって、上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を検出した。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ上清を添加し、プレート上を被覆する抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブした。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加して、ＨＲＰ活性を調べた。図６ＡのＥＬＩＳＡから、ｐＭＡＧ９培養上清中の可溶性ｓｃＦｖ抗体が用量依存的にＶＥＧＦ抗原に結合したことが示された。一方、ｐＵＣ１８ベクターを有する陰性対照細胞から生じた上清はＶＥＧＦに対する結合活性がなかった。図６Ａで与えられるこれらの結果から、提示ベクターから発現ベクターへと関心のある遺伝子を移動させる段階を実施する必要なく、Ｅ．コリ細胞において可溶性タンパク質発現を支配することができる発現ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することが分かった。
【０１２７】
さらに、上清及び細胞周辺質抽出物両方から可溶性タンパク質を精製することができる。簡潔に述べると、増殖培地の１／４０体積で、予め冷却したＰＰＢ緩衝液（２００ｍｇ／ｍＬ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で細胞ペレットを再懸濁し、氷上で３０分間温置する。次いで、予め冷却した５ｍＭ ＭｇＳＯ４を用いて上記プロセスを繰り返す。細胞ペレットからの周辺質抽出物及び培養上清を合わせ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに添加する。結合したＨｉｓ−タグタンパク質をＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで溶出する。分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析する。
【実施例７】
【０１２８】
ｐＭＡＧ９を用いたファージ上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
ヘルパーベクターと組み合わせてｐＭＡＧ９ベクターを使用することによって、研究者は、遺伝子パッケージ又は関心のある宿主細胞の表面上に、関心のあるタンパク質又はタンパク質のライブラリを提示することができるようになる。例えば、ファージ表面上でｓｃＦｖを提示するために、実施例４の上記のＧＭＣＴヘルパーファージと組み合わせてｐＭＡＧ９を使用する。
【０１２９】
ｐＭＡＧ９により産生されるｓｃＦｖ−アダプター／ＧＲ１融合タンパク質に存在するアダプター（ＧＲ１）と対をなす組み合わせが可能な第二のアダプター（アダプター２）とインフレームで融合したウイルスコートタンパク質を含む融合タンパク質を発現するヘルパーファージと組み合わせて同時発現される場合、ファージ提示を支配することができる提示ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することを示すために、ｐＭＡＧ９ベクターを有するＴＧ１細胞を１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭＣＴヘルパーファージにより重複感染させた。感染させたＴＧ１細胞を一晩、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地中で３０℃の振盪器中で増殖させた。培養上清中のファージミドウイルス粒子を２回、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁した。
【０１３０】
抗原ＶＥＧＦで被覆したプレートを用いて、ファージＥＬＩＳＡによって、ファージ表面上で提示された１本鎖抗体を検出した。簡潔に述べると、４℃で２μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１００μＬで一晩被覆した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ緩衝液中５％ミルクで室温にて１時間ブロッキング処理した。従って、５％ミルク−ＰＢＳ中の希釈ファージ１００μＬを使用し、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを室温で１時間被覆した。ＥＬＩＳＡプレートに結合したファージ粒子をＨＲＰ−標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともにさらに室温にて１時間温置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより遊離抗Ｍ１３抗体を洗い流した。次に基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収により、ＨＲＰ活性を調べた。図８で示されるＥＬＩＳＡの結果から、ｐＭＡＧ９ベクターを有する重複感染細胞から生成されたファージが用量依存的にＶＥＧＦに結合したことが分かる。陰性対照として、ｐＵＣ１８ベクターを有する細胞から及びｐＭＡＴ６ベクターを有する細胞（図１４Ｂで示される、酵母／哺乳動物異種間提示ベクター）から生成したファージは、ＶＥＧＦに対する結合活性を全く示さなかった。これらの結果から、ファージ提示のためのＰＭＡＧ９／ＧＭＣＴベクターセットの使用が示された。
【実施例８】
【０１３１】
ｐＭＡＧ９を用いた、哺乳動物細胞での可溶性Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の発現
実施例６で行われた実験から、細菌細胞（即ちＥ．コリ）においてｐＭＡＧ９が発現ベクターとして機能することが分かる。ｐＭＡＧ９はまた、異種間発現及び提示ベクターとして機能するように設計された。このベクターの異種間機能性を示すため、哺乳動物細胞での抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ発現及び産生を支配するためにｐＭＡＧ９を使用した。
【０１３２】
簡潔に述べると、フリースタイル２９３Ｆ細胞（ヒト胎児腎臓細胞株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣＯＳ６（形質転換されたサル腎臓細胞）を用いて哺乳動物細胞において可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖを発現させた。ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造者の操作マニュアルに従い形質移入を行った。簡潔に述べると、ｐＭＡＧ９ベクターＤＮＡ １又は２μｇを血清不含培地中で希釈ＦｕＧＥＮＥ６試薬に６：１又は３：１又は３：２の割合で添加した。温置１５分後、ＦｕＧＥＮＥ６試薬ＤＮＡ複合体を６ウェルプレート中の細胞に移した（２ｍＬ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１．０ｘ１０６細胞）。９５％ＣＯ２雰囲気中で７２時間、３７℃で細胞を温置した。ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＧＲ１タンパク質を抗−ＨＡウェスタンブロット分析及び抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで評価するために、上清を回収した。
【０１３３】
ＰｒｏＦｏｕｎｄ ＨＡ Ｔａｇ ＩＰ／Ｃｏ−ＩＰキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従い、抗−ＨＡ抗体ビーズを用いて、培養上清８００μＬから、抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖタンパク質を精製した。ＥＣＬ ｐｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の説明書に従い、精製したｓｃＦｖタンパク質をタンパク質分離用の４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、ウエスタンブロッティング分析のために０．４５ニトロセルロースに転写した。簡潔に述べると、ＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で膜をブロッキング処理し、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに室温で１時間温置した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、１時間温置してペルオキシダーゼ標識抗−マウス抗体で膜をプローブし、洗浄した膜に検出溶液を添加し、５分間温置した。次に、化学発光シグナルをｘ線フィルムにより検出した。抗−ＨＡブロッティングの結果を図７Ａで示す。ウエスタンブロットの結果から、２９３及びＣＯＳ６培養上清の両方でｓｃＦｖタンパク質（〜３５ＫＤ）が存在することが分かり、このことから、哺乳動物細胞での異種間提示ベクターｐＭＡＧ９による可溶性タンパク質発現が分かる。
【０１３４】
抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡにより、哺乳動物細胞培養上清から得られたｓｃＦｖタンパク質の機能をさらに分析した。簡潔に述べると、濃度２μｇ／ｍＬの重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の希釈ｒｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）１００μＬでＭａｘｉＳｏｒｐプレートを一晩被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、室温にて１時間、５％ミルクＰＢＳでプレートをブロッキング処理した。さらなる洗浄後、様々な希釈度の精製ｓｃＦｖタンパク質入りの溶液５０μＬをウェルに添加し、室温にて１時間、温置した。洗浄後、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μＬを添加し、室温で１時間温置し、次いで、５％ミルクＰＢＳ中の１：２，０００の希釈度の抗−マウス−ＨＲＰ標識抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに１時間温置した。最後に、次いでＡＢＴＳ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を発色のために添加した。９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、ＯＤ４０５でプレートの読み取りを行った。
【０１３５】
図６Ｂで示されるＥＬＩＳＡの結果から、３つの個々の２９３細胞形質移入物及び４つの個々のＣＯＳ６細胞形質移入物からのｐＭＡＧ９培養上清中で用量依存的なＶＥＧＦ結合活性が示される。図６Ａ及び図７Ａでの結果と合わせて、ＥＬＩＳＡの結果から、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞の両方で、異種間発現ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することが証明される。
【実施例９】
【０１３６】
ｐＭＡＧ９ベクターを用いた、哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖタンパク質の提示
ヘルパーベクターＧＭＣＴと組み合わせてｐＭＡＧ９がファージ上でのｓｃＦｖの提示を支配すること（前出実施例７参照）及びヘルパーベクターなしで哺乳動物細胞において発現されるｐＭＡＧ９が哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現を支配するように機能すること（実施例８参照）を証明した後、このベクターの異種間提示機能を証明するために次の実験を行った。
【０１３７】
１０％ウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地が入った６ウェルプレート中のカバースリップ上でＣＯＳ６細胞を増殖させた。製造者の説明書に従い、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｐＡＭＧ９発現ベクター及びヘルパーベクターｐＭＡＧ２をＣＯＳ６細胞に同時形質移入した。簡潔に述べると、血清不含培地中、３：２のＦｕＧｅｎｅ６試薬（μＬ）：ＤＮＡ複合体（μｇ）の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にプラスミドＤＮＡ０８００ｎｇ（ｐＭＡＧ９ ４００ｎｇ＋ｐＭＡＧ２ ４００ｎｇ）を添加した。ＦｕＧＥＮＥ試薬ＤＮＡ複合体を室温で１５分間温置し、次いで細胞に添加した。４８時間後、細胞表面上で提示されるＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１融合タンパク質（ｐＭＡＧ９ベクターより）をＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体で検出した。簡潔に述べると、ＣＯＳ６細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで２５℃にて３０分間ブロッキング処理し、次いでＰＢＳ中のＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）とともに６０分間温置した。核を可視化するために、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でも細胞を染色した。Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ １００／１．３０油浸対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡で細胞を観察した。図９で示される結果から、ＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１が明確に表面に局在することが分かり、このことから、ｐＭＡＧ９ベクターを用いたｓｃＦｖの細胞表面提示が示される。
【０１３８】
あるいは、表面提示される抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの存在を検出するために、形質移入から４８時間後にフローサイトメトリー分析を行うことができる。簡潔に述べると、ビオチン化ｒｈＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｆｃを細胞懸濁液（４ｘ１０６細胞／ｍＬ）２５μＬに添加し、４℃にて６０分間温置する。陰性染色対照として、細胞の同一試料をビオチン化ダイズトリプシン阻害剤で染色する。次に、アビジン−ＦＩＴＣ又は抗−Ｆｃ抗体−ＦＩＴＣとともにさらに３０分間、４℃にて暗所で細胞を温置する。ＲＤＦ１緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのフローサイトメトリー分析用にこの細胞を０．２ｍＬ ＲＤＦ１緩衝液中で再懸濁する。（注記：これは机上ＦＡＣＳ実験である。）
【実施例１０】
【０１３９】
ファージ及び哺乳動物細胞上の所望のポリペプチドの選択及び異種間提示（注記：机上実験）
可溶性ポリペプチドの発現又はＥ．コリ及び／又は哺乳動物細胞での提示のために、多岐にわたるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリをｐＭＡＧ１又はｐＭＡＧ９ベクターにクローニングすることができる。
【０１４０】
ファージ提示の場合ＧＭＣＴヘルパーベクター又は哺乳動物細胞提示の場合ｐＭＡＧ２など、ヘルパーベクターの同時発現によって、原核遺伝子パッケージ又は真核生物宿主細胞の表面上で発現ライブラリを提示することができる。連続的にパニングすることにより、所望の特異性（結合活性）を特徴とするポリペプチドを濃縮することができる。簡潔に述べると、ファージパニングプロセスを次のように進める：１−１０μｇ／ｍＬの濃度の特異的抗原で４℃にて一晩、９６ウェルプレートを被覆する。ＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキング処理した後、５％ミルク／ＰＢＳ中の１０１１−１２ファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬトリプシンとともに３０分間温置して結合したファージを溶出するが、これは、本ヘルパーファージがｐＩＩＩタンパク質に融合されたＭｙｃ−タグにおいて切断可能部位を有するからである。発明者らの実験において、トリプシン溶出は１００ｍＭトリエチルアミン（通常、従来のファージパニングで使用される。）よりも効率的である。このプロセスを２−３回繰り返すと、所望のポリペプチドを提示するファージのプールを濃縮することができる。濃縮したファージはＥ．コリ細胞に感染し得るが、これは、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を有するベクターの調製のために使用することができる。
【０１４１】
このように、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２を用いて同時形質移入することにより、細胞表面提示のために、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡの小さなプールを直接哺乳動物細胞に形質移入することができる。ＦＡＣＳソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを単離することができる。簡潔に述べると、キュベット中で氷冷ＰＢＳで洗浄したＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ細胞３ｘ１０６と１０−２０μｇＤＮＡを混合する。氷上で１０分間温置した後、２５０μＦ、６６０Ｖに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、細胞／ＤＮＡ混合物に対してエレクトロポレーションを行う。室温で１０分間温置した後、７５ｃｍ培養フラスコ中の２０ｍＬ培地に細胞を移し、３７℃、５％ＣＯ２で２−３日間温置する。あるいは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより記載されたプロトコールに従い、形質移入のために、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬を使用することができる。
【０１４２】
標的抗原に対する結合特異性を有する抗体を同定するための適切な選択プロセスは、ＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化標的抗原及び抗−ＨＡタグｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬ（Ｓａｎｔａ Ｃｌｕｚｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにおよそ１０７個の形質移入細胞を２５℃で１時間温置することを含む。次に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（抗体発現を監視するために、ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、抗原結合細胞の標識のため）とともに４℃で１時間温置して標識しなければならない。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でこの細胞をソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターのみ、ＫＯ７などの通常のヘルパーファージによりパッケージングすることができ、従って、哺乳動物ヘルパーベクターから分離することができる。次に、別の回のＦＡＣＳソーティング又はＤＮＡ配列決定のために、回収した提示ベクターＤＮＡを使用することができる。
【０１４３】
ファージ及び酵母異種間提示系
【実施例１１】
【０１４４】
提示ベクターｐＭＡＴ２
ｐＭＡＴ２は、発現及び原核細胞系（ファージ及び細菌細胞）と真核細胞系（酵母細胞）との間の異種間提示に適切な発現ベクターを提供する。図１０Ａで示されるように、ｐＭＡＴ２は、３１８４ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片によりＡａｔＩＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することによって、市販のベクターｐＵＣ１９の骨格上で作製される。この完全合成ＤＮＡは、（１）ファージパッケージのためのｆ１ ｏｒｉ；（２）アダプターＧＲ１（配列番号１９）融合のための異種間発現カセット（これは２つのプロモーター：酵母細胞での発現のための酵母ｐＧＡＬ１プロモーター及び細菌細胞のためのｐｌａｃプロモーターにより駆動される。）を含む。関心のある遺伝子クローニングのための多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列は、二重機能シグナル配列（酵母エンド−β−１，３−グルカナーゼタンパク質Ｂｇｌ２ｐ）の下流に構築される。ＨＡ−Ｈｉｓ６タグ（ＤＨ−タグ）配列は、タンパク質検出及びＮｉ−ＮＴＡ精製のために、ＧＲ１配列の上流である。（３）複製のための酵母ＣＥＮ／ＡＲＳ ｏｒｉ；及び（４）酵母ＴＲＰ１栄養要求性マーカーのための発現カセット。
【０１４５】
簡潔に述べると、ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによる遺伝子合成のためにＤＮＡを１１９６、８０４及び１２９４ｂｐの３片のセグメントに分割することによって、このベクターを合成した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列付きのこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法を用いて、得られたベクター配列（配列番号１０）を確認した（注記：これはｓｃＦｖ遺伝子なしのファージ／酵母発現ベクターである。）。
【実施例１２】
【０１４６】
クロス提示ベクターｐＭＡＴ５
ベクターｐＭＡＴ５（配列番号１１）は、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体をコードするｓｃＦｖ遺伝子（発現カセット）を挿入することによって、ｐＭＡＴ２ベクターから得られた。当業者にとって当然のことながら、多様な様式の抗体をコードするコード配列のライブラリを提示するために、ｐＭＡＴ２を使用することができる。ＰＣＲによってｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。簡潔に述べると、ｐＡＢＭＸ２６８ ＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲに対するプライマーは以下のとおりであった：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴ ＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３（配列番号４）。
【０１４７】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に記載のようにｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによって、ＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃で３分間変性；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング、７２℃で１分３０秒間伸長を３０サイクル；次いで７２℃で１０分間ポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、このように、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＴ２ベクターにクローニングした。
【０１４８】
ＤＮＡ配列決定によってｓｃＦｖの配列を確認した。ｐＭＡＴ５ベクターの成分を図１０Ｂで示す。ｐＭＡＴ５において、関心のあるポリペプチド／アダプターＧＲ１−タンパク質の融合物の転写及び発現はＥ．コリ細胞においてｐＬａｃプロモーターにより駆動され、酵母細胞において酵母ＧＡＬ１プロモーターにより駆動される。酵母エンド−β−１，３−グルカナーゼタンパク質Ｂｇｌ２ｐのシグナルペプチドは、酵母及び細菌細胞の両方で機能し（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２０００、２０：２５２−２６４）、酵母及び細菌細胞の両方の分泌経路を通じてアダプター融合タンパク質を支配する。
【実施例１３】
【０１４９】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３
図１１Ａで図示するｐＭＡＴ３は、アダプター２との、インフレームでＣ末端酵母外面ＧＰＩアンカータンパク質Ｆｌｏ１を含む融合タンパク質を発現する酵母提示ヘルパーベクターである。７０３０ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片によりＡａｔＩＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することによって、市販のベクターｐＵＣ１９の骨格上でこのベクターを構築した。この完全合成ＤＮＡは、３つの発現カセットに対する配列：（１）酵母ＵＲＡ３選択マーカー；（２）酵母選択のためのＺｅｏｃｉｎマーカー；（３）酵母ｐＧＡＬ１プロモーター及びＦｌｏ１の分泌シグナル配列の調節下での、酵母アウトウェルタンパク質（ｗｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｆｌｏ１ Ｃ末端１１００アミノ酸とのアダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）融合物を含む。簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いることによる遺伝子合成のために、１１１２、７４０、７４８、１０４２、８９７、１１５２、８０２及び８２１ｂｐ（＃１から番＃８）の８片のセグメントに合成ＤＮＡを分割した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。
【０１５０】
合成ＤＮＡセグメント＃１−４をタイプＩＩ制限酵素で消化し、１つのＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。合成ＤＮＡセグメント＃５から８をタイプＩＩ制限酵素で消化し、別の１つのＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれを第一の断片を有するｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、得られたベクター配列（配列番号１２）を確認した。
【実施例１４】
【０１５１】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ７ベクター
図１１Ｂで図示するｐＭＡＴ７は、アダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）との、インフレームで酵母外面タンパク質Ａｇａ２を含む融合タンパク質を発現する別の酵母提示ヘルパーベクターである。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を２０８ｂｐの合成ＤＮＡ断片で置換することによって、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３からこのベクターを作製した。この合成ＤＮＡは、酵母アウトウェルタンパク質Ａｇａ２をコードする配列を含む。Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、最終ベクター配列（配列番号１３）を確認した。
【実施例１５】
【０１５２】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ８
図１１Ｃで図示するｐＭＡＴ８は、アダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）との、インフレームでＣ末端酵母外面ＧＰＩアンカータンパク質Ｃｗｐ２を含む融合タンパク質を発現する、別の酵母提示ヘルパーベクターを表す。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を１２５２ｂｐの合成ＤＮＡ断片で置換することによって、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３からこのベクターを作製した。この合成ＤＮＡは、Ｆｌｏ１のＳ／Ｔリッチ領域と融合した酵母アウトウェルタンパク質Ｃｗｐ２をコードする配列を含む。ＢｏｓｔｏｎのＣｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、合成ＤＮＡ中のエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、最終ベクター配列（配列番号１４）を確認した。
【実施例１６】
【０１５３】
ｐＭＡＴ５を用いた、Ｅ．コリ細胞における可溶性ｓｃＦｖタンパク質の発現
可溶性タンパク質発現のために、ファージ／酵母発現ベクターｐＭＡＴ５を直接Ｅ．コリＴＧ１細胞へと形質転換した。３つの個々のクローンからの形質転換細胞を３７℃振盪器においてアンピシリン１００μｇ／ｍＬ入りの２ＹＴ培地中でＯＤ６００が０．９になるまで増殖させた。０．５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加し、３０℃振盪器で一晩誘導した。ＥＬＩＳＡアッセイにより上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を検出した。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ上清を添加し、プレート上の抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブした。次に、ＨＲＰ活性を調べるために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。
【０１５４】
図１２で示されるデータから、３つの個々のクローンからのｐＭＡＴ５ 上清中のＶＥＧＦへの用量依存的結合活性が証明され、これにより、Ｅ．コリ細胞での可溶性タンパク質の発現に対するｐＭＡＴ５ベクターの機能が明らかになった。
【実施例１７】
【０１５５】
ｐＭＡＴ５を用いた、ファージ表面上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
実施例１６で示されるデータから、ｐＭＡＴ５がＥ．コリ細胞において可溶性ｓｃＦｖ発現のための発現ベクターとして機能することが証明された。ＧＭＣＴヘルパーファージと組み合わせたＭＡＴ５の同時発現がファージ表面上でｓｃＦｖ（又はｓｃＦｖのライブラリ）を提示するように機能することを明らかにするために、ｐＭＡＴ５ベクターをＴＧ１細胞に形質転換し、形質転換したＥ．コリ細胞を１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭＣＴヘルパーファージにより重複感染させた。
【０１５６】
感染したＴＧ１細胞を２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ中で３０℃にて一晩増殖させた。培養上清中のファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌにより２回沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁した。ＶＥＧＦで被覆されたプレートを用いて、ファージＥＬＩＳＡにより、ファージ表面上で提示される１本鎖抗体を検出した。簡潔に述べると、２μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ １００μＬで４℃にて一晩被覆した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ緩衝液中の５％ミルクで室温にて１時間ブロッキング処理した。このように、ＰＢＳ−ミルク中の希釈ファージ１００μＬを用いて、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを被覆した。ＨＲＰ−標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともに室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレート上に結合したファージ粒子をさらに温置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで遊離抗−Ｍ１３抗体を洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収によりＨＲＰ活性を調べた。
【０１５７】
図１３で示されるＥＬＩＳＡの結果から、ｐＭＡＴ５ベクターを有する細胞から生成したファージが用量依存的にＶＥＧＦに結合したことが証明される。陰性対照として、ｐＵＣ１８ベクターを有する細胞及びｐＭＡＴ６ベクターを有する細胞（図１４Ｂで示される酵母／哺乳動物異種間提示ベクター）から生成したファージは、ＶＥＧＦに対して結合活性を示さなかった。これらの結果から、ベクターセットｐＭＡＴ５及びヘルパーベクターＧＭＣＴがファージ表面上でのポリペプチド配列の提示を支配するように機能することが分かった。
【実施例１８】
【０１５８】
ｐＭＡＴ５を用いた、酵母における可溶性ｓｃＦｖタンパク質の発現
ｐＭＡＴ５は異種間発現ベクターである。実施例１６で示されるデータから、ｐＭＡＴ５が、細菌細胞においてアダプター１（ＧＲ１タンパク質）とインフレームで融合したｓｃＦｖポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質の発現を支配するように機能することが証明される。ｐＭＡＴ５が酵母細胞で発現を支配することができることを証明するために、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈの説明書に従い、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキットを用いて酵母ＹＨＰ４９９細胞にベクターを形質転換し得る。
【０１５９】
３℃でＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−選択培地５０ｍＬ中で、飽和するまで（ＯＤ６００＝２〜３）１個のコロニーからの酵母細胞を増殖させ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの５０ｍＬ ＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ／Ｔｒｉｐ培地中で再懸濁することができる。誘導２−３日後、上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液で透析しなければならない。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡによって上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を測定することができる。簡潔に述べると、１００μＬ上清又は抗−ＨＡビーズで上清から精製したｓｃＦｖを、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加し、プレーティングした抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）で検出することができる。次に、ＨＲＰ活性を調べるために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加しなければならない。酵母細胞での可溶性タンパク質の発現に対するｐＭＡＴ５ベクターの機能を示すために、ＥＬＩＳＡの結果を使用し得る。あるいは、精製のために培養上清をＮｉ−ＮＴＡカラムに添加することができる。ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで、結合したＨｉｓ−タグタンパク質を溶出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体でのウエスタンブロットによる分析のために、分画を回収し得る。
【実施例１９】
【０１６１】
ｐＭＡＴ５を用いた、酵母細胞表面上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
酵母宿主細胞表面上でのｓｃＦｖ抗体の提示を支配するために、ｐＭＡＴ５発現ベクターを使用することもできる。簡潔に述べると、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキットなどの適切なプロトコールを用いて、酵母提示ヘルパーベクター（即ち、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８）の存在下で、酵母細胞にｐＭＡＴ５を同時形質転換することができる。あるいは、そのゲノム中に酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞を発現ベクターｐＭＡＴ５で形質転換することができる。
【０１６２】
ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｕｒａ−寒天プレート又はＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｚｅｏｃｉｎ上で発現ベクター及びヘルパー提示ベクター（即ち酵母提示ベクターセット）の両方を含む酵母細胞を選択し、飽和するまで同じ選択培地中で増殖させることができる。次に、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘを含有する誘導培地にこの細胞を移し、一晩、振盪しながら２０℃又は２５℃で温置しなければならない。氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、１００ｎＭビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液中で３回洗浄する。５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（ＳＡ−ＰＥ）及びヤギ抗−マウス−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置し、３回洗浄し、１ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁することによって、この細胞をプローブし得る。酵母細胞上で提示されるｓｃＦｖと会合した蛍光は、ＦＡＣＳ Ｃａｉｌｉｂｕｒフローサイトメトリー又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、フローサイトメトリーにより測定することができる。
【実施例２０】
【０１６３】
ファージ及び酵母細胞上で提示された所望のポリペプチドの選択
原核細胞（即ちＥ．コリ）及び原核細胞（即ち酵母細胞）での連続的な可溶性ポリペプチドの発現のために、ＤＮＡ配列の多岐にわたる集団（即ちレパートリー）をｐＭＡＴ２ベクターにクローニングすることができる。本発明の様々なヘルパー提示ベクターを用いて、ファージ又は酵母細胞の表面上で、得られた発現ライブラリを提示することができる。とりわけ、ファージ提示ヘルパーベクターとしてＧＭＣＴを使用し得、酵母細胞上での提示のために酵母提示ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８を使用し得る。
【０１６４】
ファージ上で提示される具体的なタンパク質又はペプチドを最初に数回の操作により濃縮することができる。簡潔に述べると、適切なパニングプロセスは、１−１０μｇ／ｍＬの濃度の標的抗原で９６ウェルプレートを４℃で一晩被覆することを含む。ＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１０１１−１２個のファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬトリプシンを用いて、３０分温置して、結合したファージを溶出し得るが、これは、本ヘルパーファージがｐＩＩＩタンパク質に融合した切断可能なＭｙｃ−タグを有するからである。溶出されたファージをＴＧ１細胞に感染させ、次回のファージ調製及びパニングに備える。このプロセスを２−３回繰り返したら、所望のポリペプチドを提示するファージのプールを濃縮することができる。濃縮したファージをＥ．コリ細胞に感染させることができ、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を用いてベクターＤＮＡを調製するためにこれを使用することができる。
【０１６５】
酵母ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを含む受容酵母宿主細胞に、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡのこの小さいプールを続いて直接、形質転換することができる。所望の特性を有するリードを提示する形質転換酵母細胞を数回のフローサイトメトリーソーティングで単離することができる。簡潔に述べると、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０もしくは２５℃で１６−１８時間移し得る。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化抗原及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート及びヤギ抗−マウス−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって細胞をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁することができる。選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。回収した細胞をＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレートに播種し、３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。選択後、個々のコロニーを拾うことができる。説明書に従いＺｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、配列決定を行うために、酵母細胞からのベクターＤＮＡを回収することができる。
【０１６６】
酵母と哺乳動物宿主細胞との間の複数種提示
【実施例２１】
【０１６７】
提示ベクターｐＭＡＴ４
図１４Ａで示されるｐＭＡＴ４は、酵母及び哺乳動物細胞でのポリペプチドライブラリの連続的発現又は提示のための、複数種又は異種間発現ベクターである。ＰａｃＩ−ＳａｃＩＩ断片を１４２０ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片で置換することによって、ベクターｐＭＡＴ２からこれを作製した。ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによりこの完全合成ＤＮＡを作製したが、これは、イントロン配列内部に酵母ｐＧＡＬ１０プロモーターを含有する。従って、アダプター１（ＧＲ１）（配列番号１９）にインフレームで融合するライブラリタンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物細胞に対するＳＶ４０プロモーター；酵母細胞に対するｐＧＡＬ１０；及びＥ．コリに対するｐＬａｃプロモーターにより駆動される。ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）のシグナルペプチドは、酵母及び哺乳動物細胞の両方で機能的である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２００６、４７：４１５−４２１）。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定によってｐＭＡＴの最終ポリヌクレオチド配列（配列番号１５）を確認した。
【実施例２２】
【０１６８】
提示ベクターｐＭＡＴ６
ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体のｓｃＦｖ遺伝子を挿入することによって、ｐＭＡＴ４ベクターからｐＭＡＴ６を得た。ｐＡＢＭＸ２６８ＤＮＡからＰＣＲによりｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。ＰＣＲプライマーは次のとおりであった：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に記載のように、ｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによってＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件は次のとおりであった：９４℃で３分間変性；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング及び７℃で１分３０秒間伸長のサイクルを３０回；次に、７２℃で１０分間ポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＴ４ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定によりｓｃＦｖの配列を確認した。
【０１６９】
ｐＭＡＴ６（配列番号１６）を図１４Ｂで図示する。酵母及び哺乳動物細胞の両方において、ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）シグナルペプチドは機能的であり（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２００６、４７：４１５−４２１）、真核生物（酵母及び哺乳動物）宿主細胞の分泌経路を通じて、発現融合タンパク質（アダプター１とインフレームでｓｃＦｖポリペプチド）を支配する。
【実施例２３】
【０１７０】
ｐＭＡＴ６を用いた、酵母細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現
Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈの説明書に従い、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋを用いて、発現ベクターｐＭＡＴ６を酵母細胞ＹＨ４９９に形質転換することができる。ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−選択培地５０ｍＬ中で３０℃で、飽和するまで１個のコロニーからの細胞を増殖させ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの５０ｍＬ ＴＥＰ Ｇ／Ｒ培地中で再懸濁する。誘導２−３日後、上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液で透析することができる。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を測定することができる。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬの上清を添加し、プレート上の抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブする。次に、ＨＲＰ活性を決定するために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加する。さらに、精製するためにＮｉ−ＮＴＡカラムに上清を添加することができる。ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで、結合したＨｉｓ−タグタンパク質を溶出する。分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体でのウェスタンブロットによって分析する。
【実施例２４】
【０１７２】
ｐＭＡＴ６を用いた、酵母上でのｓｃＦｖの提示
発現ベクターｐＭＡＴ６ベクター及び酵母ヘルパー提示ベクター（ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８など）を上記のように酵母細胞へと同時形質転換することができる。あるいは、クロス提示ベクターのみの形質転換のために、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞を使用することができる。
【０１７３】
ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｕｒａ−又はＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｚｅｏｃｉｎｅ寒天プレート上で提示ベクター及びヘルパーベクターの両方を有する受容宿主細胞を選択することができ、同じ選択培地中で飽和するまで増殖させることができる。次に、この細胞を１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの誘導培地に移し、一晩振盪しながら２０℃で温置することができる。氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間、１００ｎＭビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、次いで氷冷洗浄緩衝液中で３回洗浄する。暗所で氷上で３０分間、各５ｍｇ／ｍＬのＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに温置することによってこの細胞をプローブし、次いで再び３回洗浄し、１ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し得る。細胞で提示されるｓｃＦｖと会合した蛍光をＦＡＣｓ Ｃａｉｌｉｂｕｒ フローサイトメトリー又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ）で測定する。
【実施例２５】
【０１７４】
ｐＭＡＴ６を用いた、哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現
実施例８での説明に従い、ＣＯＳ細胞を用いて、哺乳動物細胞において可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現をｐＭＡＴ６が支配する能力を評価した。簡潔に述べると、血清不含培地中３：１又は３：２の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にｐＭＡＴ６ベクターＤＮＡ １又は２μｇを使用した。１５分間温置した後、ＦｕＧＥＮＥ６試薬ＤＮＡ複合体を６ウェルプレート中の細胞（２ｍＬ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１．０ｘ１０６細胞）に移す。９５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で７２時間、この細胞を温置しなければならない。機能的ｓｃＦｖタンパク質を測定するために、ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＧＲ１タンパク質の抗−ＨＡウエスタンブロット分析及び抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を回収することができる。
【０１７５】
最初に、ＰｒｏＦｏｕｎｄ ＨＡ Ｔａｇ ＩＰ／Ｃｏ−ＩＰキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従い、抗−ＨＡ抗体ビーズを用いて培養上清８００μＬからｓｃＦｖタンパク質を精製した。このように、タンパク質分離のために４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に精製ｓｃＦｖタンパク質を添加し、ＥＣＬ ｐｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の説明書に従い、ウエスタンブロッティング分析のために０．４５ニトロセルロース膜に転写した。簡潔に述べると、ＴＢＳＴ中５％脱脂乳で膜をブロッキング処理し、室温で１時間、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに温置した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗−マウス抗体で１時間温置して膜をプローブした。洗浄した膜に検出溶液を添加し、５分間温置した。次に、ｘ線フィルムを用いて化学発光シグナルを検出した。図７Ａで与えられる抗−ＨＡブロッティングの結果から、ｐＭＡＴ６がＣＯＳ６細胞培養上清へのｓｃＦｖタンパク質（〜３５ＫＤ）の発現を支配するように機能することが示される。
【０１７６】
抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＣＯＳ６培養上清からのｓｃＦｖタンパク質の機能をさらに分析した。簡潔に述べると、２μｇ／ｍＬの濃度の、重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の希釈ｒｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）１００μＬで、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを一晩被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ミルクＰＢＳを用いて室温で１時間、プレートをブロッキング処理した。さらなる洗浄後、様々な希釈度の精製ｓｃＦｖタンパク質が入った溶液５０μＬをウェルに添加し、室温にて１時間、温置した。洗浄後、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μＬを添加して室温で１時間温置し、続いて５％ミルクＰＢＳ中１：２，０００希釈の抗−マウス抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに１時間温置した。次いで、最後に、ＡＢＴＳ基質.（Ｐｉｅｒｃｅ）を発色のために添加した。９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、ＯＤ４０５でプレートの読み取りを行った。図７Ｂで示されるＥＬＩＳＡの結果から、２つの個々のＣＯＳ６細胞形質移入物からのｐＭＡＴ６培養上清中で用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示され、このことから、哺乳動物細胞における酵母／哺乳動物ｐＭＡＴ６ベクターからのｓｃＦｖの機能的発現が示唆される。
【実施例２６】
【０１７７】
ｐＭＡＴ６を用いた、哺乳動物細胞上でのｓｃＦｖ提示
次のプロトコールによって哺乳動物細胞におけるｐＭＡＴ６の異種間提示機能を調べることができる。１０％ウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地が入った６ウェルプレート中のカバースリップ上でＣＯＳ６細胞を増殖させる。製造者の説明書に従い、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｐＡＭＴ６クロス提示ベクター及び哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２をＣＯＳ６細胞に同時形質移入する。簡潔に述べると、血清不含培地中、３：２のＦｕＧＥＮＥ６試薬（μＬ）：ＤＮＡ複合体（μｇ）の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にプラスミドＤＮＡ０８００ｎｇ（ｐＭＡＴ６ ４００ｎｇ＋ｐＭＡＧ２ ４００ｎｇ）を添加する。ＦｕＧＥＮＥ試薬ＤＮＡ複合体を室温で１５分間温置し、次いで細胞に添加する。
【０１７８】
４８時間後、細胞表面上で提示されるＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１融合タンパク質（ｐＭＡＴ６ベクターより）をＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体で検出することができる。簡潔に述べると、ＣＯＳ６細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで２５℃にて３０分間ブロッキング処理し、次いでＰＢＳ中のＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）とともに６０分間温置する。核を可視化するために、細胞をまた、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でも染色する。Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ １００／１．３０油浸対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡で細胞を観察する。細胞表面上のＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１は緑色蛍光で観察される。
【０１７９】
あるいは、関心のあるポリペプチドを発現している宿主細胞を同定するために、ＦＡＣＳアッセイを行うことができる。形質移入から４８時間後に、染色のために４ｘ１０６細胞／ｍＬの最終濃度を用いる。ビオチン化ｒｈＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｆｃを細胞懸濁液２５μＬに添加し、４℃にて６０分間温置する。陰性染色対照として、細胞の同一試料をビオチン化ダイズトリプシン阻害剤で染色する。次に、アビジン−ＦＩＴＣ又は抗−Ｆｃ抗体−ＦＩＴＣとともにさらに３０分間、４℃で暗所で細胞を温置する。ＲＤＦ１緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのフローサイトメトリー分析のために０．２ｍＬ ＲＤＦＩ緩衝液中でこの細胞を再懸濁する。
【実施例２７】
【０１８０】
酵母及び哺乳動物細胞上で提示される所望のポリペプチドの選択
ＤＮＡのライブラリをｐＭＡＴ４ベクターに挿入し、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーがそのゲノムに組み込まれた酵母細胞に直接形質転換することができる。
【０１８１】
フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを提示する形質転換酵母細胞を単離することができる。簡潔に述べると、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０℃で１６−１８時間移すことができる。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化抗原及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって細胞試料をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。
【０１８２】
選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレートに回収した細胞を播種し３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。２−３回の選択後、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、酵母細胞からのベクターＤＮＡのリードのプールを回収することができる。
【０１８３】
次に、酵母提示ライブラリから単離された、この得られたベクターＤＮＡのプールを、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２とともに同時形質移入することにより、細胞表面提示のために哺乳動物細胞に直接形質移入することができる。フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを同定し、回収することができる。簡潔に述べると、キュベット中で氷冷ＰＢＳで洗浄したＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ細胞３ｘ１０６と１０−２０μｇＤＮＡを混合する。氷上で１０分間温置した後、２５０ｕＦ、６６０Ｖに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、細胞／ＤＮＡ混合物に対してエレクトロポレーションを行う。室温で１０分間温置した後、７５ｃｍ培養フラスコ中の２０ｍＬ培地に細胞を移し、３℃、５％ＣＯ２で２−３日間温置する。あるいは、形質移入のために、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬を使用することができる。
【０１８４】
適切な選択プロセスを下記に記載する。ＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化抗原タンパク質及び抗−ＨＡ ｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬとともにおよそ１０７個の形質移入細胞を２５℃で１時間温置する。最後に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）とともに４℃で１時間温置して標識した。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でこの細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ＫＯ７などの通常のヘルパーファージにより、ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターのみをパッケージングすることができるが、これは、哺乳動物ヘルパーベクターからベクターを分離するという効果がある。次に、別の回のＦＡＣＳソーティング又はＤＮＡ配列決定のために、回収した提示ベクターＤＮＡを使用することができる。
【実施例２８】
【０１８５】
Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において機能を有するシグナルペプチドの選択
ｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプターＧＲ１／ポリペプチド融合タンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物細胞に対するＳＶ４０プロモーター；酵母細胞に対するｐＧＡＬ１０プロモーター；及び細菌細胞に対するｐＬａｃプロモーターにより支配される。従って、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞の全てにおいて機能する（即ち、分泌経路に対して融合タンパク質を支配する）シグナルペプチドをベクターが含むならば、このベクターは潜在的にファージ、酵母及び哺乳動物細胞上でのポリペプチドの異種間提示を支配するために使用し得る。
【０１８６】
Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において分泌機能を有するシグナルペプチドを単離するために、抗−ＶＥＧＦ ｃＦｖなどの試験タンパク質に対する発現カセットを含むｐＭＡＴ６ベクターへとシグナル配列のライブラリをクローニングすることができる。得られたライブラリをファージ上で提示し、ＶＥＧＦ抗原を用いたパニングプロトコールを使用して選択することができる。そのＶＥＧＦ結合活性に基づき同定された単離ファージは、Ｅ．コリ細胞で機能するシグナルペプチドが存在することを特徴とするであろう。適切なパニングプロセスには、４℃で一晩５μｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦで９６ウェルプレートを被覆し、そのプレートをＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキングすることが含まれる。１００μＬ １０１１−１２個のファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳでの数回の洗浄後、１０μｇ／ｍＬトリプシンで３０分間、結合ファージを溶出する。ＴＧ１細胞に溶出ファージを感染させ、次回のファージ調製及びパニングに対して使用する。このプロセスを２−３回繰り返した後、提示するファージのプールを濃縮することができる。Ｅ．コリ細胞に感染させるために濃縮したファージを使用し、次の酵母提示用のベクターＤＮＡの調製のためにこれを使用する。
【０１８７】
酵母ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞へと、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡのこの小さなプールを続いて直接形質転換することができる。酵母細胞表面上で機能的ｓｃＦｖを提示するために、酵母細胞で分泌を支配できるシグナルペプチドが必要である。フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、機能的シグナルペプチドを有する酵母細胞を単離することができる。適切なソーティングプロトコールは、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０℃で１６−１８時間移すことを含み得る。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともにこの細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄することができる。５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びヤギ抗−マウスＡｂ−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって続いて細胞をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁することができる。選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレート上に回収した細胞を播種し、３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。２−３回の選択後、説明書に従いＺｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、酵母細胞からベクターＤＮＡを回収する。
【０１８８】
Ｅ．コリ及び酵母で機能するシグナルペプチドを同定するために、上記のファージ及び酵母選択プロトコールを使用した後、ライブラリを哺乳動物提示系に導入することによって第三の選択を行うことにより、哺乳動物細胞で機能することができるさらなる特性を特徴とするシグナルペプチドを同定することができる。表面提示のために、ファージ及び酵母提示から選択されたリードＤＮＡを哺乳動物細胞に直接形質移入することができる。簡潔に述べると、リードＤＮＡ２０μｇを上記のＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ６細胞に形質移入する。培養２日後、形質移入した細胞をＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び抗−ＨＡ ｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬlとともに２５℃で１時間温置する。最後に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）とともに４℃で１時間温置することにより標識した。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でこの細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ファージパッケージングによって、ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターＤＮＡを単離することができる。これらの選択後、ファージ、酵母及び哺乳動物提示を通じて単離されたシグナルペプチドは、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞で機能的である。これを確認するために、個々のクローンからのＤＮＡを直接使用して、それぞれＥ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞に形質転換する。上記のように抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡによって、これらの細胞から分泌される可溶性ｓｃＦｖを検出することができる。
【０１８９】
原核及び真核宿主細胞上での異種間提示
【実施例２９】
【０１９０】
細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１
ＰｃｉＩ部位を用いた自己連結によって、図１３Ａで示されるｐＭＡＬ１を３８２２ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片から作製した。この完全合成ＤＮＡは、（１）複製のためのｐＵＣ ｏｒｉ、ファージパッケージングのためのｆ１ ｏｒｉ及びクロラムフェニコール選択マーカーの発現カセットを含む細菌の制御エレメントに対する配列と；（２）細菌外面ドメイン（ＰｅｌＢシグナル−Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）とのアダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）融合物の発現カセットと、を含む。簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いることによる遺伝子合成のために、この合成ＤＮＡを１８５１及び２０１９ｂｐの２片のセグメントに分割した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。２つの末端にＰｃｉＩ制限部位があるこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、核酸連結した。標準的ＤＮＡ配列決定によって、得られたベクター（配列番号１７）を確認した。
【実施例３０】
【０１９１】
細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ２
ＰｃｉＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を１００６ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片（これは、アダプター２（ＧＫ１）（配列番号２０）に融合したＬｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外面ドメインに対する発現カセットを含む。）で置換することにより、図１３Ｂで図示されるｐＭＡＬ２をｐＭＡＬ１ベクターから得た。融合タンパク質の発現はファージｐ８シグナルペプチドにより支配される。
【０１９２】
簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて合成ＤＮＡを作製した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。得られたベクター（配列番号１８）を標準的ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【実施例３１】
【０１９３】
Ｅ．コリ及び哺乳動物宿主細胞上でのｓｃＦｖの異種間提示
上記で示されるように、宿主細胞の複数種におけるポリペプチドの発現のために、及び、本発明のヘルパー提示ベクターと組み合わせて使用される場合、実施例２、６から９に記載のファージ及び哺乳動物細胞上でのタンパク質ライブラリの表面提示を支配するために、ベクターｐＭＡＧ９を使用した。同様に、細菌及び哺乳動物細胞上でのクロス提示のためにこのベクターを使用することもできる。細菌細胞提示を次のように行うことができる。
【０１９４】
細菌ヘルパー提示ベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２と組み合わせた発現ベクターｐＭＡＧ９ベクターの同時形質転換は、２つの融合タンパク質：可溶性ｓｃＦｖ−ＧＲ１（タンパク質／アダプター１）及びＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２（表面タンパク質／アダプター２）を発現するようにＥ．コリを支配する。ＧＲ１及びＧＲ２融合タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、集合してＧＲ１及びＧＲ２相互作用によりタンパク質複合体を形成する。得られたタンパク質複合体は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ外膜アンカードメインによって細胞表面上で提示される。
【０１９５】
簡潔に述べると、アンピシリン選択マーカーを有するｐＭＡＧ９発現ベクターで細胞を形質転換し、次いでクロラムフェニコール選択マーカーを有するファージミドパッケージングヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２を感染させることができる。ＯＤ６００＝０．５まで、１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの抗生物質を含有する２ＹＴ培地中で提示及びヘルパーベクター両方を有する細胞を増殖させ、次いで、アダプター融合タンパク質の発現のために、グルコース不含の増殖培地に移す。４−６時間温置した後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、ビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに３０分間、暗所で氷上で温置することによって細胞をプローブし、ＦＡＣＳ分析のためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖのライブラリをこの方法で提示させる場合、ｓｃＦｖタンパク質を提示する細胞を上記のようにプローブし、フローサイトメトリーによりソーティングし得る。抗生物質アンピシリンのみを含有する２ＹＴ／グルコース培地中での増殖を通じて、ヘルパーベクターから提示ベクターのリードを分離することができる。
【実施例３２】
【０１９６】
Ｅ．コリと酵母との間のｓｃＦｖの異種間提示
本明細書中で示されるように、ファージと酵母細胞との間のクロス提示（実施例１２から１９に記載）に対して及び細菌と酵母細胞との間の細胞表面提示に対して、ｐＭＡＴ５を使用することができる。ｐＭＡＴ６ベクター及び細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＡＭＬ２で受容宿主細胞を同時形質転換し、次に、細胞が２種類の融合タンパク質：可溶性ｓｃＦｖ−ＧＲ１及びＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２融合物を発現する。ＧＲ１及びＧＲ２融合タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、ＧＲ１及びＧＲ２相互作用によりタンパク質複合体を形成する。Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ外膜ドメインを通じて細胞表面上にｓｃＦｖ−ＧＲ１タンパク質が提示される。
【０１９７】
簡潔に述べると、アンピシリン選択マーカーを含む提示ベクターで細胞を最初に形質転換し、続いて、クロラムフェニコール選択マーカーを有するファージミドパッケージングヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２を感染させることができる。ＯＤ６００＝０．５まで、１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの抗生物質を含有する２ＹＴ培地中で提示及びヘルパーベクター両方を有する細胞を増殖させ、次いで、アダプター融合タンパク質の発現のために、グルコース不含の増殖培地に移す。４−６時間温置した後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、ビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに３０分間、暗所で氷上で温置することによって細胞をプローブし、ＦＡＣＳ分析のためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖのライブラリをこの方法で提示させる場合、ｓｃＦｖタンパク質を提示する細胞を上記のようにプローブし、フローサイトメトリーによりソーティングし得る。抗生物質アンピシリンのみを含有する２ＹＴ／グルコース培地中での増殖を通じて、ヘルパーベクターから提示ベクターのリードを分離することができる。酵母細胞提示のためのｐＭＡＴ５提示ベクターは実施例１９に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、本発明の異種間及び複数種提示系の実験計画の概略である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ファージ及び哺乳動物の異種間又は複数種提示ベクターｐＭＡＧ１（図２Ａ）及びｐＭＡＧ９（図２Ｂ）の概略を示す。ｐＭＡＧ１及びｐＭＡＧ９ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【図３】図３は、ＫＯ７Ｋｐｎベクターのカナマイシン耐性ファージ−陽性クローンに対する抗−ファージＥＬＩＳＡスクリーニングの結果の概略を示す。クローン＃Ｃ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２は、ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ−陽性クローンに相当する。Ｆ１及びＦ２は、親Ｍ１３ＫＯ７ファージの２つの陽性対照に相当する。
【図４】図４は、ファージヘルパーベクターＧＭＣＴの概略を示す。このベクターは、ＫＯ７ｋｐｎファージベクターにおいてアダプターＧＲ２及びＭｙｃ−タグに融合した改変遺伝子ＩＩＩのさらなるコピーをコードするヌクレオチド配列を含有する。
【図５】図５は、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２の概略を示すが、これは、ヒトＥＧＦ受容体の膜貫通ドメインに融合したアダプター２を含む融合タンパク質を産生する。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、異種間提示ベクターｐＭＡＧ９を用いてＥ．コリ細胞（図６Ａ）及び哺乳動物細胞（図６Ｂ）で発現される可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖに対する機能的発現アッセイの結果の概略を示す。これらのデータから、培養上清からのｓｃＦｖ抗体のＶＥＧＦ結合活性が示され、このことから、ベクターｐＭＡＧ９の異種間発現機能が明らかとなった。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、異種間提示ベクターｐＭＡＧ９及びｐＭＡＴ６を用いた哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現を示す結果である。図７Ａは、ｐＭＡＧ９及びｐＭＡＴ６ベクターによって２９３及びＣＯＳ細胞からの培養上清中で分泌された３５ＫＤ ｓｃＦｖタンパク質を示す、抗−ＨＡ抗体で発色させたウエスタンブロットの結果である。図７Ｂは、ｐＭＡＴ６ベクターによってＣＯＳ細胞上清中で発現されるｓｃＦｖのＶＥＧＦ結合活性を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果をまとめたものであるが、これにより、ベクターｐＭＡＴ６の複数種発現機能が明らかとなった。
【図８】図８は、ベクターｐＭＡＧ９を用いたファージ表面上でのｓｃＦｖの機能的提示を示す。このデータから、ファージ表面上で提示された抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図９】図９Ａ、Ｂ及びＣは、表面上で抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖを提示するＣＯＳ６細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。ｐＭＡＧ９及びｐＭＡＧ２ベクターで形質移入されたＣＯＳ６細胞をチャンバースライド上で増殖させた。抗−ＨＡ抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）核染色で、形質移入された細胞を染色した。図９Ａは、重ね合わせた染色パターンである。図９Ｂは、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ−４８８染色を与え、図９Ｃは、ＤＡＰＩ核染色を与える。このデータから、ｐＭＡＧ９ベクターの哺乳動物提示機能が明らかとなった。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ファージ及び酵母異種間又は複数種発現ベクターｐＭＡＴ２及びｐＭＡＴ５の概略を示す。図１０はベクターｐＭＡＴ２の成分を示す。図１０Ｂは、ベクターｐＭＡＴ５の成分を示す。ｐＭＡＴ２及びｐＭＡＴ５ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、酵母プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【図１１】図１１Ａ、Ｂ及びＣは、酵母ヘルパー提示ベクター、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８の概略を示す。これらのベクターにおいて、アダプター２は次のような様々な酵母細胞外壁タンパク質：ｐＭＡＴ３の場合Ｆｌｏ１のＣ末端ドメイン；ｐＭＡＴ７の場合Ａｇａ２；及びｐＭＡＴ８の場合Ｃｗｐ２、に融合する。
【図１２】図１２は、発現ベクターｐＭＡＴ５を用いたＥ．コリ細胞での可溶性ｓｃＦｖに対する機能的発現アッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡデータから、ＴＧ１培養上清中の抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図１３】図１３は、異種間提示ベクターｐＭＡＴ５を用いたファージ表面上でのｓｃＦｖの機能的提示を示す。このデータから、ｐＭＡＴ５ファージ表面上で提示される抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、酵母及び哺乳動物異種間又は複数種発現ベクターｐＭＡＴ４（１４Ａ）及びｐＭＡＴ６（１４Ｂ）の概略を示す。ｐＭＡＴ４及びｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物、酵母及び細菌プロモーターの調節下にある。このシグナルペプチドは酵母及び哺乳動物細胞において機能的である。
【図１５】図１５Ａ及びＢは、細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１（１５Ａ）及びｐＭＡＬ２（１５Ｂ）の概略を示す。このベクターは、抗生物質選択（Ｃａｍ）のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子及びＬｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外膜ドメインへのアダプター融合のための発現カセットを含有する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、米国仮出願第６０／７４６，４８９号（２００６年５月４日出願、題名「複数種提示系」）の３５ＵＳＣ １１９（ｅ）の定めるところに従い、優先権を主張する。この仮出願の開示は、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、タンパク質提示の分野に関し、発現ベクターの分子操作を何ら行うことなく、原核及び／又は真核生物宿主細胞の表面での、タンパク質ライブラリの、連続的な複数種提示又は異種間提示を可能にする提示系を提供する。
【０００３】
発明の背景
ファージ提示系は、ポリペプチドライブラリ（例えば抗体ライブラリ）の構築及びスクリーニングのためのコアテクノロジープラットフォームと考えられる。これは、様々な遺伝学的ツールの利用可能性、操作の利便性及びＥ．コリ細胞の高い形質転換効率（通常、１０９から１０１０ｃｆｕ／μｇ ｐＵＣ１８ ＤＮＡ）を含む、数多くの実施上の配慮点による。現在、ファージ上で提示されるナイーブ抗体ライブラリが日常的に抗体探索のために使用されており、これにより、動物免疫付与及び従来のハイブリドーマ技術の使用が不要となる。ファージ提示ライブラリの複雑性は、１０１１の規模に達した。しかし、抗体探索及び操作技術においてファージ提示がうまく使用されているにもかかわらず、原核生物系での真核タンパク質の発現及び提示に関連して多くの欠点がある。例えば、一部の真核生物タンパク質は、原核細胞において機能的に発現され得ず、原核生物宿主細胞は、真核生物宿主細胞の特徴である翻訳後修飾を完全に行うことができない。
【０００４】
原核生物提示系の使用に関連する制限の一部は、真核生物提示系を使用することによって解決できる。例えば、真核生物宿主細胞は一般に、比較的大型のタンパク質の提示に適応し得、複雑なグリコシル化を含む翻訳後修飾が可能である。酵母提示系の使用に付随するユニークな長所には、酵母細胞が比較的単純で安価な培養液中で高密度になるまで培養できるという有利な特性が含まれる。加えて、真核細胞は大きいので、フローサイトメトリーによる所望の特性を有するタンパク質を発現する１個の細胞についてライブラリをスクリーニングすることができる。
【０００５】
しかし、実際、タンパク質提示のために真核宿主細胞を大規模に使用することは、宿主細胞の形質転換効率などのいくつかの根本的な問題により制限される。例えば、酵母細胞形質転換の効率は、通常、１０４−１０５ｃｆｕ／μｇＤＮＡであり、これにより、酵母提示に基づく系において大型のライブラリを提示する能力が大きく制限される。今日、報告されている酵母提示ライブラリの最大のものは１０９前後のサイズである。
【０００６】
研究者が抗体探索及び分子進化適用のために原核及び真核提示系の威力を活用することを可能にする複数種提示系は、タンパク質提示の領域での重要な進歩と言える。複数種又は異種間提示系を開発するための以前の取り組みは、特異的外面タンパク質との関心のあるタンパク質配列のライブラリの融合に基づく提示ストラテジーが、表面タンパク質が由来する１種類の宿主細胞に限定されるということによって妨げられている。例えば、関心のあるタンパク質が酵母細胞壁タンパク質を含む融合タンパク質として提示される提示ストラテジーにおいて前提とされる酵母提示系は、本質的に酵母に限定され、ファージ及び哺乳動物宿主細胞で実施することはできない。
【０００７】
Ｈｕｆｔｏｎら（米国特許出願２００３０１８６３７４ Ａ１）で示されるように、先行技術の提示系は、通常、原核（ファージ）提示ベクターから真核（酵母）提示ベクターへとコード配列を移入するためにさらなる段階が必要であるベクターを使用する。一般的に、異なる遺伝子パッケージを用いて第一の提示系から第二の提示系へと移動させるために、第一のベクターから第二のベクターへの発現カセットの移動に制限部位の同じセットを使用するように設計されたクローニングストラテジーを用いた消化及び核酸連結によって、第二の宿主細胞（例えば種）での使用のためにベクターを修飾しなければならない。実際に、第二の種での提示に対してコード配列のライブラリを適合させるためにＤＮＡ消化及び核酸連結を行わなければならないプロセスは非効率的であり、プロセス中にユニークな特性を有する所望のものである可能性があるメンバーが失われ得る恐れがあり、それによりライブラリの多様性に悪影響がある。
【０００８】
従って、提示ベクター又は提示ベクターのライブラリの分子操作を何ら行わずに、原核（ファージ又は細菌）遺伝子パッケージの別の異なる種間又は原核遺伝子パッケージと真核（酵母、哺乳動物細胞）系との間又は２種類の別の真核生物宿主細胞（酵母及び哺乳動物細胞）間で、提示ベクターを移動させることができる理想的なタンパク質提示系に対するニーズは満たされていない。
【０００９】
本発明の要約
本発明は、ポリペプチドの様々なライブラリの異種間複数種の両方の提示を可能にするタンパク質提示系を提供する。何らかの分子操作（即ち、ＤＮＡ消化及び核酸連結）の必要なく、同じ発現ベクターを用いて、異種間及び複数種提示法を実施することができる。ファージ及び細菌細胞又はファージ及び酵母細胞又はファージ及び哺乳動物細胞などの遺伝子パッケージの複数種の表面上で、コード配列の多様性のあるレパートリーによりコードされるタンパク質産物を提示するために、本発明の組成物及び方法を使用することができる。本発明の組成物及び方法は、探索（即ちスクリーニング）又は分子進化プロトコールとの関連においてタンパク質のコレクションの提示に特に有用である。
【００１０】
とりわけ、本発明は、提示ベクター又は提示ベクターのライブラリの分子操作を何ら行わずに、原核（例えばファージ又は細菌）と真核（酵母、哺乳動物細胞）生物宿主細胞との間又は真核生物宿主細胞（例えば、酵母及び哺乳動物細胞）の異なる種の間の両方で研究者が発現／提示ベクターを移動させることができるようになる、タンパク質提示系を提供する。
【００１１】
図１で示されるように、開示される提示系によって、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の様々な種の外面上で外来配列を提示できるようになる。各提示系は、一般に、２つの成分：１）複数種又は異種間発現ベクターと、２）各種に対する対応するヘルパーベクターと、を有する。ある実施形態において、本発明は、異種間又は複数種発現ベクター、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ６及びＰＭＡＴ５を提供する。ｐＭＡＧ１及びｐＭＡＧ９ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。ベクターｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ５及びｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、酵母プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ヘルパー提示ベクター、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８を提供する。細菌ヘルパー提示ベクターｐＭＡＬ１（図１５Ａ参照）及びｐＭＡＬ２（図１５Ｂ参照）は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外膜ドメインに融合したアダプター２を含む融合タンパク質を発現する発現カセットを含む。各酵母ヘルパー提示ベクターは、様々な酵母細胞外壁タンパク質に融合したアダプター２を含む融合タンパク質の発現を支配する（図１１参照）。とりわけ、ｐＭＡＴ３は、Ｆｌｏ１のＣ末端ドメインに融合したアダプター２の発現を支配し、ｐＭＡＴ７はアダプター２ Ａｇａ２融合タンパク質を発現し；ｐＭＡＴ８はアダプター２ Ｃｗｐ２融合タンパク質を発現する。
【００１３】
異種間又は複数種発現ベクターのみを対応する宿主細胞（Ｅ．コリ又は酵母細胞又は哺乳動物細胞など）へ導入することによって、第一のアダプターエレメント（本明細書中で「アダプター１」と呼ぶ。）とインフレームで融合した外来ポリペプチドが発現され分泌される。特定の提示ベクターセットの対応するヘルパーベクターと組み合わせた本発明の発現ベクターの同時発現は、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上でのタンパク質ライブラリの外来ポリペプチドメンバーの提示を支配する。特定のベクターセットのヘルパーベクター成分が第二のアダプターエレメント（本明細書中で「アダプター２」と呼ぶ。）を含み、それが、タンパク質配列のライブラリを提示するために使用されている特異的遺伝子パッケージ又は宿主細胞で機能的である外面アンカータンパク質に融合した第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用を介して支配する結果、表面提示が起こる。
【００１４】
例えば、Ｅ．コリ細胞での外来ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質の発現を支配する複数種又は異種間提示ベクターと組み合わせた、ファージコートタンパク質に融合したアダプター２を含むヘルパーベクターの同時発現によって、外来ポリペプチドのライブラリがファージ粒子上で提示される。同様に、外来ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質の発現を支配する複数種提示ベクターと組み合わせた、細菌外膜アンカータンパク質に融合したアダプター２を含む細菌ヘルパーベクターの同時発現によって、細菌提示ライブラリが得られる。あるいは、ポリペプチド−アダプター１融合タンパク質のライブラリの発現を支配する複数種提示ベクターと組み合わせて、酵母外面アンカータンパク質に融合したアダプター２を含む酵母ヘルパーベクターを使用することによって、酵母提示ライブラリが得られる。本発明の複数種提示ベクターと組み合わせて、哺乳動物外面タンパク質に融合したアダプター２を含む哺乳動物ヘルパーベクターを同時発現させることにより、哺乳動物提示ライブラリを調製することができる。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、原核及び真核細胞提示系間で、関心のあるタンパク質のライブラリを移動させるのに適切な異種間提示系を提供する。とりわけ、本発明は、関心のあるポリペプチド配列をコードする発現ベクターを操作する必要のない、原核生物宿主及び真核生物宿主細胞での、関心のあるポリペプチド配列のレパートリーの連続提示のための異種間提示系を提示する。
【００１６】
大まかに言えば、本発明の各異種間提示ベクターセットは、１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする異種間発現カセットと、を含む提示ベクターと、２）原核生物宿主により発現される外面タンパク質に融合した、提示ベクターの第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第一のヘルパーベクターと、３）真核生物宿主細胞により発現される外面タンパク質に融合した、第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第二のヘルパーベクターと、を含む。開示される細菌／酵母異種間提示ベクターは、次の機能的エレメント：酵母プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、細菌／酵母二重機能シグナル配列；関心のある遺伝子；アダプターコード配列；及び酵母転写終結配列を含む。細菌ヘルパーベクターは、アダプター２及び細菌外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含み、Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、関心のあるタンパク質がＥ．コリ細胞で細胞表面提示される。従って、酵母細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、関心のあるタンパク質が酵母細胞上で表面提示される。
【００１７】
本発明のこの態様の特定の実施形態は、関心のあるタンパク質又はタンパク質のライブラリを連続的にファージウイルス粒子（原核生物宿主細胞）及び酵母又は哺乳動物細胞の何れか（真核生物宿主細胞）の上で提示するための方法を提供する。一般に、ファージ／哺乳動物異種間提示ベクターは、次の機能的エレメント：（１）哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、（２）細菌／哺乳動物二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）哺乳動物ポリＡ配列を含む。米国特許第７，１７５，９８３号に記載のように、ファージに対するヘルパーベクターは、ウイルス粒子のアセンブリーに必要とされるファージ遺伝子全て及びアダプター２及び外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含む。哺乳動物細胞に対するヘルパーベクターは、哺乳動物表面アンカーシグナルとのアダプター２融合物を発現するための発現カセットを含む。Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、ファージ粒子上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、哺乳動物細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、哺乳動物細胞において関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００１８】
本発明の異種間提示系のある実施形態は、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞の表面上でのタンパク質配列のライブラリの連続提示のための系を提供する。開示されるファージ／哺乳動物異種間提示ベクター＋（プラス）上記の細菌ヘルパーベクターを用いて、Ｅ．コリ細胞でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現により、細菌細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、ファージ／哺乳動物異種間提示ベクター＋哺乳動物ヘルパーベクターを用いることにより、哺乳動物細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、哺乳動物細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、２種を超える受容宿主細胞上での異種間提示のための方法を提供する。例えば、何らかの組み合わせ又は順序で、ファージ、酵母又は哺乳動物宿主細胞上でタンパク質配列のライブラリを連続的に提示するために、本発明を使用することができる。ファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクターは：（１）イントロン配列内部の哺乳動物プロモーター、酵母プロモーター及びイントロン後のより短い細菌プロモーター；（２）Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において機能的であるシグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）転写終結配列を含む。個々の種に対するヘルパーベクターは上記で述べられている。従って、ファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクター＋各種に対する対応するヘルパーベクターを使用することにより、対応する種においてアダプター１及びアダプター２融合物を同時発現させると、ファージ又は酵母細胞又は哺乳動物細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示されるようになる。
【００２０】
本発明はまた、様々な原核及び真核生物宿主細胞でタンパク質の表面提示を支配するのに適切なヘルパー提示ベクターと組み合わせた異種間及び複数種発現ベクターの特定のセットを含む、本発明の提示ベクターセットを含むキットも提供する。例えば、ファージ及び哺乳動物宿主細胞の表面上でのタンパク質発現ライブラリの連続提示を支配するための用途に適切な異種間提示キットは、適切な包装中に、哺乳動物細胞での細胞表面提示を支配する哺乳動物ヘルパー提示ベクターｐＭＡＧ２（図５）と組み合わせて、ファージ提示を促進するベクターセットｐＭＡＧ９（図２）及びＧＭＣＴ（図４）を含み得る。あるいは、酵母及び哺乳動物細胞上でのタンパク質発現ライブラリの連続提示を支配するための用途に適切な複数種提示キットは、適切な包装中に、哺乳動物提示に対するベクターｐＭＡＧ９（図２）及びｐＭＡＧ２（図５）及び酵母提示に対するベクターｐＭＡＴ５（図１０）及びｐＭＡＴ３（図１１）を含むベクターセットを含み得る。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルパー提示ベクターを含む宿主細胞を含む。適切な原核生物宿主には、Ｅ．コリ細胞又はファージが含まれる。適切な真核生物宿主は酵母細胞又は哺乳動物細胞である。好ましい原核及び真核生物宿主は、線状ファージウイルス及び酵母Ｓ．セレビシエ細胞である。
【００２２】
本発明のファージ／酵母異種間提示ベクターセットは、一般に、次の機能的エレメント：（１）酵母プロモーター及び細菌プロモーター、その前方に、（２）細菌／酵母二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）酵母転写終結配列を含む。米国特許第７，１７５，９８３号に記載のように、ファージに対するヘルパーベクターは、ウイルス粒子のアセンブリーに必要なファージ遺伝子全て及びアダプター２及び外面タンパク質をコードする遺伝子融合物の少なくとも１コピーを含む。酵母Ｓ．セレビシエに対するヘルパーベクターは、酵母外壁タンパク質に融合したアダプター２を含む融合タンパク質の発現を支配する発現カセットを含む。Ｅ．コリ細胞におけるアダプター１及びアダプター融合物の同時発現によって、ファージ粒子上で関心のあるタンパク質が表面提示される。従って、酵母細胞におけるアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、酵母細胞上で関心のあるタンパク質が表面提示される。
【００２３】
本発明はまた、別の種の宿主細胞で可溶性タンパク質を発現するための用途の広い方法も提供する。異種間発現カセットのタンパク質産物に融合した適合性のあるアダプター配列と対をなし相互作用することができるアダプター配列と組み合わせた、外面アンカータンパク質を含む融合タンパク質を含むヘルパーベクターなしで本発明の発現ベクターを使用すると、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞を含む複数の宿主細胞においてタンパク質の可溶性発現が起こる。本発明の複数種及び異種間発現／提示ベクターを使用することにより、ベクターの分子操作を何ら行う必要なく、異なる宿主細胞で連続的に関心のあるタンパク質を産生させることができる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、原核又は真核宿主細胞の２種類の異なる種上で関心のあるタンパク質又は多様性のあるタンパク質のライブラリを提示するために使用することができる、複数種提示方法を提供する。適切な原核細胞には、グラム陰性細菌細胞が含まれる。適切な真核生物宿主には、以下に限定されないがＳ．セレビシエ細胞などの酵母細胞又は哺乳動物細胞が含まれる。
【００２５】
特定の複数種実施形態において、本発明は、酵母及び哺乳動物細胞上での関心のあるタンパク質配列のライブラリの連続的細胞表面提示のための方法を提供する。本発明の酵母／哺乳動物複数種提示ベクターは、次の機能的エレメント：（１）イントロン配列内部の哺乳動物プロモーター及び酵母プロモーター；（２）酵母／哺乳動物二重機能シグナル配列；（３）関心のある遺伝子；（４）アダプター１コード配列；及び（５）酵母及び哺乳動物のための転写終結配列を含む。酵母又は哺乳動物に対するヘルパーベクターは、上記の酵母又は哺乳動物細胞の細胞表面アンカーシグナルとのアダプター２融合物を発現するための発現カセットを含む。従って、対応する種でのアダプター１及びアダプター２融合物の同時発現によって、酵母細胞又は哺乳動物細胞上での関心のあるタンパク質の表面提示が起こる。
【００２６】
従って、本発明は、関心のあるタンパク質のライブラリから所望のタンパク質特性を特徴とする関心のあるタンパク質を単離するために使用することができる方法を提供する。好ましい方法は、ファージ上で提示されるタンパク質配列のライブラリから所望の特性を有するタンパク質を最初に同定すること、及び、続いて酵母又は哺乳動物提示系を用いてリードタンパク質を再評価することである。例えば、ヒトタンパク質を改変するために、大規模なライブラリ（多様性＞１０ｅ９）をファージ／酵母／哺乳動物異種間提示ベクターで構築する。ファージ提示技術のユニークな長所を利用して、この大規模なライブラリを最初にファージヘルパーベクターでのファージ提示方式で構築することができ、数回のライブラリパニングを行う。このように、小規模の酵母提示ライブラリを構築するために、ファージパニングからのリードライブラリのＤＮＡ（多様性＜１０ｅ６）を直接、酵母ヘルパーベクターで酵母細胞に形質転換する。酵母提示ライブラリのＦＡＣＳソーティングから単離されるリードは折りたたみ及びグリコシル化などの所望の真核生物特性を有し、これは、機能及び産生などの下流のプロセスにおいて非常に有益となる。さらに、必要に応じて、機能アッセイのために、哺乳動物細胞表面上で酵母提示から単離されたリードを直接提示することができる。
【００２７】
本発明はまた、ライブラリの大きさが酵母提示ライブラリの構築に適切である場合、酵母／哺乳動物異種間提示ライブラリからの、所望の結合特異性を特徴とするタンパク質の単離のための方法も提供する。本発明の酵母ヘルパー提示ベクターを用いて、関心のあるタンパク質を含むライブラリを最初に酵母上で提示することができる。続いて、細胞表面提示及び選択の第二回目に対して、酵母ライブラリ選択アッセイから単離されたリードＤＮＡを直接哺乳動物細胞へと形質移入することができる。発現／提示ベクターの分子操作を何ら行う必要なく、上記の異種間（酵母から哺乳動物細胞）を行うことができる。本発明の異種間提示能により、第一の提示系で同定されたリードの機能確認を同時に提供するスクリーニングアッセイを研究者が行えるようになる。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、異種間複数種の機能などの所望の特性を有するシグナル配列の単離のための方法を提供する。対応する異種間提示ベクターを用いてシグナル配列のライブラリを構築することができる。対応する種における提示ライブラリのシャトリング選択から、対応する種での機能を有するシグナル配列を単離することができる。
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に指示されない限り、複数の意味も含む。本明細書中で使用する場合、「種」という用語は、比較的最近の共通の祖先を有するために、形態学的、解剖学的、生理学的及び遺伝学的に非常に類似している生物の群を指す。様々な種は、通常、その他の違いにかかわらず、共通の生命機能を果たすことにおいて共通の特性を示す。例えば、ヒト細胞とマウス細胞とは、共通のある種の分子標認点を有し、同じ種のメンバーであるとみなされ（即ち哺乳動物細胞）、一方、ヒト細胞と酵母細胞とは、真核宿主細胞の異なる種である。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子パッケージ」という用語は、関心のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が発現及び／又は表面提示のためにパッケージ化されている、ウイルス又は細胞を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「複数種提示」という用語は、様々なタイプの原核遺伝子パッケージ（即ち、ファージ又は細菌）又は様々なタイプの真核生物宿主細胞（即ち、酵母又は哺乳動物細胞）の表面上でポリペプチド配列のライブラリをコードするポリヌクレオチド配列の様々なレパートリーを研究者が発現させることを可能にする提示ストラテジーを指す。例えば、複数種提示ストラテジーによって、酵母及び哺乳動物細胞の表面上で抗体を提示することが可能となる。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「異種間提示」という用語は、原核遺伝子パッケージ及び真核生物宿主細胞の表面上で連続的にポリペプチド配列のライブラリをコードするポリヌクレオチド配列の様々なレパートリーを研究者が提示することを可能にする提示ストラテジーを指す。例えば、異種間提示ストラテジーによって、ファージ上及び連続的に酵母上で抗体ライブラリを提示することが可能となる。
【００３３】
「原核細胞系」及び「原核遺伝子パッケージ」という用語は、細菌細胞又は原核ウイルス（ファージ又は細菌胞子など）などの原核細胞を指すために、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３４】
「真核細胞系」及び「真核宿主細胞」という用語は、動物、植物、真菌及び原生生物及び真核ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）の細胞を含む真核細胞を指すために、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。この用語は、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター又はエンハンサーなどの非翻訳隣接領域を含まない。
【００３６】
「発現カセット」という用語は、本明細書中で、組み換えタンパク質／ペプチドを発現させるためにベクターにおいて構築された機能的単位を指すために使用される。これは通常、プロモーター、リボソーム結合部位及び発現標的のｃＤＮＡからなる。発現カセットを構築するために、その他の副成分を付加することができる。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、挿入された核酸分子を宿主細胞へ及び／又は宿主細胞間で移動させる核酸分子、好ましくは自己複製するものを指す。通常、ベクターは、複製起点、選択マーカー及び又はウイルスパッケージシグナル及びその他の制御エレメントを含む環状ＤＮＡである。ベクター、ベクターＤＮＡ、プラスミドＤＮＡは、本明細書の記述において交換可能な用語である。この用語は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記機能の複数を与えるベクターも含まれる。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞に導入された場合にポリペプチドへと転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。
【００３９】
「発現ベクター」、「複数種発現ベクター」及び「異種間発現ベクター」という用語は、本発明のヘルパーベクターにより産生されるアダプター配列と対をなして会合する能力を特徴とするアダプター配列とインフレームで融合した関心のあるタンパク質の可溶性の発現を支配するベクターを指す。
【００４０】
「ヘルパーベクター」という用語は、本発明の発現ベクターにより産生されたアダプター配列と対をなして会合する能力を特徴とするアダプター配列とインフレームで融合したアンカータンパク質を含む融合タンパク質を産生するように設計された遺伝子パッケージ又は宿主細胞特異的ベクターを指す。一時的に同時形質転換することにより、又は恒久的に宿主ゲノムに組み込むことにより、発現ベクターと組み合わせて、ヘルパーベクターを受容宿主細胞に導入することができる。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「複数種提示ベクターセット」という用語は、特定の種の遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上でポリペプチドを提示するように機能する相補的アダプター配列を含むように設計されている発現ベクター及びヘルパーベクターの特定の組み合わせを指す。例えば、哺乳動物提示のための一連のベクター、ｐＭＡＧ９（図２）及びｐＭＡＧ２（図５）、酵母提示のための一連のベクター、ｐＭＡＴ５（図１０）及びｐＭＡＴ３（図１１）である。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「異種間提示ベクターセット」という用語は、原核真核細胞系の両方においてポリペプチドを連続提示するように機能する相補的アダプター配列を含むように設計されている発現ベクター及びヘルパーベクターの特定の組み合わせを指す。例えば、ベクターセットｐＭＡＧ９（図２）及びＧＭＣＴ（図４）はファージ提示を促進し、一方、ｐＭＡＧ２（図５）と組み合わせたｐＭＡＧ９の使用は、哺乳動物細胞での細胞表面提示を支配する。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「発現系」という用語は、通常、所望の発現産物を産生するように機能できる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「表面抗原」という用語は、細胞の原形質膜成分を指す。これは、原形質膜を構成する、内在性膜タンパク質及び表在性膜タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質を包含する。「内在性膜タンパク質」は、細胞の原形質膜の脂質二重層にまたがる膜貫通型タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質は、一般に疎水性アミノ酸残基を含む少なくとも１つの「膜貫通セグメント」からなる。表在性膜タンパク質は、脂質二重層の疎水性の内部には広がらず、これらはその他の膜タンパク質との非共有相互作用により膜表面に結合している。
【００４５】
「外面アンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、遺伝子パッケージの外面に組み込まれるか又は連結される、ポリペプチド又はタンパク質又はタンパク質ドメインを指す。これは、天然由来であるか又は何らかの手段により人工的に作製されたものであり得る。この用語は、「表面アンカー配列」又は「シグナルコートタンパク質」、「外面配列」、「外膜タンパク質」、「膜アンカータンパク質」、「アンカータンパク質」、「細胞壁タンパク質」、「ＧＰＩアンカーシグナル」、「ＧＰＩ結合シグナル」及び「シグナルアンカー配列」と交換可能に使用される。
【００４６】
「シグナル配列」及び「リーダー配列」という用語は、ＤＮＡレベルでより大きいペプチドの成分である分泌ペプチドをコードするＤＮＡ配列を指すために本明細書中で交換可能に使用される。これはまた、分泌ペプチドのアミノ酸配列も指し得る。分泌ペプチドの機能は、細胞の分泌経路を通じてより大きいポリペプチドを支配することである。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用される。これらは、何らかの長さの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの何れかのヌクレオチド又はその類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、何らかの３次元構造を有し得、既知又は未知の何らかの機能を果たし得る。次のものは、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、リンケージ分析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリーの前又は後で行われ得る。非ヌクレオチド成分がヌクレオチド配列の途中に入り得る。ポリヌクレオチドは、重合後、標識成分との連結などにより、さらに修飾され得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸の何れかを指す。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」及び「関心のあるタンパク質」という用語は、何れかの長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書中で交換可能に使用される。このポリマーは、直線状、環状又は分枝状であり得、これは、修飾アミノ酸を含み得、途中に非アミノ酸が入り得る。この用語はまた、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファーＲＮＡを介したアミノ酸付加（アルギンニン化など）、ユビキチン化又は標識成分との連結などの何らかのその他の操作などにより修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性のある部分、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。構造的に、最も単純な天然の抗体（例えばＩｇＧ）は、ジスルフィド結合により相互連結した、４個のポリペプチド鎖、２個の重（Ｈ）鎖及び２個の軽（Ｌ）鎖を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーに相当する。「免疫グロブリン分子」という用語は、例えば、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びそれらの断片を含む。抗体断片の非限定例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（４）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（５）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（６）Ｆ（Ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片；（７）より短いリンカーを有する２個の同一の１本鎖Ｆｖからなるダイアボディ；（８）コイルドコイルドメインのペアの相互作用により安定化されたＦｖからなるｃｃＦｖ抗体が含まれる。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「対をなす相互作用」という用語は、安定な複合体を形成するために、２個のアダプターが、互いに相互作用でき、結合できることを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外面上にポリペプチドをパッケージングできるよう十分に長持ちしなければならない。複合体又は二量体は、どんな条件が存在しても、又は提示されるポリペプチドの形成と検出との時間の間にどんな条件が導入されても（これらの条件は、行われているアッセイ又は反応の機能である。）持ちこたえることができなければならない。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、目標ベクターに対する受容者であり得る又は受容者である、個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれる。この子孫は、天然、偶発的又は故意の突然変異のために、起源となる親細胞と必ずしも完全に（形態において又はトータルＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターによりインビボで形質移入された細胞が含まれる。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「レパートリー」という用語は、機能的又は物理的起源の種々のメンバーの総合的集団を指す。ライブラリは、同種の種々のメンバーの総合的集団である。一般に、レパートリーは、非常に広範で大型の機能的及び物理的背景を示し、従って、これは、機能的に定義されるライブラリを含み得る。例えば、種における免疫グロブリンの全体的な遺伝学的能力は、その免疫グロブリンレパートリーであり；タンパク質改変の目的のために、ライブラリは通常、１又は定義される多くの祖先由来の種々の分子の集団を指す。治療用抗体の作製などの、ある種の実際的な目的のレパートリーには、このような目的のために作製された全てのライブラリが含まれる。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「アダプター」という用語は、２個の異なる相互作用するアダプター間で物理的及び／又は機能的な合致に基づき物理的単位を形成するために互いに対をなし相互作用できる、相補的エレメント又は成分を指す。アダプターは、天然又は人工的起源由来の、タンパク質、タンパク質ドメイン、ペプチド、非ポリペプチドの化合物などであり得る。アダプターに対する典型例には、コイルドコイルへテロ二量体を形成する２つの相互作用するポリペプチド、ＧＲ１及びＧＲ２など（配列番号１９及び２０で示される。）；ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎ；天然及び人工的ロイシンジッパーなど；リガンドとその同族の受容体との間の特異的結合由来の特異的タンパク質−タンパク質相互作用；機能的単位を形成するための２つの異なるタンパク質のヘテロ二量体複合体など；ビオチン及びストレプトアビジンなどの２つの異なる非ポリペプチド成分からの特異的結合など、が含まれる。本発明に記載の表面提示において使用されるアダプターは宿主種にとって内因性及び／又は外来性であり得、及び／又は人工的なものであり得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、ペプチドの直線状配列は、両配列が実質的なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を示すならば、別の直線状配列と「基本的に同一」である。一般的に、基本的に同一である配列は、相同領域のアラインメント後、互いに少なくとも約６０％同一である。好ましくは、これらの配列は、少なくとも約７０％同一；より好ましくは、これらは少なくとも約８０％同一；より好ましくは、これらは少なくとも約９０％同一；より好ましくは、これらの配列は少なくとも約９５％同一；さらにより好ましくは、これらの配列は１００％同一である。
【００５６】
先行技術の原核生物提示系
ファージ提示
遺伝子パッケージの表面上でのポリペプチドの提示は、ポリペプチド配列のライブラリをスクリーニングするための強力な方法となる。非常に多様な分子のライブラリを構築し、所望の特性を有する分子を選択することができることから、スクリーニング／探索プロトコールならびに分子進化プロトコールを含む多くの応用に対して、この技術が広く利用可能となった。ファージ提示の起源は、ファージコートタンパク質に外来配列を融合させることによりバクテリオファージＭ１３ウイルス粒子の表面上でＧｅｏｒｇｅ Ｓｍｉｔｈが初めてタンパク質の外来セグメントを発現させた、１９８０年代中頃に遡る（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１３１５−１３１７）。このときから、Ｇｅｏｒｇｅ Ｓｍｉｔｈの知見に基づき、一連の提示系が開発されてきた。これらの系は、２つのカテゴリーに大きく分類することができる（米国特許第５，９６９，１０８号及び同第５，８３７，５００号）。第一世代の系は１−ベクター系である。この系でのベクターは、ファージゲノム全体、その中の挿入物、コートタンパク質遺伝子とインフレームで外来配列を含有する。得られたファージ粒子はファージゲノム全体を担うので、これらは比較的不安定で感染性が低い。第二世代の系は、一般にファージミド系と呼ばれ、２つの成分：（１）ファージ粒子へのファージミドのパッケージングを可能にするためのファージコートタンパク質及びファージ由来複製起点に融合した外来配列を担うファージミドベクター；及び（２）ファージパッケージングに必要とされる全てのその他の配列を担うヘルパーファージを有する。ヘルパーファージは通常、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製造のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ及びＳｔｒａｔａｇｅｎ製造のその誘導体ＶＣＳＭ１３などの複製欠損体である。ヘルパーファージによる細菌細胞の重複感染において、ファージミドベクターを担い、外来配列を提示する、新しくパッケージングされたファージが産生される。このように、先行技術のファージミド系は、ファージ外面配列（即ちコート配列）の少なくとも一部への外来配列の融合を必要とする。最もよく使用される融合又は提示部位は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩ及びＶＩＩＩ内であるが、遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸ融合物が報告されている。
【００５７】
コートタンパク質融合系の代わりに、融合ファージミド系への様々な修飾が記載されている。Ｃｒａｍｅｒｉらは、ｃＤＮＡ産物を提示するための系を考案したが、ここでは、ファージミドベクター上で提示されるべき外来配列の隣にＦｏｓ癌遺伝子が挿入され、同じベクター上で遺伝子ＩＩＩの隣にＪｕｎ癌遺伝子が挿入された（Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：６９−７５を参照）。Ｃｒａｍｅｒｉアプローチは、ｆｏｓとｊｕｎタンパク質との間の選択的相互作用を活用し：Ｆｏｓ−外来ポリペプチドが発現され、細胞膜周辺腔に分泌される場合、これがｐＩＩＩ−Ｊｕｎと複合体を形成し、次にこの複合体がＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージでの重複感染においてファージ粒子にパッケージングされる。
【００５８】
Ｃｒａｍｅｒｉ系と同様の別の変法は、ＷＯ０１／０５９５０、米国特許第６７５３１３６号に記載の「システインカップリング」提示系である。外来ポリペプチドの連結及び提示には、細菌細胞膜周辺腔における２個のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成が介在し、その一方は外来配列に含有され、他方は外面配列に挿入される。これらの２つの系が外面タンパク質に連結された外来タンパク質を含む融合物の発現を回避するにもかかわらず、これらの系は、提示ベクターにおいてコートタンパク質ｐＩＩＩが構成的に発現されるため、宿主細胞に対するコートタンパク質の毒性を最小限に抑えることはできない。さらに、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成には、外来配列及びコートタンパク質ｐＩＩＩの両方が高レベルで発現される必要がある。従って、低発現のものは何れも提示することができない。
【００５９】
最近、Ｗａｎｇらは、アダプターに支配される提示系に基づく代替的ファージ提示系を記載した（米国特許第７，１７５，９８３号）が、これには：（ａ）第一のアダプター配列にインフレームで融合した外来ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現ベクター；（ｂ）ファージ粒子をパッケージングするのに必要な外面タンパク質をコードする外面配列を含むヘルパーベクターが含まれ、外面タンパク質の１つが第二のアダプターにインフレームで融合している。従って、外来ポリペプチドの提示は、第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用によって達成される。
【００６０】
Ｅ．コリ提示
Ｅ．コリの表面上でのポリペプチドの提示は、ファージ提示技術に対する代替物として開発された。ファージ提示と同様に、細菌提示は、様々な遺伝学的ツール及び突然変異株が利用可能であり、形質転換効率が高く、そのため大規模なライブラリ構築及びスクリーニングに理想的であるので、魅力的な方法である。グラム陰性細菌において、提示されるべきタンパク質の様々なアンカータンパク質への融合に基づく表面提示系が報告されており、そこでは、外膜タンパク質（Ｃｈａｎｇ及びＬｏ ２０００、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７８：１１５−１２２；Ｌｅｅら、２００４、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：５０７４−５０８０）、線毛及び鞭毛（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ−Ｗｉｋｓｔｒｏｍら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：１３１９−１３２６）、修飾リポタンパク質（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：２３９−２４７）、氷核タンパク質（Ｊｕｎｇら、１９９８、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：５７６−５８０）及びオートトランスポーター（Ｖｅｉｇａら、２００３、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８５：５５８５−５５９０）が提示のためのアンカーとして使用された。
【００６１】
先行技術の真核提示系、酵母提示
真核生物宿主細胞、サッカロミセス・セレビシエの細胞壁での異種タンパク質の提示は、細胞壁タンパク質α−アグルチニンＡＧＡ１のＣ末端半分へのα−ガラクトシダーゼの融合によって、１９９３年に最初に記載された（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ ＭＰら、Ｙｅａｓｔ ９：３９９−４０９）。これ以来、様々な細胞ウェルタンパク質（ｃｅｌｌ ｗｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）への関心のあるタンパク質の融合に基づく様々な酵母提示系が報告された（Ｋｏｎｄｏ Ｍら、概説）。酵母に対して開発された細胞−表面提示系は殆ど全て、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー依存性である。１０を超える、Ｃ末端に推定ＧＰＩ連結シグナルのある酵母細胞ウェルタンパク質が、ペプチド及びタンパク質を提示できることが証明されているが、これには、Ｓ．セレビシエにおける、ａ−アグルチニン（Ａｇａ１及びＡｇａ２）、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ４及びＩｃｗｐ；メタノール資化酵母（ハンセヌラ・ポリモルファ）における、ＨｐＳＥＤ１、ＨｐＧＡＳ１、ＨｐＴＩＰ１、ＨＰＷＰ１及びカンジダ・アルビカンスにおける、Ｈｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ｒｂｔ５ｐが含まれる。今日まで、酵母細胞表面上で２０を超える外来タンパク質の提示に成功している。
【００６２】
上記の細胞−表面提示系全ての中で、ａ−アグルチニン受容体に基づくＤａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐにより作製された系が、ｓｃＦｖ抗体及び抗体ライブラリなど、様々なペプチド及びタンパク質を提示するために広く使用されてきた（米国特許第６３０００６５号、同第６４２３５３８号、同第６６９６２５１号及び同第６６９９６５８号）。Ｓ．セレビシエにおいて、ａ−アグルチニン受容体は、細胞−細胞相互作用を安定化し、接合「ａ」及びα半数体酵母細胞の間の融合を促進するための接着分子として作用する。この受容体は、コアサブユニットＡｇａ１及び小サブユニットＡｇａ２からなる。この細胞からＡｇａ１が分泌され、そのＧＰＩアンカー−連結シグナルを通じて、酵母細胞壁の細胞外マトリクスにおいてＯ−結合型グルカンに共有結合するようになる。Ａｇａ２は、２個のジスルフィド結合を通じて、おそらく、ゴルジ体において、Ａｇａ１に結合し、分泌後、Ａｇａ１を介して細胞に連結し続ける。この酵母提示系は、Ａｇａ２サブユニットとのタンパク質の融合を通じて酵母細胞表面上で組み換えタンパク質を提示するために、Ａｇａ１及びＡｇａ２タンパク質の会合を利用する。
【００６３】
Ｗｉｔｔｒｕｐの系は、免疫グロブリンＦａｂ断片などの複数鎖ポリペプチドに適している（Ｈｕｆｔｏｎら、米国特許出願２００３０１８６３７４ Ａ１）。Ｈｕｆｔｏｎらは、真核細胞での使用に適切な提示系の基礎としてＦｏｓ／Ｊｕｎ相互作用をおそらく使用できるであろうことに言及している。しかし、Ｈｕｆｔｏｎらは、真核宿主細胞でのタンパク質提示を支配するためにＦｏｓ／Ｊｕｎ相互作用がどのように利用され得るかを実現する説明を提供しなかった。しかし、参考文献は、Ｄａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐにより開発された、Ｆａｂ抗体の酵母提示に対するＡｇ２融合の使用法（米国特許第６３０００６５号、同第６４２３５３８号、同第６６９６２５１号及び同第６６９９６５８号）及び分子クローニングによるファージ提示ベクターから酵母ベクターへの遺伝子移入法のみを教示する。
【００６４】
哺乳動物提示
細胞表面受容体の膜ドメイン（Ｃｈｅｓｎｕｔら、１９９６、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｈｏら、２００６、ＰＮＡＳ ０３：９６３７−９６４２）、ＧＰＩアンカー配列（米国特許６８３８４４６号）、非開裂型タイプＩＩシグナルアンカー配列（米国特許７１２５９７３号）を含む様々な膜アンカータンパク質への融合により哺乳動物細胞の表面上でのタンパク質の提示を遂行するために、多くのアプローチが使用されてきた。典型例は、ｐＤｉｓｐｌａｙベクターであり、これは、哺乳動物細胞表面上でタンパク質を提示するための、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．からの市販ベクターである。このベクターにおいて、関心のあるタンパク質を細胞表面受容体ＰＤＧＦＲの膜ドメインと融合させる。米国特許第６９１９１８３号において別のアプローチもまた報告された。この系において、細胞表面はタンパク質Ｇなどの分子を捕捉し、タンパク質Ａは、哺乳動物細胞表面上で抗体分子を捕捉するために使用される。
【００６５】
本発明の複数種及び異種間提示系
ファージ提示は、受容体リガンド選択、抗体操作及びタンパク質エピトープ同定などの様々な適用に対して最もよく使用される系である。利便性及びファージ遺伝子操作の効率ゆえに、サイズ１０９の大型の多様なライブラリを１つのファージライブラリにおいて作製することができる。しかし、ファージ系を使用することができるのは、翻訳後修飾及びその他の細胞内プロセシングが必要ないか所望されない状況においてのみである。抗体断片などの殆どの真核タンパク質の場合、これらの生物学的機能は、グリコシル化などの細胞内プロセシングと関与する。さらに、真核タンパク質の一部は原核細胞において機能的に折りたたまれ得ない。
【００６６】
真核細胞の表面上での外来タンパク質の提示により、原核細胞系の制限を克服することができる。これにより、発現される真核タンパク質の折りたたみ及びグリコシル化が可能となり、比較的大きなタンパク質の提示が可能となる。しかし、真核細胞形質転換の効率が低いことから、実現できるライブラリは非常に小さいサイズに限定されており、これによって、ファージ提示が提供できる規模に匹敵し得ない。
【００６７】
従って、様々な適用に対する原核及び真核両方の提示技術の力を合わせた提示系の開発は根本的な難題である。関心のあるタンパク質が特異的外面配列と融合される場合、このタンパク質を提示できるのは、対応する種の表面上のみである。ファージ提示から酵母提示に移すために、Ｈｕｆｔｏｎら（米国特許出願第２００３０１８６３７４ Ａ１号）は、消化及び核酸連結を通じて原核提示ベクター（ファージｐＩＩＩコートタンパク質融合ベクター）から真核提示ベクター（酵母Ａｇａ２融合ベクター）に関心のある遺伝子を移すための方法を記載した。
【００６８】
本発明は、複数種提示を行うことができる新しい提示系を提供する。より具体的に、ＤＮＡ消化及びクローニングなどの分子操作を何ら行わずに、同じ提示ベクターを用いて、ファージ及び細菌細胞又は／及び酵母細胞又は／及び哺乳動物細胞などの、複数種の表面上で関心のあるタンパク質を提示することができる。さらに、この提示系は、異種間提示法の機能を提供する。例えば、開示されるベクターセットを用いて、ファージ又は細菌細胞などの原核細胞系において関心のあるタンパク質を提示することができ、続いて、ベクターの分子操作を何ら行うことなく、このタンパク質又は、タンパク質の組み換えライブラリの場合、関心のあるタンパク質（複数形）を、酵母又は哺乳動物細胞などの真核細胞の表面上で提示することもできる。本発明の各提示系は、提示ベクターの特定のセットを利用する。本発明の様々なベクターセットは、特定の遺伝子パッケージ又は宿主細胞に特異的なヘルパーベクターと組み合わせて、第一のアダプター（即ちアダプター１）に融合したポリペプチド配列のライブラリをコードする複数種発現ベクターを含む。各ヘルパーベクターは、第二のアダプター（即ちアダプター２）に融合した細胞表面アンカータンパク質を含む。本明細書中で示されるように、対応するアダプターを含むヘルパーベクターと組み合わせた複数種提示ベクターの同時発現によって、アダプター（即ちアダプター１及びアダプター２）の対をなす相互作用を介してその表面上で提示されるポリペプチド配列のレパートリーを有する遺伝子パッケージ（又は宿主細胞）集団が作製される。
【００６９】
ベクターの成分
アダプター
本提示系の提示及びヘルパーベクターを構築するために適用可能なアダプター配列は、様々な起源由来であり得る。一般に、安定した多量体の形成に関与する何らかのタンパク質配列はアダプター配列候補である。このように、これらの配列は、何らかのホモ多量体又はヘテロ多量体タンパク質複合体由来であり得る。代表的ホモ多量体タンパク質は、ホモ二量体受容体（例えば血小板由来増殖因子ホモ二量体ＢＢ（ＰＤＧＦ）、ホモ二量体転写因子（例えばＭａｘホモ二量体、ＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）ホモ二量体）及び増殖因子（例えば神経栄養因子ホモ二量体）である。ヘテロ多量体タンパク質の非限定例は、タンパク質キナーゼ及びＳＨ２−ドメイン含有タンパク質の複合体（Ｃａｎｔｌｅｙら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７６７ ７７８；Ｃａｎｔｌｅｙら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４４）：２６０２９ ２６０３２）、ヘテロ二量体転写因子及びヘテロ二量体受容体である。
【００７０】
以下に限定されないが、増殖因子に結合する受容体（例えばヘレグリン）、神経伝達因子（例えばγ−アミノ酪酸）及びその他の有機又は無機小分子（例えば鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）を含む、非常に多数のヘテロ二量体受容体が知られている。好ましいヘテロ二量体受容体は、核ホルモン受容体（Ｂｅｌｓｈａｗら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９３（１０）：４６０４−４６０７）、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２受容体複合体及びＧ−タンパク質共役受容体（以下に限定されないが、オピオイド（Ｇｏｍｅｓら、（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０（２２）：ＲＣ１１０）；Ｊｏｒｄａｎら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９９：６９７ ７００）、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン及びＧＡＢＡ．ｓｕｂ．Ｂの受容体ファミリーを含む。）である。既知のヘテロ二量体受容体の大多数の場合、それらのＣ末端配列がヘテロ二量体形成に介在することが分かっている。
【００７１】
ＧＡＢＡＢ−Ｒ１／ＧＡＢＡ−Ｒ２受容体は、上記の物理的特性を示す。これらの２つの受容体は、基本的に、生理的条件下（例えばインビボ）及び生理的体温でホモ二量体を形成することができない。Ｋｕｎｅｒら及びＷｈｉｔｅらによる研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８３：７４ ７７）；Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９６：６７９ ６８２））は、インビボでのＧＡＢＡＢＲ１及びＧＡＢＡＢＲ２Ｃのヘテロ二量体形成特異性を示した。実際、Ｗｈｉｔｅらは、このヘテロ二量体受容体ペアの独占的な特異性に基づき、酵母細胞からＧＡＢＡ．ｓｕｂ．Ｂ−Ｒ２をクローニングすることができた。Ｋａｍｍｅｒｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８：１３２６３-１３２６９）によるインビトロ実験は、生理的体温でアッセイした場合、生理的緩衝液条件下でＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２Ｃ末端配列の両方とも、ホモ二量体を形成することができないことを示した。具体的に、Ｋａｍｍｅｒｅｒらは、沈降実験によって、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２のヘテロ二量体形成配列は、単独で試験した場合、生理的条件下及び生理的体温で単量体の分子量で沈降することを明らかにした。等モル量で混合した場合、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２ヘテロ二量体形成配列は、この２つの配列のヘテロ二量体に対応する分子量で沈降する（Ｋａｍｍｅｒｅｒらの表１参照）。しかし、ＧＡＢＡＢＲ１及びＧＡＢＡＢＲ２Ｃ末端配列がシステイン残基に連結される場合、ジスルフィド結合の形成を介してホモ二量体が生じ得る。
【００７２】
本提示系において、アダプターとして多量体形成に関与する多様なコイルドコイルを使用することができる。好ましいコイルドコイルはヘテロ二量体受容体由来である。従って、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２由来のコイルドコイルアダプターを包含する。ある態様において、本コイルドコイルアダプターは、本明細書中でＧＲ１と呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体１のＣ末端配列（配列番号１９）ＥＥＫＳＲＬＬＥＫＥＮＲＥＬＥＫＩＩＡＥＫＥＥＲＶＳＥＬＲＨＱＬＱＳＶＧＧＣ及び本明細書中でＧＲ２と呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体２の配列（配列番号２０）ＴＳＲＬＥＧＬＱＳＥＮＨＲＬＲＭＫＩＴＥＬＤＫＤＬＥＥＶＴＭＱＬＱＤＶＧＧＣを含む。
【００７３】
この例は、アダプター配列の同じ対を含むベクターセットの使用を述べるが（発現ベクター１に関連してアダプター１と呼ばれ、ヘルパー提示ベクターに関連してアダプター２と呼ばれる。）、代替的アダプターを用いて、本明細書中に記載のベクターを調製することができ、本発明の方法を実施することができることを理解されたい。例えば、本明細書中で提供される開示に基づき、適切なアダプター配列は、例えばＷｉｎｚｉｐ−Ａ２Ｂ１（Ｋａｔｊａ Ｍ Ａｒｎｄｔら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００２、１０：１２３５−１２４８）；Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ１Ｂ１（Ｋａｔｊａ Ｍ Ａｒｎｄｔら、ＪＭＢ、２０００、２９５：６２７−６３９）；ＦＮｆｎ１０（Ｓａｎｊｉｂ Ｄｕｔｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５、１４：２８３８−２８４８）、ＩＡＡＬ−Ｅ３／Ｋ３（Ｊｅｎｉｆｅｒ Ｒ．Ｌｉｔｏｗｓｋｉ及びＲｏｂｅｒｔ Ｓ Ｈｏｄｇｅｓ、ＪＢＣ、２００２、２７７（４０）：３７２７２−３７２７９）、ＰｃｒＶ／ＰｃｒＧ（Ｍａｘ Ｎａｎａｏら、ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３：１−９）、ｂＺｉｐ及び誘導体（Ｊｕｍｉ Ａ．Ｓｈｉｎ、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４、７６（７−８）：１５７９−１５９０）、ＥＳＣＲＴ−Ｉ／ＩＩ（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｇｉｌｌら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００７、２６：６００−６１２）、ＥＥ１２３４／ＲＲ１２３４及び誘導体（Ｊｏｈｎｔｈａｎ Ｒ．Ｍｏｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１０：６４９−６５５）、Ｌａｍｉｎｉｎ ａ、ｂ、ｇ（Ａｔｓｕｓｈｉ Ｕｔａｎｉら、ＪＢＣ １９９５、２７０（７）：３２９２−３２９８）、ペプチドＡ／Ｂ及び誘導体（Ｉｌｉａｎ Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ及びＨａｎｓ Ｒｕｄｏｌｆ Ｂｏｓｓｈａｒｄ、ＪＭＢ、１９９６、２６３：３４４−３５８）、人工的に設計されたペプチド（Ｄｅｒｅｋ Ｎ．Ｗｏｏｌｆｓｏｎ及びＴｏｍ Ａｌｂｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４：１５９６−１６０７）、ＤｃｏＨ−ＨＮＦ−ｐｌ（Ｒｏｂｅｒｔ．Ｂ．Ｒｏｓｅら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２０００、７（９）：７４４−７４８）及びＡＰＣペプチド（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｌ．Ｄａｙ及びＴｏｍ Ａｌｂｅｒ、ＪＭＢ、２０００、３０１：１４７−１５６）を含む多くのコイルドコイルドメインの何れか由来であり得る。
【００７４】
アダプターサブユニットの特定のペアと会合するアダプターサブユニット相互作用の親和性に依存して、生じたコイルドコイル相互作用を安定させるためにジスルフィド結合を使用する必要がなくなり得る。例えば、上記で列挙するコイルドコイルドメインの一部に対する文献で報告される親和性は、．００００１ｎＭから７０ｎＭ（Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ２Ｂ１に対して４，５ｎＭ、Ｗｉｎｚｉｐ−Ａ１Ｂ１に対して２４ｎＭ、ＦＮｆｎ１０に対して３ｎＭ、ＩＡＡＬ−Ｅ３／Ｋ３に対して７０ｎＭ、ＰｃｒＶ／ＰｃｒＧに対して１５，６ｎＭ及びＥＥ１２３４／ＲＲ１２３４及び誘導体に対して０．０００１ｎＭ）の範囲である。アダプターとしての使用に適切な代替的ヘテロ二量体転写因子には、α−Ｐａｌ／Ｍａｘ複合体及びＨｏｘ／Ｐｂｘ複合体が含まれる。Ｈｏｘは、胚形成中、前後軸のパターン形成に関与する転写因子の大きなファミリーに相当する。Ｈｏｘタンパク質は、保存された３個のアルファへリックスホメオドメインを有するＤＮＡと結合する。特異的ＤＮＡ配列と結合するために、Ｈｏｘタンパク質は、Ｐｂｘホメオドメインなどのヘテロ−パートナーの存在を必要とする。Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒらは、Ｈｏｘ−Ｐｂｘ複合体形成がどのように起こり、この複合体がどのようにＤＮＡに結合するかを理解するために、ＨｏｘＢ１−Ｐｂｘ１−ＤＮＡ三次元複合体の２．３５．ＡＮＧ．結晶構造を解析した。この構造から、各タンパク質のホメオドメインが、ＤＮＡの反対側において、隣接認識配列に結合することが示される。ヘテロ二量体形成は、ＨｏｘＢ１のホメオドメインに対する６個のアミノ酸ヘキサペプチドＮ−末端の間に形成される接触及びヘリックス３とへリックス１及び２との間に形成されるＰｂｘ１のポケットを通じて起こる。Ｐｂｘ１ホメオドメインのＣ末端伸長によって、へリックス１に対して密集するアルファへリックスが形成され、より大きな４個のへリックスホメオドメインが形成される（Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒら、（１９９９）Ｃｅｌｌ ９６：５８７ ５９７；Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９１：５２１ ５３０）。
【００７５】
例えば、新規へテロ多量体タンパク質からの配列をアダプターとして使用することができる。このような状況において、ヘテロ多量体の形成に関与する候補配列の同定は、過度の実験を行わずに、何らかの遺伝学的又は生化学的アッセイにより行うことができる。さらに、コンピュータモデリング及び検索技術によって、さらに、関連及び非関連遺伝子で見られる共通ドメインの配列相同性に基づくヘテロ多量体配列の検出が容易になる。相同性検索を可能にするプログラムの非限定例は、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、Ｆａｓｔａ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｐａｃｋａｇｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｃｌｕｓｔｌａｗ、ＴＯＦＦＥＥ、ＣＯＢＬＡＴＨ、Ｇｅｎｔｈｒｅａｄｅｒ及びＭｅｇＡｌｉｇｎが含まれる。標的受容体又はそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含有する何らかの配列データベースを配列分析のために使用することができる。一般によく使用されるデータベースには、以下に限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ及びＨＴＧＳが含まれる。
【００７６】
ヘテロ二量体形成配列由来の適切なアダプターは、その物理的特性に基づくさらなる特徴を有する。好ましいヘテロ二量体形成配列は、対をなす親和性を示し、結果として、ホモ二量体は実質的に除外され、ヘテロ二量体の形成が主となる。好ましくは、主な形成は、生理的緩衝液条件下及び／又は生理的体温で形成することを可能とする、少なくとも６０％のヘテロ二量体、より好ましくは少なくとも８０％のヘテロ二量体、より好ましくは８５−９０％の間のヘテロ二量体及びより好ましくは９０−９５％の間のヘテロ二量体及びさらにより好ましくは９６−９９％の間のヘテロ二量体を含有するヘテロ多量体プールをもたらす。本発明のある実施形態において、アダプターペアのヘテロ二量体形成配列の少なくとも１つは、生理的緩衝液条件下及び／又は生理的体温でホモ二量体を形成することが基本的に不可能である。「基本的に不可能」とは、選択されたへテロ二量体形成配列が、単独で試験した場合、Ｋａｍｍｅｒｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３ １３２６９）で詳述されるようなインビトロ沈降実験又はインビボ２−ハイブリッド酵母分析（例えばＷｈｉｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９６：６７９−６８２参照）において検出可能量のホモ二量体が生成されないことを意味する。さらに、個々のヘテロ二量体形成配列を宿主細胞で発現させることができ、宿主細胞におけるホモ二量体の欠如は、以下に限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット及び免疫沈降を含む様々なタンパク質分析によって示すことができる。インビトロアッセイは、生理的緩衝条件下及び／又は好ましくは生理的体温において実行しなければならない。一般に、生理的緩衝液は、塩の生理的濃度を含有し、約６．５から約７．８、好ましくは約７．０から約７．５の範囲の中性ｐＨに調整される。様々な生理的緩衝液はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出で挙げられており、従って、本明細書中では詳述しない。好ましい生理的条件は、Ｋａｍｍｅｒｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８：１３２６３−１３２６９）で述べられている。
【００７７】
アダプターはさらにその二次構造に基づく特徴を有する。好ましいアダプターは、コイルドコイルへリックス構造に適した両親媒性ペプチドからなる。へリックスコイルドコイルは、タンパク質における主要なサブユニットオリゴマー形成配列の１つである。一次配列分析から、全タンパク質残基のおよそ２ ３％がコイルドコイルを形成することが分かる（Ｗｏｌｆら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：１１７９ １１８９）。よく特徴が分かっているコイルドコイル含有タンパク質には、細胞骨格ファミリーのメンバー（例えばアルファ−ケラチン、ビメンチン）、細胞骨格モーターファミリー（例えばミオシン、キネシン及びダイニン）、ウイルス膜タンパク質（例えばエボラ又はＨＩＶの膜タンパク質）、ＤＮＡ結合タンパク質及び細胞表面受容体（例えばＧＡＢＡＢ受容体１及び２）が含まれる。
【００７８】
本発明のコイルドコイルアダプターは、左巻き及び右巻きコイルドコイルという２つの群に大きく分類することができる。左巻きコイルドコイルは、好ましくは第一（ａ）及び第四（ｄ）の位置に位置する無極性残基が生じる、「ａｂｃｄｅｆｇ」で表される７残基反復を特徴とする。これらの２箇所の残基は通常、ぴったりとした疎水性コアを形成するために他方のスタンドのものとかみ合う「取っ手と穴」のジグザグパターンを構成する。一方、コイルドコイルの周囲をカバーする第二（ｂ）、第三（ｃ）及び第六（ｆ）の位置は、好ましくは荷電残基である。荷電アミノ酸の例には、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性残基及び、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンなどの酸性残基が含まれる。ヘテロ二量体コイルドコイルを設計するのに適切な非電荷又は無極性アミノ酸には、以下に限定されないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンが含まれる。非電荷残基は一般に疎水性コアを形成するが、一方、全体的へリックコイルドコイル構造を安定化させるために、コア位置でさえも荷電残基を含む、へリックス間及びヘリックス内塩−架橋を使用し得る（Ｂｕｒｋｈａｒｄら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１６７２ １１６７７）。様々な長さのコイルドコイルを使用し得るが、本コイルドコイルアダプターは、好ましくは、２から１０の７残基反復を含有する。より好ましくは、このアダプターは、３から８の７残基反復を含有し、さらにより好ましくは、４から５の７残基反復を含有する。
【００７９】
最適なコイルドコイルアダプターの設計において、ペプチドの二次構造を予想する様々な既存のコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。実例となるコンピュータ分析は、アミノ酸配列を既知の２本鎖コイルドコイルのデータベース中の配列と比較し、高確率のコイルドコイルストレッチを予想する、ＣＯＩＬＳアルゴリズムを使用する（Ｋａｍｍｅｒｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３ １３２６９）。設計及び選択に基づき、ナノモルからフェントモル（ｆｅｎｔｏｍｏｌｅ）領域の親和性を有する様々な改変コイルドコイル配列が報告された（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００２、１０（９）：１２３５−４８；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００、２１；２９５（３）：６２７−３９；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５、１４（１１）：２８３８−４８；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２、２７７（４０）：３７２７２−９；ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３、１８；３：２１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１０：６４９−６５５）。例えば、ヒトＢ−ＺＩＰ由来の再設計ヘテロ二量体コイルドコイル配列の解離定数はフェントモルであり、これは、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用に対するものと同様である。
【００８０】
好ましいコイルドコイルアダプターの別のクラスは、ロイシンジッパーである。ロイシンジッパーは、当技術分野で、６個のアミノ酸で互いに隔てられている４−５個のロイシン残基を含有する約３５アミノ酸の一続きとして定義されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ及びＡｂｅｌ、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：２４）。ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物などの様々な真核細胞ＤＮＡ−結合タンパク質で生じることが分かった。これらのタンパク質において、ロイシンジッパーは、ロイシンジッパーを含有するタンパク質が安定したホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成し得る、二量体形成面を生成させる。２個の癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎによりコードされるタンパク質産物の分子分析から、このような選択的ヘテロ二量体形成のケースが明らかになった（Ｇｅｎｔｚら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６９５；Ｎａｋａｂｅｐｐｕら（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５：９０７；Ｃｏｈｅｎら（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１７３）。Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域を含む合成ペプチドはヘテロ二量体形成に介在することも分かっており、分子間ジスルフィド結合を可能にするために合成ペプチドそれぞれのアミノ末端がシステイン残基を含む場合、ヘテロ二量体形成が起こり、ホモ二量体形成が実質的に排除される。
【００８１】
本発明のロイシン−ジッパーアダプターは、７残基の繰り返しとして知られる一般構造式（ロイシン−Ｘ．ｓｕｂ−Ｘ．ｓｕｂ１−Ｘ．ｓｕｂ．３−Ｘ．ｓｕｂ．４−Ｘ．ｓｕｂ．５−Ｘ．ｓｕｂ．６）．ｓｕｂ．ｎを有するが、式中、Ｘは、従来の２０種類のアミノ酸の何れかであり得るが、例えばアラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びリジン及びなど、アルファ−へリックス形成能のあるアミノ酸である可能性が最も高く、ｎは２以上であるが、通常ｎは３から１０、好ましくは４から８、より好ましくは４から５である。好ましい配列は、Ｆｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパー配列である。
【００８２】
Ｌ及びＨ鎖の二量体化に関与する抗体鎖の配列も、本提示系を構築するためにアダプターとして使用することができる。これらの配列には、以下に限定されないが、Ｌ又はＨ鎖の定常領域配列が含まれる。さらに、アダプター配列は、抗原−結合部位配列及びその結合抗原由来であり得る。このような場合、その対の一方のアダプターは、対応する抗原残基を含有する他方のアダプターにより認識される（即ち、安定して会合できる）抗原結合部位アミノ酸残基を含有する。
【００８３】
第一と第二のアダプターとの間の対をなす相互作用は共有又は非共有相互作用であり得る。非共有相互作用は、結果として共有結合が形成されない全ての既存の安定的連結を包含する。非共有相互作用の非限定例には、静電結合、水素結合、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチドの立体相互嵌合が含まれる。一方、共有相互作用の結果、以下に限定されないが、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合、２個の炭素含有分子間のＣ−−Ｃ結合、炭素とそれぞれ酸素又は水素含有分子との間のＣ−−Ｏ又はＣ−−Ｈ及び酸素とリン酸含有分子との間のＯ−−Ｐ結合を含む共有結合が形成される。
【００８４】
遺伝子の巨大なファミリーにおける豊富な遺伝学及び生化学データに基づき、当業者は、過度な実験を行わずに、本提示系を構築するために、適切なアダプター配列を選択し、得ることができる。
【００８５】
外面アンカータンパク質
ファージ提示のための適切なアンカータンパク質には、何れかのコートタンパク質、例えばｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸなど、又はこのようなコートタンパク質のドメイン又は発明者らのファージ粒子の表面に集合させられるかもしくはこれに連結される何らかの人工配列が含まれる。本明細書中の実施例７で示されるように、ヘルパーベクター ＹＧＭＣＴを用いることにより、ファージ上でｓｃＦｖ抗体が提示されたが、この場合、外膜アンカータンパク質は図４で示されるｐＩＩＩのＣ末端ドメインである。
【００８６】
細菌提示のための適切なアンカータンパク質には、細菌外膜タンパク質、例えば、線毛及び鞭毛、リポタンパク質、氷核タンパク質及びオートトランスポーターが含まれる。あるいは、このアンカータンパク質は、Ｅ．コリの外面に集合させられるか又はこれに連結される人工配列であり得る。本明細書中で示されるように、実施例２９−３２は、ヘルパーベクターｐＭＡＬ１及びｐＭＡＬ２を用いることによるｓｃＦｖ抗体提示を示し（図１５）、この場合、細菌外面ドメインＬｐｐ−ＯｍｐＡは外面アンカータンパク質である。
【００８７】
酵母提示の場合、適切な外面アンカータンパク質は、ＧＰＩシグナルを有するか又は持たない外壁タンパク質の何れかであり得、これには、Ｓ．セレビシエにおける、ａ−アグルチニン（Ａｇａ１及びＡｇａ２；注記：ＧＰＩありでＡｇａ１及びＧＰＩなしでＡｇａ２）、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ４及びＩｃｗｐ；メタノール資化酵母（ハンセヌラ・ポリモルファ）における、ＨｐＳＥＤ１、ＨｐＧＡＳ１、ＨｐＴＩＰ１、ＨＰＷＰ１及びカンジダ・アルビカンスにおける、Ｈｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ｒｂｔ５ｐが含まれる。あるいは、本発明の方法は、酵母の外壁に集合させられるか又はこれに連結させることができる人工配列である細胞表面アンカーを用いて、酵母に関連して実施することができる。本明細書中で示されるように、実施例１８は、ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８を使用することによるｓｃＦｖ抗体の酵母提示を示すが、この場合、酵母外面アンカータンパク質は、図１１で示される、Ｆｌｏ１又はＣｗｐ２又はＡｇａ２のＣ末端ドメイン由来である。
【００８８】
表面アンカーとして、何らかの既知の細胞膜タンパク質の膜貫通ドメイン又はＧＰＩアンカー配列を有するポリペプチド又は非切断タイプＩＩシグナルアンカー配列を用いて、哺乳動物細胞表面提示を実施することができる。あるいは、本発明の方法は、哺乳動物細胞の細胞膜に集合させるか又はこれに連結させることができる人工配列である細胞表面アンカーを用いて、哺乳動物細胞に関連して実施することができる。本明細書中で示されるように、実施例８は、ヘルパーベクターｐＭＡＧ２（図５）を使用することによる、哺乳動物細胞上でのｓｃＦｖタンパク質の提示を示し、この場合、アダプター２に融合するヒトＥＧＦ受容体の膜貫通ドメインが提示のための表面アンカーとして使用される。
【００８９】
シグナル配列
同じ一般的な系列に従って、原核及び真核両方からのシグナル配列が構築される。これらは、約１５−３０アミノ酸長であり、３つの領域：正荷電Ｎ末端領域、中央の疎水性領域及びより極性が大きいＣ末端領域からなる。原核及び真核細胞系のシグナルペプチド間で、大きな機能的及び構造相同性がある。従って、一部のネイティブシグナルペプチドが原核及び真核細胞の両方で機能すると予想される。
【００９０】
予想と一致して、一部の真核シグナルペプチドは、原核細胞において機能的であることが報告されている。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びラットプロインスリンタンパク質からのシグナルペプチドはＥ．コリで機能し（Ｇｅｎｅ、１９８５、３９：２４７−２５４）；エンド−β−１，３−グルカナーゼの酵母シグナルペプチドもまたＥ．コリで機能的である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ．、２０００、２０：２５２−２６４）。さらに、ブドウ球菌タンパク質Ａ、細菌ｂ−ラクタマーゼタンパク質及び細菌ＯｍｐＡの原核シグナルペプチドは哺乳動物細胞で機能的である（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．２０００、２０：２５２−２６４）。本明細書中で示されるように、実施例６及び７は、ヒト成長ホルモン１からのシグナルペプチドがｓｃＦｖ分泌及びファージ提示に対してＥ．コリ細胞において機能したことを示した。同様に、エンド−β−１，３−グルカナーゼの酵母シグナルペプチドは、本発明において実施例１６及び１７で示されたｓｃＦｖ分泌及びファージ提示について、Ｅ．コリにおいて機能的であった。
【００９１】
酵母及び哺乳動物細胞の間にわたり作用するシグナルペプチドの例は、ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）、ヒトインターフェロン、ヒト胆汁塩刺激性リパーゼ及び酵母サッカロミセス・セレビシエ インベルターゼ（ＳＵＣ２）に対するシグナルペプチドである（Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９９６、１８０：２９７−３０８；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ．、２００６、４７：４１５−４２１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ、１９９８、１４：４２５−４３３）。本明細書中で示されるように、実施例２２は、酵母／哺乳動物異種間提示のためのヒト膵臓リパーゼタンパク質１のシグナルペプチドの使用を示す。
【００９２】
本発明の複数種発現ベクターのためのシグナルペプチドとして、複数種で機能する能力について上記で同定されたネイティブシグナルペプチドの何れかを使用し得る。さらに、本明細書中で開示される方法を実施するために、様々な種の宿主細胞間で機能する能力を特徴とする人工シグナルペプチド配列を使用することもできる。この開示の実施例２８に記載の方法又は何らかのその他の方法によって、設計シグナルペプチドライブラリから人工シグナルペプチドを単離し得る。
【００９３】
本発明のベクターは、一般に、外来ポリペプチドを発現させるのに必要とされる転写又は翻訳調節配列を含む。適切な転写又は翻訳調節配列には、以下に限定されないが、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位及び転写及び翻訳に対する終結部位が含まれる。
【００９４】
複製起点（一般にｏｒｉ配列と呼ばれる。）により、適切な宿主細胞において、ベクターの複製が可能になる。ｏｒｉの選択は、使用される宿主細胞及び／又は遺伝子パッケージのタイプに依存する。宿主細胞が原核細胞であり、遺伝子パッケージがファージ粒子である場合、発現ベクターは通常、２個のｏｒｉ配列を含み、１つは原核細胞内でのベクターの自己複製を支配し、他方のｏｒｉはファージ粒子のパッケージングを支持する。好ましい原核細胞ｏｒｉは、細菌細胞においてベクター複製を支配することができる。ｏｒｉのこのクラスの非限定例には、ｐＭＢ１、ｐＵＣならびにその他のＥ．コリ起点が含まれる。ファージ粒子のパッケージングを支持する好ましいｏｒｉには、以下に限定されないが、ｆ１、ｏｒｉ、Ｐｆ３ファージ複製ｏｒｉが含まれる。ファージ提示のために、本発明において、例えば、ｐＵＣ ｏｒｉ及びｆ１ ｏｒｉが、異種間発現ベクターにおいて構築される。
【００９５】
真核細胞系において、高等真核細胞は、複数のＤＮＡ複製起点を含有する（１０４−１０６ｏｒｉ／哺乳動物ゲノムと推定される。）が、ｏｒｉ配列はあまり明確に定められていない。哺乳動物ベクターに対する適切な起点は通常、真核ウイルス由来である。好ましい真核ｏｒｉには、以下に限定されないが、ＳＶ４０ ｏｒｉ、ＥＢＶ ｏｒｉ、ＨＳＶ ｏｒｉが含まれる。酵母細胞に対する適切なｏｒｉには、以下に限定されないが、２ｕ ｏｒｉ ＣＥＮ６／ＡＲＳ４ ｏｒｉが含まれる。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、ある種の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモーターから下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。これは構成的又は誘導可能であり得る。一般に、プロモーター配列は、転写開始部位がその３’末端で結合し、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の塩基又はエレメントを含むように上流に伸びる（５’方向）。プロモーター配列内部は、転写開始部位ならびに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインである。
【００９７】
真核プロモーターは、必ずしもそうではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。
【００９８】
プロモーターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に大きく依存する。原核細胞の場合、様々な強力なプロモーターが当技術分野で公知である。好ましいプロモーターは、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター及びｐＢＡＤプロモーターである。通常、複数種において外来配列の発現を得るために、原核性プロモーターを真核性プロモーターの直後又は真核性プロモーターの後のイントロン配列内に置くことができる。
【００９９】
その他の真核細胞に対する適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその多の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素及び上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域である。哺乳動物細胞に対する好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｂ−アクチンプロモーター及びそれらのハイブリッドである。酵母細胞に対する好ましいプロモーターには、以下に限定されないが、Ｓ．セレビシエのＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ＴＥＦ１及びＰ．パストリスのＧＡＰ、ＡＯＸ１が含まれる。
【０１００】
本ベクターを構築することにおいて、外来配列に関与する終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び／又は転写終結シグナルを与えるために、転写したい配列の３’末端に挿入する。終止配列は、好ましくは、１以上の転写終結配列（ポリアデニル化配列など）を含有し、転写読み合わせをさらに阻止するためにさらなるＤＮＡ配列を包含することによって延長することもできる。本発明の好ましい終止配列（又は終結部位）は、転写終結配列、それ自身の終止配列又は異種終止配列の何れかが続く遺伝子を有する。このような終止配列の例には、当技術分野で公知の、広く利用可能で、下記で例を挙げる、様々な酵母転写終結配列又は哺乳動物ポリアデニル化配列に連結された終止コドンが含まれる。ターミネーターが遺伝子を含む場合、検出可能な又は選択可能なマーカーをコードする遺伝子を使用することは有利であり得；それにより、終止配列の存在及び／又は不在（及び、従って、転写単位の対応する不活性化及び／又は活性化）を検出及び／又は選択することができる手段が得られる。
【０１０１】
上記のエレメントに加えて、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、そのベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含有し得るが、宿主細胞に同時に導入される別のポリヌクレオチド配列でこのようなマーカー遺伝子を持ち込むことができる。選択条件下で、選択可能遺伝子を導入された宿主細胞のみが生存及び／又は増殖する。一般的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他の毒素、例えばアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキセートなどに対する耐性を与える；（ｂ）栄養要求性欠損を補完する；又は（ｃ）複合培地から得ることができない不可欠な栄養素を補給するタンパク質をコードする。適正なマーカー遺伝子の選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主に対する適切な遺伝子が当技術分野で公知である。
【０１０２】
本発明のある実施形態において、発現ベクターは、少なくとも２種類の無関係の発現系で複製可能なシャトルベクターである。このような複製を促進するために、本ベクターは通常、少なくとも２つの複製起点を含有し、各発現系で１つが有効である。通常、シャトルベクターは、真核細胞発現系及び原核細胞発現系で複製可能である。これにより、真核生物宿主（発現細胞型）でのタンパク質発現の検出及び原核生物宿主（増幅細胞型）でのこのベクターの増幅が可能になる。好ましくは、１つの複製起点はＳＶ４０由来であり、１つはｐＵＣ由来であるが、それがベクターの複製を支配するならば、当技術分野で公知の何れかの適切な起点を使用し得る。ベクターがシャトルベクターである場合、ベクターは、好ましくは、少なくとも２つの選択可能マーカーを含有し、１つは発現細胞型に対するものであり、１つは増幅細胞型に対するものである。それが利用される発現系で機能するならば、当技術分野で公知の何れかの選択可能マーカー又は本明細書中に記載のものを使用し得る。
【０１０３】
組み換えクローニング法を用いて及び／又は化学合成により、本発明に包含されるベクターを得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化及び核酸連結などの膨大な数の組み換えクローニング技術が当技術分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。当業者はまた、当技術分野で利用可能な何らかの合成手段によって所望のベクターを得るために、本明細書中で与えられる配列データ、又は公開もしくは私有のデータベースの配列データを使用することもできる。さらに、周知の制限及び核酸連結技術を用いて、様々なＤＮＡソースから適切な配列を切り出し、本発明に従い発現させるべき外来配列と操作可能な関係で組み込むことができる。
【０１０４】
本開示とともに提供される実施例及び図面は、原核及び真核細胞系での関心のあるタンパク質の複数種及び異種間提示における本発明の実施を例示する。次の実施例は、本発明の実施形態を例示するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。本開示を読むことから、多くの変更及び変形が当業者にとって明らかとなろう。かかる変更及び変形は本発明の一部をなす。
【０１０５】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技術内である、細胞生物学、分子生物学、細胞培養などの従来の技術を使用する。本明細書中で引用される刊行物及び特許出願は全て、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【０１０６】
抗−ＶＥＧＦ抗体に対するコード配列を用いて本発明の様々な組成物及び方法（複数種及び異種間提示ストラテジー）を本明細書中で例示するが、当業者にとって当然のことながら、抗体探索及び操作プロトコールを遂行するために、本発明の発現及び提示ベクターセットにおいて、抗体配列の様々なライブラリをコードする発現カセットのライブラリを使用することができる。
【０１０７】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組み換えＤＮＡの従来の技術を使用するが、これらは当技術分野の技術の範囲内である。例えば、ＰＨＡＧＥ ＤＩＳＰＬＡＹ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ（Ｂ．Ｋ．Ｋａｙら、１９９６）；ＰＨＡＧＥ ＤＩＳＰＬＡＹ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら、２００１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第二版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、（１９８７））；一連のＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））。
【０１０８】
ファージ及び哺乳動物細胞異種間提示系
【実施例１】
【０１０９】
提示ベクターｐＭＡＧ１
ベクターｐＭＡＧ１は、異種間提示での使用に適切な発現ベクター及び、ポリペプチドライブラリが原核細胞提示系（ファージ及び細菌細胞）で提示及び／又は産生され、続いて真核細胞提示系（哺乳動物細胞）で提示及び／又は産生される作製プロトコール（図２Ａで示す。）の範例となる。
【０１１０】
図２Ａで示されるｐＭＡＧ１ベクターは、ＥｃｏＲＩ及びＰｃｉＩ部位を３７９９ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片とともに挿入することにより、市販のベクター、ｐＵＣ１９の骨格において構築される。この完全合成ＤＮＡは次のエレメント：（１）ファージパッケージのためのｆ１ ｏｒｉ；（２）異種間発現カセット（ここでアダプターＧＲ１融合物の発現は２つのプロモーター、哺乳動物細胞に対するＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター及び細菌細胞に対するｐＬａｃプロモーターにより支配される。）を含む。関心のある遺伝子クローニングに対する多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列は、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞で機能を有するヒト成長ホルモン１からのシグナル配列の下流に構築される。ＨＡ−Ｈｉｓ６タグ（ＤＨ−タグ）配列は、タンパク質検出及びＮｉ−ＮＴＡ精製のため、ＧＲ１配列（アダプター１）（配列番号１９）に対するコード配列の上流である。（３）哺乳動物細胞選択マーカーネオマイシンに対する発現カセット。
【０１１１】
簡潔に述べると、遺伝子合成には、Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｂｉｏｆａｂプラットフォーム技術（Ｂｏｓｔｏｎ）を使用することによる遺伝子合成のために、１３７９、１２２７及び１２８７ｂｐの３片のセグメントに合成ＤＮＡを分割することが含まれた。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列のあるこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片に核酸連結し、次にこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、得られたベクター配列（配列番号１）を確認した。
【実施例２】
【０１１２】
提示ベクターｐＭＡＧ９
ベクターｐＭＡＧ９（配列番号２）は、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体 ｓｃＦｖをコードする遺伝子を挿入することによって、ｐＭＡＧ１ベクターから得られた。当業者にとって当然のことながら、様々な様式の抗体をコードするコード配列のライブラリを提示するためにｐＭＡＧ９を使用することができる。ＰＣＲによりｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。簡潔に述べると、ｐＡＢＭＸ２６８（米国特許出願第２００４０１３３３５７Ａ１号）ＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲプライマーは下記で列挙した：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３（配列番号４）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に従い、ｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによって、ＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件を次のように設定した：９４℃で３分間変性させ；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング及び７２℃で１分３０秒間伸長反応を３０サイクル行い；次に、７２℃で１０分間のポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＧ１ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によりｓｃＦｖの配列を確認した。得られたｐＭＡＧ９ベクターを図２Ｂで示す。
【０１１３】
ＤＮＡ複製のためのｐＵＣ ｏｒｉ、アンピシリン選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子及びファージミドＤＮＡパッケージのためのｆ１ ｏｒｉを有するので、このベクターはＥ．コリ細胞で機能する。さらに、ｓｃＦｖ−アダプターＧＲ１の融合物の転写及び発現は、Ｅ．コリ細胞においてｐＬａｃプロモーターにより、及び哺乳動物細胞においてニワトリｂ−アクチンプロモーターにより駆動される。哺乳動物及び細菌細胞の両方で機能を有するヒト成長ホルモンＩのシグナルペプチド（Ｇｅｎｅ、１９８５、３９：２４７−２５４）は哺乳動物及び細菌細胞両方で分泌経路を通じてアダプター融合タンパク質を支配する。
【実施例３】
【０１１４】
ファージヘルパーベクターＧＭＣＴ
特徴がよく分かっているベクター、即ちＭ１３ＫＯ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａより）から、下記で詳述する手段に従い２段階でベクターＧＭＣＴを構築した。第一段階において、ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発により、ＫＯ７ヘルパーファージベクターの遺伝子ＩＩＩシグナル配列にＫｐｎＩ部位を導入した。このサイレント突然変異によって、ｐＩＩＩシグナルペプチドのコード配列は変化しなかった。ＫｐｎＩ部位を含有する次のプライマーを用いてＰＣＲによりＫＯ７ゲノムを増幅した：ｐ３ＫＮＩ：５’−ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧ−３’（配列番号５）及びｐ３ＫＮ２：５’−ＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’（配列番号６）。これらのプライマーは、遺伝子ＩＩＩシグナル配列と相同性のある共通の部分配列を有する。１００ｎｇ ＫＯ７ベクターＤＮＡ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、２５０μＭ ｄＮＴＰ及び１Ｘｐｆｕ緩衝液及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する１００μＬ反応混合液中でＰＣＲを行った。反応混合液を最初に約９６℃で温置し、次にサーモサイクラー中で次のようにＰＣＲ１５サイクル：９６℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１０分間伸長を行った。増幅後、産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで切断して核酸連結し、エレクトロポレーションによりＴＧ１細菌細胞に形質転換した。
【０１１５】
細菌細胞をカナマイシン耐性に関して選択した。具体的には、カナマイシン耐性コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの２ＹＴ培地中で増殖させ、ＰＣＲエラーにより生じた機能欠損突然変異を除外するために、ファージＥＬＩＳＡアッセイによって、培養上清をファージスクリーニングに使用した。簡潔に述べると、次のようにファージＥＬＩＳＡを行った：ファージ粒子を含有する上清１００μＬを４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートのコートウェルに対して使用した。ＰＢＳ緩衝液中の５％ミルクで室温にて３０分間ブロッキング処理を行った後、ＥＬＩＳＡプレートに結合したファージ粒子をＨＲＰ−標識抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともに室温で１時間さらに温置した。
【０１１６】
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより遊離抗Ｍ１３抗体を洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収により、ＨＲＰ活性を調べた。全部で４８個のクローンをファージ生成についてスクリーニングした。クローンＣ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９及びＡ１２が図３で示されるようにファージ陽性であった。クローンＢ７、Ｂ９及びＡ１２から抽出されたＤＮＡをＴＧ１培養物から調製した。Ａｃｃ６５Ｉ（ＫｐｎＩのイソシゾマー）及びＢａｍＨＩでベクターＤＮＡを二重消化することによって、６００ｂｐ ＤＮＡ断片が示され、これにより、この３種類のＫＯ７ｋｐｎベクタークローン全てにＫｐｎＩ部位が存在することが確認される。得られたベクターは、遺伝子ＩＩＩコード領域を妨害することなくユニークなＫｐｎＩ制限部位が遺伝子ＩＩＩシグナル配列（改変遺伝子ＩＩＩシグナル、配列番号７）にサイレントに導入されていることを除き、ＫＯ７と同一である。
【０１１７】
ＫＯ７ｋｐｎＢ７ヘルパーベクター中の遺伝子ＩＩＩのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片を合成ＤＮＡ断片（配列番号８）で置換することによって、ＧＭＣＴファージヘルパーベクターを構築した。得られたＧＭＣＴファージベクター（図４）は、改変ｐＩＩＩキャプシドのさらなるコピーをコードし、これには、ＧＲ２ドメイン（配列番号２０）（アダプター２）、改変ｐＩＩＩタンパク質の検出のためのｍｙｃ−ｔａｇ配列及びｐＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴドメイン）が含まれる。この改変遺伝子ＩＩＩの下流、リボソーム結合配列（Ｓ／Ｄ）及び細菌タンパク質ＯｍｐＡからのシグナル配列を遺伝子ＩＩＩ配列に融合させた。遺伝子ＩＩＩ含有配列のこれらの２コピーはオリジナルの遺伝子ＩＩＩプロモーター調節下に置かれる。
【０１１８】
核酸連結したベクターＤＮＡをＴＧ１細胞へと形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの２ＹＴ培地中で増殖させ、上記のようにファージ陽性クローンを選択するために、ファージＥＬＩＳＡアッセイによるファージスクリーニングに対して上清を使用した。１０個以上のクローンがファージ粒子を生成することが分かった。大規模ファージ調製のためにクローン＃３を使用した。
【実施例４】
【０１１９】
ＧＭＣＴヘルパーファージの生成
クローン＃３から生成されたＧＭＣＴヘルパーファージを含有する上清を２ＹＴ寒天プレート上にストリーク播種した。ＴＧ１培養物（ＯＤ６０００−５）０．５ｍＬと混合した軟寒天４ｍＬをプレート上に注いだ。３７℃で一晩温置した後、ファージプラークを形成させた。１個のファージプラークを採取し、７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの１０ｍＬ ２ＹＴ培養液に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで一定に振盪しながら３７℃で２時間温置した後、７０μｇ／ｍＬカナマイシン入りの５００ｍＬの２ＹＴを含有する２Ｌフラスコに培養物を移した。３７℃で一定に振盪しながら培養物を一晩温置した。次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて上清中のファージを沈降させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。ＯＤ２６８の測定によりファージ濃度を調べた。通常、ＯＤ２６８での１単位の読み取りは、上清１ｍＬがおよそ５ｘ１０１２個のウイルウ粒子を含有することを指す。ＧＭＣＴヘルパーファージに対するファージ回収率は、およそ８ｘ１０１１／ｍＬ培養液であり、これは、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージと同様であり、このことから、アダプターＧＲ２−ｐＩＩＩ融合物がファージ粒子集合に影響を与えないことが分かった。
【０１２０】
抗−ＭｙｃタグファージＥＬＩＳＡによって、ヘルパーファージ粒子上のＧＲ２−Ｍｙｃアセンブリーが確認された。簡潔に述べると、抗−Ｍｙｃタグ抗体９Ｅ１０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより）でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ＨＲＰ標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を用いて、９Ｅ１０抗体に結合したファージを検出した。
【実施例５】
【０１２１】
哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２
市販のベクターｐＵＣ１９の骨格において、３１３４ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片を用いてＥｃｏＲＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することにより哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２（図５）を作製した。この完全合成ＤＮＡは、２つの成分：（１）ＳＶ４０ ｏｒｉ／プロモーター及びＳＶ４０ポリＡを伴うＺｅｏｃｉｎ発現カセット；（２）ＣＭＶプロモーターにより駆動され、ＢＧＨポリＡにより停止される、ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）の膜貫通ドメインとのアダプター２（ＧＲ２、配列番号２０）融合物、に対する配列を含む。アダプターＧＲ２融合物に対する分泌シグナル配列はｈＥＧＦＲ由来である。
【０１２２】
簡潔に述べると、ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した合成のために、８０８、７９０、８２９及び８１７ｂｐのセグメント４片に合成ＤＮＡを分割することにより、ベクターを合成した。オリゴ合成から生じたエラーは、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製により修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列付きのこれらのＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片に核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法により、得られたベクター配列（配列番号９）を確認した。
【実施例６】
【０１２３】
ｐＭＡＧ９ベクターを用いた、Ｅ．コリ細胞での可溶性Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）の発現
ヘルパーベクターなしでｐＭＡＧ９発現ベクターを使用すると、アダプター１（ＧＲ１）と組み合わせたコード配列の産物を含む融合タンパク質として、関心のあるタンパク質が発現及び分泌される。
【０１２４】
発現される融合タンパク質を遺伝子パッケージの表面上で提示するためには、対をなすアダプター１（ＧＲ１）と会合することができる第二のアダプター（例えばＧＲ２）とインフレームで融合したアンカータンパク質を含む第二の融合タンパク質を提供するヘルパーベクター存在下での同時発現が必要である。２個のアダプター間の対をなす相互作用によって、遺伝子パッケージ又は宿主細胞の表面上で関心のあるタンパク質の提示が促進される。
【０１２５】
ヘルパーベクターなしで、ｐＭＡＧ９が発現ベクターとして機能することを示すために、可溶性タンパク質発現のためにｐＭＡＧ９を直接ＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＡＧ９ベクターで形質転換された細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ入りの２ＹＴ培地中で３７℃振盪器でＯＤ６０００．９まで増殖させた。次に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度まで添加し、３０℃振盪器で一晩誘導した。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡアッセイによって、上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を検出した。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ上清を添加し、プレート上を被覆する抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブした。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加して、ＨＲＰ活性を調べた。図６ＡのＥＬＩＳＡから、ｐＭＡＧ９培養上清中の可溶性ｓｃＦｖ抗体が用量依存的にＶＥＧＦ抗原に結合したことが示された。一方、ｐＵＣ１８ベクターを有する陰性対照細胞から生じた上清はＶＥＧＦに対する結合活性がなかった。図６Ａで与えられるこれらの結果から、提示ベクターから発現ベクターへと関心のある遺伝子を移動させる段階を実施する必要なく、Ｅ．コリ細胞において可溶性タンパク質発現を支配することができる発現ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することが分かった。
【０１２７】
さらに、上清及び細胞周辺質抽出物両方から可溶性タンパク質を精製することができる。簡潔に述べると、増殖培地の１／４０体積で、予め冷却したＰＰＢ緩衝液（２００ｍｇ／ｍＬ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で細胞ペレットを再懸濁し、氷上で３０分間温置する。次いで、予め冷却した５ｍＭ ＭｇＳＯ４を用いて上記プロセスを繰り返す。細胞ペレットからの周辺質抽出物及び培養上清を合わせ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに添加する。結合したＨｉｓ−タグタンパク質をＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで溶出する。分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析する。
【実施例７】
【０１２８】
ｐＭＡＧ９を用いたファージ上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
ヘルパーベクターと組み合わせてｐＭＡＧ９ベクターを使用することによって、研究者は、遺伝子パッケージ又は関心のある宿主細胞の表面上に、関心のあるタンパク質又はタンパク質のライブラリを提示することができるようになる。例えば、ファージ表面上でｓｃＦｖを提示するために、実施例４の上記のＧＭＣＴヘルパーファージと組み合わせてｐＭＡＧ９を使用する。
【０１２９】
ｐＭＡＧ９により産生されるｓｃＦｖ−アダプター／ＧＲ１融合タンパク質に存在するアダプター（ＧＲ１）と対をなす組み合わせが可能な第二のアダプター（アダプター２）とインフレームで融合したウイルスコートタンパク質を含む融合タンパク質を発現するヘルパーファージと組み合わせて同時発現される場合、ファージ提示を支配することができる提示ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することを示すために、ｐＭＡＧ９ベクターを有するＴＧ１細胞を１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭＣＴヘルパーファージにより重複感染させた。感染させたＴＧ１細胞を一晩、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地中で３０℃の振盪器中で増殖させた。培養上清中のファージミドウイルス粒子を２回、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁した。
【０１３０】
抗原ＶＥＧＦで被覆したプレートを用いて、ファージＥＬＩＳＡによって、ファージ表面上で提示された１本鎖抗体を検出した。簡潔に述べると、４℃で２μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１００μＬで一晩被覆した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ緩衝液中５％ミルクで室温にて１時間ブロッキング処理した。従って、５％ミルク−ＰＢＳ中の希釈ファージ１００μＬを使用し、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを室温で１時間被覆した。ＥＬＩＳＡプレートに結合したファージ粒子をＨＲＰ−標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともにさらに室温にて１時間温置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより遊離抗Ｍ１３抗体を洗い流した。次に基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収により、ＨＲＰ活性を調べた。図８で示されるＥＬＩＳＡの結果から、ｐＭＡＧ９ベクターを有する重複感染細胞から生成されたファージが用量依存的にＶＥＧＦに結合したことが分かる。陰性対照として、ｐＵＣ１８ベクターを有する細胞から及びｐＭＡＴ６ベクターを有する細胞（図１４Ｂで示される、酵母／哺乳動物異種間提示ベクター）から生成したファージは、ＶＥＧＦに対する結合活性を全く示さなかった。これらの結果から、ファージ提示のためのＰＭＡＧ９／ＧＭＣＴベクターセットの使用が示された。
【実施例８】
【０１３１】
ｐＭＡＧ９を用いた、哺乳動物細胞での可溶性Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の発現
実施例６で行われた実験から、細菌細胞（即ちＥ．コリ）においてｐＭＡＧ９が発現ベクターとして機能することが分かる。ｐＭＡＧ９はまた、異種間発現及び提示ベクターとして機能するように設計された。このベクターの異種間機能性を示すため、哺乳動物細胞での抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ発現及び産生を支配するためにｐＭＡＧ９を使用した。
【０１３２】
簡潔に述べると、フリースタイル２９３Ｆ細胞（ヒト胎児腎臓細胞株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣＯＳ６（形質転換されたサル腎臓細胞）を用いて哺乳動物細胞において可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖを発現させた。ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造者の操作マニュアルに従い形質移入を行った。簡潔に述べると、ｐＭＡＧ９ベクターＤＮＡ １又は２μｇを血清不含培地中で希釈ＦｕＧＥＮＥ６試薬に６：１又は３：１又は３：２の割合で添加した。温置１５分後、ＦｕＧＥＮＥ６試薬ＤＮＡ複合体を６ウェルプレート中の細胞に移した（２ｍＬ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１．０ｘ１０６細胞）。９５％ＣＯ２雰囲気中で７２時間、３７℃で細胞を温置した。ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＧＲ１タンパク質を抗−ＨＡウェスタンブロット分析及び抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで評価するために、上清を回収した。
【０１３３】
ＰｒｏＦｏｕｎｄ ＨＡ Ｔａｇ ＩＰ／Ｃｏ−ＩＰキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従い、抗−ＨＡ抗体ビーズを用いて、培養上清８００μＬから、抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖタンパク質を精製した。ＥＣＬ ｐｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の説明書に従い、精製したｓｃＦｖタンパク質をタンパク質分離用の４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、ウエスタンブロッティング分析のために０．４５ニトロセルロースに転写した。簡潔に述べると、ＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で膜をブロッキング処理し、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに室温で１時間温置した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、１時間温置してペルオキシダーゼ標識抗−マウス抗体で膜をプローブし、洗浄した膜に検出溶液を添加し、５分間温置した。次に、化学発光シグナルをｘ線フィルムにより検出した。抗−ＨＡブロッティングの結果を図７Ａで示す。ウエスタンブロットの結果から、２９３及びＣＯＳ６培養上清の両方でｓｃＦｖタンパク質（〜３５ＫＤ）が存在することが分かり、このことから、哺乳動物細胞での異種間提示ベクターｐＭＡＧ９による可溶性タンパク質発現が分かる。
【０１３４】
抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡにより、哺乳動物細胞培養上清から得られたｓｃＦｖタンパク質の機能をさらに分析した。簡潔に述べると、濃度２μｇ／ｍＬの重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の希釈ｒｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）１００μＬでＭａｘｉＳｏｒｐプレートを一晩被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、室温にて１時間、５％ミルクＰＢＳでプレートをブロッキング処理した。さらなる洗浄後、様々な希釈度の精製ｓｃＦｖタンパク質入りの溶液５０μＬをウェルに添加し、室温にて１時間、温置した。洗浄後、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μＬを添加し、室温で１時間温置し、次いで、５％ミルクＰＢＳ中の１：２，０００の希釈度の抗−マウス−ＨＲＰ標識抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに１時間温置した。最後に、次いでＡＢＴＳ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を発色のために添加した。９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、ＯＤ４０５でプレートの読み取りを行った。
【０１３５】
図６Ｂで示されるＥＬＩＳＡの結果から、３つの個々の２９３細胞形質移入物及び４つの個々のＣＯＳ６細胞形質移入物からのｐＭＡＧ９培養上清中で用量依存的なＶＥＧＦ結合活性が示される。図６Ａ及び図７Ａでの結果と合わせて、ＥＬＩＳＡの結果から、Ｅ．コリ及び哺乳動物細胞の両方で、異種間発現ベクターとしてｐＭＡＧ９が機能することが証明される。
【実施例９】
【０１３６】
ｐＭＡＧ９ベクターを用いた、哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖタンパク質の提示
ヘルパーベクターＧＭＣＴと組み合わせてｐＭＡＧ９がファージ上でのｓｃＦｖの提示を支配すること（前出実施例７参照）及びヘルパーベクターなしで哺乳動物細胞において発現されるｐＭＡＧ９が哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現を支配するように機能すること（実施例８参照）を証明した後、このベクターの異種間提示機能を証明するために次の実験を行った。
【０１３７】
１０％ウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地が入った６ウェルプレート中のカバースリップ上でＣＯＳ６細胞を増殖させた。製造者の説明書に従い、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｐＡＭＧ９発現ベクター及びヘルパーベクターｐＭＡＧ２をＣＯＳ６細胞に同時形質移入した。簡潔に述べると、血清不含培地中、３：２のＦｕＧｅｎｅ６試薬（μＬ）：ＤＮＡ複合体（μｇ）の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にプラスミドＤＮＡ０８００ｎｇ（ｐＭＡＧ９ ４００ｎｇ＋ｐＭＡＧ２ ４００ｎｇ）を添加した。ＦｕＧＥＮＥ試薬ＤＮＡ複合体を室温で１５分間温置し、次いで細胞に添加した。４８時間後、細胞表面上で提示されるＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１融合タンパク質（ｐＭＡＧ９ベクターより）をＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体で検出した。簡潔に述べると、ＣＯＳ６細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで２５℃にて３０分間ブロッキング処理し、次いでＰＢＳ中のＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）とともに６０分間温置した。核を可視化するために、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でも細胞を染色した。Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ １００／１．３０油浸対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡で細胞を観察した。図９で示される結果から、ＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１が明確に表面に局在することが分かり、このことから、ｐＭＡＧ９ベクターを用いたｓｃＦｖの細胞表面提示が示される。
【０１３８】
あるいは、表面提示される抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの存在を検出するために、形質移入から４８時間後にフローサイトメトリー分析を行うことができる。簡潔に述べると、ビオチン化ｒｈＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｆｃを細胞懸濁液（４ｘ１０６細胞／ｍＬ）２５μＬに添加し、４℃にて６０分間温置する。陰性染色対照として、細胞の同一試料をビオチン化ダイズトリプシン阻害剤で染色する。次に、アビジン−ＦＩＴＣ又は抗−Ｆｃ抗体−ＦＩＴＣとともにさらに３０分間、４℃にて暗所で細胞を温置する。ＲＤＦ１緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのフローサイトメトリー分析用にこの細胞を０．２ｍＬ ＲＤＦ１緩衝液中で再懸濁する。（注記：これは机上ＦＡＣＳ実験である。）
【実施例１０】
【０１３９】
ファージ及び哺乳動物細胞上の所望のポリペプチドの選択及び異種間提示（注記：机上実験）
可溶性ポリペプチドの発現又はＥ．コリ及び／又は哺乳動物細胞での提示のために、多岐にわたるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリをｐＭＡＧ１又はｐＭＡＧ９ベクターにクローニングすることができる。
【０１４０】
ファージ提示の場合ＧＭＣＴヘルパーベクター又は哺乳動物細胞提示の場合ｐＭＡＧ２など、ヘルパーベクターの同時発現によって、原核遺伝子パッケージ又は真核生物宿主細胞の表面上で発現ライブラリを提示することができる。連続的にパニングすることにより、所望の特異性（結合活性）を特徴とするポリペプチドを濃縮することができる。簡潔に述べると、ファージパニングプロセスを次のように進める：１−１０μｇ／ｍＬの濃度の特異的抗原で４℃にて一晩、９６ウェルプレートを被覆する。ＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキング処理した後、５％ミルク／ＰＢＳ中の１０１１−１２ファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬトリプシンとともに３０分間温置して結合したファージを溶出するが、これは、本ヘルパーファージがｐＩＩＩタンパク質に融合されたＭｙｃ−タグにおいて切断可能部位を有するからである。発明者らの実験において、トリプシン溶出は１００ｍＭトリエチルアミン（通常、従来のファージパニングで使用される。）よりも効率的である。このプロセスを２−３回繰り返すと、所望のポリペプチドを提示するファージのプールを濃縮することができる。濃縮したファージはＥ．コリ細胞に感染し得るが、これは、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を有するベクターの調製のために使用することができる。
【０１４１】
このように、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２を用いて同時形質移入することにより、細胞表面提示のために、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡの小さなプールを直接哺乳動物細胞に形質移入することができる。ＦＡＣＳソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを単離することができる。簡潔に述べると、キュベット中で氷冷ＰＢＳで洗浄したＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ細胞３ｘ１０６と１０−２０μｇＤＮＡを混合する。氷上で１０分間温置した後、２５０μＦ、６６０Ｖに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、細胞／ＤＮＡ混合物に対してエレクトロポレーションを行う。室温で１０分間温置した後、７５ｃｍ培養フラスコ中の２０ｍＬ培地に細胞を移し、３７℃、５％ＣＯ２で２−３日間温置する。あるいは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより記載されたプロトコールに従い、形質移入のために、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬を使用することができる。
【０１４２】
標的抗原に対する結合特異性を有する抗体を同定するための適切な選択プロセスは、ＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化標的抗原及び抗−ＨＡタグｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬ（Ｓａｎｔａ Ｃｌｕｚｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにおよそ１０７個の形質移入細胞を２５℃で１時間温置することを含む。次に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（抗体発現を監視するために、ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、抗原結合細胞の標識のため）とともに４℃で１時間温置して標識しなければならない。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でこの細胞をソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターのみ、ＫＯ７などの通常のヘルパーファージによりパッケージングすることができ、従って、哺乳動物ヘルパーベクターから分離することができる。次に、別の回のＦＡＣＳソーティング又はＤＮＡ配列決定のために、回収した提示ベクターＤＮＡを使用することができる。
【０１４３】
ファージ及び酵母異種間提示系
【実施例１１】
【０１４４】
提示ベクターｐＭＡＴ２
ｐＭＡＴ２は、発現及び原核細胞系（ファージ及び細菌細胞）と真核細胞系（酵母細胞）との間の異種間提示に適切な発現ベクターを提供する。図１０Ａで示されるように、ｐＭＡＴ２は、３１８４ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片によりＡａｔＩＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することによって、市販のベクターｐＵＣ１９の骨格上で作製される。この完全合成ＤＮＡは、（１）ファージパッケージのためのｆ１ ｏｒｉ；（２）アダプターＧＲ１（配列番号１９）融合のための異種間発現カセット（これは２つのプロモーター：酵母細胞での発現のための酵母ｐＧＡＬ１プロモーター及び細菌細胞のためのｐｌａｃプロモーターにより駆動される。）を含む。関心のある遺伝子クローニングのための多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列は、二重機能シグナル配列（酵母エンド−β−１，３−グルカナーゼタンパク質Ｂｇｌ２ｐ）の下流に構築される。ＨＡ−Ｈｉｓ６タグ（ＤＨ−タグ）配列は、タンパク質検出及びＮｉ−ＮＴＡ精製のために、ＧＲ１配列の上流である。（３）複製のための酵母ＣＥＮ／ＡＲＳ ｏｒｉ；及び（４）酵母ＴＲＰ１栄養要求性マーカーのための発現カセット。
【０１４５】
簡潔に述べると、ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによる遺伝子合成のためにＤＮＡを１１９６、８０４及び１２９４ｂｐの３片のセグメントに分割することによって、このベクターを合成した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。タイプＩＩ制限部位を含有するタグ配列付きのこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、完全ＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法を用いて、得られたベクター配列（配列番号１０）を確認した（注記：これはｓｃＦｖ遺伝子なしのファージ／酵母発現ベクターである。）。
【実施例１２】
【０１４６】
クロス提示ベクターｐＭＡＴ５
ベクターｐＭＡＴ５（配列番号１１）は、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体をコードするｓｃＦｖ遺伝子（発現カセット）を挿入することによって、ｐＭＡＴ２ベクターから得られた。当業者にとって当然のことながら、多様な様式の抗体をコードするコード配列のライブラリを提示するために、ｐＭＡＴ２を使用することができる。ＰＣＲによってｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。簡潔に述べると、ｐＡＢＭＸ２６８ ＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲに対するプライマーは以下のとおりであった：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴ ＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３（配列番号４）。
【０１４７】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に記載のようにｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによって、ＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃で３分間変性；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング、７２℃で１分３０秒間伸長を３０サイクル；次いで７２℃で１０分間ポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、このように、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＴ２ベクターにクローニングした。
【０１４８】
ＤＮＡ配列決定によってｓｃＦｖの配列を確認した。ｐＭＡＴ５ベクターの成分を図１０Ｂで示す。ｐＭＡＴ５において、関心のあるポリペプチド／アダプターＧＲ１−タンパク質の融合物の転写及び発現はＥ．コリ細胞においてｐＬａｃプロモーターにより駆動され、酵母細胞において酵母ＧＡＬ１プロモーターにより駆動される。酵母エンド−β−１，３−グルカナーゼタンパク質Ｂｇｌ２ｐのシグナルペプチドは、酵母及び細菌細胞の両方で機能し（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２０００、２０：２５２−２６４）、酵母及び細菌細胞の両方の分泌経路を通じてアダプター融合タンパク質を支配する。
【実施例１３】
【０１４９】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３
図１１Ａで図示するｐＭＡＴ３は、アダプター２との、インフレームでＣ末端酵母外面ＧＰＩアンカータンパク質Ｆｌｏ１を含む融合タンパク質を発現する酵母提示ヘルパーベクターである。７０３０ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片によりＡａｔＩＩ及びＰｃｉＩ部位を挿入することによって、市販のベクターｐＵＣ１９の骨格上でこのベクターを構築した。この完全合成ＤＮＡは、３つの発現カセットに対する配列：（１）酵母ＵＲＡ３選択マーカー；（２）酵母選択のためのＺｅｏｃｉｎマーカー；（３）酵母ｐＧＡＬ１プロモーター及びＦｌｏ１の分泌シグナル配列の調節下での、酵母アウトウェルタンパク質（ｗｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｆｌｏ１ Ｃ末端１１００アミノ酸とのアダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）融合物を含む。簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いることによる遺伝子合成のために、１１１２、７４０、７４８、１０４２、８９７、１１５２、８０２及び８２１ｂｐ（＃１から番＃８）の８片のセグメントに合成ＤＮＡを分割した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。
【０１５０】
合成ＤＮＡセグメント＃１−４をタイプＩＩ制限酵素で消化し、１つのＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれをｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。合成ＤＮＡセグメント＃５から８をタイプＩＩ制限酵素で消化し、別の１つのＤＮＡ断片へと核酸連結し、次いでこれを第一の断片を有するｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、得られたベクター配列（配列番号１２）を確認した。
【実施例１４】
【０１５１】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ７ベクター
図１１Ｂで図示するｐＭＡＴ７は、アダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）との、インフレームで酵母外面タンパク質Ａｇａ２を含む融合タンパク質を発現する別の酵母提示ヘルパーベクターである。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を２０８ｂｐの合成ＤＮＡ断片で置換することによって、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３からこのベクターを作製した。この合成ＤＮＡは、酵母アウトウェルタンパク質Ａｇａ２をコードする配列を含む。Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、最終ベクター配列（配列番号１３）を確認した。
【実施例１５】
【０１５２】
酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ８
図１１Ｃで図示するｐＭＡＴ８は、アダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）との、インフレームでＣ末端酵母外面ＧＰＩアンカータンパク質Ｃｗｐ２を含む融合タンパク質を発現する、別の酵母提示ヘルパーベクターを表す。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を１２５２ｂｐの合成ＤＮＡ断片で置換することによって、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３からこのベクターを作製した。この合成ＤＮＡは、Ｆｌｏ１のＳ／Ｔリッチ領域と融合した酵母アウトウェルタンパク質Ｃｗｐ２をコードする配列を含む。ＢｏｓｔｏｎのＣｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅｓのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて、合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、合成ＤＮＡ中のエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定法によって、最終ベクター配列（配列番号１４）を確認した。
【実施例１６】
【０１５３】
ｐＭＡＴ５を用いた、Ｅ．コリ細胞における可溶性ｓｃＦｖタンパク質の発現
可溶性タンパク質発現のために、ファージ／酵母発現ベクターｐＭＡＴ５を直接Ｅ．コリＴＧ１細胞へと形質転換した。３つの個々のクローンからの形質転換細胞を３７℃振盪器においてアンピシリン１００μｇ／ｍＬ入りの２ＹＴ培地中でＯＤ６００が０．９になるまで増殖させた。０．５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加し、３０℃振盪器で一晩誘導した。ＥＬＩＳＡアッセイにより上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を検出した。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ上清を添加し、プレート上の抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブした。次に、ＨＲＰ活性を調べるために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。
【０１５４】
図１２で示されるデータから、３つの個々のクローンからのｐＭＡＴ５ 上清中のＶＥＧＦへの用量依存的結合活性が証明され、これにより、Ｅ．コリ細胞での可溶性タンパク質の発現に対するｐＭＡＴ５ベクターの機能が明らかになった。
【実施例１７】
【０１５５】
ｐＭＡＴ５を用いた、ファージ表面上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
実施例１６で示されるデータから、ｐＭＡＴ５がＥ．コリ細胞において可溶性ｓｃＦｖ発現のための発現ベクターとして機能することが証明された。ＧＭＣＴヘルパーファージと組み合わせたＭＡＴ５の同時発現がファージ表面上でｓｃＦｖ（又はｓｃＦｖのライブラリ）を提示するように機能することを明らかにするために、ｐＭＡＴ５ベクターをＴＧ１細胞に形質転換し、形質転換したＥ．コリ細胞を１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭＣＴヘルパーファージにより重複感染させた。
【０１５６】
感染したＴＧ１細胞を２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ中で３０℃にて一晩増殖させた。培養上清中のファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌにより２回沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁した。ＶＥＧＦで被覆されたプレートを用いて、ファージＥＬＩＳＡにより、ファージ表面上で提示される１本鎖抗体を検出した。簡潔に述べると、２μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ １００μＬで４℃にて一晩被覆した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ緩衝液中の５％ミルクで室温にて１時間ブロッキング処理した。このように、ＰＢＳ−ミルク中の希釈ファージ１００μＬを用いて、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを被覆した。ＨＲＰ−標識抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μＬとともに室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレート上に結合したファージ粒子をさらに温置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで遊離抗−Ｍ１３抗体を洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加した。４０５ｎｍでの吸収によりＨＲＰ活性を調べた。
【０１５７】
図１３で示されるＥＬＩＳＡの結果から、ｐＭＡＴ５ベクターを有する細胞から生成したファージが用量依存的にＶＥＧＦに結合したことが証明される。陰性対照として、ｐＵＣ１８ベクターを有する細胞及びｐＭＡＴ６ベクターを有する細胞（図１４Ｂで示される酵母／哺乳動物異種間提示ベクター）から生成したファージは、ＶＥＧＦに対して結合活性を示さなかった。これらの結果から、ベクターセットｐＭＡＴ５及びヘルパーベクターＧＭＣＴがファージ表面上でのポリペプチド配列の提示を支配するように機能することが分かった。
【実施例１８】
【０１５８】
ｐＭＡＴ５を用いた、酵母における可溶性ｓｃＦｖタンパク質の発現
ｐＭＡＴ５は異種間発現ベクターである。実施例１６で示されるデータから、ｐＭＡＴ５が、細菌細胞においてアダプター１（ＧＲ１タンパク質）とインフレームで融合したｓｃＦｖポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質の発現を支配するように機能することが証明される。ｐＭＡＴ５が酵母細胞で発現を支配することができることを証明するために、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈの説明書に従い、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキットを用いて酵母ＹＨＰ４９９細胞にベクターを形質転換し得る。
【０１５９】
３℃でＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−選択培地５０ｍＬ中で、飽和するまで（ＯＤ６００＝２〜３）１個のコロニーからの酵母細胞を増殖させ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの５０ｍＬ ＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ／Ｔｒｉｐ培地中で再懸濁することができる。誘導２−３日後、上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液で透析しなければならない。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡによって上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を測定することができる。簡潔に述べると、１００μＬ上清又は抗−ＨＡビーズで上清から精製したｓｃＦｖを、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加し、プレーティングした抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）で検出することができる。次に、ＨＲＰ活性を調べるために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加しなければならない。酵母細胞での可溶性タンパク質の発現に対するｐＭＡＴ５ベクターの機能を示すために、ＥＬＩＳＡの結果を使用し得る。あるいは、精製のために培養上清をＮｉ−ＮＴＡカラムに添加することができる。ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで、結合したＨｉｓ−タグタンパク質を溶出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体でのウエスタンブロットによる分析のために、分画を回収し得る。
【実施例１９】
【０１６１】
ｐＭＡＴ５を用いた、酵母細胞表面上でのｓｃＦｖタンパク質の提示
酵母宿主細胞表面上でのｓｃＦｖ抗体の提示を支配するために、ｐＭＡＴ５発現ベクターを使用することもできる。簡潔に述べると、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキットなどの適切なプロトコールを用いて、酵母提示ヘルパーベクター（即ち、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８）の存在下で、酵母細胞にｐＭＡＴ５を同時形質転換することができる。あるいは、そのゲノム中に酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞を発現ベクターｐＭＡＴ５で形質転換することができる。
【０１６２】
ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｕｒａ−寒天プレート又はＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｚｅｏｃｉｎ上で発現ベクター及びヘルパー提示ベクター（即ち酵母提示ベクターセット）の両方を含む酵母細胞を選択し、飽和するまで同じ選択培地中で増殖させることができる。次に、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘを含有する誘導培地にこの細胞を移し、一晩、振盪しながら２０℃又は２５℃で温置しなければならない。氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、１００ｎＭビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液中で３回洗浄する。５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（ＳＡ−ＰＥ）及びヤギ抗−マウス−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置し、３回洗浄し、１ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁することによって、この細胞をプローブし得る。酵母細胞上で提示されるｓｃＦｖと会合した蛍光は、ＦＡＣＳ Ｃａｉｌｉｂｕｒフローサイトメトリー又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、フローサイトメトリーにより測定することができる。
【実施例２０】
【０１６３】
ファージ及び酵母細胞上で提示された所望のポリペプチドの選択
原核細胞（即ちＥ．コリ）及び原核細胞（即ち酵母細胞）での連続的な可溶性ポリペプチドの発現のために、ＤＮＡ配列の多岐にわたる集団（即ちレパートリー）をｐＭＡＴ２ベクターにクローニングすることができる。本発明の様々なヘルパー提示ベクターを用いて、ファージ又は酵母細胞の表面上で、得られた発現ライブラリを提示することができる。とりわけ、ファージ提示ヘルパーベクターとしてＧＭＣＴを使用し得、酵母細胞上での提示のために酵母提示ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８を使用し得る。
【０１６４】
ファージ上で提示される具体的なタンパク質又はペプチドを最初に数回の操作により濃縮することができる。簡潔に述べると、適切なパニングプロセスは、１−１０μｇ／ｍＬの濃度の標的抗原で９６ウェルプレートを４℃で一晩被覆することを含む。ＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１０１１−１２個のファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬトリプシンを用いて、３０分温置して、結合したファージを溶出し得るが、これは、本ヘルパーファージがｐＩＩＩタンパク質に融合した切断可能なＭｙｃ−タグを有するからである。溶出されたファージをＴＧ１細胞に感染させ、次回のファージ調製及びパニングに備える。このプロセスを２−３回繰り返したら、所望のポリペプチドを提示するファージのプールを濃縮することができる。濃縮したファージをＥ．コリ細胞に感染させることができ、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を用いてベクターＤＮＡを調製するためにこれを使用することができる。
【０１６５】
酵母ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを含む受容酵母宿主細胞に、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡのこの小さいプールを続いて直接、形質転換することができる。所望の特性を有するリードを提示する形質転換酵母細胞を数回のフローサイトメトリーソーティングで単離することができる。簡潔に述べると、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０もしくは２５℃で１６−１８時間移し得る。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化抗原及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート及びヤギ抗−マウス−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって細胞をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁することができる。選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。回収した細胞をＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレートに播種し、３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。選択後、個々のコロニーを拾うことができる。説明書に従いＺｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、配列決定を行うために、酵母細胞からのベクターＤＮＡを回収することができる。
【０１６６】
酵母と哺乳動物宿主細胞との間の複数種提示
【実施例２１】
【０１６７】
提示ベクターｐＭＡＴ４
図１４Ａで示されるｐＭＡＴ４は、酵母及び哺乳動物細胞でのポリペプチドライブラリの連続的発現又は提示のための、複数種又は異種間発現ベクターである。ＰａｃＩ−ＳａｃＩＩ断片を１４２０ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片で置換することによって、ベクターｐＭＡＴ２からこれを作製した。ＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術（Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによりこの完全合成ＤＮＡを作製したが、これは、イントロン配列内部に酵母ｐＧＡＬ１０プロモーターを含有する。従って、アダプター１（ＧＲ１）（配列番号１９）にインフレームで融合するライブラリタンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物細胞に対するＳＶ４０プロモーター；酵母細胞に対するｐＧＡＬ１０；及びＥ．コリに対するｐＬａｃプロモーターにより駆動される。ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）のシグナルペプチドは、酵母及び哺乳動物細胞の両方で機能的である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２００６、４７：４１５−４２１）。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。標準的ＤＮＡ配列決定によってｐＭＡＴの最終ポリヌクレオチド配列（配列番号１５）を確認した。
【実施例２２】
【０１６８】
提示ベクターｐＭＡＴ６
ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位によりシグナル配列の下流に抗−ＶＥＧＦ抗体のｓｃＦｖ遺伝子を挿入することによって、ｐＭＡＴ４ベクターからｐＭＡＴ６を得た。ｐＡＢＭＸ２６８ＤＮＡからＰＣＲによりｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。ＰＣＲプライマーは次のとおりであった：ＡＭ−９０：５’−ＡＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３）及びＡＭ−９１：５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの説明書に記載のように、ｐｆｕＵｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲマスターミックスと鋳型／プライマー溶液を混合することによってＰＣＲ反応液を調製した。温度サイクル条件は次のとおりであった：９４℃で３分間変性；９４℃で４５秒間変性、５５℃で４５秒間アニーリング及び７℃で１分３０秒間伸長のサイクルを３０回；次に、７２℃で１０分間ポリッシング段階を行った。ＰＣＲ産物を消化し、１％アガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＭＡＴ４ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定によりｓｃＦｖの配列を確認した。
【０１６９】
ｐＭＡＴ６（配列番号１６）を図１４Ｂで図示する。酵母及び哺乳動物細胞の両方において、ヒト膵臓リパーゼタンパク質１（ＨＰＬＲＰ１）シグナルペプチドは機能的であり（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉ、２００６、４７：４１５−４２１）、真核生物（酵母及び哺乳動物）宿主細胞の分泌経路を通じて、発現融合タンパク質（アダプター１とインフレームでｓｃＦｖポリペプチド）を支配する。
【実施例２３】
【０１７０】
ｐＭＡＴ６を用いた、酵母細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現
Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈの説明書に従い、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋを用いて、発現ベクターｐＭＡＴ６を酵母細胞ＹＨ４９９に形質転換することができる。ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−選択培地５０ｍＬ中で３０℃で、飽和するまで１個のコロニーからの細胞を増殖させ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの５０ｍＬ ＴＥＰ Ｇ／Ｒ培地中で再懸濁する。誘導２−３日後、上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液で透析することができる。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて上清中の可溶性ｓｃＦｖタンパク質を測定することができる。簡潔に述べると、ＶＥＧＦで被覆したＥＬＩＳＡプレートに１００μＬの上清を添加し、プレート上の抗原に結合したｓｃＦｖ抗体をＨＲＰ−標識抗−ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５）でプローブする。次に、ＨＲＰ活性を決定するために、基質ＡＢＴＳ［２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加する。さらに、精製するためにＮｉ−ＮＴＡカラムに上清を添加することができる。ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで、結合したＨｉｓ−タグタンパク質を溶出する。分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−ＨＡ抗体でのウェスタンブロットによって分析する。
【実施例２４】
【０１７２】
ｐＭＡＴ６を用いた、酵母上でのｓｃＦｖの提示
発現ベクターｐＭＡＴ６ベクター及び酵母ヘルパー提示ベクター（ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８など）を上記のように酵母細胞へと同時形質転換することができる。あるいは、クロス提示ベクターのみの形質転換のために、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞を使用することができる。
【０１７３】
ＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｕｒａ−又はＳＤ−ＣＡＡ／Ｔｒｐ−／Ｚｅｏｃｉｎｅ寒天プレート上で提示ベクター及びヘルパーベクターの両方を有する受容宿主細胞を選択することができ、同じ選択培地中で飽和するまで増殖させることができる。次に、この細胞を１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．１％ｄｅｘ入りの誘導培地に移し、一晩振盪しながら２０℃で温置することができる。氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間、１００ｎＭビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、次いで氷冷洗浄緩衝液中で３回洗浄する。暗所で氷上で３０分間、各５ｍｇ／ｍＬのＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに温置することによってこの細胞をプローブし、次いで再び３回洗浄し、１ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し得る。細胞で提示されるｓｃＦｖと会合した蛍光をＦＡＣｓ Ｃａｉｌｉｂｕｒ フローサイトメトリー又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ）で測定する。
【実施例２５】
【０１７４】
ｐＭＡＴ６を用いた、哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現
実施例８での説明に従い、ＣＯＳ細胞を用いて、哺乳動物細胞において可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現をｐＭＡＴ６が支配する能力を評価した。簡潔に述べると、血清不含培地中３：１又は３：２の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にｐＭＡＴ６ベクターＤＮＡ １又は２μｇを使用した。１５分間温置した後、ＦｕＧＥＮＥ６試薬ＤＮＡ複合体を６ウェルプレート中の細胞（２ｍＬ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１．０ｘ１０６細胞）に移す。９５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で７２時間、この細胞を温置しなければならない。機能的ｓｃＦｖタンパク質を測定するために、ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＧＲ１タンパク質の抗−ＨＡウエスタンブロット分析及び抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を回収することができる。
【０１７５】
最初に、ＰｒｏＦｏｕｎｄ ＨＡ Ｔａｇ ＩＰ／Ｃｏ−ＩＰキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従い、抗−ＨＡ抗体ビーズを用いて培養上清８００μＬからｓｃＦｖタンパク質を精製した。このように、タンパク質分離のために４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に精製ｓｃＦｖタンパク質を添加し、ＥＣＬ ｐｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の説明書に従い、ウエスタンブロッティング分析のために０．４５ニトロセルロース膜に転写した。簡潔に述べると、ＴＢＳＴ中５％脱脂乳で膜をブロッキング処理し、室温で１時間、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに温置した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗−マウス抗体で１時間温置して膜をプローブした。洗浄した膜に検出溶液を添加し、５分間温置した。次に、ｘ線フィルムを用いて化学発光シグナルを検出した。図７Ａで与えられる抗−ＨＡブロッティングの結果から、ｐＭＡＴ６がＣＯＳ６細胞培養上清へのｓｃＦｖタンパク質（〜３５ＫＤ）の発現を支配するように機能することが示される。
【０１７６】
抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＣＯＳ６培養上清からのｓｃＦｖタンパク質の機能をさらに分析した。簡潔に述べると、２μｇ／ｍＬの濃度の、重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の希釈ｒｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）１００μＬで、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを一晩被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ミルクＰＢＳを用いて室温で１時間、プレートをブロッキング処理した。さらなる洗浄後、様々な希釈度の精製ｓｃＦｖタンパク質が入った溶液５０μＬをウェルに添加し、室温にて１時間、温置した。洗浄後、マウス抗体ＨＡ−プローブＦ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μＬを添加して室温で１時間温置し、続いて５％ミルクＰＢＳ中１：２，０００希釈の抗−マウス抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに１時間温置した。次いで、最後に、ＡＢＴＳ基質.（Ｐｉｅｒｃｅ）を発色のために添加した。９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、ＯＤ４０５でプレートの読み取りを行った。図７Ｂで示されるＥＬＩＳＡの結果から、２つの個々のＣＯＳ６細胞形質移入物からのｐＭＡＴ６培養上清中で用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示され、このことから、哺乳動物細胞における酵母／哺乳動物ｐＭＡＴ６ベクターからのｓｃＦｖの機能的発現が示唆される。
【実施例２６】
【０１７７】
ｐＭＡＴ６を用いた、哺乳動物細胞上でのｓｃＦｖ提示
次のプロトコールによって哺乳動物細胞におけるｐＭＡＴ６の異種間提示機能を調べることができる。１０％ウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地が入った６ウェルプレート中のカバースリップ上でＣＯＳ６細胞を増殖させる。製造者の説明書に従い、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｐＡＭＴ６クロス提示ベクター及び哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２をＣＯＳ６細胞に同時形質移入する。簡潔に述べると、血清不含培地中、３：２のＦｕＧＥＮＥ６試薬（μＬ）：ＤＮＡ複合体（μｇ）の割合で、希釈したＦｕＧＥＮＥ６試薬にプラスミドＤＮＡ０８００ｎｇ（ｐＭＡＴ６ ４００ｎｇ＋ｐＭＡＧ２ ４００ｎｇ）を添加する。ＦｕＧＥＮＥ試薬ＤＮＡ複合体を室温で１５分間温置し、次いで細胞に添加する。
【０１７８】
４８時間後、細胞表面上で提示されるＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１融合タンパク質（ｐＭＡＴ６ベクターより）をＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体で検出することができる。簡潔に述べると、ＣＯＳ６細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで２５℃にて３０分間ブロッキング処理し、次いでＰＢＳ中のＡｌｅｘａ４８８標識抗−ＨＡ抗体（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）とともに６０分間温置する。核を可視化するために、細胞をまた、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でも染色する。Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ １００／１．３０油浸対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡で細胞を観察する。細胞表面上のＨＡタグ付加ｓｃＦｖ−ＧＲ１は緑色蛍光で観察される。
【０１７９】
あるいは、関心のあるポリペプチドを発現している宿主細胞を同定するために、ＦＡＣＳアッセイを行うことができる。形質移入から４８時間後に、染色のために４ｘ１０６細胞／ｍＬの最終濃度を用いる。ビオチン化ｒｈＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｆｃを細胞懸濁液２５μＬに添加し、４℃にて６０分間温置する。陰性染色対照として、細胞の同一試料をビオチン化ダイズトリプシン阻害剤で染色する。次に、アビジン−ＦＩＴＣ又は抗−Ｆｃ抗体−ＦＩＴＣとともにさらに３０分間、４℃で暗所で細胞を温置する。ＲＤＦ１緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのフローサイトメトリー分析のために０．２ｍＬ ＲＤＦＩ緩衝液中でこの細胞を再懸濁する。
【実施例２７】
【０１８０】
酵母及び哺乳動物細胞上で提示される所望のポリペプチドの選択
ＤＮＡのライブラリをｐＭＡＴ４ベクターに挿入し、酵母ヘルパーベクターｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーがそのゲノムに組み込まれた酵母細胞に直接形質転換することができる。
【０１８１】
フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを提示する形質転換酵母細胞を単離することができる。簡潔に述べると、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０℃で１６−１８時間移すことができる。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化抗原及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに酵母細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって細胞試料をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。
【０１８２】
選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレートに回収した細胞を播種し３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。２−３回の選択後、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、酵母細胞からのベクターＤＮＡのリードのプールを回収することができる。
【０１８３】
次に、酵母提示ライブラリから単離された、この得られたベクターＤＮＡのプールを、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２とともに同時形質移入することにより、細胞表面提示のために哺乳動物細胞に直接形質移入することができる。フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、所望の特性を有するリードを同定し、回収することができる。簡潔に述べると、キュベット中で氷冷ＰＢＳで洗浄したＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ細胞３ｘ１０６と１０−２０μｇＤＮＡを混合する。氷上で１０分間温置した後、２５０ｕＦ、６６０Ｖに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、細胞／ＤＮＡ混合物に対してエレクトロポレーションを行う。室温で１０分間温置した後、７５ｃｍ培養フラスコ中の２０ｍＬ培地に細胞を移し、３℃、５％ＣＯ２で２−３日間温置する。あるいは、形質移入のために、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬を使用することができる。
【０１８４】
適切な選択プロセスを下記に記載する。ＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化抗原タンパク質及び抗−ＨＡ ｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬとともにおよそ１０７個の形質移入細胞を２５℃で１時間温置する。最後に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）とともに４℃で１時間温置して標識した。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でこの細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ＫＯ７などの通常のヘルパーファージにより、ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターのみをパッケージングすることができるが、これは、哺乳動物ヘルパーベクターからベクターを分離するという効果がある。次に、別の回のＦＡＣＳソーティング又はＤＮＡ配列決定のために、回収した提示ベクターＤＮＡを使用することができる。
【実施例２８】
【０１８５】
Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において機能を有するシグナルペプチドの選択
ｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプターＧＲ１／ポリペプチド融合タンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物細胞に対するＳＶ４０プロモーター；酵母細胞に対するｐＧＡＬ１０プロモーター；及び細菌細胞に対するｐＬａｃプロモーターにより支配される。従って、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞の全てにおいて機能する（即ち、分泌経路に対して融合タンパク質を支配する）シグナルペプチドをベクターが含むならば、このベクターは潜在的にファージ、酵母及び哺乳動物細胞上でのポリペプチドの異種間提示を支配するために使用し得る。
【０１８６】
Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞において分泌機能を有するシグナルペプチドを単離するために、抗−ＶＥＧＦ ｃＦｖなどの試験タンパク質に対する発現カセットを含むｐＭＡＴ６ベクターへとシグナル配列のライブラリをクローニングすることができる。得られたライブラリをファージ上で提示し、ＶＥＧＦ抗原を用いたパニングプロトコールを使用して選択することができる。そのＶＥＧＦ結合活性に基づき同定された単離ファージは、Ｅ．コリ細胞で機能するシグナルペプチドが存在することを特徴とするであろう。適切なパニングプロセスには、４℃で一晩５μｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦで９６ウェルプレートを被覆し、そのプレートをＰＢＳで洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳでブロッキングすることが含まれる。１００μＬ １０１１−１２個のファージを添加し、室温で２時間温置する。ＰＢＳＴ及びＰＢＳでの数回の洗浄後、１０μｇ／ｍＬトリプシンで３０分間、結合ファージを溶出する。ＴＧ１細胞に溶出ファージを感染させ、次回のファージ調製及びパニングに対して使用する。このプロセスを２−３回繰り返した後、提示するファージのプールを濃縮することができる。Ｅ．コリ細胞に感染させるために濃縮したファージを使用し、次の酵母提示用のベクターＤＮＡの調製のためにこれを使用する。
【０１８７】
酵母ヘルパーベクター、ｐＭＡＴ３又はｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８のコピーを有する酵母細胞へと、ファージライブラリから選択されたベクターＤＮＡのこの小さなプールを続いて直接形質転換することができる。酵母細胞表面上で機能的ｓｃＦｖを提示するために、酵母細胞で分泌を支配できるシグナルペプチドが必要である。フローサイトメトリーソーティングを数回行うことにより、機能的シグナルペプチドを有する酵母細胞を単離することができる。適切なソーティングプロトコールは、３０℃で１８−２２時間、ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中で酵母細胞を増殖させ、次いでＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ発現培地に２０℃で１６−１８時間移すことを含み得る。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温にて３０分間ビオチン化ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともにこの細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄することができる。５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びヤギ抗−マウスＡｂ−４８８とともに暗所で氷上で３０分間温置することによって続いて細胞をプローブし、フローサイトメトリーによるソーティングのためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁することができる。選択物を精製するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＤｉＶａセットを用いて選択を行うことができ、所望の二重陽性細胞を選択するためにソートゲートを決定する。Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのＳＤ−ＣＡＡプレート上に回収した細胞を播種し、３０℃で２日間増殖させる。次に、細胞を再懸濁し、次回のために増幅する。２−３回の選択後、説明書に従いＺｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、酵母細胞からベクターＤＮＡを回収する。
【０１８８】
Ｅ．コリ及び酵母で機能するシグナルペプチドを同定するために、上記のファージ及び酵母選択プロトコールを使用した後、ライブラリを哺乳動物提示系に導入することによって第三の選択を行うことにより、哺乳動物細胞で機能することができるさらなる特性を特徴とするシグナルペプチドを同定することができる。表面提示のために、ファージ及び酵母提示から選択されたリードＤＮＡを哺乳動物細胞に直接形質移入することができる。簡潔に述べると、リードＤＮＡ２０μｇを上記のＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ６細胞に形質移入する。培養２日後、形質移入した細胞をＰＢＳ緩衝液中の０．２ｎＭビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び抗−ＨＡ ｍＡｂ １２ＣＡ５ ２０μｇ／ｍＬlとともに２５℃で１時間温置する。最後に、氷冷ＰＢＳ緩衝液でこの細胞をすすぎ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＦＩＴＣ（ＡＭＩ０４０８；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）及びストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥコンジュゲート（Ｓ８６６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）とともに４℃で１時間温置することにより標識した。このように、適切なソートウィンドウ（ｓｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗ）でこの細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でソーティングする。上位０．１％のＰＥ−陽性細胞を回収する。選択された細胞から回収された提示及びヘルパーベクター両方のＤＮＡをＥ．コリ細胞に形質転換する。ファージパッケージングによって、ｆ１ ｏｒｉを有する提示ベクターＤＮＡを単離することができる。これらの選択後、ファージ、酵母及び哺乳動物提示を通じて単離されたシグナルペプチドは、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞で機能的である。これを確認するために、個々のクローンからのＤＮＡを直接使用して、それぞれＥ．コリ、酵母及び哺乳動物細胞に形質転換する。上記のように抗−ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡによって、これらの細胞から分泌される可溶性ｓｃＦｖを検出することができる。
【０１８９】
原核及び真核宿主細胞上での異種間提示
【実施例２９】
【０１９０】
細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１
ＰｃｉＩ部位を用いた自己連結によって、図１３Ａで示されるｐＭＡＬ１を３８２２ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片から作製した。この完全合成ＤＮＡは、（１）複製のためのｐＵＣ ｏｒｉ、ファージパッケージングのためのｆ１ ｏｒｉ及びクロラムフェニコール選択マーカーの発現カセットを含む細菌の制御エレメントに対する配列と；（２）細菌外面ドメイン（ＰｅｌＢシグナル−Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）とのアダプター２（ＧＲ２）（配列番号２０）融合物の発現カセットと、を含む。簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いることによる遺伝子合成のために、この合成ＤＮＡを１８５１及び２０１９ｂｐの２片のセグメントに分割した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。２つの末端にＰｃｉＩ制限部位があるこれらの合成ＤＮＡセグメントを消化し、核酸連結した。標準的ＤＮＡ配列決定によって、得られたベクター（配列番号１７）を確認した。
【実施例３０】
【０１９１】
細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ２
ＰｃｉＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を１００６ｂｐの完全合成ＤＮＡ断片（これは、アダプター２（ＧＫ１）（配列番号２０）に融合したＬｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外面ドメインに対する発現カセットを含む。）で置換することにより、図１３Ｂで図示されるｐＭＡＬ２をｐＭＡＬ１ベクターから得た。融合タンパク質の発現はファージｐ８シグナルペプチドにより支配される。
【０１９２】
簡潔に述べると、Ｃｏｄｏｎ ＤｅｖｉｃｅのＢｉｏＦａｂプラットフォーム技術を用いて合成ＤＮＡを作製した。合成遺伝子に相補的な配列を用いたオリゴ選択及びＭｕｔ−Ｓタンパク質カラムのアフィニティー精製によって、オリゴ合成から生じたエラーを修正した。得られたベクター（配列番号１８）を標準的ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【実施例３１】
【０１９３】
Ｅ．コリ及び哺乳動物宿主細胞上でのｓｃＦｖの異種間提示
上記で示されるように、宿主細胞の複数種におけるポリペプチドの発現のために、及び、本発明のヘルパー提示ベクターと組み合わせて使用される場合、実施例２、６から９に記載のファージ及び哺乳動物細胞上でのタンパク質ライブラリの表面提示を支配するために、ベクターｐＭＡＧ９を使用した。同様に、細菌及び哺乳動物細胞上でのクロス提示のためにこのベクターを使用することもできる。細菌細胞提示を次のように行うことができる。
【０１９４】
細菌ヘルパー提示ベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２と組み合わせた発現ベクターｐＭＡＧ９ベクターの同時形質転換は、２つの融合タンパク質：可溶性ｓｃＦｖ−ＧＲ１（タンパク質／アダプター１）及びＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２（表面タンパク質／アダプター２）を発現するようにＥ．コリを支配する。ＧＲ１及びＧＲ２融合タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、集合してＧＲ１及びＧＲ２相互作用によりタンパク質複合体を形成する。得られたタンパク質複合体は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ外膜アンカードメインによって細胞表面上で提示される。
【０１９５】
簡潔に述べると、アンピシリン選択マーカーを有するｐＭＡＧ９発現ベクターで細胞を形質転換し、次いでクロラムフェニコール選択マーカーを有するファージミドパッケージングヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２を感染させることができる。ＯＤ６００＝０．５まで、１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの抗生物質を含有する２ＹＴ培地中で提示及びヘルパーベクター両方を有する細胞を増殖させ、次いで、アダプター融合タンパク質の発現のために、グルコース不含の増殖培地に移す。４−６時間温置した後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、ビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに３０分間、暗所で氷上で温置することによって細胞をプローブし、ＦＡＣＳ分析のためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖのライブラリをこの方法で提示させる場合、ｓｃＦｖタンパク質を提示する細胞を上記のようにプローブし、フローサイトメトリーによりソーティングし得る。抗生物質アンピシリンのみを含有する２ＹＴ／グルコース培地中での増殖を通じて、ヘルパーベクターから提示ベクターのリードを分離することができる。
【実施例３２】
【０１９６】
Ｅ．コリと酵母との間のｓｃＦｖの異種間提示
本明細書中で示されるように、ファージと酵母細胞との間のクロス提示（実施例１２から１９に記載）に対して及び細菌と酵母細胞との間の細胞表面提示に対して、ｐＭＡＴ５を使用することができる。ｐＭＡＴ６ベクター及び細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＡＭＬ２で受容宿主細胞を同時形質転換し、次に、細胞が２種類の融合タンパク質：可溶性ｓｃＦｖ−ＧＲ１及びＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２融合物を発現する。ＧＲ１及びＧＲ２融合タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、ＧＲ１及びＧＲ２相互作用によりタンパク質複合体を形成する。Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ外膜ドメインを通じて細胞表面上にｓｃＦｖ−ＧＲ１タンパク質が提示される。
【０１９７】
簡潔に述べると、アンピシリン選択マーカーを含む提示ベクターで細胞を最初に形質転換し、続いて、クロラムフェニコール選択マーカーを有するファージミドパッケージングヘルパーベクターｐＭＡＬ１又はｐＭＡＬ２を感染させることができる。ＯＤ６００＝０．５まで、１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの抗生物質を含有する２ＹＴ培地中で提示及びヘルパーベクター両方を有する細胞を増殖させ、次いで、アダプター融合タンパク質の発現のために、グルコース不含の増殖培地に移す。４−６時間温置した後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、室温で３０分間、ビオチン化抗原ＶＥＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体とともに細胞を温置し、氷冷洗浄緩衝液で洗浄する。このように、５ｍｇ／ｍＬ ＳＡ−ＰＥ及びＧａＭ−４８８とともに３０分間、暗所で氷上で温置することによって細胞をプローブし、ＦＡＣＳ分析のためにＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で再懸濁する。抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖのライブラリをこの方法で提示させる場合、ｓｃＦｖタンパク質を提示する細胞を上記のようにプローブし、フローサイトメトリーによりソーティングし得る。抗生物質アンピシリンのみを含有する２ＹＴ／グルコース培地中での増殖を通じて、ヘルパーベクターから提示ベクターのリードを分離することができる。酵母細胞提示のためのｐＭＡＴ５提示ベクターは実施例１９に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、本発明の異種間及び複数種提示系の実験計画の概略である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ファージ及び哺乳動物の異種間又は複数種提示ベクターｐＭＡＧ１（図２Ａ）及びｐＭＡＧ９（図２Ｂ）の概略を示す。ｐＭＡＧ１及びｐＭＡＧ９ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【図３】図３は、ＫＯ７Ｋｐｎベクターのカナマイシン耐性ファージ−陽性クローンに対する抗−ファージＥＬＩＳＡスクリーニングの結果の概略を示す。クローン＃Ｃ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２は、ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ−陽性クローンに相当する。Ｆ１及びＦ２は、親Ｍ１３ＫＯ７ファージの２つの陽性対照に相当する。
【図４】図４は、ファージヘルパーベクターＧＭＣＴの概略を示す。このベクターは、ＫＯ７ｋｐｎファージベクターにおいてアダプターＧＲ２及びＭｙｃ−タグに融合した改変遺伝子ＩＩＩのさらなるコピーをコードするヌクレオチド配列を含有する。
【図５】図５は、哺乳動物ヘルパーベクターｐＭＡＧ２の概略を示すが、これは、ヒトＥＧＦ受容体の膜貫通ドメインに融合したアダプター２を含む融合タンパク質を産生する。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、異種間提示ベクターｐＭＡＧ９を用いてＥ．コリ細胞（図６Ａ）及び哺乳動物細胞（図６Ｂ）で発現される可溶性抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖに対する機能的発現アッセイの結果の概略を示す。これらのデータから、培養上清からのｓｃＦｖ抗体のＶＥＧＦ結合活性が示され、このことから、ベクターｐＭＡＧ９の異種間発現機能が明らかとなった。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、異種間提示ベクターｐＭＡＧ９及びｐＭＡＴ６を用いた哺乳動物細胞での可溶性ｓｃＦｖの発現を示す結果である。図７Ａは、ｐＭＡＧ９及びｐＭＡＴ６ベクターによって２９３及びＣＯＳ細胞からの培養上清中で分泌された３５ＫＤ ｓｃＦｖタンパク質を示す、抗−ＨＡ抗体で発色させたウエスタンブロットの結果である。図７Ｂは、ｐＭＡＴ６ベクターによってＣＯＳ細胞上清中で発現されるｓｃＦｖのＶＥＧＦ結合活性を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果をまとめたものであるが、これにより、ベクターｐＭＡＴ６の複数種発現機能が明らかとなった。
【図８】図８は、ベクターｐＭＡＧ９を用いたファージ表面上でのｓｃＦｖの機能的提示を示す。このデータから、ファージ表面上で提示された抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図９】図９Ａ、Ｂ及びＣは、表面上で抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖを提示するＣＯＳ６細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。ｐＭＡＧ９及びｐＭＡＧ２ベクターで形質移入されたＣＯＳ６細胞をチャンバースライド上で増殖させた。抗−ＨＡ抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）核染色で、形質移入された細胞を染色した。図９Ａは、重ね合わせた染色パターンである。図９Ｂは、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ−４８８染色を与え、図９Ｃは、ＤＡＰＩ核染色を与える。このデータから、ｐＭＡＧ９ベクターの哺乳動物提示機能が明らかとなった。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ファージ及び酵母異種間又は複数種発現ベクターｐＭＡＴ２及びｐＭＡＴ５の概略を示す。図１０はベクターｐＭＡＴ２の成分を示す。図１０Ｂは、ベクターｐＭＡＴ５の成分を示す。ｐＭＡＴ２及びｐＭＡＴ５ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、酵母プロモーター及び細菌プロモーターの調節下にある。
【図１１】図１１Ａ、Ｂ及びＣは、酵母ヘルパー提示ベクター、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８の概略を示す。これらのベクターにおいて、アダプター２は次のような様々な酵母細胞外壁タンパク質：ｐＭＡＴ３の場合Ｆｌｏ１のＣ末端ドメイン；ｐＭＡＴ７の場合Ａｇａ２；及びｐＭＡＴ８の場合Ｃｗｐ２、に融合する。
【図１２】図１２は、発現ベクターｐＭＡＴ５を用いたＥ．コリ細胞での可溶性ｓｃＦｖに対する機能的発現アッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡデータから、ＴＧ１培養上清中の抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図１３】図１３は、異種間提示ベクターｐＭＡＴ５を用いたファージ表面上でのｓｃＦｖの機能的提示を示す。このデータから、ｐＭＡＴ５ファージ表面上で提示される抗−ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体の用量依存的ＶＥＧＦ結合活性が示された。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、酵母及び哺乳動物異種間又は複数種発現ベクターｐＭＡＴ４（１４Ａ）及びｐＭＡＴ６（１４Ｂ）の概略を示す。ｐＭＡＴ４及びｐＭＡＴ６ベクターにおいて、アダプター１融合タンパク質の発現は、３つのプロモーター：哺乳動物、酵母及び細菌プロモーターの調節下にある。このシグナルペプチドは酵母及び哺乳動物細胞において機能的である。
【図１５】図１５Ａ及びＢは、細菌ヘルパーベクターｐＭＡＬ１（１５Ａ）及びｐＭＡＬ２（１５Ｂ）の概略を示す。このベクターは、抗生物質選択（Ｃａｍ）のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子及びＬｐｐ−ＯｍｐＡの細菌外膜ドメインへのアダプター融合のための発現カセットを含有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする異種間発現カセットと、を含む異種間発現ベクターと、２）原核生物宿主により発現される外面タンパク質に融合した、提示ベクターの第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第一のヘルパーベクターと、３）真核生物宿主細胞により発現される外面タンパク質に融合した、第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第二のヘルパーベクターと、からなる異種間提示ベクターセットを含む、関心のあるポリペプチド配列をコードする発現ベクターを操作する必要のない、原核生物宿主及び真核生物宿主細胞における関心のあるポリペプチド配列のレパートリーの連続提示のための異種間提示系。
【請求項２】
関心のあるポリペプチド配列のレパートリーが抗体ライブラリである、請求項１に記載の異種間提示系。
【請求項３】
原核生物宿主がファージであり、真核生物宿主が酵母である、請求項２に記載の異種間提示系。
【請求項４】
異種間発現ベクターが、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ６又はｐＭＡＴ５から選択され、第一及び第二のヘルパーベクターが、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８から選択される、請求項３に記載の提示系。
【請求項５】
異種間発現セットが、ａ）提示ベクターｐＭＡＴ５と、ｂ）ヘルパーベクターＧＭＣＴと、ｃ）ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８から選択される第二の酵母ヘルパーベクターと、を含む、請求項４に記載の異種間提示系。
【請求項６】
第一及び第二のアダプター配列がコイルドコイルドメイン由来である、請求項２に記載の提示系。
【請求項７】
第一のアダプター配列が配列番号１９からなり、第二のアダプター配列が配列番号２０からなる、請求項６に記載の提示系。
【請求項８】
原核生物宿主がファージであり、真核生物宿主が哺乳類であり、さらに、異種間ベクターセットが、提示ベクターｐＡＭＧ９及びヘルパーベクターＧＭＣＴ及びｐＭＡＧ２を含む、請求項２に記載の提示系。
【請求項９】
ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８の群から選択されるヘルパーベクターで形質転換される酵母宿主細胞。
【請求項１０】
適切な包装中に請求項１に記載の異種間提示ベクターセットを含む、キット。
【請求項１１】
１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする発現カセットと、を含む複数種発現ベクターと、２）提示のために選択される宿主細胞の種により発現される外面タンパク質に融合した、第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードするヘルパーベクターと、３）少なくとも２種類の宿主細胞の異なる種と、を含む、複数種提示系。
【請求項１２】
関心のあるタンパク質が抗体ライブラリである、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１３】
第一及び第二のアダプター配列がコイルドコイルドメイン由来である、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１４】
第一のアダプター配列が配列番号１９からなり、第二のアダプター配列が配列番号２０からなる、請求項１３に記載の提示系。
【請求項１５】
宿主細胞の２種類の異なる種が原核性である、請求項１２に記載の複数種提示系。
【請求項１６】
提示ベクターがｐＭＡＧ１又はｐＭＡＧ９から選択される、請求項１５に記載の提示系。
【請求項１７】
異種間発現ベクターが、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ６又はｐＭＡＴ５から選択され、第一及び第二のヘルパーベクターが、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８から選択される、請求項３に記載の提示系。
【請求項１８】
宿主細胞の２種類の異なる種が真核性である、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１９】
提示ベクターが、ｐＭＡＧ１（配列番号１）又はｐＭＡＧ９（配列番号２）から選択される、請求項１８に記載の提示系。
【請求項２０】
提示ベクターがｐＭＡＧ９であり、ヘルパーベクターがｐＭＡＧ２であり、宿主細胞が酵母及び哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の提示系。
【請求項１】
１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする異種間発現カセットと、を含む異種間発現ベクターと、２）原核生物宿主により発現される外面タンパク質に融合した、提示ベクターの第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第一のヘルパーベクターと、３）真核生物宿主細胞により発現される外面タンパク質に融合した、第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードする第二のヘルパーベクターと、からなる異種間提示ベクターセットを含む、関心のあるポリペプチド配列をコードする発現ベクターを操作する必要のない、原核生物宿主及び真核生物宿主細胞における関心のあるポリペプチド配列のレパートリーの連続提示のための異種間提示系。
【請求項２】
関心のあるポリペプチド配列のレパートリーが抗体ライブラリである、請求項１に記載の異種間提示系。
【請求項３】
原核生物宿主がファージであり、真核生物宿主が酵母である、請求項２に記載の異種間提示系。
【請求項４】
異種間発現ベクターが、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ６又はｐＭＡＴ５から選択され、第一及び第二のヘルパーベクターが、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８から選択される、請求項３に記載の提示系。
【請求項５】
異種間発現セットが、ａ）提示ベクターｐＭＡＴ５と、ｂ）ヘルパーベクターＧＭＣＴと、ｃ）ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８から選択される第二の酵母ヘルパーベクターと、を含む、請求項４に記載の異種間提示系。
【請求項６】
第一及び第二のアダプター配列がコイルドコイルドメイン由来である、請求項２に記載の提示系。
【請求項７】
第一のアダプター配列が配列番号１９からなり、第二のアダプター配列が配列番号２０からなる、請求項６に記載の提示系。
【請求項８】
原核生物宿主がファージであり、真核生物宿主が哺乳類であり、さらに、異種間ベクターセットが、提示ベクターｐＡＭＧ９及びヘルパーベクターＧＭＣＴ及びｐＭＡＧ２を含む、請求項２に記載の提示系。
【請求項９】
ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７又はｐＭＡＴ８の群から選択されるヘルパーベクターで形質転換される酵母宿主細胞。
【請求項１０】
適切な包装中に請求項１に記載の異種間提示ベクターセットを含む、キット。
【請求項１１】
１）１以上のプロモーターと、第一のアダプター配列にインフレームで融合した関心のあるタンパク質をコードする発現カセットと、を含む複数種発現ベクターと、２）提示のために選択される宿主細胞の種により発現される外面タンパク質に融合した、第一のアダプター配列と対をなし相互作用する第二のアダプター配列からなる融合タンパク質をコードするヘルパーベクターと、３）少なくとも２種類の宿主細胞の異なる種と、を含む、複数種提示系。
【請求項１２】
関心のあるタンパク質が抗体ライブラリである、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１３】
第一及び第二のアダプター配列がコイルドコイルドメイン由来である、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１４】
第一のアダプター配列が配列番号１９からなり、第二のアダプター配列が配列番号２０からなる、請求項１３に記載の提示系。
【請求項１５】
宿主細胞の２種類の異なる種が原核性である、請求項１２に記載の複数種提示系。
【請求項１６】
提示ベクターがｐＭＡＧ１又はｐＭＡＧ９から選択される、請求項１５に記載の提示系。
【請求項１７】
異種間発現ベクターが、ｐＭＡＧ１、ｐＭＡＧ９、ｐＭＡＴ２、ｐＭＡＴ４、ｐＭＡＴ６又はｐＭＡＴ５から選択され、第一及び第二のヘルパーベクターが、ＧＭＣＴ、ｐＭＡＧ２、ｐＭＡＬ１、ｐＭＡＬ２、ｐＭＡＴ３、ｐＭＡＴ７及びｐＭＡＴ８から選択される、請求項３に記載の提示系。
【請求項１８】
宿主細胞の２種類の異なる種が真核性である、請求項１１に記載の提示系。
【請求項１９】
提示ベクターが、ｐＭＡＧ１（配列番号１）又はｐＭＡＧ９（配列番号２）から選択される、請求項１８に記載の提示系。
【請求項２０】
提示ベクターがｐＭＡＧ９であり、ヘルパーベクターがｐＭＡＧ２であり、宿主細胞が酵母及び哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の提示系。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５３５０６３（Ｐ２００９−５３５０６３Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０９７１６（Ｐ２００９−５０９７１６）
【出願日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０７４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０５２０
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０８３２６４９３）アブマクシス・インコーポレイテツド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０７４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０５２０
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０８３２６４９３）アブマクシス・インコーポレイテツド (2)
【Ｆターム（参考）】
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